Исследование генетического разнообразия эпидемиологически
advertisement
На правах рукописи Шеховцов Сергей Викторович Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории функциональной генетики, г. Новосибирск Научный руководитель: доктор биологических наук В.А. Мордвинов Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.В. Морозова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск кандидат биологических наук О.Э. Костерин Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск Защита диссертации состоится "__" __________ 2010 г. на утреннем заседании диссертационого совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10; факс 7(383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН Автореферат разослан "__" ___________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Семейство Opisthorchiidae (кл. Trematoda, тип Platyhelminthes) включает в себя паразитов почти всех классов позвоночных, главным образом млекопитающих и птиц. Тремя представителями этого семейства – Opisthorchis felineus, Clonorchis sinensis и O. viverrini – заражены около 30 млн человек в мире (King, Scholtz, 2001) и примерно 300 млн человек находится в группе риска. Кроме того, в некоторых случаях человека могут поражать ряд других видов описторхид. Pseudamphistomum truncatum считается настолько же патогенным для человека, как и O. felineus (Ромашов с соавт., 2005). Есть сообщения, что Metorchis bilis и M. xanthosomus также могут быть опасны для человека (Сидоров, 1983). Несмотря на практическую важность, генетическая изменчивость как представителей сем. Opisthorchiidae, так и кл. Trematoda в целом остается слабо изученной. Главной причиной этого является относительно небольшое (в сравнении, например, с позвоночными и членистоногими) количество признаков для традиционного морфологического анализа; кроме того, многие из этих признаков, например, размер и форма тела, зависят в большей степени от вида организма-хозяина и интенсивности инвазии, чем от генетических факторов. В последние годы широкое паспространение получили различные методы изучения генетического разнообразия последовательностей ДНК. Эти методы зачастую могут выявлять значительно больший природный полиморфизм, чем традиционные методы, основанные на анализе морфологических признаков. Другим плюсом является возможность работать с музейными образцами, небольшими фрагментами тканей (вплоть до отдельных клеток) и различными стадиями жизненного цикла. В последнем случае появляется возможность определять вид паразита на стадии, на которой идентификация с помощью морфометрии невозможна. Для успешного изучения генетического разнообразия описторхид при помощи молекулярных методов прежде всего необходимы исследования изменчивости отдельных последовательностей и выбор наиболее быстро эволюционирущих из них. В связи с этим первоочередной задачей становится определение первичных последовательностей митохондриальных геномов как одних из наиболее быстро эволюционирующих последовательностей ДНК животных (Brown et al., 1987). Цель и задачи исследований Основной целью данного исследования было определение меж- и внутривидовой изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК O. felineus и близкородственных видов - C. sinensis, O. viverrini, M. bilis и M. xanthosomus. В работе были поставлены и решены следующие задачи: 1. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов O. felineus, C. sinensis и O. viverrini и их анализ. 2. Исследование филогенетических взаимоотношений между O. felineus, C. sinensis, O. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus и P. truncatum при помощи митохондриальных и ядерных маркеров. 3. Исследование внутривидовой структуры O. felineus на территории России при помощи митохондриальных маркеров. Научная новизна Разработаны новые ядерные (9й интрон гена парамиозина и гистон H1) и митохондриальные (cox3 и atp6) маркеры описторхид. Усовершенствованы системы использования ранее использовавшихся маркеров cox1 и ITS2. По данным маркерам получены нуклеотидные последовательности образцов O. felineus, C. sinensis, O. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus и P. truncatum и реконструированы филогенетические отношения между этими видами. Впервые проведена реконструкция полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов O. felineus и C. