Колокольцов Андрей Алексеевич
advertisement
На правах рукописи Колокольцов Андрей Алексеевич ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ В КЛЕТКУ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 03.00.04 – биохимия 03.00.06 - вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2007 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) и Университете Техаса, Медицинское Отделение (Галвестон, США) Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Гуляева Л.Ф кандидат биологических наук Давэй Р.А. Официальные оппоненты: доктор биологических наук Усынин И.Ф. кандидат биологических наук Плясунова О.А. Ведущая организация: ГУ НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (Москва). Защита диссертации состоится «___»_________2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научноисследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института биохимии СО РАМН. ГУ Научно- Автореферат диссертации разослан « 16 » апреля 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета Русских Г.С. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Детальное исследование процессов проникновения вирусов в клетки и выявление факторов, необходимых для этого, имеет огромное значение не только для понимания природы вируса, но и для разработки новых противовирусных препаратов и диагностических методов. Например, для лечения вируса иммунодифицита человека (ВИЧ) используются как специфичные ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, так и ингибиторы проникновения вируса в клетку (Reeves and Piefer, 2005). К сожалению, существующие методы определения проникновения вирусов имеют множество ограничений и не всегда применимы. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) входит в состав семейства Тогавирусов, рода альфавирусов. Наши знания об альфавирусах получены в основном при исследованиях вирусов леса Семлики (SFV) и Синдбис (SINV), в то время как мало известно о высоко вирулентном ВВЭЛ, особенно о его вхождении. Так как существует много примеров, когда родственные вирусы используют разные пути проникновения, (так, пикорновирусы используют как клатрин-зависимый эндоцитоз, так и кавеола), то необходимо определить, какой из этих механизмов работает у альфавирусов. К тому же было предположено, что аминокислотные различия в оболочечных белках ВВЭЛ и SFV определяют зависимость слияния от содержания холестерина в мембране, но это никогда не было проверено на клетках млекопитающих. Целью настоящей работы было изучение механизмов проникновения вируса ВЭЛ в клетки 293 НЕК человека. Для достижения цели решались следующие задачи: 1. Подобрать способ включения в вирусную частицу люциферазы, как наиболее подходящего фермента для определения слияния вируса. 2. Проверить разработанный метод на псевдотипах VSV и MLV. 3. Получить псевдотип ВВЭЛ и проверить его функциональность. 4. Адаптировать разработанный метод к ВВЭЛ псевдотипу. 5. На основании анализа люциферазной активности выяснить роль мембранного холестерина и ранних и поздних эндосом при вхождении ВВЭЛ в клетки. Научная новизна работы В работе впервые разработан метод специфичного включения фермента люциферазы в вирусную частицу. Было показано, что модифицированный вирус функционален, а люцифераза находится внутри вируса и защищена от контакта с субстратом вирусной мембраной, поэтому фермент может получить доступ к субстрату только после слияния вируса с клеткой. Впервые разработан метод наблюдения проникновения вируса в клетку в реальном времени. Показано, что связывание вируса является рецепторспецифичным, так как сигнал был получен только на клетках, 3 экспрессирующих рецептор. Использование ингибиторов эндосомального закисления доказало пригодность разработанного метода для изучения эффекта ингибиторов на проникновение вирусов, причем эффект специфичен для каждого псевдотипа тестируемого вируса и зависит от используемого оболочечного белка. Впервые получен ВВЭЛ псевдотип, обладающий высоким титром и несущий на своей поверхности нативные оболочечные белки ВВЭЛ. Таким образом, псевдотип повторяет путь проникновения вируса дикого типа, что позволяет использовать его для определения факторов, необходимых для проникновения в клетки ВВЭЛ дикого типа. В результате данного исследования была показана необходимость наличия функциональных поздних эндосом для эффективного проникновения ВВЭЛ в клетки, а также независимость проникновения ВВЭЛ от мембранного холестерина. Научно-практическая значимость Результаты, полученные при изучении способов проникновения вируса ВЭЛ в клетку хозяина, имеют существенное значение для фундаментальной науки. Исследование механизмов транспорта вирусных частиц через клеточную мембрану важно для современной биохимии, изучающей мембранный транспорт. Эта проблема позволяет также подойти к пониманию механизмов инфицирования, что важно для изучения природы самого вируса и вирусного патогенеза. Так, необходимость в функциональных поздних эндосомах говорит о том, что для слияния вирусу нужен более низкий рН, либо ему необходимы дополнительные, неизвестные факторы, которые присутствуют в поздних эндосомах, такие, как протеазы, корецепторы, или изменение плотности рецептора. Показана независимость проникновения вируса ВЭЛ в клетки от мембраного холестерина, что говорит о наличии принципиальной разницы между такими близкородствеными вирусами, как ВВЭЛ и SFV. Работа имеет также практическое значение, так как разработанный метод определения проникновения вируса в клетки в реальном времени позволяет определить точную кинетику этого процесса и ее изменение под действием различных факторов. Проведение измерений в