Расширенная аннотация проекта. «Микробные фитазы как

Расширенная аннотация проекта.
1. Полное наименование проекта (в соответствии с госконтрактом или
соглашением)
«Микробные
фитазы
как
основа
новой
эффективной
биотехнологии растений»
2. Наименование
программы:
Федеральная
целевая
программа
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России
на 2009-2013 годы».
3. Наименование мероприятия Программы
Мероприятие 1.5. Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных
исследователей
4. Научный руководитель
Шакиров Евгений Витальевич
5. Ответственный исполнитель
Тойменцева Анна Александровна
6. Описание ожидаемых (полученных) результатов с указанием
конкретных планируемых характеристик и параметров объектов
исследования или разработки (1-2 страницы).
Недоступность почвенных фитатов для роста растений, загрязнение
окружающей
среды
избытком
органических
фосфорных
соединений – лишь некоторые, проблемы которые подчеркивают
необходимость поиска новых путей развития сельского хозяйства.
В частности, перед современной биотехнологической наукой стоит
важная задача – научиться создавать генно-инженерным путём
сорта сельскохозяйственных растений, способных секретировать
высоко-специфичные фитазы в ризосферу корней и, таким образом,
использовать почвенные фитаты в качестве дополнительного
источника фосфора.
Цель выполняемого научно-исследовательского проекта разработать эффективную технологию получения трансгенных
растений на основе гена фитазы бацилл для улучшения роста и
урожайности сельскохозяйственных растений, культивируемых на
фитат-содержащих почвах.
В ходе выполнения этапа №1 работы проведено клонирование и
секвенирование гена фитазы Bacillus ginsengihumi (phyCg). Продукт
амплификации гена phyCg был клонирован в his-tag-вектор pET-46
Ek/LIC. Создана и отработана методика экспрессии гена фитазы B.
ginsengihumi в модельном штамме E. coli Rosseta с частично
делетироваными протеазами. Рекомбинантный фермент фитазы
(PhyCg) выделен и очищен с помощью аффинной и ионообменной
хроматографии. Последовательность гомогенного белка определена
методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии и составляет 384
аминокислотных остатков. Определены физико-химические
свойства фермента - оптимальное значением рН для проявления
фитазной активности и температурный оптимум.
Далее была создана химерная конструкция из гена фитазы phyCg и
сигнальной
последовательности
гена
экстенсина
AtExt3,
находящиеся в одной рамке считывания. Получившаяся
конструкция методом молекулярного клонирования помещена под
контроль промотера Pht1;2, и затем введена в состав бинарной
плазмиды pCBK05. По данным литературы, использование Pht1;2
промотора и сигнальной последовательности белка экстенсина
позволит полностью исключить потенциально негативное влияние
фитазы phyCg на метаболизм и развитие семян трансгенных
растений путем экспрессии рекомбинантного белка только в
клетках эпидермиса корней и его последующей секреции в
корневую ризосферу. Плазмида pCBK05 способна реплицироваться
в клетках грамотрицательных бактерий Escherichia coli и
грамположительных бактерий Agrobacterium tumefaciens.
На следующем этапе плазмида содержащая химерную конструкцию
будет перенесена в бактерии Agrobacterium tumefaciens, а затем в
клетки растений Arabidopsis thaliana. Будет проведено
исследование активности бактериальной фитазы в трансгенных
растениях, определено влияния фитазы phyCg на морфологию и
развитие растений. Также будет определена устойчивость
трансформированных растений к гербициду BASTA, исследована
активность секретируемой фитазы по расщеплению фитатов до
неорганического фосфата.
Таким образом, особенностью предлагаемой нами биотехнологии
является целевая экспрессия гена бациллярной фитазы в корнях
растений и её секреция в ризосферу. Мы предполагаем, что
успешное выполнение поставленной задачи позволит решить
многие актуальные проблемы, стоящие сегодня на пути
эффективного использования микробных фитаз для улучшения
роста
и
урожайности
сельскохозяйственных
растений,
выращиваемых на обедненных фосфором почвах.
7. Библиографическое
описание
публикации
по
проекту
и
гиперссылки на публикации на персональных страницах.
1. Валеева Л.Р. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana,
несущих ген внеклеточной фитазы phyCg из почвенной бактерии Bacillus
ginsengihumi, [Тезисы докладов] / Л.Р. Валеева, Ч. Нямсурэн // XIX-ая
Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых
«ЛОМОНОСОВ 2013», 8-13 апреля 2013 г., -С. 81-82.
2. Нямсурэн Ч. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana,
секретирующих микробную фитазу PhyCg Bacillus ginsengihumi, [Тезисы
докладов] / Ч. Нямсурэн, Л.Р. Валеева, А.И. Ахметова, А.Д. Сулейманова,
Н.П. Балабан, Е.В. Шакиров, М.Р. Шарипова // XIII-ая Молодежная научная
конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и
ветеринарии», 10 апреля 2013 г., -С. 39-40.
3. Валеева Л.Р. Получение растений Arabidopsis thaliana с интегрированным
геном микробной фитазы, [Тезисы докладов] / Л.Р. Валеева, Ч. Нямсурэн,
Е.В. Шакиров, М.Р. Шарипова // Х-ая международная конференция
«Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 14-18 октября 2013 г. В
ПЕЧАТИ.
4. Нямсурэн Ч. Гетерологичная система экспрессии генов на основе гена
фитазы бацилл, [Тезисы докладов] / Ч. Нямсурэн, Л.Р. Валеева, А.И.
Ахметова, А.Д. Сулейманова, Н.П. Балабан, Е.В. Шакиров, М.Р. Шарипова //
17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых
«БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА», Пущино 21–26 апреля 2013 г. –С. 358359.
5. Нямсурэн Ч. Гетерологичная система экспрессии генов в растениях на
основе гена бациллярной фитазы, [Тезисы докладов] / Ч. Нямсурэн, Л.Р.
Валеева, А.И. Ахметова, А.Д.Сулейманова, Н.П. Балабан, Е.В. Шакиров, М.Р.
Шарипова // Всероссийская научная конференция с международным
участием «ИННОВАЦИОННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ СОВРЕМЕННОЙ
ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ», Москва 2-6 июня 2013 г. –С. 212-213.
6. Нямсурэн Ч. Получение трансгенных растений Аrabidopsis thaliana с
интегрированным геном бациллярной фитазы / Ч. Нямсурэн, Л.Р. Валеева,
А.И. Ахметова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров // Физиология
растений, выпуск с материалами конференции «Биология клеток растений in
vitro и биотехнология» НА РЕЦЕНЗИИ.