РЕФНОТ. Рекомбинантный Фактор Некроза Опухолей
реклама
ООО «РЕФНОТ-ФАРМ» РЕФНОТ Рекомбинантный Фактор Некроза Опухолей-Тимозин альфа1, высокоэффективный препарат с низкой системной токсичностью, иммуномодулятор с прямым противоопухолевым действием для лечения онкологических заболеваний. 2015 СОДЕРЖАНИЕ ГИБРИДНЫЕ ЦИТОКИНЫ. ...............................................................................................4 ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА (ФНО). ................................5 Структура ФНО............................................................................................................................................... 5 Синтез ФНО в организме. ............................................................................................................................. 6 Рецепторы для ФНО. ...................................................................................................................................... 8 Механизм противоопухолевого действия ФНО. ..................................................................................... 14 Противоопухолевое действие (доклинические исследования)............................................................. 23 Спектр чувствительности опухолевых клеток к ФНО. ........................................................................... 23 Чувствительность клеток опухолей нервной системы к ФНО............................................................... 25 Чувствительность клеток опухолей головы и шеи к ФНО. .................................................................... 25 Чувствительность клеток опухолей лёгкого к ФНО. .............................................................................. 26 Чувствительность клеток опухолей молочной железы к ФНО. ............................................................. 26 Чувствительность клеток опухолей желудка к ФНО. ............................................................................. 27 Чувствительность клеток опухолей поджелудочной железы к ФНО.................................................... 28 Чувствительность клеток опухолей толстой кишки к ФНО. ................................................................. 29 Чувствительность клеток опухолей яичников к ФНО. ........................................................................... 30 Чувствительность клеток опухолей предстательной железы к ФНО. ................................................... 32 Чувствительность клеток опухолей матки к ФНО. ................................................................................. 32 Чувствительность клеток опухолей мочевого пузыря к ФНО. .............................................................. 33 Чувствительность клеток опухолей костей к ФНО. ................................................................................ 34 Чувствительность лейкозных клеток к ФНО. .......................................................................................... 34 Чувствительность опухолевых клеток к комбинации ФНО с химиопрепаратами. ............................. 34 ФНО и ионизирующие излучения. ........................................................................................................... 35 Взаимодействие ФНО с другими цитокинами. ....................................................................................... 36 Участие ФНО в инфекционных процессах. ............................................................................................. 37 ФНО и аутоиммунные заболевания. ......................................................................................................... 42 Токсичность и кахектический эффект ФНО. .......................................................................................... 45 КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФНО. ........................................................................48 Чувствительность опухолей к системному введению ФНО. ................................................................ 48 Чувствительность опухолей к интра- или перитуморальному введению ФНО. ............................. 49 Противоопухолевое действие ФНО в комбинации с мелфаланом при изолированной региональной перфузии........................................................................................... 50 Противоопухолевое действие ФНО в комбинации с мелфаланом при изолированной перфузии печени. ...................................................................................................... 56 ТИМОЗИН-АЛЬФА1. ..........................................................................................................59 Структура и синтез тимозина-альфа1 in vivo. ......................................................................................... 59 Рецепторы для тимозина-альфа1. .............................................................................................................. 61 Роль тимозина-альфа1 в системе иммунитета. ....................................................................................... 61 Влияние тимозина-альфа1 на противоопухолевый и противоинфекционный иммунитет. ...................................................................................................................................................... 62 Клиническое применение тимозина-альфа1. .......................................................................................... 63 РЕФНОТ® - РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГИБРИД ФНО-ТИМОЗИН-АЛЬФА1. ..........66 Доклинические исследования..................................................................................................................... 67 Противоопухолевое действие ФНО и его гибрида с тимозином-альфа1. .......................................... 67 Воздействие гибрида ФНО-Т на систему иммунитета. ......................................................................... 67 Синергический эффект ФНО и ФНО-Т с антивирусной активностью ИФН-гамма. ..................... 68 Фармакокинетика рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот......................................... 69 Общетоксическое действие рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот. ........................ 70 Изучение мутагенной активности рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот. ............ 70 Изучение репродуктивной токсичности субстанции рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот. ....................................................................................................................... 71 Изучение иммунотоксических свойств субстанции рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот. ....................................................................................................................... 71 КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I, II И III ФАЗЫ РЕФНОТА ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ.............................................................72 Изучение безопасности, переносимости и эффективности препарата Рефнот у пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи (I фаза). ................................................................................. 72 Сравнительное рандомизированное исследование Рефнота® в комбинации с химиотерапией в режиме FEC, Рефнота® в комбинации с Ингароном® и химиотерапией FEC, а также одной химиотерапии FEC при местно-распространенном и метастатическом раке молочной железы (фаза II/III)........................................................................................................................................ 75 Заключения и выводы по доклиническим и 1-2-3 фазам клинических исследований................... 81 IV фаза клинических исследований препарата Рефнот: «Влияние Рефнота на иммунитет у онкологических больных» ........................................................................................................................ 84 Материал и методы. ...................................................................................................................................... 85 Результаты...................................................................................................................................................... 86 Влияние Рефнота на основные показатели состояния иммунной системы. ..................................... 87 Заключение. .................................................................................................................................................... 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ ПО 4 ФАЗАМ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. ..............................................................................................................90 ЛИТЕРАТУРА. ......................................................................................................................91 ГИБРИДНЫЕ ЦИТОКИНЫ С конца 1980-х годов в разных лабораториях мира с использованием методов генной инженерии начали конструировать гибридные (слитые на уровне генов) белки, состоящие из цитокинов человека, обладающих противоопухолевым, противовирусным и иммуностимулирующим действием. В литературе описаны гибридные белки тимозина-бета4 с фактором некроза опухолей альфа (β4-Т-ФНО) [Tsuji et al. 1989] и интерферона-гамма (ИФН-гамма) с лимфотоксином (ЛТ) или ФНО [Korobkoetal., 1991], однако, отсутствуют подробные данные об их биологической активности. Известно, что белок β4-Т-ФНО имел удельную цитотоксичность на клетках L-929 равную 2,5.106 ЕД на мг белка в присутствии актиномицина Д [Tsuji et al., 1989]. Позже был сконструирован гибридный белок альфа2b-ИФН-тимозин-альфа1 (α2bИФН-Т-α1), который проявлял и антивирусную активность ИФН-α2b, и иммуномодулирующую активность тимозина-альфа1 [Yang et al., 2005]. Нами сконструированы плазмиды, кодирующие синтез гибридных (слитых) белков, состоящих из ФНО-альфа и тимозина-альфа1 (ФНО-Т, Т-ФНО и Т-ФНО-Т) [Коробко и др., 1992; Шмелёв и др., 1995]. Сочетание биологических свойств цитокинов, входящих в состав этих гибридов, позволяло предполагать как возможный синергизм их биологических действий, так и появление новых свойств и активностей у гибридных белков. Отметим, что через 10 лет после нашей публикации (и сославшись на неё) в Китае создали серию слитых белков, содержащих тимозин-альфа1 [Chen et al., 2005]. Наш гибрид ФНО-Т получил наименование (товарный знак) РЕФНОТ® и с 27 марта 2009 года зарегистрирован в РФ в качестве лекарственного средства для лечения рака молочной железы в комплексной терапии с химиопрепаратами. Чтобы лучше понять, какие активности полученного гибрида принадлежат цитокинам, составляющим его (фактор некроза опухолей альфа и тимозин-альфа1), а какие собственно гибриду, рассмотрим известные в научной литературе данные. 4 ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА (ФНО) Структура ФНО ФНО человека известен как белок, состоящий из 157 аминокислотных остатков (а. о.), с молекулярной массой 17356 Да, его аминокислотная последовательность: Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-15 t t t t* * * Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Glu-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-30 t Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-45 t t t * * * Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-Tyr-Ser-60 * * * t* * * T T Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-75 t t t Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-90 Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-105 t t t t T t t t t t t Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-120 t t T t t t T Gly-Gly-Val-Phe-Gln-Leu-Glu-Lys-Gly-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu-135 t T t ----------------------------------------Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln-Val-150 t t Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu T T * T* Выделены жирным шрифтом консервативные аминокислотные остатки (а. о.), гомологичные в ФНО человека, мыши, быка и кролика. Подчеркнуты а. о. идентичные для ФНО и лимфотоксина (ЛТ, ранее назывался ФНО-бэта) человека. Звездочками отмечены а. о., формирующие потенциальный локус для связывания с рецептором; буквами t - а. о., находящиеся на конформационных цепях, участвующих во взаимодействии мономеров для образования тримера, Т - то же, но обеспечивающие вандерваальсовые или электростатические взаимодействия [Eck, Sprang, 1989]. Пунктирной линией подчеркнута основная антигенная детерминанта ФНО. Биологической активностью обладает тримерная форма ФНО, образующаяся за счет ионного и гидрофобного взаимодействия мономеров и связывающаяся с рецепторами на 5 различных типах клеток. Модели трехмерной структуры ФНО и ЛТ показаны на рис. 1. Рис. 1. Модели тримеров ФНО (слева) и ЛТ (в центре). Белым, синим и черным цветом показаны мономеры, красным показаны аминокислоты, мутации в которых нарушали связывание с рецептором и цитотоксичность. Для ФНО это – а. о. с 84 по 91 на белой субъединице, с 30 по 34 (вверху) и с 143 по 149 (внизу) на черной. Для ЛТ это – Tyr-108 на белой субъединице и Asp-50 на черной [Eck et al., 1992]. Удельная цитотоксичность ФНО на клетках L-929 составляет 2.107 ЕД на мг белка в присутствии актиномицина-Д [Smith, Baglioni, 1987]. ФНО синтезируется в клетках в виде предшественника, состоящего из 233 а. о., N-концевая часть которого, 76 аминокислотных остатков, участвует в секреции и в формировании мембраносвязанной формы ФНО. У всех членов ФНО-семейства N-концевая последовательность высоко консервативна (76% гомологии), что позволяет предполагать ее важную, но пока неясную, биологическую роль. При сравнении ами-нокислотных последовательностей ФНО и ЛТ выявлена существенная 50%-ная гомология в двух участках, 35-66 и 110-133 а. о. (нумерация по ФНО). Эти участки конформационно сближены за счет образования петли разделяющей их негомологичной области. Петля в молекуле ФНО стабилизируется внутримолекуляр-ной S-S связью между цистеиновыми остатками в положениях 69 и 101 [Pennica et al., 1984]. Синтез ФНО в организме Синтез ФНО не наблюдается в нестимулированных клетках и ФНО не определяется в сыворотке крови здоровых животных и человека. Активация макрофагов липополисахаридами (ЛПС) или другими стимуляторами приводит к индукции синтеза ФНО через 15-20 мин. Предварительная обработка макрофагов дексаметазоном предотвращает синтез ФНО, вызываемый ЛПС, на уровне ингибирования трансляции м-РНК [Beutler, Cerami, 1988]. In vivo ФНО синтезируется в основном макрофагами в ответ на их активацию при различных заболеваниях. При исследовании плазматических мембран макрофагов установлено, что ФНО находится в их составе, как в виде интегрального белка, так и в связанной с рецептором форме. Изолированные мембраны макрофагов при этом об- 6 ладают цитотоксическим действием против ФНО-чувствительных опухолевых клеток [Luettig et al., 1989]. Наиболее активно ФНО продуцируется макрофагами, стимулированными ЛПС (1 мкг), уровень продукции был выше в присутствии индометацина. Предварительная активация макрофагов invivo внутрибрюшинным введением Corinebacteriumparvum приводила к увеличению продукции ФНО. Увеличение температуры до 41°С не влияло на продукцию ФНО, но усиливало цитотоксический эффект на клетках L-929 [Danielova et al., 1991]. Мононуклеарные лейкоциты синтезируют ФНО при индукции не только ЛПС, но и ФГА, Кон-А, митогеном лаконоса, убитыми микроорганизмами S. aureus и B. pertussis, столбнячным анатоксином, коклюшными токсином и гемагглютинином [Ferrante et al., 1990]. Мононуклеарные клетки плевральной жидкости человека начинают синтезировать ФНО под воздействием компонентов клеточной стенки Mycobacteriumtuberculosis: ЛПС в дозе 0,1 мкг/мл, белок-пептидогликанового комплекса (содержит Т-клеточные эпитопы) или липоарабиномананнана (супрессор Т-клеточной реактивности) в дозах 10 мкг/мл [Barnes et al., 1990]. Токсин из касторовых бобов рицин в концентрациях 5-10 пМ также способен индуцировать синтез ФНО и ИЛ-1β периферическими мононуклеарными клетками человека [Licastro et al., 1993]. ФНО является необходимым аутокринным фактором роста и дифференцировки самих макрофагов. Показана регулирующая роль ФНО на пролиферацию макрофагов в процессе их дифференцировки. Макрофаги костного мозга мыши в ранних стадиях дифференцировки синтезируют эндогенный ФНО. Добавление антисмысловых олигонуклеотидов приводило к блокированию эндогенного синтеза ФНО и увеличению неконтролируемой пролиферации костномозговых макрофагов в присутствии ГМ-КСФ с уменьшением их дифференцировки [Witsell, Schook, 1992]. Лимфокины, такие как ИФН-гамма, М-КСФ и ГМ-КСФ, могут «примировать» клетки для усиления синтеза ФНО при последующей их стимуляции ЛПС [Meager et al., 1989]. Однако предварительное введение ЛПС в низких (10 нг/мл) дозах вызывает толерантность и эффективно супрессирует ФНО-продукцию при последующих введениях ЛПС (1 мкг/мл). Механизм толерантности включает синтез простагландина Е2 и активацию протеинкиназы С. Циклооксигеназные ингибиторы индометацин или ибупрофен ингибируют толерантность. В моноцитах с вызванной ЛПС толерантностью активируется фактор ядра клетки NF-kB (фактор транскрипции), но транскрипции ФНО-гена при этом не происходит [Haas et al., 1990]. Т-клетки периферической крови человека также способны вырабатывать ФНО при их активации через рецепторы CD2 или CD3, и такая выработка зависит от присутствия в среде ИЛ-2. При активации клеток через CD3-рецептор сначала усиливается синтез ИЛ-2, а затем ФНО. При активации через CD2 рецептор синтез ФНО не усиливается без экзогенного ИЛ-2 [Lorre et al., 1992]. Периферические Т-лимфоциты человека после однократной стимуляции митогенами Кон-А и ФМА начинают синтезировать ФНО и лимфотоксин. Накопление м-РНК ФНО достигает максимума через 6 часов и возвращается к фоновым величинам через 7 24 часа. М-РНК лимфотоксина накапливается медленно с максимумом через 18 часов и сохраняет повышенный уровень до 48-72 часов. ФНО-транскрипционный пик при этом в 4-10 раз больше лимфотоксинового, но время полужизни м-РНК лимфотоксина в 8-10 раз продолжительней. Эти результаты показывают, что гены ФНО и лимфотоксина подвержены дифференциальной регуляции в Т-лимфоцитах [English et al., 1991]. Некоторые линии опухолевых клеток синтезируют ФНО, в частности, HL-60 клетки промиелоцитарного лейкоза, стимулированные ФМА [Aggarwal et al., 1985]. Моноцитарные лейкемические клетки U-937 и TPH-1 синтезируют ФНО-подобные цитотоксические факторы, отличающиеся от ФНО аминокислотными заменами в первых 12 N-концевых а. о. [Soma et al., 1987]. Определение уровня активности ФНО у 58 пациентов с острыми лейкозами показало, что его уровень был значительно выше при острых моноцитарных и миеломоноцитарных лейкозах, чем у пациентов с острыми лимфобластными и гранулоцитарными лейкозами (P<0,05) [Zeng, 1992]. Исследование опухолевых клеток 57 пациентов (21 с острым миелобластным лейкозом; 14 с острым лимфобластным лейкозом; 12 с Филадельфийскими хромосом-позитивными миелобластным хроническим [бластная фаза] или острым лейкозами; 5 с хроническим лимфоцитарным лейкозом; 5 с хроническим миеломоноцитарным лейкозом) на экспрессию ИЛ-1β- и ФНО-транскриптов Northern-гибридизацией выявило, что м-РНК ФНО обнаружена в образцах почти от половины (47%) пациентов. Исключение составили все T-клеточные острые лимфобластные лейкозы. Экспрессия отмечалась с большой частотой в образцах (12 из 15 [80%]) моноцитарных острых и хронических лейкозов и прогрессирующих хронических лимфоцитарных лейкозов (4 из 5 образцов [80%]). ИЛ-1 транскрипты были обнаружены в 20 из 57 образцов (35%). Таким образом, м-РНК ФНО и/или ИЛ-1 могут быть с высокой частотой найдены в В-клеточных острых лимфобластных лейкозах, хронических и острых миелоидных, моноцитарных или лимфоцитарных лейкозах [Kurzrock et al., 1993]. Некоторые линии клеток сарком человека, в отличие от нормальных фибробластов, начинали синтезировать ФНО после рентгеновского облучения. Подъем уровня синтезируемого ФНО отмечался через 20 часов после облучения, достигал максимума к 3-му дню и оставался повышенным 5 дней. Уровень м-РНК ФНО в клетках повышался в несколько раз через несколько (3-6) часов, отличаясь кинетикой среди клеточных линий. Сочетание добавления экзогенного ФНО с рентгеновским облучением имело синергический эффект в киллинге некоторых линий ФНО-продуцирующих и не продуцирующих клеток. На других линиях клеток подобный эффект отсутствовал [Hallahan et al., 1989]. Рецепторы для ФНО ФНО взаимодействует с различными клетками через рецепторы, находящиеся на их поверхности. В настоящее время большая часть публикаций посвящена двум типам ФНОрецепторов с молекулярными массами 55 и 75 кДа, обнаруженным на различных клетках. 8 Эти работы опираются в основном на использование моноклональных антител серии utr против ФНО-рецептора 75/65 кДа и серии htr против 55/50 кДа-рецептора, полученных специалистами фирмы Hoffmann-LaRoche. Применение этих моноклональных антител показало, что линии клеток HeLa, Hep-2 и MSF-7 имеют только 55 кДа-рецептор, клетки U-937, HL-60, очищенные моноциты и гранулоциты периферической крови - оба рецептора. Классически используемые для тестирования ФНО линии клеток L-929 и WEHI-164, оказалось, взаимодействуют с ФНО в присутствии обеих серий моноклональных антител. Это обстоятельство указывает на то, что на поверхности этих клеток имеются рецепторы другого типа. Клетки Raji не имеют определяемых проточной цитометрией ФНОсвязывающих сайтов. Отмечено также, что моноклональные антитела htr (анти-R55), но не utr, имеют ФНО-подобную активность при определении цитотоксичности, роста фибробластов и ИЛ-6 секреции [Brockhaus et al., 1990]. ФНО и ЛТ связываются с рецептором 55 кДа с константами 160 и 67 пм, а с рецептором 75 кДа - 10 и 21 пм, соответственно [Schoenfeld et al., 1991]. Противовоспалительный препарат сульфасалазин препятствует связыванию ФНО с рецепторами и ингибирует цитотоксические функции Т-лимфоцитов, их супернатантов и рекомбинантного ФНО [Shanahanetal., 1990]. С помощью моноклональных антител против ФНО-рецепторов 55 и 75 кДа анализировано наличие этих рецепторов на клетках различных лимфоидных органов. В тимусе 75 кДа-рецептор определялся на медуллярных лимфобластах и дендритных клетках; в лимфатических узлах и миндалинах - на активированных лимфоцитах и интердигитальных клетках ретикулума Т-зависимых зон. 55 кДа-рецептор выявлялся на дендритных клетках зародышевых центров ретикулума, которые являются главным местом продукции ФНО [Ryffel et al., 1991a, 1991b]. Оба ФНО-рецептора 55 и 75 кДа обнаружены и на естественных киллерных клетках (CD56+). Стимулирование НК-клеток ИЛ-2 и добавление ФНО увеличивает их пролиферативную активность. Моноклональные антитела к 55- и 75 кДа-рецепторам ингибируют пролиферацию, индуцированную ИЛ-2, что свидетельствует о вовлечённости этих рецепторов в процесс пролиферации НК-клеток [Naume et al., 1991]. На Т-лимфоцитах/киллерах человека 55 кДа-рецептор индуцировался ИЛ-2. Дополнительная обработка ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6 усиливала транскрипцию м-РНК рецептора, экспрессию рецептора на мембране и секрецию ФНО [Dett et al., 1991]. В сыворотках крови обнаружена повышенная концентрация растворенного рецептора к ФНО у ВИЧ-инфицированных лиц. У серонегативных мужчин-гомосексуалистов концентрация составила 4,4 нг/мл, у асимптоматических серопозитивных - 5,2 и у больных СПИДом - 9,5 нг/мл [Kalinkovitch et al., 1992]. Белок, ингибитор ФНО, с молекулярной массой 33 кДа был выделен из мочи лихорадящих больных с температурой более 38,5°С. Этот белок взаимодействовал с ФНО, блокируя его способность связываться с клетками U-937, индуцировать продукцию фибробластами простагландина Е2 и экспрессию ИЛ-1 [Seckinger et al., 1989]. В дальнейших исследованиях были получены антитела против ФНО-ингибитора и выявлено, что они взаимодействуют также с ФНО-рецептором (95 кДа, поперечно сшитый с ФНО) на 9 клетках U937 и на ФГА/ИЛ-2-стимулированных Т-лимфоцитах [Seckinger et al., 1990]. В сыворотках крови пациентов больных раком простаты, молочной железы, мозга или кишечника содержится 28 кДа белок, связывающий ФНО человека и мыши и блокирующий их цитотоксическую активность. Менее эффективно он взаимодействовал и нейтрализовал лимфотоксин. Его N-концевая аминокислотная последовательность AspSer-Val-Cys-Pro соответствовала и ФНО-связывающим белкам, выделенным из мочи женщин в менопаузе и из мочи пациентов с хронической почечной недостаточностью [Gatanaga et al., 1990]. В последующем, основываясь на аминокислотной последовательности этого ФНО-связывающего белка были синтезированы олигонуклеотидные зонды и использованы для клонирования соответствующего гена. Оказалось, что это ген 55 кДа ФНО-рецептора [Schalletal., 1990]. Протеолитически отщепленные внеклеточные домены 75 кДа- и 55 кДа-рецепторов, растворимые ФНО-связывающие белки тип А и тип В, соответственно, присутствуют в сыворотках крови больных В-клеточными лейкозами (волосатоклеточным и хроническим лимфоцитарным). Лечение ИФНом-альфа больных волосатоклеточным лейкозом приводит к снижению уровней этих белков [Digel et al., 1992]. Отмечено, что при внутривенных инъекциях рекомбинантного ФНО онкологическим больным уровень протеолитического фрагмента 55 кДа-рецептора повышался у всех больных и сохранялся у одного больного до двух суток. Это обстоятельство может существенно снижать биологические эффекты вводимого ФНО [Malik et al., 1991]. В настоящее время в литературе рассматривают только два типа ФНО-рецепторов с молекулярными массами 55 (TNFR-I, CD120a) и 75 кДа (TNFR-II, CD120b), обнаруженных на различных клетках. Считается, что цитотоксичность (апоптоз) ФНО для опухолевых клеток опосредована через активацию 55 кДа-рецептора, только TNFR-I (55 кДа) имеет домен смерти на своей цитоплазматической части [Bazzoni, Beutler, 1996]. В целом на начало 2000-х годов известны восемь членов семейства рецепторов смерти: ФНО-рецептор 1 (TNFRI; также известный как DR1, CD120a, p55 или p60), CD95 (известный как DR2, APO-1 или Fas), DR3 (известный как APO-3, LARD, TRAMP или WSL1), TRAILR1 (связанный с ФНО вызывающий апоптоз рецептор лиганда 1; также известный как DR4 илиAPO-2), TRAILR2 (также известный как DR5, KILLER или TRICK2), DR6, эктодисплазиновый (ectodysplasin) рецептор (EDAR) и рецептор фактора роста нервов (NGFR). Их отличает цитоплазматический домен размером приблизительно 80 аминокислотных остатков, названный доменом смерти. Когда эти рецепторы активируются соответствующими лигандами, множество молекул привлекается к доменам смерти, и происходит каскад передачи сигналов. Лиганды смерти также взаимодействуют с рецепторами приманками (DcRs), которые не обладают доменами смерти и не могут формировать комплексы передачи сигналов смерти. До настоящего времени четыре рецептора приманки были охарактеризованы: TRAILR3 (также известный как DcR1), TRAILR4 (известный как DcR2), DcR3 и остеопротегрин (OPG) [Lavrik et al., 2005]. Передача сигналов с ФНО-рецептора 1 отличается от CD95-рецептора или TRAILR1/R2-индуцированного апоптоза. Стимуляция TNFRI приводит к формиро- 10 11 Рис. 2. Семейство рецепторов смерти и цитоплазматические белки, участвующие в передаче сигнала [Lavrik etal., 2005]. ванию двух комплексов передачи сигналов. Комплекс I формируется на мембране и включает TNFRI, ФНО, RIP (взаимодействующий с рецептором белок), TRADD (TNFR-связанный белок домена смерти), TRAF-1/2 (TNFR ассоциированный фактор), и вероятно другие пока ещё не идентифицированные молекулы. Вызывается активация NF-κB-сигнального пути через пополнение IKK-комплекса и активируется JNK через TRAF-2-зависимый механизм (рис. 2). Комплекс I лишен FADD и прокаспазы-8, но перемещается в цитоплазме, где рекрутируются FADD, прокаспазы-8/10 и FLIP-L/S и формируется так называемые траддосомы или комплекс II. Активация прокаспазы-8 происходит в траддосоме и сопровождается активацией передачи сигналов смерти. В этой модели выбор между выживанием и смертью клетки зависит от эффективности формирования комплекса II, активации каспазы-8 и количества FLIP в клетках, который блокирует активацию прокаспазы-8 в комплексе II. Хотя эта модель обеспечивает изящный механизм принятия решения между жизнью и смертью клетки, требуется дальнейшее экспериментальное подтверждение этому [Lavrik et al., 2005]. Однако при действии на клетки через TNFR-1 ФНО может активировать и выживание, и пролиферацию, и апоптоз. Отдельные проводящие пути хорошо определены, в то время как другие остаются неясными (рис. 3). Рис. 3. Рецептор фактора некроза опухолей 1 (TNFR-1) и его сигнальные пути [van Horssen et al., 2006]. Сокращения: APAF-1 - белок апоптоз-активирующий фактор 1; Bcl-2 – белок В-клеточной лимфомы 2; Bid, Bak, Bax и Bcl-XL - митохондриальные белки Bcl-2-семейства; CAD - активированная каспазой ДНК-аза; Caspase-3/8/9 – цистеиновая аспартаза (апоптотическая протеаза) 3/8/9; Cdc37 - ко-шаперон HSP90; cIAP - цитоплазматический ингибитор апоптоза; cFos/cJun - факторы транскрипции; DD - домен смерти; EndoG - митохондриальная ДНК-аза; FADD - Fas-ассоциированный DD; HSP90 - белок теплового шока 90; I-CAD - ингибитор CAD; IκB - ингибитор NF-κB; IKK α/β - IκB киназа; JNK - cJun N-концевая киназа; MEKK1 - активизированная митогеном протеинкиназа / внеклеточная связанная с сигналом киназа 1; MKK3/7 – MAPK-киназа 3/7; NEMO - NF-κB существенный модулятор; NF-κB - ядерный фактор транс- 12 крипции каппа B; NIK - NF-κB индуцирующая киназа; p38MAPK - p38 активированная митогеном протеинкиназа; RIP - взаимодействующий с рецептором белок; SODD - ослабитель доменов смерти; sTNFR-1 - растворимый TNFR-1; ФНО - фактор некроза опухолей альфа; TNFR-1 – ФНО-рецептор 1; TRADD – белок, ассоциированный с DD ФНО-рецептора; TRAF-2 - ассоциированный с ФНО-рецептором фактор 2 [VanHorssen et al., 2006]. Однако ФНО и ИЛ-1 могут проявлять и антиапоптотическое действие через активацию транскрипции как антиапоптотических, так и провоспалительных генов в эндотелиальных клетках человека, как предполагалось через NF-kappaB. При этом оба и ФНО и ИЛ-1 активируют антиапоптотическую протеинкиназу Akt. Фосфорилирование Akt блокируется ингибиторами фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3-киназа). Одни авторы показали, что ФНО и ИЛ-1 активируют PI-3-киназный/Akt антиапоптотический сигнальный путь не через NFkappaB, и что антиапоптотические эффекты Akt являются независимыми от NF-kappaB [Madge, Pober 2000]. Другие доказывают, что фактор транскрипции NF-kappaB и серин-треониновая киназа Akt оба включены в поддержку клеточного выживания и их проводящие пути могут сходиться. Так, IkappaB-киназа, включаемая в активацию NF-kappaB, является субстратом Akt, и поэтому активация Akt стимулирует активность NF-kappaB. Хотя эти результаты помещают Akt вверх по течению активации NF-kappaB, сообщается, что это не обязательно и что Akt может быть целью NF-kappaB. Обработка NIH3T3-клеток активаторами NF-kappaB (ФНО и ЛПС) приводит к стимуляции Akt-фосфорилирования. Стимуляция Akt обнаруживается только после IkappaBдеградации, вызванной этими агентами. Воздействие ингибиторов NF-kappaB блокирует ФНО-индуцированную Akt-активацию. С другой стороны, ФНО-опосредованная активация NF-kappaB не уменьшается ингибиторами киназы, хотя эти ингибиторы полностью блокируют активацию Akt. Эти результаты предполагают, что NF-kappaB требуется для ФНО-опосредованной Akt-активации и что NF-kappaB находится вверх по течению стимуляции Akt [Meng et al., 2002]. В клетках и на уровне целого организма человека ФНО вызывает следующие процессы: - активация фактора транскрипции NF-kappaB, - положительная регуляция каскада киназы I-kappaB /NF-kappaB, - негативная регуляция транскрипции с промотора РНК-полимеразы II, - положительная регуляция транскрипции с промотора РНК-полимеразы II, - регуляция ДНК-зависимой транскрипции, - положительная регуляция каскада JNK, - положительная регуляция транскрипции, - положительная регуляция инициации трансляции ионами железа, - белковый импорт, транслокация в ядро клетки, - регуляция фосфорилирования аминокислот белков, - трансдукция сигналов, - апоптоз, индукция апоптоза через домен смерти рецептора, - антиапоптоз, 13 - негативная регуляция импорта глюкозы, метаболизм глюкозы, клеточная транссудация, антибактериальный защитный ответ, антивирусный ответ, гуморальный иммунный ответ, регуляция секреции иммуноглобулинов, адгезия лейкоцитов, регуляция клеточной пролиферации, регуляция дифференцирования остеокластов, органный морфогенез, развитие многоклеточного организма. Механизм противоопухолевого действия ФНО До настоящего времени полной и однозначной картины механизма противоопухолевого действия ФНО invivo не существует. Очевидным является рассмотрение нескольких путей, которыми ФНО уничтожает опухоль или останавливает её рост: • первый из них - непосредственное воздействие белка ФНО на опухолевую клеткумишень через соответствующие рецепторы на её поверхности со всеми сложными процессами, запускаемыми внутри клетки, конечным результатом которых является апоптоз клетки (цитотоксическое действие) или арест клеточного цикла (цитостатическое действие). В случае последнего события клетка также становится более дифференцированной и экспрессирует ряд антигенов; • второй - каскад химических реакций, включающий активацию коагуляционной системы крови и местных воспалительных реакций, обусловленных ФНО-активированными клетками эндотелия и лимфоцитами, и ведущий к так называемому «геморрагическому» некрозу опухолей; • третий путь – блокирование ангиогенеза, приводящее к уменьшению прорастания новыми сосудами быстрорастущей опухоли и, как следствие, к снижению кровоснабжения вплоть до некроза центра опухоли; • и, наконец, четвертый путь, обуславливающий уничтожение опухоли, - воздействие клеток иммунной системы, цитотоксичность которых оказалась тесно связана с наличием молекул ФНО на их поверхности или процесс созревания/активации этих клеток связан с ответом на ФНО. Наличие рецепторов для ФНО на клетке-мишени необходимо, но недостаточно для цитотоксичности. Так нормальные фибробласты и многие опухолевые клетки имеют рецепторы для ФНО, но резистентны к его цитотоксической активности. Линия Т-лимфобластных клеток CCRF-CEM устойчива к ФНО, но ее варианты CEMVBL10 и CEM-VBL100, экспрессирующие P-гликопротеин и имеющие множественную устойчивость к химиопрепаратам (МЛУ), оказались чувствительными к ФНО. Определение связывания ФНО с исходной линией и ее МЛУ-вариантами показало отсутствие различий по числу и аффинности ФНО-связывающих сайтов на клетках [Cianfriglia et al., 1991]. 