Таблица 12.
реклама
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им.Будкера Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Новосибирск - 2011 г. УДК: 636.619 Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов/ Россельхозакадемия. ГНУ ИЭВСиДВ, РАН. Сибирское отделение ИХБФМ, ИЯФ, НГУ -Новосибирск, 2011. - 63 с. Современные методы выявления, идентификации сальмонелл, мониторинга сальмонеллезной инфекции позволяют существенно изменить эпизоотическую и эпидемическую ситуацию. В данных методических рекомендациях дан обзор современных методов исследования сальмонелл и контроля эпизоотического процесса при сальмонеллезах Данные рекомендации рассчитаны на сотрудников НИУ и специалистов по лабораторной диагностике. Методические рекомендации подготовили: канд. биол. наук В.Н. Афонюшкин, Сподырева Т.В., канд. вет. наук Ю.Г. Юшков, к.в.н. Коптев В.Ю. (ГНУ ИЭВСиДВ), канд. биол. наук Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Дударева Е.В.(ИХБФМ СО РАН) А. Дудников ИЯФ (СО РАН), Аркова О.В., Шмаков Н.А. НГУ, канд. вет. наук В.Т.Вольф (НГАУ) Рекомендации рассмотрены и утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (протокол № от 2011 г. ) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № от 2011 г.). Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАН №16 Рецензент: д-р вет. наук Лопатин С.В. 2 Содержание: Введение 1. Таксономия сальмонелл 2.Определение антигенной структуры 2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов. 2.2Антигенспецифичная ПЦР 3 Определение факторов патогенности и антибиотикорезистентности 3.1 Структурная организация факторов патогенности в геноме сальмонелл 3.2 Выявление гена SpvC 3.3 Гены Rck и PagC 3.4 Тестирование на наличие генов устойчивости к аминогликозидам StrA и StrB 3.5 Нитроцефиновый тест 4.Флюориметрические методы исследований сальмонелл для исследования фагоцитоза 5. Определение антибиотикорезистентности в микропланшетном формате 6. Молекулярная эпизоотология 6.1 VNTR типрирование 6.2 Дискриминация штаммов и изолятов с использованием метода PFGE 6.3 ПЦР мониторинг для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий 7.Методические подходы, для контроля сальмонеллезов, на птицефабрике 8. Бактериологические методы изоляции возбудителя 9. Серологический мониторинг сальмонеллоносительства 10.Методические подходы к снижению реинфекции и рецидивирования сальмонеллоносительства 11.Эпизоотологические методы борьбы с антибиотикорезистентностью 12.Повышение эффективности антибиотикотерапии 13. Постантибиотические дисбактериозы как фактор реинфицирования. 14.Изучение радиорезистентности сальмонелл 15. Фаготипирование изолятов сальмонелл Заключение Литература 3 Стр. 4 5 5 6 7 8 8 9 14 15 16 18 21 26 26 27 29 35 38 41 43 44 45 46 47 52 Введение: Вид Salmonella enterica включает в себя более 2500 сероваров, характеризующихся различной устойчивостью к антибиотикам, гостальной специфичностью, токсичностью, патогенностью, вирулентностью, природными резервуарами и т.д. В то же время идентификация серовара только иммунохимическими методами не представляется достаточно адекватной, т. к. патогенность внутри отдельного серовара сальмонелл может варьировать благодаря наличию плазмид, мутаций и рекомбинации в хромосомной ДНК. Изменение антигенной структуры сальмонелл может происходить за счет незначительных генетических изменений в относительно небольшом числе генов, и, соответственно, иммунохимические методы типирования не в полной мере отражают генетическую изменчивость того или иного изолята сальмонелл. Целью исследования было усовершенствовать систему изоляции и типирования сальмонелл при мониторинге сальмонеллоноситества для свинокомплексов и птицефабрик. 1. Таксономия сальмонелл Все серовары сальмонелл относятся к двум видам: S. bongori и S. enterica. Последний разделяется на 5 подвидов, обозначаемых собственными именами и цифрами: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) и indica (V). Для человека патогенны первые два подвида, причем подвид enterica (I) включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров микроба (1400 из 2500). В этиологии внекишечного сальмонеллеза основную роль играют S. typhimurium (34%) и S. enteritidis (21%). Далее следуют следующие серовары: S. panama (6%). S. choleraesuis (5%) и S.virchow (5%). На долю остальных приходится 29% [1, 2]. Смертность при внекишечных формах сальмонеллеза у человека варьирует от 7% для инфекций костно-суставной системы до 60-80% для инфекций дыхательной системы и ЦНС [3]. 4 2. Определение антигенной структуры 2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов. Сальмонеллы серогрупп А, B, D характеризуются иммунодоминантными антигенами имеющими в своем составе паратозу, абеквозу и тивелозу. Наличие гена rfbJ абеквоза синтаза, обеспечивает синтез О антигена на основа GDP-абеквозы а ген rfbS паратоза-синтаза необходим для синтеза О антигенов групп B и D дальнейшая конверсия GDP паратозы с использованием продукта гена rfbE GDP-тивелоза-эпимераза конвертирующая паратозу в тивелозу необходимую для синтеза О антигена группы D (рисунок 1). Рис1. Финальные этапы путей синтеза углеводных единиц полисахаридных О-антигенов сальмонелл различных серогрупп абеквозы, паратозы и тивелозы. 5 Рис. 2 (A) Структуры О- антигенов S. enterica групп B, D1, D1 соответствующих фаготипам P27, D2, D3, and E1. Абревиатуры: Abe, абеквоза; Gal, галактоза; Man, манноза; Rha, рамноза; Tyv, тивелоза. . (B) Представлен эпитоп O антигена S. enterica серовара Zuerich группы D3.Утолщенная линия окружающая олигосахаридную единицу символизирует значимость углевода в структуре эпитопа, тонкая линия отмечает важные сахара в комбинации, прерывистая линия отмечает дополнительные углеводы, которые могут легко утрачиваться в процессе экспрессии эпитопов (modified after Nghiem et al. [28]). О – единицы S. enteric группы D2 (O9,46) отличаются от группы D1 (O9,12) мономерными комбинациями остатков маннозы(reviewed by Kauffmann), галактозил-маннозная связь при полимеризации О антигена у сальмонелл группы D1 формируется в положениях 1 – 2, а у группы D2 [7.] в 6 положении 1-6 О - единица S. enterica E1 (O3,10) имеет такую же олигосахаридную единицу как у группы D2, но без тивелозы [9]. Гены обеспечивающие синтез О антигенов локализуются совместно в хромосоме в составе генного кластера rfb[4]. Гены кодирующие синтез сахаров и трансферразы необходимы для синтеза повторяющихся олигосахарилдных единиц О антигена. Ген именуемый wzx (ранее rfbX) кодирует протеин входящий в состав 12 потенциальных трансмембранных сегментов, найден во всех кластерах генов О-антигена сальмонелл . Wzx – протеины из различных О антигенных кластеров обладают структурной гомологией но имеют незначительное сходство по аминокислотному составу [6]. Предполагается, что Wxz обеспечивает перенос из цитоплазмы на периплазматическую зону цитоплазматической мембраны. Жгутиковые антигены H1 и H2 (фаза 1 и 2) кодируются генами fliC и fljB соответственно. Как правило, эти гены локализуются на разных участках хромосомы, но только один из генов экспрессируется клетками благодаря механизму регуляции оперона fljBA[5]. 2.2 Антигенспецифичная ПЦР Подробный анализ структуры антигенов сальмонелл и генов ответственных за синтез антигенов, сделал возможныпм создание ПЦР тестов для определения серотипов сальмонелл. В таблице 1 приведены структуры праймеров и примеры тестов для определения серотипа сальмонелл метобом ПЦР [10]. Таблица 1. Структруы праймеров и размеры ампликонов для определение серотипов сальмонелл методом ПЦР. Ген Нуклеотидная последовательность Ампликон п.н. O-antigen multiplex abe1 (B) F: GGCTTCCGGCTTTATTGG 561 R: TCTCTTATCTGTTCGCCTGTTG wbaD-manC (C1) F: ATTTGCCCAGTTCGGTTTG R: CCATAACCGACTTCCATTTCC 7 341 Ген Нуклеотидная последовательность Ампликон п.н. abe2 (C2) F: CGTCCTATAACCGAGCCAAC 397 R: CTGCTTTATCCCTCTCACCG prt (A/D1) F: ATGGGAGCGTTTGGGTTC 624 R: CGCCTCTCCACTACCAACTTC wzx – wzy (E1) F: GATAGCAACGTTCGGAAATTC 281 R: CCCAATAGCAATAAACCAAGC H1-1 multiplex fliC (i) F: AACGAAATCAACAACAACCTGC 508 R: TAGCCATCTTTACCAGTTCCC fliC (g,m) F: GCAGCAGCACCGGATAAAG 309 R: CATTAACATCCGTCGCGCTAG H1-2 multiplex fliC (r) F: CCTGCTATTACTGGTGATC 169 R: GTTGAAGGGAAGCCAGCAG fliC (z10) F: GCACTGGCGTTACTCAATCTC 363 R: GCATCAGCAATACCACTCGC H2 multiplex fljB (I: 1,2; 1,5; 1,6; 1,7) F: AGAAAGCGTATGATGTGAAA 294 R: ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC fljB (II: e,n,x; e,n,z15) F: TAACTGGCGATACATTGACTG 152 R: TAGCACCGAATGATACAGCC 3. Определение факторов патогенности и антибиотикорезистентности 3.1 структурная организация факторов патогенности в геноме сальмонелл Одним из факторов патогенности преимущественно нетифоидных сальмонелл является Spv оперон содержащий гены патогенности SpvA, SpvB, SpvC и регуляторный ген SpvR [11, 12]. Продукты экспрессии генов патогенности Spv оперона обеспечивают устойчивость сальмонелл к фагоцитозу путем рибозилирования 8 элемента цитоскелета актина предотвращая тем самым слияние фагосомы с лизосомой у макрофагов [13, 14]. В связи с этим штаммы сальмонелл имеющие Spv оперон с гораздо большей частотой вызывают септические процессы у человека и животных [16, 17], у сельскохозяйственной птицы такие штаммы чаще изолируются из внутренних органов (печень, сердце, органы яйцепродукции). Spv оперон кодируется в различных плазмидах размерами от 60 тыс п.н. до 120 тыс. п.н. хотя большинство этих плазмид серотипоспецифично, однако показана возможность их репродукции у сальмонелл других серотипов. Частота встречаемости плазмид у сальмонелл разных сероваров варьирует, например Typhi, Paratyphi, Hadar, Infantis и большинство экзотических сероваров не содержат плазмид, а среди сероваров Enteritidis, Typhimurium, Dublin, Choleraesuis, Gallinarum, Pullorum and Abortusovis напротив, редко встречаются изоляты не содержащие плазмид. У сальмонелл плазмиды подразделяют с функциональной точки зрения на две группы. В первую группу входят функционально значимые плазмиды это серовароспецифические, ассоциируемые с патогенностью и антибиотикорезистентностю плазмиды размерами от 40000 до 160000 п.н. и плазмиды меньших размеров, функциональное значение которых в реализации патогенного потенциала сальмонелл не доказана [18]. Таблица 2 Факторы вирулентности кодируемые серовар-специфичными плазмидами ген spv rck pef srg A mig-5 S. typhimurium + + + + S. enterrtidis + + + + + S. choleraesuis + + + + S. gallinarum + + S. dublin + ? + Ген rck найденный у S. Typhimurium и S. Enteritidis ассоциируется с повышенной устойчивостью сальмонелл к комплементу [19]. Продукт гена 9 rck представляет собой поверхностный мембранный протеин блокирующий полимеризацию компонента комплемента С9 и предотвращающий тем самым повреждение мембраны бактериальной клетки (Плазмиды вирулентности Typhimurium, Enteritidis and Choleraesuis кодируют pef фимбрии [20]. Как было показано на лабораторных мышах, фимбрии способны обеспечивать адгезию сальмонелл на кишечном эпителии и индуцировать продукцию жидкости [21]. У сероваров Gallinarum and Dublin, pef локус отсутствует, однако плазмиды вирулентности кодируют фимбрии имеющие частичное сходство с фимбриями K88 E. coli. фагоцитозе сальмонелл макрофагами [22]. Mig-5 экспрессируется при однако биологический смысл протекающих при этом биохимических реакций остается неясным [23]. Таблица 3. Размеры серотипоспецифических плазмид вирулентности Серовар S. gallinarum S. typhimurium S. enteritidis S. choleraesuis Размер, п.н. 88230 93939 59372 49504 Помимо плазмид вирулентности встречаются крупные плазмиды до 200 килобаз. К таким плазмидам можно отнести группу коньюгативных плазмид IncHI размером 227000п.