Версия для печати - medical

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Деятельность Системы Терапии Раны Qoustic
против планктонических и биопленочных бактерий в лабораторных условиях
Melissa J. Karau, MLS(ASCP); Kerryl E. Piper, MS; James M. Steckelberg, MD; Steven J.
Kavros, DPM; and Robin Patel, MD
РЕЗЮМЕ
ЦЕЛЬ: цель этого исследования состояла в том, чтобы определить,
убивает ли Система Терапии Раны Qoustic (Arobella Medical, LLC,
Minnetonka, Minnesota) планктонические бактериальные клетки
и/или удаляет бактериальные биопленки.
ПРОЕКТ: Система Терапии Раны Qoustic была оценена в действии
против Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, и
Staphylococcus aureus (планктонические клетки) и биопленки в
пробирке.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ: количество P aeruginosa, S epidermidis, и S
aureus (планктонические клетки), уменьшилось в среднем на 5.10, 4.99,
и 5.22 log10 формирующих колонию единиц/мл, соответственно, за 4
минуты обработки Системой Терапии Раны Qoustic. После 10 минут
обработки, количество P aeruginosa, S epidermidis, и S aureus
биопленок уменьшилось в среднем на 1.34, 1.46, и 1.02 log10
формирующих колонию единиц/мл соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Система Терапии Раны Qoustic, с использованием
Qoustic Qurette, убивает планктонические бактерии и уменьшает
бактериальные биопленки в лабораторных условиях.
ADV SKIN WOUND CARE 2010;23:316-20
ВВЕДЕНИЕ
Система Терапии Раны Qoustic (Arobella Medical, LLC,
Minnetonka, Minnesota), использующая ультразвук низкой
частоты (35 ± 2 кГц), содействует заживлению раны. Она
использует стерильный физраствор (0.9 % ) в качестве
среды для переноса ультразвуковой энергии в ложе раны
через легкий контакт с наконечником аппликатора Qoustic
Qurette. Ультразвуковая энергия, передаваемая через
контактную
среду,
выборочно
анализирует
и
фрагментирует больную и некротическую ткань от
основной здоровой ткани, с последующим вымыванием
физраствором. Выпуклый Qoustic Qurette монтируется к
ручному блоку прибора и обеспечивает двойное действие –
фокусировка ультразвуковой энергии через радиальный
центр купола и акустическое смещение через его края и
наконечник. Система разработана для обработки острых
или хронических ран, включая язвы давления,
артериальные раны, диабетические язвы ноги, ожоги,
воспаления костного мозга, хирургические раны, фистулы и
другие раны, тяжело поддающиеся лечению.
Небольшое количество опубликованных исследований,
использующих другие устройства, показывает преимущества
ультразвука низкой частоты в лечении ран нижних
конечностей. Например, низкочастотная ультразвуковая
система терапии MIST (Celleration, Inc, Inc, Eden Prairie,
Minnesota) продемонстрировала ускорение темпа заживления
повреждений и язв на ногах у пациентов с хронической
серьезной ишемией конечностей1 и ран на нижних
конечностях.2,3 Так же имеется благоприятный опыт работы
с ультразвуком низкой частоты, вырабатываемым Soring
Sonoca Ultrasonic Debridement Device, Sonoca 180 (Soring, Inc,
North Richland Hills, Texas) при лечении хронических ран.4
Опубликованной информации относительно Системы
Терапии Раны Qoustic нет.
Благоприятное воздействие на заживление ран ультразвука
низкой
частоты
могут
быть
установлены
через
многочисленные механизмы. Один из фундаментальных
механизмов - кавитация, посредством чего ультразвуковая
энергия создает и приводит в движение ряд микропузырей в
пределах среды сцепления и жидкостей в пределах
рассмотренных тканей. Другой механизм - излучение,
движение
жидкостей
по
акустическим
границам.