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома O. viverrini. Проведено масштабное исследование генетической изменчивости O. felineus на молекулярном уровне. Практическая значимость работы Полученные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов и ядерных маркеров найдут применение в эпидемиологических исследований в качестве маркеров видов и популяций, а также в медицинских диагностических наборов на основе ДНК. Положения, выносимые на защиту 1. Реконструированные митохондриальные геномы O. felineus, C. sinensis и O. viverrini обладают рядом особенностей, отличающих их от известных митохондриальных геномов трематод. В частности, обнаружены альтернативные структуры для тРНК-Ser(AGN) и отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys этих видов; впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК. В контрольных районах митохондриальных геномов O. felineus и C. sinensis отсутствуют тандемные повторы и шпильки; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирующих регионов этих видов между собой. 2. Схемы филогенетических отношений между исследованными видами описторхид, построенные на основе ядерных и митохондриальных маркеров, различаются. 3. Отсутствуют достоверные различия между популяциями O. felineus на территории России по митохондриальным последовательностям. На основании этих данных выдвинута гипотеза о происхождении популяций O. felineus на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межледниковья. Апробация работы Основные положения диссертации были представлены на: IV Съезде Паразитологического общества РАН (Санкт-Петербург, 2008), на рабочем совещании по программе "Геномика, протеомика, биоинформатика" в рамках проекта "Секвенирование генома возбудителя описторхоза Opisthorchis felineus" (Новосибирск, 2008), на VI Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2008), на отчетной сессии Института Цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2009), на IV Международной конференции молодых учёных "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, 2009), на Всероссийской конференции молодых ученых "Эволюционная и популяционная экология" (Екатеринбург, 2009) и на XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, 2008). Вклад автора Основные результаты работы получены автором самостоятельно. Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 154 источника (в том числе на иностранном языке 135). Работа изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве исходного биологического материала использовались образцы описторхид на стадии мариты либо метацеркарии. Метацеркарии выделяли из второго промежуточного хозяина либо компрессионным методом, либо путем переваривания мышц рыбы в искусственном желудочном соке. Мариты выделяли из печени естественно или искусственно зараженного хозяина (кошек и золотистых хомячков). ДНК из образцов описторхид выделяли или фенольным методом, или перевариванием протеиназой К, или гуанидинизотиоцианатным методом. Электрофорез проводили в 0.5-2% агарозных гелях. Анализ и редактирование хроматограмм проводился программами Chromas v.2.0 и FinchTV v.1.4.0. Для поиска гомологичных последовательностей использовались прогрмаммы серии BLAST, представленные на сервере www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Множественное выравниване последовательностей производилось при помощи программы ClustalW (Larkin et al., 2007). Также использовались программы Genomatix, Virtual Ribosome (Wernersson, 2006), Tandem Repeats Finder (Benson, 1999), MEME и MAST (Bailey, Gribskov, 1998), Primer3, Oligo v.3.3, программы серии VectorNTI Suite 7. Поиск тРНК производился программой tRNAScan. Филогенетический анализ проводился программами PAUP v.4b10 и MEGA v.4.0. Для выбора наилучшей модели нуклеотидных замен использовалась программа ModelTest (Posada, Crandall, 2000). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Секвенирование митохондриальных геномов O. felineus, C. sinensis и O. viverrini Для получения последовательностей митохондриальных геномов используется несколько подходов. Прямой подход – выделение мтДНК – проводится путем мягкого разрушения клеточных стенок с последующим разделением ядер и митохондрий. Он, однако, пригоден лишь при наличии большого количества исходного живого материала, что делает его непригодным для организмов малых размеров, которых нельзя набрать в большом количестве. В таких случаях предпочтительны методы, основанные на ПЦР, что требует предварительного знания хотя бы части последовательностей мтДНК организма. В связи с очень малым весом единичных марит, в качестве исходного биологического материала для получения