реальном времени дает возможность исполнения эксперимента в присутствии токсичных ингибиторов на протяжении всего эксперимента. Разработанный метод позволяет также однозначно ответить на вопрос об эффекте ингибиторов на проникновение вируса в клетку. Это его выгодно отличает от классических экспериментов с инфицированием, где ингибитор добавляется в течение определенного времени, после чего удаляется, и вирус может проникать в клетку с задержкой, которой не будет видно на фоне продолжительной инфекции, что может быть причиной ложно негативного результата. Данный метод отражает специфические условия проникновения псевдотипированного вируса в зависимости от используемого оболочечного белка, что позволяет определять ключевые клеточные факторы, необходимые вирусу для инфицирования. Это дает возможность определять мишени для рационально разрабатываемых 4 препаратов, что позволит в будущем создавать эффективные, высоко специфичные противовирусные препараты. Основные положения, выносимые на защиту 1. Слияние люциферазы светлячка с оболочечным белком вируса обеспечивает специфичное включение фермента в вирусную частицу. 2. Включение люциферазы приводит к получению вируса с интактной мембраной, выполняющей функцию барьера, предохраняющего фермент от субстрата до момента слияния вируса с клеткой. 3. Разработанный метод отражает специфичное проникновение вируса в клетки, зависимое от оболочечного белка псевдотипа. 4. Полученный псевдотип ВВЭЛ содержит оболочечные белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в нативной конформации и проникает в клетки по механизму, специфичному для ВВЭЛ. 5. Для проникновения вируса ВЭЛ в клетки требуется наличие функциональных поздних эндосом. 6. Для слияния с клеткой ВВЭЛ не нуждается в мембранном холестерине. Апробация работы: Результаты работы были представленны и обсуждены на XXIII конференции Американского общества вирусологии (ASV), Montreal, Canada, 2004; на конференции регионального центра превосходства (RCE) в биозащите и возникающих инфекционных заболеваниях, Galveston, USA, 2004; на XXV конференции Американского общества вирусологии (ASV), Madison, Wisconsin, USA, 2006; на ежегодном коллоквиуме товарищества McLaughlin, Galveston, USA, 2007. Публикации. По материалам диссертации имеется 6 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 6 таблиц и 16 рисунков и состоит из 5 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 273 источника. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для оценки зависимости вирусов от рН использовались ингибиторы эндосомального закисления. Хлорохин (100 мкМ), бафиломицин А1 (50нМ), моненсин (1 мкМ) и хлорид аммония (20 мМ) были использованы в качестве ингибиторов в указанных концентрациях, если были использованы другие концентрации, то они указаны в тексте. Хлорохин, моненсин и хлорид аммония были растворены в DMEM и добавлены за час до инкубации с вирусом. Бафиломицин А1 сначала растворяли в DMSO для получения стокового раствора 50 мкМ, а затем растворяли в DMEM перед использованием. Для определения эффекта ингибиторов эндосомального закисления на инфекцию после 1 часа преинкубации с препаратом в клетки добавляли вирус и инкубировали в течение 3 часов, при температуре 37° С, 5 после чего культуральную среду удаляли и заменяли на новую, не содержащую ингибиторов. После этого клетки инкубировали еще в течение 2-х дней и подсчитывали вирусный титр. При определении эффекта ингибиторов эндосомального закисления на сливание вирусов с клеткой, ингибитор присутствовал на протяжении всего эксперимента. Проникновение вирусов определялось на 293 клетках для всех вирусов, кроме MLV, для которого проникновение измерялось на 293-CAT клетках, экспрессирующих его рецептор. Обычно для каждого образца использовали 105 клеток, которые инкубировали с вирусом, содержащим люциферазу, в течение 1 часа (за исключением случаев, когда указано обратное) при множественности заражения (MOI) от 0,1 до 0,5. После этого клетки отмывали от излишнего вируса путем осаждения центрифугированием при 200 g в течение 5 минут, осадки клеток ресуспендировали в DMEM. Затем клетки осаждали снова и ресуспендировали в 100 мкл люциферазного буфера. Люциферазную активность измеряли в Turner Designs TD 20/20 люминометре в единицах света в секунду. Для изучения кинетики проникновения вирусов в клетки указанный выше метод был модифицирован следующим образом: вирус добавляли к клеткам на короткое время, отмывали избыток вируса и затем наблюдали за проникновением связанного вируса. Это было достигнуто инкубированием клеток с вирусом в течение 1 минуты при MOI=10 инфекционных частиц на клетку. В течение этого времени <5% вируса успевало связаться с клеткой, а не связавшийся вирус был отмыт коротким двукратным центрифугированием и ресуспендированием в DMEM. Клетки и оставшийся связанный вирус инкубировали в течение указанного времени, отбирали образцы и измеряли люциферазную активность, как описано выше. Для демонстрации активности экспресированных мутантных генов (Rab и Eps15) и измерения клатрин-зависимого эндоцитоза был использован захват трансферрина. Для измерения захвата трансферрина клетки сначала инкубировали в DMEM c 1 % БСА и без сыворотки в течение часа, а потом к ним на 5 минут добавляли трансферрин в концентрации 50 мкг/мл, меченный Alexafluor594, после чего излишки трансферрина дважды отмывали в DMEM, и клетки зафиксировали параформальдегидом. Для удаления холестерина клетки инкубировали в DMEM без сыворотки в течение часа, затем к ним добавляли нистатин до конечной концентрации 60 мкг/мл. Эта концентрация являлась минимальной, при которой