КЛЕТКИ РИД-ШТЕРНБЕРГА И ХОДЖКИНА
advertisement
КЛЕТКИ РИД-ШТЕРНБЕРГА И ХОДЖКИНА 1. Введение Уникальной и отличительной особенностью лимфогранулематоза (ЛГМ) является малое количество опухолевых клеток в пораженной ткани. С момента их описания прошло уже более ста лет. Впервые в 1890 году С.Я.Березовским было высказано предположение об опухолевой природе лимфогранулематоза и отмечено наличие при этом заболевании крупных многоядерных клеток. В 1897 г. Пальтауфом, в 1898 г. Штернбергом и в 1902 году Рид были описаны характерные для данного заболевания гигантские клетки, в дальнейшем получившие название клеток Березовского-Штернберга (за рубежом – Рид-Штернберга). Но, несмотря на более чем столетнюю историю этих опухолевых клеток, остаются нерешенными множество вопросов в отношении их происхождения, клональности, взаимодействия с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) и т.д. 2. Типы клеток Рид-Штернберга Классические (диагностические) клетки Рид-Штернберга представляют собой крупные (40-80 мкм) клетки, основной морфологической особенностью которых является наличие обильной бледной цитоплазмы и двух крупных ядер с нежной тонкодисперсной сетью хроматина, сгущающейся к периферии, что создает внутри ядра центральную зону просветления. Ядро округлое или овальное, содержит отчетливо видимые оксифильные нуклеолы. Клетки с подобной морфологией, но наличием одного ядра носят название клеток Ходжкина. Один из типов клеток Рид-Штернберга – лакунарные клетки с эксцентрично расположенными темными ядрами меньшей величины; очень четко очерченной, обычно светлой, иногда оптически “пустой” цитоплазмой. Такой своеобразный вид клетка приобретает за счет ретракции цитоплазмы при фиксации ткани формалином, в результате образуется так называемое “пустое пространство”, “лакуна” вокруг ядра. Другой тип клеток Рид-Штернберга - L&H (лимфоциты и/или гистиоциты) или “попкорн-клетки” – крупные клетки, имеющие широкую светлую цитоплазму, многодольчатые лопастные ядра с диспергированным хроматином и маленькими нуклеолами, локализующимися часто у ядерной мембраны. Доли ядра, наслаиваясь друг на друга, придают ему своеобразный вид, напоминающий воздушную кукурузу ("popcorn"). Анаплазированные клетки Рид-Штернберга или, так называемые, “саркомные”, характерные для лимфоидного истощения и саркомы Ходжкина, в соответствии с теорией опухолевой прогрессии [1], положения которой действительны и для ЛГМ [3], приобретают черты атипизма и полиморфизма. Данные клетки имеют плотный глыбчатый хроматин, уродливые и полиморфные ядра и огромные ядрышки. Результатом опухолевой прогрессии, по-видимому, является появление при ЛГМ многоядерных гигантских подковообразных клеток, напоминающих початок кукурузы. Особый тип представляют собой мумифицированные клетки (некробиотическая форма клеток Рид-Штернберга). Lorenzen и соавторы изучали данные клетки на светооптическом и ультраструктурном уровне, пытаясь установить зависимость между частотой встречаемости мумифицированных клеток при различных вариантах лимфогранулематоза (ЛГМ) и экспрессией генов p53, bcl-2, mdm2*, p21/waf1**, как известно, вовлеченных в регуляцию гибели клетки при апоптозе. Разрывы цепочки ДНК выявлялись при помощи метода концевой метки in situ (ISEL – in situ end-labeling tecnique) и метода TdT промежуточной dUTP дигогсигенин концевой метки (TUNEL). Морфологические признаки мумифицированных клеток отличались от таковых при классическом апоптозе. В отличие от апоптотических клеток, данные клетки не реагировали при использовании методов ISEL и TUNEL, что указывало на отсутствие разрывов цепочки ДНК, также они продолжали экспрессировать CD15 и CD30, т.е. сохраняли свои антигенные характеристики. Мумифицированные клетки наиболее часто встречались при нодулярном склерозе и смешанноклеточном варианте, наименьшее количество этих клеток определялось при лимфоидном преобладании. Количество мумифицированных клеток не зависело от экспрессии p53, bcl-2, p21, mdm2. В 63-66% случаев клетки экспрессировали mdm2, p21/waf1, что тесно коррелировало с иммуногистохимическим обнаружением p53. При лимфоидном преобладании клетки Рид-Штернберга были фактически негативны в отношении p21/waf1 или bcl-2. Классические апоптотические клетки (по ISEL и TUNEL) выявлялись при всех вариантах ЛГМ [41] и происходили из неопухолевого клеточного фона [33]. Достоверной корреляции между количеством апоптотических клеток и гистологическим вариантом не определялось[41]. Исследованиями Benharroch D. и соавторов также было подтверждено отсутствие фрагментации ДНК при гибели мумифицированной клетки. Методом электронной микроскопии были обнаружены набухшие митохондрии. Авторы предполагают, что гибель мумифицированных клеток является атипичной формой апоптоза (параапоптозом) [8]. Говоря о проблеме программированной клеточной смерти при лимфогранулематозе, следует отметить экспрессию Bax и Bak (индукторов апоптоза), выявляемых в 91% ВЭБ-позитивных и в 79% ВЭБ-негативных случаях, что говорит о наличии потенциальной проапоптотической функции. Из этого следует, что устойчивость к апоптозу, вероятно, обусловлена гиперэкспрессией антиапоптотических генов, обеспечивающих опухолевый рост [11]. В то же время, мутации гена p53 обнаруживались крайне редко [42, 47, 48], а также не была найдена зависимость между наличием / отсутствием апоптотических клеток и экспрессией