митохондриальных геномов O. felineus и C. sinensis были использованы пулированые мариты. Для получения тотальной ДНК O. felineus были взяты кошки, пойманной в селе Усть-Тула Болотнинского района Новосибирской области. Для получения тотальной ДНК C. sinensis были взяты мариты, полученные в результате заражения сирийского хомячка метацеркариями из Приморского края. Для получения тотальной ДНК O. viverrini была взята марита из провинции Хон Хаен (Таиланд), предоставленная проф. P. Sithithaworn. Для всех образцов было проведено морфологическое определение. На момент начала исследования были известны: последовательность гена nd2, частичная последовательность гена nd1 и кластера из трех тРНК, находящиеся между ними, для C. sinensis и частичные последовательности генов nd1 и nd3 и находящихся между ними четырех тРНК – для O. viverrini. Сначала были получены короткие фрагменты генов cob, nd5 и nd4 при использовании универсальных праймеров, подобранных путем поиска консервативных сайтов в геномах Fasciops hepatica, Paragonimus westermani и Schistosoma mansoni программой MEME. Затем аналогичным способом были получены последовательности, фланкирующие эти фрагменты. Таким образом, были получены перекрывающиеся ампликоны, вместе составляющие последовательность полного митохондриального генома. За исключением фрагментов генов 16S рРНК, nd5 и некодирующего региона, которые были клонированы, все остальные последовательности получены путем прямого секвенирования ампликонов. Для заклонированных фрагментов было просеквенировано не менее трех клонов каждой последовательности для того, чтобы исключить возможность мутаций, внесенных Taq-полимеразой. Полученные перекрывающиеся последовательности были собраны в программе Vector-NTI. Каждая просеквенированная последовательность исследовалась программами серии BLAST на предмет присутствия схожих последовательностей в нуклеотидных и белковых базах данных. Затем при помощи программы Virtual Ribosome производился поиск рамок считывания. Вторичные структуры части тРНК были найдены программой tRNAScan-SE (Lowe, Eddy, 1997); вторичные структуры остальных тРНК были найдены вручную, используя сравнения последовательностей тРНК описторхид между собой и с тРНК других трематод. Полные митохондриальные геномы O. felineus и C. sinensis имели длину 14277 п.н. и 13875 п.н., соответственно. Таким образом, они являются наиболее короткими из просеквенированных на данный момент геномов трематод. Частичная последовательность митохондриального генома O. viverrini имела длину 12735 п.н. Как и у всех изученных митохондриальных геномов плоских червей, все гены описторхид транскрибировались только с одной кодирующей цепи (Le et al., 2002). В последовательностях геномов O. felineus, C. sinensis и O. viverrini были обнаружены 12 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК и 22 гена тРНК. Порядок расположения генов совпадает с таковым у F. hepatica (Рисунок 1). Как и у F. hepatica (Le et al., 2000), гены nd4L и nd4 перекрывались по разным рамкам считывания на 40 п.н. у всех трех видов. Как и митохондриальные геномы других видов трематод, за исключением P. westermani, митохондриальные геномы описторхид АТбогаты. Но в случае трематод стоит скорее говорить об обогащении кодирующей цепи тимином и гуанином. У всех трех видов наблюдалось обогащение тимином и недостаток аденина и, в особенности, цитозина: при ~42% T в кодирующей цепи наблюдалось всего 12% C. Эта же особенность отмечается и у других митохондриальных геномов трематод, за исключением P. westermani (Le et al., 2004). Различные компоненты митохондриального генома заметно различаются по нуклеотидному составу. Наиболее обеднены цитозиномтретьи позиции кодонов – около 7%. В то же время в генах тРНК тимина заметно меньше, чем в среднем по геному – 35% против 45%. Заметно отличаются по нуклеотидному составу как от средних показателей, так и между собой некодирующие регионы O. felineus и C. sinensis. Рис. 1. Схема строения митохондриальных геномов описторхид. Особенности нуклеотидного состава влияют и на использование кодонов и аминокислот. Так, самыми часто встречающимися кодонами в митохондриальных геномах описторхид являются ТТТ, GTT и TTG. ТТТ составляет почти 10% всех кодонов, в то время как все кодоны, содержащие только А и С, составляют около 2%. Аминокислоты, в первых и вторых позициях которых присутствуют T или G (Cys, Phe, Gly, Leu, Val и Trp), составляют почти 50% от всех аминокислот, а аминокислоты, в первых и вторых