н. обеспечивающих утилизацию лактозы [24]. Плазмида S. abortusequi, размерами около 85 kb кодирует резистентность к токсичным тяжелым металлам (серебру, хрому, кадмию и мышьяку), у этой плазмиды также обнаружен ряд генов обеспечивающих резистентность к некоторым бета-лактамным антибиотикам и утилизацию цитрата [25]. Гены устойчивости к антибиотикам у сальмонелл кодируются как в хромосоме, так и некоторых плазмидах. Как правило, гены устойчивости к антибиотикам образуют кассеты, локализующиеся внутри транспозонов которые могут переноситься из хромосомы в плазмиду и обратно, учитывая коньюгативность большинства таких плазмид, этот механизм обеспечивает распространение генов антибиотикорезистентности среди сальмонелл [26]. 10 Наиболее широко распространен у сальмонелл интегрон класса 1 состоящий из двух последовательностей – гена int I кодирующего интегразу и гена sul1 обеспечивающего устойчивость к сульфаниламидам. Данный интегрон встречается как в первом островке патогенности хромосомы, так и в плазмидах, причем благодаря активности интегразы, между генами intI и sul1 могут встраиваться другие гены антибиотикорезистентности [27, 28]. Процесс увеличения частоты встречаемости генетических детерминант антибиотикорезистентности носит обратимый характер и при снижении селективного давления частота устойчивости снижается [29]. плазмидо-кодируемых Среди R-плазмид детерминант ответственных за антибиотикорезистентность распространена плазмида класса IncFII 140 кб. несущая гены вирулентности spvABC и rck а также гены устойчивости к тетрациклину и хлорамфениколу [28]. Сходная в функциональном аспекте плазмида S. typhimurium относящаяся к IncFIC группе плазмид кодирует гены вирулентности spvCD вместе с детерминантами резистентности обеспечивающими ампициллину реализацию хлорамфениколу, ACSSuT фенотипа стрептомицину, (устойчивость к сульфаниламидам и тетрациклину) [30]. Среди функционально-значимых плазмид с низким молекулярным весом, найдено только несколько. Плазмида обеспечивающая перенос устойчивости к сульфаниламидам была описана у S. choleraesuis [31]. У S. typhi D4 мультикопийная плазмида кодирует систему рестрикции- модификации (RMS) [32]. Плазмида pWQ799 у серовара S. Borreze способна модифицировать О низкомолекулярных антиген плазмид [33]. Одной из кодирующих важнейших функций системы-модификации рестрикции может являться обеспечение фагорезистентности, в частности подобная роль показана для плазмиды pI, [14]. Таким образом, иммунохимическое и VNTR типирование сальмонелл абсолютно недостаточно для оценки патогенного потенциала полевых изолятов сальмонелл и адекватной оценки эпидемической значимости 11 штаммов сальмонелл, обязательным условием молекулярно- эпидемиологического анализа сальмонеллезных инфекций должно являться выявление высокополиморфных хромосомных маркеров штамма и охарактеризация мобильных генетических детерминант патогенности 3.2 Выявление гена SpvC Одним из ключевых факторов определяющих способность сальмонелл вызывать внекишечные формы сальмонеллеза у человека и животных является устойчивость к фагоцитозу. Устойчивость сальмонелл к фагоцитозу обуславливается двумя процессами: кислотоустойчивостью и экспрессией генов Spv оперона. Продукты оперона Spv обеспечивают разрушение актина в цитоплазме клетки и таким образом предотвращают слияние фагосомы с лизосомой что и предотвращает гибель сальмонеллы внутри клетки. Таким образом, этот механизм позволяет сальмонеллам не только репродуцироватся в кишечнике, но и вызывать внекишечные инфекции. Сальмонелл можно изолировать из различных объектов (пробы патологического материала, продукция животноводства и птицеводства, пробы кишечного содержимого). Для изоляции используют селективные и элективные среды (среда Эндо, селенитовый бульон, висмутсульфитагар). Культуры обладающие характеристиками типичными дополнительно для сальмонелл типируют на культуральными питательной среде урислелект 4 (BioRad) для исключения энтеробактеров, клебсиелл и протеев также растущих на висмутсульфитагаре. Идентификацию вида проводят с использованием биохимических тестов ПБДЭ «ДС Нижний Новгород» и realtime ПЦР. Для выявления наличия Spv оперона у тестируемых культур используют ПЦР на ген Spv С. В реакции применяются праймеры со следующей структурой: `5-ACAGTGCTCGTTTACGACTTGAAT-3`, TCACGCCCACTTCGTAGTTCA-3`. Реакцию 12 проводят по `5- следующей программе: линеаризация 95оС 30сек., отжиг праймеров 54оС 20сек, элонгация 72оС -40 сек, количество циклов – 40. Результаты реакции учитывают путем электрофореза ПЦР продуктов в 6% полиакриламидном геле и после окрашивания бромистым этидием, в случае положительной реакции на электрофореграммах регистрировали ампликоны размером 553 п.н.(см. рис. 2) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12131415 16 17 18 192021 22 23 24 553пн Рис. 2. Результаты ПЦР на наличие гена SpvC С целью повышения надежности результатов ПЦР , положительные на наличие гена SpvC пробы, следует дополнительно проверять путем рестрикции ПЦР-продукта эндонуклеазой Taq1. При этом образовывается 2 фрагмента длинной 395 и 158 п.н. (см. рис. 2) 395п.н. 158п.н. Рис.3 результаты верификации положительных на наличие гена SpvC проб рестрикцией Taq1. Таблица 4. Результаты исследования наличия Spv региона у сальмонелл изолированных на с./х. предприятиях Сибири и Алтая. наименование Источник выделения Кол-во имеющих Sl.typhymurium Продукты культур Количество SPV тестированных оперон культур 2 2 животноводства Sl.choleraesuis Печень птицы 1 1 Sl. enteritidis Печень птицы 1 2 Sl. hamburg ЖКТ птицы 2 2 13 Органы Sl. enterica яйцепродукции 3 6 птиц Теленок, печень Sl. dublin Всего культур протестировано 1 1 14 42 Как следует из таблицы 4, около 33% культур имеют Spv оперон, что делает их опасными как в эпидемическом так и эпизоотическом отношении. Полученные результаты в целом совпадают с данными зарубежных исследователей [5,6]. Таким образом, система детекции и верификации высокопатогенных форм сальмонелл имеющих Spv оперон должна включать в себя спектр микробиологических чувствительность и техник обеспечивающих селективность, системы достаточную идентификации вида дублирующие друг друга но основанные на разных методических подходах и молекулярных механизмах. С целью повышения достоверности результатов ПЦР, исключения ложноположительных реакций не обусловленных кроссконтаминацией целесообразно ставить ПЦР только с плазмидной ДНК, а полученные положительные пробы дополнительно перепроверять рестрикцией. 3.3 Гены Rck и PagC Salmonella могут проникать в нефагоцитирующие клетки благодаря наличию системы секреции III типа (T3SS-1), которая запускает триггер интернализации в клетку. Существуют данные что проникновение бактерий Salmonella enterica серовара Enteritidis в эукариотические клетки может также обеспечиваться внешним мембранным белком Rck Rck – зависимая интернализация сальмонелл происходит путем активации комплекса Arp2/3 при участии малых GTPаз Rac1 и Cdc42. В результате формируется зиппер-подобное выпячивание мембраны эукариотической клетки обеспечивающее попадание сальмонелл внутрь клетки. Таким образом сальмонеллы являются единственными известными 14 бактериями способными попадать внутрь клеток как через триггер-механизм, так и через зиппер-механизм интернализации [34]. Хотя у вирулентных штаммов сальмонелл наружние мембранные белки Rck and PagC имеют достаточно высокую гомологию по аминокислотным последовательностям (53%) сходство их функций не очевидно. Rck ассоциируется с устойчивостью к комплементу, адгезией на эпителии и инвазией [35, 36], тогда как PagC обеспечивает выживаемость при фагоцитозе и развитие системной инфекции [37]. Эти частичное расхождение функций лежит в основе участка с наибольшим сходством нуклеотидной последовательности локализованного в трансмембранной части токсинов, тогда как наибольший уровень различий нуклеотидных последовательностей наблюдается во внеклеточных доменах протеинов в основном определяющих межклеточные взаимодействия [38]. Тем не менее число сходных аминокислотных остатков больше между Rck и PagC чем между Rck , PagC и их ортологом Yersinia Ail, который подобно Rck обеспечивает адгезию и инвазию [39, 40] 3.4 Тестирование на наличие генов устойчивости к аминогликозидам StrA и StrB StrA и StrB гены кодируют стрептомицин фосфотрансферразы Aph3 и Aph6 обеспечивающие устойчивость к стрептомицину но неактивные в отношении спектиномицина. Обычно эти гены локализуются внутри транспозона Tn5393 [41] и в «родительской» последовательности Tn5393c. [42, 43] свободной от IS элементов. Sul2 ген кодирует сульфаниламид устойчивую дигидроптероат синтазу. Как отмечено ранее [42], RSF1010 и pSRC15 содержат протяженный 1778 п.н. сегмент транспозона Tn5393 который включает в свовем составе strAB и прилегающий к ним инвертированный повтор (IRR). Sul2 изначально не входили в состав этого генетического элемента, как следует из 15 исследований некоторых авторов (GenBank последовательность. AB277723) Sul2 обнаружен в составе малого мобильного элемента CR2 [44] 3.5 Нитроцефиновый тест -латамазы, группа ферментов разрушающих антибиотики лактамного ряда. Многие из этих ферментов кодируются в мобильных детерминантах патогенности (плазмидах и транспозонах) и могут передаваться горизонтально между бактериями одного вида, возможен также межвидовой перенос. продукцией Однако эффективность выявления устойчивости, связанной с БЛРС, с помощью традиционных чувствительности остается край методов оценки -лактамазы делятся на 4 типа A, B, C, D из них B тип является металлобетталактамазами и -лактамазы лактамазы расшире -лактамаз расширенного спектра (БЛРС) – один из наиболее распространенных и клинически значимых механизмов резистентности энтеробактерий к -лактамным антибиотикам [45]. Одним из способов выявления бетталактамаз является нитроцефиновый тест, сущность теста заключается в выявлении бетталактамаз которые разрушают хромогенный субстрат – цефалоспориновый антибиотик цефиназу с образованием хромогенного субстрата. Для выявления нитроцефиновой (цефиназной) активности культур, следует ресуспендировать свежую культуру в капле физиологического раствора (1-2 бактериальных петли при отборе материала с твердой питательной среды или 1-2 капли бульонной культуры), и пропитать диск с нитроцефином. Нередко бетта-лактамазная активность выявляется сразу в течение 5-10 минут, в виде розового окрашивания, однако рекомендуется инкубировать диски при 37 С в течение 1 часа, желательно во влажной камере (например, чашке Петри). Особенность применения антибиотиков лактамного ряда, при терапии 16 инфекций желудочно-кишечного тракта, равно как и при пероральном применении лактамных антибиотиков заключается в том, что защиту патогенного микроорганизма от антибиотика может обеспечить любой компонент микробиоценоза секретирующий фермент бетта-лактамазу. В связи с этим, мы рекомендуем тестировать нативное кишечное содержимое на наличие бетта-лактамазной активности. Предложенная нами модификация метода заключается в следующем: свежий образец кишечного содержимого или фекалий (помета) отбирают ложкой Фолькмана или Люэра (предварительно обожженной на огне спиртовки). Образец ресуспендируют в 1 мл стерильного физиологического раствора, сначала путем смывания кишечного содержимого с ложки Фолькмана, потом с помощью пипетки. 