нарушается поглощение токсина холеры, указывающее на то, что холестерин эффективно удален. Это было определено с помощью добавления к клеткам токсина холеры, меченного Alexaflour568 (Molecular Probes, США). Окрашенные клетки визуализовались при помощи инвертированного микроскопа Leica DM IRB и Optronics Magnafire camera. Проникновение вируса определяли с помощью измерения люциферазной активности, как было описано выше. 6 Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Excel 2003. Результаты представлены в виде M ± m, где М - среднее, m – стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий между выборками использовали t -критерий Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Специфическое включение люциферазы в вироплазму с помощью слияния с оболочечным белком Для направленной доставки люциферазы в вирус был использован оболочечный белок. Оболочечный белок MLV синтезируется как полипептид, который быстро расщепляется в эндоплазматическом ретикулуме на две субъединицы SU (70 кДа) и TM (15 кДа), которая заякоривает комплекс в клеточной и затем в вирусной мембране. Непосредственно до или сразу после отпочковывания от клеточной поверхности ТМ далее расщепляется вирусной протеазой, высвобождая С-концевой пептид р2е. Тогда присоединение белка к С-концу ТМ обеспечило бы новый метод доставки рекомбинантного белка в вирус между мембраной и матриксом. Расщепление белка вирусной протеазой после отпочковывания освободило бы люциферазу, позволив ей диффундировать в клеточную цитоплазму после слияния. Чтобы проверить это предположение, мы сделали две конструкции env-luc1 и env-luc2, которые присоединяют Friend 57 MLV оболочечный белок к N-концу люциферазного гена (рис. 1А). Рисунок 1. Схематическое изображение конструкции оболочечный белоклюцифераза (env-luc) MLV. Открытой стрелкой отмечено место расщепления фурином (SU-TM соединение), а закрытой стрелкой – место расщепления вирусной протеазой (TM-p2e соединение). Созданные конструкции различались по длине линкерного пептида между Сконцом оболочечного белка и N-концом люциферазы, так env-luc1 линкерная последовательность состояла из Glu-Phe, а env-luc2 – из Glu-Phe-Gly-Ser. Следующим этапом была сборка MLV с добавлением плазмиды, кодирующей env-luc1 и env-luc2. В этом случае плазмида pFB-luc была заменена на pψEGFP, что позволило определять вирусный титр с помощью инфицирования клеток и количественно учитывать колонии, экспрессирующие белок EGFP. Мы обнаружили, что в случае использования обеих конструкций люцифераза присутствовала в супернатанте, но большая часть ее активности регистрировалась в осадке, полученном центрифугированием при 50000g, что говорит о прохождении люциферазы через 20%-ую сахарозу, а это характерно для интактных MLV частиц. Осажденный материал также соосаждался с инфекционным вирусом и имел титр 3x10 3 и 4x104 к.ф.е./мл для env-luc1 и envluc2, соответственно. 7 Сравнение целостности полученных вирусных частиц Для того, чтобы измерить проникновение вируса в клетки, люцифераза должна быть заключена вовнутрь частиц и недоступна для субстрата. MLV обычно непроницаемы для маленьких молекул, таких как dNTPs (Mothes et al., 2000a), но могут стать проницаемыми с помощью добавления детергентов, таких как, например, 1%-й NP-40, который разрушает вирусную липидную мембрану и оболочечные белки (Pinter et al., 1997). Для того, чтобы определить, заключена ли люцифераза в интактный вирион, люциферазную активность измеряли в присутствии или отсутствии 1%-го NP-40. Вирус, собранный с env-luc1, показал люциферазную активность в 3 раза выше, чем вирус с env-luc2. Добавление 1%-го NP-40 существенно увеличило сигнал в случае env-luc1, Л/НЛ равнялось 15, в то время как для env-luc2, Л/НЛ равнялось 1. Эти результаты показали, что хотя обе конструкции успешно направляли люциферазу в вирус, включение env-luc2 было более разрушительным, что приводило к большому количеству нарушений мембраны. В большинстве случаев вирус, собранный с env-luc1, был интактным. В последующем мы использовали лишь вирус, собранный с envluc1. Следующим шагом работы была попытка увеличить титр вируса, собранного с env-luc1, до титра вируса дикого типа, для которого этот показатель составлял 106 к.ф.е./мл. Эта проблема решалась добавлением в смесь для трансфекции плазмиды, кодирующей оболочечный белок дикого типа. Было изменено соотношение env-luc к дикому типу и были измерены соотношение Л/НЛ и вирусный титр (рис. 2). Рисунок 2. Оптимизация производства вируса. Показана зависимость между количеством ДНК, используемым для трансфекции (нижняя ось), между люциферазной активностью и титром вируса. Все вирусы были осаждены через 20%-ую подушку сахарозы и люциферазная активность (левая ось) была определена для неповрежденного вируса (■) или лизированного вируса (●; 1% был добавлен NP-40). Вирусный титр - ▲, правая ось. 8 Соотношение 1:4 плазмид, кодирующих env-luc и дикий тип, улучшило вирусный титр до 106 к.ф.