позициях которых присутствуют А или С (His, Lys, Asn, Pro, Gln и Thr ) – только около 10%. В качестве старт-кодонов в митохондриальных геномах описторхид используются ATG и GTG, необычных старт-кодонов (например, GTТ, который был найден у цестоды Hymenolepis diminuta (Le et al., 2002)), обнаружено не было. При установлении рамки считывания выбирался старт-кодон, при котором длина некодирующей последовательности между исследуемым геном и предшествующим ему минимальна. Иногда присутствовало несколько альтернативных старт-кодонов на небольшом расстоянии друг от друга. Стоп-кодонами являлись TAG и ТАА, что также типично для трематод. У гена nd1 O. viverrini стоп-кодон TAG перекрывался с последующим геном тРНК-Asn на 1 пн; таким образом, нельзя исключить возможность, что этот кодон на самом деле является укороченным и достраивается до стоп-кодона TAA путем полиаденилирования транскрипта (Ojala et al., 1981). В митохондриальных геномах O. felineus и C. sinensis было обнаружено по 22 гена тРНК. В частичной последовательности митохондриального генома O. viverrini было обнаружено 20 генов тРНК. Структура тРНК описторхид сходна с таковой у прочих многоклеточных животных. Длина тРНК составляет от 59 до 72 нуклеотидов, у большинства – 63-67 нуклеотидов. У тРНК-Cys всех трех видов отсутствует DHU-петля. Известно, что DHU-петля у тРНК-Cys присутствует у F. hepatica и P. westermani, в то время как для различных видов шистосом характерно как ее наличие, так и отсутствие (Littlewood et al., 2006). Как и у большинства многоклеточных животных, у всех трех видов описторхид DHU-петля тРНК-Ser(AGN) отсутствует. У многих многоклеточных животных, и у всех трематод, чей геном известен, отсутствует и DHU-петля тРНК-Ser(UCN). В случае наших видов, у O. felineus и C. sinensis возможны две альтернативные структуры тРНКSer(UCN), без DHU-петли и с ней; в последнем случае наблюдается перекрытие 3 пн с предыдущим геном тРНК-Leu(CUN) (Рисунок 2). В Рис. 2. Альтернативные структуры тРНК-Ser(UCN) O.felineus, C. sinensis и O. viverrini. случае тРНК-Ser(UCN) O. viverrini возможны две структуры, обе из которых способны к формированию DHU-петли. Некодирующие регионы O. felineus и C. sinensis разделены на 2 части неравной длины геном тРНК-Gly (Рисунок 3). Некодирующий регион между генами тРНК-Gly и cox3 имеют длину 78 и 67 п.н. у O. felineus и C. sinensis, соответственно, и не содержат каких-либо структурных особенностей. Участки между генами тРНК-Gln и тРНК-Gly значительно длиннее – 561 и 153 п.н., соответственно. В этом длинном некодирующем регионе у O. felineus было обнаружено 30 повторов ТА-микросателлита и длинная открытая рамка считывания длиной 402 п.н., в то время как у C. sinensis никаких особенностей данный район не содержал. Рис. 3. Схема строения некодирующих регионов O. felineus и C. sinensis. LNR длинный некодирующий регион, SNR - короткий некодирующий регион. У млекопитающих некодирующий регион содержит ориждин репликации, промотор полицистрона митохондриальных генов, консервативные CSB- и TAS-элементы, а также участки, спообные к формированию тРНК-подобных структур (Shadel, Clayton, 1997). У всех изученных до сих пор цестод эти участки содержат участки, способные к формированию шпилек, а у трематод – длинные тандемные повторы (Le et al., 2002). Предположительно, эти структуры необходимы репликации или транскрипции мтДНК. У O. felineus и C. sinensis, однако, не было обнаружено ни длинных тандемных повторов, ни участков, способных формировать шпильки. Не было обнаружено и каких-либо консервативных участков, присутствующих у обоих видов. Из этого можно сделать вывод, что ни тандемные повторы, ни шпильки, ни консервативные мотивы не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид. Следует, однако, подчеркнуть, что даже у млекопитающих его функционирование изучено слабо, так что окончательных выводов без поддержки экспериментальных данных сделать пока нельзя. Интересно, что открытая рамка считывания в некодирующем регионе обнаруживается также у F. hepatica и у моногенеи Microcotyle sebastis (Park et al., 2007). Однако, последовательности некодирующего региона O. felineus не имеют сходства ни с этими рамками, ни с какимилибо другими последовательностями в базах данных. Это оставляет открытым вопрос о ее функциональности. Филогеография O. felineus Для изучения внутривидовой изменчивости O. felineus были использованы образцы из 13 географических точек (Рисунок 4, Таблица 1). Для исследования внутривидовой изменчивости O. felineus нами были подобраны праймеры для последовательности, включающей в себя 3' конец гена cox3 (561 пн), частичную последовательность (26 пн) гена тРНК-His и участок длиной 54 п.