bcl–2 [41]. Это позволяет предполагать участие других факторов в реализации апоптоза при ЛГМ. Одной из причин резистентности к апоптозу считают соматические мутации гена CD95 (FAS/APO-I) в клетках-предшественниках клеток Рид-Штернберга [49]. CD95 является геном, относящимся к суперсемейству фактора роста нервов и фактора некроза опухолей (ФНО), в норме индуцирующим апоптоз. Однако, исследования, проведенные Rе и соавторами показали как достаточную экспрессию CD95 при ЛГМ, так и отсутствие его соматической мутации. Авторы предполагали возможность существования нарушений в каскаде СD95-активации, что требовало дополнительного изучения [58]. Дальнейшие исследования показали, что массовому апоптозу В-клеток в герминальных центрах препятствует гиперэкспрессия белка C-FLIP, являющимся мощным ингибитором апоптоза [67, 43, 18]. Особую роль в развитии устойчивости клеток к сигналам апоптоза отводят вирусу Эпштейна-Барр [38], хотя его влияние еще до конца не выяснено. 3. Клетки Рид-Штернберга и клинико-гистологические варианты ЛГМ Возвращаясь к различным типам клеток Штернберга и Ходжкина, следует отметить, что частота встречаемости тех или иных форм находится в прямой зависимости от гистологического варианта лимфогранулематоза. В соответствие с классификацией Ann. Arbor, 1970 г., дополненной в Cotswolds, 1989 г., основанной на выделении морфологических вариантов учитывая структуру опухолевых клеток, клеточный состав реактивного компонента и характер роста: -лимфоидное преобладание, -нодулярный склероз, -смешанноклеточный вариант, -лимфоидное истощение. Однако, за последние годы получено достаточно доказательств, позволяющих доказать, что лимфоидное преобладание включает в себя, по крайнем мере две нозологические формы: собственно лимфома Ходжкина (ЛХ) с лимфоидным преобладанием, получившая также название парагранулемы (термин, использованный Jaeksona и Parker, 1944), и вторая, богатая лимфоцитами, классическая ЛХ. Оказалось, что ЛХ с лимфоидным преобладанием (парагранулема) характеризуется морфологическими, иммунофенотипическими и клиническими отличиями от классической болезни Ходжкина (Classical Hodgkin’s disease - богатая лимфоцитами классическая ЛХ, нодулярный склероз, смешанно-клеточный вариант и вариант с лимфоидным истощением) [22, 24]. При варианте лимфоидного преобладания (парагранулеме) классические клетки Рид-Штернберга практически отсутствуют, характерны “попкорнклетки” с многодольчатыми ядрами и маленькими нуклеолами. Тип роста узловой. Фон представлен в основном лимфоцитами (В-клетками с фенотипом клеток мантийной зоны и CD57-позитивными Т-клетками, окружающими L&H), единичными плазматическими клетками, эозинофилами, нейтрофилами. В узлах присутствует выраженная сеть фолликулярных дендритических клеток. В редких случаях выявляется склероз, что может создавать картину, напоминающую нодулярный склероз. Нодулярные структуры могут занимать различную площадь срезов лимфоузла и сочетаться с полями диффузного роста. В тех случаях, когда нодули занимают 30%, предлагается классифицировать ЛХ как вариант с лимфоидным преобладанием; если же поля диффузного роста занимают более 70% площади лимфоузла - как диффузную с нодулярными очагами. Иммунофенотип опухолевых клеток: CD45+, CD15-, CD30-/+, EMA (антиген эпителиальной мембраны)+/-, позитивны общие В-клеточные антигены (CD19, 20, 22, 79a). Вариант лимфоидного преобладания, как правило, не ассоциирован с вирусом Эпштейна-Барр. Дифференциальную диагностику проводят с богатой Т-клетками крупноклеточной В-клеточной лимфомой, прежде всего в случаях с преимущественно диффузным ростом, а также с фолликулярной гиперплазией, с прогрессивно трансформированными центрами размножения. В последнее время появилось много данных, свидетельствующих, что L&H при лимфоидном преобладании представляют собой моноклональную популяцию В-клеток [10, 17]. Высокий уровень мутаций вариабельного региона V(H) и внутриклональные нарушения подтверждают общность L&H и зародышевого центра В-клеток на стадии дифференцировки центробластов [44, 46]. В современной литературе приводятся многочисленные данные об ассоциации лимфоидного преобладания с В-крупноклеточной лимфомой, либо о прогрессировании в нее [73]. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)* in situ выявлено, что при сосуществовании лимфоидного преобладания и В-клеточной лимфомы, как правило, в злокачественном процессе задействованы одни и те же опухолевые клоны, что также дает основания предполагать развитие L&H из зародышевого центра В-клеток. Hancock и соавторы наблюдали мужчину 41 года, с диффузной лимфаденопатией и «В»-симптомами. Из анамнеза выяснено, что 24 года назад проводилось лечение по поводу ЛГМ (лимфоидное преобладание). В настоящее время исследование биопсированного лимфатического узла показало сочетание диффузной В-крупноклеточной лимфомы и периферической Т-клеточной лимфомы. При проведении ПЦР в области Тклеточной опухоли обнаруживалась перестройка Т-клеточного рецептора (TCR), а в области В-лимфомы реаранжировка генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов Jg(Н). Между областями Т- и В-лимфом располагалась зона, состоящая из малых CD57+ Т-лимфоцитов и малых Влимфоцитов, а также единичных L&H, говорящих в пользу рецидива ЛГМ. Сочетание В и Т-клеточной лимфом, возникших на фоне рецидива ЛГМ у данного пациента, дало авторам