е./мл (титр, близкий к дикому типу), а соотношение Л/НЛ было 10:1. В 6-ти других независимых экспериментах это соотношение было 11,2±3,7. Суммируя эти результаты, можно заключить, что использование 1 мкг env-luc и 4 мкг env обеспечивает оптимальные условия, при которых вирусный титр близок к таковому для дикого типа, а высокое значение соотношения Л/НЛ (более 10) говорит о целостности полученых вирусов, что позволяет использовать этот метод для определения слияния. Исследование специфичности полученных вирусных частиц на клетках, не содержащих вирусный рецептор Для проникновения в клетку вирусу необходим специфичный клеточный рецептор, без которого вирус не в состоянии инфицировать клетку. Поэтому следующим шагом исследования была проверка специфичности полученного сигнала на клетках, не экспрессирующих рецептор. Наличие сигнала на негативных клетках означало бы, что люциферазный сигнал отражает неспецифические процессы поглощения клеткой люциферазы, а не рецепторзависимое проникновение вируса. Клетки 293 не инфицируются экотропным MLV до тех пор, пока в них не экспрессируется рецептор. Поэтому эти клетки служили негативным контролем, а клон 293-CAT, экспрессирующий рекомбинантный mCAT-1 рецептор, использовался в качестве позитивного конроля. Было обнаружено, что клетки 293 не давали сигнала выше фоновых значений люминометра (около 10 относительных световых единиц в секунду). В клетках, экспрессирующих рецептор, регистрировали сигнал, который достигал своего максимума в интервале от 1 до 1,5 часов, а величина сигнала составляла 5000 о.е.с./сек (рис. 3). Рисунок 3. Люциферазная активность вируса, инкубированного разные промежутки времени с клетками 293, несущими (293-САТ; ▲) или не несущими рецептор (293; ●). В других экспериментах мы обнаружили, что величина сигнала прямо пропорциональна количеству рецептор-содержащих клеток (в интервале от 104 до 107 ) или количеству вируса на клетку (MOI от 0,01 до 10). Эти результаты указывают на то, что частицы, содержащие люциферазу, успешно 9 направляются в рецептор-содержащие клетки, а полученный сигнал – рецептор-зависимый. Исследование влияния Т471Р мутации на слияние вирусных частиц с клеткой Для дальнейшего доказательства того, что люциферазная активность отражает специфичное проникновение в клетку вирусных частиц, был сконструирован оболочечный белок, содержащий единичную мутацию Т471Р в пептиде слияния. Ранее было показано, что такой вирус может связываться с клетками, содержащими рецептор, но не инфицировать их (Zhu et al., 1998). Мутация была введена в обе конструкции, кодирующие оболочечный белок и env-luc. После одного часа инкубации с клетками мутант Т471Р дал сигнал, который был близок к фоновому значению и в 20 раз ниже, чем для вируса дикого типа (рис. 4, левая панель). Для того, чтобы выявить спрятанную люциферазу и определить количество вируса, ассоциированного с клеткой, был использован детергент. При добавлении 1%-го раствора детергента NP-40 значение люциферазной активности для дикого типа и для Т471Р мутанта сравнялись (рис. 4, правая панель). Таким образом было показано, что мутант Т471Р связался с клеткой, но не слился с ней. Это доказывает, что использованный метод в полной мере отражает поведение вируса. Более того, после специфического связывания вируса с рецептором клетки не происходит неспецифического поглощения люциферазы. Это свидетельствует о возможности использования данного подхода для независимого измерения рецептор-зависимого связывания вируса с клеткой и для измерения слияния вируса с клеткой. Рисунок 4. Анализ единичной мутации Т471Р в пептиде слияния с помощью люциферазного метода определения проникновения вируса. Люциферазную активность измеряли через 1 час инкубации на интактных клетках (левая панель) или в присутствии 1%-го NP-40 (правая панель). * Достоверность различий с вирусом дикого типа (р<0,01). 10 Исследование экспрессии и включения оболочечных белков ВВЭЛ в вирусную частицу Известно, что высокий уровень экспрессии оболочечных белков вируса на поверхности клетки является важным фактором для эффективного формирования псевдотипа (Sanders, 2002). Поэтому в первую очередь нами были сконструированы плазмиды, экспрессирующие оболочечные белки. Сначала были сконструированы плазмиды на основе штамма Trinidad donkey, как наиболее охарактеризованного в литературе. В одной из конструкций была использована часть гена, кодирующая капсид RRV как лидерную последовательность (рис 5А, верхняя конструкция). Эта стратегия ранее использовалась для эффективной экспрессии оболочечных белков родственного SINV (Frolov et al., 1997). Вторая конструкция содержала дополнительный кодон инициации трансляции в начале последовательности Е3 (рис. 5А, нижняя конструкция). Эта стратегия ранее использовалась для получения псевдотипов RRV и SINV. Обнаружено, что конструкция с частью капсида обеспечивала высокий уровень экспрессии оболочечных белков в клетке (рис 5В, дорожка 3), поэтому эти белки плохо включались в частицы MLV (дорожка 10). Так как моноклональными антителами против Е2 1А3В-7 была детектирована только одна полоса (дорожка 3, нижняя панель), то лидерный кусок капсида был отрезан правильно. Вторая конструкция дала основную широкую полосу такого же размера при использовании поликлональной сыворотки против ВЭЛ (рис. 5В, дорожки 1 и 2, верхняя панель). Но, в отличие от оболочечных белков, синтезированных с лидерной последовательностью капсида, эти белки включались в состав вирусных частиц (дорожки 6-9). Эти результаты предполагают, что лидерная последовательность капсида может усиливать производство оболочечных белков, и они либо не правильно складываются и не достигают клеточной мембраны, либо лидерный пептид капсида сам мешает включению оболочечных белков в MLV частицы. Белки Е1 и Е2 мигрировали близко друг от друга в геле из-за гетерологичного гликозилирования и не могли быть разделены по размерам. Однако Е2 белок детектировался с помощью моноклональных антител против Е2. Так как для правильного процессинга Е2 необходима экспрессия Е1, должны быть экспрессированы оба белка. Для конструкции безлидерного пептида было проверено включение оболочечного белка в интактные и дефектные частицы. Для этого были сравнены осадки до центрифугирования с осадками после центрифугирования через 20%-й раствор сахарозы, который исключает дефектные частицы из осадка. Было обнаружено, что большинство оболочечных белков, представленных в культуральном супернатанте (рис. 5В, дорожка 6), было осаждено через подушку сахарозы (дорожка 7), а их количество было соизмеримо с количеством, полученным центрифугированием без подушки (дорожка 8). Эти результаты показывают, что большая часть оболочечных белков была эффективно включена в частицы. 