н., находящийся между ними; этот маркер в дальнейшем будем для краткости называть просто cox3. Для исследования был выбран именно данная последовательность, так как она наряду с последовательностью гена cox3, более изменчивого, чем традиционно используемый для описторхид cox1, включает в себя и самый длинный (после LNR и SNR) некодирующий спейсер. Ожидалось, что этот участок будет более изменчив, чем кодирующая последовательность, что и подтвердилось впоследствии: в данном спейсере были выявлены мутации в 18,5% нуклеотидов по сравнению с 8,7% для последовательности гена cox3. Рисунок 4. Точки сбора образцов O. felineus. Серым цветом показан ареал O. felineus. В результате были получены 135 последовательностей cox3 из 13 популяций (Таблица 1). Всего в этой выборке последовательностей был обнаружен 55 гаплотипов. Из 64 вариабельных сайтов 49 приходились на кодирующую последовательность гена cox3, 5 – на тРНК-His и 10 – на Рисунок 5. Сеть гаплотипов O. felineus. Цифры означают количество образцов, имеющих данный гаплотип; пустой кружок означает, что данный гаплотип представлен одним образцом. Точками обозначены отсутствующие образцы. Таблица 1. Характеристика исследованных популяций O. felineus. Номера популяции соответствуют точкам, указанным на карте. Главный гаплотип количество образцов в данной популяции, имеющих главный гаплотип; GD ± SD – галотипическое разнообразие и его стандартное отклонение; π ± SD – нуклеотидное разнообразие и его стандартное отклонение. Номер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Популяция Новосибирск Томск Куйбышев Черлак Тобольск ХантыМансийск Сургут Шеркалы Мехонское Сакмара Илек Сыртинское Воронеж Вся выборка Образцов Гаплотипов 17 14 11 1 19 9 8 5 1 15 Главной гаплотип 7 7 7 1 4 9 8 6 8 1 14 11 16 135 5 7 4 5 1 7 6 6 55 4 2 3 3 0 6 5 10 59 GD ± SD π ± SD 0.846 ± 0.089 0.769 ± 0.120 0.618 ± 0.164 0.003 ± 0.002 0.002 ± 0.001 0.001 ± 0.001 0.965 ± 0.036 0.004 ± 0.003 0.833 ± 0.127 0.964 ± 0.077 0.800 ± 0.172 0.893 ± 0.111 0.001 ± 0.001 0.003 ± 0.002 0.002 ± 0.001 0.003 ± 0.002 0.835 ± 0.101 0.818 ± 0.119 0.625 ± 0.139 0.811 ± 0.037 0.002 ± 0.002 0.003 ± 0.002 0.001 ± 0.001 0.002 ± 0.002 из 50 были представлены всего одним образцом, 7 гаплотипов – двумя, два – тремя и два – шестью образцами. межгенный промежуток. 34 из 49 вариабельных сайтов, приходящихся на ген cox3, приводят к синонимичным заменам; чаще всего встречаются транзиции С<>Т, приходящиеся на третью позицию кодона. Большинство минорных гаплотипов отличались от главного однойдвумя заменами. Исключения составляют гаплотипы spSUOr03-04 (Сыртинское), ofOpNk05-24 (Новосибирск), spToTu03-02 и spToTu03-06 (Тобольск), образующие группу и заметно (5-6 замен) отличающиеся от главного гаплотипа. Величины нуклеотидной и гаплотипической изменчивости для каждой популяции и для выборки в целом представлены в Таблице 1. Для выборки в целом нуклеотидная изменчивость мала, в то время как гаплотипическая изменчивость имеет достаточно высокие значения. По Avise (2000), это может свидетельствовать о быстрой экспансии популяции, имевшей изначально малый эффективный размер; т.е. время экспансии было достаточным для появления новых гаплотипов, но мало для накопления значительного количества замен. Попарные значения коэффициэнта генетической дифференциации FST для всех изученных популяций представлены в Таблице 2. Видно, что они для большинства популяций близки к нулю и лишь в двух случаях, кроме двух, p-value значений FST не является значимым. Точный тест дифференциации популяций (Exact test of population differentiation) не выявил достоверной дифференциации ни для одной пары популяций. Дисперсионный анализ (AMOVA) показал, что 99% всех различий приходятся на разнообразие внутри популяций и лишь 1% – на различия 0.03 - 0 0 0 0 0 0 0.01 0 0.02 0.07 0 0 0 0 0 0 0.02 0 0 0 0 0 0 0 0 0.01 0.01 0.08* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.08 0 0 0 0 0 Илек Сургут Мехонское 0 0 0 0 0.02 Сыртинское 0 0.07* ХантыМансийск Тобольск Томск 0 0 0.01 Шеркалы Новосибирск Куйбышев Томск Тобольск ХантыМансийск Мехонское Сургут Шеркалы Сыртинское Илек Воронеж Куйбышев Новосибирск Таблица 2. Попарные значения коэффициэнтов FST для изученных популяций O. felineus. * – значение является достоверным с вероятностью 0,95. 