Объединяясь, кавитация и излучение могут затронуть клетки
эукариот, содействуя излечению множеством способов,
включая клеточную вербовку, синтез коллагена, увеличение
предела прочности коллагена, развитие кровеносных
сосудов, сокращение раны, возбуждение фибробластов и
макрофагов, фибринолиз, и/или сокращение воспалительной
фазы и поощрения фазы заживления.5,6 Присутствуют также
тепловые эффекты.
Помимо воздействия на клетки эукариот, ультразвук может
затронуть бактерии, внося свой вклад в выгодную роль в
заживлении раны. Ультразвук продемонстрировал в
зависимости от используемой интенсивности и частоты
разнообразие своих возможностей: увеличение степени
уничтожения биопленочных бактерий антибактериальными и
антисептическими агентами,7 увеличение темпа роста
бактерий, 8 удаление бактериальных биопленок из раневых
поверхностей, и содействие передаче ДНК в бактерии. 9
Ультразвук показал возможности деактивации Грампозитивных и Грам-негативных бактерий в муниципальных
сточных водах.10 Щерба11 продемонстрировал, что
ультразвук на частоте 26 кГц при взаимодействии с водными
суспензиями Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Бациллы
Melissa J. Karau, MLS(ASCP), Kerryl E. Piper, MS, and James M. Steckelberg, MD, work in the Division of Infectious Diseases, Department of Medicine; Steven J. Kavros, DPM, works in
the Department of Orthopedic Surgery; and Robin Patel, MD, works in the Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, and the Division of Clinical Microbiology, Department of
Laboratory Medicine and Pathology; all at the Mayo Clinic College of Medicine, Rochester, Minnesota. Acknowledgments: The authors thank Dr Eliaz Babaev (Arabella Medical, LLC;
Minnetonka, Minnesota) for providing and operating the Qoustic Qurette during the reported studies, and Mark S. Rouse for assistance with the electron microscopic studies. This study
was funded by Arоbella Medical, LLC, Minnetonka, Minnesota. Submitted February 26, 2009; accepted in revised form July 21, 2009.
ADVANCES IN SKIN & WOUND CARE • VOL 23 NO. 7
316
WWW.WOUNDCAREJOURNAL.COM
Copyright © 2010 Lippincott Williams & Wilkins. Unauthorized reproduction of this article is prohibited.
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Прививочный материал 106 P aeruginosa, S
epidermidis, или S aureus был помещен в
стерильный физраствор в пробирку (2 мл) и не
подвергался никакой обработке или воздействию
Qoustic Qurette, погруженной в пробирку без
дополнительного потока физраствора. Чтобы
избегать нагревания, пробирки рассматривали на
льду. (Приблизительная температура раствора
после 4 минут обработки при помощи Qoustic
Qurette была 78°F-90°F.) Через временные
промежутки, составляющие 0.5, 1, 1.5, 2, 3, и 4
минуты, раствор перелили в новую емкость, чтобы
избежать расплескивания образца жидкости по
сторонам пробирки;
количественный подсчет
культуры был выполнен. Тест был проведен
трижды, зарегистрирован средний результат
формирующих колонию единиц (CFU) / мл.
Схема 1.
УНИЧТОЖЕНИЕ ПЛАНКТОНИЧЕСКИХ PSEUDOMONAS
AERUGINOSA, STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS, И
Устранение биопленок P aeruginosa, S
epidermidis, или S aureus
Использовалась реактивная среда Центра
Профилактики
и
Контроля
над
Распространением Заболеваний (BioSurface
Technologies,
Bozeman,
Montana).
Цилиндрические тефлоновые пластины, 12 x
1 мм, использовались для роста биопленок.
Реактор был заполнен 400 мл жидкой средой
на основе сои, с добавлением 1%-ой
глюкозы; 3 колонии S aureus, S epidermidis,
или P aeruginosa помещались в среду.
