диагностика бактерий erwinia amylovora методом

ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИЙ ERWINIA AMYLOVORA МЕТОДОМ ПЦР С
ПРАЙМЕРАМИ К ГЕНУ HRPN
В.Ю. ЛАГОНЕНКО, А.Л. ЛАГОНЕНКО, Е.А. НИКОЛАЙЧИК, А.Н. ЕВТУШЕНКОВ
Кафедра молекулярной биологии, Биологический факультет, Белорусский государственный
университет
Бактерии Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. являются возбудителями
бактериального ожога многих экономически значимых растений семейства Rosaceae. На
данный момент уже разработано довольно большое количество методов диагностики этого
фитопатогена. Классические тесты основаны на микробиологических (полуселективные
среды) и иммунологических (ELISA, иммунофлюоресценция, реакция агглютинации)
методах. [1; 11]. Значительно более быстрой и чувствительной является диагностика E.
amylovora, основанная на ПЦР амплификации специфичных фрагментов ДНК с праймерами к
региону повторов на плазмиде pEA29 или хромосомальным ams генам [2; 3]. Разработаны
также различные модификации методов молекулярной детекции E. amylovora, такие как realtime PCR, nested PCR, PCR-ELISA [4; 8; 10; 12]. Большинство этих методов основаны на
амплификации фрагмента pEA29, однако недавно были обнаружены вирулентные штаммы,
лишенные этой плазмиды [9]. Данная работа посвящена разработке альтернативного метода
молекулярной диагностики, применимого для детекции и идентификации клеток E.
amylovora. Этот метод основан на амплификации хромосомального гена hrpN. Этот ген
кодирует белок харпин, описанный в литературе как компонент системы секреции третьего
типа и важнейший фактор вирулентности E. amylovora [14].
Выделение ДНК, рестрикцию, лигирование, электрофорез в агарозном геле и
трансформацию проводили в соответствие со стандартными протоколами [13]. Экстракцию
ДНК из растительного материала проводили как описано P.Llop [7]. Амплификацию гена
hrpN E. amylovora осуществляли с праймерами Eam1 (5’gaggaataccatatgagtctgaatacaagtg3’) and
Eam2 (5’agcgtcgaccagcttgccaagtgccat3’). Реакцию осуществляли в объеме 20 мкл, с 0,2 ед Taqполимеразы, 0,2 мМ дНТФ, 16 мМ сульфата аммония, 10 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 1,5 – 3,5 мМ
MgCl2, 50 мМ KCl, 0,001% желатина, по 10 пкМ каждого праймера. Параметры реакции: 94°С
5 мин, затем 35 циклов 94°С 30 сек, 55°С 30 сек, 72°С 1,5 мин и 1 цикл 72ºС 5 мин.
Амплификацию фрагмента плазмиды pEA29 E. amylovora с праймерами А и В проводили как
описано ранее [2].
Для определения специфичности метода, на первом этапе работы пара праймеров Eam1
и Eam2 была протестирована на чистых культурах 38 штаммов фитопатогенных, условно
фитопатогенных и сапрофитных бактерий. В случае 17 штаммов Erwinia amylovora,
выделенных на территории Беларуси, Германии и Великобритании, был амплифицирован
фрагмент ДНК, соответствующий по размеру гену hrpN (1,2 т.п.н.). При использовании в
качестве матриц для ПЦР хромосомных ДНК других видов, никаких визуально
детектируемых фрагментов не амплифицировалось (Рисунок 1).
Кроме того, специфичность праймеров Eam1 и Eam2 была оценена с помощью
программы Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Среди нуклеотидных
последовательностей микроорганизмов, доступных в базе данных GeneBank, кроме
последовательностей генов hrpN Erwinia amylovora, были выявлены лишь
последовательности генов hrpN бактерий Erwinia pyrifoliae, потенциально способные
амплифицироваться с помощью праймеров Eam1 и Eam2.