14 15 Рис. 4. Индукция апоптоза лигандами клеточной смерти (к которым относится ФНО) или химиопрепаратами (drugs) [Petak., Houghton, 2001]. ядро цитоплазма Фрагментация, формирование апоптотических телец Расслоение Увеличенное число аутофагических везикул Расслоение клеточные мембраны Морфологические изменения Таблица 1. Характеристика известных типов клеточной смерти. Тип клеточной смерти Апоптоз Конденсация хроматина; ядерная фрагментация; ДНК-фрагментация Аутофагия Частичная конденсация хроматина; отсутствие ДНК-фрагментации - Увеличенное образование вакуолей; дегенерация органелл; митохондриаль-ное набухание Увеличение зернистости - Набухание; разрывы. Множественные микроядра; фрагментация ядра Некроз Групповая и случайная деградация ядерной ДНК - Митотическая катастрофа Старение Различные гетерохроматические структуры (ассоциированные со старением гетерохроматические фокусы) Каспазо- независимая; увеличенная лизосомальная активность Каспазо- независимая (в ранней стадии) активация CDK1/ циклина B Каспазо-зависимый Электронная микроскопия; исследование белковой деградации; исследование транслокации маркерного белка к аутофагическим мембранам; MDC-окрашивание. Электронная микроскопия; исследование митотических маркеров (MPM2); TUNEL-окрашивание. Электронная микроскопия; TUNELокрашивание; аннексиновое окрашивание; исследования активности каспазы; исследование фрагментации ДНК; обнаружение увеличенного числа клеток в subG1/G0 фазах; обнаружение изменений в потенциале митохондриальных мембран. Методы обнаружения - Электронная микроскопия; окрашивание ядра (обычно негативное); определение воспаления и повреждений в окружающих тканях Биохимические особенности Активность SA-β-gal (бета-галактозидаза, связанная со старением) Электронная микроскопия; SA-β-galокрашивание; исследование ростового ареста; исследования увеличенных уровней p53, INK4A и ARF (обычно повышены); исследование RB-фосфорилирования (белок ретинобластомы обычно гипофосфорилирован); исследование активности металлопротеиназ (обычно повышена) 16 Ряд авторов полагает, что ФНО проявляет цитотоксическое действие главным образом или только через взаимодействие с 55 кДа рецептором. Через его активацию происходит также индукция синтеза цитокинов, простагландинов и пролиферация клеток. 75 кДа рецептор играет вспомогательную роль и «представляет» ФНО, находящийся в низких дозах, для 55 кДа рецептора. Пострецепторные механизмы включают через активацию транскрипционного фактора ядра NF-kB транскрипцию генов, программирующих самодеструкцию, и активацию группы Ser/Thr-протеин-киназ, тирозин фосфатазу и фосфолипазу А2, через активацию G-белков, чувствительных к коклюшному токсину. Эти процессы приводят к образованию арахидоновой кислоты, инозитол фосфатов, диацилглицерина, фосфатидиловой кислоты и их производных. Эти метаболиты прямо или опосредованно активируют новые биохимические пути, включая и продукцию митохондриальных радикалов, которые, в конечном счете, и определяют гибель клетки. Однако эта картина имела много белых пятен и была далека от завершения [Beyaert, Fiers, 1994]. Некоторые участники процесса апоптоза показаны на рис. 4. После связывания ФНО с рецептором на поверхности клетки-мишени индуцируется внутриклеточный каскад цитотоксических реакций. Происходит опосредованная G-белком активация фосфолипаз, образование свободных радикалов и разрушение ДНК ядра клетки нуклеазами, в конечном счёте, клетки претерпевают апоптоз и погибают [Larrick, Wright, 1990]. ФНО – не только мощный индуктор апоптоза, он также воздействует на переход клеток через фазы клеточного цикла. Вообще, судьба клетки зависит от множества в большинстве своем пока неизвестных факторов. Еще до 90-х годов 20-го века о программируемой клеточной смерти (апоптозе) мало кто знал, общеизвестным был некроз, а теперь в науке речь уже идет о выборе из пяти типов клеточных смертей (табл. 1) [Okada, Mak, 2004] (рис. 5). Рис. 5. Факторы, влияющие на судьбу опухоли. 17 На чувствительных к ФНО клеточных линиях Me-180 и MCF-7 и резистентной линии TCC-Sup показана хорошая линейная корреляция, указывающая, что высокими уровнями c-Myc обладают клетки, чувствительные к апоптозу [Baisch, 2001]. При исследовании влияния ФНО на экспрессию и активность антиоксидантных ферментов показана индукция Mn-супероксиддисмутазы у линий устойчивых опухолевых клеток и продукция супероксида, возможно, путем активации NADPH-зависимой оксидазы у чувствительной линии клеток [Wong et al., 1989]. В возникновении апоптоза опухолевых клеток под воздействием ФНО не последнюю роль играет экспрессия в этих клетках онкогенов, продукты которых являются ростовыми регуляторами. Так повышенный синтез белков генов p53 и c-mic ведет к развитию апоптоза после воздействия на клетку ФНО. А экспрессия генов bcl-2 и A-20 блокирует апоптоз [Fernandez еt al., 1994]. ФНО вызывает продукцию ИЛ-1 клетками эндотелия сосудов и вместе с ним влияет на экспрессию тромбомодулина на поверхности эндотелия и прокоагулянтную активность. Эти процессы могут приводить к диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, наблюдаемой при сепсисе и различных неопластических заболеваниях [Stern et al., 1985, Nawroth, Stern, 1986]. При взаимодействии ФНО с клетками HUVE эндотелия человека происходит включение экспрессии генов первичного ответа, среди которых идентифицированы гены поверхностных рецепторов: эндотелиальной-лейкоцитарной адгезивной молекулы-1 (ELAM-1) и внутриклеточной адгезивной молекулы-1 (ICAM-1), которые определяют адгезию лейкоцитов и их трансэндотелиальную миграцию. Кроме этого происходит активация экспрессии генов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и моноцит хемотаксического фактора, которые определяют местные воспалительные реакции и нарушают нормальную антикоагулянтную поверхность эндотелия [Wolfetal., 1992]. На последующих рисунках представлен гипотетический механизм ФНО уничтожения солидных опухолей путем «геморрагического некроза» [Van Horssen et al., 2006] (рис. 9-11). Рис. 6. Последовательные этапы в развитии опухолевого ангиогенеза. Возникающая опухоль в стадии 1 начинает секретировать ангиогенные ростовые факторы (GF) после срабатывания “ангиогенного выключателя”, который достигается разбалансом между про- и анти-ангиогенными факторами. Росто- 18 вые факторы активируют эндотелиальные клетки, окружающие сосуды, и клетки начинают мигрировать (стадия 2) и пролиферировать в сторону опухоли. Эндотелиальная концевая клетка (TC) руководит этим процессом роста сосудов (стадия 3). В стадии 4 новый росток сформировал полость сосуда, и опухоль оказалась связанной с сосудистой сетью, что гарантирует её рост и возможность метастазировать гематогенно. Сокращение: ECM - внеклеточная матрица[Van Horssen et al., 2006]. Рис. 7. Различия между здоровым и опухолевым эндотелием и предложенный механизм противоопухолевого эффекта ФНО. (A): Схематическое представление сосуда со здоровым эндотелиальным слоем (верхний) и опухолевым эндотелиальным покровом (нижний). Здоровый эндотелий - непрерывный слой эндотелиальных клеток, закрытых перицитами и тонкой базальной мембраной. Проницаемость низка, и транссудация под сильным контролем. Напротив, опухолевый эндотелий не состоит из непрерывного покрова эндотелиальных клеток; он лишен покрытия перицитами, и базальная мембрана утолщается. Этот фенотип приводит к большей проницаемости опухолевого сосуда (малые стрелки). Выдвигается гипотеза, что опухолевый эндотелий имеет более высокий уровень экспрессии TNFR-1 из-за действия стимулирующих и ростовых факторов, синтезируемых клетками, окружающими сосуд. (B): При лечении ФНО методом изолированной региональной перфузии здоровый эндотелий остается интактным, потому что является ФНО-нечувствительным вследствие низкой экспрессии TNFR-1 на мембране. Опухолевый эндотелий эффективно связывает ФНО, который воздействует на эндотелиальный фенотип и индуцирует апоптоз в этих эндотелиальных клетках. Эти два процесса приводят к индукции высокой проницаемости сосуда (большие стрелки). В результате химиопрепарат хорошо проникает в опухоль, а сильная транссудация эритроцитов приводит к массивному геморрагическому некрозу опухоли. Таким образом, происходит целенаправленная регрессия опухолевых сосудов, которые становятся не функциональными [Van Horssen et al., 2006]. 19 Рис. 8. Противоопухолевые и антисосудистые эффекты ФНО при лечении изолированной региональной перфузией (ИРП) пациентов с саркомами и меланомами. (A): Магнитно-резонансное изображение пациента с леиомиосаркомой в верхней части бедра показывает опухоль до лечения (слева). Спустя пять недель после ИРП ФНО и мелфаланом нет накопления гадолиния в остатках опухоли (справа). Когда остатки опухоли были резецированы, опухоль была полностью некротизирована. (B): Ангиографии двух пациентов с быстро растущими саркомами в ноге до (слева) и после (справа) ИРП ФНО и мелфаланом. Ангиографии ясно показывают хорошо развитую опухолевую сосудистую сеть до ИРП, которая была выборочно разрушена после лечения, в то время как нормальные сосуды присутствуют и интактны. Оба пациента были классифицированы, как имеющие полные клинические ответы [Van Horssen et al., 2006]. Естественные киллерные клетки (ЕКК) используют связанный с мембраной ФНО для осуществления лизиса клеток-мишеней, но в отличие от макрофагов не сохраняют цитолитическую активность после фиксации параформальдегидом. Лизис не возрастает, если перед фиксацией проводят инкубацию с липополисахаридом или рекомбинантным ФНО. Видимо существует несколько путей использования ФНО в киллинге опухолей различными эффекторными клетками [Vanderslice, Collins, 1991]. Показано, что ФНО, ИЛ-2 или ИЛ-4 превращают нецитолитические ЕКК в клетки, осуществляющие медленный лизис, но не влияют на быстрый. Активированные ЕКК синтезируют в больших количествах ФНО, ИФН-гамма, ГМ-КСФ, Г-КСФ и ИЛ-3 [Karre et al., 1991; Ting, Hargrove, 1991]. Рис. 9. Участники врожденного и адаптивного иммунитета. 20 Резистентные к лизису ФНО опухолевые клетки (К562) лизируются моноцитами, экспрессирующими мембрано-ассоциированный ФНО. Фиксированные формальдегидом моноциты или их мембраны цитотоксичны для клеток-мишеней. Обработка моноцитов ИФН-гамма приводит к усилению цитотоксичности живых и фиксированных клеток или их экстрагированных мембран. ИФН-гамма модулирует уровень ФНО и его рецептора на мембранах моноцитов. Антитела к ФНО или к его рецептору (htr-9, анти-R55) ингибируют эту цитотоксичность. Инкубация эффекторных клеток с экзогенным ФНО до фиксации формальдегидом повышает их цитотоксичность. Инкубация клеток-мишеней с ФНО не влияет на уровень цитолиза, осуществляемого эффекторными клетками. Сделан вывод, что ФНО-рецептор на эффекторных клетках, но не на клетках-мишенях играет важную роль в ФНО-опосредуемой цитотоксичности моноцитов [Peck et al., 1991]. Участие клеток иммунной системы и цитокинов в распознавании и уничтожении раковых клеток схематично показано на рисунках 9 и 10. Подробнее об этом можно прочесть: Glenn Dranoff. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nature Reviews, Cancer, 2004; 4: 11-22. Рис. 10. Клетки иммунной системы и цитокины, участвующие в распознавании и уничтожении раковых клеток. 21 Следует отметить, что не все опухолевые клетки чувствительны к цитотоксическому или цитостатическому действию ФНО. Было обнаружено, что устойчивые клетки сами продуцируют эндогенный ФНО. При этом ингибирование синтеза РНК или белка делает резистентные клетки чувствительными к ФНО. Кроме того, предварительная обработка invitroклеток низкими дозами ФНО снижает их чувствительность к ФНО и на этом эффекте основан метод получения ФНОрезистентных линий клеток. При этом было показано, что низкие дозы экзогенного ФНО вызывают синтез эндогенного ФНО. Для доказательства того, что эндогенный ФНО является одним из факторов ФНОрезистентности клеток, был использован метод трансфекции генов в опухолевые клетки. В ФНО-чувствительные L-M клетки липофекцией была введена плазмида pcDV-TNF, кодирующая синтез ФНО человека. Через 36 часов в культуральной среде трансфецированных клеток определялось 7,8 ЕД/мл активности ФНО. Стабильный трансфектант при последующих исследованиях был полностью резистентен к ФНО. Низкочувствительные к ФНО клетки HeLa, продуцирующие эндогенный ФНО были трансфецированы плазмидой pcDAN-8B, кодирующей антисмысловую ФНО м-РНК. Трансфектанты продуцировали значительно меньшие количества эндогенного ФНО и были более чувствительны к цитотоксической активности экзогенного ФНО [Himeno et al., 1990]. В резистентности клеток к ФНО ключевыми могут являться другие факторы, например: увеличение внутриклеточного уровня глютатиона [Zimmerman et al., 1989] и Mnсупероксид дисмутазы [Wong et al., 1989]. В частности высокочувствительные к ФНО раковые клетки, трансфецированные ФНО-геном и экспрессирующие эндогенный ФНО, стали резистентны к экзогенному ФНО, при этом у них произошло повышение активности внутриклеточной Mn-супероксид дисмутазы [Okamoto et al., 1992]. Кроме этого на резистентность клеток к ФНО влияют продукты генов ИФН-β2 (ИЛ6) [Defilippi et al., 1987], гена HER2/ERBB2 [Hudziak et al., 1988],а также 14700 Да белок Е3-региона аденовируса [Gooding et al., 1988]. Для изучения ангиогенеза была разработана модельная система, в которой микроваскулярные фрагменты и миофибробласты, изолированные из жировой ткани, выращивают в совместной культуре. Показано, что миофибробласты индуцируют формирование капилляров, продуцируя эндотелиальный клеточный ростовой фактор и секретируя внеклеточную матрицу, которая заставляет эндотелиальные клетки формировать подобную шнуру структуру. В этой системе ФНО-альфа, ЛТ и ИФН-гамма не только значительно замедляли капиллярный рост, индуцированный миофибробластами, но также блокировали капиллярное развитие, индуцированное фибробластными ростовыми факторами (FGF), известными как мощные ангиогенные факторы. Было найдено, что тромбоцит-производный ростовой фактор (PDGF) усиливает формирование капилляров invitro, вероятно частично, действуя на миофибробласты. Также как и с FGF, капиллярный рост в наличии PDGF был почти полностью блокирован ИФН-гамма. Был исследован способ, которым ИФН-гамма ингибирует ангиогенез и обнаружено, что ИФН-гамма ингибирует и пролиферацию эндотелиальных клеток, и синтез коллагенов миофибробластами. Через эти действия ФНО или ИФН-гамма могут ограничивать формирование сосудов в солидных опухолях [Sato et al., 1990]. 22 Региональное введение больших доз ФНО, ИФН-гамма и мелфалана пациентам с распространенным раком конечностей (см. «Клиническое применение ФНО») приводит к быстрому и специфичному опухолевому некрозу, в то время как нормальные смежные ткани остаются незатронутыми. Опухолевая сосудистая сеть выборочно разрушается этим лечением, и эндотелиальные клетки, кажется, являются ранней и специфичной целью для ФНО и ИФН-гамма. Чтобы проверить это действие, исследовали ответ человеческих макро- и капиллярных эндотелиальных клеток invitro на экспозицию с большими дозами ФНО и ИФН-гамма (до 40000 ЕД/мл каждого). ФНО и ИФН-гамма синергично замедляли эндотелиально-клеточную пролиферацию до 80% после 72 часов лечения. Эффекты на эндотелиально-клеточную пролиферацию и морфологию были обратимы после удаления цитокинов. В отличие от эффекта на клеточную пролиферацию, не было никакого эффекта на эндотелиально-клеточный апоптоз. Представленные данные предполагают, что разрушение invivo опухолевой сосудистой сети, вызванной большими дозами ФНО и ИФН-гамма, не является следствием их прямого цитотоксического эффекта на эндотелиальные клетки [Yilmazetal., 1998]. Показано, что роль макрофагов в опухолевом ангиогенезе состоит во влиянии на продукцию ангиогенных цитокинов и ростовых факторов. Недавно было найдено, что макрофаги продуцируют ИФН-гамма, который включен в ангиогенное ингибирование. Таким образом, макрофаги в опухолевом ангиогенезе могут быть ангиогенными выключателями. Резидентные макрофаги из брюшной полости C57BL/6 мышей, инокулированных клетками B16F10 меланомы, не отвечали на ЛПС или ФНО-альфа воздействие, чтобы продуцировать ИФН-гамма. Макрофаги из опухолевого окружения продуцировали ИФН-гамма и VEGF. Однако после добавления ЛПС или ФНО-альфа к макрофагам из опухолевого окружения наблюдалось повышение продукции ими ИФН-гамма и ингибирование опухолевого ангиогенеза. Сделано заключение, что макрофаги в опухолевом окружении могут играть важную роль в ангиогенном и в антиангиогенном сигнале, продуцируя различные цитокины. При этом, ФНО-альфа может быть ключевым цитокином, функционирующим как ангиогенный выключательв опухолях [Lee et al., 2006]. Противоопухолевое действие (доклинические исследования) Спектр чувствительности опухолевых клеток к ФНО Рекомбинантный ФНО человека обладает противоопухолевой активностью на широком спектре опухолевых клеток. В частности, оказывает цитостатическое действие invitro (более 50% ингибирования включения 3Н-тимидина) на линиях клеток карци¬ном (PC-10, ZR-75-1, ZR-75-30, PANC-1, MCF-7), меланомы (G-361), лейкемий (Namalwa, CCRF-SB, Molt-3, K-562), леиомиобластомы G-402. На некоторых линиях опухолевых клеток (карциномы PC-10, ZR-75-1, PANC-1, MCF-7) ФНО проявляет цитотоксический эффект, вызывая выход более 50% 3Н-тимидина из меченных клеток. Однако, на многих других линиях клеток, на которых отмечали цитостатическое действие ФНО, лизис был минимальным или практически отсутствовал. На одних линиях клеток (ZR-75-1, 23 PANC-1) отмечено дозозависимое влияние ФНО, на других (РС-10, MCF-7) дозы от 1 до 1000 ЕД/мл оказывают практически одинаковое действие. Показано, что нормальные диплоидные клетки легкого WI-38 резистентны к ФНО. Однако, при их трансформации вирусом SV-40, клетки WI-38 VA13 становятся чувствительными к цитостатическому или цитотоксическому действию ФНО [Nakano et al., 1986]. ФНО индуцирует геморрагический некроз и ингибирование роста трансплантированных опухолей invivo, а также увеличение времени выживания животных. Эффект наблюдается как на мышиных опухолях (саркома MethA, меланома В-16, аденокарцинома Colon-26, гепатома МН-134), так и на опухолях человека (мела-нома HMV-2, нейробластома GOTO, карцинома легкого PC-10), трансплантированных nude-мышам. При этом наибольший эффект наблюдался при внутриопухолевом введении ФНО. Удивительно, но нейробластома GOTO, резистентная к действию ФНО invitro, чувствительна invivo [Sohmura et al., 1986]. Опухолевые клетки, выращенные из свежих образцов биопсий от 102 пациентов со злокачественными новообразованиями, были обработаны invitro фармакологически достижимыми дозами рекомбинантного ФНО. 68 опухолевых образцов были также проверены с рекомбинантным человеческим ИФН-гамма и комбинацией ФНО и ИФН-гамма. ФНО показал дозозависимый и зависимый от типа опухоли противоопухолевый эффект. Чувствительность к ФНО в дозах меньше чем 100 ЕД отмечена у 28% проверенных опухолей. Более высокая, чем средняя, частота чувствительности наблюдалась у клеток колоректальных опухолей и рака легкого. Устойчивость к ФНО отмечена у 42% опухолей, включая 52% образцов овариального рака. Комбинация ФНО и ИФН-гамма часто приводила к большему противоопухолевому эффекту чем, наблюдаемому с любым отдельным цитокином; аддитивные эффекты отмечены у 62% образцов, проверенных с комбинацией препаратов. Антагонизм между ФНО и ИФН-гамма наблюдался на 18% образцов опухолей. В целом, комбинация ФНО и ИФН-гамма уменьшала дозу ФНО, требуемую для значительной противоопухолевой активности, примерно в три раза. Был сделан вывод, что ФНО перспективен для клинических испытаний II фазы с определенным акцентом на колоректальном раке и раке лёгкого. Исследование комбинации ФНО и ИФН-гамма будет представлять интерес для лечения эндометриального рака и рака молочной железы [Salmon et al., 1987]. Была исследована противоопухолевая активность ФНО против различных культивируемых человеческих раковых клеток (32 случая). Более чем 50%-ая чувствительность была отмечена в 4 из 14 случаев желудочного рака (28,6%), 7 из 9 случаев лейкозных клеток (77,8%) и по 1 случаю панкреатической карциномы и овариального рака [Watanabe et al., 1985]. Линии клеток мезотелиомы человека, установленные от первичных опухолей, не отвечали invitro ни на ФНО, ни на ИФН-гамма, но их рост ингибировался комбинациями ФНО и ИФН-гамма на таких низких концентрациях, как 5 нг/мл. Напротив, линия клеток мезотелиомы, установленная от метастатической опухоли, была чувствительна к ИФНгамма и к его комбинации с ФНО, но не к ФНО отдельно. Эти клеточные линии были чувствительны также к ИФН-альфа, но ещё более чувствительны к комбинации ФНО и 24 ИФН-альфа. Был сделан вывод, что комбинации низких доз этих цитокинов достойны клинического исследования в терапии мезотелиомы [Hand et al., 1991]. Чувствительность клеток опухолей нервной системы к ФНО Испытывали эффект ФНО, ИФН-гамма и их комбинации на клоногенном росте клеточных линий и первичных культур злокачественных опухолей мозга человека. Из 29 изученных первичных культур 5 замедляли рост на 50% или больше от ИФН-гамма (10 нг/мл), 6 замедляли рост на 50% или больше от ФНО (10 нг/мл) и 14 замедляли рост на 50% или больше от комбинации ИФН-гамма (10 нг/мл) и ФНО (10 нг/мл). Дозы, используемые в этом изучении invitro, достижимы в сыворотке после внутривенного введения ИФН-гамма и ФНО, не вызывая недопустимых побочных эффектов. Сделано предположение, что некоторые пациенты с глиомами и с мозговыми метастазами получат пользу от лечения ИФН-гамма, ФНО и от их комбинаций. Пациенты должны быть отобраны для лечения этими препаратами по результатам чувствительности invitro [Helseth et al., 1989]. ФНО в высоких (256 ЕД/мл) дозах не проявлял цитотоксической активности invitro на клетках глиобластомы, но в низких дозах 10 ЕД/мл стимулировал продукцию простагландина-E2, Mn-супероксиддисмутазы, ИЛ-6 и ИЛ-8 этими клетками, обуславливая антипролиферативное действие. При проведении I-ой фазы клинических испытаний, шести пациентам с глиобластомой ФНО вводили интракраниально. В спинномозговой жидкости время полувыведения ФНО составило несколько часов. Пик активности ИЛ-8, увеличения уровня ИЛ-6, ИЛ-1β, простагландина-Е2 и миграция нейтрофилов в СМЖ наблюдались через 8-12 часов после введения ФНО [Tada et al., 1993]. Чувствительность клеток опухолей головы и шеи к ФНО Чтобы оценить эффект ФНО на плоскоклеточных карциномах, использовали 6 установленных клеточных линий, производных от плоскоклеточных карцином пищевода: TE1, -2, -3, -4, -5 и -7, а также линии L-M, FL, WISH, HEp-2 andTHP-1. HEp-2 производная линия от рака гортани человека, L-M, TE-3 и TE-4 были чувствительны к ФНО, в то время как THP-1, TE-1, -2, -5 и -7 были резистентны. Линии TE-2 и TE-3 были чувствительны к ИФН-гамма. Комбинированное использование этих двух цитокинов привело к аддитивному ингибирующему эффекту на TE-2 и -3, но никакого значительного синергичного эффекта на линиях TE-1, -2, -3 или -4 не наблюдалось [Suzuki et al., 1989]. 12 клеточных линий плоскоклеточных карцином головы и шеи использовались для определения антипролиферативной активности ФНО-альфа, ИФН-гамма и ИФН-альфа invitro в колориметрическом MTT-анализе. Все 12 клеточных линий были чувствительны к ИФН-гамма с 50%-ой ингибирующей дозой в пределах от 0,07±0,01 до 104±5 ЕД/мл. ФНО показал антипролиферативную активность на трех клеточных линиях в относительно больших дозах от 55±4 до 847±10 ЕД/мл, а ИФН-альфа был ингибирующим только для одной линии в дозе 1211±46 ЕД/мл. Комбинация ИФН-гамма и ФНО имела синергичный антипролиферативный эффект на восьми и аддитивный эффект на двух клеточных ли- 25 ниях. У двух клеточных линий эффект комбинации был равен ИФН-гамма. Комбинация ИФН-альфа и ФНО привела к синергичному клеточному торможению роста на шести из семи проверенных линий [Sacchi et al., 1991]. Чувствительность клеток опухолей лёгкого к ФНО Человеческие клеточные линии рака легкого PC-7 и PC-9 (аденокарциномы), PC-10 (плоскоклеточная карцинома) и PC-13 (крупно-клеточная карцинома) были исследованы на ингибирующие эффекты ФНО, ИФН-альфа, ИФН-бета и ИФН-гамма по одному или в комбинации. ФНО ингибировал формирование колоний PC-10 даже на низкой концентрации (10 ЕД/мл), однако, PC-7, PC-9 и PC-13 были резистентны к ФНО. ИФН-альфа, ИФН-бета и ИФН-гамма замедляли формирование колоний PC-10 менее чем на 50% даже на самой высокой проверенной концентрации (10000 ЕД/мл). ИФН-бета ингибировал рост PC-7. PC-9 и PC-13 были нечувствительны ко всем трем ИФН-ам даже на самых высоких проверенных концентрациях. Комбинированные эффекты ФНО и ИФН-альфа или ИФН-гамма были синергичны только на самых высоких концентрациях, проверенных на PC-9. Однако, максимальное ингибирование формирования колонии PC-7, PC-9 или PC-13 в любой комбинации было меньше чем 50% [Hong et al., 1987]. Ингибирующий эффект ФНО и ИФН-гамма был оценен на четырех человеческих линиях клеток рака легкого и их устойчивых к цисплатину подлиниях. Клеточные линии PC-7 и PC-9 (аденокарциномы), H69 и N231 (мелкоклеточный рак легкого) и 4 устойчивые к цисплатину подлинии PC-7/1.0, PC-9/0.5, H69/0.2 и N231/0.2, которые были 20,0, 7,1, 4,8 и 8,4 кратно резистентны к цисплатину, соответственно, по сравнению с соответствующими родительскими клеточными линиями. Все родительские клеточные линии были резистентны к ФНО и ИФН-гамма по отдельности и в комбинации. Однако 2 резистентные к цисплатину подлинии показали чувствительность к ФНО и ИФН-гамма. Формирование колоний PC-9/0.5 значительно замедлялось, в отсутствии или наличии цисплатина и 100 ЕД/мл ФНО, а ингибирование было синергичным с 1000 или 10000 ЕД/мл ИФН-гамма. ИФН-гамма замедлял формирование колоний H69/0.2 только на самой высокой проверенной концентрации (10000 ЕД/мл), при этом эффект комбинации с ФНО был аддитивным. Эти результаты показывают, что ФНО и ИФН-гамма могут иметь некоторый потенциал в преодолении устойчивости опухолевых клеток к цисплатину [Hong et al., 1987]. Чувствительность клеток опухолей молочной железы к ФНО Противоопухолевое действие рекомбинантных ФНО, ИФН-гамма и ИФН-альфа было изучено на “голых” мышах с ксенотрансплантатами рака молочных желез человека, растущих с двух боков мышей. Цитокины были введены отдельно или в комбинации в одну из двух опухолей каждой мыши, чтобы изучить местные эффекты, в то время как противоположную опухоль оставляли интактной, для оценки общего действия. Было проведено по 20 внутриопухолевых инъекций (четыре цикла по 5 ежедневных инъекций). 26 Лучшие результаты были получены от комбинации ФНО с ИФН-альфа или ИФН-гамма. Ответы были дозозависимыми, приводя к полной регрессии 9 из 9 опухолей с ФНО, используемым в дозе 5 мкг на инъекцию, 6 из 8 опухолей при дозе 2,5 мкг и 4 из 8 опухолей при дозе 0,5 мкг. Частичные ответы были замечены в других группах. Общее действие на контралатеральных опухолях были значительно меньше, чем местные эффекты на соответствующих опухолях. Гистологический ответ опухолей показал реактивный фиброз и инфильтрацию клетками, определяющими воспаление. Никакие сосудистые изменения не были замечены, возможно, из-за иммунодефицита “голых” мышей. Сделано заключение, что потенцирование антиопухолевого действия ФНО-альфа в сочетании с ИФНами было эффективно на местном, но не на системном уровне [Ozzello et al,. 1995]. Были исследованы комбинированные эффекты ФНО, ИФН-гамма и тамоксифена (TAM) на пролиферацию линий клеток рака молочной железы человека. В позитивных по эстрогеновым рецепторам MCF-7 клетках, относительно резистентных к TAM и ФНО, цитотоксичность значительно увеличивалась при комбинациях ФНО с ИФН-гамма или цитокин плюс TAM. Цитотоксичность ФНО увеличивалась, когда клетки были предварительно обработаны ИФН-гамма, но не наоборот. Последовательное лечение ИФН-гамма потом ФНО и TAM также показало значительный антипролиферативный эффект. Таким образом, комбинированное или последовательное лечения цитокинами и тамоксифеном возможный метод для преодоления рака молочной железы, нечувствительного к лечению гормонами и тамоксифеном [Matsuo et al., 1992]. Испытывали эффективность ФНО и ИФН-гамма на линиях клеток рака молочной железы человека, особенно сравнивая гормонозависимый и гормононезависимый фенотипы. ФНО замедлял рост гормонозависимых MCF-7, ZR-75-1 и T47-D клеток. Напротив, ФНО не влиял на рост гормононезависимых клеток MDA-MB-231 и HS578T, но синергичное ингибирование наблюдалось при использовании ИФН-гамма и ФНО вместе. М-РНК протоонкогена c-myc, как внутриклеточного индикатора клеточной активации, была значительно увеличена в MCF-7 клетках в присутствии ФНО. В MDA-MB-231 клетках эта c-mycм-РНК была увеличена только в присутствии ФНО и ИФН-гамма, без изменения в количестве поверхностных рецепторов ФНО. Эти результаты показывают, что лечение ФНО в комбинации с ИФН-гамма может обеспечить успешный подход, чтобы преодолеть клеточную гетерогенность распространенных опухолей молочной железы [Mueller et al., 1996]. Чувствительность клеток опухолей желудка к ФНО Изучали эффекты рекомбинантных человеческих ФНО и ИФН-альфа, ИФН-бета и ИФН-гамма по одному или в комбинации на цитотоксичность цисплатина против клеток MKN-45 (человеческая аденокарцинома желудка). MKN-45 резистентна к ФНО в дозах до 1000 ЕД/мл. ИФН-гамма замедлял выживание MKN-45 дозозависимо, в то время как ИФН-альфа и ИФН-бета не ингибировали выживание MKN-45 даже на самых высоких проверенных концентрациях (10000 ЕД/мл). Комбинация ФНО с ИФН-ами значительно не ингибировала выживание MKN-45, за исключением комбинации 10 ЕД/мл 27 ФНО и 1000 ЕД/мл ИФН-гамма (P<0,05). Цисплатин замедлял выживание MKN-45 дозозависимо. При комбинировании цисплатина с ФНО и/или ИФН-альфа, ИФН-бета или ИФН-гамма цитотоксичность цисплатина была увеличена и эффекты были аддитивны. Эффекты ФНО и ИФН-ов на модификацию цитотоксичности цисплатина были оценены в виде индекса модификации (ИМ). Значения ИМ для 1000 ЕД/мл ИФН-альфа, ИФНбета и ИФН-гамма были 1,4, 1,4 и 2,3, соответственно; на тех же самых концентрациях ИФН-альфа, ИФН-бета и ИФН-гамма в присутствии 10 ЕД/мл ФНО были 3,6, 2,5 и 5,1, соответственно. Эти результаты демонстрируют, что цитотоксичность цисплатина может быть увеличена ФНО и/или ИФН-ами, и что рак может более эффективно лечиться комбинацией цисплатина с этими модификаторами биологической реакции, чем цисплатином одним [Kim et al., 1989]. Исследовали активность и механизмы ИФН-альфа и ИФН-гамма на рост TSGH9201, TMK-1 и AGS клеток рака желудка in vitro, измеряя апоптоз по расщеплению ДНК in situ и формированию “лестниц” ДНК при электорофорезе. Эффекты ИФН-ов на клеточный цикл также были проанализированы, используя проточную цитометрию. Уровни Bcl-2 белков после лечения с ИФНами были проанализированы, используя Вестерн-блоттинг. ИФН-альфа и ИФН-гамма были активны в подавлении роста TSGH9201 и TMK-1 клеток, в то время как AGS клетки были резистентные к лечению ИФН-ами. ИК50 ИФНальфа для TSGH9201 и TMK-1 клеток была 300 и 500 ЕД/мл, соответственно, а ИК50 ИФН-гамма была 40 и 2,0 ЕД/мл, соответственно. И ИФН-альфа и ИФН-гамма задерживали клеточный цикл в чувствительных клетках. ИФН-гамма также увеличивает клеточный апоптоз, демонстрируемый по повреждению ДНК insitu и фрагментации ДНК. ИФН-гамма увеличил уровень BAK-белка и снизил уровень Bcl-2 и Bcl-X(S) белков в TSGH9201 клетках. Таким образом, ИФН-альфа и ИФН-гамма подавляют рост раковых клеток желудка через индукцию ареста клеточного цикла, но ИФН-гамма также убивает раковые клетки через апоптоз, который связан с изменением содержания белков Bcl-2, Bcl-X(S) и BAK [Shyu et al., 2000]. Чувствительность клеток опухолей поджелудочной железы к ФНО ФНО проявлял антипролиферативные эффекты на 3 из 9 человеческих панкреатических линиях раковых клеток invitro и на WiDR линии колоректальных раковых клеток. Комбинация ФНО и ИФН-гамма имела антипролиферативные эффекты на 7 из 9 панкреатических линиях раковых клеток, включая те, которые были нечувствительными к ФНО [Schmiegel et al., 1988]. Антипролиферативные эффекты ФНО и ИФН-альфа или их комбинации исследовали на человеческих панкреатических линиях раковых клеток (PANC-1, MIAPaCa-2 andBxPC-3) и человеческой панкреатической раковой опухоли (Exp-58) invitro и invivo. Комбинированная терапия ФНО и ИФН-альфа демонстрировала синергичные и/или аддитивные эффекты в сравнении с раздельным применением препаратов [Watanabe et al., 1993]. 28 Чувствительность клеток опухолей толстой кишки к ФНО Проведена оценка антипролиферативных эффектов ФНО-альфа и ИФН-гамма по одному и в комбинации на 9 линиях клеток карцином толстой кишки человека. Все линии были резистентными к ФНО (<30% ингибирования). К ИФН-гамма 4 клеточные линии были резистентны, 2 показали минимальную степень чувствительности (ингибирование 30-50%), 1 была умеренно и 2 высоко чувствительны (>70%). Синергичный антипролиферативный эффект был получен на 8 из 9 клеточных линий, леченных комбинацией ФНО и ИФН-гамма. В 7 из этих 8, комбинация цитокинов привела к увеличению на 30-40% торможения роста клеток (P<0,005). Данные были далее проанализированы, чтобы определить, изменило ли комбинированное лечение чувствительность клеток к одному или обоим средствам. Комбинация ФНО/ИФН-гамма усиливала активность ФНО на 3 клеточных линиях (P<0,09) и уменьшала активность ИФН-гамма в других трех (P<0,02). Сделано заключение, что комбинация ФНО/ИФН-гамма имеет синергичный цитотоксический эффект на человеческих клетках карциномы толстой кишки. ИФН-гамма усиливает эффективность ФНО на некоторых клеточных линиях, но не наоборот [Schiller et al,. 1987]. В продолжение этих исследований было установлено, что максимальный антипролиферативный эффект на трех линиях клеток карциномы толстой кишки наблюдался, когда ИФН-гамма и ФНО применялись одновременно, независимо от доз каждого и продолжительности экспозиции. Экспозиция клеток с ФНО перед ИФН-гамма привела к наименьшему ингибированию клеточного роста. У всех трех клеточных линий антипролиферативные эффекты каждой группы лечения были связаны непосредственно с продолжительностью экспозиции. У двух из трех клеточных линий прерывистое воздействие было столь же эффективно как 24-х часовая экспозиция. Таким образом, максимальный антипролиферативный эффект у человека с карциномой толстой кишки может быть достигнут длительным одновременным введением высоких концентраций каждого лекарства. Если клиническая токсичность запрещает этот подход, прерывистое расписание введения препаратов может быть также эффективно [Schiller et al,. 1990]. Исследовали 3 линии клеток колоректальных карцином человека (HCT-116, SKO1 и VACO-9P), чтобы изучить ингибирующие эффекты комбинации ФНО и ИФН-гамма в сочетании с 5-фторурацилом (5-ФУ). Концентрации 0,1 мкг/мл 5-ФУ, применяемые в течение 96 часов и 50 мкг/мл, применяемые 1 час, замедляли рост HCT-116 клеток на 20% и 77%, соответственно; SKCO1 клеток на 25% и 66%, а VACO-9P клеток на 25% и 55%, соответственно. Комбинации ФНО и ИФНгамма применяли в течение 1 часа через день в дни 1, 3 и 5 и дополнительно 5-ФУ как указано выше в первый день. Добавление 10 нг/мл ФНО и ИФН-гамма к 0,1 мкг/мл 5-ФУ увеличивало ингибирование роста HCT-116, SKCO1 и VACO-9P клеток на 10%, 5% и 20%, соответственно. Дополнение 10 нг/мл ФНО и ИФН-гамма к 50 мкг/мл 5-ФУ полностью блокировало клеточный рост у всех 3-х клеточных линий. Комбинация 3-х лекарств ФНО, ИФН-гамма и 5-ФУ позволяет достигнуть более высокой противоопухолевой активности, чем раздельное их применение invitro, и эта комбинация перспективна для дальнейшего клинического изучения [Schiller, Bittner, 1990]. 29 Чувствительность клеток опухолей яичников к ФНО Исследования карцином яичников показали, что они могут быть как чувствительными, так и нечувствительными in vitro к ФНО. Комбинации разных концентраций рекомбинантного ФНО с адриамицином (ADR) и цисплатином (CDDP) были проверены на человеческих линиях клеток карцином яичников: PA-1, 222, OVCAR-3, SKOV-3 и OVCAR-8. Минимальные дозы ФНО, которые обладали значительной цитотоксичностью, использовались с оптимальными или подоптимальными концентрациями ADR или CDDP. Синергизм был отмечен на четырех клеточных линиях. Интересно, что резистентная клеточная линия SKOV-3 была чувствительна к синергичному эффекту комбинации адриамицина с ФНО. Синергичный эффект был ФНО-специфичным, так как комбинированное использование ADR и CDDP и рекомбинантного интерлейкина-2 не имело никакого синергичного эффекта на лизис опухолевых клеток. Добавление антител против-ФНО аннулировало синергичный эффект ФНО с цитотоксическими препаратами. Это исследование демонстрирует, что значительная синергичная противоопухолевая цитотоксическая активность против человеческих линий клеток карцином яичников может быть достигнута комбинациями низких доз ФНО сADR или CDDP. С тех пор как ФНО, используемый отдельно, был относительно неэффективным при клинических испытаниях, его потенциальная активность может быть очевидно выше, когда ФНО в относительно низкой концентрации будет объединен с цитотоксическими химиопрепаратами [Bonavida et al., 1990]. Устойчивость раковых клеток молочной железы и яичников к цитотоксическому эффекту ФНО оказалась связана с сверхэкспрессией в них HER2/neu-онкогена. Так были изучены 9 человеческих линий рака яичников и 3 линии клеток рака молочной железы. 