Реактор биопленок был выведен в режим
37°C при непрерывном взбалтывании в
течение 24 часов. После 24 часов инкубации,
реактивная среда в течение дополнительных
24 часов находилвсь при комнатной
температуре
на
магнитной
пластине
движения.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Subtilis
и
Pseudomonas
aeruginosa
уничтожает
перечисленные бактерии, причем результативность
уничтожения растет вместе с увеличением времени
обработки. Убийство приросших планктонических
бактерий и удаления биопленки бактерий от ложа раны
- потенциальный механизм, которым Система Терапии
Раны Qoustic излечивает раны. Поэтому цель данного
исследования состояла в том, чтобы определить,
способна ли Qoustic Qurette убивать планктонические
бактериальные клетки и/или удалять бактериальные
пленки
МЕТОДЫ
Покрытые биопленкой пластины были
асептически удалены из реактора. Каждую
пластину ополоснули 15 мл стерильного
физраствора (по 7,5 мл на каждую сторону).
Схема 2.
УСТРАНЕНИЕ/УНИЧТОЖЕНИЕ БИОПЛЕНОК
PSEUDOMONAS AERUGINOSA, STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS И STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Уничтожения планктонических P aeruginosa,
Staphylococcus epidermidis, или S aureus при
помощи Системы терапии ран Qoustic
317
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
СХЕМА 3.
СКАНИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ БИОПЛЕНКИ,
ОБРАЗОВАННОЙ
PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ
ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА
СХЕМА 4.
СКАНИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ БИОПЛЕНКИ,
ОБРАЗОВАННОЙSTAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS, ПОЛУЧЕННЫХ
ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА
Группы
обработки
были
подвергнуты
воздействию Qoustic Qurette в 2 режимах - с/без
ультразвука. Устройство находилось ~ 1 мм от
поверхности
бактериальной
пленки
и
обрабатывало всю поверхность в течение 10
СХЕМА 5.
СКАНИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ БИОПЛЕНКИ,
ОБРАЗОВАННОЙ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ
ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА
минут (то есть, по 5 минут на каждую сторону).
22 мл стерильного физраствора в минуту
подавалось в течение всей обработки, в общей
сложности приблизительно для 220 мл (110 мл
на сторону). После обработки, пластины были
помещены в пробирку (1 мл) физиологического
раствора для остаточной культуры.
Остаточные
количества
содержимого
биопленки
были
определены
методом
индивидуального размещения каждой пластины
в пробирку с физраствором (1 мл). Пробирки
были подвергнуты взбалтыванию в течение 30
секунд в Mini vortexer (VWR Scientific, West
Chester, Pennsylvania), режим 7, разрушению
ультразвуком в 40 кГц и 0.33 W/cm2 в течение
5 минут (model 750D; Zenith Ultrasonics,
Norwood, New Jersey), затем - дополнительные
30 секунд взбалтывания. Количественные
показатели культуры в пробирке с образцом
были взяты как средний log10 ФКЕ
(формирующих колонию единиц)/ CFU на
поверхность пластины (cm2) для каждого
тройного набора пластин. 2 группы обработки
были
сравнены
по
параметру
удаление/уничтожение (то есть, log10 CFU/cm2
группы без ультразвука минус log10 CFU/cm2
группы с ультразвуком).
Одна пластина каждого типа организмов от
каждой группы обработки была подвергнута
просмотру электронной микроскопии (SEM) и
софокусной микроскопии.
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
СХЕМА 6.
ЖИВЫЕ/МЕРТВЫЕ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
Исследование сканирующим электронным
микроскопом было выполнено на тефлоновых
пластинах с
использованием электронного
микроскопа Hitachi S-4700 (Hitachi Ltd, Tokyo,
Japan) после закрепления на фиксаторе Trump
(4% формальдегид, 1% глутаральдегид, буферфосфат, pH фактор - 7.2), критическая точка
обезвоживания,
и
покрытие
дисковой
поверхности распылением золота и палладия.
Множественные поля были исследованы в 1000
и 10 000 усилений, и представительные
изображения были зафиксированы.