возможность предполагать, что лимфоидное преобладание развивается из ранних предшественников лимфоцитов, которые в дальнейшем могут дифференцироваться в двух направлениях (Т и В) [21]. ___________________ *Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот (НК), инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами. Впервые была произведена в 1985 году. ПЦР-цикл состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжима с праймером и удлинения цепи (элонгации); смена этих этапов происходит в результате простого изменения температуры. Следует отметить, что применение молекулярных методов для целей клинической диагностики ограничивается их невысокой чувствительностью и длительностью анализа. Так, для выявления НК-мишени методом гибридизации in situ с применением радиоактивно меченого зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в препарате в нескольких тысячах копий. Нередко число аномальных последовательностей в клиническом препарате диагностически значимо, но меньше этой величины, и гибридизация может дать ложноотрицательный результат. В отличие от этого, ПЦР позволяет выявить уникальную нуклеотидную последовательность. Образно говоря, ПЦР позволяет найти “иголку в стоге сена” - всего одну аномальную последовательность на 100000 – 1000000 нормальных клеток [7]. Классической богатой лимфоцитами ЛХ более всего свойственен диффузный характер роста, однако, встречается и нодулярный. Богатая лимфоцитами классическая ЛХ с нодулярным ростом была впервые описана Ashton-Key et. al. в 1995 г. и названа "фолликулярной болезнью Ходжкина". В отличие от варианта ЛХ с лимфоидным преобладанием (парагранулемы), нодули при классической богатой лимфоцитами ЛХ содержат на периферии небольшой регрессивно трансформированный центр размножения, а сама узелковая структура представлена эксцентрической экспансией зоны мантии. Если в случаях с нодулярным "фоном" для опухолевых клеток служат Влимфоциты, то при диффузном преобладают Т-клетки (СДЗ0+). Основным критерием принадлежности богатой лимфоцитами ЛХ к классическому варианту служит преобладание среди опухолевых клеток типичных клеток Рид-Штернберга и клеток Ходжкина с соответствующим фенотипом (СД15+, СДЗ0+, СД45-, ЕМА-, J-chain-). Нодулярный склероз (НС) характеризуется разрастанием коллагенизированной бедной фибробластами соединительной ткани, источником которой является капсула (трабекулы) лимфоузла. Тяжи соединительной ткани вызывают фрагментацию опухолевого инфильтрата, формируют кольцевидные структуры. Коллаген при этой форме ЛХ двояко преломляющий, что отличает его от фиброза при других гистологических вариантах этого заболевания. Наряду с узловым типом роста могут наблюдаться диффузные области роста и участки некроза. Морфологической особенностью является частое преобладание в опухолевой ткани лакунарных клеток. Данные клетки характерны именно для нодулярного склероза и практически не обнаруживаются при других гистологических вариантах. Встречаются диагностические клетки Рид-Штернберга, хотя иногда их количество может быть столь малочисленными, что выявляется с трудом. Фон представлен лимфоцитами, нейтрофилами, плазматическими клетками, гистиоцитами, эозинофилами. Иммунофенотипическая характеристика атипичных клеток: CD15+, CD30+, CD45-, EMA-, Вклеточные антигены положительны в 15% случаев. В 40% случаев НС ассоциирован с ВЭБ. В зависимости от количества атипичных клеток опухоль подразделяется на подтипы (НС I, НС II, синцитиальный вариант). Для "синцитиального варианта" нодулярного склероза характерно формирование лакунарными и атипичными крупными опухолевыми клетками компактных очагов и полей, напоминающие метастазы рака, меланомы, герминогенных опухолей, для дифференциальной диагностики с которыми нередко требуется иммуногистохимическое исследование. Британской национальной группой по изучению лимфом была предложена гистологическая градация нодулярного склероза на две категории НС-1 и НС11. К последней отнесены все те случаи, где более 25% нодулей характеризуется лимфоидным истощением. При клинико-морфологических сопоставлениях в плане клинической значимости клеточного состава нодулярных очагов получены противоречивые результаты. Дальнейшее исследование в этом направлении установило, что при выделении NS-11 необходимо учитывать следующие критерии: 1) более чем 25% нодулей должны быть представлены преимущественно опухолевыми клетками (плеоморфный или ретикулярный подтип); 2) более чем 80% нодулей фиброзированы; 3) более чем 25% нодулей содержат многочисленные уродливые или анаплазированные опухолевые клетки при отсутствии подавления реактивного лимфоидного компонента. Дифференцировать нодулярный склероз в ряде случаев приходится с анапластической крупноклеточной и первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомами. Смешанноклеточный вариант (СВ) имеет пестрый клеточный состав, представленный классическими клетками Рид-Штернберга и Ходжкина, небольшим количеством лакунарных клеток, лимфоцитами, нейтрофилами, гистиоцитами, плазматическими клетками. Тип роста диффузный. Иммунофенотип клеток Рид-Штернберга аналогичен иммунофенотипу клеток при нодулярном склерозе: CD15+, CD30+, CD45-, ЕМА-, общие Вклеточные антигены экспрессируются в 15-25% случаев. Среди малых лимфоцитов преимущественно выявляются Т-клетки (СДЗ+, СД57-). Могут встречаться очажки фиброза в виде тяжей беспорядочно