50 мкл. суспензии наносят на предметное стекло в виде капли, аналогичным образом поступают с остальными пробами кишечного содержимого (ложку Фолькмана следует каждый раз очищать от остатков предыдущей пробы и обжигать над пламенем спиртовки). Затем на капли суспензий раскладывают диски с нитроцефином, предметное стекло помещают в чашку Петри и инкубируют не менее часа, после чего проводят учет результатов как описано выше (см. также рис.4). Метод удобен для обоснования назначения антибиотиков лактамного ряда а также мониторинга адаптации кишечных микробиоценозов к антибиотику. Рисунок 4. Результаты тестирования проб помета на бетта-лактамазную активность (первые 4 пробы положительны, проба 5 - отрицательна). 17 4. Флюориметрические методы исследований сальмонелл для исследования фагоцитоза Изучение фагоцитоза осуществляют с использованием свежей крови кролика и флюоресцентномеченных бактерий. Бактерии к заражению подготавливаются двумя различными способами: 1) В культуру клеток добавляют реакционно-способную группу (сукцинимидное производное флюоресцеина). Флюоресцентная метка связывается в щелочной среде рН 8 с лизином (положительно заряженная аминокислота) на поверхности прокариотической клетки. 2) К бактериям добавляют краситель флюоресцеина диацетат (ФДА) -его особенность — эффективный транспорт в живую бактериальную клетку. После его транспорта внутрь бактериальной клетки, эстераза отщепляет СН3 группу у ФДА и образуется флюоресцин флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах. Получается светящаяся изнутри бактерия. Микроскопию проводят, например, с использованием эпифлюоресцентного микроскопа ImagerD1 (CarlZeiss) и программного обеспечения AxioVision. Также использовали конфокальный микроскоп фирмы Olympus. Принцип метода состоит в том, что при фагоцитозе бактериальной клетки окрашенной снаружи, флюоресцеин может снижать свою флюоресценцию при закислении рН внутри фаголизосомы, а при использовании флюоресцеина находящегося внутри бактериальной клетки снижение светимости будет происходить только внутри погибших клеток. Использование меченых бактерий позволит зафиксировать: образование фагосом этап слияния фагосомы с лизосомой — по снижению светимости клеток меченных сукцинимидным 18 производным флюоресцеина снаружи и сохранению светимости живых бактериальных клеток меченных FDA. Также в работе использовался краситель — трипановый синий, который гасит флюоресцентное свечение (квенчинг) у бактерий, которые не подверглись фагоцитозу. Пробоподготовка окрашивания бактерий ФДА 1. Готовим предварительно рабочий раствор ФДА (из маточного раствора ФДА 1 мг/мл): 1мкл ФДА + 1мл Физиологического р-ра В 4 пробирки вносим по 1 мл физ.раствора. Потом в них же в первую пробирку добавляем 1 мкл ФДА, во вторую 2 мкл ФДА, в третью – 3мкл, и в четвертую - 4 мкл соотвественно. 2. Готовим рабочую суспензию бактерий: Использовали культуру клеток S.enterica Jl/bnc 13 = назовем ее A. В физ. растворе или PBS следует отмыть клетки от питательной среды. Для этого А — центрофугировали 3000 оборотов 2 минуты (далее 3000\2). Слили супернатант. Затем добавили 500 мкл PBS(рН=7,2 - 7,4) и центрифугировали 3000\2. Слили супернатант и опять добавили 500 мкл PBS, центрифугировали 3000\2, слили супернатант. Потом добавили 200 мкл PBS и разлили бактерии по четырем пипеткам по 50 мкл в каждую 3. Метим бактерии ФДА: для этого в суспензию бактерий капаем ФДА. 4. Инкубируем 30 минут. 5. Затем центрифугируя отмываем бактерии от непоглощенного флуоресцина (3-4 раза): центрифугируем 3000\2, сливаем надосодок +1000мкл физ р-ра и центрифугируем 3000\2, сливаем надосадок +1000мкл физ р-ра и центрифугируем 3000\2, сливаем надосадок +200мкл физ р-ра и смотрим на эпифлюоресцентном микроскопе через 10 минут, 20 минут, 1 час, 2 часа. 19 Пробоподготовки окрашивания бактерий сукцинимидным производным Приготовление маточного раствора 2мг\мл = 2 мг сукцинимида + 1мл(1000 мкл) ацетона (необходим неполярный растворитель) Сукц2 = Приготовление 0,2 мг/мл раствора = 450 мкл физ р-ра или дист Н2О + 50 мкл маточ. раствора (– хранится недолго из-за гидролиза). Берем 6 пробирок и в каждую вносим 1,5 мл суспензии бактерий. Центрифугируем 5000/8, сливаем надосадок, добавляем в каждую пробирку 0,1М КБК 200 мкл (рН=8, готовим – 1 таблетка на 100 мл, по уже заданной концентрации), т.е. в каждой пробирке получаем 200 мкл смеси бактерий с КБК. Далее в первую пробирку добавляем 200 мкл сукцинимидной смеси, перемешиваем (плч 0,1 мг/мл). Потом берем 200 мкл из этой пробирки и вносим во вторую пробирку, перемешиваем(0,05 мг/мл). И т.д. со всеми пробирками. Потом все пробирки ставим на ночь в холодильник. Утром 2х кратное промывания в PBSе. Методика получения лейкоцитов с использованием гипотонического лизиса эритроцитов Вначале берется свежая кровь и смешивается с раствором Версена. Далее при использовании RCLB смешиваем 400 мкл крови и 1100 мкл RCLB (RCLB используют для гипотонического лизиса эритроцитов). Затем инкубируем 10 минут. Центирфугируем ресуспендируем. Опять 3000/10, сливаем надосадок, добавляем PBS и центрифугируем, сливаем надосадок и ресуспендируем добавленным до 200 мкл PBSом. Потом к этому добавляем 10 мкл крашенных сукцинимидом бактерий. Инкубируем 30 минут при 370С. Делаем мазок, сушим и смотрим на микроскопе. Методика дифференциального центрифугирования Вначале берется свежая кровь и смешивается с раствором Версена изотонический раствор ЭДТА, антикоагулянт. При использовании фиколла (d = 0,077) поступаем следующее: в пробирку вносим 1 мл фекола, затем к ниму осторожно добавляем 400 мкл крови, 20 центрифугируем 3000/10. Берем надосадок – это мононуклеары. Добавляем к ним до 200 мкл PBSа. Потом к ним туда же добавляем 10 мкл крашенных сукцинимидом бактерий. Инкубируем 30 минут при 370С. Делаем мазок, сушим и смотрим на микроскопе. Таблица 5. Схема приготовления раствора Фиколла требуемой плотности: Плотность d=0,077 d = 0,082 Фиколл 400 6 гр 7,3 гр Урографин 60% 14,78 мл 17,78 мл PBS рН = 7,4 0,35 мл 8,75 мл Добавить воды 200 мл 100 мл до Методика окрашивания пропидием йодидом (PI): Предварительно готовят смесь из эукариотических клеток и бактерий с люминисцентной меткой. Затем делаем мазок и сушим стекло. Далее, для лучшего прокрашивания, промываем стекло спиртом и обрабатываем разведенным PI (маточный раствор 500 кратный) 1 мкл на 500 мкл в дистиллированной воде. 5 Определение антибиотикорезистентности в микропланшетном формате В последнее время, довольно перспективным направлением в микробиологии, можно считать использование автоматизированных систем культивирования микроорганизмов в присутствии различных антибактериальных веществ в 96 луночных микропланшетах. Данная технология не только микробиологических обеспечивает исследований антибиотикорезистентности микробов высокую направленных [46], автоматизированный, количественный анализ данных. 21 производительность но на изучение и облегчает Одной из таких технологий, является выращивание микроорганизмов в лунках планшета с различными антибиотиками (концентрация которых эквивалентна терапевтической) [47]. Однако, спектрофотометрический анализ оптических плотностей в планшетах имеет некоторые отличия от фотометрии в кюветах, в частности длинна оптического пути проходящего через слой культуральной жидкости, в планшетах, может колебаться. В связи с этим, была поставлена задача – оценить воспроизводимость таких исследований и разработать наиболее простой протокол адаптированный для производственных лабораторий. Чувствительность выделенных микроорганизмов к антибиотикам проверяли Таблица №6. Структура планшетов № антибиотик путем инкубирования в лунках полистиролового планшета в присутствии антибиотиков, в концентрациях вертикального эквивалентных рядка в терапевтическим. После инкубации планшеты планшете фотометрировали на ИФА-ридере «Пикон» 1 Зинаприм 2 Эриприм 3 Рифан 4 Апрамицин 5 Родотиум 6 Фуразолидон полевой изолят сальмонелл. Для работы 7 Коливет использовали 8 Квинабик планшеты 9 Энроколи 10 Амоксициллин 11 Энрофлон 12 Без при длине волны 540нм. Данные автоматически заносились и обрабатывались в компьютере [47]. В качестве тест объекта используют полистироловые фирмы внесенными ИФА- «Медполимер» с коммерческими антибактериальными препаратами (таблица 6) антибиотиков Таблица №7 Оптическая плотность в лунках с МПБ 22 № Квадратическое эксперимента M+m отклонение При Cv капельном 1 0,252+0,005 0,017668 7,006402 внесении МПБ 2 0,261+0,011 0,040508 15,52036 коэффициент вариации 3 0,237+0,006 0,023551 9,916092 4 0,239+0,011 0,038839 16,21095 оптических плотностей Cv варьировал от 7 до 16,2%. Дополнительное воздействие на варьирование оптических плотностей мог оказывать «краевой эффект» - испарение части МПБ в краевых зонах планшет. Тем не менее, статистически достоверных отличий оптических плотностей МПБ в разных повторностях обнаружено не было (см. табл.№7). Оценка Таблица№ 8. Воспроизводимость усредненных результатов оценки антибиотикорезистентности к 11 антибиотикам вариабельности и № Квадратическое воспроизводимос эксперимента M отклонение Cv ти m оптических 1 0,703333 0,304171 43,24712 0,087911 плотностей 2 0,725833 0,305983 инокуляции 3 0,702083 0,289999 41,30544 0,083815 4 0,287306 41,82042 0,083037 0,687 42,1561 0,088434 при культуры во все лунки бактериологической петлей после однократного отбора пробы. Для этой цели инокулировали культуру E.coli во все 4 рядка лунок с разными антибиотиками после однократного взятия материала на бак. петлю из единичной колонии с твердой питательной среды. В результате исследований не было обнаружено достоверного снижения средней оптической плотности в направлении от первого рядка лунок к последнему (таблица№ 8). отр. контроль энрофлон амоксици ллин энроколи квинабик коливет фуразолид он родотиум апрамици н рифан эриприм зинаприм Таблица 9. Воспроизводимость антибиотикограмм M 0,96 0,56 0,96 0,24 0,82 0,88 0,24 0,24 0,90 0,86 0,88 0,85 m 0,01 0,01 0,01 0,002 0,03 0,01 0,00 0,01 0,02 0,011 0,04 0,01 Cv 1,83 5,44 3,22 8,67 4,45 2,82 5,17 5,09 2,75 10,13 4,09 2,28 23 При анализе воспроизводимости антибиотикограмм (оптических плотностей бактериальной культуры после 18 часовой инкубации в присутствии различных антибиотиков) значительных отклонений результатов в 4-х повторностях обнаружено не было. Коэффициент вариации оптических плотностей варьировал от 1.83% до 10.1% (таблица 9). Статистически достоверных различий средней оптической плотности лунок в рядках антибиотикограмм также не установлено (таблица 8). В ходе исследований была установлена оптимальная воспроизводимость и достаточная надежность следующего протокола методики: 1. Обжечь горлышко и резиновую пробку флакона с МПБ, а также поверхность рабочего стола. Работать стерильном боксе, с соблюдением правил асептики! Оптимальным является дополнительное использование минибокса и рециркулятора воздуха. 2. В планшету с заранее внесенными антибиотиками с помощью одноразового стерильного шприца набрать через пробку из флакона МПБ 3. Отсоединить шприц от иглы и по каплям вносить МПБ поочередно в лунки планшета раскапывая среду до объема приблизительно равного 400 мкл (мениск жидкости должен быть вогнутым), не следует допускать струйного внесения среды (в этом случае при примерно идентичном уровне МПБ в лунках, количество капель будет одинаково, а точность внесения выше). 4. Бактериальной петлей произвести отбор культуры с поверхности твердой питательной среды и, быстро погружая петлю в лунки, произвести инокуляцию культуры во все лунки рядка 5. Заполнить остальные лунки планшета инокулируя по одной культуре на рядок лунок 6. Закрыть планшет стерильной крышкой или другим стерильным планшетом 7. Инкубировать при 37оС 16-18ч. 24 8.