Рисунок 1 – ПЦР продукты, полученные после амплификации с праймерами Eam1
и Eam2 к гену hrpN Erwinia amylovora. 1 - Erwinia amylovora 1/79Sm, 2 - Erwinia amylovora
LMG 2024, 3 - Erwinia amylovora E3, 4 - Pseudomonas fluorescens, 5 - Pseudomonas aeruginosa,
6 - Pseudomonas putidae, 7 - Erwinia carotovora JN42, 8 - Pantoea agglomerans 208, 9 Pseudomonas syringae B-1027, 10 - Pseudomonas syringae pv. tomato B-8290, 11 - Pseudomonas
syringae pv. lacrymans B-1059, К – отрицательный контроль, M – ДНК маркер (GeneRuler
DNA ladder mix, Fermentas).
Бактерии Erwinia pyrifoliae вызывают некрозы азиатской груши Pyrus pyrifolia Nakai
(при искусственном заражении поражает P. communis, но не растения родов Cotoneaster,
Crataegus, Malus, Prunus, Rubus) и выявлены только на территории Кореи и Японии, что
сводит на нет вероятность ложно-положительного результата ПЦР диагностики
применительно к образцам яблони и груши, отобранным на территории Беларуси.
Аналогичные результаты были получены при использовании стандартной пары праймеров
A/B (таблица 1).
Ранее мы продемонстрировали идентичность RFLP профилей продуктов амплификации
с праймерами Eam1 и Eam2 с использованием рестриктаз EcoRV, PvuII и AvaI. Для более
точного подтверждения амплификации гена hrpN, ПЦР продукт, амплифицированный с
использованием хромосомной ДНК штамма E. amylovora LMG2024 был клонирован в
векторе pUC18 и частично секвенирован. Секвенированный фрагмент размером 500 п.о. был
100% идентичен последовательностям генов hrpN бактерий E. amylovora USAW004, 1/79,
EaMR1, EaCa1-95 (коды доступа AY999003, AJ579689, AJ579692 and AJ579690
соответственно).
Для определения чувствительности диагностической процедуры при работе с
растительными образцами, к навескам (30 мг) листьев, стеблей и цветков яблони перед
экстракцией добавляли по 20 мкл серии разведений суспензии клеток Erwinia amylovora E3.
Выделенную ДНК растворяли в 20 мкл дистиллированной воды, 1 мкл использовали в
качестве матрицы для ПЦР (рисунок. 2).
Таблица 1 – Штаммы бактерий, использованные в работе и результаты амплификации
хромосомных ДНК этих бактерий с диагностическими праймерами Eam1/Eam2 и A/B
Вид
Erwinia amylovora
Erwinia сarotovora
Erwinia сarotovora
subsp. atroseptica
Erwinia chrysanthemy
Pantoea agglomerans
Pseudomonas syringae
pv. syringae
Pseudomonas syringae
pv. tomato
Pseudomonas syringae
pv. lacrymans
Pseudomonas
corrugata
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas putida
Clavibacter
michiganensis subsp.
michiganensis
Штамм
Источник, год и место изоляции
1/79
LMG2024
E1
E2
E3
E4
E5
L3-1
L3-2
L3-5
L3-6
L3-8
L13
612
646
659
133/95
JN42
J289
Германия, Cotoneaster sp., 1979
Великобритания, Pyrus communis, 1980
Беларусь, Malus sp., 2007
-«-«-«-«-«-«Беларусь, Pyrus communis, 2007
Беларусь, Malus sp., 2007
Беларусь, Malus sp., 2007
Беларусь, Malus sp., 2008
Польша, Pyrus communis, 1995
Польша, Crataegus sp.
Польша, Malus sp., 1986
Польша, Cydonia sp., 1985
-
SCRI1043
ENA49
A3501
208
244
EH103
93
129
195
B-1027
Великобритания
-
Результаты ПЦР
Eam1/Eam2a
A/Bb
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Ukraine, Syringa vulgaris
-
4/11
8/12
B-8290
Беларусь, Pyrus communis, 2007
-«-
-
-
B-1059
Ukraine, Cucumis sativus
-
-
B-9069
-
-
-
3’M
37’1
-
Беларусь, Solanum lycopersicum, 2006
Беларусь, Solanum lycopersicum, 2009
-
-
-
-
-
-
-
39’1
Беларусь, Solanum lycopersicum, 2009
-
-
Беларусь, Prunus cerasifera, 1982
-
33’1
Беларусь, Solanum lycopersicum, 2009
E. coli
XL-I Blue
a
Результаты ПЦР с праймерами eam1/eam2: «+» - положительный, амплифицирован продукт 1200 п.о.; «-» отрицательный.
b
Результаты ПЦР с праймерами A/B: «+» «+» - положительный, амплифицирован продукт 1100 п.о.; «-» отрицательный.