11 Рисунок 5. Дизайн конструкции и экспрессия VEEV оболочечных белков в 293 HEK клетках. (А). Было сделаны две конструкции. Первая (верхняя) содержит C-концевой домен RRV капсида как лидерный пептид для инициации трансляции открытой рамки считывания. Вторая (нижняя) содержит искусственный кодон инициации трансляции, который предшествовал открытой рамки считывания кодирующей от Е3 до Е1. (В) Вестерн блот анализ экспрессии оболочечных белков в 293 клетках, трансфецированных экспрессионными конструкциям для VEEV Trinidad donkey оболочечных белков (левая панель) или анализ отфильтрованного культурального супернатанта (правая панель) с помощью поликлональных антител против VEEV (ATCC VR-1249AF) или с помощью моноклонального антитела 1А3В7 реагирующего с Е2. Дорожка 1 и 2, лизаты клеток, экспрессирующих VEEV Trinidad donkey с конструкции без капсида в нормальной среде и в среде с добавлением 5мМ битурата натрия, соответственно; дорожка 3, конструкция с капсидным лидерным пептидом; дорожка 4, VSV-G экспрессионный вектор; дорожка 5, лизат очищенного ТС-83 вируса. Супернатанты в правой панели представляют неконцентрированный материал (дорожка 6), вирус осажденный через 20% подушку сахарозы (дорожка 7 и 9), вирус осажденный без сахарозы (дорожка 8), осадок с конструкции с капсидным лидером (дорожка 10), и VSV-G псевдотип осажденный через сахарозу (линия 11). (С) Частицы, осажденные через сахарозу, псевдотипированные с VSV-G (дорожка 1) или с VEEV штамм 3908 (дорожка 2) или Trinidad donkey (дорожка 3) оболочечным белком. Каждый был окрашен с использованием тех же антител, что были описаны для панели В. Изначальная характеристика была сфокусирована на конструкциях, экспрессирующих оболочечные белки от Trinidad donkey штамма ВЭЛ члена 1АВ серогруппы. Затем было решено проверить возможность получения частиц, содержащих оболочечные белки от 3908 штамма ВЭЛ, который 12 является типичным членом недавних полевых изолятов 1С серогруппы и инфекционным для людей и лошадей. Было обнаружено, что оболочечные белки Trinidad donkey и 3908 штаммов имеют близкий уровень включения в частицы (рис. 5С). Определение инфекционности полученных псевдотипов ВВЭЛ Для определения инфекционности псевдотипов ВВЭЛ была использована линия 293 НЕК фибробластов человека (таблица 1). Таблица 1. Титры псевдотипированных MLV, определенные с помощью последовательных разведенийa Титр (кфе/мл) на: Оболочечный белок VEEV капсидный лидер VEEV E3-1 TRD VEEV E3-1 3908 VSV-G MLV Без оболочечного белка HEK 293 клетки (1 ± 0.6) x 103 (2.0 ± 0.5) x 105 (1.0 ± 0.2) x 105 (1 ± 0.5) x 107 0 0 293-CAT клетки Н.о. Н.о. Н.о. 107 106 Н.о. a Вирус был собран с использованием трансфецированных 293 HEK клеток. Н.о. - не определено. Обнаружено, что конструкция с лидерным участком капсида обеспечивала низкий уровень включения оболочечного белка, и этот вирус мог инфицировать клетки с низким титром 10 3 кфе/мл. Напротив, конструкции без лидерной последовательности давали титр в 100 раз выше для обоих Trinidad donkey и 3908 штаммов. Фоновая инфекция, вирус, собранный без добавления оболочечных белков, или титрование на клетках без рецептора, не давали сигнала. В некоторых экспериментах использование бутирата натрия (5 мМ бутират натрия добавлялся в среду за 12 часов до собирания вируса) повысило титр до 10 раз. Этот реагент известен способностью увеличивать экспрессию белков с цитомегаловирусного промотора через активацию энхансерного элемента промотора. Однако это соединение оказывало эффект только в случаях неоптимальной трансфекции, из чего можно сделать вывод о том, что использование бутирата натрия имеет смысл только тогда, когда плазмида лимитирована. Подтверждением этого являются эксперименты, в которых трансфекция была оптимизирована, а анализ экспрессии оболочечного белка (рис. 5Б, дорожка 2) и его включения в частицы (дорожка 9) в клетках, обработанных бутиратом натрия, показал отсутствие изменений или незначительные изменения в уровне экспрессии. 13 Нейтрализация псевдотипов с помощью ВВЭЛ реактивной сыворотки Для определения входят ли псевдотипированные частицы в клетки с помощью механизма зависимого от оболочечных белков ВВЭЛ, был проведен эксперимент по ингибированию инфицирования с помощью моноклональных антител против Trinidad donkey штамма ВВЭЛ. В данном случае нейтрализация псевдотипа специфичными моноклональными антителами, узнающими различные эпитопы, доказывает наличие этих эпитопов на поверхности псевдотипа, тем самым доказывая конформацию оболочечных белков сходную с вирусом дикого типа. Ранее было показано, что три вида моноклональных антител реагировали с различными эпитопами на Е2 (1А3В-7, 1А2А-9 и 1А2В-10) и одно антитело узнавало эпитоп на Е1 (1А4В-6) (Roehrig and Mathews, 1985; Hunt and Roehrig, 1995). Поэтому мы использовали эти антитела вместе с нейтрализующей поликлональной кроличьей сывороткой, реагирующей со всем вирусом, для нейтрализации полученного псевдотипа. Моноклональные антитела были использованы при конечном разведении 1:200 (конечная концентрация 5 мкг/мл). Поликлональные антитела были использованы при разведении 1:100. 