Произвести измерение оптических плотностей на вертикальном планшетном спектрофотометре с использованием светофильтра 530 – 550 нм 9. Импортировать данные в компьютер и обработать с использованием специализированного программного обеспечения. Протокол анализа антибиотикорезистентности микроорганизмов в ИФА формате, характеризуется адаптированный достаточной для прикладных воспроизводимостью исследований, и надежностью. Технология изготовления комплекта планшет и реактивов обеспечивает получение стерильных компонентов с минимальным разбросом технических характеристик. Использование шприцев для внесения питательных сред позволяет уменьшить риск контаминации лунок посторонней микрофлорой в призводственных условиях. Инокуляция материала в рядок после однократного отбора обеспечивает достаточную надежность, высокую производительность труда и уменьшает риск контаминации за счет уменьшения времени работы с планшетом. Микропланшетный метод определения антибиотикорезистентности сальмонелл с резазурином. Принцип метода заключается в том, что краситель резазурин при наличии роста бактерии меняет цвет питательной среды с синего на розовый. Протокол метода определения антибиотикорезистентности: Таблица 10: концентрации антибиотиков в лунках микропланшета. № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 антибиотик Концентрация, мкг/мл Цефтриаксон 16 Канамицин 16 Метронидазол 5 Рифампицин 16 Гентамицин 16 Ампициллин 16 Цефотаксим 16 Амикацин 10 Стрептомицин 10 Бензилпенициллин 16 Амоксициллин 16 Контроль 0 Тестируемые культуры заранее ресуспендируют в пробирках с питательной средой (4 мл), для этого в пробирку бактериологической петлей 25 вносят 1-2 петли бактерий с твердой питательной среды, либо 100-200 мкл культуры выращенной на жидкой питательной среде. В микропланшет с предварительно внесенными антибиотиками (таблица 10), и резазурином (по 10 мкл рабочего раствора на лунку) вносят питательную среду – бульон Хоттингера с предварительно внесенными в нее бактериями. Одна культура бактерий высевается на один горизонтальный ряд микропланшета в количестве по 200 мкл. на лунку. Микропланшет закрывается крышкой и помещается в термостат при 37С на 16-18 часов. Учет результатов проводят анализируя подавление антибиотиком изменение цвета резазурина с синего на розовый. 6. Молекулярная эпизоотология 6.1 VNTR типрирование За последние годы были полностью отсеквенированы геномы многих бактерий, в том числе бактерий, патогенных для человека. При анализе секвенированных геномов было обнаружено, что значительная часть ДНК содержит повторяющиеся последовательности. Повторы отличаются по размеру, расположению, сложности и подразделяются на классы, такие как прямые повторы, двойные повторы, инвертированные повторы. Полиморфные микросателлиты обычно упоминаются как варьирующие по числу тандемные повторы (VNTR, variable number tandem repeats). Известно, что кластеры повторов могут служить мишенями для рекомбинации или сдвигов ДНК-полимеразы, что приводит к изменению числа повторов. Если такие события происходят с достаточной частотой, это приводит к появлению различий по данному локусу повторов между разными штаммами. Перестройки в повторённых участках ДНК также помогают микроорганизмам осуществлять быстрые геномные и фенотипические изменения. Такие изменения содержат механизмы регуляции генов или появления новых копий генов, кодирующих разнообразные поверхностные 26 белки, что приводит к антигенному сдвигу и позволяет бактерии избежать иммунной системы хозяина. В последние годы во многих работах тандемные повторы ДНК стали использоваться как средство для идентификации бактериальных штаммов. Многие патогенные бактерии генетически гомогенны, что, вероятно, отражает их быстрое распространение и успех в качестве патогенов млекопитающих. Мультилокусный анализ VNTR стал хорошим методом изучения генетического разнообразия высоко мономорфных видов, таких как Bacillus anthracis и Yersinia pestis. На настоящий момент осуществляется разработка методов типирования других бактерий, патогенных для человека, например, Escherichia coli и сероваров Salmonella, поскольку эти бактерии имеют огромное значение для здравоохранения. Для типирования используют 7 пар праймеров предложенных нами, предварительное моделирование результатов полногеномных последовательностях VNTR- сальмонелл, типирования на показало что для достоверной дискриминации всех представителей исследуемой выборки, требуется 7 пар праймеров (см. табл.11). Таблица 11. Результаты VNTR типирования in silico известных геномов S. enterica Название серотипа S. enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483 S. enterica subsp. arizonae serovar 62z4,z23S. enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67 S. enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_02021853 S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. P125109 S. enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str. 287/91 S. enterica subsp. enterica serovar Heidelberg str. SL476 S. enterica subsp. enterica serovar Newport str. SL254 S. enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150 S. enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B str. SPB7 S. enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund str. CVM 19633 SE-1 SE-2 Пары праймеров SE-3 STTR5 SE-7 SE-8 SE-9 - - - 108 bp 135 bp 1329 bp - 465 bp - 320 bp 320 bp - - - 162 bp 475 bp 467 bp 320 bp 253 bp 201 bp 308 bp 168 bp 353 bp 467 bp 320 bp 267 bp 208 bp 308 bp 132 bp 719 bp 467 bp 329 bp 295 bp 194 bp 308 bp - 354 bp 467 bp 320 bp - - - 168 bp 1865 bp 467 bp 320 bp - - - 108 bp 1805 bp 467 bp 320 bp 246 bp - - 108 bp 524 bp 468 bp 320 bp - - - 150 bp - 467 bp 320 bp - - - 132 bp 951 bp 466 bp 320 bp 27 S. enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18 S. enterica subsp. enterica serovar typhimurium LT2 S. enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2 246 bp 245 bp - - 144 bp 576 bp 465 bp 320 bp 150 bp 156 bp 1739 bp 611 bp 467 bp 465 bp 320 bp 320 bp Как следует из таблицы, совокупная дискриминационная способность метода формируется из наличия и отсутствия реакции – пары праймеров SE1, 2, 3 так и размеров ампликонов – пары праймеров STTR5, SE-7, SE-1. Высоко-консервативные локусы фланкированные парами праймеров SE-8,9 представляют ценность в качестве прохождения внутреннего контроля реакции. Таким образом, мультилокусный анализ включает в себя VNTR типирование как высоковариабельных так и низковариабельных участков генома сальмонелл, что в перспективе позволит оценивать изоляты сальмонелл с различным уровнем генетических различий (рис. №№5-8). В процессе исследований были отработаны режимы проведения реакций позволяющие обеспечить получение воспроизводимых результатов (см. рис. 5.). SE-1 SE-2 SE-3 STTR5 SE-7 SE-8 SE-9 Рис.5 Электрофореграмма типирования 2-х изолятов сальмонелл со всем разработанными парами праймеров. На электрофореграмме показаны результаты VNTR- типирования с полевым изолятом S. enteritidis. Tree Diagram for 14 Cases Single Linkage Euclidean distances 5.AgonaОпределение плазмидного профиля Schwarzengrund Heidelberg Newport Typhimurium Choleraesuis Paratyphi A Typhi Typhi Dublin Gallinarum 28 Рис. 6 Кластерный анализ результатов VNTR-типирования in silico известных геномов S. enterica. Рис. 7 ПЦР с использованием праймеров фланкирующих VNTR типа GATGCCG Рис. 8 ПЦР с использованием праймеров фланкирующих VNTR типа GTTGGTA Голубь с кормоцеха Бройлеры Суточные цыплята от ПФ поставщика 29 Рис. 9 Результаты VNTR типирвания с системой праймеров VNTR 7 панели изолятов сальмонелл изолированных в Новосибирской области Наглядный пример - использование результатов VNTR типирования изолятов сальмонелл, отражен на рис. На электрофореграмме видна гомология по VNTR типам у изолятов сальмонелл выделенных у голубя убитого на зерноскладе, из печени цыпленка –бройлера и от суточных цыплят родительского стада. Ввиду того, что поставщик племенной птицы находится от неблагополучной, по сальмонеллезу птицефабрики далеко, мы можем предполагать вертикальный путь заноса данного VNTR типа сальмонелл на фабрику. С другой стороны мы можем наблюдать сходство VNTR типов изолятов сальмонелл выделенных от голубя на зерноскладе, что свидетельствует о контаминации зерна голубями и высокой вероятности заражения через корм. Однако, так как голуби явно не в состоянии долететь до поставщика племенной птицы, ибо не в состоянии пересекать континенты, следует ожидать что голуби заразились от сельско-хозяйственной птицы и стали резервуаром сальмонеллеза для данной и близлежащих птицефабрик, что делает неэффективным проведение протиовэпизоотических мероприятий нацеленных на прерывание только вертикального пути заражения. 6.2 Дискриминация штаммов и изолятов с использованием метода PFGE У сальмонелл плазмиды подразделяют с функциональной точки зрения на две группы. В первую группу входят функционально значимые плазмиды это серовароспецифические, ассоциируемые с патогенностью и антибиотикорезистентностю плазмиды размерами от 40000 до 160000 п.н. и плазмиды меньших размеров, функциональное значение которых в реализации патогенного потенциала сальмонелл не доказана [14]. Моделирование эндонуклеазами XbaI, профилей макрорестрикции AvrII, in SfiI silico показало редкощепящими что наиболее вариабельными характеристиками электрофореграммы у разных сероваров 30 сальмонелл обладали при изучении фрагемнтов рестрикции размерами до 200 килобаз (см. рис. 9). XbaI AvrII 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 15 20K 10K 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 20K 10K 5K 5K 2K 2K 700 400 1K SfiI 9 часов 1 2 SfiI 20 часов 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 15 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 20K 10K 20K 5K 10K 2K Рис. 1 Результаты PFGE in silico профилей макрорестрикции геномной ДНК различных сероваров сальмонелл при рестрикции эндонуклеазами XbaI, AvrII, SfiI, Примечание: последовательности треков 1 agona, 2 arizonae, 3 cholerasuis, 4 dublin, 5 enteritidis, 6 gallinarum,7 heidelberg, 8 newport, 9 paratyphi A, 10 paratyphi B,11 S. enteritidis, 12 schwarzergrund, 13 неидентифицированный серовар, 14 typhiCT, 15 typhimurium Ввиду того что, фрагменты рестрикции меньшего размера содержат меньше ДНК и, соответственно обладают меньшей светимостью, была предпринята попытка оптимизировать метод пробоподготовки ДНК с целью увеличения фракции мобильной ДНК и уменьшение ее деструкции эндогенными ДНКазами. В итоге был подобран следующий протокол выделения: 1. Kлетки суточной культуры сальмонелл в объеме 15 мл прогревали 30 минут при 65оС, осаждали центрифугированием 2. Осадок обрабатывали лизоцимом (20ед на пробу), в буфере 0,1 ЭДТА, 0,05ТрисHCl в течение 1 часа (в объеме 200 мкл). 3. К суспензии добавляли 10 ед. протеиназы К и инкубировали в течение 2-х часов 31 4. К суспензии внесенной в лунки 12 луночного планшета, добавляли расплавленную SDS агарозу (1%SDS, 1% агарозы) и инкубировали в течение 3-х часов при 65 оС. 5. Планшет с пробами остужали при комнатной температуре, из пластинок агарозы скальпелем вырезали блоки толщиной не более 5мм, и переносили в пробирки с 5мл. стерильной дист. воды. инкубировали ночь при температуре 65оС 6. Воду сливали и в пробирки с агарозными блоками вносили 2М раствор гуанидина гидрохлорида и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. 7. После удаления гуанидина, блоки промывали дист. водой однократно 1ч при комнатной температуре и, при температуре 65оС, 3-х кратно по 1-2 часа. 8. На ночь блоки оставляли в ТЕ буфере и использовали для пульсэлектрофореза плазмид. Тестирование 28 выделенных культур на наличие крупных плазмид позволило выявить наличие 12 культур содержащих плазмиду размерами ~58000п.