Рисунок 2 – Чувствительность ПЦР диагностики при экстракции ДНК Erwinia
amylovora из водной суспензии бактериальных клеток (А), стеблей (Б), листьев (В) и
цветков (Г) яблони методом, предложенным Llop P. et al. (1999). Дорожка 1 – 108
кл/мл; 2 – 107 кл/мл; 3 – 106 кл/мл; 4 – 105 кл/мл; 5 – 104 кл/мл; К – отрицательный
контроль.
Как видно из данных, приведенных на рисунке 2, чувствительность ПЦР при
выбранном способе экстракции ДНК из растительной ткани составляла 10 клеток
E.amylovora на реакцию, хотя количество детектируемого продукта амплификации было
несколько меньшим, чем в случае водных суспензий бактериальных клеток (особенно при
экстракции из цветков яблони).
Таким образом, для проанализированной выборки штаммов микроорганизмов,
достоверность, специфичность и воспроизводимость метода ПЦР диагностики бактерий E.
amylovora с праймерами к хромосомному гену hrpN составляет 100%. Аналитическая
чувствительность изучаемого метода диагностики составляет приблизительно 10 клеток
E.amylovora на ПЦР реакцию (104 кл/мл).
Литература
1. Bereswill S, Jock S, Bellemann P, Geider K (1998) Identification of Erwinia
amylovora by growth morphology on agar containing copper sulfate and by
capsule staining with lectin. Plant Disease. 82:158–164.
2. Bereswill S, Pahl A, Bellemann P, Zeller W, Geider K (1992) Sensitive and
species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction
analysis. Applied and Envir. Microbiol. 58:3522–3526.
3. Bereswill S, Bugert P. Bruchmuller I. Geider K (1995) Identification of the fire
blight pathogen Erwinia amylovora by PCR assays with chromosomal DNA.
Applied and Envir. Microbiol. 61:2636–2642.
4. De Bellis P, Shena L, Cariddi C (2007) Real-time scorpion-PCR detection and
quantification of Erwinia amylovora on pear leaves and flovers. Eur. J. Plant
Pathol. 118:11–22.
5. Jock S and Geider K (2004) Molecular differentiation of Erwinia amylovora
strains from North America and of two Asian pear pathogens by analysis of
PFGE patterns and hrpN genes. Environ. Microbiol. 6:480-490.
6. Lagonenko AL, Komardina VS, Nikolaichik YA, Evtushenkov AN (2008) First
Report of Erwinia amylovora Fire Blight in Belarus. J. Phytopathol 156: 638 –
640.
7. Llop P, Caruso P, Cubero J, Morente C, Lopez M (1999) A simple extraction
procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material
by polymerase chain reaction. J. Microbiol. Meth. 27: 23–31.
8. Llop P, Bonaterra A, Penalver J, Lopez M (2000) Development of highly
sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of
Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. Applied and Envir.
Microbiol. 66:2071–2078.
9. Llop P, Donat V, Rodríguez M, Cabrefiga J, Ruz,José L, Palomo L, Montesinos
E, López M (2006) An Indigenous Virulent Strain of Erwinia amylovora
Lacking the Ubiquitous Plasmid pEA29. Phytopathology 96: 900 – 907.
10. Merighi M, Sandrini A, Landini S, Ghini S, Girotti S, Malaguti S, Bazzi C
(2000) Chemiluminescent and colorimetric detection of Erwinia amylovora by
immunoenzymatic determination of PCR amplicons from plasmid pEA29. Plant
Disease. 84:49–54.
11. Mraz I, Pankova I, Petrzik K, Sip M (1999) Erwinia and Pseudomonas bacteria
can be reliably screened by an improved serological agglutination test. J.
Phytopathology. 147:429–431.
12. Salm H, and Geider K (2004) Real-time PCR for detection and quantification of
Erwinia amylovora, the causal agent of fireblight. Plant Pathol. 53:602–610.
13. Sambrook J and. Russel DW (2001). Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
14. Wei Z, Laby R, and Zumoff C (1992) Harpin, elicitor of the hypersensitive
response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora. Science. 257:85–
88.