Аннотация работы - Институт биоорганической химии

Аннотация работы представляемой на
«конкурс 2010 года на соискание медалей РАН с премиями для молодых
учёных и студентов высших учебных заведений России».
РЕГУЛЯЦИЯ ОПЕРОНА rpsB-tsf, КОДИРУЮЩЕГО РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК
S2 И ФАКТОР ЭЛОНГАЦИИ Ts У ГАММА-ПРОТЕОБАКТЕРИЙ
Асеев Леонид Викторович
Направление конкурса: 9. физико-химическая биология
Аутогенная регуляция синтеза рибосомных белков (р-белков) – необходимое условие
поддержания эквимолярности синтеза рибосомных компонентов у бактерий. Молекулярные
механизмы аутогенного контроля исследованы для многих рибосомных оперонов, однако
оперон rpsB-tsf, кодирующий жизненно важные компоненты трансляционного аппарата – рбелок S2 и фактор элонгации Ts, никогда не исследовался и даже его промотор не был
локализован. Цель работы - изучение особенностей регуляции оперона rpsB-tsf у Escherichia
coli и родственных бактерий в сравнении с известными моделями регуляции других
рибосомных оперонов. В работе получены следующие принципиально новые результаты.
Впервые локализован промотор оперона и показана его консервативность в -подклассе
протеобактерий. Для идентификации промотора картированы 5’-концы rpsB-транскриптов
методом удлинения праймера на тотальной клеточной РНК. Обнаружен единственный
сигнал, соответствующий позиции -162 (относительно А в стартовом кодоне AUG rpsBмРНК). Анализ последовательности перед локализованным транскрипционным стартом
позволил предположить, что транскрипция оперона направляется единственным промотором
TGTGGTATAAA, принадлежащим к редкому классу «удлиненных» -10 промоторов, что
подтверждено мутационным анализом. Удлиненный -10 элемент отделен от старта
транскрипции так наз. дискриминатором GCGCGC, типичным для промоторов стабильных
РНК, негативно регулируемых алармоном ppGpp при аминокислотном голодании, но редким
для промоторов белковых оперонов. Получены данные, что GC-богатый дискриминатор
отвечает за негативную регуляцию rpsB-промотора при увеличении уровня ppGpp в клетке.
Филогенетический анализ выявил высокую консервативность строения промоторной области
оперона rpsB-tsf (сочетание удлиненного -10-элемента и GC-богатого дискриминатора) у протеобактерий. Консервативность промотора rpsB у γ-протеобактерий подтверждена
экспериментально: экспериментах in vivo показано, что экзогенные промоторы из Y.pestis,
H.influenzae и P.aeruginosa активны в транскрипции химерных генов rpsB-lacZ в E.coli.
Впервые показано, что р-белок S2 служит негативным регулятором экспрессии оперона
rpsB-tsf на пост-транскрипционном уровне. Оперон rpsB-tsf априори не подчиняется
классической схеме аутогенной регуляции р-белков, согласно которой один из продуктов
оперона является не только структурным компонентом рибосомы, напрямую
взаимодействующим с рРНК на первых этапах сборки субчастиц, но и негативным
регулятором, способным подавлять трансляцию своей мРНК, если его количество в клетке
превышает уровень рРНК. Однако S2 не узнает свободную рРНК и включается в состав 30S
субчастиц на завершающем этапе сборки, поэтому как потенциальный белок-репрессор он
априори представлял исключение из общего правила. Для исследования возможности
аутогенного контроля экспрессии оперона in vivo созданы специализированные штаммы, в
которых синтез β-галактозидазы с хромосомного lacZ-гена направляется областью
инициации трансляции rpsB-мРНК, включающей 5’-нетранслируемую область (5’-НТО)
различной длины (как природную длиной 162 н.о., так и укороченные варианты), а также
плазмида, экспрессирующая S2 с rpsB-промотора. Cинтез S2 с плазмиды специфически
подавлял экспрессию rpsB-lacZ-репортера, если длина 5’-НТО не менее 120 н.о., что прямо
доказывает функцию S2 как аутогенного репрессора. Показана консервативность фолдинга
5’-НТО у разных представителей -протеобактерий: в каждом случае две протяженные
шпилечные структуры LH и RH разделены слабоструктурированной центральной областью
CR. Более того, некоторые участки последовательности 5’-НТО оказались универсально
консервативными, что предполагает их важную роль в регуляции экспрессии.
Филогенетические предсказания подтверждены экспериментально. Оказалось, что при
делециях универсально-консервативных участков 5’-НТО в репортерных конструкциях rpsBlacZ нарушается аутогенная регуляция. Полученные данные указывают на высокую
консервативность механизма регуляции оперона rpsB-tsf в эволюции протеобактерий.
С помощью Вестерн- и Нозерн-блоттинга исследован механизм регуляции экспрессии
второго гена оперона, tsf, который не имеет собственного промотора и транскрибируется как
часть бицистронного транскрипта. Показано, что прямое ингибирование трансляции rpsBгена белком S2 оказывает полярный эффект на транскрипцию второго цистрона (и как
следствие на уровень синтеза фактора Ts) в результате нарушения транскрипционнотрансляционного сопряжения в пределах rpsB-гена.