н. и 2 культуры содержащие низкомолекулярные плазмиды ~5000п.н. 6.3 ПЦР мониторинг для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий В исследованиях используется количественная Real-time PCR c зондом Такман разработанная в ИХБФМ СО РАН. В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными 5`GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3` последовательностями: и Sm2 Sm1 5`- AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 и флуоресцентный зонд Sm3 Taqman FAM-TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG-гаситель. Для количественного учета реакции ставят контроли с заведомо известным содержанием микроорганизмов в пробе, в количестве не менее 4-х контрольных точек. 32 Реакцию учитывают общепринятым методом с использованием реалтайм амплификатора на основании калибровочных кривых, полученных с использованем стандартных образцов с различным содержанием микроорганизмов в пробе [50]. Геномную ДНК выделяют следующим образом. Одноразовыми стерильными тампонами делают соскоб содержимого клоаки. С тампонов соскоб смывают 1 мл 4М раствором гуанидинизотиоцианата. По 300 мкл. смыва переносят в пробирки Эппендорфа, тщательно перемешивают, инкубируют при 56оС в течение 5 минут и центрифугируют при 4 тыс. об./мин.в течение 3-х минут. Надосадочную жидкость переносят в другие пробирки и туда же вносили по 50 мкл ДНК сорбента (silica). Пробы тщательно перемешивают, инкубируют 5 минут, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 5 тыс. об/мин. в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость сливают, сорбент промывают буфером для промывки, ДНК элюируют 50 мкл ТЕ буфера при 56 С. Учитывая, что желудочно-кишечниый тракт можно рассматривать как входные ворота и место резервации сальмонеллезной инфекции, а также как один из важных органов, откуда происходит диссеминация возбудителя, мы сочли целесообразным для ПЦР-скрининга и мониторинга сальмонеллоносительства на птицефабриках, использовать клоакальные смывы. Отбор проб производят одноразовыми стерильными тампонами, метод отбора позволяет проводить прижизненную диагностику и сводит риск перекрестной контаминации к минимуму [49]. С целью оценки эффективности антибиотикотерапии, проводят отбор биоматериала непосредственно до обработки антибиотиком и сразу после отмены курса антибиотикотерапии. Курсы антибиотикотерапии проводят в соответствии с рекомендациями производителя антибиотика. Таблица 12. Инфицированность клоакальных смывов от кур родительских стад до и после обработки антибиотиками, по результатам ПЦР, % 33 группа антибиотик Размеры выборки % инфицированности 1 До обработки 10 20 2 До обработки 10 30 3 До обработки 10 20 4 До обработки 21 19,04 1 Флубактин 10 0 2 Энроксил 10 0 3 Энроксил 10 10 4 Эгоцин 21 0 Как следует из таблицы №1, уровень инфицированности клоаки птицы родительских стад варьировал от 19% до 30%. Данный метод оказался удобен для подбора эффективных препаратов позволяющих контролировать сальмонеллоносительство. Например, неожиданно удачным оказался эксперимент с флубактином, так после обработки этим препаратом все пробы были отрицательны в ПЦР на наличие ДНК сальмонеллы (см. табл. 12). Помимо инфицированности на популяционном уровне, с помощью real-time ПЦР (см. рис.10), нами была оценена инфекционная нагрузка сальмонеллами инфицированной птицы. Рис. 10 кривые накопления ПЦР продукта во взаимосвязи с количеством сальмонелл в пробе Так до обработки эгоцином инфекционная нагрузка варьировала от 1,4 тыс. до 558 млн. микроорганизмов на пробу. Через семь дней после окончания обработки у единственной инфицированной птицы инфекционная нагрузка несколько выросла до 2,8 млрд. сальмонелл на пробу. Можно предполагать что это было обусловлено эффектом постантибиотического 34 дисбактериоза, либо снижением колонизационной резистентности кишечника за счет уменьшения активности клеточного конвейера (по нашим данным антибиотики тетрациклинового ряда оказывают такое дейстиве на стенку кишечника). Тем не менее, для взрослой птицы со сформированной микрофлорой кишечника данная ситуация вполне безопасна. Обобщая данные по результатам экспериментов с эгоцином, можно предложить использовать эгоцин в первую очередь в период предшествующий переводу и в начале яйцекладки. Для молодой птицы в возрасте до 30 дней важно использование препаратов снижающих количество сальмонелл в кишечном содержимом (эгоцин, как следует из наших исследований, к этой группе отнести нельзя). После завершения формирования желудочно-кишечного тракта становиться более актуальным снижение процента инфицированной птицы, с этой задачей эгоцин справился т.к. увеличение процента инфицированности в долгосрочном периоде не наблюдается (по сравнению с птицей не обработанной эгоцином). 7.Методические подходы, для контроля сальмонеллезов, на птицефабрике Существуют разные принципы, на основе которых разрабатывают системы контроля сальмонеллезов на сельскохозяйственных предприятиях. «Концепция нулевого риска», наиболее активно позиционируется медицинскими работниками, стремящимися свести риск заражения человека сальмонеллами через животноводческую продукцию к нулю. Вероятно, наиболее последовательная попытка реализации этой концепции, была предпринята в Дании. Система противо-сальмонеллезных мероприятий в Дании построена на обнаружении неблагополучных по сальмонеллезам стад на основе массового микробиологического и серологического мониторинга и уничтожения этих стад (птица из неблагополучных птицефабрик забивается на отдельных сан.бойнях, подвергается температурной обработке). Наиболее важным элементом этой программы мероприятий, является обеспечение 35 птицефабрик и фермерских хозяйств неинфицированной птицей. Для достижения этой цели жесткому микробиологическому контролю подвергаются родительские (племенные) стада и ремонтный молодняк. При этом, запрещены вакцинопрофилактика сальмонеллезов, лечение зараженной сальмонеллами птицы с помощью антибиотиков. Также, важным моментом предотвращения заноса сальмонелл на птицефабрику, является микробиологический контроль поступающих кормов. В результате реализации комплекса противоэпизоотических мероприятий Дания находится в числе стран с самым низким уровнем зараженности сальмонеллами продукции птицеводства и животноводства. Количество неблагополучных по сальмонеллезу хозяйств менее 1%. Разберем плюсы и минусы данной системы с учетом особенностей птицеводства в РФ. На момент начала программы противосальмонеллезных мероприятий Дания уже входила в группу стран Европы с самым низким уровнем инфицированности стад птицы и свиней. Однако в большинстве стран доля неблагополучных по сальмонеллезу хозяйств варьирует от 56 до 20%, к наиболее неблагополучным странам можно отнести Польшу, Венгрию, Болгарию. Внедрение Датской системы противосальмонеллезных мероприятий для таких стран грозило бы потерей, соответственно, более 3050% птицеводческих хозяйств, резким удорожанием продукции птицеводства и не гарантировало бы благополучия в будущем, так как высокая значимость вертикальных путей заражения при сальмонеллезах, требует обязательного контроля сальмонеллоносительства на племенных репродукторах и родительских стадах, то есть хозяйства, поставляющие племенную птицу должны быть либо из этой же страны, либо из страны, где принята аналогичная программа мероприятий. К минусам следует отнести также значительные финансовые затраты (в Дании, около 25 млрд. евро), следует учесть что Дания маленькая и 36 компактная страна, для РФ потребуется пропорционально большее количество денег. Также следует учитывать, что Датчане не добились «нулевого риска заражения» так как не смогли полностью, тотально искоренить сальмонеллоносителство и их экономика не может обеспечивать постоянные двадцатипятимиллиардные вливания в поддержание системы противосальмонеллезных мероприятий. К несомненным плюсам следует отнести следующие – противосальмонеллезные мероприятия нацелены не только на снижение зараженности пищевой продукции сальмонеллой, но и на снижение инфицированности животных, птиц на всех этапах технологического процесса. Основным источником заражения птицы промышленных стад являются родительские стада, передающие возбудителя с яйцом. Поэтому первоочередная задача – искоренить сальмонеллоносительство в специалисты совершенно из Дании родительских сальмонеллез стадах. обоснованно и Ветеринарные придают этому первоочередное значение. Реализация противосальмонеллезных мероприятий на системном уровне в масштабе страны, делает возможным взять под контроль производителей племенной птицы, что делает возможным проведение противосальмонеллезных мероприятий на промышленном поголовье и пищевых производствах. Концепция невозможность «допустимого достижения риска». нулевого Опыт Дании уровня подтверждает инфицированности животноводческой и птицеводческой продукции. Снижение риска заражения к технологически-возможному минимуму более достижимая задача, о чем свидетельствует предпринимаются опять таки попытки опыт Дании. Учеными ряда оценить уровни зараженности стран стад и птицеводческой продукции в разных странах, выявить причины, по которым отдельные хозяйства отличаются по этим показателям в лучшую или худшую 37 сторону. Использование мониторинга зараженности сальмонеллами продуктов птицеводства и самой птицы позволяет своевременно выявлять повышение уровни зараженности до недопустимого уровня и принимать соответствующие меры. Важным фактором могло бы являться оценка эпидемической и эпизоотологической значимости обнаруженных изолятов сальмонелл, ввиду того что эта значимость варьирует в широких пределах. Например, по последним данным средний уровень инфицированности сальмонеллами тушек бройлеров в РФ составляет 32% что сопоставимо с аналогичным показа теме в Китае, Чили, Индии. Уровень инфицированности тушек бройлеров в США по разным данным варьирует от 6 до 40% в разных штатах. С одной стороны, показатель весьма высок, с другой стороны все вспышки сальмонеллезов птицеводческой продукции, у человека, за связанные последние 20 лет с употреблением ассоциировались исключительно с употреблением яиц и продуктов питания содержащих различные их ингредиенты. 8. Бактериологические методы изоляции возбудителя Обращает на себя внимание различная эффективность различных микробиологических методов выделения и первичной типизации сальмонелл. Так, при использовании следующей схемы: пептонная вода, селенитовый бульон, висмут-сульфитагар из желудочно-кишечного тракта и проб печени преимущественно изолировали P.vulgaris (64%), P.mirabilis (12%), микроорганизмы рода Enterobacter 13% Pseudomonas (4%), и в остальных случаях Salmonella enterica (в среднем 7%, в кишечнике 1%). При этом высеваемость сальмонелл из проб печени была выше, чем из проб кишечного содержимого, что парадоксально т.