200 инфекционных единиц псевдотипорованного вируса на лунку 24луночного планшета инкубировались в присутствии или в отсутствии антител. VSV-G псевдотип использовался как негативный контроль неспецифичного ингибирования антителами. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2. Ингибирование инфицирования ВВЭЛ штамма Trinidad псевдотипированного MLV с помощью нейтрализующих моноклональных и поликлональных антител. Антитела Моноклональные 1A4B-6 1A3B-7 1A3A-9 1A2B-10 Поликлональные Специфичность E1 E2 E2 E2 Вирус % уменьшения титра (относительно не нейтрализованного вируса) VEEV псевдотип VSV-G псевдотип 97 44 100 29 100 0 0 0 0 2 Как видно из таблицы, выделяется три наиболее эффективных антитела: 1А4В-6, 1А3А-9 и поликлональная сыворотка, которые блокировали инфекцию. В подтверждение специфичности полученных результатов VSV-G псевдотип не был нейтрализован. Моноклональное антитело 1А3В-7 уменьшило инфекцию лишь наполовину, а 1А2В-10 обеспечило только 29%-ое ингибирование инфекции. Важным заключением является то, что результаты по нейтрализации ВВЭЛ оболочечных белков псевдотипа совпадали с 14 таковыми для вируса дикого типа, полученными ранее (Hunt and Roehrig, 1995; Roehrig and Mathews, 1985). Исключение составила реактивность антитела против Е1. В случае вируса дикого типа это антитело взаимодействует с защищенным эпитопом. Скорее всего, этот факт свидетельствует о том, что Е1 белок в альфавирусных частицах обычно расположен у уснования Е2 и защищен от взаимодействия с антителами через стерические ограничения плотно упакованных Е1-Е2 гетеродимеров (Paredes et al., 2001; Pletnev et al., 2001). По данным электронной микроскопии псевдотипированные частицы имеют меньше оболочечных белков на своей поверхности и, таким образом, Е1 оболочечный белок становится доступным для антител. Однако, как минимум для Е2, было показано, что псевдотип несет нативный набор эпитопов на своей поверхности и эффективно нейтрализуется подходящими антителами. Таким образом, эти данные говорят о том, что ВВЭЛ оболочечные белки были ответственны за проникновение псевдотипа в клетки. Включение фермента люциферазы в ВВЭЛ псевдотип Клеточные процессы, которые ведут к проникновению оболочечного вируса, плохо изучены, в основном из-за отсутствия количественного и чувствительного метода, который бы измерял проникновение вируса в реальном времени. Для альфавирусов основная часть работ была сфокусирована на изучении вирусов SFV и SINV, так как каждый из них растет до высоких титров и не патогенен для человека. Оба вида сливаются с мембраной клеток с помощью понижения pH, что показано методом смешивания липидов. Этот метод измеряет дисперсию флуоресцентно меченой пробы после слияния вирусной мембраны с клеточной или искусственной мембранами (Smit et al., 1999; White and Helenius, 1980). Однако из-за высокого фона этого метода требуется большое количество очищенного вируса, что является не физиологичным и трудно выполнимым для таких высоко патогенных вирусов, как ВВЭЛ, а для синхронизации процесса слияния и увеличения сигнала требуется понижение рН. Кроме того, этот метод не применим к pH-независимым вирусам, так как их слияние не возможно стимулировать, что приводит к тому, что сигнал практически не отличим от фоновых значений. Другим недостатком является то, что понижение pH заставляет весь вирус перейти в стадию слияния, независимо от места нахождения вируса, что делает невозможным изучение транспорта вируса и физиологичных условий его слияния с клеточными мембранами. В связи с вышесказанным было решено адаптировать метод, разработанный ранее для экотропного MLV к ВВЭЛ. По аналогии с этим методом так же, как и в случае MLV, люцифераза была включена в состав псевдотипированной частицы. Для этого С-конец Е1 белка ВВЭЛ был модифицирован таким образом, чтобы присоединить к нему люциферазу (рис. 6А). Для получения люциферазы, связанной с вирусом, оказался необходим удлиненный линкер, состоящий из трех копий последовательностей, кодирующих HA-эпитоп (рис. 6А). Более 15 того, наличие этого эпитопа позволило детектировать Е1 белок методом Вестерн блота (рис. 6В открытая стрелка). Как видно из картины Вестерн блота, комплекс Е1-люцифераза соответствовал полосе 100 кДа для клеточного лизата (дорожка 3) и вирусных частиц (дорожка 6, заполненная стрелка). Рисунок 6. Дизайн конструкции и экспрессия env-luc. (A) Рекомбинантный оболочечный ген был сделан в экспрессионном векторе pCDNA3 (Invitrogen). Единственная рамка считывания кодировала оболочечные белки ВВЭЛ от E3 до E1, как и ранее, за исключением того, что кодон терминации был удален и слит с геном, кодирующем три копии HA эпитопа (HA), который, в свою очередь, был соединен с геном люциферазы светлячка. (B) Вестерн блот анализ рекомбинантного оболочечного белка ВВЭЛ лизата трансфецированных клеток (слева) и осажденного вируса (справа). Клетки трансфецированы для производства MLV частиц, псевдотипированных с оболочечными белками от eco-MLV (дорожки 1 и 4), ВВЭЛ с HA-tag (дорожки 2 и 5) или ВВЭЛ env-luc конструкцией (дорожки 3 и 6). Открытая и сплошная стрелки показывают предсказанный размер ВВЭЛ HA-tagged E1 белок и E1-luc белок, соответственно. Определение целостности полученного вируса Для определения целостности вирусных частиц они были разделены центрифугированием в градиенте сахарозы. В каждой фракции был определен вирусный титр, люциферазная активность и измерено содержание белка Е1. Максимальное значение исследуемых параметров было зарегистрировано во фракции 4, где концентрация сахарозы была около 40% (рис. 7). Соотношение люциферазной активности лизированного вируса к нелизированному для ВЭЛ составило >10. Вместе с данными о том, что измеряемые активности находятся в одной и той же фракции, которая соответствует плотности нативного вируса, эти результаты говорят о том, что ВВЭЛ псевдотипированные частицы были неповрежденными, инфекционными и готовыми для использования в измерении проникновения вируса. 