Показано, что для аутогенной регуляции своего оперона белку S2 требуется помощник,
р-белок S1. Оказалось, что нарушение аутогенного контроля происходит не только в rpsB-
мутантах (нарушение регуляции в мутантах по гену, кодирующему белок-регулятор,
типично для оперонов р-белков), но и в мутанте по гену белка S1 (rpsA::IS10) с низким
уровнем синтеза укороченного варианта белка. Зависимость от уровня синтеза р-белка,
кодируемого в другом опероне, предполагает, что в регуляции может участвовать комплекс
р-белков S1-S2. Образование такого комплекса доказано с помощью иммунопреципитации.
Таким образом выявлено принципиальное отличие механизма аутоконтроля оперона rpsB-tsf
от известных моделей регуляции других оперонов р-белков, где белку-репрессору не
требуется помощник.
Список научных статей, опубликованных в ходе выполнения представляемой
работы.
1. Асеев Л.В., Левандовская А.А., Скапцова Н.В., Бони И.В. 2009. Консервативность
регуляторных элементов, контролирующих экспрессию rpsB-tsf оперона у гаммапротеобактерий. Молекулярная биология, 43(1): 111-118.
2. Leonid V. Aseev, Alexandrina A. Levandovskaya, Ludmila S. Tchufistova, Nadezda V.
Scaptzova, and Irina V. Boni. 2008. A new regulatory circuit in ribosomal protein operons: S2mediated control of the rpsB-tsf expression in vivo. RNA, 14(9): 1882-1894.
Автобиография Асеева Леонида Викторовича
Я, Асеев Леонид Викторович родился 03 мая 1984 года в г. Москва. В 2001 году поступил на
биологический факультет Московского государственного университета им. М.В.
Ломоносова, обучался на кафедре биоорганической химии. Сделал курсовую, а затем
дипломную работу в лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН под
руководством Бони И.В. В2006 году закончил МГУ и получил квалификацию «биохимик» по
специальности «биохимия». С 2006 по 2009 г. обучался в аспирантуре института
биоорганической химии РАН. В настоящее время работаю младшим научным сотрудником
лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
Публикаций в научных журналах:
1. Комарова А.В., Чуфистова Л.С., Асеев Л.В., Бони И.В. 2005 Штамм Escherichia coli,
продуцирующий безлидерную мРНК с хромосомного lac-промотора. Биоорганическая
химия. 31, №5, 557-560.
2. Асеев Л.В., Левандовская А.А., Скапцова Н.В., Бони И.В. 2009. Консервативность
регуляторных элементов, контролирующих экспрессию rpsB-tsf оперона у гаммапротеобактерий. Молекулярная биология, 43(1): 111-118.
3. Leonid V. Aseev, Alexandrina A. Levandovskaya, Ludmila S. Tchufistova, Nadezda V.
Scaptzova, and Irina V. Boni. 2008. A new regulatory circuit in ribosomal protein operons: S2mediated control of the rpsB-tsf expression in vivo. RNA, 14(9): 1882-1894.
Тезисы конференций:
1. Асеев Л.В. Исследование аутогенного контроля экспрессии оперона rpsB-tsf Escherichia
coli: идентификация регуляторной области. Тезисы докладов XIII Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006", секция Биология,
12-15 апреля 2006, МГУ, с. 16-17.
2. Бони И.В., Чуфистова (Калединская) Л.С., Асеев Л.В. Регуляция синтеза рибосомных
белков. Тезисы докладов VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова.
25-27 окт. 2006, ИБХ РАН, с. 24.
3. Асеев Л.В., Левандовская А.А., Скапцова Н.В., Бони И.В. Регуляция оперона rpsB-tsf,
кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts. Тезисы докладов IV
Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск 11-15
мая 2008 г., с. 90.
4. Асеев Л. Консервативность регуляторных элементов, контролирующих экспрессию
оперона rpsB-tsf у гамма-протеобактерий. Тезисы докладов международной конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов – 2008», секция Биология 8-11 апреля
2008, МГУ, с. 144-145.
5. Асеев Л.В., Левандовская А.А., Бони И.В. Аутогенная регуляция оперона rpsB-tsf,
кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts. Тезисы докладов
XXI зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической
биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009, ИБХ РАН, с.13.
6. Асеев Л.В., Бони И.В. Регуляция оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и
фактор элонгации Ts. Тезисы докладов международной научной конференции по
биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со
дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчиннокова. 28 сентября – 1 октября 2009,
ИБХ РАН, том 2, с 14-15.
7. Aseev L.V., Boni I.V. Autogenous regulation of the rpsB-tsf operon of Escherichia coli.
Abstracts of VII International conference Ribosome synthesis-2006, Airlie Conference centre,
Virginia, USA, p. 58.
8. Leonid V. Aseev, Ludmila S. Tchufistova and Irina V. Boni. A new regulatory circuit in
ribosomal protein operons: S2-mediated control of rpsB-tsf expression. Abstracts of International
Conference “Ribosomes 2007”, Sea Crest Resort, Cape Cod, MA USA, June 3-8, p.33.
9. L.V. Aseev, N.V. Scaptzova, and I.V. Boni. Conservation of the regulatory elements that control
expression of the rpsB-tsf operon in gamma-proteobacteria. Book of Abstracts, II International
Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. 28 November-1 December
2007, Seville, Spain, page 538. http://www.formatex.org/biomicroworld2007.
10. Aseev L.V., Levandovskaya A.A., Skaptsova N.V., Boni I.V. Dissection of the Escherichia coli
rpsB promoter: in vivo analysis of activity and stringent response. Book of Abstracts, III
International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. 2 – 4 December
2009, Lisbon, Portugal, page 580.