к. кишечник является воротами инфекции и должен быть основным источником сальмонелл. Очевидно, что наиболее негативным фактором, снижающим чувствительность данной схемы выделения , являлась возможность роста на используемых средах других бактерий сем. Enterobacteriaceae напр. рода 38 Proteus, Enterobacter. В то же время использование методов ПЦР позволяло выявить более высокую инфицированность проб кишечного содержимого (таблица 13), тогда как, по результатам микробиологического метода инфицированность кишечного содержимого не превышала 1%. Таблица 13. Скрининг четырех птицефабрик Сибирского региона на носительство сальмонелл по результатам ПЦР. тип стада возраст птицы выборка материал Бройлеры 15дн 6 проб клоака Бройлеры до обработки флубактином Бройлеры после обработки флубактином Родительское стадо несушка 21дн 50% 170дн 5+5 проб 2 клоака разных корпуса 4+4 проб клоака 2 разных корпуса 8 проб клоака 195дн 10 проб 0% 28 дн клоака процент положительных проб 33,3% 0% 0% Как следует из таблицы №13, уровень инфицированности по данным ПЦР анализа варьировал от 0 до 50%. Недостатком традиционной схемы изоляции сальмонелл является тот факт что и селенитовый бульон и висмут-сульфитагар селективны в отношении грамм-отрицательных микроорганизмов активно продуцирующих сероводород (при этом посевная доза таких микроорганизмов должна быть высокой чтобы обеспечить подавление селектирующего агента). Соответственно высокая концентрация в пробе микроорганизмов рода Proteus защищает другие микроорганизмы путем редукции сульфитов до сероводорода. Более эффективна была первичная изоляция на среде Эндо, при этом посевная доза сальмонелл может варьировать до единичных бактериальных клеток и этот фактор не влияет на выживаемость сальмонелл в данной среде. Однако при исследовании желудочно-кишечного тракта птиц данный метод оставался недостаточно эффективным ввиду возможности ползущего роста P.vulgaris по среде Эндо (данный микроорганизм всегда встречается в кишечном содержимом птиц). 39 Использование среды XLT4 позволило исключить негативное влияние микроорганизмов рода Proteus на рост сальмонелл при их первичной изоляции. При тестировании 34 проб кишечного содержимого на среде XLT4 было выделено 12 культур сальмонелл и ни одной культуры микроорганизмов рода Proteus. Схема изоляции была следующей; посев на среду Эндо на 16 ч, рассев бледно-розовых колоний на среде XLT4 инкубация 24-48 ч, посев штрихом на среды висмут-сульфитагар и уриселект-4 (для подтверждения продукции сероводорода и исключения триптофандезаминазной активности соответственно). В дальнейшем изоляты обладающие культуральными и тинкториальными характеристиками сальмонелл типировали иммунохимически, биохимически или ПЦР. Таблица 14 Сопоставление результатов детекции сальмонелл из толстого отдела кишечника цыплят-бролйеров Схема выделения 1 Схема выделения 2 ПЦР Кол-во выделенных культур Кол-во выделенных культур Кол-во положительных реакций 0 12 14 Как следует из таблицы 2 сопоставление традиционной схемы выделения (схема 1) и предложенной нами (схема 2) а также результатов ПЦР анализа показывает более высокую чувствительность предложенной нами схемы, сопоставимую с результатами ПЦР. Схема изоляции сальмонелл из клоакальных смывов и продукции птицеводства: Соскоб клоаки или кишечное содержимое сеют на пептонную воду и инкубируют при 37оС 3-5часов. Пробы продуктов птицеводства (смывы с поверхности тушек, кусочки фарша (25 гр.), кусочки мяса, смыв со скорлупы яйца) сеют на пептонную воду и также инкубируют 3-5 часов при 37 оС. Пересев в соотношении 1:10 осуществляют в пробирки Эппендорфа с селенитовым бульоном и тергитолом-4, инкубируют до суток, в случае 40 появления оранжевого окрашивания и/или осадка, делают рассев на среде Эндо. При появлении бледно-розовых колоний осуществляют параллельные пересевы на висмут-сульфит/агар или XLT-4, среду Уриселект-4 и среду Хоттингера или TCS-агар для последующей биохимической и иммунохимической идентификации в случае, если на среде XLT-4 образуются колонии с черным пигментом, без пожелтения среды, на среде уриселект-4 колонии синего или красного цвета. Используемая схема выделения сальмонелл позволяет дать отрицательный ответ в течение полутора суток (при отсутствии роста на селенитовом бульоне с тергитолом), или положительный ответ в течение 3-х суток. 9. Серологический мониторинг сальмонеллоносительства Серомониторинг следует считать более чувствительным методом позволяющим выявлять инфицированность стад птицы сальмонеллами. Связано это с тем, что локализация сальмонелл в организме может быть неравномерной, и при отборе материала существует вероятность отобрать образец не содержащий сальмонелл. В то же время, контакт антигенов сальмонелл с иммунной системой организма приводит к образованию антител, вне зависимости от места локализации возбудителя. Использование иммуноферментного анализа имеет определенные ограничения, связанные как с видоспецифичностью конъюгата, так и с высоким риском перекрестных реакций на неродственные антигены микроорганизмов другого вида. В этом аспекте реакция агглютинации имеет такие преимущества как универсальность, а низкая чувствительность реакции снижает вероятность неспецифического реагирования. Для повышения производительности метода мы разработали флюоресцентный вариант РА с корпускулярным сальмонеллезным О антигеном. Преимуществом метода является возможность приготовления антигена из местного штамма S.enterica выделенного из патологического материала. 41 Для проведения РА требуются следующие компоненты: 1. Инактивированный нагреванием корпускулярный антиген S.enterica меченный бромистым этидием, 2х 2. Фосфатно-солевой буфер с рН 7,0-7,2 3. 96 луночные микропланшеты с V-образным дном 4. Трансиллюминатор с системой видеодокументирования 5. Многоканальные пипетки с диапазоном дозирования 50-250мкл 6. Ванночки 7. Одноканальные пипетки с диапазоном дозирования 20-200мкл Реакция ставиться следующим образом: 1. Во все лунки микропланшетов вносят по 100 мкл фосфатносолевого буфера. 2. В первый горизонтальный ряд, отдельными наконечниками вносят по 25 мкл сыворотки и перемешивают 3. Многоканальной пипеткой из первого ряда лунок отбирают 100 мкл сыворотки и переносят во второй ряд лунок. Таким образом, меняя носики, титруют сыворотку с шагом 1:2. 4. В лунки вносят по 100 мкл флюоресцентно- меченного антигена и инкубируют от 4-х до 18 часов. 5. Микропланшет фотографируют в ультрафиолетовых лучах, с использованием трансиллюминатора. 6. При наличии положительной реакции образуется «зонтик», в случае отрицательной реакции, бактериальные клетки скапливаются на дне лунок, в виде «пуговки», которая выглядит более ярко светящейся точкой на общем фоне (см. рис. 11). 7. Определяют титр тестируемой сохранилась агглютинация. 42 сыворотки на котором Рис. 11 Результаты РА с флюоресцентно меченным антигеном. 10.Методические подходы к снижению реинфекции и рецидивирования сальмонеллоносительства Серьезной проблемой является повторное инфицирование птицы после отмены курса антибиотикотерапии. Мы неоднократно сталкивались с ситуациями, когда антибиотик очень хорошо подавлял патогенную флору в организме птицы, но после его отмены инфекция вспыхивала с новой силой. Обычно это обусловлено тем, что птица в состоянии постантибиотического дисбактериоза отличается высокой восприимчивостью к заражению, при этом наиболее патогенные формы бактерий заселяют организм птицы одними из первых. Основной источник реинфицирования в напольных птичниках это, естественно, подстилка. Длительность переживания E.coli в подстилке варьирует от 4 до 20 дней, Salmonella нередко существует в подстилке длительное время. В связи с этим мы можем предложить 2 технологии эмпирического подбора антибиотиков. 1. При ПЦР-мониторинге курса антибиотикотерапии мы стараемся оценивать эффективность антибиотика не только в краткосрочном, но и отдаленном периоде. Например, наши исследования показывают достаточно высокую эффективность эгоцина применяемом с целью снижения обсемененоости птицы родительского стада сальмонеллами. 2. Важным фактором, определяющим риск реинфекции является вероятность дисбактериоза. Наши исследования показывают, что не все антибиотики вызывают постантибиотический дисбактериоз, устойчивость нормофлоры к 43 антибиотикам на разных птицефабриках варьирует, но есть и определенные закономерности. Например, по нашим данным, стабильном инимальное снижение концентрации лактобактерий наблюдается при использовании фуразолидона, колистина и гентамицина. Фторхинолоны (энроксил, флубактин) способны повреждать лактофлору примерно в 50% случаев. Такие антибиотики как тилозин, амоксициллин, спектиномицин, клиндамицин, линкомицин и левомицетин в большинстве случаев вызывают постантибиотический дисбактериоз. Соответственно можно рекомендовать проведение хотя-бы однократной оценки антибиотикорезистентности лактофлоры, существующей на конкретной птицефабрике. Суть технологии заключается в преимущественном использовании антибиотиков активных в отношении патогенных микроорганизмов, но не повреждающих, при этом нормофлору птицы. 11. Эпизоотологические методы борьбы с антибиотикорезистентностью Законы распространения антибиотикорезистентности вполне подчиняются принципам эпизоотологии, и методы профилактики этого явления в принципе аналогичны. Поэтому, качественная дезинфекция, качественная мойка птичников, дезинфекция в присутствии птицы имеют значение и здесь. Отличительными особенностями является возможность передачи генов устойчивости к антибиотикам от одного вида к другому, и ферментативные механизмы защиты от позволяющих защищать от антибиотика всю микрофлору в целом. Поэтому важно не допускать повторное использование одного и того же антибиотика на одном технологическом цикле, полезно иметь схему ротации антибиотиков и заранее формировать группу антибиотиков запаса. Также следует учитывать занос антибиотикорезистентных штаммов из раодителского стада, для минимизации ущерба от этого явления следует на родителях и промышленном стаде использовать различные антибиотики, 44 уделять больше внимания бактериальным инфекциям передающимся с яйцом (сальмонеллы, псевдомонасы, протеи и т.д.). 12. Повышение эффективности антибиотикотерапии Разработка и использование челночных схем. В течение одного курса, например 5 дней, первые 2 дня назначается один антибиотик, последующие 3 дня используется другой антибиотик. Так как процесс адаптации бактерий занимает некоторое время (от нескольких часов, до нескольких суток) то челночная схема позволяет выдержать необходимую длительность курса и при этом, микрофлора может не успеть адаптироваться. В идеале, можно добиться того, что антибиотик №1 подавляет микрофлору способную разрушить антибиотик №2, либо снизить к нему устойчивость. Мы этот процесс называем последовательным синергизмом. Естественно подбор челночных схем необходимо проводить с использованием специальных тестов на перекрестную антибиотикорезистентность. Обеспечение адекватных доз – назначение заниженных концентраций это верный путь к возникновению устойчивости к антибиотику. Поэтому большой проблемой являеться фальсификация препаратов, снижение концентрации действующего вещества и т.д. Мы предлагаем вводит на птицефабрике самостоятельный контроль качества покупаемого препарата. Для этого необходимо хранить в морозилке растворы антибиотиков в которых вы уверенны (эталоны). При покупке новой партии следует отобрать пробу и развести до такой же концентрации как и в эталонных образцах. После этого на чашку Петри следует посеять газоном чувствительную к антибиотику культуру. На поверхности агара нагретым стеклянным стержнем выплавить лунки, или положить диски из вильтровальной бумаги. Затем необходимо с помощью автоматической пипетки внести в лунки расположенные друг от друга на расстоянии не менее 2-х см. точно по 10 мкл. проб антибиотиков. Если, после инкубации в термостате зона задержки купленного препарата будет меньше чем у эталонного образца, следует ставить вопрос о целесообразности дальнейших закупок у этой фирмы, либо 45 направить образец антибиотика в ВГНКИ для дальнейших судебных разбирательств. 