Для софокусной микроскопии пластины были
подвергнуты окрашиванию живого/мертвого
при помощи, LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen,
Eugene, Oregon); наблюдение проводилось
Софокусным Лазерным Микроскопом LSM510,
оборудованным Axiovert 200M платформой
(Carl Zeiss, Inc, Oberkochen, Германия).
Активизация длины волны для живых
(зеленых) клеток - 488 нм с эмиссией,
собранной через 505-530нм полосовой фильтр;
для мертвых (красных) клеток - 543
нитрометана с эмиссией, собранной через
фильтр длинного прохода 560 нм. Объект - Cапохромат 63 x/1.2 водно-иммерсионная линза
с цифровой апертурой. Множественные поля
были исследованы на каждой стороне
пластины. Представительные изображения
были зафиксированы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Наблюдалось
быстрое
убийство
планктонических P aeruginosa, S epidermidis, и S
aureus сверхзвуковой обработкой (иллюстрация
1). Количество клеток P aeruginosa, S epidermidis,
и S aureus уменьшилось в среднем до 5.10, 4.99, и
5.22 log10 CFU/mL, соответственно (по
сравнению с колонией бактерий без обработки).
После 10-минутной обработки ультразвуком,
биопленки P aeruginosa, S epidermidis, и S aureus
уменьшились в среднем до 1.34, 1.46, and 1.02
log10 CFU/cm2 соответственно (по сравнению с
обработкой только физраствором) (Схема 2).
Изображения,
полученные
сканирующим
электронным микроскопом, показали меньшее
количество
клеток
после
обработки
ультразвуком биопленок P aeruginosa и S
epidermidis по сравнению с обработкой без
применения ультразвука. (3 и 4). При обоих
изученных усилениях, пластины с P aeruginosa
обрабатывались физиологическим раствором,
покрывались биопленкой, но после обработки
ультразвуком видих клеток не оставалось. В
случае с S epidermidis, умеренное количество
бактерий
было
видно
на
пластинах,
обработанных только физраствором, тогда как
после
ультразвуковой
обработки
только
несколько рассеянных клеток было замечено.
Схема 7.
ИЗОБРАЖЕНИЯ ЖИВЫХ/МЕРТВЫХ
БИОПЛЕНОК STAPHYLOCOCCUS
EPIDER
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
др.13 провели эксперимент на крысах, чтобы
СХЕМА 8.
сравнить различные методы лечения ран и
ИЗОБРАЖЕНИЯ ЖИВЫХ/МЕРТВЫХ БИОПЛЕНОК
предотвращения инфекции после закрытия ран,
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
зараженных S aureus. До закрытия, раны
подвергались
хирургической
обработке,
ирригации (промыванию) под давлением,
обработке ультразвуком, вымачиванию. По
сравнению с другими методами ультразвуковое
воздействие
реже
всего
приводило к
увеличению
заражения,
а
также
к
возникновению уплотнений и затвердений. И
хотя авторы работы использовали другое
устройство, результаты, наблюдаемые в
лабораторных условиях, в естественной среде
будут теми же, что и в исследованиях.
В заключение: результаты этого исследования
указывают, что Система Терапии Раны Qoustic
с применением Qoustic Qurette эффетивно
убивает
планктонические
бактерии
и
уменьшает
бактериальные
биопленки
в
лабораторных условиях, обеспечивая тем
самым механизм действия для использования
данной системы в обработке язв давления,
артериальных ран, диабетических язв ноги, язв
венозной
недостаточности,
ожогов,
остеомиелита, для лечения хирургических ран,
фистул и заражений, экземы, а также
нежизнеспособной
(ослабленной)
кожи.
Дальнейшие исследования необходимы для
оценки антибактериального воздействия этого
устройства в лабораторных и естественных
условиях.