расположенного коллагена, иногда выражены посткапиллярные венулы. Встречаются некрозы. В 60-70% случаев ВЭБ-позитивны. Говоря о возможности перестройки генов иммуноглобулинов Jg(H), можно привести данные Kornacker M. и соавторов, которые анализируя многочисленные образцы крови больного смешанноклеточным вариантом лимфогранулематоза в период рецидива, определяли в клетках Рид-Штернберга клональную перестройку Jg(H). После лечения реаранжировка генов не выявлялась [37]. В то же время, интересным представляется наблюдение Jox и соавторами идентичной перестройки генов вариабельного региона у больного СВ ЛГМ в дебюте заболевания и при генерализованном рецидиве через 2,5 года, несмотря на проводимую терапию, в том числе и высокодозную, с последующей аутологической трансплантацией костного мозга. Данное наблюдение свидетельствует о персистенции опухолевого клона, несмотря на проведенную агрессивную терапию [33]. Лимфоидное истощение характеризуется беспорядочным развитием соединительной ткани, участками фиброза и некроза, снижением общего числа клеток, прежде всего за счет лимфоцитов. Имеется большое количество клеток Рид-Штернберга, их уродливые “саркомные варианты”. Тип роста диффузный. Иммунофенотипическая характеристика опухолевых клеток (аналогична иммунофенотипу при НС и СВ): CD15+, CD30+, CD45-, EMA-, общие В-клеточные антигены, как правило, не экспрессируются (возможна слабая экспрессия CD20), Т-линейные антигены могут быть позитивны. Вариант с лимфоидным истощением ЛХ представлен двумя гистологическими подвариантами: диффузным фиброзом и так называемым ретикулярным подвариантом. При диффузном фиброзе в лимфатических узлах наблюдается разрастание фиброзной, чаще бедной фибробластами соединительной ткани, не обладающей двойным лучепреломлением. Могут встречаться участки отложения аморфного белкового вещества (преколлагена). Иногда тяжи фиброзной соединительной ткани формируют сетчатый рисунок. Небольшие скопления представлены скудным количеством лимфоцитов и вариабельными клетками Рид-Штернберга и Ходжкина. Другие реактивные клеточные элементы, как правило, отсутствуют. Встречаются очаги некрозов. При ретикулярном подварианте лимфоидного истощения инфильтрат представлен преимущественно опухолевыми клетками. В разных соотношениях могут присутствовать как типичные клетки Рид-Штернберга и Ходжкина, так и атипичные, уродливые. Возможна примесь фибробластоподобных клеток. Реактивный компонент скудный. Нередко встречаются очаги некрозов. При преобладании атипичных форм опухолевых клеток, особенно в тех случаях, когда они растут пластом, возникает необходимость дифференциации с крупноклеточными лимфомами. В тех случаях, когда в лимфоузлах, наряду с разрастаниями крупных атипичных клеток, удается обнаружить участки, где клеточный состав соответствует типичной ЛХ, вопрос решается в пользу последней. Саркома Ходжкина – вариант ЛГМ, представляющий собой промежуточную форму между классическим лимфогранулематозом и лимфосаркомой. Характерно обилие крупных анаплазированных опухолевых клеток, возможно полное отсутствие типичных диагностических клеток РидШтернберга. 4. Происхождение клеток Рид-Штернберга Клеточное происхождение и клональная природа клеток Рид-Штернберга и Ходжкина оставалась неясной до середины 90-х годов ХХ века. Еще два-три десятилетия назад не было убедительного ответа на вопрос, является ли ЛГМ опухолью или инфекцией. Основным препятствием на пути успешных экспериментальных исследований служило малое количество опухолевых клеток в пораженной лимфогранулематозом ткани. Иммунофенотипический анализ с использованием моноклональных антител уже с начала 80-х годов указывал в направление лимфатической природы клеток Рид-Штернберга и Ходжкина [63]. Однако, экспрессия В-клеточных и/или Т-клеточных антигенов, а также дополнительная экспрессия специфических маркеров различных других клеточных линий (дендритных, моноцитарномакрофагальных) приводили к получению неоднородных результатов исследований. В дальнейшем для установления происхождения клеток Рид-Штернберга и Ходжкина и доказательства клональности клеточной популяции был применен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в культуре ткани, который выявил перестройку генов иммуноглобулинов Jg(H) и Т-клеточного рецептора (TCR). Однако, полученные результаты не дали достоверной информации о природе и клональности клеток Рид-Штернберга и Ходжкина из-за наличия в культуре ткани как опухолевых клеток, так и клеток микроокружения. Это привело к направлению исследований в сторону манипуляций на отдельно взятой клетке (single cell PCR). Современные цитогенетические исследования, изучение присутствия вируса Эпштейна-Барр в геноме клеток Рид-Штернберга и Ходжкина, анализ перестроек генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора, микроманипуляция с атипичными клетками доказывают, что клетки Рид-Штернберга и Ходжкина представляют собой широкую клональную популяцию. Исследование перестройки Jg(H) и TCR в клетках Рид-Штернберга и Ходжкина, а также выявление высокого уровня соматической гипермутации в вариабельном регионе в большинстве случаев свидетельствует об их преимущественно В-клеточном происхождении [38, 45, 59, 64,]. Так, происхождение из зародышевого (герминального) центра В-клеток выявляется в 95% случаев [15, 59, 64]. Основным событием, происходящим в герминальном центре, является соматическая гипермутация, приводящая к возникновению множества соматических мутаций в перестроенных генах иммуноглобулинов в темной зоне герминального центра, а также селекция Вклеток в светлой зоне зародышевого центра, приводящая к элиминации Вклеток с неблагоприятными мутациями и низкой аффинностью к антигену [39, 40, 68]. Приблизительно четверть возникающих мутаций носит так называемый деструктивный характер, т.