0 между популяциями. Это свидетельствует о том, что, по-видимому, даже на такой значительной территории популяции O. felineus почти не отличаются друг от друга генетически. С целью проверки гипотезы о прохождении популяцией O. felineus недавнего бутылочного горлышка был проведен тест распределения попарных замен (mismatch distribution). Распределение попарных различий было унимодальным, наблюдаемое распределение отличалось от ожидаемого лишь незначительно; p-value как индекса шероховатости (raggedness index), так и суммы квадратных отклонений были незначительными ( < 0,05). Это подтверждает гипотезу о недавней популяционной экспансии O. felineus. Параметр τ, оценивающий время начала экспансии, для всей нашей выборки составил 1,38 (1,09 – 1,67 при 5% отклонении). Как известно, τ = 2ut, где u – скорость мутации, а t – время дивергенции в поколениях. К сожалению, на данный момент мы не можем достаточно точно оценить ни скорость мутации мтДНК O. felineus, ни среднюю продолжительность его поколения. Если же мы примем наиболее распространенную оценку для cox1 позвоночных (2% замен/млн лет, т.е. 6,41*10-6 замен/сайт/год (Brown et al., 1987)) и примем время поколения равному 1 году, то получим оценку в 108 000 (85 000 – 130 000) лет. Эти цифры хорошо согласуются с приведенными для ряда других видов, обитающих на той же территории: 125 000 (85 000 – 151 000) лет для лесного лемминга Myopus schisticolor (Fedorov et al., 2008) и 106 000 (38 000 – 138 000) лет для красного лесного муравья Formica lugubris (Goropashnaya et al., 2004). Если считать верной оценку времени начала демографической экспансии для O. felineus и ряда упомянутых выше видов, то можно утверждать, что эти виды прошли бутылочное горлышко, скорее всего, во время московского оледенения, с последующей экспансией во время микулинского межледниковья – около 125 000 лет назад. Филогения видов сем. Opisthorchiidae Для исследования филогенетических отношений между видами сем. Opisthorchiidae мы использовали несколько различающихся по происхождению и скорости эволюции последовательностей. Внутренний транскрибируемый спейсер рибосомального кластера (ITS2) - наиболее часто используемый для исследования филогенетических отношений трематод ядерный маркер. Так как степень его изменчивости не всегда достаточна для надежного исследования филогенетических отношений, мы разработали более изменчивые ядерные маркеры - Pm-int9, включающий в себя девятый интрон гена парамиозина с фланкирующими экзонными последовательностям, и H1 - частичная последовательность гена гистона H1, содержащая экзонные и интронные последовательности, а также 3'UTR. Кроме того, мы использовали частичную последовательность митохондриального гена cox1, которая также была использована в ряде работ по видам сем. Opisthorchiiae (Pauly et al., 2003; Pick, 2005). Филогенетический анализ был проведен при помощи методов ME (минимальной эволюции), NJ (метод ближайших соседей), MP (максимальной парсимонии) и ML (максимального правдоподобия) при помощи программ PAUP v.4b10 (Swofford, 2003) и MEGA v.4.0 (Tamura et al., 2007). Мы проводили укоренения деревьев при помощи последовательностей различных видов из близкородственных семейств и выявили сильное влияние внешней группы на получающееся дерево, что является следствием насыщения заменами. Вследствие этого мы использовали в филогенетическом анализе либо неукорененные деревья, либо деревья, укорененные на среднюю точку. Для выбора наилучшей модели нуклеотидных замен использовалась программа ModelTest (Posada, Crandall, 2000). Взаимоотношения родов Opisthorchis и Clonorchis O. felineus, O. viverrini и C. sinensis – весьма близкие друг к другу виды. Относительно филогенетических взаимоотношений этих видов существует две точки зрения. Согласно первой, O. felineus и O. viverrini ближе друг к другу, чем к C. sinensis. Эта точка зрения основана на строении марит: У O. felineus и O. viverrini яичники цельнокрайние или неглубоко лопастные, не заходят за кишечные стволы, в то время как у C. sinensis яичники древовидно разветвленные, заходящие за кишечные стволы. Согласно другой точке зрения, O. viverrini и C. sinensis ближе друг к другу, чем к O. felineus. В пользу этой точки зрения говорят следующие аргументы: а) Экскреторные формулы (количество протонефридиев) на стадиях метацеркарии и церкарии у C. sinensis и O. viverrini формула имеет вид 2[(3+3)+(3+3+3)]=30, в то время как у O. felineus она имеет вид 2[(5+5)+(5+5+5)]=50 для церкарии и 