13. Постантибиотические дисбактериозы как фактор реинфицирования. Как следует из таблиц №№ 15 и 16 постантибиотические дисбактериозы могут быть фактором определяющим риск реинфицирования сальмонеллами. В таблице 15 можно подобрать антибиотики пригодные для построения челночных схем антибиотикотерапии сальмонеллезов, либо снижения риска реинфекции при монотерапии одним антибактериальным препаратом. Таблица 15. Чувствительность лактобактерий к антибиотикам Таблица 16. Уровни инфицированности сальмонеллами бройлеров при различной концентрации лактобактерий в толстом отделе кишечника по результатам ПЦР 46 Примечание: ПЦР на микроорганизмы рода Salmonella (+ положительная реакция, - отрицательная реакция), ГЕ/гр. – количественная ПЦР на микроорганизмы рода Lactobacillus в геномных эквивалентах на 100мг фекалий (аналог КОЕ). 12.Изучение радиорезистентности сальмонелл Использование являться методов важным стерилизации фактором, пищевой позволяющим продукции значительно может повысить безопасность продуктов животноводства и снизить риск заражения населения сальмонеллами и рядом других микроорганизмов способных вызывать пищевые токсикоинфекции. Наиболее широко используется стерилизация гамма-излучением, однако, этот способ требует надежного экранирования технологических помещений и небезопасен для персонала, также у этого метода достаточно низкая энергоэффективность. Обработка бета-лучами существенно дешевле, затраты энергии меньше, ввиду низкой проникающей способности бета-частиц, затраты на экранирование технологических помещений существенно ниже. К недостаткам этого способа является незначительная толщина зоны стерилизации. Эффективная глубина стерилизации мясопродуктов, как правило не превышает 1 см. В то же время, основное количество изолятов сальмонелл из мясо-продуктов, выделяется с 47 поверхности тушек птиц и свиней, бактериальная мясопродуктов обычно имеет экзогенный контаминация характер, таким образом, поверхностная стерилизация субпродуктов и мясопродуктов представляется довольно перспективным направлением. Для жидких продуктов и фарша представляется реальной тотальная стерилизация в процессе перекачки этих субстанций по трубочкам диаметром не более 1-2 см. при этом процесс стерилизации каждой новой порции продукта занимает доли секунды. В связи с этим представляет интерес оценка факторов влияющих на эффективность радиационнной стерилизации. Для анализа биологических эффектов вызываемых различными дозами бета-частиц создавали градиент излучения. Градиент ионизирующего излучения (около 10 раз на см) создавался за счет рассеяния пучка электронов на титановой фольге. При этом, возникает поперечная компонента скорости электронов (явление открытое Резерфордом), при этом, пропорционально удалению от оси пучка, происходит уменьшение дозы электронов. Для оценки линейности градиента использовали пластину содержащую химические компоненты темнеющие под воздействием ионизирующего излучения пропорционально дозе. Рис. 12 Линейность градиента оценена по градиенту потемнения dosimetric plate (на графике отражено изменение светимости за счет гашения аутофлюоресценции дозиметрической пластины пропорционально дозе излучения). 48 Как следует из рис 12, предложенным нами способом можно создать участок градиента с линейностью достаточной для проведения исследований, на участке градиента используемого нами для исследований. Корелляция между расстоянием от оси пучка и светимостью аутофлюоресценции пластины составляла k=-0.99. Для тестирования изменения антибиотикорезистентности бактерий, под воздействием градиента доз ионизирующего излучения, на прямоугольную чашку с агаром TCS газоном сеяли S.enterica. На чашку рядками вдоль продольной оси раскладывали диски с антибиотиками на расстоянии друг от друга не менее 3 см. Чашку инкубировали при комнатной температуре 2 ч и облучали электронами (см. выше) так, чтобы направление градиента дозы электронов совпадало с продольной осью чашки. После облучения бактерии инкубировали при 37оС 18ч. Рис. 13 Изменение размеров зон задержки роста к энрофлоксацину, гентамицину и доксициклину S. paratiphi A под воздействием градиента ионизирующего излучения. Из рис. 15 следует, что воздействие ионизирующего излучения на S.paratyphi A сопровождалось увеличением зоны задержки роста к антибиотику 49 тетрациклинового ряда – доксициклину и представителю группы фторхинолоновых антибиотиков (энрофлоксацину). Однако, у другого штамма S. dublin (штамм гусь 09) наблюдается уменьшение зоны задержки роста к доксициклину, устойчивости более сальмонелл к того, отмечается значительный ионизирующему излучению в рост участках прилегающих к дискам с доксициклином. По нашему мнению этот феномен может быть обусловлен тем, что антибиотики тетрациклинового ряда тормозят деление клеток и синтез ДНК, в то время как ионизирующее излучение наиболее опасно для активно пролиферирующих клеток. а) б) Рис. 15 Изменение размеров и формы зон задержки роста S. dublin (штамм гусь 06) к гентамицину. Примечание: а) наибольшая доза излучения б) наименьшая доза излучения Нами было сделано предположение, что градиент ионизирующего излучения может менять не только размер зон задержки роста, но и форму зоны задержки роста, в случае если микроорганизм изменяет свои биологические свойства ионизирующего излучения. даже при небольших изменениях дозы На рис. 3 мы видим, что устойчивость к гентамицину S. dublin (штамм гусь 06) не только возрастала, но и форма зоны задержки роста была изменена, т.е. мы наблюдаем эксцентричность зоны относительно диска с антибиотиком. Из гипотезы предложенной нами следует что, зоны задержки роста должны последовательно уменьшаться или увеличиваться в направлении роста дозы, при этом расстояние противоположных краев деформированной зоны задержки роста, по оси градиента ионизирующего излучения, от центра диска с антибиотиком должно изменяться в том же направлении. 50 D1>D2>Dn (при увеличении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) или D1<D2<Dn (при уменьшении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) где S – диаметр зоны задержки роста к дискам с антибиотиками расположенным продольно оси градиента ионизирующего излучения r1>r2 (при увеличении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) r1<r2 (при уменьшении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) где r1 - расстояние от центра диска с антибиотиком до границы зоны задержки роста по оси градиента ионизирующего излучения в направлении меньшей дозы, r2 - расстояние от центра диска с антибиотиком до границы зоны задержки роста по оси градиента ионизирующего излучения в направлении большей дозы 20.00 мм., градиента дозы 18.00 16.00 14.00 Гентамицин 12.00 Энрофлоксацин1 10.00 Доксициклин 8.00 Энрофлоксацин 2 6.00 4.00 2.00 13 .0 0 13 .0 0 13 .5 0 13 .8 0 14 .0 0 14 .8 0 15 .2 0 0.00 мм., зоны задержки роста Рис.14 Графическая зависимость между величиной зоны задержки роста S.enterica и дозой излучения. Принцип, заложенный в основу метода предложенного нами перекликается с фенотипическим анализом метало-бетта лактамаз методом «двойных дисков». В этом методе также создается градиент фактора подавляющего адаптивные возможности бактерии к повреждающему действию антибиотика, вследствие чего происходит увеличение площади 51 зоны задержки роста в сторону диска содержащего ингибитор металло-бетта лактамаз. Зафиксированные нами изменения свидетельствуют о влиянии антибиотиков на антибиотикорезистентность сальмонелл, что может иметь значение при радиационной стерилизации пищевой продукции и обеззараживания отходов сельскохозяйственного производства. Помимо этого, случаи повышения чувствительности отдельных штаммов сальмонелл к гентамицину, энрофлоксацину и доксициклину свидетельствует о наличии общих механизмов повреждения бактериальной клетки при воздействии ионизирующего излучения и вышеперечисленных антибиотиков, либо нарушении механизмов адаптации. 15. Фаготипирование изолятов сальмонелл Материалы и методы: Для фаготипирования используют типовые штаммы S. enterica, S. enterica и штаммы бактериофагов под коллекционными номерами: 7, 17, 23, 24, 25, 102, 103, 104, 105, 106 из коллекции лаборатории микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины. В качестве твердых питательных сред использовали СПА, содержащий 1,5 %-ного агара (г. Махачкала, Россия). 0,7 %-ный агар (Difco, USA), среды стерилизовали автоклавированием. Бактерии ресуспендируют в 0,9 % NaCI. Для кратковременного хранения бактериальных культур при 6 0С используют чашки Петри с твердой питательной средой. Для длительного хранения при – 70 0С в жидкую среду с бактериальной культурой добавляют глицерин до конечной концентрации 15 %. Бактериофаги хранят при – 15 0С. Для выращивания и титрования бактериофага используют стандартный метод агаровых слоев описанный (А. Грациа, 1936) Техника фаготипирования: Первый этап выявления фагочувствительности бактерий поводят быстрым скринингом бактериофагов: к расплавленному и остывшему до 4546 0С (0,7 %-ного) голодного агара, добавляли 0,1 мл «ночной» бульонной 52 культуры исследуемого штамма бактерии и наносили на плотную питательную среду. После застывания верхнего слоя, на газон бактериальных клеток наносят исследуемые бактериофаги по 5 мкл. Через 18 часов при 37 0 С на поверхности твердой среды бактерий образуют равномерный мутный газон (сплошной рост) бактериальной культуры. В местах, где клетки бактерий оказались чувствительны к бактериофагу, возникают прозрачные зоны лизиса - негативные бляшки (стерильные пятна). Второй этап: Бактериофаги, обладавшие литическим действием, исследуют на эффективность размножения путем титрования. Титрование проводят десятикратным разбавлением препарата содержащего бактериофаг в 0,9 % NaCI. При титровании, определенное количество бактериофага вносят вместе с «ночной» бульонной культурой исследуемого штамма бактерии в остывший до 45 – 46 0С полужидкий агар, перемешивали и равномерно наносили на питательный питательный 1,5 %-ный агар. Рис. 17 Количество разведений зависит от предполагаемой концентрации фаговых частиц в образце. Рис. 17. 3 2 Титрование бактериофага 1 1. Контроль – сплошной газон бактериальной культуры 2. Негативные колонии бактериофага в седьмом разведении 3. Негативные колонии бактериофага в шестом разведении На чашке Петри подсчитывают число колоний и умножают на количество разведений. Концентрацию фаговых частиц выражают в бляшкообразующих еденицах (БОЕ/ мл) Титрование можно проводить и микро методом, представлено на Рис. 18. (а и б), что уменьшает количество чашек и расхода реактивов и материалов. На питательный агар также наносили остывший полужидкий агар с «ночной» 53 культурой бактерий. На поверхность полужидкого (0,7 %-ного) наносили по 5 мкл титрованного раствора бактериофага. представлено 2 штамма агара На рисунке 2 бактериофага с разным диаметром негативных колоний: а) точечные и б) диаметр 1,5 – 2 мм Рис. 18. Титрование бактериофага микрометодом а) б) Концентрацию бактериофага подсчитывают так же, как описано выше с учетом разведения. При исследовании штаммов сальмонелл, было выявлено 8 фаготипов взаимодействия бактериофагов с микроорганизмами, что представлено в таблице 16. Фаготипы характерные для сальмонелл таблица 16 Фаготип I Фаготип II Фаготип III Фаготип IV Фаготип V Фаготип VI ph 7 + + ph 17 + ph 23 + ph 24 + + ph 25 + + ph 102 + + ph 103 + + ph 104 + + ph 105 + + ph 106 + - - - - - - - + - + + + - + + + + + + + - - + + + - - + - + + + + + + + + - + - 54 Фаготип VII Фаготип VIII - - - + + - - + - + + + - + + + + - + - Заключение: Изменения эпидемиологических и эпизоотологических особенностей сальмонеллезов у человека и животных, сопровождающихся ростом инцидентности, появление новых технологий диагностики и профилактики, требует радикального пересмотра существующих средств контроля сальмонеллеза на всех этапах производства пищевой продукции. 