Исследование возбудимости клеток харовых водорослей.

Исследование возбудимости клеток харовых
водорослей.
6 сентября 2009 г.
1
Рис. 1: Схема продольного (А) и поперечного (Б) сечения интернодальной
клетки харовой водоросли Chara corallina, световые (В, Г) и электронная
(Д) фотографии участка клетки с разделительной полосой (РП) между направленными в противоположные стороны по спирали потоками цитоплазмы. хлрп—хлоропласты, Т—тонопласт, ПЛ—плазмалемма
0.1
Описание объекта.
Харовые водоросли—излюбленный объект электрофизиологических исследований, потому что они обладают возбудимостью (способны генерировать
потенциал действия(ПД)) и гигантскими размерами. ПД у харовых водорослей на несколько порядков медленнее, чем ПД у животных клеток. Можно сказать, что харовые водросли - это растительный аналог аксона кальмара, который можно круглый год культивировать в пресноводном аквариуме.
Особенно удобны для электрофизиологических исследований харовые водоросли, у которых нет коры (Chara corallina, Nitellopsis obtusa и более мелкие
предсатвители рода Nitella). Крупные клетки междоузлий представляют
собой многоядерный синцитий, окруженный плазматической мембраной и
клеточной стенкой. Под плазмалеммой находится слой неподвижных хлоропластов, закрепленных на актиновых филаментах. Далее идет слой цитоплазмы, которая находится в непрерывном циклическом движеннии. Движение цитоплазмы замирает только во время ПД, что, возможно, помогает
харовой водоросли справляться с повреждением таллома (хотя физиологическая роль ПД у харовых водорослей во многом остается неизвестной).
Большую часть клетки занимает центральная вакуоль.
Потенциал покоя клеток харовых водорослей составляет порядка –200–
300 мВ, и определяется частично равновесным калиевым потенциалом, ча-
2
Рис. 2: Потенциал действия на тонопласте и плазмалемме харовой водоросли Chara corallina полученные методом фиксации тока. Lunevsky с соавт.,
1983.
стично — работой протонных АТФаз.
Гигантские размеры клеток позволяют не только легко вводить внутриклеточный микроэлектрод, но и даже полностью заменять содержимое
клетки на экспериментальный раствор (внутриклеточная перфузия). Это
дало возможность хорошо изучить механизм возникновения ПД у харовых водорослей. При возбуждении открываются кальциевые каналы плазматической мембраны и внутриклеточная концентрация свободного кальция возрастает. Кроме того, кальций освобождается из внириклеточных
депо (). При повышении концентрации кальция в цитоплазме активируются Ca-активируемые анионные каналы, через которые ионы Cl- выходят
из клетки, что приводит к деполяризации мембраны. Деполяризация мембраны открывает потенциал-зависимые калиевые каналы, через которые
K+ выходит из клетки по градиенту концентрации и реполяризует мембрану. Высокая внутриклеточная концентрация кальция поддерживается лишь
на стадии деполяризации, а затем потенциал-зависимые кальциевые каналы закрываются, а ионы кальция закачиваются во внутриклеточные депо
и во внешнюю среду при помощи активного транспорта.
Вакуолярная мембрана харовых водорослей тоже возбудима и генерирует ПД (порядка 20 мВ) с некоторой задержкой относительно плазмалеммы.
0.2
Постановка задачи.
Методом внеклеточного отведения электрических потенциалов исследовать
пассивные и активные электрические свойства мембраны клеток харовой
водоросли Chara corallina.
1. Определить удельное сопротивление мембраны.
2. Определить удельную емкость мембраны.
3. Увеличивая амплитуду тока стимуляции исследовать возникновение
электрического ответа при превышении порогового значения и зависимость
3
Рис. 3:
для электростимуляции и внеклеточного отведения электрических потенциалов от клеток харовых водорослей.
амплитуды ответа от величины стимула.
4. Используя два электростимулятора оценить изменение сопротивления
мембраны во время потенциала действия.
0.3
Описание установки.