е. данные мутации вызывают образование стоп-кодона и/или делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания. В норме В-клетки с деструктивными мутациями подвергаются апоптозу и не могут дифференцироваться дальше. При наличие у Влимфоцита с деструктивными мутациями сопутствующего онкогенного дефекта, клетка не подвергается апоптозу и может трансформироваться в клетку Рид-Штернберга [68]. Эксперименты с клеточными линиями, полученными из клеток Рид-Штернберга и Ходжкина подтверждают версию о резистентности клеток к FAS-опосредованному апоптозу [36]. Мутации FAS при ЛГМ встречаются значительно чаще, чем при других лимфомах. Однако это не единственный механизм, препятствующих апоптозу. Выявлена мутация гена IF-каппаВ-альфа, который усиливает перенос транскрипционного фактора NF-каппаВ в ядро, что вызывает транскрипцию генов мишеней [26, 27]. Также, как уже упоминалось выше, повышение экспрессии C-FLIP, являющегося антиапоптозным белком, ингибируют индукцию сигнала к программированной клеточной гибели [68]. Seitz V. и соавторы, исследуя происхождение оставшихся 5% клеток РидШтернберга, выявили в 1-2% случаев возможность наличия в качестве предшественников клеток Штернберга и Ходжкина – Т-клетку. Это доказывается как клональной перестройкой Т-клеточного рецептора, так и экспрессией Т-клеточных маркеров (гранзима В и перфорина). Интересно, что даже среди Т-маркер позитивных случаев только 15% происходят из Тклетки-предшественницы, т.е. остальные 85% клеток - В-клеточной природы. Это свидетельствует о том, что экспрессия Т-клеточных антигенов на клетках Рид-Штернберга, в отличие от таковой при неходжкинской лимфоме, не является линейно специфичной [59]. В качестве одной из версий рассматривалась возможность происхождения клеток Рид-Штернберга из антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток и макрофагов), в пользу чего свидетельствовали: высокая экспрессия антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости, наличие активационных маркеров CD15, CD25, CD30, CD70, CD71, молекул адгезии CD54, CD58, костимулирующих молекул CD40, CD80, CD86 и активная секреторная деятельность [12]. Экспрессия большинством клеток Рид-Штернберга CD83 [60] - маркера дендритных клеток, а также протеина S–100 [12] говорит в пользу существования их общего предшественника. Также, Pinkus и соавторы выявили присутствие в опухолевых клетках фасцина – протеина, специфичного только для дендритных клеток. Это дало авторам право предполагать, что либо клетки Рид-Штернберга происходят из дендритных клеток, либо ВЭБ стимулирует экспрессию В-клетками фасцина. Последняя версия представляется более достоверной. [55]. 5. Секреторная микроокружение деятельность клеток Рид-Штернберга и их Характерная для ЛГМ гистологическая картина (наличие в пораженной ткани эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов, плазматических клеток, участков фиброза и некроза) обусловлена активной секреторной деятельностью клеток Рид-Штернберга и реактивных клеток. Так, свойственный нодулярному склерозу фиброз обусловлен секрецией при нем клетками Рид-Штернберга и Ходжкина фактора роста фибробластов, обеспечивающего коллагенообразование [54]. ФНО и ИЛ (интерлейкин)-8 (максимальный при нодулярном склерозе и практически отсутствует при лимфоидном преобладании) обеспечивают активацию и хемотаксис нейтрофилов [30]. Среди реактивных клеток преобладают активированные CD4+ лимфоциты (Т-хелперы/индукторы), представляющие собой поликлональную популяцию. Наблюдается селективное подавление NK-клеток (натуральные киллеры) [57] и CD8+ (супрессоры/цитотоксические клетки), составляющих всего около 25% от общего числа лимфоцитов [57 ,74]. Миграция клеток в очаг воспаления приводит к снижению в крови общего пула Т-лимфоцитов, субпопуляции хелперы/индукторы и иммунорегуляторного индекса [5, 62], что объясняет характерный для ЛГМ иммунодефицит. Перераспределение CD4-лимфоцитов происходит в результате реализации нескольких механизмов: влияние ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, взаимодействия лигандов суперсемейства ФНО CD40L и CD30L с соответствующими CD30+ и CD40+ клетками-мишенями [72], наличие костимулирующих молекул CD80 и CD86 [52, 70], а также высокий уровень экспрессии хемокинов. Так, ССхемокин TARC, секретируемый при нодулярном склерозе и смешанноклеточном варианте, но не лимфоидном преобладании, обеспечивает миграцию Т-лимфоцитов[69]. Недавно выявлен другой ССхемокин – эотаксин, привлекающий в очаг воспаления как Т-хелперы/ индукторы, так и эозинофилы. Было доказано, что клетки Рид-Штернберга непосредственно не экспрессируют данный хемокин. Однако, секреция ими ФНО-альфа вызывает ответную реакцию фибробластов в виде экспрессии эотаксина. При блоке ФНО-альфа фибробласты перестают участвовать в процессе хемотаксиса Т-лимфоцитов и эозинофилов[34, 66]. Так, клетки Рид-Штернберга имеют полный набор антигенов II класса ГКГ, экспрессируют молекулы адгезии CD54, CD58 и активационные маркеры, что позволяет адекватно стимулировать CD4+ клетки и обеспечивать их межклеточное взаимодействие [16]. В то же время, малопонятной остается возможность сосуществования опухолевых клеток и враждебного микроокружения иммунокомпетентных клеток (CD4+). Проведенные исследования, по данным Bosshart, свидетельствуют, что основная часть молекул II класса ГКГ на клетках Штернберга представлена неиммуногенными полипептидами (non-immunogenic invariant chain peptide – CLIP), т.