3 из овариальных и 1 из линий клеток рака молочной железы показали амплификацию HER2/ neu-гена и соответственно увеличенное количество м-РНК и белка HER2/neu. Другие 8 линий содержали неамплифицированные гены и невыявляемые м-РНК и белок. Все 4 сверхэкспрессирующие HER2/neu линии были резистентны к цитотоксическим эффектам ФНО. Интересно, что они были также резистентны к лимфокин-активированным киллерным клеткам. Напротив, 7 из 8 неэкспрессирующих HER2/neu линий показали чувствительность к ФНО, и все 8 были чувствительны к лимфокин-активированным киллерным клеткам [Lichtenstein et al., 1990]. Сверхэкспрессия протоонкогена c-erbB-2 (HER-2/neu) в овариальной и грудной карциноме - важный индикатор плохого прогноза. На 3-х из четырех линий клеток карциномы яичников показано, что обработка ИФНом-гамма привела к специфичному снижению уровня HER-2/neu-белка, и этот эффект коррелировал с антипролиферативным действием. Интересно, что нет никакого соотношения между абсолютным количеством экспрессированного HER-2/neu-белка и чувствительностью клеток карциномы яичников к антипролиферативной активности ИФН-гамма. Другие химиотерапевтические средства не воздействовали на HER-2/neu-экспрессию, хотя и ингибировали пролиферацию. Экспрессия онкогена снижалась только на линиях клеток карциномы яичников, но не на 3-х чувствительных к ИФН-гамма человеческих линиях клеток рака молочной железы [Marth et al., 1990]. Оказалось, что и ИФН-альфа и ИФН-омега, также как и ИФН-гамма, 30 уменьшали экспрессию гена HER-2/neu на линиях клеток карцином яичников OVCAR-3, HTB-77, 2774 и SKOV-6 и на SKUT-2 клетках эндометриальной карциномы. Напротив, SKOV-8 человеческие клетки карциномы яичников были чувствительны к ингибированию пролиферации обоими типами ИФН-ов, но только ИФН-гамма уменьшал экспрессию протоонкогена. На клетках SKBR-3 карциномы молочной железы человека никакие ИФН-ы не имели эффекта на экспрессию HER-2 [Marth et al., 1992]. Рост трёх из 4 линий клеток карцином яичников (OVCAR-3, HTB-77, CRL-1572) был ингибирован ИФН-гамма. Комбинация ИФН-гамма с цисплатином давала или аддитивное или синергичное усиление антипролиферативной активности на этих клетках, тогда как комбинации цисплатина с ФНО-альфа привели к синергизму во всех случаях [Marth et al., 1989]. Четыре человеческие клеточные линии, производные от цервикальных карцином (ME-180, SiHa, HT-3 и MS751), и 3 клеточные линии, производные от карцином яичников человека (SK-OV-3, CAOV-3 и NIH:OVCAR-3), были проанализированны invitro для определения эффектов ИФН-гамма и ФНО на рост и выживание клеток. Результаты показали, что все семь клеточных линий были резистентны к антипролиферативному действию ФНО, а рост большинства клеточных линий был ингибирован ИФН-гамма, кроме того, все клеточные линии продемонстрировали синергичный антипролиферативный ответ на комбинацию ИФН-гамма и ФНО. Однако, рост одной клеточной линии CAOV3 стимулировался и ИФН-гамма и ФНО [Mutch et al., 1990]. Эти же самые клеточные линии плюс производная от человеческих цервикальных карцином линия C-33A были обработаны ФНО, ИФН гамма и их комбинацией с ингибиторами синтеза белка invitro. Результаты показали, что предварительная обработка клеток ИФН-гамма,а затем ФНО в присутствии ингибиторов синтеза белка увеличила лизис семи из восьми клеточных линий. Только клеточная линия C-33A была резистентна к лизису ФНО и ИФН-гамма по одному или в комбинации с ингибиторами синтеза белка [Massad et al., 1991]. Исследованы 4 линии клеток опухолей яичника человека A2780, AD10, OVC-8 и SKOV-3 на чувствительность к ФНО и цитостатику доксорубицину. Линия AD10 имела фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Комбинация ФНО и доксорубицина увеличивала цитотоксичность на всех линиях клеток, при этом воздействие ФНО не влияло на уровень м-РНК МЛУ [Safrit et al., 1993]. Комбинированный эффект таксола и ФНО на клеточных линиях CAOV-3, SK-OV-3, NIH:OVCAR-3 и A2780, чувствительных к цитолитическому эффекту ФНО в присутствии ингибиторов синтеза белка, был исследован. В терапевтических концентрациях таксол вызвал значительное увеличение цитолиза ФНО клеток CAOV-3 и A2780 (p<0,05), но уменьшение цитолиза клеток SK-OV-3 и NIH:OVCAR-3 (p<0,01). Эти результаты показывают, что карциномы яичников имеют гетерогенный ответ на химиотерапевтический эффект таксола [Williams et al., 1992]. Исследования ФНО и пяти химиотерапевтических средств CTX, 5-FU, VCR, DDP, KSM против клеток OVCAR3 и CAOV3 показали, что цитотоксичность ФНО в концентрациях 5x104 и 5x107 ЕД/л против OVCAR3 клеток была 14,2±6,8% и 67±3% и против CAOV3 клеток 8,2±4,3% и 60,9±1,3%, соответственно. Цитотоксические эффекты всех 31 пяти химиотерапевтических средств против двух клеточных линий были намного ниже, чем ФНО. Были отмечены различные степени синергичного повышения цитотоксичности комбинации ФНО с DDP или KSM [Zhao, 1993]. Исследование ИФН-гамма и ФНО-альфа по усилению цитотоксического действия цисплатина проведено на овариальных опухолевых клетках (OAW42, GG, JA Mand PE01). Когда ИФН-гамма использовался в комбинации с цисплатином, значительное повышение токсичности цисплатина произошло на трех из четырех клеточных линий. ФНО демонстрировал такой эффект на двух клеточных линиях, но уменьшил токсичность цисплатина на одной клеточной линии. В большинстве случаев комбинаций препаратов наблюдался аддитивный эффект, однако, на PEO1 клеточной линии и ФНО-альфа и ИФН-гамма демонстрировали синергичный эффект с цисплатином. Эти цитокины, используемые в сочетании с цисплатином могут обеспечить лучший противоопухолевый режим, чем лечение одним цисплатином некоторых пациентов с раком яичников, но противоопухолевый ответ, вероятно, будет гетерогенным между пациентами [Clark et al., 1994]. ФНО, эндогенно секретируемый человеческими овариальными линиями раковых клеток, очень эффективен в увеличении активности ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (доксорубицин, митоксантрон, VP16). Необходимо отметить, что активность винбластина и блеомицина при этом не изменяется, а активность цисплатина ингибируется. Эти результаты подсказывают важный метод в терапии рака яичников человека, сопровождаемого эндогенной секрецией белка ФНО, которую считают негативным прогностическим фактором [Debernardis et al., 1996]. Чувствительность клеток опухолей предстательной железы к ФНО Человеческий рекомбинантный ФНО-альфа в концентрации 10-12 и 10-8 M замедлял пролиферацию андроген-зависимых LNCaP клеток предстательной железы на 32-56%, а пролиферация андроген-независимых PC-3 и JCA-1 клеток замедлялась незначительно или не замедлялась совсем, соответственно. Обратная картина наблюдалась с ИФН-гамма (500 ЕД/мл), который снижал пролиферацию PC-3 и JCA-1 клеток на 35% и 53%, соответственно, но не имел никакого эффекта на LNCaP клетках. Комбинация ИФН-гамма и ФНО имела значительные антипролиферативные эффекты на JCA-1 клетках, чем лечение любым из цитокинов. Однако, антипролиферативные эффекты этой комбинации для PC3 или LNCaP клеток были подобны воздействию ИФН-гамма или ФНО по одному, соответственно. Эти данные показывают, что различные формы рака простаты могут подвергаться комбинированной терапии ИФН-гамма и ФНО [Nakajima et al., 1995]. Чувствительность клеток опухолей матки к ФНО Эффекты рекомбинантных человеческих ФНО и ИФН-гамма против пролиферации 4-х линий клеток человеческих гинекологических опухолей (HHUA, ISHIKAWA, HeLa S3 и SCH) были исследованны invitro. ISHIKAWA и SCH клетки были очень чувствительны к ФНО, HHUA клетки показали минимальную степень реактивности к ФНО, а 32 HeLa S3 клетки были нечувствителены к ФНО. HHUA, HeLa S3 и SCH клетки были дозозависимо чувствительны к ИФН-гамма, а ISHIKAWA клетки были нечувствительны к ИФН-гамма. Синергичный антипролиферативный эффект комбинации ФНО и ИФНгамма проявился на HHUA, ISHIKAWA и HeLa S3 клетках. Эффективность ФНО увеличилась на этих клеточных линиях, когда был предварительно введен ИФН-гамма, но не наоборот. ИФН-гамма не изменял аффинность связывания рецепторов ФНО на 4-х клеточных линиях, но увеличил количество ФНО-связывающих сайтов на HeLa S3 и SCH клетках. Эти результаты показывают, что нет никакой зависимости между увеличением ФНО-связывающих сайтов на клетках, которое вызывает ИФН-гамма, и синергичным антипролиферативным эффектом ИФН-гамма и ФНО. Предположили, что комбинированная терапия ИФН-гамма и ФНО будет новым подходом для лечения гинекологического рака [Mori et al., 1989]. Исследовали противоопухолевые эффекты рекомбинантных ИФН-гамма и ФНО на линиях клеток цервикальных аденокарцином человека in vitro и in vivo. Четыре из пяти клеточных линий показали высокую чувствительность к ИФН-гамма in vitro. Одна из пяти клеточных линий показала замечательную чувствительность к ФНО in vitro. Только одна клеточная линия из хорошо-дифференцированной аденокарциномы эндоцервикального типа была резистентна и к ИФН-гамма, и к ФНО. Эксперименты с использованием “голых” мышей, несущих пересаженные опухоли, показали, что эти цитокины были также эффективны против опухолей in vivo. Эти наблюдения предполагают, что ИФН-гамма и ФНО могут иметь позитивные эффекты в лечении пациентов с аденокарциномой шейки матки [Iwasaka et al., 1991]. Чувствительность трех клеточных линий цервикальных карцином SiHa, ME-180 и C33A к ИФН-альфа, ИФН-гамма, ФНО и цисплатину была проверена in vitro. Все три клеточные линии продемонстрировали различную чувствительность к цисплатину и цитокинам. ИФН-ы и ФНО при использовании в комбинации с низкой дозой цисплатина показали значительное повышение цитотоксического действия на всех клеточных линиях [Verma et al., 1996]. Чувствительность клеток опухолей мочевого пузыря к ФНО Исследована активность ИФН-альфа, ИФН-гамма и ФНО в концентрациях 100-10000 ЕД/мл на 10 человеческих линиях опухолевых клеток мочевого пузыря. ИФН-альфа был активен против пяти из десяти линий, в то время как ИФН-гамма был активен только против одной линии, а ФНО против пяти из десяти линий. Максимальные синергичные эффекты были получены от комбинации ИФН-альфа и ФНО на девяти из десяти клеточных линий. Сделано заключение, что ИФН-альфа и ФНО активны как отдельные средства и ещё более активны, когда используется вместе на человеческих линиях опухолевых клеток мочевого пузыря in vitro [Niell et al., 1994]. 33 Чувствительность клеток опухолей костей к ФНО Остеосаркома - первичная злокачественная опухоль кости. Пик встречаемости находится в пубертатном периоде, и прогноз очень неблагоприятен, даже после ампутации и химиотерапии. Много пациентов с остеосаркомой умирают от метастазов в легкое в течение 2 лет. Клеточные линии клеток остеосаркомы человека MG-63, SAOS-2 и TE-85 были инкубированы с ФНО, ИЛ-1 или ИФН-гамма отдельно или в комбинации. ФНО и ИФН-гамма были наиболее эффективными против SAOS-2 клеток; MG-63 клетки были наиболее чувствительными к ИЛ-1, а TE-85 клетки, были резистентны к ФНО и ИЛ-1, но чувствительны к ИФН-гамма. Синергичный противоопухолевый эффект комбинации ФНО плюс ИФН-гамма, ИЛ-1-альфа или ИЛ-1-бета или комбинации ИФН-гамма плюс ИЛ-1-альфа или ИЛ-1-бета был более высок чем, когда цитокины применялись по одному [Jia, Kleinerman, 1991]. Чувствительность лейкозных клеток к ФНО Мышиная линия клеток BCL-1 B-клеточного лейкоза исследована на сравнительную эффективность противоопухолевого действия рекомбинантных цитокинов ФНО, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, Г-КСФ, ГМ-КСФ и их комбинаций. Из этих 6 цитокинов только ФНО, ИЛ1β, ИЛ-2и Г-КСФ обладали антилейкозной активностью, существенно увеличивая выживаемость мышей. Адитивного или синергического эффекта не обнаружено, когда использовались комбинации 2-4-х цитокинов [Chelstrom et al., 1992]. Исследование ФНО, ИЛ-1α и ИФН-β на линии клеток М1 мышиного миелобластного лейкоза показало, что они проявляют антипролиферативный эффект. Сочетание ИЛ-1α с ФНО или ИФН-β имело адитивное действие в ингибировании роста М1, при этом отмечалось, что клетки усиливали экспрессию Fc-рецепторов, стимулировалась их фагоцитарная активность и морфологическая дифференцировка в макрофаги. Комбинация ФНО и ИФН-β проявляла только антипролиферативное действие. Цитостатический эффект ФНО и дифференцировка клеток, обусловленная сочетанием цитокинов, блокировалась антителами против мышиного ИФН-β. Northern-гибридизацией было показано, что ФНО вызывает увеличение экспрессии м-РНК ИФН-β1 [Onozaki et al., 1988]. Чувствительность опухолевых клеток к комбинации ФНО с химиопрепаратами Известно, что повышение температуры до 40°С, а также добавление ингибиторов синтеза ДНК, РНК или белка значительно усиливают цитотоксичность ФНО [Meager et al., 1989]. Синергичное увеличение цитотоксических эффектов рекомбинантного человеческого ФНО и противораковых химиопрепаратов было продемонстрировано invitro. Частично о примерах этому было сказано выше. Цитотоксичность ФНО против L-M клеток в комбинации с митомицином С, адриамицином, арабинозидом C, актиномицином Д, дауномицином, цисплатином, винкристином и 5-фторурацилом на концентрации, необходимой для 50%-ого ингибирования клеточного роста (IC50), была в 4-347 раз более 34 высока, чем при применении одного ФНО. Однако, комбинация ФНО с блеомицином не показала синергичный эффект. Комбинированная терапия, включающая ФНО и противораковые химиопрепараты, может иметь важное значение в лечении злокачественных опухолей у человека [Watanabe et al., 1988]. Исследовали цитотоксические эффекты ФНО и его комбинаций с ИФН-гамма и/ или цитотоксическими препаратами на ряде человеческих линий опухолевых клеток (U937, IGROV-1, HT29, LoVo, MCF7 и U20S), включая устойчивые клеточные линии (LoVo/DX и MCF7/DX, устойчивые к доксорубицину (ДР) и U20S/Pt устойчивые к цисплатину (ЦП). Клетки U937 и MCF7 были чувствительны к цитотоксическому эффекту ФНО, тогда как все другие клетки были нечувствительны до 1000 ЕД/мл (максимальная проверенная доза). Удивительно, что ФНО был цитотоксическим (на 30-40%) для двух резистентных линий (LoVo/DX и U20S/Pt), но не против материнских, чувствительных к химиопрепаратам линий клеток. Лечение ФНО после 6 часовой прединкубации с ИФН-гамма показало синергичный эффект на четырех клеточных линиях (U937, HT29, LoVo/DX и MCF7), тогда как на других пяти - нет. Комбинация субтоксических доз ФНО и увеличивающихся доз химиопрепаратов, направленных на ДНК-топоизомеразу II (доксорубицин, актиномицин Д и VP16), произвела аддитивный цитотоксический эффект на всех клеточных линиях. Те же самые результаты были получены при комбинации ФНО и ЦП, кроме U20S/Pt клеток, на которых ФНО синергично увеличил ЦПцитотоксичность. Комбинация ФНО и ИФН-гамма усилила цитотоксичность 20-кратно для доксорубицина и 6-кратно для цисплатина против LoVo/DX и U20S/Pt клеток, соответственно [Soranzo et al., 1990]. ФНО и ионизирующие излучения Некоторые линии клеток сарком человека, в отличие от нормальных фибробластов, начинают синтезировать ФНО после рентгеновского облучения. Подъем уровня синтезируемого ФНО отмечался через 20 часов после облучения, достигал максимума к 3-му дню и оставался повышенным 5 дней. Уровень м-РНК ФНО в клетках повышался в несколько раз через 3-6 часов, отличаясь кинетикой среди клеточных линий. Сочетание добавления экзогенного ФНО с рентгеновским облучением имело синергический эффект в киллинге некоторых линий ФНО-продуцирующих и непродуцирующих клеток сарком человека. На других линиях клеток подобный эффект отсутствовал [Hallahan et al., 1989]. Введение человеческих рекомбинантных ФНО или ИЛ-1альфа обладало радиозащитным действием у летально облученных мышей дозами ɣ-излучения от 850 до 1050 рад. ИЛ-1альфа был более эффективен в дозах от 100 до 1000 нг на мышь линий С57BL/6 и B6D2F (выживаемость до 80%), чем ФНО в дозах 5-10 мкг (выживаемость до 50%). Однако, на мышах линии C3H/HeN при тех же дозах цитокинов выживание после применения ФНО составило 50%, а после ИЛ-1альфа - 28%. Эти результаты предполагают влияние генотипа животного на пострадиационную выживаемость, и кроме этого, различные биохимические механизмы защитного действия цитокинов. Комбинация ФНО в дозе 5 мкг и ИЛ-1альфа в дозе 100 нг за 20 часов до облучения защищала 100% мышей 35 линии B6D2F от дозы облучения 1050 и 82% - от 1150 рад. При этом комбинация цитокинов имела адитивный радиопротективный эффект на всех трех линиях мышей [Neta et al., 1988]. Введение ФНО, ИЛ-1бета или ИЛ-2 до тотального облучения мышей BALB/c приводило к тому, что иммунологические показатели и число колониеформирующих единиц в культуре клеток селезенки были существенно выше (в 1,6-2,1 раза) в сравнении с мышами, не получавшими препараты. Взаимодействие ФНО с другими цитокинами ФНО индуцирует синтез ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, Г-КСФ, ГМ-КСФ [Koeffler et al., 1987, 1988; Oliveira et al., 1992]. Введение мышам моноклональных антител против ФНО до инъекции антител антиCD3 приводило к значительному снижению тяжести или отмене осложнений, развивающихся в ответ на анти-CD3-терапию. Одновременно регулировался сывороточный уровень других цитокинов: повышалось высвобождение ИФН-гамма и снижался уровень ИЛ-3 и ИЛ-6. Введение антител к ИФН-гамма перед антителами против CD3 приводило к повышению продукции ИЛ-3 и ИЛ-6 и не влияло на уровень ФНО и клинические осложнения анти-CD3 терапии [Ferran et al., 1991]. При изучении влияния ИФН-гамма на связывание ФНО с макрофагами мыши было установлено, что предварительная инкубация макрофагов с ИФН-гамма предотвращает этот процесс. Сделан вывод об отрицательном контроле ИФН-гамма числа рецепторов к ФНО на макрофагах мыши [Drapier, Wietzerbin, 1991]. Показано, что ИЛ-2 в условиях исключения индукции липополисахаридом обуславливает экспрессию гена ФНО invivo [Remick et al., 1991]. Уровень экспрессии гена ФНО определяется количеством ИЛ-2, представленного в течение активации лимфоцитов. Секреция ФНО возрастает параллельно синтезу его м-РНК и возрастает с повышением дозы ИЛ-2 [Owen-Schaub et al., 1991]. Установлено, что ФНО является мощным индуктором накопления м-РНК ИЛ-6 в моноцитах крови человека. Эффект возрастал по мере дифференцировки моноцитов. ФНО повышал стационарный уровень ИЛ-6 транскриптов вследствие стабилизации м-РНК [Brach et al., 1990]. Индуцируемый ИЛ-6 является своего рода негативным регулятором, подавляющим продукцию ФНО. Кроме этого ИЛ-6 вызывает каскад негативных реакций организма, приписываемых ФНО, в частности, синтез белков острой фазы, пирогенный эффект [Le, Vilcek, 1989]. Фибробласты легкого человека продуцировали ИЛ-6 после стимуляции рекомбинантными ФНО или ИЛ-1, которые при их комбинации проявляли синергический эффект. Синергизм был обусловлен более высокой стабильностью м-РНК ИЛ-6 [Elias, Lentz, 1990]. Ряд цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ, синтез которых обуславливается ФНО, играют существенную роль в развитии воспалительных и аутоиммунных заболеваний среди которых ревматоидный артрит, гломерулонефрит, кистозный фиброз лёгких, аутоиммунный тиреоидит и др. [Fischer et al., 1990; Feldmann et al., 1991; Diamant et al., 1991; Haworth et al., 1991; Le , Vilcek, 1989]. 36 ИФН-альфа ингибирует спонтанную и индуцированную ФНО пролиферацию мононуклеарных клеток от больных волосатоклеточным лейкозом. Ингибирование происходит на уровне синтеза ДНК ly7-позитивными бластными В-клетками [Hassan et al., 1992]. Рекомбинантный ФНО человека увеличивал экспрессию трансформирующего ростового фактора альфа (ТРФ) и рецептора для эпидермального ростового фактора (ЭРФ-Р) на уровне транскрипции их м-РНК и синтеза белков в шести тестированных линиях клеток карцином поджелудочной железы человека. Циклогексимид предотвращает ФНОобусловленную экспрессию ЭРФ-Р на уровне м-РНК, но не влияет на ТРФ. Показано, что фосфолипаза А2 включена в модуляцию экспрессии ЭРФ-Р [Schmiegel et al., 1993]. Клинические испытания I/II фазы на 26 пациентах показали, что комбинация ФНО с моноклональными анителами против рецептора эпидермального ростового фактора – хороший вариант лечения рака поджелудочной железы [Schmiegel et al., 1997]. ФНО индуцирует синтез ИЛ-8 на уровне транскрипции и накопления его м-РНК в клетках фибробластов человека FS-4. ИФН-бета или ИФН-гамма блокируют эти процессы [Oliveira et al., 1992]. Установлено, что ФНО-стимуляция эндотелиальных клеток HUVEC ведет к увеличению синтеза м-РНК и белков (α и β цепей) высокоаффинного рецептора ИЛ-3, максимум которых наблюдался между 16 и 36 часами после стимуляции ФНО в дозе 100 ЕД/ мл [Korpelainen et al,. 1993]. ИФН-гамма также является мощным стимулятором рецептора ИЛ-3 на HUVEC клетках. В комбинации с ИЛ-3 ИФН-гамма проявляет синергичный эффект в индукции экспрессии молекул II класса ГКГС, ИЛ-6 и Г-КСФ [Korpelainen et al,. 1995]. Участие ФНО в инфекционных процессах ФНО проявляет антивирусную активность (1-3).106 ед/мг в тестах invitro на человеческих клетках карциномы глотки НЕр-2, инфицированных вирусом везикулярного стоматита. Концентрация ФНО 1 нг/мл была достаточна для защиты клеток от цитопатического действия вируса при множественности инфекции 0,04, при этом ФНО действовал при добавлении к клеткам и после 7 часов от внесения вируса. Однако, при множественности инфекции более 1, для защиты требовалась четырехчасовая прединкубация клеток с ФНО до внесения вируса. Как и ИФН-бета, ФНО ингибировал ранние стадии вирусной репликации и формирование вирусных белков в НЕр-2 клетках. ФНО проявлял антивирусный эффект также на фибробластах легкого эмбриона человека НЕL и WI-38 и фибробластах мышиных эмбрионов MEF. Однако на клетках HeLa, фибробластах кожи человека BUD-8, клетках амниона человека WISH, мышиных фибробластах L-929, фибробластах эмбриона крысы REF и клетках почки обезьяны RITA антивирусного эффекта ФНО не отмечалось. Противовирусный эффект распространялся и на вирусы энцефаломиокардита и простого герпеса. Отмечено, что цитотоксический и антивирусный эффекты являются раздельными активностями ФНО. Антитела против альфа- и гамма-ИФН, добавленные к клеткам НЕр-2, не устраняют антивирусную защиту ФНО. Гибридизация меченной ДНК генов интерферонов не обнаружила интерферон-специфичной м-РНК в клетках, обработанных различными дозами ФНО. Это свидетельствует о том, что ФНО 37 не индуцирует экспрессию генов альфа- и бета-ИФН и проявляет антивирусный эффект не через активацию интерферонов [Mestan et al., 1986]. Прединкубация клеток (линия 7860) карциномы почки человека с ФНО в 1000 раз снижала выход РНК-содержащих вирусов везикулярного стоматита и энцефаломиокардита и ДНК-содержащих аденовируса-2 и вируса простого герпеса типа II. При этом добавление антител против альфа-, бета- и гамма-ИФН не оказывало влияния. ИФН-гамма защищает от вируса везикулярного стоматита многие клетки, но не линию А549 карциномы легкого человека. Однако, в присутствии ФНО, 1 нг/мл каждого цитокина было достаточно для выраженного противовирусного действия. Таким образом, сочетание ФНО и ИФН-гамма позволяет получать противовирусную защиту даже тех линий клеток (A549, HeLa), на которых эффект ФНО и ИФН-гамма отсутствует или слабо выражен. Определено, что ФНО вызывает гибель вирус-инфицированных клеток до времени созревания вирусных частиц. Этот феномен не ограничен типом клетки или вируса. Механизм противовирусного действия ФНО не ясен полностью. Однако, можно отметить, что, во-первых, он не связан с интерферонами и имеет с ними различные механизмы, во-вторых, ФНО индуцирует резистентность к вирусу неинфицированных клеток и, в-третьих, селективно убивает вирус-инфицированные клетки, предотвращая распространение вируса [Wong, Goeddel, 1986]. ФНО оказывает также действие против вируса цитомегалии [Arakawa, Yphantis, 1987] и в смеси с ИФН-гамма эффективно блокирует репликацию вируса простого герпеса типа I [Feduchi et al., 1989]. ФНО ингибирует пролиферацию вируса лейкоза крупного рогатого скота и образование индуцированного этим вирусом синцития. Наблюдается синергический эффект против этого вируса при совместном воздействии ФНО и человеческого ИФН-альфа1 [Imanishi et al., 1987]. ФНО в сочетании с альфа1- или гамма-ИФН вызывают или усиливают цитопатическое действие на клетки, инфицированные вирусом диареи крупного рогатого скота [Ohmann et al., 1989]. ФНО был запатентован как противовирусный препарат при широком круге заболеваний, вызываемых (кроме перечисленных выше) вирусами Коксаки, гепатита, опоясывающего лишая, гриппа, кератоконъюктивита, лимфаденита, инфекционного мононуклеоза, СПИДа и др., самостоятельно или в комбинации с ИФН-гамма [PatentFRD 3525750]. Однако, надежды на противовирусный эффект ФНО при различных заболеваниях вирусной этиологии, оказались преувеличенными. Ряд работ, выполненных в последующие годы, показывает, что ФНО может являться фактором активации латентной вирусной инфекции, например, СПИДа. Так, при обработке ФНО Т-клеток линии АСН-2, хронически инфицированных ВИЧ-1, обнаружено, что возрастает количество ВИЧ-специфической РНК и её транскрипция [Duh et al., 1989]. Антитела против ФНО значительно супрессировали экспрессию ВИЧ на АСН-2 клетках [Poli et al., 1990]. Используя клетки OM-10.1 (CD4+), как модель хронической ВИЧ-1 инфекции, исследовали влияние ФНО на вирусную экспрессию. Продолжительное воздействие экзогенного ФНО приводило к тому, что почти в 100% клеток активировалась экспрессия ВИЧ-1 в течение 24 ч. При кратковременном воздействии ФНО с последующей отмывкой клеток также наблюдалась активация экспрессии ВИЧ-1, которая предотвращалась в присутствии моноклональных антител против ФНО [Butera et al., 1993]. ФНО селективно цитотоксичен для ВИЧ-инфицированных 38 клеток, но стимулирует ВИЧ-репликацию за счет индукции транскрипционного фактора ядра клетки NF-kB, при этом происходит увеличение содержания gp120, продукта envгена вируса. Добавление стауроспорина, ингибитора протеинкиназы С, сохраняет цитотоксичность ФНО, но без индукции ВИЧ-репликации [Hamamoto et al., 1990]. Однако комбинация ФНО с ИФН-гамма в дозах от 1 до 10 нг/мл эффективно блокирует ВИЧрепликацию, накопление вирусной РНК как внутри клеток HuT-78 и RPMI-1788 так и в культуральной жидкости и уровень синтеза вирусного белка p24. Кроме этого сочетанное действие обоих цитокинов проявляет выраженный цитопатический эффект на ВИЧинфицированные клетки [Wong et al., 1988]. Однако, на клеточной линии U937, инфицированной ВИЧ-1, ФНО и ИФН-гамма синергично активировали и вирусную репликацию и апоптоз этих клеток [Han et al., 1996]. Важную роль играет ФНО в выработке противоинфекционного иммунитета и резистентности от инфицирования Klebsiella, Listeria, Candida [Havell, 1989; Parant et al., 1987; Vecchiarelli et al., 1989]. ФНО усиливает фагоцитоз, цитотоксичность полиморфонуклеарных нейтрофилов и ответ Т-лимфоцитов на активирующие стимулы [Beutler, Сerami, 1988] и был запатентован в качестве адъюванта иммунного ответа [Patent EPAN 0315110]. Как уже отмечалось выше, invivo ФНО синтезируется макрофагами в ответ на их активацию различными мембранными и секретируемыми компонентами микробных клеток. Наиболее активно ФНО продуцируется макрофагами, стимулированными ЛПС. Предварительная активация макрофагов invivo внутрибрюшинным введением Corinebacteriumparvum приводила к увеличению продукции ФНО. Мононуклеарные лейкоциты синтезируют ФНО при индукции не только ЛПС, но и ФГА, Кон-А, митогеном лаконоса, убитыми микроорганизмами S. aureus и B. pertussis, столбнячным анатоксином, коклюшными токсином и гемагглютинином [Ferrante et al., 1990]. Антитела против ФНО способствуют размножению Mycobacteriumaviumintracellulare, а введение рекомбинантного ФНО, но не ИФН-гамма или ИЛ-2, тормозит рост этих микроорганизмов в печени и селезёнке инфицированных мышей. Сочетание ФНО и ИЛ-1 усиливает ингибирование размножения М. avium [Denis, 1991]. Мононуклеарные клетки плевральной жидкости человека начинают синтезировать ФНО и ИФНгамма под воздействием компонентов клеточной стенки Mycobacteriumtuberculosis: ЛПС в дозе 0,1 мкг/мл, белок-пептидогликанового комплекса (содержит Т-клеточные эпитопы) или липоарабиномананнана (супрессор Т-клеточной реактивности) в дозах 10 мкг/мл, создавая высокую локальную концентрацию цитокинов, что ведет к образованию гранулем и элиминации бактерий [Barnes et al., 1990]. M. tuberculosis фагоцитируются альвеолярными макрофагами (АМ) и моноцитами крови (МК). При этом адгезия М. tuberculosis на АМ опосредована рецептором комплемента СR4, а на МК - СR1 и СR3. АМ более эффективны в фагоцитозе и ингибировании внутриклеточного роста М. tuberculosis и в больших количествах синтезируют ФНО, чем МК. Пентоксифиллин и моноклональные анти-ФНО антитела усиливают внутриклеточное размножение М. tuberculosis [Hirsch et al., 1994]. Эксперименты с рекомбинантными цитокинами и иммунологически активными витаминами показали, что комбинация ИФН-гамма, ФНО и кальцитриола индуцирует ин- 39 трамоноцитарный киллинг M. tuberculosis. Добавление этого коктейля к инфицированным моноцитам ведет к полному уничтожению туберкулёзных бацилл [Denis, 1991]. В легочной жидкости мышей после интратрахеального введения Legionellapneumophilla обнаруживали повышение уровня ФНО через 3 часа с пиком активности через 24 часа, после чего происходило его быстрое снижение. Декстран сульфат, введенный до инфицирования, снижает количество ФНО, что указывает на участие макрофагов в его продукции. Наряду с ФНО происходило повышение уровня и ИФНгамма. Культуры прилипающих лейкоцитов легкого и макрофагов продуцировали ФНО при стимуляции ЛПС L. pneumophilla [Blanchard et al., 1987]. Внеклеточный, эритрогенный культуральный супернатант Streptococcusoralis или S. mitis индуцировал синтез ФНО, ИЛ-6 и тимоцит-активирующего фактора макрофагами мыши и человека [Takada et al., 1993]. Компоненты клеточных стенок (липотехоивые кислоты) стрептококков и энтерококков стимулируют выделение ФНО и ИЛ-6 моноцитами/макрофагами. Однако, в сыворотках пациентов с подострым энтерококковым или стрептококковым эндокардитом уровень ФНО был очень низким или не определялся. Но уровень растворимых ФНО-рецепторов был существенно выше (p<0,0001) по сравнению с контролем (здоровые пациенты). Уровень R-55-фрагмента составлял 4,8±3,3 нг/мл, а R-75-фрагмента - 20,9±20,5 нг/мл [Kern et al., 1993]. Токсин 1 синдрома токсического шока из Staphylococcusaureus также индуцирует синтез ФНО и ИФН-гамма полиморфонуклеарными нейтрофилами [Jupin et al., 1988]. Комбинации стафилококковых энтеротоксинов А, В и С1 с ЛПС оказались более токсичными для мышей, чем их раздельное введение. Трансгенные мыши мутантные по молекулам ГКГС II-го типа оказались устойчивыми, мутантные по ГКГС I-го типа имели летальность около 30%, а мыши дикого типа - 93% от одинаковых доз стафилококкового энтеротоксина А 30 мкг в комбинации с 150 мкг ЛПС. Токсичность препаратов коррелировала с их способностью индуцировать синтез цитокинов: ФНО, ИЛ-1альфа, ИЛ-6 и ИФН-гамма [Stiles et al., 1993]. Антитела против ФНО, введенные мышам, инфицированным сублетальными дозами Listeriamonocytogenes, ускоряют развитие листериоза. Введение антител против ИФН-гамма приводит к снижению уровня ФНО, стимулированного ЛПС, в кровотоке инфицированных животных. Элиминация бактерий из печени и селезенки существенно блокируется при введении инфицированным животным антисыворотки против ФНО или 2-х сывороток против ФНО и ИФН-гамма. У иммунизированных мышей при вторичной инфекции L. monocytogenes обнаруживается сначала подъем уровня сывороточного ФНО (через 2 ч.), а затем ИФН-гамма (через 6 ч.); у неиммунизированных животных подъем ИФН-альфа наблюдался в поздние сроки (более 24 ч.), а уровни ИФН-гамма и ФНО не изменялись [Nakane et al. 1989]. Введение ФНО в дозе 1 мкг на мышь за 2 часа до инфицирования Listeria monocytogenes или Klebsiella pneumonia вызывает защиту 56-79% животных от гибели. Однако, мышей, возрастом 1 неделя, введение рекомбинантного ФНО не защищает [Parant et al., 1990]. Макрофаги клеточной линии GG2ЕЕ, спонтанно подавляющие рост Candida albicans in vitro, значительно увеличивали противогрибковую активность при добавлении ФНО, 40 ИФН-гамма или ИЛ-1, в отличие от ИЛ-2 и ИЛ-4. Повышение активности при этом не коррелировало с усилением фагоцитоза [Blasi, 1990]. При исследовании продукции окиси азота в макрофагах мыши, под активирующим действием ИФН-гамма, установлено её снижение при добавлении антител к ФНО. Простагландин-Е2 в значительной степени усиливал продукцию окиси азота в макрофагах в ответ на действие ФНО или ИФНгамма [Corradin, 1991]. Способность макрофагов синтезировать окись азота после активации ФНО или ИФН-гамма коррелирует с резистентностью мышей к инфицированию Leishmania major. Уровень окиси азота связан с уровнем активности азотоксидсинтетазы макрофагов. Макрофаги резистентных линий мышей СВА, С57Вl, В10 и С3Н продуцируют более высокий уровень оксида, чем макрофаги чувствительных ВАLВ/С, ВАLВ/В и DBА/2 [Liew et al., 1991]. Фагоцитарная активность полиморфноядерных лейкоцитов значительно усиливается под влиянием ФНО и ИЛ-1, в то время как ИЛ-2 не оказывал влияние на поглощение опсонизированных эритроцитов барана. Напротив, в присутствии ИЛ-2 снижалось связывание ФНО с поверхностью лейкоцитов [Moxey-Mims et al., 1991]. Патологические процессы в области оболочек мозга сопровождаются повышением уровней ФНО и ИЛ-6 в спинномозговой жидкости [Weller et al., 1991]. После интрацеребрального, но не системного, введения мышам Listeriamonocytogenes в спинномозговой жидкости (СМЖ) обнаруживался повышенный уровень ФНО, однако, он не обнаруживался в сыворотке крови. При интрацеребральном введении мышам вируса лимфоцитарного хориоменингита ФНО в СМЖ не выявлялся. Результаты, полученные на мышах, совпали с клиническими наблюдениями. У всех пациентов с бактериальным менингитом в первый день госпитализации обнаружен повышенный уровень ФНО (130-400 ЕД/мл) в СМЖ. У пациентов с поздними сроками (3-19 сутки) госпитализации при бактериальном менингите, а также у всех пациентов с вирусными менингитами различной этиологии, рассеянным склерозом и другими неврологическими заболеваниями ФНО в СМЖ не обнаруживался [Leist et al., 1988]. Установлено, что при малярии мышей, вызванной Plasmodiumberghei, и при длительных инфузиях рекомбинантного ФНО, происходит редукция полипотентных стволовых клеток костного мозга, клеток-предшественников эритропоэза и снижение включения 59 Fe в эритроциты. Введение антител против ФНО частично восстанавливает эритропоэз [Miller et al., 1989]. В целом, при инфекционных процессах ФНО усиливает общую противовирусную и антибактериальную резистентность. С другой стороны избыточное образование ФНО приводит к развитию анемии, поражению почек, печени, кишечника и другим общетоксическим явлениям, снижающим противоинфекционную сопротивляемость. То есть, ФНО можно рассматривать как аутотоксин, при этом антитела к ФНО, при его высоком уровне, могут положительно влиять