Экспериментальная камера состоит из трех отсеков (рис. 1). Для успешного выполнения задачи необходимо уложить клетку харовой водоросли в
камеру таким образом, чтобы стимулирующий ток не мог проходить от стимулирующего электрода (ЭТ) на электрод сравнения (ЭС) снаружи клетки,
а только через клетку. Для этого перед укладкой в камеру клетку нужно
немного подсушить фильтровальной бумагой и проследить, чтобы воздушные отсеки камеры, разделяющие отсеки с электродами, оставались сухими.
Установка
4
Рис. 4: Пассивный электрический ответ клеточной мембраны на 200-мс импульс тока с амплитудой 0.1 мкА.
При этом важно не погубить клетку, что может легко случиться, если она
потеряет тургор. Лучше, если эту деликатную операцию выполнит за вас
преподаватель.
Электрометрический усилитель У1 измеряет разность потенциалов между двумя электродами: ЭС, потенциал которого принимается за ноль (на
схеме этот потенциал имеет специальное обозначение — знак “земли”), и
ЭИ—измерительный электрод. Каждый электрод представляет собой серебряную проволочку, покрытую тонким слоем хлорида серебра. Такой электрод, в отличие от обычной металлической проволочки, не меняет своего
потенциала при прохождении через него небольшого тока, и поэтому называется неполяризующимся электродом (другой пример неполяризующегося
электрода - каломельный электрод). В состоянии покоя разность потенциалов между электродами невелика и определяется самими электродами и
окружающими их растворами электролитов.
При пропускании слабого импульса тока от стимулятора 1 (200 мс, 0.1
мкА: 2.5 В при сопротивлении нагрузочного резистора R1н =22 МОм) мембрана харовой водоросли отвечает пассивно—заряжается и разряжается по
экспоненциальному закону до определенного потенциала ϕm (рис. 2). Быстрый рост потенциала в начале импульса (перед экспоненциальной стадией)
вызван током утечки—небольшая часть тока идет через внеклеточную среду, поскольку клеточная стенка остается влажной и представляет собой
альтернативный путь протекания тока при приложении разности потенциалов между токовым электродом и электродом сравнения.
Ток в цепи стимуляции клетки проходит через нагрузочный резистор,
сопротивление которого на несколько порядков больше сопротивления всего
остального участка цепи, включающего клетку. Поэтому именно сопротивление Rн определяет ток в цепи, а сопротивлением клетки можно пренебречь. Ток стимуляции не зависит от сопротивления клетки и определяется
5
Рис. 5: Эквивалентная электрическая схема установки для измерения пассивных свойств биологических мембран.
только величиной Rн и установленной амплитудой стимула. Значит, по закону Ома, можно определить сопротивление клеточной мембраны, через
которую протекает ток от стимулятора 1: R = ϕm /I. В узком (0.2 см)
центральном отсеке ток выходит из клетки через мембрану и зависит от
площади мембраны (площадь поверхности цилиндрической клетки определяется диаметром d клетки и шириной камеры l: S = πdl. Тогда удельное
сопротивление клетки определяется по формуле Rm = RS [кОм см2 ].
Для того, чтобы определить емкость мембраны, рассмотрим эквивалентную схему установки (рис. 3). С точти зрения электросхемотехники,
мембрана представляет собой параллельно соединеные конденсатор (с емкостью Cm ) и резистор (с сопротивлением Rm ). Действительно, липидный
бислой представляет собой тонкий слой диэлектрика между двумя проводящими пластинами, которые в нашем случае представлены внутри- и внеклеточной средами. Ионные каналы и другие транспортные системы мембраны создают проводимость мембраны. В покое сопротивление клеточной
мембраны почти не меняется, и поэтому на схеме проводимость мембраны
обозначена как постоянный резистор Rm .
Суммарный ток, который создает стимулятор, складывается из емкостного тока и тока проводимости мембраны I = IR + IC . Ток проводимости
описывается законом Ома, а емкостной ток пропорционален скорости изменения потенциала на мембране:
ϕm
ϕm
E
=
+ Cm
Rm
Rm
dt
Допустим, в начальный момент времени (сразу после замыкания ключа) потенциал мембраны равен нулю (t = 0, ϕm = 0), что равносильно тому,
что мы не интересуемся потенциалом покоя, а рассматриваем лишь изменения мембранного потенциала от уровня потенциала покоя, который условно
принимаем за нулевой уровень. Через достаточно долгий промежуток времени мембрана зарядится до максимального значения (t = ∞, ϕm = ϕmax ).