е. не способными вызывать адекватный иммунный ответ [9]. Эозинофилы, которые в достаточном количестве присутствуют в пораженной ткани, несут на своей поверхности рецепторы и лиганды суперсемейства ФНО, включая CD40, CD40L, CD30L, CD95/Fas, CD95/FasL и 4-1BB. Доказано, что (ИЛ-3), ИЛ-5, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), секретируемые клетками РидШтернберга, повышают экспрессию рецепторов/лигандов на поверхности эозинофилов. Эозинофилы, в свою очередь, являясь функционально активными, взаимодействуют с CD40+ и CD30+ клетками-мишенями, в том числе, и с клетками Рид-Штернберга [28, 56, 36]. Под действием лиганда CD30 передача сигнала включает активацию тирозинкиназы и митогенактивируемой протеинкиназы в клетках Штернберга, инициируя опухолевую пролиферацию [72, 36]. Опухолевый рост стимулируют ФНО, ГМ-КСФ, ИЛ6, ИЛ-9, а также ИЛ-13, вероятно, по аутокринному механизму [35]. Перестройки генов Jg(H) и TCR в большинстве случаев поликлональные. В то же время, Hummel и соавторы, а также Мykata и соавторы выявили поликлональные реаранжировки только в половине случаев; во второй половине отмечалась моноклональность, причем 70% моноклональных перестроек составили ВЭБ-негативные, CD20+ клетки Рид-Штернберга[29, 50]. Chan WC. и соавторы высказали предположение о возможной трансформации неклонального заболевания, каким, по их мнению, является лимфогранулематоз, в клональное, при его прогрессировании [13]. 6. Хромосомные аномалии в клетках Рид-Штернберга Числовые изменения хромосом в клетках Рид-Штернберга были выявлены в 100% проанализированных наблюдений при исследовании по методике FICTION (одновременное использование флюоресцентного иммунофенотипирования и интерфазного цитогенетического анализа) [71] и методом сочетания гибридизации in situ* и иммуноцитохимического анализа [32], что позволяет говорить о нестабильности кариотипов при ЛГМ. Не было обнаружено характерных хромосомных аномалий. Наиболее типичной являлась трисомия с более частым вовлечением 1 хромосомы [31, 32, 53]. Неоднократно выявлялись генетические нарушения в хромосомах 7 и 16 [43], а также многочисленные неспецифические поломки в локусе протоонкогенов и генов апоптоза [71]. При лимфоидном преобладании (парагранулеме) обнаруживались другие хромосомные нарушения, вовлекающие 17q (70%), 2p (40%), 17 p (40%), 22q (35%), 9p (30%), 14q (30%), а также делеция 13q (35%), 6q (30%), 11q (25%) и 4q (25%) [14]. Jansen и соавторы, исследовав клеточный фон при лимфоидном преобладании, указывают на присутствие подобных хромосомных аномалий в CD30-негативных, морфологически нормальных клетках, несущих Влинейный антиген CD19, что еще раз свидетельствует в пользу В-клеточной природы клеток Рид-Штернберга [32]. Цитогенетические исследования микроокружения клеток Рид-Штернберга и Ходжкина выявили достоверно большее количество хромосомных аномалий в сравнении с реактивным лимфаденитом, 1-12% и менее 1% соответственно. Нарушения чаще затрагивали 1 хромосому [31]. По данным Gravel и соавторов транслокация t (14;18)(q32;q21) определялась на неопухолевых В-лимфоцитах, окружающих клетки Рид-Штернберга, в 32% случаев [20]. ___________________ *Гибридизация in situ – метод прямого выявления нуклеиновых кислот в клеточных культурах в условиях, позволяющих одновременно исследовать их морфологию. Метод разработан в 1969 году Пардю и Голл, и независимо от них Джонс и др. С накоплением данных о молекулярной структуре вирусов и других микроорганизмов, с разработкой методов получения зондов с помощью ферментативного синтеза или рекомбинантных ДНК появилась возможность выявлять чужеродный генетический материал в клинических препаратах [4]. Метод гибридизации in situ позволяет получить важную информацию о структуре и функционировании клеток при различных заболеваниях, а при параллельном применении других методов (например, иммуноцитохимии) удается исследовать статические и динамические особенности клеток и сопоставить их с морфологией клеток и тканей. К недостаткам метода следует отнести трудность выявления последовательностей, представленных небольшим числом копий [6]. 7. Роль вируса Эпштейна-Барр Выявление ДНК вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в клетках Рид-Штернберга и Ходжкина является одним из показателей клональности ЛГМ. По разным данным ВЭБ определяется в 40-73% случаев [2, 23, 50]. Предполагаемое инфицирование клеточной популяции представляется наиболее общей генетической аномалией, выявляемой при лимфогранулематозе. Однако, до сих пор роль ВЭБ в патогенезе ЛГМ остается не полностью понятной. Окончательно не определена зависимость между инфицированием ВЭБ и генетическими аномалиями в клетках Рид-Штернберга [53]. В вирусассоциированных случаях ЛГМ моноклональный геном вируса выявлялся во всех клетках Рид-Штернберга, указывая на предшествующее инфицирование вирусом экспансии клона. Это косвенно свидетельствует о моноклональном происхождении клеток Рид-Штернберга [51, 61]. Вирус Эпштейна-Барр не определяет развитие того или иного варианта ЛГМ [51]. Хотя по данным Леенман Е.