на течение инфекционного заболевания. Однако, влияние ФНО и индуцирующих его ЛПС на течение инфекционных процессов затруднительно рассматривать отдельно от каскада других участников, в том числе цитокинов. Invivo ЛПС вызывает повышение уровней ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, Г-КСФ и ГМ-КСФ в среднем до 4-8 часов, после чего происходит их снижение, а также КСФ-1 и 41 глюкокортикоидов. Пассивная иммунизация анти-ФНО антителами предотвращает синтез ИЛ-1, ИЛ-6 и снижает смертность при летальном ЛПС-шоке. ИЛ-1 и ИЛ-6 являются эндогенными пирогенами, обуславливающими острофазовый ответ и синтез белков в печени. Г-КСФ и ГМ-КСФ мимикрируют эффекты ЛПС invivo, такие как нейтрофилия и сдвиг лейкоцитарной формулы в сторону молодых клеток. ЛПС влияет также на взаимодействие цитокинов с рецепторами. Invivo ЛПС в дозе 50 мкг снижает связывание с мышиными клетками костного мозга ФНО на 62%, ИЛ-1 на 90%, ГМ-КСФ на 42% и Г-КСФ на 91% в течение 2-х часов, но затем увеличивают связывание ИЛ-1 в 8,4 раза между 8 и 48 часами. In vitro ЛПС снижают связывание ИЛ-1 и Г-КСФ после 8 часов и дозозависимо увеличивают связывание ФНО, что указывает на не прямое, а опосредованное действие ЛПС. In vivo ФНО снижает связывание с мышиными клетками костного мозга ФНО на 88 %, ИЛ-1 на 73% и Г-КСФ на 89% в течение 30 минут, но затем увеличивает связывание ИЛ-1 в 4,8 раза после 10 часов. In vitro ФНО снижает связывание ИЛ-1 после 8 часов, что указывает на его опосредованное действие. ГМ-КСФ и его комбинации с дексаметазоном увеличивают после 8 часов связывание ИЛ-1 in vivo и in vitro [Shieh et al., 1994]. ФНО и аутоиммунные заболевания Выделенные из спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом Т-лимфоциты (СD4+) после стимуляции ФГА продуцировали большие количества ФНО, а также ИФН-гамма и ИЛ-2, что, как посчитали авторы, свидетельствует об участии этих цитокинов в иммунопатогенезе заболевания [Benvenuto, 1991]. Моноциты крови больных рассеянным склерозом также продуцируют повышенные количества ФНО [Piotrowska et al., 1991]. При лечении 9 больных псориазом инъекциями рекомбинантного ФНО отмечен выраженный клинический эффект у 2-х пациентов и регрессия симптомов еще у четверых. Однако, при терапии ФНО отмечали снижение числа тромбоцитов крови и изменения функции печени [Biotechnol. News, 1990]. У 36,4% крыс линии ВВ к 28-й неделе жизни развивается диабет. У подопытных крыс оказалась сниженной активность естественных киллерных клеток в отношении мишеней, клеток инсулиномы. У 2-х крыс развилась гепато и спленомегалия, в их селезёнке отмечено накопление W3/13 и W3/25 клеток, которые не проявляли активности ЕКК. При введении рекомбинантного ФНО в дозе 5.104ЕД внутрибрюшинно 2 раза в неделю крысам этой линии в возрасте 4-27 недель диабет не развился ни у одной из 21 опытной крысы [Satoh et al., 1990]. Гены ФНО и ЛТ человека и мыши локализованы в центральном районе генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Это единственные из цитокинов тесно сцепленные с ГКГС. Молекулы II-го класса ГКГС (DR, DQ и DP у человека) играют мажорную роль в инициации иммунного ответа и аутоиммунных процессов. Аберрантная экспрессия антигенов II-го класса ГКГС ведет к хронической стимуляции аутореактивных Т-клеток и развитию аутоиммунных заболеваний. ФНО, как оказалось, может ингибировать экспрессию антигенов II-го класса ГКГС. Ингибирующее действие ФНО 42 проявляется на дифференцированных клетках, таких как фибробласты кожи человека или активированные макрофаги [Watanabe, Jacob, 1991]. Было установлено, что лимфоциты и моноциты пациентов с DR2+ аллотипом II-го класса ГКГС продуцируют низкие количества ФНО и это сопровождается частыми рецидивами нефрита при системной красной волчанке. На аналогичной модели (NZB х NZW)F1 мышей с красной волчанкой было показано, что введение рекомбинантного ФНО существенно снижает возникновение нефрита. Подобная эффективность вводимого рекомбинантного ФНО показана при аутоиммунном инсулин-зависимом диабете у NOD мышей и ВВ крыс. Введение моноклональных анти-ФНО антител существенно ускоряло развитие диабета. Неясно, как ФНО супрессировал аутоиммунный процесс, однако, на гуморальное звено ФНО не оказывал влияния. Показано, что в тимусе ФНО продуцируется в основном лимфоцитами и в меньшей степени тимусными эпителиальными клетками. Введение моноклональных анти-ФНО антител новорожденным мышам ведет к инволюции тимуса и лимфоидной гипоплазии. Это указывает на то, что ФНО необходим для развития процессов толерантности и предотвращения заболеваний, ведущих к аутоиммунному синдрому [Jacob, 1992]. Показано, что ФНО является одним из основных участников в реакциях отторжения трансплантантов. Так исследование уровня ФНО у пациентов с пересаженной печенью показало, что у всех больных с признаками отторжения трансплантанта наблюдали высокий уровень ФНО в плазме сразу после восстановления циркуляци крови. У реципиентов, не имевших осложнений или инфекций, отмечали низкий уровень этого цитокина. Таким образом, начало отторжения трансплантанта печени связано с повышением концентрации ФНО в плазме, достаточной для обеспечения связывания лимфоцитов с эндотелиальной тканью и для индукции экспрессии НLА антигенов в трансплантанте [Hamilton et al., 1991]. При трансплантации сердца крысам проводили иммуносупрессию антителами против ФНО. Антитела к ФНО уменьшали мононуклеарную инфильтрацию трансплантантов и увеличивали время их выживания. Когда крысам вводили ФНО, наблюдали ускорение отторжения аллотранслантантов [Imagawa et al., 1991]. Сегодня считают, что ФНО-альфа играет ключевую роль в патогенезе многих хронических воспалительный и ревматических болезней, в частности: болезни Крона, ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита и псориазного артрита. Контролируемые испытания показали, что ингибиторы ФНО (Etanercept, Infliximab и Adalimumab табл. 2) значительно снижают симптомы и признаки заболеваний, улучшают функцию и качество жизни, и снижают радиологически подтверждаемые повреждения у больных с ревматоидными болезнями. По не полностью ясным причинам, Etanercept не работает при лечении болезни Крона. Реакции после местных и внутривенных инъекций, а также увеличенный риск инфекций (в частности реактивация туберкулеза) ассоциированы с использованием этих препаратов. Увеличенный риск лимфопролиферативной болезни, развитие волчаночно подобных синдромов и демиелинизации, включая оптический неврит и реактивацию множественного склероза, находятся под оценкой в долговременном дополнительном клиническом исследовании. 43 Таблица 2. Характеристики лицензированных ингибиторов ФНО. Etanercept (Enbrel) Infliximab (Remicade) Adalimumab (Humira) Класс. Растворимый ФНОрецептор. Анти-ФНО-α моноклональное антитело. Конструкция. Рекомбинантный слитый белок. Происхождение. Рекомбинантный человеческий. 4,8 дней Анти-ФНО-α моноклональное антитело. Химерное моноклональное антитело. Человеческое и мышиное. 9,5 дней Эффективно в комбинации с метотрексатом (ревматоидный артрит). Дозировка. 3-5 мг/кг внутривенно в 0, 2 и 6 неделю; затем с 4 по 8 еженедельно. Эффективно в монотерапии или в комбинации с метотрексатом (ревматоидный артрит). 5 мг/кг внутривенно в 0, 2 и 6 неделю; затем 8 еженедельных введений. По 40 мг подкожно раз в две недели под контролем. Период полувыведения. Использование. Ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит. Болезнь Крона. Эффективен в монотерапии или в комбинации с метотрексатом. 25 мг подкожно два раза в неделю. Не показал эффекта. Человеческое моноклональное антитело. Полностью человеческое. 12-14 дней По 40 мг подкожно раз в две недели Ингибиторы ФНО дороги (приблизительно 18 000 $ в год), а некоторым пациентам их нужно давать непрерывно, чтобы получить пользу, даже при использовании другой иммуносупрессивной терапии [Nash, Florin, 2005]. Рис. 11. Иллюстрация механизма действия ингибиторв ФНО. Нейтрализация ФНО растворимым ФНО-рецептором (рФНО-рец.) или анти-ФНО моноклональным антителом (анти-ФНО МАТ) предотвращает ФНО-связывание с p55 и p75 рецепторами и блокирует, запускаемые ими реакции [Mease, 2002]. 44 Однако необходимо помнить, что ФНО играет важную роль в иммунологической защите организма от инфекций и контроле опухолевого роста. Поэтому, терапия антителами против ФНО может увеличить риск развития серьезных инфекций и злокачественных новообразований. Был проведён мета-анализ данных клинических испытаний двух препаратов лицензированных анти-ФНО антител, применявшихся для лечения у больных с ревматоидным артритом, чтобы оценить их влияние на увеличение риска развития серьезных инфекций и злокачественных новообразований. В анализ были включены рандомизированные, плацебо контролируемые испытания 2-х лицензированных анти-ФНО антител (Infliximab и Adalimumab фирм Abbott и Centocor), применявшихся в течение от 12 недель и более у больных с ревматоидным артритом, включая 3493 пациентов, которые получили лечение анти-ФНО антителами и 1512 пациентов, которые получили плацебо. Число пациентов, леченных анти-ФНО антителами и включенных в испытания, должно было быть 154 (для 95% вероятности интервал - 91-500 человек) для развития 1 злокачественного новообразования в пределах периода лечения 6-12 месяцев. Число пациентов для развития 1 случая серьезной инфекций должно было быть 59 (для 95% вероятности интервал - 39-125) в пределах периода лечения 3-12 месяцев. Отношение шансов развития злокачественных новообразований было 3,3 (при 95%ой вероятности, интервал от 1,2 до 9,1) и для развития серьезных инфекции было 2,0 (при 95%, интервал от 1,3 до 3,1). Были оценены эффекты для высоких и низких доз анти-ФНО антител отдельно. Злокачественные новообразования были значительно чаще у больных, леченных более высокими дозами анти-ФНО антител по сравнению с пациентами, получавшими низкие дозы. Таким образом, получены доказательства увеличения риска развития серьезных инфекций, которые требовали проведения антимикробной терапии и/или госпитализации, и дозозависимого увеличения риска развития злокачественных новообразований у больных ревматоидным артритом, которых лечили антителами против ФНО в сравнении с пациентами, получавшими плацебо [Bongartz et al., 2006]. На сегодня включены противотивопоказания для всех препаратов ингибиторов ФНО: - вирусный гепатит В, - риск ВИЧ-инфекции, - латентная туберкулёзная инфекция, - симптомы инфекции, рака, сердечной недостаточности, демиелинизации, - существенные гематологические отклонения. Токсичность и кахектический эффект ФНО Использование ФНО в качестве лекарственного препарата ограничено из-за побочных токсических эффектов. Так, ФНО вызывает выход свободных жирных кислот и супрессию липопротеинлипазы в культуре адипоцитов с удельной активностью 107ед/мг [Liang et al., 1986], ингибирует на уровне транскрипции глицерин-фосфат дегидрогеназу, белок, связывающий жирные кислоты, супрессирует синтетазу жирных кислот и ацетил-КоА карбоксилазу. Всё это приводит к повышению уровня триглицеридов крови и 45 истощению животных (кахексии) [Beutler, Cerami, 1989]. Пентоксифиллин, ингибиторы синтеза простагландинов (ибупрофен и аспирин) и ингибитор фактора активирующего тромбоциты (WEB-2086) не влияют на усиленный ФНО липогенез в печени крыс и повышение триглицеридов крови. ИЛ-6, синтез и секреция которого индуцируется ФНО, усиливает липогенез и уровень цитрата аналогично эффекту ФНО [Grunfeld et al., 1990]. ФНО вызывает освобождение клетками простагландина Е2, ИЛ-1 и ИЛ-6, что способствует развитию лихорадки, появлению в крови острофазовых белков таких как С-реактивного белка, гаптоглобина, церулоплазмина и др. [Beutler, Cerami, 1989]. Противовоспалительные препараты индометацин и ибупрофен, ингибиторы циклооксигеназы арахидоновой кислоты (простагландин синтетазы), введенные крысам в/в в дозах, соответственно, 3 или 20 мг/кг массы тела, блокируют побочные токсические эффекты ФНО. При этом индометацин не блокирует цитотоксический эффект ФНО на линиях клеток HeLa, Me-180 и L-929 invitro [Kettelhut et al., 1987]. ФНО является медиатором эндотоксического шока при грамм-негативных инфекциях и в токсических дозах вызывает лихорадку, снижение массы тела, гипотензию, метаболический ацидоз [Beutler, Cerami, 1989; Mannel et al., 1987]. Однако отмечается различная чувствительность человека и животных к токсическим эффектам ФНО. Видимо, наиболее чувствительным является человек. В сыворотке крови здоровых людей ФНО не определяется. Наличие ФНО в сыворотке больных менингококковыми инфекциями 10 ЕД/мл сопровождается шоком; концентрация ФНО более 440 ЕД/мл приводит к смерти [Waage et al., 1987]. У больных септическим шоком уровень сывороточного ФНО составлял у выживших в среднем 180 пг/мл (100-1300), у умерших - 330 пг/мл (100-3500). Выздоровление больных сопровождалось снижением концентрации сывороточного ФНО, но уровень ФНО оставался высоким или еще более возрастал в течение болезни у пациентов, умерших впоследствии [Calandra et al., 1990]. У новорожденных с системными инфекциями, сопровождающимися шоком, уровень сывороточного ФНО составлял в среднем 2165 пг/мл, по сравнению с 27 пг/мл в группе без шока [Girardin et al., 1990]. Антитела против ФНО предотвращают септический шок и летальный эффект от эндотоксина при бактериемии [Beutler et al., 1985; Tracey et al., 1987]. Ишемия нижних конечностей с последующим восстановлением кровообращения приводит к выходу нейтрофилов в бронхоальвеолярное пространство и отеку легких, связанному с нарушением проницаемости сосудов. Введение антител против ФНО крысам за 30 мин. до восстановления кровообращения после ишемии приводило к снижению выраженности этих явлений [Welbourn et al., 1991]. Декстран сульфат ингибирует гидростатический отек лёгкого, зависимый от ФНО-опосредуемой миграции нейтрофилов [Hocking et al., 1991]. Введение пентоксифиллина крысам за 1 час дов/в инъекции ЛПС E. coli подавляло синтез ФНО, секвестрацию нейтрофилов в лёгкие и летальность от индуцируемого шока [Noel et al., 1990]. При клинических испытаниях внутривенное введение рекомбинантного ФНО пациентам с различными опухолями в дозах от 9.103 до 9.105ЕД/м2 поверхности тела (4-400 мкг/м2) вызывало озноб, лихорадку (37,4-39°С), тахикардию, гипотензию, повышение уровня С-реактивного белка и др. [Selby et al., 1987]. Клиническое изучение в рамках I 46 фазы и фармакокинетическое исследование рекомбинантного фактора некроза опухолей (фирмы Asahi) было выполнено на 29 пациентах, которые получили в общем 72 курса ФНО в дозах от 10 до 480 тысяч ЕД/м2. Лекарственное средство давалось как 1-часовое в/в вливание. Острая токсичность, включающая лихорадку, озноб, тахикардию, гипертензию, периферический цианоз, тошноту, рвоту, головную боль, стеснение в груди, невысокую боль в пояснице, понос и одышку были отмечены, при этом не ограничиваемые дозой или зависящие от дозы. Эозинофилия, моноцитоз, умеренная гипокальциемия и увеличение продуктов деградации фибрина были отмечены у нескольких пациентов. Ограничивающей дозу токсичностью была гипотония, которая произошла после окончания вливания лекарственного средства и была замечена у всех 5 пациентов, получавших самую высокую дозу. Не отмечалось никакой смертности или долговременной заболеваемости. Фармакокинетические изучения показали быстрый плазменный клиренс и короткий плазменный период полураспада, меньше чем 0,5 часа [Creaven et al., 1987]. 47 КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФНО Чувствительность опухолей к системному введению ФНО При клинических испытаниях препарата рекомбинантного ФНО человека на 18 больных различными злокачественными новообразованиями (5 неходжкинские лимфомы, 1 лимфогранулематоз, остальные с меланомами, липосаркомой, раком лёгкого и желудочно-кишечного тракта), положительный клинический и цитологический эффект наблюдался только у 1 пациента с лимфогранулематозом и у 2-х пациентов с неходжкинскими лимфомами [Selby et al., 1987]. У 12 пациентов (10 из них с аденокарциномой толстого кишечника), получавших рекомбинантный ФНО (фирмы Cetus Inc.) в/в в дозе 40 мкг/м2/день в течение 5 дней, повысилась цитотоксическая активность лейкоцитов крови. При этом наблюдалось снижение общего количества лейкоцитов, хотя процентное содержание естественных киллерных клеток и цитотоксических Т-клеток оставалось постоянным [Charnetsky et al., 1989]. Проведено клиническое изучение на 21 пациенте с локальными распространенными или метастатическими солидными опухолями, для которых никакая другая стандартная терапия не была доступна. ФНО им вводили по утрам 20-минутным внутривенным вливанием в дозе 75 мкг/день в течение 5 последовательных дней (один цикл). При отсутствии прогрессии два последующих цикла делали с 14-дневными интервалами, при этом доза была увеличена во 2-ой цикл – до 100 мкг/день, в 3-ий цикл – до 150 мкг/ день. Из 21 пациентов, оцененных по клиническим и иммунологическим ответам, 4 пациента имели полный и 4 частичный ответ. Показано, что лечение ФНО не связано с увеличением количества циркулирующих лимфоцитов. CD4/CD8 отношение у пациентов, леченных ФНО, показало значительно более низкие величины, чем перед лечением [Braczkowski et al., 1998]. 44 пациента с различными распространенными злокачественными опухолями лечили в рамках I фазы клинических испытаний. 30 пациентов получили ФНО по 3 раза в неделю внутримышечно в дозах между 25-300 мкг. Другие 14 пациентов получали ФНО внутриили перитуморально в тех же дозах. Максимальная толерантная доза была 150 мкг/м2 для обоих путей применения. Терапия продолжалась 1-26 недель для системного и 2-20 недель для местного применения. Среди пациентов, получавших ФНО внутримышечно, у 2-х зарегистрирован незначительный ответ и у 9 пациентов наблюдались стабилизации опухолей. 5 из 14 пациентов, получавшие ФНО интратуморально, показали значительную опухолевую регрессию (3 PR, 2 MR). Основные побочные эффекты были дозозависимыми и включали лихорадку, насморк, анорексию и тошноту. На дозах более 50 мкг/м2 было отмечено уменьшение артериального давления III-степени по ВОЗ классификации. Гематологическая токсичность включала переходное уменьшение лейкоцитов и тромбоцитов. Испытания показали определенную антиопухолевую активность ФНО, при этом региональное лечение превосходило системное применение ФНО [Bartsch et al., 1989]. 48 Чувствительность опухолей к интра- или перитуморальному введению ФНО ФНО использовали для внутриопухолевого введения при первичных множественных кожных плазмацитомах. Было отмеченно значительное сокращение размера опухолей без выраженных неблагоприятных эффектов [Tsuboi et al., 1992]. Двух пациентов, одного с гистологически подтвержденной мультиформной глиобластомой, другого с анапластической астроцитомой, лечили четырьмя курсами внутриопухолевого введения ФНО с промежутками в 3-5 месяцев. Каждый курс состоял из 8-10 инъекций в дозах от 50000 до 100000 ЕД с промежутками в 3-5 дней. Стероиды одновременно не вводили. Последующие неврологические обследования и исследование компьютерной и ЯМР-томографией продемонстрировали частичные ответы продолжительностью 28 и 36 месяцев. Не отмечено никаких значительных, связанных с введением ФНО осложнений, включающих мозговой отек, внутримозговое кровоизлияние или нейротоксичность. Местное введение ФНО может безопасно использоваться для лечения этих опухолей [Yamasaki et al., 1994]. 15 пациентов с распространенными солидными опухолями различных типов лечили внутриопухолевым введением ФНО. Лечение оказалось эффективным в 4 случаях поверхностных опухолей: 1 полный ответ, 1 частичный и 2 незначительных ответа. У остальных 11 пациентов с глубокорасположенными опухолями, включающими 6 случаев панкреатического рака, 4 гепатоцеллюлярного рака и 1 метастатической опухоли печени, никакой опухолевой регрессии не было отмечено, но у всех остановлена прогрессия этих опухолей. У 7 из 11 с этими опухолями показано уменьшение опухолевых маркеров и/ или развитие опухолевого некроза. Лихорадка, гипотония и усталость были основными клиническими побочными эффектами. Никакие значительные изменения не отмечены в гематологических, почечных или печеночных параметрах. Результаты показывают, что введение ФНО в опухолевый сайт имеет хороший потенциал для контроля опухолевого роста [Watanabe et al., 1994]. Два пациента, имеющие Merkel-карциномы, получали лечение внутриопухолевыми инъекциями ФНО. У обоих пациентов местная терапия достигла полной опухолевой регрессии, при этом не вызывая образование язвы или рубца. Эти результаты показывают, что внутриопухолевые инъекции ФНО могут быть очень эффективны в лечении Merkelклеточной карциномы [Hata et al., 1997]. Исследовали переносимость и активность местного, внутриопухолевого введения ФНО и системного ИФН-альфа2b при локальном распространенном, гормоноустойчивом раке простаты (LA-HRPC). 10 пациентов с LA-HRPC (T4N0M0, n = 3; T4N0M1, n = 5; T4N1M1, n = 2) лечили рекомбинантным ФНО, вводимом локально в опухоль простаты с 4-недельными интервалами (максимум четыре цикла) комбинированно с перемежающимися подкожными введениями 5.106 МЕ ИФН- альфа2b. Несмотря на значительную утечку ФНО в большой круг кровообращения через 2 часа после внутрипредстательного применения (до 416 пг/мл; p=0,0034), ФНО (и ИФН-альфа2b) были хорошо переносимы (1-2 степень токсичности по ВОЗ классификации). ФНО вызвал некроз опухолевых кле- 49 ток простаты у всех пациентов, ведя к значительному уменьшению объемов простаты в 9 из 10 случаев. Значительное кратковременное в пределах 4 часов увеличение серологических уровней простат специфичного антигена (ПСA) (в среднем на 65%; p<0,001) и полипептидного тканеспецифического антигена (TPS) (в среднем на 85%; p=0,001) и ИЛ-8 (в среднем на 26-87%; p<0,009) после того, как ФНО проявлял цитотоксический эффект in vivo. В отдаленные сроки сыворочные уровни ПСA понижались на 18-87%, достигая самого низкого базового уровня спустя 7 недель. Метастазы не были замечены. Введение ФНО внутрь предстательной железы выполнимо при умеренной токсичности у больных с LA-HRPC и, таким образом, может быть новым выбором лечения для этих пациентов [Kramer et al., 2001]. Противоопухолевое действие ФНО в комбинации с мелфаланом при изолированной региональной перфузии 55 пациентов, участвовавших в многоцентровом клиническом испытании, имели 30 первичных и 25 текущих сарком. 13 пациентов (24%) имели многоочаговые первичные саркомы или множественные рецидивы опухоли; опухоли были очень большие (медиана - 18 см); девять пациентов (16%) имели системные метастазы. Все пациенты получили ИФН-гамма подкожно в течение 2-х дней а затем изолированную региональную перфузию (ИРП) комбинации ФНО, ИФН-гамма и мелфалана (рис. 12 и 13). Рис. 12. Принципы изолированной региональной перфузии [Lejeune et al., 2006]. 50 Рис. 13. Схема методики проведения изолированной региональной перфузии на примере нижней конечности [Lejeune et al., 2006]. Отсроченная резекция остатка опухоли обычно применялась спустя 2-3 месяца после ИРП. Мажорный опухолевый ответ был отмечен у 87% пациентов, который переводил саркомы в операбельные в большинстве случаев. Клинические ответы были следующие: 10 (18%) полные ответы (CRs), 35 (64%) частичные ответы (PRs) и 10 (18 %) без изменений (NC). Заключительный результат был определен по клиническому и патологическому ответам: 20 (36%) CRs, 28 (51%) PRs и семь (13%) NC. Спасение конечности было достигнуто у 84%. У 39 пациентов была выполнена резекция остатка опухоли (n=31) или от двух до восьми опухолей (n=8) после выполнения ИРП; местный рецидив развился в пяти случаях (13%). Когда резекция не выполнялась в случаях множественных опухолей или системных метастазов, местные рецидивы были частыми (5 из 16). Региональная и системная токсичность была минимальная. Гистологический анализ показал геморрагический некроз, а ангиографии показали селективную деструкцию опухолевых сосудов [Eggermont et al., 1996]. На основании этих результатов авторы решили, что уникальное свойство больших доз рекомбинантного ФНО-альфа состоит в активации и селективном уничтожении связанного с опухолью микроциркуляторного русла (рис. 14). 51 Рис. 14. Селективная деструкция сосудов саркомы конечности после проведения изолированной региональной перфузии (ФНО-альфа+ИФН-гамма+мелфалан) [Lejeune et al., 2006]. При системном применении ФНО показано, что максимальная толерантная доза (MTD) для человека - в 10 раз меньше, чем эффективная противоопухолевая доза для животных. Основная токсичность соответствует синдрому системного воспалительного ответа с уменьшением тонуса сосудов и гипотонии. Применяли ФНО в ИРП с аппаратом искусственного кровообращения для лечения локальных распространенных сарком мягких тканей конечностей. 140 пациентов получили ИРП с большой дозой ФНО. У 55 пациентов, леченных комбинацией ФНОальфа + ИФН-гамма + мелфалан полная объективная отвечаемость была получена у 87% с полными ответами у 36%; в группе, получавшей лечение ФНО-альфа и мелфалан (n=85), ответы были у 81% и 28%, соответственно. Ангиографическое и иммуногистологическое исследования показали селективное и раннее повреждение микроциркуляторного русла, связанного с саркомой, которому предшествует активация адгезивных молекул и внутриопухолевой несостоятельности Willebrand-фактора. Опухолевая инвазия тромбоцитами и, в некоторых случаях, полиморфнонуклеарными клетками, появилась в течение часов после применения ФНО перед распадом опухоли. Как решили авторы испытаний, ИРП большой дозой ФНО-альфа и химиопрепарата имеет двойное действие: ФНО поражает опухолевую сосудистую сеть, а химиотерапия воздействует на опухолевые клетки [Eggermont et al., 1997]. Изолированная региональная перфузия (ИРП) с мелфаланом эффективна против меланомы с метастазами, но потерпела неудачу в лечении сарком мягких тканей конечностей. Применение ФНО изменило это положение полностью. Теперь ИРП с ФНО + мелфалан - очень успешное лечение, чтобы предотвратить ампутацию. В многоцентровом европейском клиническом испытании ИРП с ФНО + мелфалан привела к 76%-ной от- 52 вечаемости и 71%-ному коэффициенту выживаемости у больных с угрожающими саркомами мягких тканей, считавшимися неоперабельными. Сообщено также об успехе этого режима против объемных меланом, многоочагового рака кожи и резистентных к лекарственным средствам костных сарком. ФНО в больших дозах разрушает сосудистую сеть в опухолях, и, что наиболее важно, усиливает селективную восприимчивость опухолей к лекарствам (мелфалану или доксорубицину) в три – шесть раз. Подобный синергизм наблюдался в хорошо-васкуляризированных метастазах печени после изолированной печеночной перфузии с ФНО и мелфаланом [Eggermont, tenHagen, 2001]. ИРП с ФНО и мелфаланом очень эффективна в лечении сарком мягких тканей и других объемных опухолей. Из-за опасения связанной с ФНО токсичности, ИРП с ФНО в ряде клиник не предлагается старым пациентам. В университетском госпитале Роттердама (Нидерланды) из 306 ИРП на основе ФНО пятьдесят ИРП применили 43 пациентам старше 75-летнего возраста (диапазон: 75-91 год): 29 пациентов с саркомами и 14 пациентов с меланомами конечностей. В результате среди пациентов с саркомами была достигнута отвечаемость в 76% и сохранение конечности в 76% случаев. Среди пациентов с меланомами 100%-ая отвечаемость и 93%-ное сохранение конечности были достигнуты (рис. 16). Местная токсичность была умерена. Три послеоперационных смертных случая, которые произошли в полном ряде из 306 ИРП на основе ФНО в Роттердаме (<1%), произошли у больных > 75-лет после перфузий без утечки и не были связаны с ФНО, а с чрезвычайно высоким риском у этих трех пациентов. В заключение, старым пациентам нельзя отказывать в ИРП на основе ФНО для регионального лечения, потому что, эта процедура безопасна и очень эффективна для этих пациентов [Van Etten et al., 2003]. Свежие образцы опухолей для гистологических исследований от 27 пациентов с обширными саркомами мягких тканей и от 3 пациентов с десмоидными опухолями конечностей были собраны спустя 6-8 недель после гипертермической ИРП с ФНО-альфа плюс мелфалан. Типичными гистологическими изменениями были центральный узловой геморрагический некроз с периузловым обширным фиброзом (рис. 15). Некоторые неспецифические изменения были отмечены в мягких тканях вокруг опухолевой массы. В восьми случаях был более чем 90%-ый некроз. В 17 случаях распространение некроза отмечалось между 60% и 90% (80-90% в 4 из 17 случаев). В пяти случаях был отмечен некроз менее чем 60%. Лучшие ответы (> 90%-ый некроз) наблюдались в дистально расположенных опухолях. Чувствительными типами опухолей была злокачественная фиброзная гистиоцитома, сопровождаемая слизеподобной липосаркомой и синовиальной саркомой. Десмоидные опухоли показали меньше некроза, чем саркомы. Сосудистая инвазия наблюдалась в двух случаях и внутриузловой венозный тромбоз в одном случае. Никакой периневральной инвазии или участия лимфатических узлов не наблюдалось. Мягкие ткани, смежные с опухолевым ложем, не имели морфологических изменений. Никакой корреляции не было между гистологическими изменениями и анатомическим (верхняя или нижняя конечность) положением опухоли; была ли опухоль первичной или возвратной; типом предыдущего лечения (системная химиотерапия или лучевая терапия) и размером опухоли. 53 Рис. 15. Злокачественная фиброзная гистиоцитома после ИРП с ФНО и мелфаланом и удаления остатка опухоли. Видны фиброзная капсула вокруг опухоли, геморрагические и некротические зоны с формированием псевдоцист и жидким геморрагическим содержимым [Issakov et al., 2000]. Открытое, многоцентровое, рандомизированное клиническое испытание II фазы проводилось, чтобы определить эффект изолированной региональной перфузии (ИРП) ФНО-альфа в комбинации с мелфаланом с или без ИФН-гамма у больных с метастазами меланомы (MD стадия Андерсона IIIA или IIIAB, AJCC стадия III). 64 пациента были рандомизированы, чтобы получить лекарственную терапию, состоящую из ФНО и мелфалана (ФМ-ИРП) или ФНО, мелфалана и ИФН-гамма (ФМИ-ИРП). Пациентам рандомизированным для получения ИФН-гамма, предварительно вводили в течение 2 дней перед ИРП ежедневно по 0,2 мг ИФН-гамма подкожно и то же самое количество в течение ИРП. Получено 47 полных ответов (73%), из которых 22 (69%) произошли в группе ФМ-ИРП и 25 (78%) в группе ФМИ-ИРП. 14 частичных ответов (22%) были распределены равномерно между группами лечения. В группе ФМ-ИРП отмечены два случаях стабилизации болезни и один случай прогрессирования болезни. Отвечаемость (полный плюс частичные ответы) была 100% в группе ФМИ-ИРП и 91% в группе ФМИРП. В прошлых контрольных данных, когда 103 пациента получали только мелфалан (М-ИРП), было 54 полных ответа (52%) и 80 частичных ответов (78%). Среднее время выживания, оцененное Kaplan-Meier методом, было 819 дней для группы ФМ-ИРП, более 705 дней для группы ФМИ-ИРП и 873 дней для объединенной совокупности изучения; время местной прогрессии или рецидива было 327 дней, более 498 дней и 405 дней, соответственно. Соответствующее число для контрольной группы М-ИРП было 338 дней. Эти данные показывают, что ФНО в комбинации с мелфаланом превосходит мелфалан для ИРП [Lienard et al., 1999]. Лечение пациентов с меланомой в стадии IIIA/B методом изолированной региональной перфузии (ИРП) комбинацией ФНО-альфа и мелфалана вызывает полный ответ в 54 80-90% случаев. Указывается, что механизм опухолевой регрессии, индуцированной комбинацией ФНО-альфа и мелфалана точно не понят. Предыдущие исследования были сосредоточены на непосредственных (немедленных, в течение нескольких дней) клинико-патологических изменениях после перфузии, включающих геморрагический некроз. Однако, клинические данные ясно указывают, что полная опухолевая ремиссия часто требует периода от нескольких недель до нескольких месяцев после ИРП. Поскольку механизм, лежащий в основе этой реакции отсроченного типа полностью неизвестен, изучали клинико-патологические события у больных с такими медленно регрессирующими меланомами. Для этой цели, 94 биопсии метастазов меланомы, которые получали от 11 пациентов между 1 неделей и 9 месяцами спустя после ИРП, были проанализированы световой и электронной микроскопией и иммуногистохимией. Все 11 пациентов отвечали на лечение ИРП (9 полных ответов, 1 частичный и 1 стабилизация болезни). Последовательные биопсии показали рассеянный некроз опухолевых клеток без кровотечения. Большинство поражений с этой реакцией отсроченного типа было меньше чем 0,5 см в диаметре. Они содержали изменяющиеся количества гистологически выглядящих жизнеспособными опухолевых клеток и опухолеинфильтрирующих меланофагов. Кроме того, отмечены переходные перитуморальные инфильтраты эозинофилами и умеренные промежуточные отеки и фиброзы. Отмечалось присутствие малого количества лимфоцитов. По сравнению с реакцией после лечения одним мелфаланом, структура реакции отсроченного типа была сходна, но более интенсивна. Рассеянный некроз опухолевых клеток в последнем типе можно объяснить индуцированным ФНО увеличением проницаемости опухолевого сосудистого русла, которое приводит к более высоким внутриопухолевым концентрациям мелфалана или в продлении его эффекта. Впоследствии, дегенерируемые опухолевые клетки удаляются макрофагами, и, наконец, происходит репарация фиброзом [Nooijen et al., 1998]. Рис. 16. Эффективность изолированной региональной перфузии (ФНО+ИФН-гамма+мелфалан) на примере множественной меланомы конечности (83-летняя женщина) [Lejeune et al., 2006]. 55 Хотя классическую форму саркомы Капоши считают безболезненной и мягкой, время от времени ее развитие протекает более тяжело, с острым началом и изнурительными осложнениями, требующими агрессивного лечения и даже ампутации. Оценка эффективности гипертермической изолированной региональной перфузии (ИРП) с ФНОальфа и мелфаланом проведена на 5 пациентах, в возрасте 60-82 лет, с обширной, классической саркомой Капоши нижней конечности. Все пациенты были кандидатами на ампутацию вследствие изнуряющих симптомов. Пациенты переносили ИРП через подвздошную (n=2), бедренную (n=2) или подколенную (n=1) артерию. ФНО-альфа 4 мг и мелфалан 1,5 мг/кг были введены в течение 90 минут. Конечность была нагрета до 40оC. Клинические ответы были зарегистрированы для всех пациентов после 6 - 8 недель. Отвечаемость была 100%: 1 из 5 пациентов имел полный ответ и 4 из 5 имели частичный ответ. Два пациента имели прогрессию болезни спустя 2 месяца после ИРП, но у одного из них течение было бессимптомным и не требовало никакого дальнейшего лечения. Второй пациент перенес ампутацию. Не было случаев смерти, связанных с лечением или системными осложнениями. Местные осложнения были обратимы. Эти результаты предполагают, что гипертермическую ИРП с ФНО и мелфаланом можно считать эффективной паллиативной и региональной-защитной методикой лечения для обширной саркомы Капоши [Lev-Chelouche et al., 1999]. Кожные Stewart-Treves лимфоангиосаркомы представляют редкую группу опухолей, характеризующихся высокой степенью васкуляризации и локализацией в конечности с лимфоэдемой. Многоочаговость и локализация делают эти опухоли кандидатами на лечение ИРП с ФНО и мелфаланом. 