Решением уравнения для зарядки мембранной емкости будет является экспоненциальная функция.
−t
ϕm = ϕmax (1 − e Rm Cm )
Скорость зарядки мембранной емкости определяется параметром τ = Rm Cm ,
который называется постоянной времени мембраны. Определить постоянную времени мембраны можно по кривой зарядки мембранной емкости.
Чтобы узнать, какому значению потенциала ϕm соответствует время τ ,
нужно в уравнение зарядки мембранной подставить t = Rm Cm . Мембрана зарядится до 63% от максимального уровня за время τ . Зная Rm легко
получить Cm .
6
Стимулятор 2, как и стимулятор 1, подключен к токовому электроду
ЭТ. Ток обоих стимуляторов суммируется и протекает от токового электрода ЭТ через клетку к электроду сравнения ЭС. В отличии от стимулятора 1, на стимуляторе 2 установлено приблизительно на порядок большая
амплитуда стимула, и сопротивлении нагрузочного резистора R2н =30 МОм
(надпороговый ток составляет приблизительно 0.5–1 мкА). Таким образом,
при запуске стимулятора 2 пороговое значение возбуждения может быть
превышено и клетка отвечает активно—генерирует потенциал действия.
Возможно запустить стимулятор 1 в режиме непрерывной генерации последовательности малых подпороговых импульсов (в каждый момент срабатывания такого тестирующего импульса можно определить сопротивление
мембраны по закону Ома). Поскольку ток тестирующих импульсов не зависит от сопротивления клетки, по величине отклонения потенциала ∆ϕm
можно судить о сопротивлении мембраны), и в какой-то момент времени
возбудить мембрану от стимулятора 2. Тогда тестирующие сопротивление
импульсы тока будут периодически отклонять регистрируемый потенциал
на фоне развивающегося потенциала действия.
0.4
Экспериментальная часть.
В этой работе компьютер запускает стимуляторы 1 и 2 и регистрирует сигнал с усилителя У1. ПрограммаWinWCP, управляющая работой установки,
написана Джоном Демпстером (University of Strathclyde, Шотландия) и доступна для некоммерческого использования.
0.4.0.1
Определение коэффициента усиления У1.
Первое, что нужно сделать после запуска программы WinWCP—создать рабочий файл в директории Students на рабочем столе. Файл должен иметь
разумное название, например, дата выполнения работы и ваш рабочий но-
мер файла ddmmyear_001.
После этого нужно проверить установки программы: Setup→Recording
7
Sweep→A/D Converter Voltage Range.
Аналогоцифровой преобразователь, который переводит сигнал от усилителя У1
цифровую форму, имеет встроенный усилитель, коэффициент усиления которого можно менять программно (A/D Converter Voltage Range) Для измерения сопротивления и емкости мембраны нужно выбрать коэффициент
усиления ±1 В, для записи ПД нужно загрубить чувствительность усилителя до ±5 В.
Для выполнения экспериментов Вам нужно открыть окно записи сигнала на диск (Record→Record to Disk). Большая кнопка Record предназначена
для запуска эксперимента. Эксперимент будет записан в файл, если установлена галочка Save to file. Каждый эксперимент, записанный в файл, имеет свой порядковый номер. Вы должны в своем журнале снабжать каждый
эксперимент (запись в файле) подробными описаниями условий: протокол
стимуляции, параметры стимуляторов и т.д. Перед запуском эксперимента,
нужно выбрать протокол управления стимуляторами. При выборе Free Run
из трех возможных режимов Trigger Mode, программа не запускает стимуляторы, а лишь записывает сигнал с усилителя У1 в течении времени, указанного в установках программы Setup→Recording Sweep→Record Duration.