Е. и соавторов вирус чаще ассоциирован с лимфоидным истощением и смешанноклеточным вариантом. Также имеется статистически значимое увеличение частоты его обнаружения у больных моложе 10 лет и старше 50. В вирусассоциированных случаях некротические изменения в лимфатических узлах отмечались достоверно чаще, а при смешанноклеточном варианте определялось статистически достоверное увеличение количества опухолевых и плазматических клеток [2]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что больные, перенесшие инфекционный мононуклеоз, заболевают ЛГМ в несколько раз чаще, чем бессимптомные носители [25, 65]. Вирус Эпштейна-Барр оказывает влияние на формирование фенотипа генетически незрелых лимфоцитов, вызывает изменение секреции цитокинов клетками Рид-Штернберга и Ходжкина, способствуя подавлению специфического анти-ВЭБ иммунитета, обнаруживаемого в вируспозитивных случаях [51]. Также отмечена модуляция опухолевых клеток, характеризующаяся увеличением экспрессии CD30, онкопротеина bcl-2, а также снижением экспрессии CD79a [2]. 8. Заключение Значительное развитие молекулярной биологии и генетики дало возможность шагнуть от морфологического исследования клеток РидШтернберга к современным высокочувствительным методикам, которые позволяют изучать проблемы происхождения опухолевых клеток и клональности клеточной популяции, роль вируса ЭпштейнаБарр в патогенезе ЛГМ и программированную клеточную смерть. Тем не менее, многие вопросы биологии лимфогранулематоза остаются открытыми. Происхождение клеток Рид-Штернберга является наиболее обсуждаемым на сегодняшний день. И хотя большинство ученых сходятся во мнении о В-клеточной природе клеток Рид-Штернберга, существует значительное количество работ, свидетельствующих об общности опухолевых клеток и с Т-лимфоцитами, и с дендритными клетками, и с макрофагами. Остается открытым вопрос клональности ЛГМ, о которой можно судить по выявлению идентичных включений ВЭБ, однотипным перестройкам генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов Jg(H) и Т-клеточного рецептора (TCR). И если в отношении лимфоидного преобладания все представляется более понятным (в основном моноклональные перестройки g(H) и TCR при Classical Hodgkin’s disease, получаемые разными исследователгенов Jg(H) и отсутствие ассоциации с ВЭБ), то данные о реаранжировке генов Jg, сильно варьируются. Так, встраивание ВЭБ в геном клеток Рид-Штернберга косвенно свидетельствует о моноклональности клеточной популяции. В то же время перестройки генов Jg(H) чаще бывают поликлональными. Не все понятно в отношении хромосомных аномалий, часто обнаруживаемых в опухолевых клетках, и их взаимосвязи с инфицированием вирусом Эпштейна-Барр. Также остается не до конца решенной проблема устойчивости клеток Рид-Штернберга к апоптозу, несмотря на многочисленные исследования в этом направлении. Тем не менее, большой интерес патогистологов и гематологов к этой проблеме позволяет надеяться на дальнейшие исследования в этом направлении и решение многих спорных моментов. Список литературы 1. Воробьев А.И. Опухолевая прогрессия и некоторые вопросы патогенеза лейкозов: Дис. … д-ра мед. наук. – М., 1968. 2. Леенман Е.Е., Афанасьев Б.В., Пожарисский К.М. Арх. патол., 1999; 1: 1522. 3. Лорие Ю.Ю. Тер. арх., 2000; 7: 76-80. 4. Сирьян С.М. в кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. – М.: Мир, 1999: 132-172. 5. Хамаганова Е.Г., Алещенко С.М. Совр. пробл. аллергологии, клин. иммунологии и иммунофармакологии. – М., 28-31 янв.,1997: 668. 6. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. – М.: Мир, 1999: 91-131. 7. Шибата Д.К. в кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. – М.: Мир, 1999: 395-427. 8. Benharroch D., Drousset P., Goldstein J., Gogas J. J. Pathol., 1998; 185(1): 116. 9. Bosshart H. Leuk. Lymphoma, 1999; 36(1-2): 9-14. 10. Brauninger A., Kuppers R., Strickler J.G., Wacker H.H., Rajewsky K., Hansmann M.L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997; 94(17): 9337-9342. 11. Brousset P., Krajewski S., Schlaifer D., Reed J.C., Delsol G. Leuk. Lymphoma, 1999; 34(5-6): 581-584. 12. Brown R.E. Ann. Clin. Lab. Sci., 1997; 27(5): 329-337. 13. Chan W.S., Delabie J. Ann. Oncol., 1996; 7 (Suppl.4): 41-43. 14. Chui D.T., Hammond D., Baird M., Shield L., Jackson R., Jarrett R.F. Genes Chromosomes Cancer, 2003; 38(2): 126-136. 15. Cossman J., Ammunziata C.M., Barash S. Blood, 1999; 94(2): 411-416. 16. Delabie J., Chan W.C., Weisenburger D.D., De Wolf-Peeters C. Leuk. Lymphoma, 1995; 18(1-2): 35-40. 17. Deng F., Lu G., Li G., Yang G. Mol. Pathol., 1999; 52(1): 37-41. 18. Dutton A., O’Neil J.D., Milner A.E., Reinolds G. M., Starczynski J., Crocker J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2004; 101(17): 6616-6. 19. Emmerich F., Theurich S., Hummel M., Haeffker A., Vry M.S. et all. J. Pathol., 2003; 201(3): 413-420. 20. Gravel S., Delsol G., Saati T. Blood, 1998; 91(8): 2866-2874. 21. Hancock J.G., Wells A., Haling R.C., Tilashalski K., Conner M.G. Ann. Diagn. Pathol., 1999; 3(1): 23-24. 22. Harris N.L., Jaffe E.S., Stein H. et al. Blood, 1994; 84(5): 1301-1392. 23. Harris N.L. Ann. Oncol., 1998; 9 (Suppl.5): 45-56. 