10 пациентов с многоочаговыми Stewart-Treves лимфоангиосаркомами, все были кандидатами на экзартикуляцию конечностей, были подвергнуты 16 ИРП с ФНО плюс мелфалан. Наблюдали 87%-ую отвечаемость (полные и частичные ответы); один пациент имел смешанный ответ, и один пациент не отвечал на терапию. В девяти перфузиях (56%) полный ответ был достигнут, и пять перфузий (31%) привели к частичному ответу. Сохранение конечности было достигнуто у восьми пациентов (80%), со средней продолжительностью 34,8 месяцев (диапазон от 3 до 115 месяцев). Региональная токсичность была ограничена и системная токсичность - минимальная, без токсических смертных случаев. Таким образом, многоочаговые Stewart-Treves лимфоангиосаркомы конечностей с хронической лимфоэдемой могут успешно лечиться ИРП с ФНО и мелфаланом [Lans et al., 2002]. Противоопухолевое действие ФНО в комбинации с мелфаланом при изолированной перфузии печени Первичный неоперабельный рак печени (холангио- или гепатоцеллюлярные карциномы) или метастазы в печени (колоректальный рак, меланома глаз, нейроэндокринные опухоли) – болезнь, ограничивающая жизнь многих пациентов. Нет никаких удовлетворительных вариантов лечения для пациентов с меланомой глаз, метастазировавшей в печень, и после того, как метастазы в печени идентифицированы, среднее время выживания находится между 2 и 7 месяцами. 22 пациента (13 женщин и 9 мужчин; средний воз- 56 раст - 49 лет) с меланомой глаз, метастазировавшей в печень, лечили гипертермической изолированной печеночной перфузией (ИПП) в течение 60 минут, используя мелфалан один (1,5-2,5 мг/кг, n=11) или в комбинации с ФНО (1,0 мг, n=11). При лапаротомии ИПП проводили через печеночную артерию (n=17) или печеночную артерию и портальную вену (n=5) (рис. 20). Большинство пациентов имели запущенные опухоли со средним значением печеночной замены 25 % (диапазон 10-75%) и средним количеством метастатических узлов 25 (диапазон 5-50). Полная сосудистая изоляция была подтверждена у всех пациентов использованием непрерывной интраоперационной методики контроля с альбумином, меченным изотопом 131I (рис. 17). Был один случай летального исхода лечения (5%). Полный ответ среди 21 пациента наблюдался у 62%, включая 2 радиографических полных ответа (9,5%) и 11 частичных ответов (52%). Средняя продолжительность полного ответа была 9 месяцев (диапазон 5-50) и была значительно более продолжительна у лечившихся с ФНО, чем без него (14 против 6 месяцев, соответственно; P=0,04). Полное среднее выживание у 22 пациентов было 11 месяцев. Эти данные указывают, что ИПП может привести к значительной регрессии распространенных печеночных метастазов глазной меланомы, и ФНО значительно продлевает продолжительность ответа [Alexander et al., 2000]. Рис. 17. Схема проведения изолированной перфузии печени (ИПП). Приток через канюлю в GDA, отток через канюлю, установленную на изолированном сегменте IVC. Закрытая рециркулирующая цепь перфузии, содержащая один литр раствора, состоит из оксигенатора, резервуара улавливания пузырьков, роликового насоса и теплообменника. Вено-венозный шунт отводит кровь от подпеченочной IVC и портальной вены в системную циркуляцию в течение ИПП [Alexander et al., 2000]. В целом изолированная печеночная перфузия (ИПП) включает метод полной сосудистой изоляции печени, чтобы лечить опухоли печени высокими дозами лекарств без проявления системной токсичности. Недавние клинические исследования главным образом использовали ИПП с мелфаланом, фактором некроза опухолей и умеренной гипертермией. Гипертермия увеличивает эффективность препаратов и может быть применена за счет 57 нагрева циркулирующего перфузата. Результаты этих исследований демонстрируют, что ИПП позволяет достичь высокого противоопухолевого ответа и выживаемости пациентов. Несмотря на ободрительные результаты с мелфаланом, его эффективность все еще ограничена; поэтому, другие препараты, такие как иринотекан и оксалиплатин, можно было бы применить в ИПП, поскольку они могли бы далее увеличить эффективность или безопасность лечения [Rothbarth et al., 2006]. Рис. 18. Вариант проведения изолированной перфузии печени [Rothbarth et al., 2006]. Чтобы уменьшить токсическое влияние лекарств на непораженные опухолью синусы печени применяют ретроградную венозную перфузию (рис. 19). Рис. 19. Модель ИПП опухоли печени. Распределение лекарств (мелфалана и ФНО) в течение ортоградной (А) или ретроградной (Б) венозной перфузии печени при продолжительной инфузии лекарств в печеночную артерию[Rothbarth et al., 2006]. 58 ТИМОЗИН-АЛЬФА1 Структура и синтез тимозина-альфа1 in vivo Тимозин-альфа1 – пептид вилочковой железы (тимуса), имеющий молекулярную массу 3108 Да, pI 4,2 и состоящий из 28 аминокислотных остатков с последовательностью: Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-LysLys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [Goldstein et al., 1977]. Подчеркнута основная антигенная детерминанта тимозина. В организме человека или животных N-концевой аминокислотный остаток (Ser) тимозина ацетилирован. Дезацетилтимозин, и в том числе синтезируемый в рекомбинантном штамме Escherichia coli, сохраняет биологические активности, присущие тимозину-альфа1 [Wetzel et al., 1980]. Биологическими активностями (активация Т-хелперов, продукция ИЛ-2 и экспрессия ИЛ-2-рецептора) обладает N-концевой фрагмент тимозина, состоящий из 14 а. о., у С-концевого фрагмента (15-28 а. о.) активности не обнаружено. Необходимо отметить, что активность тимозина-альфа1 и его N-концевого фрагмента выявляется только на старых животных [Frasca et al., 1985; Doria et al., 1989]. Тимозин-альфа1 не имеет существенной гомологии с тимозинами-бета4 (4963 Да), -бета8, -бета9, тимопоэтином II (5562 Да), тимостимулином (857 Да), но почти идентичен тимозину-альфа11 (35 а. о.), отличаясь от него отсутствием семи (добавочные у тимозина-альфа11) С-концевых аминокислотных остатков. Тимозин-альфа1 синтезируется и секретируется в основном медуллярными эпителиальными клетками тимуса, а также и периферическими лимфоцитами крови [Naylor et al., 1992]. Исследования показали, что тимозин-альфа1 является продуктом процессинга большой белковой молекулы, названной протимозин-альфа. Клонированная к-ДНК протимозина-альфа человека кодирует белок из 111 а. о., в котором последовательность тимозина-альфа1 находится на N-конце молекулы. Аминокислотная последовательность протимозина-альфа человека: 1-MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN↓GRDAPAN↓GNAENEENGEQEAD 51-NEVDEEEEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAESATGKRAAEDDEDDDV 101-DTKKQKTDEDD Протеолитическое расщепление протимозина-альфа с высвобождением тимозиновальфа1 и -альфа11 происходит по одинаковым дипептидам Asn-↓Gly (N↓G) в позициях 29-30 и 36-37, соответственно. Такой же дипептид имеется в позиции 44-45, однако тимозин, гомологичный -альфа1, размером 43 а. о. неизвестен. Необходимо отметить, что имеется 3 сайта классического расщепления белков сериновыми протеазами в позициях 20-21 и 103-104 Lys-Lys и в позиции 89-90 Lys-Arg, однако расщепление с образованием тимозинов происходит по другим, указанным выше, сайтам. Это свидетельствует об участии других (не сериновых протеаз) систем процессинга предшественника в зрелые продукты. На N-конце протимозина-альфа отсутствует сигнальный пептид, что указывает на отсутствие классического пути секреции тимозинов-aльфа из клеток в кровоток. Протимозин-альфа человека - высококислый белок, содержащий 19 остатков аспарагино- 59 вой и 35 глютаминовой кислот. На нем не обнаружено сайтов гликозилирования. Установлено, что стимуляция лимфоцитов митогеном, стафилококковым энтеротоксином А, приводит к 15-кратному увеличению в них синтеза м-РНК протимозина-альфа. М-РНК протимозина-альфа обнаружена во многих тканях и клетках, включая печень, селезенку, нормальные периферические лимфоциты (85% Т-клетки), клетки миеломы (100% В-клеточная линия), нормальные и трансформированные фибробласты. Это указывает, что протимозин-альфа является не только предшественником тимозинов-альфа, но и сам без процессинга участвует в жизненных (ростовых) функциях клеток [Eschenfeldt, Berger, 1986; Goodall et al., 1986]. М-РНК протимозина-альфа выявляется в яичниках, яичках, плаценте, тимусе и гипоталамусе [Oikawa et al., 1990]. При исследовании с помощью антисыворотки против тимозина-альфа1 уровня внутриклеточных тимозин-иммунореактивных пептидов (ТИП) установлено, что в клетках IEC-6 (недифференцированные клетки крипт тонкого кишечника крысы) уровень ТИП возрастал при пролиферации клеток и снижался, когда пролиферация ингибировалась. Увеличение уровня внутриклеточных ТИП предшествовало репликации ДНК, т. е. наблюдалось в G1-фазе пролиферативного цикла. Иммуно-электронная микроскопия показала локализацию ТИП на хроматине ядер клеток. Профиль ядерных ТИП при проведении HPLC соответствовал тимозину-альфа1 и следовым количествам протимозина-альфа [Conteas et al., 1990]. Эти данные показывают, что транскрипция м-РНК протимозина-альфа в различных клетках еще не доказывает регулирующую роль именно протимозина-альфа, возможно, в пролиферации клеток ведущую роль играет продукт его расщепления в ядре клетки тимозин-альфа1. Возможно также, что протимозин-альфа и продукты его гидролиза предназначены именно для внутриклеточных функций, поскольку, как указывалось выше, на N-конце протимозина-альфа отсутствует сигнальный пептид, обеспечивающий его секрецию. Доказательством участия протимозина-альфа в клеточном делении являются эксперименты сего антисмысловыми олигодезоксирибонуклеотидами. Инкубация клеток миеломы RPMI 8226 в их присутствии не приводит к нарушению синтеза протимозиновой м-РНК, но ингибирует ее трансляцию. Уменьшение синтеза про-тимозина-альфа приводило к ингибированию клеточного деления [Sburlati et al., 1991]. Тимозины-альфа1, выделенные из тимусов человека, свиньи, кролика, быка и мыши, оказались идентичными [Low, Goldstein, 1984]. Методом радиоиммуноанализа (РИА) с использованием кроличьей анти-тимозин-альфа1 сыворотки, адсорбированной С-концевым фрагментом (с 15 по 28-й аминокислотный остаток тимозина-альфа1), тимозин-подобные пептиды были обнаружены в белковых экстрактах из насекомых, крабов, грибов, простейших и микобактерий [Oates, Erdos, 1989]. Эти факты свидетельствуют о наличии консервативных последовательностей, соответствующих тимозину-альфа1 в геноме живых организмов от бактерий до человека. 60 Рецепторы для тимозина-альфа1 В литературе автором не обнаружено данных о специфических рецепторах для тимозина-альфа1. Однако имеется публикация В. П. Завьялова с соавт. о том, что пять аминокислотных остатков в позициях с 16 по 20 а. о. тимозина-альфа1 (Leu-Lys-Glu-Lys-Lys) 100% гомологичны 131-135 а. о. интерферона-альфа2. Синтетический 125I-меченный октапептид Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Tyr-Ser-Pro, соответствующий 131-138 а. о. ИФН-альфа2, эффективно связывался с рецепторами (700 на клетку) на тимоцитах с константой 4,2.10-12. Немеченные ИФН-альфа2 и тимозин-альфа1 ингибировали это связывание с константами 8,6.10-10 и 3.10-7, соответственно. Однако пентапептид, общий для обоих цитокинов, не ингибировал связывание октапептида. Тем не менее, авторы сочли, что для ИФН-альфа2 и тимозина-альфа1 имеется общий рецептор [Zav’yalov et al., 1991]. Роль тимозина-альфа1 в системе иммунитета Тимозин-альфа1 один из более 40 пептидов фракции 5 экстракта тимуса (см. Получение тимозина-альфа1). Он в 10-1000 раз более активен, чем фракция 5 в различных тестах invivo и invitro по Т-клеточной дифференцировке и усилению ответа лимфоидных клеток на митогены. Тимозин-альфа1 усиливает Т-зависимый вторичный ответ IgG, IgM и IgA антител и активность Т-хелперов. У пациентов, иммунизированных столбнячным анатоксином или полисахаридом менингококков группы С, периферические лимфоциты, обработанные тимозином-альфа1, более выражено синтезируют специфические антитела [Schulof et al., 1983]. Один из наиболее ранних определяемых эффектов тимозина-альфа1 на тимоцитах - увеличение уровня внутриклеточного циклического ГМФ, но не ц-АМФ [Naylor, Goldstein, 1979]. Показано, что тимозин-альфа1 увеличивает продукцию лимфоцитами простагландина Е2, который также может быть включен в раннюю активацию Т-клеток [Rinaldi Garaci et al., 1983]. Обработка тимозином-альфа1 мышиных протимоцитов костного мозга и селезенки вызывает экспрессию поверхностных антигенов тимоцитов: концевой дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT) и аллоантигенов Lyt-1, 2, 3 [Goldschneider et al., 1981]. In vivo тимозин-альфа1 обуславливает созревание, дифференцировку и функционирование Т-лимфоцитов, индуцирует появление Т-клеточных поверхностных антигенов, продукцию лимфотоксина, ИФН-альфа и ИФН-гамма, макрофаг-ингибирующего фактора, ИЛ-2 и его рецептора, увеличивает количество Е-РОК, усиливает противоопухолевый, противоинфекционный иммунитет и эффективность вакцин [Marshall et al., 1980; Low, Goldstein, 1984; Bistoni et al., 1985]. Инкубация макрофагов с антигеном в присутствии тимозина-альфа1 (10-8-10-10 М) приводит к последующему увеличению пролиферативной активности Т-клеток, коррелирующей с их способностью секретировать ИЛ-2 и экспрессировать для него рецепторы [Tzehoval et al., 1989]. 61 Введение экзогенного тимозина-альфа1 молодым здоровым животным не вызывает или имеет малый иммунопотенциирующий эффект. Наибольшие эффекты введение тимозина-альфа1 оказывает в организмах старого возраста и у молодых с угнетенным иммунитетом следствие радио- или химиотерапии [Ishitsuka et al., 1983; Ohta et al., 1985; Doria et al., 1989]. Влияние тимозина-альфа1 на противоопухолевый и противоинфекционный иммунитет Использование тимозина-альфа1 показало значительный иммуно-терапевтический эффект для предотвращения развития индуцированных или спонтанных опухолевых метастазов у мышей [Talmadge et al., 1984]. Введение тимозина-альфа1 приводит к повышению числа полиморфноядерных лимфоцитов и к усилению их активности против Candida [Bistoni et al., 1985]. Тимозин-альфа1 защищает иммуносупрессированных (цитостатиками или рентгеновским облучением) мышей от летальных доз Listeria, Candida, Pseudomonas, Serracia, восстанавливает реакции гиперчувствительности замедленного типа и предотвращает прогрессивный рост опухолей. Введение 5-фторурацила (5-ФУ) мышам в дозе 25 мг/ кг увеличивает патогенность для них L. monocytogenes, C. albicans, P. aeruginosa и S. marcescens, к которым не иммуносупрессированные мыши высоко резистентны. Так различия между LD50 этих микроорганизмов на нормальных и 5-ФУ-обработанных мышах составили 40, 20, 2000 и 2200 раз соответственно. Тимозин-альфа1 в дозе 40 мкг/ кг на 70-80% защищал 5-ФУ-обработанных мышей от летальных доз (LD100) вводимых микроорганизмов. Протективная активность тимозина-альфа1 исследовалась также совместно с каррагенаном (carrageenan) или антитимоцитной сывороткой (АТС), вызывавшими депрессию макрофагов или Т-клеток соответственно. Воздействие каррагенана или АТС абортировали активность тимозина-альфа1 против инфекции Candida, но не против Pseudomonas. Эти результаты показывают, что тимозин-альфа1 проявляет свою активность против Candida-инфекции через Т-клетки и/или макрофаги прямо или опосредованно. С другой стороны, активность, показанная на Pseudomonas-инфекции, свидетельствует, что тимозин-альфа1 может воздействовать и на другие эффекторы, возможно, нейтрофилы [Ishitsuka et al., 1984]. У старых мышей вводимый тимозин увеличивает цитотоксичность Т-лимфоцитов по отношению к клеткам, инфицированным вирусом гриппа, до уровня, отмечаемого у молодых животных [Effros, 2000]. У пожилых мужчин введение тривалентной противогриппозной вакцины в сочетании с тимозином-альфа1 давало более интенсивный иммунный ответ, в виде четырех-кратного увеличения тира антител через 3-6 недель после вакцинации [Gravenstein et al. 1989]. Защитное действие тимозина-альфа1 от токсического эффекта цитостатиков и облучения на клетки костного мозга, за счет созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов и синтеза колониестимулирующих факторов, позволяет использовать тимозин-альфа1 в комбинации с ними для лечения новообразований [Ohta et al., 1985]. Тимозин-альфа1 в 62 комбинации с ИЛ-2 или с ИФН-альфа и ИФН-гамма оказывают синергическое действие в дифференцировке и активации НК-клеток [Favalli et al., 1985; Favalli et al., 1989; Fletcher, Goldstein, 1987]. Инъекции тимозина-альфа1 (200 мкг/кг) совместно с мышиным ИФН восстанавливают активность ЕКК и существенно увеличивают продолжительность жизни мышей с В-16 меланомой [Mastinoetal., 1991a]. Аналогичный эффект усиления цитотоксической активности клеток селезенки отмечен при инъекциях тимозина-альфа1 (200 мкг/кг в течение 4 дней) отдельно или в сочетании с ИЛ-2 [Mastinoetal., 1991b]. При этом установлено, что тимозин-альфа1 в дозах 10-8 и 10-12 М вызывает экспрессию высокоаффинных рецепторов для ИЛ-2 на периферических лимфоцитах человека в присутствии фитогемагглютинина [Leichling et al., 1990]. Введение тимозина-альфа1 совместно с ИЛ-2 или ИФН-альфа в/в DBA/2 мышам с инокулированными клетками Friend-эритролейкемии приводило к полной регрессии подкожной опухоли и излечению мышей. Комбинированная иммунотерапия вызывала синергическое увеличение цитотоксичности клеток селезенки, высокую инфильтрацию опухоли лимфоидными клетками [Garaci et al., 1993]. При исследовании влияния тимозина-альфа1, ИЛ-2 и циклофосфамида на рост карциномы легкого Lewis у мышей C57Bl/6NCrlBR было установлено, что введение цитокинов после химиотерапии циклофосфамидом было значительно более эффективным, чем использование каждого в отдельности. Комбинированная иммуноте-рапия без циклофосфамида незначительно снижала рост опухоли. Химио-иммунотерапия увеличивала цитотоксичность клеток селезенки и выживание животных. Гистологический анализ показал высокую инфильтрацию лимфоидными клетками области убитых опухолевых клеток [Mastino et al., 1992]. Проведено комбинированное лечение 25 пациенток (средний возраст 54 года) с прогрессирующим раком молочной железы. Терапия включала введение эпирубицина 50 мг/ м2 в 1 и 2 дни; тимозина-альфа1 50 мкг п/к 5-8 и 12-15 дни; ИФН-альфа 3.106 ЕД п/к 8 и 15 дни. Циклы повторяли каждые 4 недели. За 2 года остались живы 20 пациенток. Отмечено клиническое улучшение у 9 из 20 пациенток (45%), 7 не имели изменений и у 4-х прогрессирование заболевания. За 153 цикла терапии гематологическая токсичность была очень низкой [Terzoli et al., 1992]. Клиническое применение тимозина-альфа1 Проведение второй фазы клинических испытаний тимозина-альфа1 в George Washington University Medical Center показало, что при лечении 42-х больных раком легкого (non-smallcell) радиотерапией и тимозином-альфа1 у них нормализовался Т-клеточный иммунитет, отсутствовали рецидивы заболевания и значительно возрос индекс выживаемости [Schulof et al., 1985]. Проведено комбинированное лечение 25 пациенток (средний возраст 54 года) с прогрессирующим раком молочной железы. Терапия включала введение эпирубицина 50 мг/ м2 в 1 и 2 дни; тимозина-альфа1 по 50 мкг п/к в 5-8 и 12-15 дни; ИФН-альфа 3.106 МЕ п/к в 8 и 15 дни. Циклы повторяли каждые 4 недели. За 2 года остались живы 20 пациенток. 63 Отмечено клиническое улучшение у 9 из 20 пациенток (45%), 7 не имели изменений и у 4-х наблюдали прогрессирование заболевания. За 153 цикла терапии гематологическая токсичность была очень низкой [Terzoli et al., 1992]. У пяти больных гепатитом В, получавших тимозин-альфа1, нормализовались уровни аланин- и аспартат-аминотрансфераз; у 80% больных после лечения тимозином не обнаружена ДНК вируса гепатита В. При проведении второй фазы клинических испытаний тимозина-альфа1 двойным слепым методом для лечения больных хроническим гепатитом В была показана его высокая эффективность. Подкожное введение 2 раза в неделю в течение 6 месяцев увеличивало частоту наступления ремиссии более чем вдвое по сравнению с применением ИФН-альфа2. Ремиссия продолжалась более 27 месяцев, при этом не было отмечено каких-либо побочных эффектов. Данные результаты позволили FDA (США) разрешить проведение третьей фазы клинических испытаний тимозина-альфа1. Тимозин-альфа1 первоначально развивался фирмой Alpha 1 Biomedicals для лечения гепатита B. Затем фирма SciClone Pharmaceuticals исследовала и зарегистрировала в развивающихся странах тимозин-альфа1 под торговым названием Zadaxin для лечения хронических гепатитов В и C. Zadaxin проходил клинические испытания на эффективность при лечении немелкоклеточного рака легкого, гепатоцеллюлярной карциномы, СПИДа и злокачественной меланомы. При этом тимозин-альфа1 способен потенциировать действие цитокинов и уменьшать гематологическую токсичность химиопрепаратов (циклофосфамида, 5-фторурацила, дакарбазина и ифосфамида) [Garaci et al., 1995; Salvati et al., 1996; Rasi et al., 2000]. Во II фазе клинических испытаний лечения пациентов с распространённым немелкоклеточным раком легкого цисплатином и этопозидом в комбинации с тимозином-альфа1 и ИФН-альфа2a в низких дозах. Циклы химиоиммунотерапии повторяли каждые 3 недели. Отмечены 24 ответа (два полных и 22 частичных) среди 56 подлежавщих лечению пациентов. Среднее выживание было 12,6 месяцев. В целом лечение имело хорошую переносимость. Активность естественных киллерных клеток и подтипы лимфоцитов были угнетены при химиотерапии, но этот эффект был менее выражен у пациентов, получавших тимозин-альфа1 и ИФН в сравнении с группой пациентов, получавших только химиотерапию. Сделан вывод, что комбинация цисплатина и этопозида с тимозином-альфа1 и ИФН-альфа2a в низких дозах эффективна при распространённом немелкоклеточном раке легкого с приемлемой токсичностью [Garaci et al., 1995]. В другом клиническом испытании лечения пациентов с распространённым немелкоклеточным раком легкого 22 пациента получали химиотерапию ифосфамидом или химиотерапию с тимозином-альфа1 и ИФН-альфа2a в низких дозах. Химиоиммунотерапия вызывала увеличенный ответ по сравнению с одной химиотерапией (33% и 10% соответственно). Хотя эти различия не были существенны, значительным было различие во времени прогрессии заболевания (p=0,0059). Количества CD4+, CD8+ и ЕК-клеток были значительно снижены после двух циклов химиотерапии, в то время как никакого различия в количестве клеток не было замечено в химиоиммунотерапии. Гематологическая токсичность была уменьшена иммунотерапией, без 3 и 4 степеней токсичности, отмечен- 64 ной у 50% пациентов, получавших одну химиотерапию [Salvati et al., 1996]. В 2001 тимозин-альфа1находился на III фазе клинических испытаний в США в комбинации с пегилированным ИФН-альфа, но уже был одобрен к применению в Аргентине, Филиппинах, Китае, Перу, Венесуэле, Сингапуре, Шри-Ланке для лечения хронических гепатитов В и С [Billich, 2002]. 65 РЕФНОТ® - РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГИБРИД ФНО-ТИМОЗИН-АЛЬФА1 Аминокислотная последовательность белка ФНО-Т: курсивом выделена последовательность, соответствующая тимозину-альфа1, жирным шрифтом - фактору некроза опухолей-альфа: MetSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnProGlnAlaGly -20 GluGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeu -40 ArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSerGlnValLeu -60 PheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrIleSerArgIle -80 AlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlaIleLysSerProCysGlnArg -100 GluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeuGlyGlyVal -120 PheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAspTyrLeuAsp -140 PheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyIleIleAlaLeuIleAspMetSerAspAla -160 AlaValAspThrSerSerGluIleThrThrLysAspLeuLysGluLysLysGluValVal -180 GluGluAlaGluAsn -185 Рекомбинантный ФНО-Т состоит из 185 а. о., имеет молекулярную массу 20,46 кДа. Препарат рекомбинантного ФНО-Т под названием Рефнот® производит ООО “Рефнот-Фарм” на основании патента [Шмелёв В.А., Чумбуридзе Г.Г., 2002] (рис. 20). Рис. 20. Патент на препарат Рефнот 66 Доклинические исследования Противоопухолевое действие ФНО и его гибрида с тимозином-альфа1 Обобщая полученные данные доклинических исследований препарата рекомбинантного гибридного белка фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 (ФНО-Т) можно сделать следующие выводы: 1. Цитотоксичность, тестируемая на традиционно используемых для ФНО клетках фибросаркомы мыши L-929, показывает, что гибрид ФНО-Т обладает в 10 раз меньшей цитотоксической активностью. Однако, среди исследованных обнаружены линии опухолевых клеток человека(Molt-4, Jm-9, Raji), на которых действие гибридного белка ФНО-Т не уступает или превосходит действие ФНО. 2. Определение противоопухолевой активности препарата гибридного белка в сравнении с ФНО in vitro и in vivo показало, что не все линии исследованных опухолевых клеток чувствительны как к самому ФНО, так и к гибриду ФНО-Т. К чувствительным линиям относятся клетки: фибросаркомы мыши L-929, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека Molt-4, В-клеточной ЭБВ+лимфомы Беркитта африканского типа Raji, В-клеточной лимфомы Jm-9, меланомы В-16. К нечувствительным линиям относятся клетки: мастоцитомы мыши Р-815, миелолимфомы мыши Jack-1, эритромиелолейкоза человека К-562, Т-клеточной лимфомы человека Jurkat, моноцитарного лейкоза человека L-41 и карциномы яичников человека CaOV. 3. Установлена противоопухолевая активность ФНО-Т invivo в отношении перевиваемой солидной опухоли мышей фибросаркомы МС-11. При этом эффект ингибирования роста опухоли ФНО-Т равняется или превосходит действие ФНО и продолжается в течение около двух недель после отмены препарата. Воздействие гибрида ФНО-Т на систему иммунитета Проведено изучение пролиферативной активности гибридного белка в сравнении с ФНО и тимозином на интактных клеткахтимуса, селезенки и лимфатических узлов. Исследование пролиферативного действия препаратов было предпринято с несколькими целями. Первая из них, проверить отсутствие цитотоксического действия препаратов на нормальные клетки иммунной системы. Вторая, по феномену пролиферации клеток можно судить о митогенном и активирующем действии на клетки иммунной системы рекомбинантных белков. И третья, исследовать усиливающее, костимулирующее действие препаратов в комбинации сизвестными митогенами. Эти результаты могут косвенно показывать возможность усиления иммунного ответа при совместном введении рекомбинантных цитокинов с вакцинами, содержащими митогены и некоторые белки-антигены. Результаты исследований пролиферативной активности препаратов на интактных клетках тимуса, селезенки и лимфатических узлов свидетельствуют о том, что ФНО в концентрациях свыше 1 мкг/мл ингибирует пролиферацию клеток лимфатических узлов на 40-50% и не влияет на клетки тимуса и селезёнки. Гибрид ФНО-Т в высоких концен- 67 трациях дозозависимо ингибирует пролиферацию клеток тимуса, но стимулирует клетки селезенки и лимфатических узлов. О влиянии препаратов на активность естественных киллерных клеток (ЕКК) против клеток миелолимфомы мыши Jack-1, меченных 3Н-уридином, судили по цитотоксическому индексу, как отношению показателя ЕКК в опыте (введение препарата) к контролю (препарат не вводили). Данные показали, что препараты ФНО и Т не оказывают влияния на проявление цитотоксического действия ЕКК, а ФНО-Т обеспечивает усиление цитотоксичности при большей дозе НК-клеток эффекторов (50:1). Результаты экспериментов по влиянию препаратов белков на поглотительную функцию макрофагов показывают, что влияние тимозина на фагоцитоз в зависимости от дозы демонстрирует отсутствие выраженного эффекта. Индекс стимуляции не превышает 1,2 при дозе 3,2.10-7М. ФНО имеет снижающийся дозозависимый профиль активации фагоцитоза при увеличении концентрации. Наиболее выраженным эффектом обладает гибрид ФНО-Т; индекс стимуляции фагоцитоза при концентрации 3,2.10-7М достигает 1,8-1,9, при этом нет проявления прямой дозозависимости. Результаты, полученные при исследовании экспрессии маркеров дифференцировки тимоцитов с использованием моноклональных антител, показывают, что все препараты в зависимости от дозы усиливали в разной степени экспрессию антигена Н-2К. Так тимозин демонстрирует известный факт усиления клеточной экспрессии антигена Н-2К, проявляя себя как фактор дифференцировки тимоцитов. ФНО усиливает экспрессию данного антигена при небольших дозах и слабо снижает его представительство на клетках при использовании больших концентраций. В то же время ФНО-Т за исключением самой низкой дозы увеличивает экспрессию антигена Н-2К в дозозависимой форме близкой к тимозину. Анализ экспрессии маркера дифференцировки Т-хелперов антителами анти-CD4 под действием препаратов белков показал, что тимозин усиливает его экспрессию в всех дозах. ФНО и ФНО-Т увеличивают его уровень при меньших иснижают при больших дозах. Анализ экспрессии маркера Т-лимфоцитов киллеров антителами анти-CD8 установил увеличение его экспрессии под влиянием тимозина. ФНО обеспечивает увеличение представительства CD8 только при низкой дозе 5.10-14 M. Гибридный белок ФНО-Т проявляет умеренное стимулирующее действие на выражение этого маркера во всех исследованных дозах. Синергический эффект ФНО и ФНО-Т с антивирусной активностью ИФН-гамма Исследовали антивирусную активность рекомбинантных ФНО, гибрида ФНО-Т и ИФН-гамма против вируса везикулярного стоматита на фибробластах человека in vitro. ФНО и его гибрид не проявили антивирусной активности в концентрациях до 10 мкг/мл. Препарат ИФН-гамма при титровании обладал активностью 105 МЕ/мл. При добавлении ФНО в начальной дозе 1 мкг к раствору ИФН-гамма антивирусная активность композиции составила 107, а в дозе 0,1 мкг - 2.106 МЕ/мл. Добавление к раствору ИФН-гамма 1мкг гибридного белка ФНО-Т привело к увеличению активности до 3.108, а 0,1 мкг - 6.106 МЕ/мл. 68 Фармакокинетика рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот Изучена фармакокинетика рекомбинантного гибридного белка, состоящего из аминокислотных последовательностей альфа-фактора некроза опухолей и тимозинаальфа1(ФНО-Т, субстанция), и нового оригинального препарата Рефнот, являющегося инъекционной лекарственной формой на основе белка ФНО-Т. Для расчета фармакокинетических параметров были подобраны соответствующие математические модели и вычислены фармакокинетические параметры ФНО-Т при внутривенном и подкожном введении субстанции и инъекционной лекарственной формы. При внутривенном введении ФНО-Т и Рефнота: изменение во времени концентрации ФНО-Т в плазме крови мышей и кроликов удовлетворительно описывается двухчастевой моделью; значения фармакокинетических параметров ФНО-Т статистически не отличаются друг от друга; ФНО-Т быстро распределяется по органам и тканям опытных животных; время полураспределения (T1/2α) составляет 5-7 минут; ФНО-Т весьма длительное время присутствует в организме мышей; период полувыведения (T1/2β) в β-фазе составляет ~105-140 минут, а среднее время пребывания препарата в организме (MRT) составляет ~100-130 минут; биодоступность ФНО-Т, входящего в составе лекарственной формы, не отличается от биодоступности субстанции; изменение во времени концентрации ФНО-Т в органах мышей удовлетворительно описывается одночастевой моделью с всасыванием; тканевая доступность (fТ), характеризующая интенсивность проникновения препарата в периферические ткани, показывает, что ФНО-Т проникает во все органы; наиболее интенсивно препарат проникает в печень, селезенку, почки и легкие; мозг и сальник малодоступны для препарата. При подкожном введении ФНО-Т и Рефнота: изменение во времени концентрации в плазме крови мышей и кроликов удовлетворительно описывается одночастевой моделью с всасыванием; значения фармакокинетических параметров ФНО-Т статистически не отличаются друг от друга; ФНО-Т довольно быстро всасывается внутренними органами мышей; время полувсасывания (T1/2вс) составляет 25-40 минут; ФНО-Т весьма длительное время присутствует в организме мышей; период полувыведения (T1/2β) в β-фазе составляет ~210 - 280 минут, а среднее время пребывания препарата в организме (MRT) составляет ~230 -280 минут; изменение во времени концентрации ФНО-Т в органах мышей удовлетворительно описывается одночастевой моделью с всасыванием; тканевая доступность (fТ), характеризующая интенсивность проникновения препарата в периферические ткани, показывает, что ФНО-Т проникает во все органы; наиболее интенсивно препарат проникает в печень, селезенку, почки и легкие; мозг и сальник малодоступны для препарата; биодоступность ФНО-Т, входящего в составе лекарственной формы, не отличается от биодоступности субстанции; биодоступность ФНО-Т выше (110–130%), чем его биодоступность при внутривенном введении. За сутки с мочой выводится 50-60% изотопа от введенного меченного ФНО-Т [Соков и др., 2003]. 69 Общетоксическое действие рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот Целью исследования явилось изучение параметров общетоксического действия, местного раздражающего действия, острой и хронической токсичности субстанции ФНО-Т и лекарственной формы Рефнот. Субстанция ФНО-Т и лекарственная форма Рефнот при курсовом ежедневном подкожном введении крысам в течение 30 дней в дозах до 70,0 мкг/кг массы тела не оказывает токсического влияния на общее клиническое состояние животных, показатели периферической крови, биохимические показатели сыворотки крови и мочи, а также не вызывает повреждения морфологической структуры внутренних органов подопытных животных. Субстанция ФНО-Т и лекарственная форма Рефнот не обладают местным раздражающим действием при однократном и повторном длительном применении. На основании проведенного комплекса исследований, можно сделать заключение о том, что препарат альфа-фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 обладает большой терапевтической широтой и безопасен при длительном применении [Рыбалкин и др., 2003]. Изучение мутагенной активности рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот Целью исследования явилось определение мутагенного действия субстанции ФНО-Т и лекарственной формы Рефнот. Работа была выполнена в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета МЗ РФ «Оценка мутагенных свойств фармакологических средств». Были использованы два теста: - метод учета хромосомных аберраций для оценки мутагенного действия препарата на теплокровных животных; - тест Эймса для учета генных мутаций с использованием бактерий Salmonella typhimurium. Уровень хромосомных аберраций оценивали в клетках костного мозга самцов мышей линии C57Bl/6 при внутрибрюшинном введении: - терапевтической и десятикратной терапевтической доз препарата – однократно, - терапевтической дозы – пятикратно. В качестве терапевтической дозы предложена доза до 250 мкг на человека (3,57 мкг/ кг). Полученные результаты показали, что доля поврежденных клеток в костном мозге мышей, получавших препарат, и количество аберраций на клетку были такими же, как и у интактных животных. В дозах до 35,7 мкг/кг препарат Рефнот не обладает мутагенной активностью в отношении клеток млекопитающих. В тесте Эймса на стандартных индикаторных штаммах Salmonella typhimurium (TA1534, TA1537, TA1950, TA98 и TA100) изучали мутагенное действие препарата в широком диапазоне концентраций: от 0,1 до 1000 мкг на чашку. Установлено, что препарат не индуцирует мутации в клетках индикаторных штаммов S. typhimurium. 