Присутствовали полосы очевидно удаленных
ячеек в биопленках S aureus, обработанных
ультразвуком (иллюстрация 5). При 10,000x
ССЫЛКИ
усилении
на
обработанной
ультразвуком
1. Kavros SJ, Miller JL, Hanna SW. Treatment of ischemic wounds with noncontact,
изучаемой пластине с S aureus клетки, казалось,
low-frequency ultrasound: the Mayo Clinic experience, 2004-2006. Adv Skin Wound
были разрушены (иллюстрация 5D).
Care 2007;20:221-6.
2. Kavros SJ, Liedl DA, Boon AJ, Miller JL, Hobbs JA, Andrews KL. Expedited wound
Изображения ЖИВЫХ/МЕРТВЫХ колоний P
healing with noncontact, low-frequency ultrasound therapy in chronic wounds: a
aeruginosa демонстрировали небольшое количество
retrospective analysis. Adv Skin Wound Care 2008;21:416-23.
клеток после обработки физиологически раствором
3. Kavros SJ, Schenck EC. Use of noncontact low-frequency ultrasound in the treatment
of chronic foot and leg ulcerations: a 51-patient analysis. J Am Podiatr Med Assoc
и полноеотсутствие клеток после обработки
2007;97:95-101.
ультразвуком. (иллюстрация 6). Количество клеток
4. Breuing KH, Bayer L, Neuwalder J, Orgill DP. Early experience using low-frequency
S epidennidis после обработки физраствором
ultrasound in chronic wounds. Ann Plast Surg 2005:55(2):183-7.
5. Vicenti FA, Laus JL, Costa Neto JM, et al. Effects of low-intensity pulsed
сократилось
приблизительно
наполовину,
ultrasound on wound healing in corneas of dogs following keratoplasty. Vet
полностью погибая после обработки ультразвуком
Ophthalmol 2003;6: 255-63.
(иллюстрация
7).
Биопленки
S
aureus,
6. Hess CL, Howard MA, Attinger CE. A review of mechanical adjuncts in wound
healing: hydrotherapy, ultrasound, negative pressure therapy, hyperbaric oxygen,
обработанные ультразвуком, также содержали
and electrostimulation. Ann Plast Surg 2003;51:210-8.
больше мертвых клеток, чем те, что не
7. Qian Z, Sagers RD, Pitt WG. The effect of ultrasonic frequency upon enhanced
подвергались
данному
виду
воздействия
killing of P. aeruginosa biofilms. Ann Biomed Eng 1997;25(1):69-76.
(иллюстрация 8).
8. Pitt WG, Ross SA. Ultrasound increases the rate of bacterial cell growth. Biotechnol
ДИСКУССИЯ
Авторы продемонстрировали, что Qoustic Qurette
(производитель - Arоbella Medical, LLC),
уничтожает
планктонические
бактерии
и
сокращает биопленки в пробирке.
Schoenbach и Song12 показали, что в
экспериментально зараженных ожогах крысы
использование
ультразвука
уменьшило
количество бактерий, ослабило оставшиеся,
повысило степень заживления раны. Nichter и
Prog 2003;19:1038-44.
9. Song Y, Hahn T, Thompson IP, et al. Ultrasound-mediated DNA transfer for
bacteria. Nucleic Acids Res 2007;35(19):e129.
10. Drakopoulou S, Terzakis S, Fountoulakis MS, Mantzavinos D, Manios T.
Ultrasound-induced inactivation of Gram-negative and Gram-positive bacteria in
secondary treated municipal wastewater. Ultrason Sonochem 2009:16:629-34.
11. Scherba G, Weigel RM, O'Brien WD Jr. Quantitative assessment of the
germicidal efficacy of ultrasonic energy. Appl Environ Microbiol 1991;57:2079-84.
12. Schoenbach SF, Song IC. Ultrasonic debridement: a new approach in the treatment
of burn wounds. Plast Reconstr Surg 1980;66(1):34-7.
13. Nichter LS. McDonald S, Gabriel K, Sloan GM, Reinisch JF. Efficacy of debridement
and primary closure of contaminated wounds: a comparison of methods. Ann Plast
Surg 1989;23:224-30.