24. Harris N.L., Jaffe E.S., Diebold J., Frandrin G. et al. J. Cl. Oncol., 1999; 17(12): 3835-3849. 25. Hjalgrim H., Askling J., Sorehsen P., Madsen M., Rosdahl N. et all. J. Natl. Cancer. Inst, 2000; 92(18): 1522-1528. 26. Horie R., Watanabe T. Drug News Perspect., 2003; 16(10): 649-656. 27. Horie R., Higashihara M., Watanabe T. Int. J. Hematol., 2003; 77(1): 37-47. 28. Hsu P.L., Hsu S.M. Lab. Invest., 2000; 80(7): 1111-1119. 29. Hummel M., Zieman K., Lammert H., Pileri S., Sabattini E., Stein H. N. Engl. J. Med., 1995; 333(14): 901-906. 30. Foss H.D., Herbst H., Gottstein S., Demel G., Araujo I., Stein H. Am. J. Pathol., 1996; 148(4): 1229-1236. 31. Jansen M.P., Hopman A.H., Haesevoets A.M., Gennotte I.A., Bot F.J., Arends J.M. J. Pathol., 1998; 185(2): 145-152. 32. Jansen M.P., Hopman A.H., Haesevoets A.M., Stevens-Kroef M.J., Arends J.M. J. Pathol., 1999; 189(4): 527-532. 33. Jox A., Zander T., Kornacker M., Kanzler H., Kuppers R., Diehl V., Wolf J. Ann. Oncol., 1998; 9(3): 287-283. 34. Jundt F., Anagnostopoulos I., Bommert K., Emmerich F. et al. Blood, 1999; 94(6): 2065-2071. 35. Kapp U., Yeh W.C., Patterson B. et al. J. Exp. Med., 1999; 189(12): 1939-1946. 36. Kim L.N., Eow G.I, Peh S.C., Poppema S. Pathology, 2003; 35(5): 428-35. 37. Kornacker M., Jox A., Vockerodt M., Tesch H., Bohlen H., Diehl V., Wolf J. Br. J. Hematol., 1999; 106(2): 528-531. 38. Kuppers R., Kajewsky K. Ann. Rev. Jmmunol., 1998; 16: 471-493. 39. Kuppers R. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2003; 987: 173-9. 40. Lee I.S., Kim S.H., Song H.G., Park S.H. Int. J. Hematol., 2003; 77(4): 330-5. 41. Lorenzen J., Alavaikko M., Hansman M.L. Abstract volume, 1995; 16(3): 208216. 42. Lorenzen J., Thiele J., Fisher R. J. Pathol., 1997; 182(3): 288-298. 43. Maggio E.M., Van Den Berg A., de Jong D., Diesptra A., Popemma S. Am. J. Pathol., 2003; 162 (1): 29-35. 44. Marafioti T., Hummel M., Anagnostopoulos I., Foss H.D., Falini B., Delsol G. N. Engl. J. Med., 1997; 337(7): 453-458. 45. Marafioti T., Hummel M., FossH.D., Laumen. Blood, 2000; 95(4): 1443-1450. 46. Meignin V., Briere J., Brice P., Gisselbrecht C., Gaulard P., Janin A. Ann. Pathol., 2000;20(1): 19-24. 47. Messineo C., Jamerson M.H., Hunter E., Braziel R., Bagg A. Blood, 1998; 91(7): 2443-2451. 48. Montesinos-Rongen M., Roers A., Kuppers R., Rajewsky K., Hansman M.L. Blood, 1999; 94(5): 1755-1760. 49. Muschen M., Re D., Brauninger A., Wolf J., Hansman M.L. Canser Res., 2000; 60(20): 5640-5643. 50. Mykata A., Li D.X., Kurosu K., Oda K., Tamaru J.I. Leuk. Lymphoma, 1997; 28(1-2): 145-152. 51. Niedobitek G. Ann. Oncol., 1996; 7 (Suppl. 4): 11-17. 52. Nozawa Y., Wakasa H., Abe M. Pathol. Int., 1998; 48(1): 10-14. 53. Ohshima K., Jshiguro M., Ohgami A. et al. Int. J. Cancer, 1999; 82(2): 250255. 54. Ohshima K., Sugihara M., Suzumiya J., Haraoka S. et al. Pathol. Res. Pract., 1999; 195(3): 149-155. 55. Pincus G.S., Pincus J.L., Langhoff E., Matsumura F., Yamashiro S., Mosialos G., Said J.W. AM. J. Pathol., 1997; 150(2): 543-562. 56. Pinto A., Aldinucci D., Gloghini A. et al. Ann. Oncol., 1997; 8 (Suppl. 2): 8996. 57. Poppema S., Potters M., Visser L., van der Berg A.M. Ann. Oncol., 1998; 9 (Suppl 5): 21-24. 58. Re D., Hofmann A., Wolf J., Diehl V., Staratschek-Jox A. Exp. Hematol., 2000; 28(1): 31-35. 59. Seitz V., Hummel M., Marafioti T., Anagnostoulos I., Assaf G., Stein H. Blood, 2000; 95(10): 3020-3024. 60. Sorg U.R., Morse T.M., Patton W.N., Hock B.D., Angus H.B., Robinson B.A., Colls B.M., Hart D.N. Pathology, 1997; 29(3): 294-299. 61. Spieker T., Kurth J., Kuppers R., Rajewsky K. et al. Blood, 2000; 96(9): 31333138. 62. Staneva M., Radeva M., Avramova D., Petrov M. Докл. Бьлг. АН, 1995; 8: 121-122. 63. Staples W.G., Visser A.E. S. Afr. Med. J., 1978; 54(5): 186-188. 64. Stein H., Hummel M. Semin. Hematol., 1999; 36(3): 233-241. 65. Tavani A., La Vecchia C., Franceschi S., Srraino D., Carbone A. Eur. J. Cancer. Prev., 2000; 9(1): 59-64. 66. Teruya-Feldsteim J., Jaffe E.S., Burd P.R., Kingma D.W., Setsuda J.E., Tosato G. Blood, 1999; 93(8): 2463-2470. 67. Thomas R.C., Kallenborn A., Wickenhauser C., Schultze J.L., Draube A. et all. Am. J. Pathol., 2002; 160(4): 1521-8. 68. Thomas R.S., Re D., Wolf J., Diehl V. Lancet Oncol., 2004; 5(1): 11-18. 69. Van den Berg A., Visser L., Poppema S. Am. J. Pathol., 1999; 154(6): 16851691. 70. Van Gool S.W., Delabie J., Vanderberghe P., Coorevits L., De Wolf-Peeters C., Ceuppens J.L. Leukemia, 1997; 11(6): 846-851. 71. Weber-Matthiesen K., Deerberg J., Poetsch M., Grote W., Schlegelberger B. Blood, 1995; 86(4): 1464-1468. 72. Wendtner C.M., Schmitt B. et al. Cancer Res., 1995; 18: 4157-4161. 73. Wickert R.S., Weisenburger D.D., Tierens A., Greiner T.C., Chan W.C. Blood, 1995; 87(6): 2312-2320. 74. Willenbrock K., Roers A., Blohbaum B., Rajewsky K., Hansmann M.L. Am. J. Pathol., 2000;157(1): 171-175. 25 августа 2004 г. * mdm2 – p53-связывающий белок; его гиперэкспрессия приводит к инактивации p53; инициирующего апоптоз. ** p21 – ингибитор циклинзависимых киназ и пролиферативного ядерного антигена (PCNA), который останавливает клетку на границе G1/S фаз клеточного цикла (блок G1). В ответ на повреждение ДНК увеличивается синтез белка p21. Ген waf1 – мишень p53, продукты данного гена активируют белки семейства pRb, причастные к задержке клеток в G1-фазе.
