УДК 535.37:577.325.3 НЕСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА

УДК 535.37:577.325.3
НЕСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗОЙ, В ВЯЗКИХ СРЕДАХ
Лисица А.Е.,
научный руководитель канд. физ.-мат. наук Немцева Е.В.
Сибирский федеральный университет
Введение
Изучение нестационарной кинетики реакции, катализируемой бактериальной
люциферазой, с одной стороны, вносит вклад в решение фундаментальной проблемы
структурно-динамической организации белков, так как варьируя вязкость среды, можно
получить информацию о конформационных перестройках бактериальной люциферазы в
ходе каталитического акта. С другой стороны, вязкое микроокружение ферментов в
некоторой степени моделирует их состояние внутри клеток. Поэтому данное исследование
приблизит нас к пониманию принципов функционирования ферментов in vivo.
Кроме того, биолюминесцентные реакции широко используются в различных
областях, таких как экологический мониторинг, клинический анализ, в исследовании
экспрессии и регуляции генов, поэтому знание детального механизма работы
биолюминесцентных ферментов имеет и практическое значение.
В основе бактериальной биолюминесценции лежит реакция окисления
восстановленного флавинмононуклеотида и длинноцепочечного альдегида кислородом в
активном центре люциферазы. Этот тип биолюминесценции считается одним из самых
изученных, но всё равно существует целый ряд нерешенных вопросов о механизме его
функционирования. [1] В том числе, недостаточно понятым является организация работы
комплексов биолюминесцентных ферментов в бактериальной клетке, химический
механизм формирования возбужденного интермедиата реакции, а также механизм влияния
модифицированных сред на биолюминесцентную реакцию. Анализ кинетики реакции,
катализируемой бактериальной люциферазой, позволит: 1) определить, на какие этапы
биолюминесцентной реакции влияет вязкость среды; 2) проследить за изменением
активности бактериальной люциферазы с увеличением вязкости среды; 3) определить тип
воздействия вязких сред на биолюминесцентные системы бактерий.
Материалы и методы
В
работе
использовали
флавинмононуклеотид
(FMN)
(Sigma),
этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) (ROTH), люциферазу P. leiognathi (Институт
биофизики СО РАН), тетрадеканаль (MP biomedicals), фосфатный буфер (pH = 7,04),
глицерин (Panreac).
Кинетику биолюминесцентной реакции регистрировали на анализаторе SX-20
(Applied Photophysics), смешивая буферный раствор восстановленного FMN (30 µМ) и
EDTA (0,02 М) с раствором, содержащим люциферазу (2,66 µМ) и тетрадеканаль (7-28 µМ).
Фотовосстановление раствора FMN проводили во внутреннем шприце анализатора SX-20
светом светодиода. Перед фотовосстановлением раствор барботировали аргоном в течение
не менее 15 минут.
Кинетику автоокисления восстановленного флавинмононуклеотида регистрировали
по изменению поглощения на длине волны 450 нм, смешивая буферный раствор
восстановленного FMN (30 µМ) и EDTA (0,02 М) с аэрированным фосфатным буфером.
Аппроксимация кинетических кривых осуществляли при помощи программы,
разработанной на основе Scilab 5.4 в Лаборатории теоретической биофизики ИБФ СО РАН.
Результаты
Были получены кинетические кривые биолюминесцентной реакции в присутствии
различных концентраций глицерина (результаты представлены на рисунке 1).
Рисунок 1 – Кинетические кривые реакции, катализируемой бактериальной
люциферазой, в средах различной вязкости
Видно, что кинетика реакции изменяется: время выхода на максимум увеличивается
с 0,4 с до 1,28 с (что может быть связано с диффузионными затруднениями), спад
интенсивности биолюминесценции для сред с вязкостью 1,5 сП и 2,5 сП остаётся примерно
постоянным, в то время как в среде с высокой вязкостью (5 сП) скорость спада существенно
снижается. Также видно уменьшение максимальной интенсивности биолюминесценции с
ростом содержания глицерина.
Вязкость может воздействовать на ферментативные реакции по двум
принципиальным механизмам: через коэффициент молекулярной диффузии, обратно
пропорциональный вязкости среды, и через снижение конформационной подвижности
фермента, для этого механизма справедлива формула:
𝑘𝑜𝑏𝑠 =
𝑘
ƞ𝛿
𝑟𝑒𝑙
(1)
где δ - константа сопряжения характеризующая чувствительность реакции к
вязкости среды, nrel. Её значения могут варировать от 0 до 1, 0 для реакций ферментов у
которых активный центр изолирован от среды и 1 для ферментов с активным центром
плотно взаимодействующим со средой.
Была получена зависимость максимумов интенсивности от вязкости в двойных
логарифмических координатах, и по тангенсу угла наклона определены константы
сопряжения для различных концентраций альдегида, для 7 µМ δ = 0,7 для 14,1 и 3,53 µМ δ
= 0,8 (рисунок 2).
Рисунок 2 – Зависимость максимальной интенсивности от вязкости при различных
концентрациях альдегида
Полученные константы сопряжения говорят о том, что в ходе каталитиечского акта
наблюдаются конформационные перестройки люциферазы.
Для описания кинетических кривых, была предложена следующая схема,
опирающаяся на предположение, что концентрация альдегида и кислорода не меняются в
ходе реакции, и равновероятную последовательность связывания двух субстратов
люциферазы – альдегида и флавина:
Здесь F – флавинмононуклеотид, L – люцифераза, LF – люцифераза, связанная с
флавинмононуклеотидом, LA – люцифераза, связанная с альдегидом, Lex – люцифераза,
связанная с альдегидом и флавинмононуклеотидом, Lin – инактивированная люцифераза, kd
– константа скорости автоокисления флавина, kp – константа скорости восстановления
инактивированной люциферазы после высвечивания. Аппроксимация экспериментальных
кинетических кривых моделью, построенной на основе данной схемы, дало хороший
результат и позволило оценить константы скорости разных стадий реакций.
Для оценки влияния неферментативного окисления восстановленного FMN на
кинетику реакции были получены кинетические кривые автоокисления этого соединения.
Рассматривая процесс как двухстадийный, была оценена константа скорости
определяющей стадии распада восстановленного флавина как kd = 11 с-1, что хорошо
согласуется с литературными данными [2]. Экспериментальная кривая и полученная
аппроксимация на основе кинетической модели представлены на рисунке 2.
Рисунок 3 - Кинетика окисления восстановленного флавинмононуклеотида
(экспериментальная кривая и модельная аппроксимация)
Таким образом, изучена кинетика реакции, катализируемой бактериальной
люциферазой в средах повышенной вязкости, моделируемых разными концентрациями
глицерина. Установлено, что диффузионные затруднения проявляются в замедлении
выхода свечения на максимум. Зависимость максимальной интенсивности свечения от
вязкости среды указывает на возможное влияние вязкости на конформационные
перестройки люциферазы в ходе катализа
Благодарности
Авторы благодарят Барцева Сергея Игоревича за помощь в работе с математической
моделью. Работа выполнена при частичной поддержке проекта 1762 в рамках
государственного задания Минобрнауки России Сибирскому федеральному университету.
•
•
Список использованной литературы
Shimomura O. Bioluminescence: chemical principles and methods. – World Scientific,
2012.
Abu-Soud H. et al. Stopped-flow kinetic analysis of the bacterial luciferase reaction
//Biochemistry. – 1992. – Т. 31. – №. 15. – С. 3807-3813.