Этот режим удобно использовать для определения коэффициента усиления
электрометрического усилителя У1. Для этого нужно установить время записи (Record Duration) порядка 30 с и чувствительность (A/D Converter
Voltage Range) ±1 В. В усилителе У1 предусмотрена возможность калибровки коэффициента усиления. Для этого нужно установить переключатель
калибровочного напряжения в положение 20 мВ (или 12 мВ), запустить программу WinWCP кнопкой Record в режиме Free Run, и на несколько секунд
нажать и удерживать кнопку Калибровка на усилителе У1. Таким образом
Вы сможете записать сигнал известной амплитуды (20 мВ или 12 мВ) в ваш
файл ddmmyear_001. Для определения коэффициента усиления У1 Вам
нужно измерить амплитуду записанного сигнала и поделить ее на 20 мВ
(или 12 мВ). Измерить амплитуду сигнала можно при помощи специальной
измерительной линейки (синяя вертикальная линия, внизу показывающая
текущее значение времени и сигнала. ), которая появляется, если в разделе меню View выбрать просмотр записанных экспериментов Raw Records.
Учтите, что амплитуда сигнала отсчитывается от нулевого уровня, который
8
нужно выставить красной пунктирной линией. Для более точного определения амплитуды сигнала можно выставить вертикальную синюю линию в
нужном месте и, меняя положение красной пунктирной линии определить
амплитуду сигнала как разность показаний в нуле и максимуме калибровочного сигнала. Проверьте, меняется ли расчетный коэффициент усиления
У1, если Вы измените чувствительность усилителя АЦП (±1 В и ±5 В).
0.4.0.2
Определение сопротивления и емкости клеточной мембраны.
Создайте второй файл ddmmyear_002 для определения сопротивления и
емкости мембраны. Чтобы определить пассивные свойства возбудимой мембраны, необходимо подать подпороговый стимул тока и зарегистрировать
кривую зарядки мембранной емкости с достаточно хорошим разрешением.
Для этого потребуется в программе WinWCP запустить стимулятор 1 (200
мс, 2.5 В). Это можно сделать, если выбрать режим Stimulus Protocol, и из
доступных протоколов выбрать capacity_tst.
Чувствительность усилителя АЦП нужно установить ±1В. Протокол стимуляции capacity_tst последовательно запишет несколько сигналов в файл.
Пассивный ответ клетки на подпороговый импульс тока содержит паразитную наводку (поскольку экспериментальная камера не экранирована от
внешних электромагнитных помех), которую можно уменьшить усреднением нескольких записей. Перед усреднением, нужно просмотреть все записи
в режиме наложения сигнала (View→Superimpose Traces). Если какие-то записи не подходят для усреднения, нужно для них отметить галочкой пункт
Rejected (отбросить), а затем в меню редактирования удалить отвергнутые
записи Edit→Remove Rejected. Затем в разделе меню “Анализ” нужно вы-
9
брать “Усреднение сигнала” (Analysis→Signal Averaging). По усредненной
записи нужно определить значение ϕmax и скорректировать его на рассчитанный Вами коэффициент усиления У1. Поделив полученное значение на
величину тока стимуляции, Вы получите сопротивление мембраны клетки
в центральном отсеке камеры. Приводить это значение в отчете преждевременно, потому что сопротивление мембраны зависит от ее площади. Нужно
умножить (если бы Вы считали проводимость, то нужно было бы поделить)
полученное значение сопротивления на площадь поверхности мембраны.
Размерность получившейся величины [кОм см2 ].
Для определения мембранной емкости нужно определить постоянную
времени зарядки мембраны. Для этого можно воспользоваться грубым графическим методом и найти время, за которое сигнал достигает 63% от
максимального значения. Точнее определить τ можно, если аппроксимировать экспериментальную кривую экспоненциальным уравнением. Для этого
нужно войти в меню фитирования экспериментальных данных (Analysis→Curve
Fitting).
Сначала нужно выбрать область экспериментальных данных, которую
вы хотите аппроксимировать экспоненциальной функцией. По умолчанию
границы (вертикальные синие линии, вертикальная зеленая линия задает t = 0 для уравнения экспоненты) установлены в начале и конце записи.