16 Рисунок 7. Анализ вирусных частиц, содержащих люциферазу, в непрерывном градиенте сахарозы (0–60%). Фракции были проанализированы на E1-HA-люциферазу методом Вестерн блота с применением моноклональных антител против НА. Определение кинетики проникновения вируса Преимуществом использования псевдотипов, является то, что разные псевдотипы имеют одинаковую сердцевину, а единственным отличием являются разные оболочечные белки. Это позволяет, с одной стороны, изучать особенности проникновения вирусов в клетки (определяются оболочечными белками), и, с другой стороны, позволяет разным псевдотипам выполнять функцию контролей друг для друга в случае неспецифических эффектов. В настоящей работе в качестве контролей использовались эко-MLV и VSV псевдотипы. Известно, что VSV входит в клетки с использованием клатринзависимого эндоцитоза, в то время как эко-MLV, как считается, входит через клеточную поверхность (Mothes et al., 2000a). Клетки инкубировались с вирусными частицами ВВЭЛ env+ВВЭЛ env-luc, eco-MLV env+eco-MLV envluc и VSV-G env+ eco-MLV env-luc, содержащими люциферазу, разное время при MOI, равной 0,5. Для определения кинетики проникновения вируса на первом этапе проведено быстрое связывание вируса, когда вирус инкубировался с клетками в течение одной минуты, после чего свободный вирус отмывался дважды в среде DMEM. Далее клетки инкубировались при 37° С в разные промежутки времени, после чего была измерена люциферазная активность. Частицы, покрытые eco-MLV env, тестировались на клетках 293, экспрессирующих рекомбинантный eco-MLV рецептор. Для других вирусов использовались нативные 293 клетки. Так как измерение кинетики проводилось в реальном времени, было обнаружено, что даже небольшие изменения условий инкубации могут существенно влиять на показания. Так, например, использование воздушного инкубатора на 37° С обеспечивало плохую передачу тепла, что привело к замедлению процесса проникновения в 17 клетки MLV и период проникновения половины вируса удлинился до 40 мин (данные не приведены) вместо 20 мин при применении водяной бани. Проникновение VSV-G и ВВЭЛ псевдотипов было более быстрым, половина времени проникновения всего вируса для них составляла 15 и 10 мин соответственно и не столь заметно зависело от температуры (рис. 8). Эти результаты хорошо согласуются с быстрым путем проникновения ВВЭЛ, возможно, с помощью клатрин-зависимого эндоцитоза. Рисунок 8. Кинетика проникновения разных вирусных частиц. По оси абсцисс – люциферазная активность (103 о.е.с./сек), по оси ординат – время инкубирования клеток с вирусом (мин). Исследование эффекта нейтрализующих антител на проникновение ВВЭЛ псевдотипа Для подтверждения специфичности метода перед добавлением к клеткам вирусные частицы были предварительно инкубированы с антителами против ВВЭЛ. Как показали результаты, для ВВЭЛ частиц сигнал снижался более, чем на 80%, в то время как VSV частицы были не затронуты (рис 9, верхняя часть). Этот факт говорит о том, что ВВЭЛ частицы входят в клетки через механизм, опосредованный ВВЭЛ-оболочечными белками. 18 Рисунок 9. Нейтрализация вирусных частиц специфичными антителами и эффект ингибиторов эндосомального закисления. По оси абсцисс – люциферазная активность (относительно контроля), по оси ординат – используемые антитела и ингибиторы. * Достоверность различий с контролем (р<0,01). Влияние ингибиторов эндосомального закисления на проникновение вируса Ранее нами было показано, что ВВЭЛ псевдотип, для инфицирования клеток, нуждается в понижении pH. Для того чтобы, с одной стороны, проверить функциональность нового метода, и, с другой стороны, определить необходимость низкого pH для проникновения вируса (условия для инфицирования могут отличаться от условий слияние вирусной с клеточной мембраной), были использованы ингибиторы закисления эндосом. Клетки были обработаны бафиломицином, хлоридом аммония, хлорохином и моненсином, после чего была измерена активность люциферазы. Каждый из этих ингибиторов блокировал проникновение VSV-G (pH-зависимый вирус) и ВВЭЛ, но не eco-MLV (рис 9, нижняя часть). Суммируя эти результаты, можно заключить, что ВВЭЛ частицы входят в клетки с помощью pH-зависимого механизма, а анализ проникновения вируса, основанный на определении активности люциферазы, отражает путь проникновения, используемый инфекционным вирусом. Кроме того, существенная разница между сигналом, полученным от вируса с добавлением ингибитора и без него, указывает на низкие фоновые значения и широкий диапазон сигнала, что делает метод идеальным для изучения эффекта других ингибиторов. 