70 Таким образом, ни в тесте Эймса, ни при учете хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей мутагенная активность фармакологического препарата Рефнот не установлена [Денисов и др., 2003]. Изучение репродуктивной токсичности субстанции рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот Цель исследований состояла в экспериментальной оценке токсического действия ФНО-Т на эмбриональное развитие зародышей, а также выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в постнатальном периоде жизни. Проведенными экспериментальными исследованиями репродуктивной токсичности ФНО-Т при подкожном введении белым беспородным крысам в дозах от эквитерапевтической до стократной эквитерапевтической на протяжении всего срока беременности, установлено отсутствие у ФНО-Т эмбриотоксического и тератогенного действия. Кроме того, введение ФНО-Т беременным самкам не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также не влияет на скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов [Рыбалкин и др., 2003]. Изучение иммунотоксических свойств субстанции рекомбинантного белка ФНО-Т и препарата Рефнот Цель работы состояла в изучении иммунотоксических свойств субстанции ФНО-Т и лекарственной формы Рефнот. Работа выполнена в соответствии с «Методическими указаниями по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ» Фармакологического комитета МЗ РФ. В экспериментальной работе использованы инбредные мыши гибриды F1 (CBA´C57Bl/6) и Balb/c, а также беспородные белые крысы. Исследовали иммунотоксические свойства лекарственного препарата при парентеральном введении в дозах до стократной терапевтической. После введения исследуемого лекарственного препарата животным оценивали клеточный и гуморальный иммунный ответ, на эритроциты барана (ЭБ), общий уровень иммуноглобулинов в сыворотках крови, фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (объект фагоцитоза - Staphylococcus aureus), уровень комплемента в сыворотках крови. В результате проведенного исследования установили, что лекарственный препарат Рефнот не обладает иммунотоксическим действием на экспериментальных животных. У них не выявлено случаев угнетения изученных параметров от уровня контроля при продолжительном – от 10 суток до 1 месяца - введении испытуемого препарата в дозах до 70 мкг/кг по действующему веществу [Денисов и др., 2003]. 71 КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I, II И III ФАЗЫ РЕФНОТА ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Изучение безопасности, переносимости и эффективности препарата Рефнот у пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи (I фаза) I фаза клинических испытаний проводилась в исследовательском центре: ГУ Российский Онкологический Научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН директор: академик РАН, РАМН Давыдов М. И. Главный исследователь: д.м.н., проф. Любаев В. Л., зав. отделением «Опухолей головы и шеи». В исследование было включено 15 пациентов, 4 женщины и 11 мужчин, и все 15 пациентов полностью выполнили исследование в соответствии с протоколом. У всех включенных в исследование пациентов имелась злокачественная опухоль головы или шеи. Информация об опухолях содержится в таблице 3. Таблица 3. Характеристика включенных в исследование пациентов. 72 Код пациента Локализация опухоли Количество дней от постановки диагноза до включения в исследование Стадия заболевания 01 правая щечная область 103 4 02 полость рта 342 4 03 полость рта 428 3 04 лимфоузел шеи слева 231 4 05 полость рта 457 1 06 полость рта 193 3 07 мягкие ткани и лимфоузлы шеи 676 1 08 полость рта 764 2 09 верхнечелюстная пазуха 130 4 10 ротоглотка 1237 4 11 передняя поверхность шеи 145 3 12 ротоглотка 1623 3 13 ротоглотка 1292 4 14 язык 910 2 15 подчелюстная область слева 850 1 Данные, полученные в ходе исследования, показывают, что значимые влияния Рефнота на температуру тела пациентов не выявлены. Вместе с тем, у ряда пациентов (01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 11, 12) в ходе исследования отмечались эпизоды повышения температуры тела. Ни у одного из пациентов, принявших участие в исследовании, не было отмечено ни одного серьезного нежелательного явления. Ни у одного из включенных в исследование пациентов курс терапии не был прерван. Клиническая переносимость. По результатам терапии каждого пациента исследователь оценивал клиническую переносимость терапии Рефнотом по следующей шкале оценок: - хорошая у 80% пациентов; - удовлетворительная у 20%; - плохая отсутствовала. В таблице 4 отражены те нежелательные явления, которые врачи внесли в карты индивидуального наблюдения и связь которых с введением препарата не подвергается врачами сомнению. Таблица 4. Нежелательные явления, связь которых с введением препарата не подвергается врачами сомнению. Нежелательные явления Коды пациентов Количество случаев Число % Повышение температуры 01, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 11, 12 9 60,0 Болезненность при введении 04, 06, 07, 12, 14, 15 6 40,0 Повышение СОЭ 06, 11, 12 3 20,0 Лейкоцитоз 06, 11, 12 3 20,0 Боль в зоне локализации опухоли 04, 07 2 13,3 Повышение АД 12 1 6,7 Вскрытие опухолевого инфильтрата (свищ) 11 1 6,7 Отек и гиперемия слизистой краев язвы 13 1 6,7 Отек языка 14 1 6,7 Отек и увеличение объема опухоли 04 1 6,7 Фибринозно-некротические налеты дна и краев язвы 13 1 6,7 Болезненная пальпация опухоли и мягких тканей над ней 04 1 6,7 73 В целом нежелательные явления, в отношении которых врачи не подвергали сомнению их отношение к исследуемому препарату, наблюдалось у 12 из 15 пациентов (80,0%). Значительная часть из всех отмеченных нежелательных явлений связана со способом введения препарата. К этой группе можно отнести следующие явления: - болезненность при введении препарата; - боль в зоне локализации опухоли; - отек и увеличение объема опухоли; - отек и гиперемия слизистой краев язвы; - отек языка; - фибринозно-некротические налеты дна и краев язвы; - болезненная пальпация опухоли и мягких тканей над ней. Если ограничиться только нежелательными явлениями, не связанными со способом введения препарата, и связь которых с введением препарата врачи не подвергают сомнению, то такие нежелательные явления отмечены у 10 пациентов из 15 (66,7%). Оценка противоопухолевого эффекта препарата Рефнот. Через три недели после начала курса терапии исследуемым препаратом оценивался противоопухолевый эффект препарата Рефнот для каждого пациента по объективной шкале оценок: 1 – полная регрессия, то есть клинически подтвержденное исчезновение опухолевого очага; 2 – частичная регрессия, то есть уменьшение площади опухолевого очага не менее чем на 50%; 3 – стабилизация опухоли, то есть уменьшение площади опухолевого очага менее чем на 50%, или стабилизация размеров опухоли; 4 – прогрессирование, то есть увеличение площади опухолевого очага не менее чем на 25%. Полученные оценки приведены в таблице 5. Таблица 5. Оценки противоопухолевого эффекта препарата Рефнот. Оценки Число пациентов % Полная регрессия опухоли 1 6,7 Частичная регрессия опухоли 2 13,3 Стабилизация опухоли 9 60,0 Прогрессирование опухоли 3 20,0 Выводы клинического исследования I фазы. Проведенные в рамках клинического исследования I фазы испытания показали, что клиническая и биологическая переносимость препарата Рефнот при его внутриопухолевом введении пациентам с плоскоклеточным раком головы и шеи в диапазоне доз от 100 000 до 800 000 ЕД можно отнести к категории хорошей. В ходе испытаний не отмечены какие-либо серьезные нежелательные явления. Все пациенты полностью выполнили протокол исследования. 74 Доказано отсутствие дозозависимой токсичности препарата Рефнот. Максимально допустимой можно считать дозу не менее 800 000 ЕД. Данные, полученные относительно противоопухолевой эффективности препарата Рефнот в дозах от 100 000 ЕД до 800 000 ЕД можно отнести к категории предварительных. Для более полной оценки этой характеристики препарата необходимы клинические исследования II и III фазы на большем количестве больных [Любаев и др., 2005]. Сравнительное рандомизированное исследование Рефнота® в комбинации с химиотерапией в режиме FEC, Рефнота® в комбинации с Ингароном® и химиотерапией FEC, а также одной химиотерапии FEC при местно-распространенном и метастатическом раке молочной железы (фаза II/III) Исследование проводилось в НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова г. Санкт-Петербург, главный исследователь - член-корреспондент РАМН, профессор, д.м.н. Семиглазов В. Ф. Рак молочной железы (РМЖ) остается наиболее частым онкологическим заболеванием у женщин. За период с 1990 г. по 2000 г. в мире было диагностировано более 10 миллионов новых случаев РМЖ. РМЖ также является основной причиной смерти в мире от злокачественных новообразований у женщин. До настоящего времени антрациклин-содержащие режимы остаются наиболее эффективными в терапии раннего и диссеминированного РМЖ. Наиболее часто применяются режимы FAC (5-фторурацил, доксорубицин, циклофосфамид) и FEC (5-фторурацил, эпирубицин, циклофосфан). Частота объективных ответов при местно-распространенном и метастатическом РМЖ при использовании этого режима достигает 54%, а время до прогрессирования составляет примерно 273 дня. При этом средняя продолжительность жизни при метастатическом РМЖ составляет 18-26 мес. Ведутся многочисленные исследования различных способов увеличения эффективности противоопухолевой терапии. Одним из таких методов является цитокино-терапия. Дизайн исследования. Общая продолжительность исследования составила 6 циклов химиотерапии или 18 недель. В день включения пациентки в исследование определяется вариант лечения путем рандомизации, выполняется физикальное обследование, определяются основные показатели состояния организма, определяется статус ECOG, фиксируются неблагоприятные события за период скрининга, сопутствующая терапия за последние 4 недели. Пациентки, рандомизированные в группу В, получают первую инъекцию Ингарона. В 1-й день каждого цикла химиотерапии изучаются неблагоприятные события, вводятся цитостатики (5-фторурацил 500 мг/м2, эпирубицин 50 мг/м2, циклофосфамид 500 мг/м2), больные из групп Б и В получают подкожную инъекцию Рефнота за 30 минут до введения цитостатиков. В дни 2-5 каждого цикла химиотерапии все больные из группы Б получают инъекции Рефнота. 75 Больные из группы В в дни 2, 4, 6, 8 получают инъекции Ингарона, а в дни 3, 5, 7, 9 инъекции Рефнота. При каждом посещении клиники регистрируются побочные реакции, если таковые имеются. В день 14-й 1-го цикла химиотерапии всем больным выполняется контрольный анализ гематологических показателей. Накануне каждого цикла химиотерапии всем больным выполняется контроль гематологических показателей, а также биохимических показателей крови, а также проводятся физикальное обследование, определение основных показателей состояния организма, функционального статуса, регистрируются неблагоприятные реакции, а также сопутствующая терапия. Накануне 3-го и 5-го циклов проводится оценка ответа опухоли на лечение с помощью физикальных и инструментальных методов. На 21-й день 6-го цикла (завершение терапии) проводится физикальное обследование, измерение опухоли, регистрация основных показателей организма, функционального статуса, неблагоприятных событий и сопутствующей терапии, а также выполняются лабораторные исследования (клинический и биохимический анализы крови). Схема лечения. Группа А. Пациентки, рандомизированные в группу А, получали химиотерапию FEC 6 циклов с интервалом в 21 день. Все больные получали стандартную антиэметическую терапию. 5-фторурацил 500 мг/м2 внутривенно, эпирубицин 50 мг/ м2 внутривенно болюсно в течение 15 минут, циклофосфан 500 мг/м2 внутривенно. Группа Б. Пациентки, рандомизированные в группу Б, дополнительно к химиотерапии FEC получали Рефнот в дозе 200 000 ME подкожно в день химиотерапии (за 30 минут до введения цитостатиков) и 4 дня после химиотерапии. Содержимое 2 флаконов разводили в 2 мл воды для инъекций и вводили в наружную поверхность плеча или бедра подкожно. Группа В. Пациентки, рандомизированные в группу В, дополнительно к химиотерапии FEC получали Ингарон в дозе 500 000 ME подкожно за день до химиотерапии и далее через день всего 5 инъекций, Рефнот 200 000 ME подкожно в день химиотерапии (за 30 минут до введения цитостатиков) и далее через день всего 5 инъекций. Ингарон 500 000 МЕ (1 флакон) разводили 1 мл воды для инъекций и вводили подкожно в наружную поверхность бедра или плеча. Рефнот: содержимое 2 флаконов разводили 2 мл воды для инъекций и вводили в наружную поверхность плеча или бедра подкожно. Места инъекций чередовали. Критерии оценки эффективности Эффективность терапии РМЖ оценивали по степени регресса опухоли. Для этого проводили объективные исследования методами рентгенографии или эхографии. Оценку противоопухолевого эффекта производили согласно критериям RECIST: полная регрессия - исчезновение всех исследуемых опухолевых очагов, подтвержденное через 4 недели; 76 частичная регрессия - уменьшение суммы наибольшего диаметра (НД) всех исследуемых очагов, по крайней мере, на 30% по сравнению с исходной оценкой, подтвержденное как минимум через 4 недели; стабилизация - отсутствие, как существенного уменьшения, так и существенного увеличения размеров опухоли, если за точку отсчета принимается минимальная сумма НД, зафиксированная после начала лечения; прогрессирование - увеличение суммы НД всех исследуемых очагов, определенной изначально, не менее чем на 20% (за точку отсчета принимается минимальная сумма НД, зафиксированная после начала лечения) либо появление одного или более новых очагов поражения. Для точного определения полного или частичного регресса опухоли подтверждали изменение размеров опухоли повторным обследованием не менее чем через 4 недели после того, как впервые были соблюдены критерии оценки ответной реакции. Для каждой больной в течение всего периода исследования применяли один и тот же метод оценки эффективности лечения. По возможности все измерения для конкретной больной в течение всего исследования выполнял один и тот же исследователь. Время до начала объективной ответной реакции на терапию — промежуток времени от начала терапии до даты, когда впервые документированы частичный или полный регресс. Продолжительность периода до прогрессирования - время от начала терапии до прогрессирования заболевания. Результаты исследования. Характеристика популяции. В исследование было включено 111 больных, из них в группу А - 40, в группу Б - 29, в группу В - 42. Распределение пациентов в группах, согласно классификации TNM приведено в таблицах 6-8. Таблица 6. Оценка распространенности опухолей. Все Т1 Т2 Т3 Т4 Все n 2 18 15 76 111 % 1,80 16,22 13,51 68,47 100,00 Группа А n % 0 0,00 6 15,00 5 12,50 29 72,50 40 100,00 Группа Б n % 1 3,45 5 17,24 4 13,79 19 65,52 29 100,00 Группа В n % 1 2,38 7 16,67 6 14,29 28 66,67 42 100,00 Таблица 7. Оценка наличия или отсутствия метастазов в регионарных лимфатических узлах и степень их распространения. Все N0 N1 N2 N3 Все n 10 25 66 10 111 % 9,01 22,52 59,46 9,01 100,00 Группа А n % 5 12,50 13 32,50 18 45,00 4 10,00 40 100,00 Группа Б n % 4 13,79 7 24,14 17 58,62 1 3,45 29 100,00 Группа В n % 1 2,38 5 11,90 31 73,81 5 11,90 42 100,00 77 Таблица 8. Оценка наличия или отсутствия отдаленных метастазов. Все M0 M1 Все n 95 16 111 Группа А n % 34 85,00 6 15,00 40 100,00 % 85,59 14,41 100,00 Группа Б n % 25 86,21 4 13,79 29 100,00 Группа В n % 36 85,71 6 14,29 42 100,00 Между группами не выявлено статистически значимых различий по исходной классификации опухолей. Влияние терапии на состояние опухолей Согласно протоколу исследования оценка эффективности лечения в изучаемых группах проводилась на основании следующих основных критериев: полный или частичный регресс опухоли, прогрессирование опухоли и количество летальных исходов. Оценка частоты полного регресса опухоли по группам приведена в таблице 9. Таблица 9. Полный регресс опухолей. Все После 2 курсов терапии После 4 курсов терапии После 6 курсов терапии n 2 5 9 % 1,80 4,50 8,11 Группа А n % 1 2,50 1 2,50 3 7,50 Группа Б n % 1 3,45 4 13,79 5 17,24 Группа В n % 0 0,00 0 0,00 1 2,38 Обращает на себя внимание тенденция к более частому полному регрессу опухоли – в 2 и более раз, в группе Б (Рефнот), которая более ярко выражена по мере увеличения циклов химиотерапии. Однако различия между рассматриваемыми группами терапии по проценту пациенток с полным регрессом опухоли не являются статистически значимыми. В частности для полного регресса опухоли после 6 курсов химиотерапии при сравнении групп А и Б (Р=0,21). Анализ частоты полного или частичного регресса опухоли приведен в таблице 10. Таблица 10. Полный или частичный регресс опухолей. Все После 2 курсов терапии После 4 курсов терапии После 6 курсов терапии n 20 44 59 % 18,02 39,64 53,15 Группа А n % 7 17,50 16 40,00 22 55,00 Группа Б n % 7 24,14 13 44,83 18 62,07 Группа В n % 6 14,29 15 35,71 19 45,24 Выявленная ранее на предварительных этапах исследования тенденция, заключающаяся в более выраженной эффективности лечения (полный или частичный регресс опухолей) во 2 группе (+ Рефнот) сохраняется и на данном этапе исследования, хотя различия незначительно превышают 7%. Различия между рассматриваемыми группами терапии по проценту пациенток с полным регрессом опухоли не являются статистически значимыми. В частности для 78 полного или частичного регресса опухоли после 6 курсов химиотерапии при сравнении групп А и Б Р=0,56. Отметим, что до начала исследования предполагалось, что после 6 курсов терапии в контрольной группе примерно у 54% пациенток будет отмечен полный или частичный регресс опухоли. Полученные экспериментальные данные практически полностью подтверждают эту оценку. Наряду с этим на данном этапе удалось выявить преимущества в группе, леченной Рефнотом - 62% полного или частичного регресса опухоли. Анализ частоты прогрессирования опухоли в изучаемых группах приведен в таблице 11. Таблица 11. Прогрессирование опухолей. Все После 2 курсов терапии После 4 курсов терапии После 6 курсов терапии Смерть или прогрессирование в ходе или после окончания химиотерапии n 5 5 7 % 4,50 4,50 6,31 Группа А n % 3 7,50 3 7,50 4 10,00 Группа Б n % 0 0,00 0 0,00 0 0,00 Группа В n % 2 4,76 2 4,76 3 7,14 21 18,92 10 5 6 25,00 17,24 14,29 Обращает на себя внимание факт, что в группе пациенток, получавших Рефнот (группа Б) прогрессирование опухоли не отмечалось ни в одном случае!, тогда как в контрольной группе прогрессирование опухоли встречалось у 25% больных. Различия между рассматриваемыми группами терапии по проценту пациенток с прогрессированием опухоли в ходе или после химиотерапии или со смертельным исходом не являются статистически значимыми. Распределение пациенток с летальным исходом в изучаемых группах представлено в таблице 12. Таблица 12. Смертельный исход после терапии. Группа А Б В Все Число 5 2 4 11 % 12,50 6,90 9,52 9,91 Различия между рассматриваемыми группами терапии по проценту пациенток со смертельным исходом не являются статистически значимыми. Самые высокие показатели – в контрольной группе А, самые низкие – в группе Б. За исключением местной реакции на введение Рефнота (нежелательное явление слабой степени) между группами нет статистически значимых различий по частоте отмеченных нежелательных явлений, что свидетельствует о безопасности использования Рефнота в комбинированной терапии у больных с изучаемой патологией. Выводы. 1. К окончанию исследования 111 пациенток (48,26%) завершили как минимум 2 курса химиотерапии. Из них 40 пациенток (36,04%) из группы А (контрольная группа, 79 в которой пациенты получали стандартную химиотерапию), 29 пациентов (26,13%) из группы Б (получали помимо стандартной химиотерапии препарат Рефнот), 42 пациента (37,84%) из группы В (получали помимо стандартной химиотерапии комбинацию препаратов Рефнот и Ингарон), 2. После 6 курсов химиотерапии полный регресс опухоли отмечен у 7,50% пациенток из контрольной группы А, у 17,24% из группы Б (Рефнот). 3. После 6 курсов химиотерапии полный или частичный регресс опухоли отмечен у 55,00% пациенток из контрольной группы А, у 62,07% из группы Б. 4. После 6 курсов химиотерапии прогрессирование опухоли отмечено у 10,00% пациенток в группе А, у 0,00% пациентов в группе Б. 5. Всего к окончанию исследования умерло 12,50% пациенток из группы А, 6,90% пациентов из группы Б и 9,52% пациентов из группы В. Между группами нет статистически значимых различий по этому параметру. В частности, при сравнении по этому параметру групп А и Б Р=0,45. 6. У всех пациенток, получавших в ходе терапии препарат Рефнот (группы Б и В) выявлена облигатная местная обратимая реакция слабой степени выраженности, обусловленная способом введения препарата Рефнот, что свидетельствует о безопасности применения Рефнота в комбинированной терапии у изучаемого контингента больных. По совокупности полученной информации можно сделать вывод о выраженной тенденции к более высокой терапевтической эффективности в группе пациенток, получавших в комбинированной терапии Рефнот (отсуствие прогрессирования опухоли у 100% больных и более выраженный полный или частичный регресс опухоли - 7%). Наряду с этим следует отметить хорошую переносимость Рефнота, заключающуюся в отсутствии дополнительных нежелательных явлений в комбинированной терапии у изучаемого контингента больных [Семиглазов, 2009]. 80 Заключение и выводы по доклиническим и 1-2-3 фазам клинических испытаний Данные научной литературы о доклинических исследованиях ФНО позволяют сделать некоторые выводы о перспективности его применения в виде монопрепарата для лечения опухолей у человека. По данным чувствительности клеток из опухолей пациентов, ФНО может быть эффективен для лечения опухолей следующих локализаций: цервикальных карцином матки, карцином легких, желудка, глиом нервной системы, плоскоклеточных карцином головы и шеи, аденокарцином поджелудочной железы, гормонозависимых аденокарцином молочной железы. Эффект по этим опухолям в виде полных клинических ответов предположительно может составлять 20-30%. Комбинация ФНО с ИФНом-гамма проявляет синергический цитотоксический эффект и может быть перспективна для лечения опухолей следующих локализаций, в дополнение к перечисленным выше: плоскоклеточных карцином и аденокарцином шейки матки, гормонозависимых и гормононезависимых аденокарцином молочной железы, мезотелиом, плоскоклеточных карцином головы и шеи, карцином легких, толстой кишки, яичников, предстательной железы и остеосаркомы. Эффект по этим опухолям в виде полных клинических ответов предположительно может составлять до 90%. Кроме этого, для глиом нервной системы и аденокарцином поджелудочной железы эффект в виде полных клинических ответов предположительно может достигать 50-70%. Комбинация ФНО с ИФН-альфа также проявляет синергический противоопухолевый эффект и может быть перспективна для лечения опухолей мочевого пузыря с клинической эффективностью до 90%. В отношении к химиопрепаратам ФНО продемонстрировал, что в ряде случаев способен отменить устойчивость опухолевых клеток к ним, а комбинация ФНО и химиопрепарата синергично убивает опухолевые клетки. Такие эффекты показаны на клетках карцином яичников, где ФНО существенно повышает действие митоксантрона, доксорубицина, адриамицина и цисплатина. Однако действие таксола было усилено ФНО только на 50% карцином яичников, а действие винбластина и блеомицина не изменялось. ФНО усилил действие цисплатина также на клетках аденокарцином легкого и тамоксифена на клетках аденокарцином молочной железы. Комбинация ФНО с ИФН-гамма повышала эффект цисплатина на клетках аденокарцином желудка и цервикальных карцином, а также 5-фторурацила на клетках карцином толстой кишки. Опыт клинического применения ФНО подтверждает выводы, сделанные на основании доклинических испытаний. Так клиническое применение ФНО, как монопрепарата в виде системного (в/в, в/м и п/к) введения, ведет к выраженным побочным и токсическим явлениям у пациентов и показывает не высокую противоопухолевую эффективность в виде полных клинических ответов до 10-20%. Внутриопухолевое или перитуморальное введение ФНО показывает меньшую токсичность и более высокий терапевтический эффект от остановки роста (до 90% опухолей) до полного уничтожения опухолей. 81 Однако революционное изменение противоопухолевой эффективности ФНО произошло от применения его в комбинации с химиопрепаратом (мелфалан) и ИФНом-гамма или без него в виде изолированной региональной или органной перфузии. Это локальное комбинированное применение вызывало полную регрессию даже очень больших неоперабельных карцином и сарком в 70-80% случаев,а меланом до 96% случаев. Сконструированный нами гибридный белок фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 (ФНО-Т), являющийся действующим веществом препарата Рефнот, имеет удельную цитотоксичность на клетках L-929, составляющую 2.106 ЕД на мг белка в присутствии актиномицина Д и проявляет иммуномодулирующее действие. ФНО-Т обладает прямым цитотоксическим (апоптоз опухолевых клеток) или цитостатическим (арест клеточного цикла) противоопухолевым действием in vitro и in vivo на различных линиях опухолевых клеток. По спектру цитотоксического и цитостатического действия на опухолевые клетки препарат не уступает, а на некоторых опухолях превосходит ФНО человека. Результаты, полученные при токсикологических исследованиях гибридного белка ФНО-Т, позволяют сделать заключение, что он не оказывает общего токсического действия на животных в дозах до 500 мкг/кг, а в клинических исследованиях на людях до 400 мкг (800.000 ЕД) на одну инъекцию, применение которых в случае нативного ФНО ведет к множественным системным повреждениям. Это свидетельствует о том, что присоединение тимозина-альфа1 к С-концу ФНО снизило его общую токсичность и придало ему дополнительные новые свойства. Однако у этого препарата есть некоторые особенности его применения в клинике. Первое: клинический противоопухолевый эффект Рефнота зависит от того, каким образом опухоль отвечает на ФНО, как таковой. Поясним, это положение: 1) если опухолевые клетки отвечают на воздействие препарата, запуская апоптоз (цитотоксическое действие), то можно наблюдать полный (исчезновение опухоли) или частичный (уменьшение размеров опухоли) клинический ответ; 2) если воздействие препарата запускает в опухолевых клетках арест клеточного цикла (цитостатическое действие), то будет наблюдаться стабилизация или частичная регрессия опухоли. Частичная регрессия опухоли наблюдается в том случае, когда арест клеточного цикла становится необратимым, что приводит к клеточной смерти через старение. Часто при цитостатическом эффекте опухолевые клетки претерпевают процессы дифференцировки (становятся более зрелыми), экспрессируя ряд антигенов, включая молекулы I класса ГКГС. В ряде случаев вокруг опухоли формируется фиброзная капсула; 3) наконец, если опухолевые клетки не чувствительны к препарату за счет накопленных мутаций, выключивших их апоптотические и контролирующие клеточный цикл машины. Или вариант резистентности, когда опухолевые клетки синтезируют эндогенный ФНО и в них отмечается высокая активность ядерного фактора-каппаB (NF-κB). В этом случае опухоль продолжает расти и метастазировать. В этом смысле клинический эффект будет зависеть не только от свойств препарата, но и от свойств конкретных опухолевых клеток у конкретного больного. В этом случае предсказать эффект лечения apriori не возможно. Ответ даст только пробный курс лечения с последующим объективным контролем судьбы опухоли. 82 Второе: привычная химиотерапевтам логика эскалации доз и лечение максимальнымипереносимыми дозами химиопрепаратов может работать только в варианте 1) апоптоз, да и то не всегда. На ряде опухолей показано, что дозы ФНО, различающиеся в 1000 раз, оказывают одинаковое действие. То есть, ответ опухолей на ФНО работает часто как в кардиологии принцип сокращения миокарда – “всё или ничего”. В вариантах 2) арест клеточного цикла и 3) опухолевые клетки не чувствительны к препарату, эскалация доз кажется вообще бессмысленной. Возникает вопрос: что же делать, если опухоль не отвечает отдельно на Рефнот (ФНО) и отдельно на химиопрепарат? Ответы уже даны доклиническими исследованиями: 1) в ряде случаев Рефнот (ФНО) отменяет устойчивость опухоли, и она становится высоко чувствительной к комбинации Рефнот + химиопрепарат. При этом подбор синергичного химиопрепарата также необходим для конкретной опухоли. 2) комбинации Рефнота (ФНО) с интерферонами альфа и гамма часто дают аддитивный или синергический противоопухолевый эффект. Особенно эффективны эти комбинации, когда возникновение и развитие опухоли связано с канцерогенными вирусами: вирусы папилломы (рак шейки матки), вирусы гепатитов В и С (гепато-целлюлярная карцинома), вирус Эпштейна-Барра и др. 3) устойчивость опухолевых клеток к Рефноту (ФНО), а также к химиопрепаратам и радиотерапии, может быть обусловлена ативностью в них ядерного фактора-каппаB (NF-κB). Гены, работу которых целенаправленно запускает фактор транскрипции NF-κB, вызывают пролиферацию, выживание (анти-апоптоз) и миграцию (метастазирование) опухолевых клеток, а также воспаление и ангиогенез. NF-κB коститутивно активирован в человеческих лимфомах, карциномах молочной железы, простаты, легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, головы и шеи, пищевода, шейки матки и многих других опухолях. Средства, которые ингибируют NF-κB, как показано, уменьшают опухолевый рост, метастазирование, а также могут индуцировать апоптоз злокачественных клеток.Ингибирование NF-κB является важным механизмом действия стероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов (аспирин, сулиндак, ибупрофен, целекоксиб), натуральных (куркумин, ресвератрол, эпигаллокатехин-3-галлат -полифенол зелёного чая) и синтетических продуктов, которые проявляют терапевтическую и профилактическую противораковую активность. Новые средства, нацеленные на ингибирование протеасомы (бортезомиб, Velcade), IκB-киназы (CHS-828, BMS-345541) и другие киназы (DMAT, Иматиниб), включенные в активацию NF-κB, показали противораковую активность в доклинических или клинических исследованиях. Комбинации этих ингибиторов NF-κB с цитотоксическими препаратами и радиотерапией в настоящее время клинически исследуются для усиления их эффективности при лечении раковых заболеваний. А комбинации ингибиторов NF-κB с Рефнотом (и химиопрепаратами) для усиления его эффективности и отмены резистентности к нему опухолевых клеток требуют проведения новых клинических испытаний. 83 IV фаза клинических испытаний препарата Рефнот «Влияние Рефнота на иммунитет у онкологических больных» Клинические исследования проводили: З. Г. Кадагидзе, д.м.н., профессор; Е. Г. Славина, д.м.н.; М. Е. Абрамов, к.м.н.; Г. В. Вышинская, д.м.н.; А. Д. Даренская в ФГБУ “Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН”, г. Москва. Одно из современных направлений развития онкологии – это изучение роли цитокинов в лечении злокачественных опухолей. Важнейшим из цитокинов является фактор некроза опухоли (ФНО), обладающий цитотоксическим и цитолитическим действиями в отношении некоторых опухолей, иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектами [Varfolomeev et al. 2012, Qidwai T, Khan F. 2011]. Как медиатор воспаления он активирует иммунокомпетентные клетки организма, осуществляет рост и дифференцировку эндотелиальных клеток, подавляет рост опухолевых клеток [Heerschap et al. 2007]. ФНО усиливает рост сосудов в нормальных тканях и подавляет их рост в опухоли. Он участвует в развитии иммунного ответа, обусловливая пролиферацию В- и Т-лимфоцитов, и препятствует возникновению иммунологической толерантности [Vujanovic N.L. 2011, Vujanovic N.L. 2001, Aggarwal et al. 2012]. С ФНО первоначально связывали большие надежды как с противоопухолевым цитокином, обладающим цитотоксическим и цитостатическим действиями. Однако последующие клинические исследования показали, что рекомбинантный ФНО высокотоксичен для человека при системном введении, что не позволяет достигать необходимого терапевтического эффекта. Таким образом, применение ФНО в медицине было ограничено его побочными эффектами [Aggarwal et al. 2012, Heerschap et al. 2007]. И только при использовании ФНО в монотерапии или в комбинации с мелфаланом в виде изолированной регионарной перфузии пациентами с меланомой или саркомой конечности были достигнуты высокие клинические результаты. Впервые эти данные были опубликованы в 1992 г. F. J. Lejeune и соавт. В многочисленных исследованиях было показано, что регионарное введение ФНО не только вызывает некроз и последующее разрушение кровеносных сосудов опухоли, но и повышает эффективность химиотерапии [Aggarwal et al. 2012, Heerschap et al. 2007]. Важным событием в клинической онкологии стало создание в России нового препарата – иммуномодулятора Рефнот – комбинации рекомбинантного ФНО-α и тимозина-α1. Он состоит из 185 аминокислотных остатков, последние 28 из которых на С-конце являются последовательностью тимозина-α1. Препарат Рефнот представляет собой уникальное соединение – гибридную молекулу двух биологически активных агентов – цитокина ФНО и гормона тимозина. Рефнот был изучен в онкологических клиниках России. Доклинические исследования и I фаза клинических исследований были проведены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов. II и III фазы открытого контролируемого рандомизированного исследования проводились в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (Санкт-Петербург). Показаны низкая системная токсичность препарата, его новые уникальные иммуномодулирующие свойства при сохранении противоопухолевой активности природного ФНО. 84 Материал и методы В ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН состоялось изучение применения Рефнота в монотерапии и в сочетании с химиотерапией при ряде злокачественных опухолей. Всего в исследование были включены 55 больных, оценены 54 пациента. Первая группа больных, в которой проводилась монотерапия Рефнотом, включила 21 пациента (5 мужчин и 16 женщин) в возрасте от 37 до 72 лет (средний возраст – 52,5 года), в т. ч. 14 пациентов с диссеминированной меланомой кожи (1 из них – с диссеминированной меланомой глаза), 4 – с диссеминированным раком толстого кишечника и 3 – с другими опухолями. К моменту начала лечения все пациенты исчерпали возможности стандартной лекарственной терапии. Рефнот вводился в дозе 100 тыс. МЕ в 1–5-й дни подкожно с 2-дневными перерывами в течение 4 недель. Вторая группа больных, в которой Рефнот применялся в комбинации с химиотерапией, включила 33 пациента (12 мужчин и 21 женщину) в возрасте от 27 до 73 лет (средний возраст – 51 год) с диссеминированной меланомой кожи, ранее не получавших лекарственного лечения по поводу диссеминированной болезни. Рефнот вводился в дозе 100 тыс. МЕ в 1–5-й дни подкожно с 2-дневными перерывами в течение 2 недель или по 400 тыс. МЕ подкожно 3 раза в неделю в течение 4 недель. Далее с 3-й или 5-й недели провели химиотерапию: дакарбазин 250 мг/м2 внутривенно струйно в дни 1–3, ломустин 80 мг/м2 внутрь в день 1 через 3 часа после дакарбазина, цисплатин 80 мг/м2 внутривенно со стандартной гипергидратацией в день 3. Антиэметическая профилактика стандартная. Далее 2-недельный перерыв. Все пациенты имели гистологическое подтверждение диагноза и измеряемые проявления болезни. У всех больных к моменту начала лечения отмечены удовлетворительное общее состояние (0–1 по классификации ВОЗ), нормальные гематологические и биохимические показатели крови, функции печени и почек. В обеих группах больных было изучено влияние Рефнота на основные показатели состояния иммунной системы. Анализы крови для определения иммунного статуса забирались во всех группах до начала терапии Рефнотом и через каждые 2 или 4 недели лечения (в зависимости от характера курсов). Как известно, Т-лимфоциты играют ключевую роль в противоопухолевом иммунитете. Они также участвуют в реакциях гуморального иммунитета, т. к. для продукции антител к большинству антигенов В-клеткам необходимо взаимодействие с Т-хелперами (это в основном CD4+-Т-лимфоциты). В противоопухолевом иммунитете существенную роль играют также лимфоциты – естественные киллеры (NK), не относящиеся ни к Т-, ни к В-популяциям, принимающие участие в антиметастатическом действии иммунной системы. Оценивалось воздействие Рефнота на различные субпопуляции Т-лимфоцитов, а также на количество и активность NK-клеток. Использовался следующий спектр иммунологического тестирования: CD3, CD5, CD7, CD4, CD8, CD4/CD8, HLA-DR, CD38, CD25, CD50, CD16, CD11b, CD20, CD95, CD45RA, CD71, CD4/CD25, CD28, CD8/CD28, активность NK-клеток, IgG, IgA, IgM. 85 Результаты В первой группе 21 пациенту было проведено 36 курсов лечения Рефнотом – 180 введений препарата. Каких-либо серьезных значимых побочных эффектов отмечено не было. Из основных явлений можно выделить гиперемию 0–1-й степени и незначительную болезненность, максимально 1-й степени, в месте введения препарата. Гиперемия и болезненность купировались самостоятельно через 24–36 часов. Все остальные побочные эффекты, характерные для применения цитокинов (гриппоподобный синдром, костно-мышечные боли, повышение температуры тела и т. д.) при применении Рефнота встречались редко, были слабовыраженными (0–1-й степени) и не требовали никакой дополнительной лекарственной терпии. Во второй группе 33 пациентам было проведено 82 курса лечения Рефнотом – 410 введений препарата. Каких-либо серьезных значимых побочных эффектов отмечено не было. Все нежелательные явления, связанные с введением Рефнота, не отличались от таковых в первой группе, были слабовыраженными и не требовали какой-либо дополнительной лекарственной терапии. Таким образом, суммарно было проведено 118 курсов лечения Рефнотом. Клинических особенностей при введении препарата в дозах 100 тыс. и 400 тыс. МЕ отмечено не было. Обе дозировки препарата характеризовались хорошей переносимостью. Эффективность лечения (стабилизация болезни) в первой группе составила 28%. Ни полных, ни частичных эффектов выявлено не было. Во второй группе больных (Рефнот в сочетании с химиотерапией) контроль болезни удалось достичь в 54,5% случаев. Полный эффект отмечен у 2 (6%), частичный – у 6 (18,2%) больных, длительная стабилизация болезни имела место в 30,3% случаев (10 пациентов). По сравнению с историческим контролем (химиотерапия без ФНО) было отмечено повышение эффективности исследуемого режима без усиления токсичности. Отдельно необходимо отметить результаты, достигнутые в ходе исследования по лечению меланомы кожи, поскольку меланома кожи является одной из агрессивных форм злокачественных опухолей, обладающей высокой потенцией местного роста, регионарного метастазирования, способностью к диссеминации по коже, множественному метастазированию. Именно метастазирование на ранних стадиях обусловливают высокую смертность и неэффективность терапии данного заболевания [Плешкан и др. 2011]. В последние десятилетия частота возникновения этой болезни значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать [Ashkenazi et al. 1999]. Среднегодовой темп прироста заболеваемости этой опухолью в мире составляет около 5% (в США - 4%, в России 3,9%) и может считаться одним из самых высоких среди всех злокачественных опухолей, после рака легкого. Ежегодно в нашей стране выявляется около 8000 пациентов с диагнозом меланома кожи [Давыдов М.