Левую границу нужно расположить сразу за быстрым скачком потенциала,
обусловленным сопротивлением утечки, там, где сигнал начинает нарастать
по экспоненциальному закону. Правую границу нужно установить перед
выключением импульса тока (это стационарный уровень ϕmax ). В разделе
Analyse, под кнопкой “Do Fit” нужно выбрать экспоненциальное уравнение
Exponential и запустить фитирование кнопкой “Do Fit”. Красаная экспонента, наложенная на экспериментальную кривую рассчитана компьютером по
10
Рис. 6: Потенциал действия в клетке харовой водоросли Chara corallina,
вызванный электростимуляцией током ___ мкА/см2 .
уравнению,которое Вы найдете в первой строке окна результатов Results.
Параметры A и tau компьютер подобрал таким образом, чтобы квадрат отклонения расчетной кривой от экспериментальной был минимальным (графически разница между этими двумя кривыми показана на нижнем графике). По значению постоянной времени рассчитайте емкость мембраны.
Проверьте единицы измерения [Ф=Кл/В], емкость мембраны должна быть
в пределах 0.5–1.5 мкФ/см2 .
0.4.0.3
Исследование возбудимости клетки харовой водоросли.
Зарегистрировать ПД при элестростимуляции.
Создайте еще один файл ddmmyear_003 для записи ПД. Чувствительность усилителя АЦП нужно установить ±5В. Для возбуждения клетки на
Стимуляторе 2 установите амплитуду 20 В и длительность 100 мс. Стимулятор 2 запускается при выборе протокола AP_1 в области Stimulus protocol.
Запишите амплитуду, установленную на стимуляторе в ваш журнал (ей будет соответствовать в файле запись номер 1), рассчитайте ток, протекающий через мембрану [мкА/см2 ]. Если клетка возбудится, вы увидете однофазный или двухфазный ПД (рис. )
Уменьшая амплитуду стимула на Стимуляторе 2 (и соблюдая достаточно большие (порядка нескольких минут) интервалы между запуском последовательных импульсов) проверьте, как ведет себя амплитуда ПД. Дей-
11
ствительно ли наблюдаемое явление носит пороговый характер?
Подробно опишите в тетради проведенные опыты, оцените значеня сопротивления и емкости мембраны харовой водоросди Chara corallina, опишите ответ клетки при электростимуляции (амплитуда, длительность ПД),
сравните его с известным ответом нервных и мышечных клеток животных,
и напишите подробные выводы из проведенных опытов. Выводы не должны
повторять описание эксперимента, а должны обощать достоверную информацию о изучаемом объекте или явлении, полученную в результате проведенных экспериментов. Выводы должны непосредственно следовать из полученных экспериментальных данных. Постарайтесь сделать максимально
болшое количество обоснованных выводов из Ваших опытов, пусть даже
они покажутся тривиальными. Главное - выводы должны следовать из ваших экспериментов! Дополнительные сведения (известные Вам, к примеру,
из научных публикаций или учебников), связанные с изучаемым явлением,
но не следующие из проведенных опытов, можно привести в дополнительном разделе “Обсуждение полученных результатов”, но не в Выводах.
0.5
Контрольные вопросы
1. Что такое мембранный потенциал и чем он определяется?
2. Дайте опеделение потенциалу действия и опишите его свойтсва. Какие
клетки животных и растений обладают ПД. Зачем нужен ПД животным и
растениям?
3. Вспомните, что такое конденсатор, чем определяется и в каких единицах выражатся его емкость. Напишите и решите дифференциальное уровнение для разрядки конденсатора. Через какое время потенциал на обкладках
конденсатора уменьшится на 99%, если к конденсатору емкостью C подключена нагрузка R?
4. Почему клеточную мембрану биофизики моделируют как комбинацию конденсатора и резистора? На какие параметры ПД влияет емкость
мембраны и ее сопротивление?
5. Как можно экспериментально выяснить, какие ионные токи каналы
(калиевые, кальциевые, натриевые, хлорные...) отвечают за регистрируемые в ходе ПД токи? В чем преимущества и недостатки методов внеклеточного отведения и других методов (фиксации потенциала, пэтч-клямп)?
6. Как Вы думаете, для чего харовой водоросли нужен потенциал действия?