55 Литература 1- Ф.Н. Шубин, Н.И. Ковальчук, Н.А. Кузнецов, Г.В. Ревина, А.В. Раков, Д.В. Маслов, Е.М. Нечухаева, Л.К. Гребенькова, Н.Г. Кошелева и Ю.Н. Хорошевская, Г.П. Горшунова, Н.А. Белоголовкиной. «Кишечные инфекции. Предэпидемическая госпитального сальмонеллеза. диагностика Методические и профилактика указания М.У. № 3.1.1.016-2000» Издание официальное. Центр госсанэпиднадзора в Приморском крае Владивосток 2001 С.24 2- А.В. Раков, Ф.Н. Шубин, В.А. Иванис. Кишечные инфекции. Внекишечные проявления сальмонеллезной инфекции. Методические указания М.У. № 3.1.1.0-28-04.Издание официальное. Центр Госсанэпиднадзора в Приморском крае. Владивосток С.23. 2004г. 3- Aguado J.M., Ramos J.M., Garciacorbeira P., Ales J.M., FernandezGuerrero M.L., Soriano F. Clinical spectrum of focal infection by Salmonella no-typhi. // Medicina Clinica, 1994, Vol. 103, P. 293-298. 4- Fukuda, M., and F. Egami. 1971. A reinvestigation of the anomeric configuration of mannose in the antigens of Salmonella groups B, D and E. Eur. J. Biochem. 20:438-441 5- Hellerqvist, C. G., B. Lindberg, A. Pilotti, and A. A. Lindberg. 1970. Structural studies on the O-specific side-chains of the cell-wall lipopolysaccharide from Salmonella strasbourg. Acta Chem. Scand. 24:1168-1174 6- Hellerqvist, C. G., B. Lindberg, S. Svensson, T. Holme, and A. A. Lindberg. 1969. Structural studies on the O-specific side chain of the cell 56 wall lipopolysaccharide from Salmonella typhi and Salmonella enteritidis. Acta Chem. Scand. 23:1588-1596 7- Kauffmann, F. 1975. . Classification of bacteria. Munksgaard, Copenhagen, Denmark. 8- Nghiem, H. O., G. Bagdian, and A. M. Staub. 1967. Études immunochimiques sur les Salmonella. 13. Détermination de la structure du polyoside spécifique d'une Salmonella du group D2 (S. strasbourg). Eur. J. Biochem. 2:392-398 9- Robbins, P. W., and T. Uchida. 1965. Chemical and macromolecular structure of O-antigens from Salmonella anatum strains carrying mutants of bacteriophage . J. Biol. Chem. 240:375-383 10- Yang Hong, Tongrui Liu, Margie D Lee, Charles L Hofacre, Marie Maier, David G White, Sherry Ayers, Lihua Wang, Roy Berghaus and John J Maurer Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologicallycorrelative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles// BMC Microbiology 2008, 8:178doi:10.1186/1471-2180-8-178 11- Jones and Stanley, Salmonella plasmids of the pre-antibiotic era/ J. Gen. Microbiol. 138 (1992), pp. 189–197 12- Norel et al., F. Norel, C. Coynault, I. Mras, D. Hermant and M.Y. Popoff, Cloning and expression of plasmid DNA sequences involved in Salmonella serotype typhimurium virulence, Mol. Microbiol. 3 (1989), pp. 733–743, 1989 13- Lesnick et al., M.L. Lesnick, N.E. Reiner, J. Fierer and D.G. Guiney, The Salmonella spvB virulence gene encodes an enzyme that ADPribosylates actin and destabilizes the cytoskeleton of eukaryotic cells, Mol. Mcrobiol. 39 (2001), pp. 1464–1470. 14- I. Rychlik, D. Gregorova and H. Hradecka Distribution and function of plasmids in Salmonella enterica Veterinary Microbiology / Volume 112, Issue 1, 10 January 2006, Pages 1-10 57 15- Tezcan-Merdol et al., 2001 D. Tezcan-Merdol, T. Nyman, U. Lindberg, F. Haag, F. Koch-Nolte and M. Rhen, Actin is ADP-ribosylated by the Salmonella enterica virulence-associated protein SpvB, Mol. Microbiol. 39 (2001), pp. 606–619. 16- Wallis et al., 1995 T.S. Wallis, S.M. Paulin, J.S. Plested, P.R. Watson and P.W. Jones, The Salmonella dublin virulence plasmid mediates systemic but not enteric phases of salmonellosis in cattle, Infect. Immun. 63 (1995), pp. 2755–2761. 17- Gulig et al., 1992 P.A. Gulig, A.L. Caldwell and V.A. Chiodo, Identification, genetic analysis and DNA sequence of a 7.8-kilobase virulence region of the Salmonella typhimurium virulence plasmid, Mol. Microbiol. 6 (1992), pp. 1395–1411. 18- I. Rychlik, D. Gregorova and H. Hradecka Review: Distribution and function of plasmids in Salmonella enterica / Veterinary Microbiology Volume 112, Issue 1, 10 January 2006, Pages 1-10 19- Hackett et al., J. Hackett, P. Wyk, P. Reeves and V. Mathan, Mediation of serum resistance in Salmonella typhimurium by an 11 kDa polypeptide encoded by the cryptic plasmid, J. Infect. Dis. 155 (1987), pp. 540–549. 20- Friedrich et al., M.J. Friedrich, N.E. Kinsey, J. Vila and R.J. Kadner, Nucleotide sequence of a 13.9-kilobase segment of the 90-kilobase virulence plasmid of Salmonella typhimurium: the presence of fimbrial biosynthetic genes, Mol. Microbiol. 8 (1993), pp. 543–558. 21- Baumler et al., 1996 A.J. Baumler, R.M. Tsolis, F.A. Bowe, J.G. Kusters, S. Hoffmann and F. Heffron, The pef fimbrial operon of Salmonella typhimurium mediates adhesion to murine small intestine and is necessary for fluid accumulation in the infant mouse, Infect. Immun. 64 (1996), pp. 61–68. 22- Rychlik et al., 1998b I. Rychlik, M.A. Lovell and P.A. Barrow, The presence of genes homologous to the K88 genes faeH and faeI on the 58 virulence plasmid of Salmonella gallinarum, FEMS Microbiol. Lett. 159 (1998), pp. 255–260. 23- Valdivia and Falkow, 1997 R.H. Valdivia and S. Falkow, Fluorescence-based isolation of bacterial genes expressed within host cells, Science 277 (1997), pp. 2007–2011. 24- Timoney et al., 1980 J.F. Timoney, D.E. Taylor, S. Shin and P. McDonough, pJT2: unusual HI plasmid in a highly virulent lactose-positive and chloramphenicol-resistant Salmonella typhimurium strain from calves, Antimicrob. Agents Chemother. 18 (1980), pp. 480–482. 25- Ghosh et al., 2000 A. Ghosh, A. Singh, P.W. Ramteke and V.P. Singh, Characterization of large plasmids encoding resistance to toxic heavy metals in Salmonella abortus equi, Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 (2000), pp. 6–11. 26- Hall and Collis, 1995 R.M. Hall and C.M. Collis, Mobile gene cassettes and integrons: capture and spread of genes by site-specific recombination, Mol. Microbiol. 15 (1995), pp. 593–600. 27- Tosini et al., 1998 F. Tosini, P. Visca, I. Luzzi, A.M. Dionisi, C. Pezzella, A. Petrucca and A. Carattoli, Class 1 integron-borne multipleantibiotic resistance carried by IncFI and IncL/M plasmids in Salmonella enterica serotype typhimurium, Antimicrob. Agents Chemother. 42 (1998), pp. 3053–3058. 28- Guerra et al., 2002 B. Guerra, S. Soto, R. Helmuth and M.C. Mendoza, Characterization of a self-transferable plasmid from Salmonella enterica serotype typhimurium clinical isolates carrying two integron-bome gene cassettes together with virulence and drug resistance genes, Antimicrob. Agents Chemother. 46 (2002), pp. 2977–2981. 29- Brown et al., 1991 D.J. Brown, E.J. Threlfall and B. Rowe, Instability of multiple drug resistance plasmids in Salmonella typhimurium isolated from poultry, Epidemiol. Infect. 106 (1991), pp. 247–257. 59 30- Llanes et al., 1999 C. Llanes, V. Kirchgesner and P. Plesiat, Propagation of TEM- and PSE-typebeta-lactamases among amoxicillinresistant Salmonella spp. isolated in France, Antimicrob. Agents Chemother. 43 (1999), pp. 2430–2436. 31- Haneda et al., 2001 T. Haneda, N. Okada, N. Nakazawa, T. Kawakami and H. Danbara, Complete DNA sequence and comparative analysis of the 50-kilobase virulence plasmid of Salmonella enterica serovar Choleraesuis, Infect. Immun. 69 (2001), pp. 2612–2620. 32- Miyahara, N. Ishiwata and Y. Yoshida, StyD4I restriction- modification system of Salmonella typhi D4: cloning and sequence analysis, Biol. Pharm. Bull. 20 (1997), pp. 201–203. 33- Keenleyside and Whitfield, 1995 W.J. Keenleyside and C. Whitfield, Lateral transfer of rfb genes: a mobilizable ColEl-type plasmid carries the rfbO:54 (0:54 antigen biosynthesis) gene cluster from Salmonella enterica serovar Borreze, J. Bacteriol. 177 (1995), pp. 5247–5253. 34- Manon Rosselin, Elisabeth Bottreau, Isabelle Virlogeux-Payant, Pierre-Yves Sizaret, Lily Mijouin, Christian Roy, Pierre Germon, Emmanuelle Caron, Philippe Velge and Agnès Wiedemann «Rck of Salmonella enterica, subspecies enterica serovar Enteritidis, mediates Zipper-like internalization»// Cell Research (2010) 20:647–664. doi:10.1038/cr.2010.45; 35- Bliska, J.B., Falkow, S. (1992) Bacterial resistance to complement killing mediated by the Ail protein of Yersinia enterocolitica. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3561–3565. 36- Hackett, J., Wyk, P., Reeves, P., Mathan, V. (1987) Mediation of serum resistance in Salmonella typhimurium by an 11-kilodalton polypeptide encoded by the cryptic plasmid. J. Infect. Dis. 155, 540–549. 37- Fields, P.I., Swanson, R.V., Haidaris, C.G., Heffron, F. (1986) Mutants of Salmonella typhimurium that cannot survive within macrophages are avirulent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5189–5193. 60 38- Miller, V.L., Beer, K.B., Loomis, W.P., Olson, J.A., Miller, S.I. (1992) An unusual pagC::TnphoA mutation leads to an invasion- and virulence-defective phenotype in salmonellae. Infect. Immun. 60, 3763– 3770. 39- Heffernan, E.J., Harwood, J., Fierer, J., Guiney, D. (1992) The Salmonella typhimurium virulence plasmid complement resistance gene rck is homologous to a family of virulence-related outer membrane protein genes, including pagC and ail. J. Bacteriol. 174, 84–91. 40- Heffernan, E.J., Wu, L., Louie, J., Okamoto, S., Fierer, J., Guiney, D.G. (1994) Specificity of complement resistance and cell association phenotypes encoded by the outer membrane proteins genes rck from Salmonella typhimurium and ail from Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 62, 5183–5186. 41- Chiou, C.-S., and A.L. Jones. 1993. Nucleotide sequence analysis of a transposon (Tn5393) carrying streptomycin resistance genes in Erwinia amylovora and other gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 175:732–740. 42- L'Abée-Lund, T.M., and H. Sørum. 2000. Functional Tn5393-like transposon in the R plasmid pRAS2 from the fish pathogen Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida isolated in Norway. Appl. Environ. Microbiol. 66:5533–5535. 43- Stokes, H.W., L.D. Elbourne, and R.M. Hall. 2007. Tn1403, a multiple antibiotic resistance transposon made up of three distinct transposons. Antimicrob. Agents Chemother. 51:1827–1829. 44- Partridge, S.R., and R.M. Hall. 2003. In34, a complex In5 family class 1 integron containing orf513 and dfrA10. Antimicrob. Agents Chemother. 47:342–349. 45- Walsh, T.R., Toleman, M.A., Poirel, L., Nordmann, P., (2005) Metallo-beta-lactamases: the quiet before the storm? Clinical Microbiology Reviews. Vol.18 (2):306-25. 61 46- Коптев В.Ю., Леонов С.В., Афонюшкин В.Н. Теоретическое и практическое обоснование последовательного применения антибиотиков // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной научно- практической конференции 23-25 сентября 2002 ., Воронеж 2002. 47- Коптев В. Ю. Механизм влияния энтеросорбента ЭСТ-1 на антибиотикоустойчивость E. coli // Сельское хозяйство Сибири на рубеже веков: итоги и перспективы развития. Материалы конференции молодых ученых СО РАСХН 16 мая 2001 г., Новосибирск 2001. 48- Е.В. Дударева Комплексная оценка генетического полиморизма хромосомных и внехромосомных маркеров патогенности Salmonella enterica при помощи пульс-электрофореза/ Е.В. Дударева, А.В.Тронева, Ю.Г.Юшков, М.Л.Филипенко, В.Н.Афонюшкин, С.В.Леонов, В.Ю. Коптев, В.Т.Вольф //Сибирский вестник сельскохозяйственной науки №1, 2010г. – С. 85-88 49- Афонюшкин В.Н. Антибиотикорезистентность сальмонелл в Сибири./ Афонюшкин В.Н., Дударева Е.В., Малахеева Л.И., Филипенко М.Л. //Ветеринария. 2008.№ 1, С. 7-9. 62