диагностика и молекулярно-генетические особенности вируса

ДИАГНОСТИКА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ВИРУСА ГРИППА А/H1N1V В РОССИИ
Грудинин М.П., Комиссаров А.Б., Елпаева Е.А., Писарева М.М., Бузицкая Ж.В., Паянкова
А.А., Романовская-Романько Е.А., Слита А.В., Стукова М.А.
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург, Россия
Появившийся в феврале-марте 2009 года в Мексике новый вирус гриппа А/H1N1v быстро
распространился по всему миру и явился причиной пандемии гриппа. Эпидемические
события в России начались в последнюю неделю сентября 2009 г. в Дальневосточном
регионе (Южно-Сахалинск), второй отправной точкой эпидемии стал Калининград, а к
октябрю 2009 г. эпидемия охватила всю территорию России.
Настоящая работа посвящена анализу результатов диагностики пандемического гриппа в
России и характеристике молекулярно-генетических особенностей вирусов гриппа
А/H1N1v, выделенных в период с мая по декабрь 2009 г., в НИИ гриппа.
Материалы и методы
Клинический (мазки из носоглотки, бронхо-альвеолярный лаваж) и секционный материал
(фрагменты трахеи, легких, бронхов, селезенки) поступал из клиник Санкт-Петербурга и
Ленинградской области, а также из вирусологических лабораторий Опорных Баз
Федерального центра по гриппу. Образцы были получены из лабораторий ФГУЗ
«Центров гигиены и эпидемиологии» республик Коми, Карелия, Башкортостан;
Белгородской, Воронежской, Калужской, Курской, Нижегородской, Новгородской,
Астраханской, Архангельской, Саратовской, Псковской, Смоленской, Самарской,
Вологодской областей и Ненецкого автономного округа.
Исследование клинического материала проводилось в день поступления методом ОТ-ПЦР
в режиме реального времени (Rotor-Gene 6000, Австралия) c использованием комплекта
реагентов по протоколу CDC (Атланта, США): набор для выделения РНК – RNeasy Mini
Kit (Qiagen); набор для постановки ОТ-ПЦР – SuperScript III Platinum One-step qRT-PCR
System (Invitrogen); набор праймеров и зондов - InfA, H1 сезонный, RNP и H1Sw
(Biosearch Technologies), а также наборов АмплиСенс Influenza virus A/B и Influenza virus
A/H1-swine-FL ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома вируса гриппа
А/H1N1v проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, США) с использованием набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit».
Филогенетический анализ осуществляли с использованием программы Vector NTI 8,0
(Invitrogen) и MEGA 3.1 (PSU, США) методом «ближайших соседей» и Kimura.
Результаты
В период с мая по декабрь 2009 г. при анализе 1558 клинических образцов РНК вируса
гриппа А(H1N1v) была обнаружена у 409 больных гриппом и 163 умерших. Вирусов
гриппа А других субтипов и гриппа В выявлено не было. Из 409 больных 58% составили
лица в возрасте до 14 лет, 41% - больные от 15 до 64 лет и 1% - лица старше 65 лет.
Средний возраст обследованных больных составил 15,7 лет. Среди умерших пациентов
большинство лиц (89,9%) были в возрасте от 15 до 65 лет, доля умерших детей до 14 лет
составила 3,8%, а лиц старше 65 лет – 6,3%. Средняя продолжительность заболевания (до
смерти) составила 10 дней (от 3-х до 30 дней). При этом в 84% случаев грипп был
осложнен пневмонией вирусной или вирусно-бактериальной этиологии, у части больных
регистрировали острый респираторный дистресс-синдром. По имеющимся данным у 6
умерших в анамнезе был сахарный диабет, у 7 – ожирение 2-3 степени, среди умерших
было 6 женщин второго и третьего триместра беременности. Средний возраст умерших
составил 39 лет.
Молекулярно-генетическая характеристика 31 пандемического штамма (20 штаммов были
выделены из клинических образцов и 11 штаммов - из секционного материала) показала,
что по генам гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) данные штаммы были подобны
штаммам вируса гриппа А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009 (гомология по HA
составила 98,9%). Филогенетический анализ показал, что популяция штаммов H1N1v
эволюционно связана с вирусами гриппа А/H1N1 1918 года и вирусами классического
гриппа свиней. При этом пандемические штаммы 2009 г. и эпидемические H1N1 штаммы
различных годов выделения образовывали две отдельные группы. Гомология по HA со
штаммом A/Брисбен/59/2007, входившим в состав гриппозных вакцин в сезоны 2007-2009
гг., составила всего 78%.
Большинство Российских штаммов пандемического вируса гриппа А/H1N1, включенных в
анализ, несли в гемагглютинине мутацию S203T, в нейраминидазе – мутацию N248D, в
NS - мутацию I23V и, таким образом, принадлежали кластеру 2, согласно классификации
Fereidouni и соавторов (Fereidouni et al., 2009).
У ряда российских штаммов выявлялись штаммоспецифические аминокислотные замены
в различных положениях HA, две из которых находятся в антигенных сайтах Ca и Sb. В
гемагглютинине 8 изолятов вируса гриппа, выделенных из секционного материала, и в 2х изолятах, выделенных от больных с тяжелым течением гриппа, была обнаружена АК
замена D222G. Известно, что АК остатки HA1 135, 183, 187, 191, 222, 223 и 225
(нумерация по H1) влияют на рецептор-связывающие свойства вирусов гриппа и,
соответственно, на тропизм вируса.
Появление АК замен в рецептор-связывающем сайте HA может быть связано с
пассированием вируса гриппа на КЭ (Xu et al., 1993; Gambaryan et al., 1999). В данном
исследовании пять штаммов, содержащих остаток глицина (G) в 222 положении HA,
были выделены из секционного материала на клетках MDCK, что исключает
адаптационный характер данных замен.
Все проанализированные штаммы не имели в NA мутаций, определяющих устойчивость к
озелтамивиру (H275Y), но содержали замену S31N в белке М2, определяющую
устойчивость вирусов к адамантанам и характерную для циркулирующих в мире штаммов
вируса гриппа АH1N1v и их предшественников по M гену – штаммов евразийского
свиного птицеподобного (avian-like) гриппа А подтипа H1N1.
Заключение
Согласно исследованиям, проведенным в НИИ гриппа, в период с мая по декабрь 2009 г.
эпидемия гриппа в России носила моноэтиологический характер и была вызвана вирусом
гриппа А(H1N1v). В отличие от предыдущих эпидемических сезонов, когда наибольшее
число тяжелых случаев гриппа регистрировалось у детей до 5 лет и лиц старше 65 лет,
особенностью эпидемии, вызванной вирусом гриппа А (H1N1v), являлась высокая
заболеваемость и смертность среди лиц молодого и среднего возраста.
Показано, что популяция штаммов H1N1v генетически однородна и эволюционно связана
с вирусами гриппа H1N1 1918 года и вирусами классического гриппа свиней. При этом
пандемические штаммы 2009 г. и эпидемические H1N1 штаммы различных годов
выделения образуют две отдельные группы.
По данным Европейского Центра
профилактики и контроля заболеваний (ECDC) G222 варианты штаммов вируса гриппа
H1N1v были выделены во многих странах как от людей, умерших от гриппа или
перенесших заболевание в тяжелой форме, так и при легком течении гриппа. Сведений,
позволяющих доказать непосредственную связь данных замен с усилением тяжести
течения заболевания на сегодняшний день недостаточно. Для установления
патогенетической роли данной мутации требуются дальнейшие исследования.