2[(6+6)+(6+6+6)]=60 для метацеркарии (Посохов, 2004). б) Число желез проникновения у церкарий также различно: 20 у O. felineus и 14 у O. viverrini и C. sinensis. Рядом авторов был проведен филогенетический анализ при помощи молекулярных методов. По данным Kang et al. (2008) основанным на последовательностях ITS1, O. felineus оказался ближе к O. viverrini, а по данным Saijuntha et al. (2008), строивших свой анадиз на последовательностях митохондриального гена nd1 – ближе к C. sinensis. Мы провели более глубокий анализ с использованием дополнительных локусов (Pm-int9 и H1) и пришли к выводу, что C. sinensis и O. viverrini объединяются в одну ветвь с довольно высокой бутстрепной поддержкой Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное по конкатенированным последовательностям ITS2+Pm-int9+H1 методом ME. Цифры означают бутстрепную поддержку соответствующей ветви. (Рисунок 6). Это говорит в пользу мнения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis. В деревьях, построенных по частичной последовательности митохондриального гена cox1, надежно выделялись только ветви, включающие в себя представителей одного вида или группы образцов; связей более высокого уровня выявлено не было. Неожиданным оказалось то, что O. viverrini отличался от O. felineus и C. sinensis сильнее, чем меторхины. Так как эта карина отличалась от ожидаемой, было проведено секвенирование нескольких других митохондриальных локусов (16S+cob+nd4+nd2) общей длиной 1943 пн. На этом наборе данных была выявлена та же закономерность. Такое расхождение генетических расстояний между митохондриальными геномами с взаимоотношениями между данными видами описторхид, полученным по морфологическим признакам и ядерным последовательностям позволяет нам утверждать, что митохондриальные последовательности не отражают филогенетических отношений представителей сем. Opisthorchiidae и не должны быть использован в качестве филогенетического маркера в данном семействе. Этот феномен является результатом особенности эволюции мтДНК в пределах данного семейства, что может быть результатом ускоренной эволюции мтДНК O. viverrini или интрогрессией мтДНК вследствие межвидовой гибридизации. Взаимоотношения между видами рода Metorchis Из 14 видов рода Metorchis наиболее часто встречаются и лучше всего изучены M. bilis и M. xanthosomus (Скрябин, Петров, 1950). Мариты этих видов плохо отличимы друг от друга морфологически (Ромашов с соавт., 2003). Так, в работе Pick (2005), посвященной изучению генетического разнообразия M. bilis, среди последовательностей cox1 M. bilis была обнаружена одна последовательность M. xanthosomus. Нашей задачей было исследовать образцы представителей рода Metorchis из Новосибирской и Челябинской областей. Рисунок 7. Филогенетическое дерево, построенное по конкатенированным последовательностям cox1 методом ME. Цифры означают бутстрепную поддержку соответствующей ветви. Среди исследованных образцов были обнаружены на основании высокой степени сходства их последовательностей cox1 с последовательностями cox1 образцов соответствующих видов из Германии представители видов M. bilis и M. xanthosomus. Но кроме того, последовательности cox1 части образцов выделялись на филогенетических деревьях в отдельную ветвь. Можно утверждать, что, судя по генетическим расстояниям между последовательностями cox1, эти образцы могут быть отнесены к другому виду. Таким образом, мы можем утверждать, что нами обнаружен криптический вид рода Metorchis, почти неотличимый от M. bilis и M. xanthosomus. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в ходе работы была проведена реконструкция полных последовательностей митохондриальных геномов O. felineus и C. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома O.viverrini, в которых были идентифицированы все характерные для митохондриальных геномов трематод гены (12 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК и 22 гена тРНК). Было проведено генотипирование собранной коллекции образцов разных видов описторхид по нескольким ядерным и митохондриальным маркерам, что позволило сделать заключения о филогенетических отношениях видов сем. Opisthorchiidae, а также о происхождении популяций O. felineus на территории России. ВЫВОДЫ 1. Митохондриальные геномы O. felineus, C. sinensis и O. viverrini имеют стандартный для трематод набор генов и порядок их следования, совпадающий с таковым у F. hepatica. Обнаружены альтернативные структуры для тРНК-Ser(AGN) O. felineus, C. sinensis и O. viverrini. Выявлено отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys O. felineus, C. sinensis и O. viverrini. Впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК. 2. В контрольных районах митохондриальных геномов O. felineus и C. sinensis отсутствуют тандемные повторы и шпильки; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирующих регионов этих видов между собой. Это позволяет заключить, что ни консервативные мотивы, ни тандемные повторы, ни особенности вторичной структуры не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид. 3. Данные филогенетического анализа подтверждают предположения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis. 4. Показано, что схема филогенетических отношений O. viverrini с другими описторхидами, полученная по митохондриальным маркерам, не совпадает с таковой по ядерным маркерам и по морфологическим признакам. Это, предположительно, является следствием ускоренной эволюции мтДНК у данного вида или интрогрессии митохондриального генома от другого вида. 5. При помощи филогенетического анализа наряду с представителями видов M. bilis и M. xanthosomus обнаружен еще один криптический вид рода Metorchis. 6. Анализ изменчивости митохондриальной последовательности, включающей в себя частичную последовательность гена cox3, межгенного спейсера и гена тРНК-His, у 135 образцов из 13 популяций O. felineus из трех речных систем (Дон, Урал и Обь-Иртышская система) показал отсутствие достоверных различий между этими популяциями. Данные позволяют выдвинуть гипотезу о происхождении популяций O. felineus на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межледниковья. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. The complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda) // Parasitology International. 2010. V. 59. P. 100-103. 2. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Romanov K.V., Besprozvannykh V.V, Fedorov K.P. , Yurlova N.I., Serbina E.A., Sithithaworn P., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) // Parasitology Research. 2009. V. 106 P. 293297. 3. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama F., Махнева Т.В., Пельтек С.Е., Мордвинов В.А. Оценка генетических отличий Opisthorchis felineus от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis по ITS2- и CO1-последовательностям // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421. № 4. С. 549-552. 4. Мордвинов В.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Шеховцов С.В., Демаков С.А., Катохин А.В., Колчанов Н.А., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома возбудителя описторхоза, Opisthorchis felineus // Живые системы. № 1. С. 95-100. 5. Патент на изобретение № 2332456. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Шеховцов С.В., Пельтек С.Е. Фрагмент FR316 митохондриального гена nd1, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза. Приоритет изобретения 05 декабря 2006 г. 6. Шеховцов С.В., Катохин А.В., Конков С., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Беспрозванных В.В., Охияма Ф., Сититаворн П., Локтев В.Б., Мордвинов В.А. Исследование генетического разнообразия описторхид - O. felineus, O. viverrini, C. sinensis и M. bilis // «Паразитология в XXI веке – проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С.223-226. 7. Katokhin A., Shekhovtsov S., Konkow S., Yurlova N., Serbina E., Vodianitskaia S., Fedorov K., Besprozvannykh V., Ohyama F., Peltek S., Mordvinov V. Analysis of Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda, Digenea, Opisthorchiidae) ITS2 and CO1 Sequences Variations // XX International Congress of Genetics. Berlin. 2008. p 235. 8. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Konkow S., Yurlova N.I., Serbina E.A., Vodianitskaia S.N., Fedorov K.P., Besprozvannykh V.V., Ohyama F., Sithithaworn P., Loktev V.B., Mordvinov V.A. Comparative phylogenetic analysis of opisthorchiid species based on nuclear and mitochondrial sequences // Proceedings Of The Sixth International Conference On Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure. 2008. p. 735. 9. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Романов К.В., Брусенцов И.И., Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Федорова 1520 сентября 2009 г. Новосибирск. 2009. С. 121-123. 10. Шеховцов С.В. Изменчивость митохондриального генома у кошачьей двуустки на территории России // Матерiали IV Мiждународноi конференицii молодих науковцiв «Бiология: вiд молекули до бiосфери». Харкiв. 2009 г. С. 153-154.