И. 2009]. Несмотря на современные методы лечения меланомы отдаленные результаты неудовлетворительные. Основным методом лечения первичной опухоли остается хирургический. Однако у 10-15% больных меланомой кожи I—II стадии в течение 5 лет после радикальной операции наступает генерализация процесса. Радикальность вмешательства при мела- 86 номах у больных с опухолями II—III стадии весьма условна, из-за наличия субклинических метастазов. Диссеминированная меланома кожи считается практически инкурабельным заболеванием. Средняя продолжительность жизни больных колеблется от 6 до 9 месяцев. Только у небольшого числа больных с помощью лекарственных методов удается добиться стойких полных ремиссии, продолжительность которых может превышать пятилетний рубеж не более, чем в 5% случаев. При использовании химиотерапии выживаемость больных с метастазами меланомы варьирует от 6 до 12 мес, а 5-летняя выживаемость составляет только 5% [Гуторов С. Л. 2009]. Небольшие успехи химиотерапии послужили стимулом к созданию и изучению комбинирования ее с цитокинами. В клинических исследованиях лечебную активность показали интерлейкин-2 (ИЛ-2), α-интерферон (α-ИФН), фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α). Влияние Рефнота на основные показатели состояния иммунной системы 1. Исходно у 38% больных было снижено количество Т-лимфоцитов: оно составило в среднем 46,9 ± 4,19% при норме от 60 до 75%. Рефнот увеличил количество этих клеток до 51,9 ± 6,8%. У 25 % этих пациентов количество CD3+-клеток повысилось до нормального уровня. 2. У 81% больных исходно наблюдалось существенное снижение числа CD4+клеток – в среднем до 25,57 ± 1,46 % (норма – 36–45%). В результате лечения Рефнотом их количество возросло до 34,1 ± 2,67% после 2-недельного и до 34,5 ± 3,67% после 4-недельного курсов терапии. Это повышение было статистически значимым (р ≤ 0,005 и 0,011 соответственно). 3. Количество CD8+-лимфоцитов было ниже нормы (25–30 %) у 24 % больных, а выше нормы – у 46%. Лимфоциты с фенотипом CD8+ представляют собой неоднородную популяцию, включающую как эффекторные цитотоксические клетки, участвующие в элиминации опухолевых клеток, так и клеткисупрессоры, угнетающие иммунные реакции. Поэтому как снижение, так и повышение их количества или активности в равной мере нежелательны. Лечение Рефнотом в течение 2 недель привело к возрастанию доли этих клеток до нормального уровня у больных, у которых она была снижена (с 19,36 ± 1,74 до 27,55 ± 2,5%; р ≤ 0,019). А поскольку значительная часть CD8+-клеток является клетками-супрессорами, еще более важным было снижение их содержания у пациентов с исходным его повышением (с 39,55 ± 1,83 до 32,45%; р ≤ 0,02). 4. Соответственно изменениям в числе CD4+- и CD8+-клеток изменялось и их соотношение – иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+. Исходно он был снижен у 52% больных, составив в среднем для этой группы 0,78 ± 0,06 при норме 1,2–2,4. После 2 и 4 недель лечения Рефнотом он повышался до 1,19 ± 0,2 и 1,3 ± 0,2 соответственно. Это возрастание оказалось статистически значимым (р ≤0,040 и 0,017 соответственно). 5. Количество и активность NK-клеток исходно были снижены у небольшого числа (15,7%) больных, количество CD16+-клеток составило 7,4 ± 0,06% при норме от 10 87 до 20%, а активность NK-клеток была понижена у 10,8% пациентов (17,12 ± 1,12% при норме 25–50%). В группе пациентов с исходным снижением этих показателей лечение Рефнотом статистически значимо повысило количество CD16+-клеток – до 17,15 ± 0,65% (р ≤ 0,001), а активность NK-клеток – до 71,8 ± 8,1%. При этом Рефнот практически не изменял количество CD16+-клеток у больных с исходно нормальным их уровнем, однако статистически значимо усиливал их цитотоксическую активность (активность NKклеток) с 40,19 ± 3,1 до 61,95 ± 3,8% после 2-недельной терапии и до 54,06 ± 7,15% после 4 недель лечения (р ≤0,04 и 0,003 соответственно). Это свидетельствует о том, что лечение Рефнотом повышало цитотоксический и противоопухолевый потенциал NK-клеток без увеличения их количества. Анализ показателей иммунного статуса: 1. Для больных с прогрессированием злокачественного заболевания на фоне лечения характерно исходно низкое соотношение CD4+-/CD8+-клеток. При этом у части пациентов с продолжительной стабилизацией указанный показатель, как правило, повышается уже после первого курса применения Рефнота. У таких больных снижение иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ зависит от одновременного сильного падения числа CD4+-клеток (< 20%) и резкого повышения количества CD8+- клеток (> 40%). 2. У большинства больных с прогрессированием болезни при нормальном или высоком количестве CD16+-клеток (NK-клеток) их активность снижена, в то время как для пациентов с положительным лечебным эффектом более характерно нормальное или даже существенно сниженное количество CD16+-клеток при высокой их активности, что свидетельствует о более высоком цитолитическом потенциале клеток этой популяции у больных, впоследствии отвечающих на терапию. 3. Из двух больных, которыми была достигнута полная ремиссия, у одной все показатели иммунного статуса исходно были нормальными, а у второго – при первом тестировании на фоне прогрессирующего заболевания был снижен индекс CD4+/CD8+(0,95 при норме 1,2–2,4), который уже после первого курса лечения Рефнотом повысился до нормы за счет увеличения исходно сниженного до 24,8% числа CD4+-клеток (норма – 35–45%). Проведенные иммунологические исследования показали позитивное воздействие Рефнота на противоопухолевый иммунитет. Было установлено, что в отличие от других известных иммуномодуляторов Рефнот одновременно положительно влияет на две клеточные популяции – Т-лимфоциты и NK-клетки, являющиеся ведущими компонентами противоопухолевого иммунитета. Важно подчеркнуть, что у онкологических больных Рефнот повышает иммунологический потенциал также при исходно ненарушенных показателях иммунного статуса. Применение препарата Рефнот обеспечивает принципиально новый подход к иммунокоррекции у онкологических больных. Перспективными направлениями лечения является комбинация Рефнота с химиотерапией и его самостоятельное использование при резистентных формах рака, не имеющих вариантов стандартной терапии. Таким образом, Рефнот представляет собой принципиально новый высокоэффективный отечественный иммуномодулятор, обладающий прямым противоопухолевым эффектом. 88 Заключение В настоящем исследовании Рефнот проявил уникальные иммуномодулирующие свойства у онкологических больных. Его отличительная особенность от других известных иммуномодуляторов заключается в положительном воздействии одновременно на 2 клеточные популяции Т- и МС-клетки. Рефнот рекомендуется для использования самостоятельно и в сочетании с цитостатическими лекарствами у больных со злокачественными опухолями в качестве иммуномодулятора. 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ, ВЫВОДЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО 4 ФАЗАМ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ Рекомбинантный Фактор Некроза Опухолей-Тимозин-α1 - высокоэффективный препарат с низкой системной токсичностью, оказывает прямое противоопухолевое действие, иммуномодулятор, снижает гематологическую токсичность химиопрепаратов и значительно увеличивает эффективность проводимой химиотерапии, эффективен для лечения онкологических заболеваний при сочетаниии с химиотерапией и при самостоятельном применении. Рефнот хорошо переносится, побочные эффекты кратковременны, клинически не значимы и не требуют лекарственной коррекции. Рефнот положительно влияет на содержание Т-лимфоцитов, активирует их и НКклетки, усиливает противоопухолевый и противоинфекционный иммунитеты. В новых исследованиях установлен антиангиогенный эффект Рефнота: уменьшение количества сосудов в опухолях на 32-62% и экспрессия эндотелиального сосудистого фактора роста (VEGF) на 50-65%. Методика применения Рефнота в монотерапии онкологических заболеваний: подкожно вводить ежедневно 5 дней затем 2 дня перерыв в течение 8 недель в дозе 100000 ЕД. После 8 недель лечения делать повтор диагностики заболевания. При частичной регрессии или стабилизации делать повторный курс лечения. Методика применения Рефнота в сочетании с химиотерапией онкологических заболеваний: до химиотерапии вводить Рефнот в дозе 100000 ЕД в течение 3 недель ежедневно 5 дней затем 2 дня перерыв. Хорошая комбинация Рефнота с Ингароном синергизм (многократное усиление) для лечения онкологических заболеваний с множественными метастазами: в первый день подкожно вводить Ингарон 500000 МЕ, во второй день вводить Рефнот в дозе 100000 ЕД, продолжая комбинацию в течение 20 дней. 90 ЛИТЕРАТУРА Баринский И. Ф., Алимбарова Л. М., Платонова А. А., Шмелёв В. А. Противовирусная активность рекомбинантного интерферона-гамма человека и рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 на моделях герпес-вирусной и цитомегаловирусной инфекции in vitro. Вопр. Вирусол. 2004; 5: 37-43. Ветчинин С. С., Шмелёв В. А., Черновская Т. В. и др. Моноклональные антитела к тимозину α1 человека. Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск, 1999, С. 37. Гуторов С. Л. Цитокины в современном комбинированном лечении некоторых злокачественных опухолей. Дисс. докторская, 2009. Давыдов М.И. Статистика злокачественных заболеваний в России и странах СНГ в 2007 году. Вестник РАМН им. Н.Н. Блохина, 2009, т. 20 № 3, Прил.1, стр. 1 1. Денисов А. А., Михина Л. В., Карпова О. А. и др. Отчет об экспериментальном изучении иммунотоксических свойств препарата альфа-фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 рекомбинантный сухой для инъекций. Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 18 стр. Денисов А. А., Михина Л. В., Карпова О. А. и др. Отчет об экспериментальном изучении аллергизирующих свойств действующего вещества и лекарственной формы препарата альфа-фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 рекомбинантный сухой для инъекций. Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 21 стр. Денисов А. А., Михина Л. В., Марченко А. И. и др. Отчет об экспериментальном изучении мутагенной активности препарата альфа-фактор некроза опухолей-тимозин-альфа1 рекомбинантный сухой для инъекций. Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 22 стр. Коробко В. Г., Болдырева Е. Ф., Филипов С. А., Шмелёв В. А. и др. Синтез искусственного гена, кодирующего тимозин α1, и его экспрессия в Escherichia coli в составе гибридов с фактором некроза опухолей человека. Биоорган. Хим. 1992; 18(5): 646-659. Медуницин Н. В., Акользина С. Е., Авдеева Ж. И., Алпатова Н. А., Шмелёв В. А. и др. Цитокины как стимуляторы поствакцинального иммунитета. Тезисы докладов II Российского национального конгресса «Человек и лекарство» 10-15 апреля 1995 г., Москва. РЦ «Фармединфо», 1995; С. 39. Плешкан В. В., Зиновьева М.В., Свердлов Е.Д. Меланома: поверхностные маркеры как первый «порт» адресной доставки терапевтических генов при многоуровневой генной терапии. Молекулярная биология, 2011, т. 45, № 3, стр. 416-433. Рыбалкин С. П., Онацкий Н. П., Соков Б. Н. и др. Экспериментальное изучение общетоксического и местного раздражающего действия субстанции и инъекционной лекарственной формы рекомбинантного гибридного белка альфа-фактора некроза опухолей-тимозин-альфа1 (ФНО-Т). Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 31 стр. Рыбалкин С. П., Иванова Ю. В., Гольцев И. А. и др. Экспериментальное изучение репродуктивной токсичности рекомбинантного гибридного белка альфа-фактора некроза опухолей-тимозин-альфа1 (ФНО-Т). Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 16 стр. Семиглазов В. Ф. Отчет «Сравнительное рандомизированное исследование Рефнота® в комбинации с химиотерапией в режиме FEC, Рефнота® в комбинации с Инга- 91 роном® и химиотерапией FEC, а также одной химиотерапии FEC при местнораспространенном и метастатическом раке молочной железы (фаза II/III)». ФГУН «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Росмедтехнологий», г. Санкт-Петербург, 2009, 59 стр. Соков Б. Н., Шаманек Т. П., Новиков Е. А и др. Доклиническое исследование фармакокинетики альфа-фактора некроза опухолей-тимозина-альфа1 рекомбинантного сухого для инъекций. Отчёт НИЦ ТБП. Серпухов, 2003, 148 стр. Шмелёв В. А., Бунина З. Ф., Кудрявцева Т. Ю. и др. Получение группы гибридных белков, состоящих из фактора некроза опухолей α и тимозина α1. Молек. Генет. Микроб. Вирусол., 1995; 1: 9-14. Шмелёв В. А., Галактионов В. Г., Бунина З. Ф., Носова Л. Ю., Новикова Н. И., Кудрявцева Т. Ю., Коробко В. Г., Болдырева Е. Ф. Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy325, кодируемый ее белок α1-тимозин-фактор некроза опухолей-α-тимозин-α1 и способ его получения. Патент РФ №92002679 по завке №92002679/13 от 28.12.1992. Шмелёв В. А., Григорьев Б. В., Можарова Т. И., Попов С. Г. Тимозин α1 и гибридные белки, состоящие из фактора некроза опухолей α и тимозина α1, увеличивают эффективность вакцинации против возбудителя чумы. Жур. Микроб. Эпидем. Иммунобиол., 1994; 4: 85-89. Шмелёв В. А., Евсегнеев С. И., Попов С. Г., Ураков Н. Н. Способ получения рекомбинантного тимозина-α1 человека. Патент РФ №2055895 по завке №5057014/13 от 29.07.1992. Шмелёв В. А., Коробко В. Г. Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315, кодирующая гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1. Патент РФ №2077586 по завке №5065134/13 от 07.10.1992. Шмелёв В. А., Носова Л. Ю., Бунина З. Ф., Новикова Н. И. Способ получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1. Патент РФ №2055896 C1 по завке №5057039/13 от 29.07.1992. Шмелёв В. А., Носова Л. Ю., Бунина З. Ф., Новикова Н. И. Способ получения гибридного белка α1-тимозин-фактор некроза опухолей-α. Патент РФ №2055897 C1 по завке №5057040/13 от 29.07.1992. Шмелёв В. А., Хромых Л. М., Дудич Е. И., Шевякова Л. Я., Горбатова Е. А., Галактионов В. Г. Изучение иммунобиоло¬гических свойств гибридных белков, состоящих из фактора некроза опухолей α и тимозина α1. Вестник Российской АМН, 1994; 6: 55-61. Шмелёв В. А., Чумбуридзе Г. Г. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1. Патент РФ №2225443 по завке №2002119729 от 25.07.2002. Aggarwal B.B., Gupta S.C., Kim J.H. Historical perspectives on tumor necrosis factor and its superfamily: 25 years later, a golden journey. Blood 2012; 119(3): 651–65. Aggarwal B. B., Kohr W. J., Hass P. E., Moffat B., Spencer S. A., Henzel W. J., Bringman T. S., Nedwin G. E., Goeddel D. V., Harkins R. N. Human tumor necrosis factor. Production, purification, and characterization. J. Biol. Chem., 1985; 260(4): 2345-2354. Alexander H. R., Libutti S. K., Bartlett D. L., Puhlmann M., Fraker D. L., Bachenheimer L. C. 92 A phase I-II study of isolated hepatic perfusion using melphalan with or without tumor necrosis factor for patients with ocular melanoma metastatic to liver. Clin. Cancer Res., 2000; 6(8): 3062-3070. Arakawa T., Yphantis D. A. Molecular weight of recombinant human tumor necrosis factoralpha. J. Biol. Chem., 1987; 262(16): 7484-7485. Ashkenazi A., PaiR.C, Fong S. Et al., Safety of antitumor activity of recombinant soluble Apo-2 ligand, J. Clin. Invest., 1999, 104, 155-1 Baisch H. Relationship between cell kinetics and apoptotic effects in TNF-alpha and IFNgamma-treated human tumour cell lines. Eur. Cytokine Netw., 2001; 12(4): 604-613. Barnes P. F., Fong S. J., Brennan P. J., Twomey P. E., Mazumder A., Modlin R. L. Local production of tumor necrosis factor and IFN-gamma in tuberculous pleuritis. J. Immunol., 1990; 145(1): 149-154. Bazzoni F., Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families. New England J. Med., 1996; 334(26): 1717-1725. Benvenuto R., Paroli M., Buttinelli C., Franco A., Barnaba V., Fieschi C., Balsano F. Tumour necrosis factor-alpha synthesis by cerebrospinal-fluid-derived T cell clones from patients with multiple sclerosis. Clin. Exp. Immunol., 1991; 84(1): 97-102. Beutler B., Cerami A. The history, properties, and biological effects of cachectin. Biochemistry, 1988; 27(20): 7575-7582. Beutler B., Cerami A. The biology of cachectin/TNF-α a primary mediator of the host response. Annu. Rev. Immunol., 1989; 7: 625-655. Beutler B., Milsark I. W., Cerami A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science, 1985; 229(4716): 869-871. Beyaert R., Fiers W. Molecular mechanisms of tumor necrosis factor-induced cytotoxicity. What we do understand and what we do not. FEBS Lett., 1994; 340(1-2): 9-16. Billich A. Thymosin alpha1, SciClone Pharmaceuticals. Curr. Opin. Investig. Drugs, 2002; 3(5): 698-707. Biotechnol. News, 1990; 10(26): 3-4. Bistoni F., Baccarini M., Blasi E., Riccardi C., Marconi P., Garaci E. Modulation of polymorphonucleate-mediated cytotoxicity against Candida albicans by thymosin alpha 1. Thymus, 1985; 7(2): 69-84. Blanchard D. K., Djeu J. Y., Klein T. W., Friedman H., Stewart W. E. 2nd. Induction of tumor necrosis factor by Legionella pneumophila. Infect. Immun., 1987; 55(2): 433-437. Blasi E., Farinelli S., Varesio L., Bistoni F. Augmentation of GG2EE macrophage cell linemediated anti-Candida activity by gamma interferon, tumor necrosis factor, and interleukin-1. Infect. Immun., 1990; 58(4): 1073-1077. Bonavida B., Tsuchitani T., Zighelboim J., Berek J. S. Synergy is documented in vitro with lowdose recombinant tumor necrosis factor, cisplatin, and doxorubicin in ovarian cancer cells. Gynecol. Oncol., 1990; 38(3): 333-339. Bongartz T., Sutton A. J., Sweeting M. J., Buchan I., Matteson E. L., Montori V. Anti-TNF antibody therapy in rheumatoid arthritis and the risk of serious infections and malignancies. Systematic review and meta-analysis of rare harmful effects in randomized controlled 93 trials. JAMA, 2006; 295(19): 2275-2285. Brach M. A., Cicco N. A., Riedel D., Hirano T., Kishimoto T., Mertelsmann R. H., Herrmann F. Mechanisms of differential regulation of interleukin-6 mRNA accumulation by tumor necrosis factor alpha and lymphotoxin during monocytic differentiation. FEBS Lett., 1990; 263(2): 349-354. Braczkowski R., Zubelewicz B., Romanowski W., Lissoni P., Brivio F. Possible biological indicators of the response to recombinant tumour necrosis factor alpha in patients with advanced neoplasms. J. Exp. Clin. Cancer Res., 1998; 17(3): 349-354. Brockhaus M., Schoenfeld H. J., Schlaeger E. J., Hunziker W., Lesslauer W., Loetscher H. Identification of two types of tumor necrosis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1990; 87(8): 3127-3131. Butera S. T., Roberts B. D., Folks T. M. Regulation of HIV-1 expression by cytokine networks in a CD4+ model of chronic infection. J. Immunol., 1993; 150(2): 625-634. Calandra T., Baumgartner J. D., Grau G. E., Wu M. M., Lambert P. H., Schellekens J., Verhoef J., Glauser M. P. Prognostic values of tumor necrosis factor/cachectin, interleukin-1, interferon-alpha, and interferon-gamma in the serum of patients with septic shock. SwissDutch J5 Immunoglobulin Study Group. J. Infect. Dis., 1990; 161(5): 982-987. Charnetsky P. S., Greisman R. A., Salmon S. E., Hersh E. M., Scuderi P. Increased peripheral blood leukocyte cytotoxic activity in cancer patients during the continuous intravenous administration of recombinant human tumor necrosis factor. J. Clin. Immunol., 1989; 9(1): 34-38. Chen P.-F., Zhang H.-Y., Fu G.-F., Xu G.-X., Hou Y.-Y. Overexpression of soluble human thymosin alpha 1 in Escherichia coli. Acta Biochim. Biophys. Sinica, 2005; 37(2): 147–151. Cianfriglia M., Yassen A., Tombesi M., Samoggia P., Barca S., Caserta M. Expression of lymphocyte homing receptor gene is lost in multi-drug-resistant variants of human T-lymphoblastoid CCRF-CEM cells. Int. J. Cancer., 1991; 49(3): 394-397. Clark S., McGuckin M. A., Hurst T., Ward B. G. Effect of interferon gamma and tumour necrosis factor alpha on sensitivity to cisplatin in ovarian carcinoma cell lines. Cancer Immunol. Immunother., 1994; 39(2): 100-104. Conteas C. N., Mutchnick M. G., Palmer K. C., Weller F. E., Luk G. D., Naylor P. H., Erdos M. R., Goldstein A. L., Panneerselvam C., Horecker B. L. Cellular levels of thymosin immunoreactive peptides are linked to proliferative events: evidence for a nuclear site of action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990; 87(9): 3269-3273. Corradin S. B., Buchmuller-Rouiller Y., Mauel J. Phagocytosis enhances murine macrophage activation by interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha. Eur. J. Immunol., 1991; 21(10): 2553-2558. Creaven P. J., Plager J. E., Dupere S., Huben R. P., Takita H., Mittelman A., Proefrock A. Phase I clinical trial of recombinant human tumor necrosis factor. Cancer Chemother. Pharmacol., 1987; 20(2): 137-144. Danielova V., Holubova J., Sourek J. Some requirements for the secretion of tumour necrosis factor and its cytotoxic activity in vitro. Folia Biol., 1991; 37(3-4): 179-188. Debernardis D., Stanzione S., Ottoboni C., Clerico L., Mancuso T., Parodi S., Russo P. 94 Endogenous tumor necrosis factor enhances topoisomerase II inhibitors activity in human ovarian cancer cell lines. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996; 279(1): 84-90. Defilippi P., Poupart P., Tavernier J., Fiers W., Content J. Induction and regulation of mRNA encoding 26-kDa protein in human cell lines treated with recombinant human tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84(13): 4557-4561. Denis M. Modulation of Mycobacterium avium growth in vivo by cytokines: involvement of tumour necrosis factor in resistance to atypical mycobacteria. Clin. Exp. Immunol., 1991; 83(3): 466-471. Dett C. A., Gatanaga M., Ininns E. K., Cappuccini F., Yamamoto R. S., Granger G. A., Gatanaga T. Enhancement of lymphokine-activated T killer cell tumor necrosis factor receptor mRNA transcription, tumor necrosis factor receptor membrane expression, and tumor necrosis factor/lymphotoxin release by IL-1 beta, IL-4, and IL-6 in vitro. J. Immunol., 1991; 146(5): 1522-1526. Diamant M., Kayser L., Rasmussen A. K., Bech K., Feldt-Rassmussen U. Interleukin-6 production by thyroid epithelial cells. Enhancement by interleukin-1. Autoimmunity, 1991; 11(1): 21-26. Digel W., Porzsolt F., Schmid M., Herrmann F., Lesslauer W., Brockhaus M. High levels of circulating soluble receptors for tumor necrosis factor in hairy cell leukemia and type B chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Invest., 1992; 89(5): 1690-1693. Doria G., Mancini C., Frasca D. Age-related changes within a suppressor T cell circuit. Cell Immunol., 1989; 122(1): 20-32. Drapier J. C., Wietzerbin J. IFN-gamma reduces specific binding of tumor necrosis factor on murine macrophages. J. Immunol., 1991; 146(4): 1198-1203. Duh E. J., Maury W. J., Folks T. M., Fauci A. S., Rabson A. B. Tumor necrosis factor alpha activates human immunodeficiency virus type 1 through induction of nuclear factor binding to the NF-kappa B sites in the long terminal repeat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86(15): 5974-5978. Eck M. J., Sprang S. R. The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding. J. Biol. Chem., 1989; 264(29): 17595-17605. Eck M. J., Ultsch M., Rinderknecht E., de Vos A. M., Sprang S. R. The structure of human lymphotoxin (tumor necrosis factor-beta) at 1.9-A resolution. J. Biol. Chem., 1992; 267(4): 2119-2122. Effros R. B. Long-term immunological memory against viruses. Mech. Ageing. Dev., 2000; 121(1-3): 161-171. Eggermont A. M., Schraffordt Koops H., Lienard D., Kroon B. B., van Geel A. N., Hoekstra H. J., Lejeune F. J. Isolated limb perfusion with high-dose tumor necrosis factor-alpha in combination with interferon-gamma and melphalan for nonresectable extremity soft tissue sarcomas: a multicenter trial. J. Clin. Oncol., 1996; 14(10): 2653-2665. Eggermont A. M., Schraffordt Koops H., Klausner J. M., Lienard D., Kroon B. B., Schlag P. M., Ben-Ari G., Lejeune F. J. Isolation limb perfusion with tumor necrosis factor alpha and chemotherapy for advanced extremity soft tissue sarcomas. Semin. Oncol., 1997; 24(5): 547-555. 95 Eggermont A. M, ten Hagen T. L. Isolated limb perfusion for extremity soft-tissue sarcomas, intransit metastases, and other unresectable tumors: credits, debits, and future perspectives. Curr. Oncol. Rep., 2001; 3 (4): 359-367. Elias J. A., Lentz V. IL-1 and tumor necrosis factor synergistically stimulate fibroblast IL-6 production and stabilize IL-6 messenger RNA. J. Immunol., 1990; 145(1): 161-166. English B. K., Weaver W. M., Wilson C. B. Differential regulation of lymphotoxin and tumor necrosis factor genes in human T lymphocytes. J. Biol. Chem., 1991; 266(11): 7108-7113. Eschenfeldt W. H., Berger S. L.The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83(24): 9403-9407. Favalli C., Jezzi T., Mastino A., Rinaldi-Garaci C., Riccardi C., Garaci E. Modulation of natural killer activity by thymosin alpha 1 and interferon. Cancer Immunol. Immunother., 1985; 20(3): 189-192. Favalli C., Mastino A., Jezzi T., Grelli S., Goldstein A. L., Garaci E. Synergistic effect of thymosin alpha 1 and alpha beta-interferon on NK activity in tumor-bearing mice. Int. J. Immunopharmacol., 1989; 11(5): 443-450. Feduchi E., Alonso M. A., Carrasco L. Human gamma interferon and tumor necrosis factor exert a synergistic blockade on the replication of herpes simplex virus. J. Virol., 1989; 63(3): 1354-1359. Feldmann M., Brennan F. M., Chantry D., Haworth C., Turner M., Katsikis P., Londei M., Abney E., Buchan G., Barrett K., et al. Cytokine assays: role in evaluation of the pathogenesis of autoimmunity. Immunol. Rev., 1991; 119:105-123. Fernandez A., Marin M. C., McDonnell T., Ananthaswamy H. N. Differential sensitivity of normal and Ha-ras-transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells. Oncogene, 1994; 9(7): 2009-2017. Ferran C., Dy M., Sheehan K., Schreiber R., Grau G., Bluestone J., Bach J. F., Chatenoud L. Cascade modulation by anti-tumor necrosis factor monoclonal antibody of interferongamma, interleukin 3 and interleukin 6 release after triggering of the CD3/T cell receptor activation pathway. Eur. J. Immunol., 1991; 21(10): 2349-2353. Ferrante A., Staugas R. E., Rowan-Kelly B., Bresatz S., Kumaratilake L. M., Rzepczyk C. M., Adolf G. R. Production of tumor necrosis factors alpha and beta by human mononuclear leukocytes stimulated with mitogens, bacteria, and malarial parasites. Infect. Immun., 1990; 58(12): 3996-4003. Fischer H., Hedlund G., Kalland T., Sjogren H. O., Dohlsten M. Independent regulation of IFNgamma and tumor necrosis factor by IL-1 in human T helper cells. J. Immunol., 1990; 145(11): 3767-3772. Fletcher M., Goldstein A. L. Recent advances in the understanding of the biochemistry and clinical pharmacology of interleukin-2. Lymphokine Res., 1987; 6(1): 45-57. Frasca D., Adorini L., Doria G. Enhancement of helper and suppressor T cell activities by thymosin alpha 1 injection in old mice. Immunopharmacology, 1985; 10(1): 41-49. Garaci E., Lopez M., Bonsignore G., Della Giulia M., D’Aprile M., Favalli C., Rasi G., Santini 96 S., Capomolla E., Vici P., et al. Sequential chemoimmunotherapy for advanced non-small cell lung cancer using cisplatin, etoposide, thymosin-alpha 1 and interferon-alpha 2a. Eur. J. Cancer, 1995; 31A(13-14): 2403-2405. Garaci E., Pica F., Mastino A., Palamara A. T., Belardelli F., Favalli C. Antitumor effect of thymosin alpha 1/interleukin-2 or thymosin alpha 1/interferon alpha,beta following cyclophosphamide in mice injected with highly metastatic Friend erythroleukemia cells. J. Immunother., 1993; 13(1): 7-17. Gatanaga T., Hwang C. D., Kohr W., Cappuccini F., Lucci J. A. 3rd, Jeffes E. W., Lentz R., Tomich J., Yamamoto R. S., Granger G. A. Purification and characterization of an inhibitor (soluble tumor necrosis factor receptor) for tumor necrosis factor and lymphotoxin obtained from the serum ultrafiltrates of human cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990; 87(22): 8781-8784. Girardin E. P., Berner M. E., Grau G. E., Suter S., Lacourt G., Paunier L. Serum tumour necrosis factor in newborns at risk for infections. Eur. J. Pediatr., 1990; 149(9): 645-647. Goldschneider I., Ahmed A., Bollum F. J., Goldstein A. L. Induction of terminal deoxynucleotidyl transferase and Lyt antigens with thymosin: identification of multiple subsets of prothymocytes in mouse bone marrow and spleen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981; 78(4): 2469-2473. Goldstein A. L., Low T. L., McAdoo M., McClure J., Thurman G. B., Rossio J., Lai C. Y., Chang D., Wang S. S., Harvey C., Ramel A. H., Meienhofer J. Thymosin alpha1: isolation and sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74(2): 725-729. Goodall G. J., Dominguez F., Horecker B. L. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83(23): 8926-8928. Gooding L. R., Elmore L. W., Tollefson A. E., Brady H. A., Wold W. S. A 14,700 MW protein from the E3 region of adenovirus inhibits cytolysis by tumor necrosis factor. Cell, 1988; 53(3): 341-346. Gravenstein S., Duthie E. H., Miller B. A., Roecker E., Drinka P., Prathipati K., Ershler W. B. Augmentation of influenza antibody response in elderly men by thymosin alpha one. A double-blind placebo-controlled clinical study. J. Am. Geriatr. Soc., 1989; 37(1):1-8. Grunfeld C., Adi S., Soued M., Moser A., Fiers W., Feingold K. R. Search for mediators of the lipogenic effects of tumor necrosis factor: potential role for interleukin 6. Cancer Res., 1990; 50(14): 4233-4238. Haas J. G., Baeuerle P. A., Riethmuller G., Ziegler-Heitbrock H. W. Molecular mechanisms in down-regulation of tumor necrosis factor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1990; 87(24): 9563-9567. Hallahan D. E., Spriggs D. R., Beckett M. A., Kufe D. W., Weichselbaum R. R. Increased tumor necrosis factor alpha mRNA after cellular exposure to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86(24): 10104-10107. Hamamoto Y., Matsuyama T., Yamamoto N., Kobayashi N. Augmentation of cytotoxic effect of tumor necrosis factor on human immunodeficiency virus-infected cells by staurosporine, a potent protein kinase C inhibitor. Cancer Res., 1990; 50(17): 5287-5290. 97 Hamilton G., Prettenhofer M., Zommer A., Hofbauer S., Götzinger P., Gnant F. X., Függer R. Intraoperative course and prognostic significance of endotoxin, tumor necrosis factoralpha and interleukin-6 in liver transplant recipients. Immunobiology, 1991; 182(5): 425-439. Han X., Becker K., Degen H. J., Jablonowski H., Strohmeyer G. Synergistic stimulatory effects of tumour necrosis factor alpha and interferon gamma on replication of human immunodeficiency virus type 1 and on apoptosis of HIV-1-infected host cells. Eur. J. Clin. Invest., 1996; 26(4): 286-292. Hand A. M., Husgafvel-Pursiainen K., Tammilehto L., Mattson K., Linnainmaa K. Malignant mesothelioma: the antiproliferative effect of cytokine combinations on three human mesothelioma cell lines. Cancer Lett., 1991; 58(3): 205-210. Hassan I. B., Gronowitz J. S., Carlsson M., Sundström C. Аlpha-Interferon inhibits spontaneous and induced DNA synthesis in hairy cell leukemia. Leuk. Lymphoma, 1992; 7(1-2): 69-77. Hata Y., Matsuka K., Ito O., Matsuda H., Furuichi H., Konstantinos A., Nuri B. Two cases of Merkel cell carcinoma cured by intratumor injection of natural human tumor necrosis factor. Plast. Reconstr. Surg., 1997; 99(2): 547-553. Havell E. A. Evidence that tumor necrosis factor has an important role in antibacterial resistance. J. Immunol., 1989; 143(9): 2894-2899. Haworth C., Brennan F. M., Chantry D., Turner M., Maini R. N., Feldmann M. Expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid arthritis: regulation by tumor necrosis factor-alpha. Eur. J. Immunol., 1991; 21(10): 2575-2579. Heerschap A., Fiedler W., Marreaud S., et al.; EORTC New Drug Development Group. A phase I study of NGR-TNF, a novel vascular targeting agent, in patients with refractory solid tumors (EORTC 16041). 2007 ASCO Annual Meeting. J. Clin. Oncol. 2007; 25(18S): 14074. Helseth E., Torp S., Dalen A., Unsgaard G. Effects of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on clonogenic growth of cell lines and primary cultures from human gliomas and brain metastases. APMIS, 1989; 97(6): 569-574. Himeno T., Watanabe N., Yamauchi N., Maeda M., Tsuji Y., Okamoto T., Neda H., Niitsu Y. Expression of endogenous tumor necrosis factor as a protective protein against the cytotoxicity of exogenous tumor necrosis factor. Cancer Res. 1990; 50(16): 4941-4945. Hirsch C. S., Ellner J. J., Russell D. G., Rich E. A. Complement receptor-mediated uptake and tumor necrosis factor-alpha-mediated growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis by human alveolar macrophages. J. Immunol., 1994; 152(2): 743-753. Hocking D. C., Ferro T. J., Johnson A. Dextran sulfate inhibits PMN-dependent hydrostatic pulmonary edema induced by tumor necrosis factor. J. Appl. Physiol., 1991; 70(3): 1121-1128. Hong W. S., Jett J. R., Sasaki Y., Takahashi H., Nakano H., Nakagawa K., Hoshi A., Saijo N. Colony inhibitory effect of recombinant human tumor necrosis factor (rh-TNF) and/or recombinant human interferon (rh-IFN)-alpha, -beta and -gamma on human lung cancer cell lines. Jpn. J. Clin. Oncol., 1987; 17(1): 49-55. Hong W. S., Saijo N., Sasaki Y., Shinkai T., Eguchi K., Sakurai M., Takahashi H., Nakano H., Nakagawa K., Twentyman P. R. In vitro growth inhibition of cisplatin-resistant human 98 lung cancer cell lines by recombinant human tumor necrosis factor and/or recombinant human interferon-gamma by virtue of collateral sensitivity. Jpn. J. Cancer Res., 1987; 78(11): 1274-1280. Hudziak R. M., Lewis G. D., Shalaby M. R., Eessalu T. E., Aggarwal B. B., Ullrich A., Shepard H. M. Amplified expression of the HER2/ERBB2 oncogene induces resistance to tumor necrosis factor alpha in NIH 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85(14): 5102-5106. Imagawa D. K., Millis J. M., Seu P., Olthoff K. M., Hart J., Wasef E., Dempsey R. A., Stephens S., Busuttil R. W. The role of tumor necrosis factor in allograft rejection. III. Evidence that anti-TNF antibody therapy prolongs allograft survival in rats with acute rejection. Transplantation, 1991; 51(1): 57-62. Imanishi J., Ike H., Yamada A. Inhibitory effect of interferons and tumor necrosis factor on syncytium formation by bovine leukemia virus. C. R. Seances Soc. Biol. Fil., 1987; 181(6): 722-726. Ishitsuka H., Umeda Y., Sakamoto A., Yagi Y. Protective activity of thymosin alpha 1 against tumor progression in immunosuppressed mice. Adv. Exp. Med. Biol., 1983; 166: 89-100. Issakov J., Merimsky O., Gutman M., Kollender Y., Lev-Chelouche D., Abu-Abid S., LifschitzMercer B., Inbar M., Klausner J. M., Meller I. Hyperthermic isolated limb perfusion with tumor necrosis factor-alpha and melphalan in advanced soft-tissue sarcomas: histopathological considerations. Ann. Surg. Oncol., 2000; 7(2): 155-159. Iwasaka T., Hara K., Hayashi Y., Yokoyama M., Hachisuga T., Fukuda K., Okuma Y., Sugimori H. Antitumor effects of human recombinant interferon-gamma and tumor necrosis factor on five cervical adenocarcinoma cell lines, in vivo and in vitro. Gynecol. Oncol., 1991; 42(1): 39-43. Jacob C. O. Tumor necrosis factor alpha in autoimmunity: pretty girl or old witch? Immunol. Today, 1992; 13(4): 122-125. Jia S. F., Kleinerman E. S. Antitumor activity of TNF-alpha, IL-1, and IFN-gamma against three human osteosarcoma cell lines. Lymphokine Cytokine Res., 1991; 10(4): 281-284. Jupin C., Anderson S., Damais C., Alouf J. E., Parant M. Toxic shock syndrome toxin 1 as an inducer of human tumor necrosis factors and gamma interferon. J. Exp. Med., 1988; 167(3): 752-761. Kalinkovich A., Engelmann H., Harpaz N., Burstein R., Barak V., Kalickman I., Wallach D., Bentwich Z. Elevated serum levels of soluble tumour necrosis factor receptors (sTNF-R) in patients with HIV infection. Clin. Exp. Immunol., 1992; 89(3): 351-355. Karre K., Hansson M., Kiessling R. Multiple interactions at the natural killer workshop. Immunol. Today, 1991; 12(10): 343-345. Kern W. V., Engel A., Schieffer S., Prümmer O., Kern P. Circulating tumor necrosis factor alpha (TNF), soluble TNF receptors, and interleukin-6 in human subacute bacterial endocarditis. Infect. Immun. 1993; 61(12): 5413-5416. Kettelhut I. C., Fiers W., Goldberg A. L. The toxic effects of tumor necrosis factor in vivo and their prevention by cyclooxygenase inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1987; 84(12): 4273-4277. 99 Kim C. M., Hong W. S., Lee J. O., Kang T. W., Kim Y. W., Song J. K., Yun T. K., Kim C. Y. Enhancement of cytotoxicity of cisplatin in vitro by recombinant human tumor necrosis factor and/or recombinant human interferon-alpha, -beta and -gamma. Jpn. J. Cancer Res., 1989; 80(9): 904-909. Koeffler H. P., Gasson J., Tobler A. Transcriptional and posttranscriptional modulation of myeloid colony-stimulating factor expression by tumor necrosis factor and other agents. Mol. Cell. Biol., 1988; 8(8): 3432-3438. Koeffler H. P., Gasson J., Ranyard J., Souza L., Shepard M., Munker R. Recombinant human TNF alpha stimulates production of granulocyte colony-stimulating factor. Blood, 1987; 70(1): 55-59. Korobko V. G., Davydov I. V., Shingarova L. N., Filippov S. A., Esipov D. S., Dobrynin V. N. Construction and properties of fusion proteins between human interferon-gamma and human tumour necrosis factors alpha and beta. Biomed. Sci., 1991; 2(6): 634-640. Korpelainen E. I., Gamble J. R., Smith W. B., Goodall G. J., Qiyu S., Woodcock J. M., Dottore M., Vadas M. A., Lopez A. F. The receptor for interleukin 3 is selectively induced in human endothelial cells by tumor necrosis factor alpha and potentiates interleukin 8 secretion and neutrophil transmigration. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1993; 90(23): 11137-11141. Korpelainen E. I., Gamble J. R., Smith W. B., Dottore M., Vadas M. A., Lopez A. F. Interferongamma upregulates interleukin-3 (IL-3) receptor expression in human endothelial cells and synergizes with IL-3 in stimulating major histocompatibility complex class II expression and cytokine production. Blood, 1995; 86(1): 176-182. Kramer G., Steiner G. E., Sokol P., Handisurya A., Klingler H. C., Maier U., Foldy M., Marberger M. Local intratumoral tumor necrosis factor-alpha and systemic IFN-alpha 2b in patients with locally advanced prostate cancer. J. Interferon Cytokine Res., 2001; 21 (7): 475-484. Kurzrock R., Kantarjian H., Wetzler M., Estrov Z., Estey E., Troutman-Worden K., Gutterman J. U., Talpaz M. Ubiquitous expression of cytokines in diverse leukemias of lymphoid and myeloid lineage. Exp. Hematol., 1993; 21(1): 80-85. Lans T. E., de Wilt J. H., van Geel A. N., Eggermont A. M. Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for nonresectable Stewart-Treves lymphangiosarcoma. Ann. Surg. Oncol., 2002; 9(10): 1004-1009. Larrick J. W., Wright S. C. Cytotoxic mechanism of tumor necrosis factor-alpha. FASEB J., 1990; 4(14): 3215-3223. Lavrik I., Golks A., Krammer P. H. Death receptor signaling. J. Cell Science, 2005; 118: 265-267. Le J. M., Vilcek J. Interleukin 6: a multifunctional cytokine regulating immune reactions and the acute phase protein response. Lab. Invest., 1989; 61(6): 588-602. Lee H., Baek S., Joe S. J., Pyo S. N. Modulation of IFN-gamma production by TNF-alpha in macrophages from the tumor environment: significance as an angiogenic switch. Int. Immunopharmacol., 2006; 6(1): 71-78. Leichtling K. D., Serrate S. A., Sztein M. B. Thymosin alpha 1 modulates the expression of high affinity interleukin-2 receptors on normal human lymphocytes. Int. J. Immunopharmacol., 1990; 12(1): 19-29. 100 Leist T. P., Frei K., Kam-Hansen S., Zinkernagel R. M., Fontana A. Tumor necrosis factor alpha in cerebrospinal fluid during bacterial, but not viral, meningitis. Evaluation in murine model infections and in patients. J. Exp. Med., 1988; 167(5): 1743-1748. Lejeune F. J., Liénard D., Matter M., Rüegg C. Efficiency of recombinant human TNF in human cancer therapy. Cancer Immunity, 2006; 6: 6. Lev-Chelouche D., Abu-Abeid S., Merimsky O., Isakov J., Kollander Y., Meller I., Klausner J. M., Gutman M. Isolated limb perfusion with high-dose tumor necrosis factor alpha and melphalan for Kaposi sarcoma. Arch. Surg., 1999; 134 (2): 177-180. Liang C. M., Liang S. M., Jost T., Sand A., Dougas I., Allet B. Production and characterization of monoclonal antibodies against recombinant human tumor necrosis factor/cachectin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986; 137(2): 847-854. Licastro F., Morini M. C., Bolognesi A., Stirpe F. Ricin induces the production of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta by human peripheral-blood mononuclear cells. Biochem. J,. 1993; 294(Pt2): 517-520. Lichtenstein A., Berenson J., Gera J. F., Waldburger K., Martinez-Maza O., Berek J. S. Resistance of human ovarian cancer cells to tumor necrosis factor and lymphokine-activated killer cells: correlation with expression of HER2/neu oncogenes. Cancer Res., 1990; 50(22): 7364-7370. Lienard D., Eggermont A. M., Koops H. S., Kroon B., Towse G., Hiemstra S., Schmitz P., Clarke J., Steinmann G., Rosenkaimer F., Lejeune F. J. Isolated limb perfusion with tumour necrosis factor-alpha and melphalan with or without interferon-gamma for the treatment of in-transit melanoma metastases: a multicentre randomized phase II study. Melanoma Res., 1999; 9 (5): 491-502. Liew F. Y., Li Y., Moss D., Parkinson C., Rogers M. V., Moncada S. Resistance to Leishmania major infection correlates with the induction of nitric oxide synthase in murine macrophages. Eur. J. Immunol., 1991; 21(12): 3009-3014. Lorre K., Fransen L., Ceuppens J. L. Interleukin-2 induces tumor necrosis factor-alpha production by activated human T cells via a cyclosporin-sensitive pathway. Eur. Cytokine Netw., 1992; 3(3): 321-330. Low T. L., Goldstein A. L. Thymosins: structure, function and therapeutic applications. Thymus, 1984; 6(1-2): 27-42. Luettig B., Decker T., Lohmann-Matthes M. L. Evidence for the existence of two forms of membrane tumor necrosis factor: an integral protein and a molecule attached to its receptor. J. Immunol., 1989; 143(12): 4034-4038. Madge L. A., Pober J. S. A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway, activated by tumor necrosis factor or interleukin-1, inhibits apoptosis but does not activate NFkappaB in human endothelial cells. J. Biol. Chem., 2000; 275(20): 15458-15465. Mannel D. N., Northoff H., Bauss F., Falk W. Tumor necrosis factor: a cytokine involved in toxic effects of endotoxin. Rev. Infect. Dis., 1987; 9 Suppl 5: S602-606. Marshall G. D. Jr., Thurman G. B., Low T. L., Goldstein A. L. Thymosin: basic properties and clinical application in the treatment of immunodeficiency diseases and cancer. Recent Results Cancer Res., 1980; 75: 100-105. 101 Marth C., Helmberg M., Mayer I., Fuith L. C., Daxenbichler G., Dapunt O. Effects of biological response modifiers on ovarian carcinoma cell lines. Anticancer Res., 1989; 9(2): 461-467. Marth C., Muller-Holzner E., Greiter E., Cronauer M. V., Zeimet A. G., Doppler W., Eibl B., Hynes N. E., Daxenbichler G. Gamma-interferon reduces expression of the protooncogene c-erbB-2 in human ovarian carcinoma cells. Cancer Res., 1990; 50(21): 7037-7041 . Marth C., Cronauer M. V., Doppler W., Ofner D., Ullrich A., Daxenbichler G. Effects of interferons on the expression of the proto-oncogene HER-2 in human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer, 1992; 50(1): 64-68. Massad L. S., Mutch D. G., Kao M. S., Powell C. B., Collins J. L. Inhibition of protein synthesis enhances the lytic effects of tumor necrosis factor alpha and interferon gamma in cell lines derived from gynecological malignancies. Cancer Immunol. Immunother., 1991; 33(3): 183-188. Mastino A., Favalli C., Grelli S., Innocenti F., Garaci E. Thymosin alpha 1 potentiates interleukin 2-induced cytotoxic activity in mice. Cell Immunol., 1991; 133(1): 196-205. Mastino A., Favalli C., Grelli S., Garaci E. Interaction between thymic hormones and other immunomodulatory agents. Ann. Ist. Super Sanita, 1991; 27(1): 51-56. Mastino A., Favalli C., Grelli S., Rasi G., Pica F., Goldstein A. L., Garaci E. Combination therapy with thymosin alpha 1 potentiates the anti-tumor activity of interleukin-2 with cyclophosphamide in the treatment of the Lewis lung carcinoma in mice. Int. J. Cancer, 1992; 50(3): 493-499. Matsuo S., Takano S., Yamashita J., Ogawa M. Synergistic cytotoxic effects of tumor necrosis factor, interferon-gamma and tamoxifen on breast cancer cell lines. Anticancer Res., 1992; 12(5): 1575-1579. Meager A., Leung H., Woolley J. Assays for tumour necrosis factor and related cytokines. J. Immunol. Methods, 1989; 116(1): 1-17. Mease P. J. Tumour necrosis factor (TNF) in psoriatic arthritis: pathophysiology and treatment with TNF inhibitors. Ann. Rheum. Dis., 2002; 61: 298–304. Meng F., Liu L., Chin P. C., D’Mello S. R. Akt is a downstream target of NF-kappaB. J. Biol. Chem. 2002, 277(33), 29674–29680. Mestan J., Digel W., Mittnacht S., Hillen H., Blohm D., Möller A., Jacobsen H., Kirchner H. Antiviral effects of recombinant tumour necrosis factor in vitro. Nature, 1986; 323(6091): 816-819. Miller K. L., Silverman P. H., Kullgren B., Mahlmann L. J. Tumor necrosis factor alpha and the anemia associated with murine malaria. Infect. Immun., 1989; 57(5): 1542-1546. Mori H., Kondoh H., Tamaya T. Synergistic effects of interferon-gamma and tumor necrosis factor against proliferation of gynecologic tumor cell lines. Gynecol. Oncol., 1989; 35(2): 209-214. Moxey-Mims M. M., Simms H. H., Frank M. M., Lin E. Y., Gaither T. A. The effects of IL-1, IL-2, and tumor necrosis factor on polymorphonuclear leukocyte Fc gamma receptormediated phagocytosis. IL-2 down-regulates the effect of tumor necrosis factor. J. Immunol., 1991; 147(6): 1823-1830. Mueller H., Flury N., Liu R., Scheidegger S., Eppenberger U. Tumour necrosis factor and 102 interferon are selectively cytostatic in vitro for hormone-dependent and hormoneindependent human breast cancer cells. Eur. J. Cancer, 1996; 32A(13): 2312-2318. Mutch D. G., Massad L. S., Kao M. S., Collins J. L. Proliferative and antiproliferative effects of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on cell lines derived from cervical and ovarian malignancies. Am. J. Obstet. Gynecol., 1990; 163(6 Pt. 1): 1920-1924. Nakajima Y., DelliPizzi A., Mallouh C., Ferreri N. R. Effect of tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma on the growth of human prostate cancer cell lines. Urol. Res., 1995; 23(4): 205-210. Nakane A., Minagawa T., Kohanawa M., Chen Y., Sato H., Moriyama M., Tsuruoka N. Interactions between endogenous gamma interferon and tumor necrosis factor in host resistance against primary and secondary Listeria monocytogenes infections. Infect. Immun., 1989; 57(11): 3331-3337. Nakano K., Abe S., Sohmura Y. Recombinant human tumor necrosis factor-α I. Cytotoxic activity in vitro. Int. J. Immunopharmacol., 1986; 8(3): 347-355. Nash P. T., Florin T. H. J. Tumour necrosis factor inhibitors. MJA, 2005; 183: 205-208. Naume B., Shalaby R., Lesslauer W., Espevik T. Involvement of the 55- and 75-kDa tumor necrosis factor receptors in the generation of lymphokine-activated killer cell activity and proliferation of natural killer cells. J. Immunol., 1991; 146(9): 3045-3048. Nawroth P. P., Stern D. M. Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J. Exp. Med., 1986; 163(3): 740-745. Naylor P. H., Goldstein A. L. Thymosin: cyclic nucleotides and T cell differentiation. Life Sci., 1979; 25(4): 301-310. Naylor P. H., Erdos M. R., Goldstein A. L. Thy¬mic. Horm. and Lymphok. Basis Chem. Clin. Appl. GWUMC Dep. Biochem. 3rd Annu. Spring Symp., Washington, D. C., 1984; P. 69-76. Naylor P. H., Oates K. K., Coss M. C., Erdos M. R., Naylor C. W., Goldstein A. L. Identification of immunoreactive forms of thymosin alpha 1 in serum and supernatants by combining HPLC and RIA. Int. J. Immunopharmacol., 1992; 14(7): 1267-1278. Neta R., Oppenheim J. J., Douches S. D. Interdependence of the radioprotective effects of human recombinant interleukin 1 alpha, tumor necrosis factor alpha, granulocyte colonystimulating factor, and murine recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. J. Immunol., 1988; 140(1): 108-111. Niell H. B., Mauer A. M., Rademacher D. Cytotoxic effects of alpha- and gamma-interferon and tumor necrosis factor in human bladder tumor cell lines. Urol. Res., 1994; 22(4): 247-250. Noel P., Nelson S., Bokulic R., Bagby G., Lippton H., Lipscomb G., Summer W. Pentoxifylline inhibits lipopolysaccharide-induced serum tumor necrosis factor and mortality. Life Sci., 1990; 47(12): 1023-1029. Nooijen P. T., Eggermont A. M., Schalkwijk L., Henzen-Logmans S., de Waal R. M., Ruiter D. J. Complete response of melanoma-in-transit metastasis after isolated limb perfusion with tumor necrosis factor alpha and melphalan without massive tumor necrosis: a clinical and histopathological study of the delayed-type reaction pattern. Cancer Res., 1998; 58 (21): 4880-4887. 103 Oates K. K., Erdos M. Biochemical identification of thymosin alpha-1: its phylogenetic distribution and evolutionary implications. Comp. Biochem. Physiol. B. 1989; 94(4): 759763. Ohmann H. B., Campos M., Griebel P. J., Babiuk L. A. 2’-5’ oligo-A-synthetase activity in bovine peripheral blood leukocytes and alveolar macrophages exposed to recombinant interferons and tumor necrosis factor-alpha. Can. J. Vet. Res., 1989; 53(2): 161-166. Ohta Y., Tezuka E., Tamura S., Yagi Y. Thymosin alpha 1 exerts protective effect against the 5-FU induced bone marrow toxicity. Int. J. Immunopharmacol., 1985; 7(5): 761-768. Oikawa M., Dargan C., Ny T. Hsueh A. J. Expression of gonadotropin-releasing hormone and prothymosin-alpha messenger ribonucleic acid in the ovary. Endocrinology, 1990; 127(5): 2350-2356. Okada H., Mak T. W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nature Reviews, Cancer, 2004; 4: 592-603. Okamoto T., Watanabe N., Yamauchi N., Tsuji Y., Tsuji N., Itoh Y., Neda H., Niitsu Y. Endogenous tumor necrosis factor exerts its protective function intracellularly against the cytotoxicity of exogenous tumor necrosis factor. Cancer Res., 1992; 52(19): 5278-5281. Oliveira I. C, Sciavolino P. J., Lee T. H., Vilcek J. Downregulation of interleukin 8 gene expression in human fibroblasts: unique mechanism of transcriptional inhibition by interferon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992; 89(19): 9049-9053. Owen-Schaub L. B., de Mars M., Murphy E. C. Jr, Grimm E. A. IL-2 dose regulates TNF-alpha mRNA transcription and protein secretion in human peripheral blood lymphocytes. Cell. Immunol., 1991; 132(1): 193-200. Ozzello L., de Rosa C. M., Cantell K., Kauppinen H. L., Habif D. V. Sr. Regression of human breast cancer xenografts in response to intralesional treatment with interferons alpha and gamma potentiated by tumor necrosis factor. J. Interferon Cytokine Res., 1995; 15(10): 839-848. Parant F., Tavernier J., Fiers W., Parant M. Comparative activity of human and murine tumor necrosis factor in toxicity and anti-infectious assays in mice. Microb. Pathog., 1990; 8(2): 143-149. Parant M., Parant F., Vinit M. A., Chedid L. Protective effect of tumor necrosis factor (TNF) obtained by genetic recombination against experimental bacterial or fungal infection. C. R. Acad. Sci. III. 1987; 304(1): 1-4. Patent EPA. 0315110 A1. 10.06.89. A61K 39/39. Patent FRD. 3525750 A1. 29.01.87. A61K 37/02. Pennica D., Nedwin G. E., Hayflick J. S., Seeburg P. H., Derynck R., Palladino M. A., Kohr W. J., Aggarwal B. B., Goeddel D. V. Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature, 1984-1985; 312(5996): 724-729. Peck R., Brockhaus M., Frey J. R. The principal tumor necrosis factor receptor in monocyte cytotoxicity is on the effector cell, not on the target cell. Cell. Immunol., 1991; 132(2): 308-318. Petak I., Houghton J. A. Shared pathways: death receptors and cytotoxic drugs in cancer therapy. Pathology Oncology Research, 2001; 7(2): 95-106. 104 Piotrowska K., Korlak J., Kruszewska J., Iwińska B., Członkowska A. Secretion of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) by peripheral blood monocytes in patients with multiple sclerosis and subacute sclerosis panencephalitis. Neurol. Neurochir. Pol., 1991; 25(4): 455-459. Poli G., Kinter A., Justement J. S., Kehrl J. H., Bressler P., Stanley S., Fauci A. S. Tumor necrosis factor alpha functions in an autocrine manner in the induction of human immunodeficiency virus expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990; 87(2): 782-785. Qidwai T, Khan F. Tumour necrosis factor gene polymorphism and disease prevalence. Scand J. Immunol. 2011; 74(6): 522–47. Rasi G., Terzoli E., Izzo F., Pierimarchi P., Ranuzzi M., Sinibaldi-Vallebona P., Tuthill C., Garaci E. Combined treatment with thymosin-alpha1 and low dose interferon-alpha after dacarbazine in advanced melanoma. Melanoma Res., 2000; 10(2): 189-192. Remick D. G., Nguyen D. T., Eskandari M. K., Kunkel S. L. Interleukin 2 induces tumor necrosis factor gene expression in vivo. Immunol. Invest., 1991; 20(4): 395-405. Rinaldi Garaci C., Favalli C., Del Gobbo V., Garaci E., Jaffe B. M. Is thymosin action mediated by prostaglandin release? Science, 1983; 220(4602): 1163-1164. Rothbarth J., Tollenaar R., van de Velde C. J. H. Recent trends and future perspectives in isolated hepatic perfusion in the treatment of liver tumors. Expert Rev. Anticancer Ther., 2006; 6(4): 553-565. Ryffel B., Brockhaus M., Durmuller U., Gudat F. Tumor necrosis factor receptors in lymphoid tissues and lymphomas. Source and site of action of tumor necrosis factor alpha. Am. J. Pathol., 1991; 139(1): 7-15. Ryffel B., Brockhaus M., Greiner B., Mihatsch M. J., Gudat F. Tumour necrosis factor receptor distribution in human lymphoid tissue. Immunology, 1991; 74(3): 446-452. Sacchi M., Klapan I., Johnson J. T., Whiteside T. L. Antiproliferative effects of cytokines on squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 1991; 117(3): 321-326. Salmon S. E., Young L., Scuderi P., Clark B. Antineoplastic effects of tumor necrosis factor alone and in combination with gamma-interferon on tumor biopsies in clonogenic assay. J. Clin. Oncol., 1987; 5(11): 1816-1821. Salvati F., Rasi G., Portalone L., Antilli A., Garaci E. Combined treatment with thymosinalpha1 and low-dose interferon-alpha after ifosfamide in non-small cell lung cancer: a phase-II controlled trial. Anticancer Res., 1996; 16(2): 1001-1004. Sato N., Nariuchi H., Tsuruoka N., Nishihara T., Beitz J. G., Calabresi P., Frackelton A. R. Jr. Actions of TNF and IFN-gamma on angiogenesis in vitro. J. Invest. Dermatol., 1990; 95(6 Suppl): 85S-89S. Satoh J., Seino H., Shintani S., Tanaka S., Ohteki T., Masuda T., Nobunaga T., Toyota T. Inhibition of type 1 diabetes in BB rats with recombinant human tumor necrosis factoralpha. J. Immunol., 1990; 145(5): 1395-1399. Sburlati A. R., Manrow R. E., Berger S. L. Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88(1): 253-257. Schall T. J., Lewis M., Koller K. J., Lee A., Rice G. C., Wong G. H., Gatanaga T., Granger G. A., Lentz R., Raab H., et al. Molecular cloning and expression of a receptor for human 105 tumor necrosis factor. Cell, 1990; 61(2): 361-370. Schiller J. H., Bittner G. Anti-proliferative effects of tumor necrosis factor, gamma interferon and 5-fluorouracil on human colorectal carcinoma cell lines. Int. J. Cancer, 1990; 46(1): 61-66. Schiller J. H., Bittner G., Storer B., Willson J. K. Synergistic antitumor effects of tumor necrosis factor and gamma-interferon on human colon carcinoma cell lines. Cancer Res., 1987; 47(11): 2809-2813. Schiller J. H., Storer B., Bittner G., Horisberger M. A. Characterization of the synergistic antiproliferative effects of interferon-gamma and tumor necrosis factor on human colon carcinoma cell lines. J. Interferon Res., 1990; 10(2): 129-139. Schmiegel W. H., Caesar J., Kalthoff H., Greten H., Schreiber H. W., Thiele H. G. Antiproliferative effects exerted by recombinant human tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interferon-gamma (IFN-gamma) on human pancreatic tumor cell lines. Pancreas, 1988; 3(2): 180-188. Schmiegel W., Roeder C., Schmielau J., Rodeck U., Kalthoff H. Tumor necrosis factor alpha induces the expression of transforming growth factor alpha and the epidermal growth factor receptor in human pancreatic cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90(3): 863-867. Schmiegel W., Schmielau J., Henne-Bruns D., Juhl H., Roeder C., Buggisch P., Onur A., Kremer B., Kalthoff H., Jensen E. V. Cytokine-mediated enhancement of epidermal growth factor receptor expression provides an immunological approach to the therapy of pancreatic cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94(23): 12622-12626. Schoenfeld H. J., Poeschl B., Frey J. R., Loetscher H., Hunziker W., Lustig A., Zulauf M. Efficient purification of recombinant human tumor necrosis factor beta from Escherichia coli yields biologically active protein with a trimeric structure that binds to both tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem., 1991; 266(6): 3863-3869. Schulof R. S., Lloyd M. J., Cleary P. A., Palaszynski S. R., Mai D. A., Cox J. W. Jr, Alabaster O., Goldstein A. L. A randomized trial to evaluate the immunorestorative properties of synthetic thymosin-alpha 1 in patients with lung cancer. J. Biol. Response Mod., 1985; 4(2): 147-158. Schulof R. S., Naylor P. H., Sztein M. B., Goldstein A. L. Thymic physiology and biochemistry. Adv. Clin. Chem., 1987; 26: 203-292. Seckinger P., Isaaz S., Dayer J. M. Purification and biologic characterization of a specific tumor necrosis factor alpha inhibitor. J. Biol. Chem., 1989; 264(20): 11966-11973. Seckinger P., Zhang J. H., Hauptmann B., Dayer J. M. Characterization of a tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) inhibitor: evidence of immunological cross-reactivity with the TNF receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1990; 87(13): 5188-5192. Selby P., Hobbs S., Viner C., Jackson E., Jones A., Newell D., Calvert A. H., McElwain T., Fearon K., Humphreys J., et al. Tumour necrosis factor in man: clinical and biological observations. Br. J. Cancer, 1987; 56(6): 803-808. Shanahan F., Niederlehner A., Carramanzana N., Anton P. Sulfasalazine inhibits the binding of TNF alpha to its receptor. Immunopharmacology, 1990; 20(3): 217-224. 106 Shieh J. H., Peterson R. H., Moore M. A. Bacterial endotoxin regulation of cytokine receptors on murine bone marrow cells: in vivo and in vitro study. J. Immunol., 1994; 152(2): 859-866. Shyu R. Y., Su H. L., Yu J. C., Jiang S. Y. Direct growth suppressive activity of interferon-alpha and -gamma on human gastric cancer cells. J. Surg. Oncol., 2000; 75(2): 122-130. Smith R. A., Baglioni C. The active form of tumor necrosis factor is a trimer. J. Biol. Chem., 1987; 262(15): 6951-6954. Sohmura Y., Nakata K., Yoshida H., Kashimoto S., Matsui Y., Furuichi H. Recombinant human tumor necrosis factor-α II. Antitumor effect on murine and human tumors transplanted in mice. Int.. J. Immunopharmacol., 1986; 8(3): 357-368. Soma G., Kitahara N., Tsuji Y., Kato M., Oshima H., Gatanaga T., Inagawa H., Noguchi K., Tanabe Y., Mizuno D. Improvement of cytotoxicity of tumor necrosis factor (TNF) by increase in basicity of its N-terminal region. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987; 148(2): 629-635. Soranzo C., Perego P., Zunino F. Effect of tumor necrosis factor on human tumor cell lines sensitive and resistant to cytotoxic drugs, and its interaction with chemotherapeutic agents. Anticancer Drugs, 1990; 1(2): 157-163. Stern D. M., Bank I., Nawroth P. P., Cassimeris J., Kisiel W., Fenton J. W., Dinarello C., Chess L., Jaffe E. A. Self-regulation of procoagulant events on the endothelial cell surface. J. Exp. Med., 1985; 162(4): 1223-1235. Stiles B. G., Bavari S., Krakauer T., Ulrich R. G. Toxicity of staphylococcal enterotoxins potentiated by lipopolysaccharide: major histocompatibility complex class II molecule dependency and cytokine release. Infect. Immun., 1993; 61(12): 5333-5338. Suzuki H., Awataguchi T., Takasaka T. TNF sensitivity of the established cell lines derived from esophageal squamous cell carcinomas and combined effect of TNF and IFN-gamma. [Article in Japanese] Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho, 1989; 92(8): 1192-1196. Tada M., Sawamura Y., Sakuma S., Suzuki K., Ohta H., Aida T., Abe H. Cellular and cytokine responses of the human central nervous system to intracranial administration of tumor necrosis factor alpha for the treatment of malignant gliomas. Cancer Immunol. Immunother., 1993; 36(4): 251-259. Takada H., Kawabata Y., Tamura M., Matsushita K., Igarashi H., Ohkuni H., Todome Y., Uchiyama T., Kotani S. Cytokine induction by extracellular products of oral viridans group streptococci. Infect. Immun., 1993; 61(12): 5252-5260. Talmadge J. E., Uithoven K. A., Lenz B. F., Chirigos M. Immunomodulation and therapeutic characterization of thymosin fraction five. Cancer Immunol Immunother., 1984; 18(3): 185-194. Terzoli E., Rasi G., Izzo F. et al. Proc. Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol., 1992; 11: A103. Ting C. C., Hargrove M. E. Anti-CD3 antibody-induced activated killer cells: cytokines as the additional signals for activation of killer cells in effector phase to mediate slow lysis. Cell Immunol. 1991; 135(2): 273-284. Tracey K. J., Fong Y., Hesse D. G., Manogue K. R., Lee A. T., Kuo G. C., Lowry S. F., Cerami A. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal 107 bacteraemia. Nature, 1987; 330(6149): 662-664. Tsuboi R., Morioka R., Yaguchi H., Shimokawa R., Inaba M., Ogawa H. Primary cutaneous plasmacytoma: treatment with intralesional tumour necrosis factor-alpha. Br. J. Dermatol., 1992; 126(4): 395-397. Tsuji Y., Kitahara-Tanabe N., Noguchi K., Gatanaga T., Mizuno D., Soma G. Production in Escherichia coli of human thymosin beta 4 as chimeric protein with human tumor necrosis factor. Biochem. Int., 1989; 18(3): 501-508. Tzehoval E., Sztein M. B., Goldstein A. L. Thymosins alpha 1 and beta 4 potentiate the antigenpresenting capacity of macrophages. Immunopharmacology, 1989; 18(2): 107-113. Vanderslice W. E., Collins J. L. Differences in the tumor necrosis factor-alpha-mediated lysis by fixed natural cytotoxic cells and fixed cytotoxic macrophages. J. Immunol., 1991; 146(1): 156-161. Van Etten B., van Geel A. N., de Wilt J. H., Eggermont A. M. Fifty tumor necrosis factorbased isolated limb perfusions for limb salvage in patients older than 75 years with limbthreatening soft tissue sarcomas and other extremity tumors. Ann. Surg. Oncol., 2003; 10(1): 32-37. Van Horssen R., ten Hagen T. L. M., Eggermont A. M. M. TNF-α in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist, 2006; 11: 397–408. Varfolomeev E, Goncharov T, Maecker H, et al. Cellular inhibitors of apoptosis are global regulators of NF-kappaB and MAPK activation by members of the TNF family of receptors. Sci Signal 2012; 5(216): ra22. Vecchiarelli A., Puliti M., Blasi E., Bistoni F. Tumor necrosis factor-alpha secretion by splenocytes of Candida albicans infected mice. J. Chemother., 1989; 1(4 Suppl): 1170-1171. Verma V. N., Shenoy C. N., Nadkarni J. J. Augmentation of cisplatin cytotoxicity using cytokines on cervical carcinoma cell lines. Cancer Biother. Radiopharm., 1996; 11(6): 349-354. Vujanovic N.L. Role of TNF superfamily ligands in innate immunity. Immunol. Res. 2011; 50(2-3): 159–74. Vujanovic N.L. Role of TNF family ligands in antitumor activity of natural killer cells. Int. Rev. Immunol. 2001; 20(3-4): 415–37. Waage A., Halstensen A., Espevik T. Association between tumour necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal disease. Lancet, 1987; 1(8529): 355-357. Watanabe N., Niitsu Y., Neda H., Sone H., Yamauchi N., Umetsu T., Urushizaki I. Antitumor effect of tumor necrosis factor against various primarily cultured human cancer cells. Jpn. J. Cancer Res., 1985; 76(11): 1115-1119. Watanabe N., Niitsu Y., Yamauchi N., Ohtsuka Y., Sone H., Neda H., Maeda M., Urushizaki I. Synergistic cytotoxicity of recombinant human TNF and various anti-cancer drugs. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1988; 10(1): 117-127. Watanabe N., Yamauchi N., Maeda M., Neda H., Tsuji Y., Okamoto T., Tsuji N., Akiyama S., Sasaki H., Niitsu Y. Recombinant human tumor necrosis factor causes regression in patients with advanced malignancies. Oncology, 1994; 51(4): 360-365. Watanabe T., Fuchimoto S., Iwagaki H., Nonaka Y., Nezu M., Nishina T., Marutaka M., Susaki 108 K., Naomoto Y., Shiki S., et al. Anti-proliferative effect of combined tumour necrosis factor-alpha and interferon-alpha on human pancreatic cancer in vitro and in vivo. Anticancer Res., 1993; 13(5A): 1501-1505. Watanabe Y., Jacob C. O. Regulation of MHC class II antigen expression. Opposing effects of tumor necrosis factor-alpha on IFN-gamma-induced HLA-DR and Ia expression depends on the maturation and differentiation stage of the cell. J. Immunol., 1991; 146(3): 899-905. Welbourn R., Goldman G., O’Riordain M., Lindsay T. F., Paterson I. S., Kobzik L., Valeri C. R., Shepro D., Hechtman H. B. Role for tumor necrosis factor as mediator of lung injury following lower torso ischemia. J. Appl. Physiol., 1991; 70(6): 2645-2649. Weller M., Stevens A., Sommer N., Melms A., Dichgans J., Wietholter H. Comparative analysis of cytokine patterns in immunological, infectious, and oncological neurological disorders. J. Neurol. Sci., 1991; 104(2): 215-221. Wetzel R., Heyneker H. L., Goeddel D. V., Jhurani P., Shapiro J., Crea R., Low T. L., McClure J. E., Thurman G. B., Goldstein A. L. Production of biologically active N alpha-desacetylthymosin alpha 1 in Escherichia coli through expression of a chemically synthesized gene. Biochemistry, 1980; 19(26): 6096-6104. Williams S., Mutch D. G., Xu L., Collins J. L. Divergent effects of taxol on tumor necrosis factor-alpha-mediated cytolysis of ovarian carcinoma cells. Am. J. Obstet. Gynecol., 1992; 167(6): 1870-1876. Witsell A. L., Schook L. B. Tumor necrosis factor alpha is an autocrine growth regulator during macrophage differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992; 89(10): 4754-4758. Wong G. H., Elwell J. H., Oberley L. W., Goeddel D. V. Manganous superoxide dismutase is essential for cellular resistance to cytotoxicity of tumor necrosis factor. Cell, 1989; 58(5): 923-931. Wong G. H., Goeddel D. V. Tumour necrosis factors alpha and beta inhibit virus replication and synergize with interferons. Nature, 1986; 323(6091): 819-822. Yamasaki T., Moritake K., Paine J. T., Fukuda M., Ohta F., Naitoh H. Intratumoral administration of tumor necrosis factor-alpha for malignant gliomas - two case reports. Neurol. Med. Chir. (Tokyo), 1994; 34(4): 216-220. Yang Y.-F., Yuan H.-Y., Liu N.-S., Chen X.-L., Gao B.-Y., Lu H., Li Y.-Y. Construction, expression and characterization of human interferon α2b-(G4S)n-thymosin α1 fusion proteins in Pichia pastoris. World J. Gastroenterol., 2005; 11(17): 2597-2602. Yilmaz A., Bieler G., Spertini O., Lejeune F. J., Ruegg C. Pulse treatment of human vascular endothelial cells with high doses of tumor necrosis factor and interferon-gamma results in simultaneous synergistic and reversible effects on proliferation and morphology. Int. J. Cancer, 1998; 77(4): 592-599. Zav’yalov V. P., Navolotskaya E. V., Abramov V. M., Galaktionov V. G., Isaev I. S., Kaurov O. A., Kozhich A. T., Maiorov V. A., Prusakov A. N., Vasilenko R. N., et al. The octapeptide corresponding to the region of the highest homology between alpha-interferon and thymosin-alpha 1 effectively competes with both cytokines for common high-affinity receptors on murine thymocytes. FEBS Lett., 1991; 278(2): 187-189. 109 Zeng B. Tumor necrosis factor alpha activity in peripheral blood in patients with acute leukemia: changes and clinical implications. Zhonghua Yi Xue Za Zhi., 1992; 72(7): 405-407. 110