19 Влияние Eps15 Е∆95/295 на поглощение трансферрина и проникновение вируса Применение доминантно-негативных мутаций в генах, кодирующих белки, регулирующие эндоцитоз, позволяет изучать их роль в проникновении вируса. Для подтверждения функциональности таких белков, был проверен их эффект на поглощение трансферрина, которое проходит исключительно через клатрин-зависимый эндоцитоз. Первым был проверен эффект доминантнонегативного мутанта Eps15 Е∆95/295, который блокирует клатрин-зависимый эндоцитоз. Клетки инкубировались с Alexafluor594-трансферрин, фиксировались, после чего с помощью конфокального микроскопа было оценено распределение продукта гена и меченного трансферрина (рис. 10А). Рисунок 10. Влияние мутантных форм белков эндоцитоза на проникновение вируса, определенное по поглощению трансферрина с использованием конфокального микроскопа (A) или по вхождению вируса (B). По оси ординат: активность люциферазы. * Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,05). Видно, что в клетках, инфицированных вирусом с вектором без вставки, меченый трансферрин захватывался клетками, что приводило к точечному окрашиванию цитоплазмы (рис. 10, контроль). Напротив, в клетках, инфицированных лентивирусом, кодирующим Е∆95/295, продукт трансгена 20 был слабо экспрессирован, но равномерно распределен в цитоплазме, а трансферрин был обнаружен только на поверхности клетки и в небольшом районе около ядра. Такое распределение указывает на то, что клатринзависимый эндоцитоз был эффективно заблокирован. После этого было измерено проникновение ВВЭЛ, VSV и eco-MLV псевдотипированных вирусов. ВВЭЛ и VSV вели себя одинаково: проникновение ингибировалось более чем на 70% (рис. 10В открытая и заштрихованная колонка), в то время как проникновение eco-MLV практически не менялось (рис. 10В, полосатая колонка). Таким образом эти данные подтвердили, что для проникновения ВВЭЛ и VSV необходим клатрин-зависимый эндоцитоз. Роль ранних и поздних эндосом в проникновении ВВЭЛ Известно, что клатрин-зависимые пузырьки транспортируются и сливаются с ранними и поздними эндосомами, становясь все более закисленными (Gruenberg and Maxfield, 1995). Потому следующим шагом было определение роли ранних и поздних эндосом в проникновении ВВЭЛ. Для этой цели были использованы доминантно-негативные формы Rab5 (S34N) и Rab7 (T22N) и конститутивно активная форма Rab5 Q79L. Так же как и в случае с Е∆95/295, каждый из них был слит с GFP для контроля экспрессии (рис. 10А). Для подтверждения влияния каждого мутанта на клатрин-зависимый эндосомальный транспорт был также использован захват меченого трансферрина. Экспрессия Rab5 дикого типа не ингибировала захват трансферрина и, как ожидалось, меченый трансферрин колокализовался с точечным Rab5-GTP сигналом. Экспрессия доминантно-негативных Rab5 и Rab7 привела к нарушению этого распределения. Так, экспрессия Rab5 S34N приводит к уменьшению захвата трансферрина подобно наблюдаемому в случае Е∆95/295, тогда как Rab7 T22N вызывает накопление трансферрина в пузырьках, больших по размерам и меньших по количеству в сравнении с пузырьками, замеченными в случае экспрессии Rab5 дикого типа (рис. 10А). Подобное распределение трансферрина было ранее описано во время экспрессии Rab7 T22N в Hela клетках (Feng et al., 2001). В нашем случае влияние конститутивно активного мутанта Rab5 Q79L было наиболее выделяющимся, его экспресссия приводила к формированию крупных пузырьков, содержащих трансферрин. Эти крупные пузырьки, скорее всего, являются результатом аккумулирования эндоцитозных пузырьков, находящихся на стадии созревания ранних эндосом, которые остались связанными с мутантным Rab5 (Roberts et al., 1999). В каждом случае анализ проникновения трансферрина показал, что экспрессионные вектора обеспечивали достаточный уровень экспрессии каждого доминантнонегативного гена, необходимого для получения ожидаемого фенотипа. Проникновение ВВЭЛ в клетки было измерено с использованием псевдотипов VSV и eco-MLV в качестве контроля. Псевдотип SFV, модифицированный для использования люциферазы, был взят для сравнения 21 проникновения ВВЭЛ с проникновением вирусов Старого Света. Ранее было показано, что VSV и SFV выходят из клатрин-зависимого эндоцитозного пути в ранних эндосомах, а eco-MLV, как считается, входит в клетки через плазматическую мембрану. Так как единственным отличием между псевдотипами является оболочечный белок, находящийся на их поверхности, различия в кинетике проникновения могут быть результатом функционирования оболочечных белков. Для каждого экспрессируемого гена проникновение MLV оставалось неизменным (рис. 10В снизу), что свидетельствует о том, что клетки оставались чувствительными к вхождению вируса, а экспрессия мутантных генов не повлияла на активность люциферазы. Напротив, экспрессия Е∆95/295, Rab5 (S34N) и Rab5 (Q79L) уменьшала проникновение ВВЭЛ, SFV и VSV на 80-90%. Способность Rab5 Q79L ингибировать проникновение вируса, скорее всего, означает, что для слияния мембран вирус был задержан в аккумулированных ранних эндосомах близко до достижения требуемой кислотности. Сверхэкспрессия Rab5 дикого типа уменьшила проникновение ВВЭЛ и SFV на 30%, но не изменила кинетики проникновения VSV. Влияние эктопичной экспрессии Rab5 дикого типа на ВВЭЛ и SFV может отражать усиленный транспорт вируса в непродуктивный Rab5-зависимый путь, который является продуктивным для VSV. Экспрессия Rab7 T22N имела разный эффект на ВВЭЛ и SFV. Так, проникновение ВВЭЛ было занижено с помощью Rab7 T22N, как это отмечалось и для доминантнонегативного Rab5 и Е∆95/295. В противоположность этому, проникновение SFV и VSV было снижено лишь на 20%. Эти данные говорят в пользу проникновения ВВЭЛ с помощью эндоцитоза через клатрин-зависимый эндоцитоз, причем проникновение вызывается в поздних эндосомах. Зависимость проникновения псевдотипа ВВЭЛ от холестерина Открытие того факта, что ВВЭЛ выходит из поздних эндосом, говорит о том, что механизмы проникновения этого вируса могут отличаться от альфавирусов Старого Света. Использование модельных систем с недостатком холестерина в мембранах показало, что для эффективного слияния SFV и SINV с клеточной мембраной необходим холестерин (Kielian and Helenius, 1984; Lu et al., 1999). Также были идентифицированы аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействие с холестерином (Lu et al., 1999; Vashishtha et al., 1998). Удивительно, но некоторые идентифицированные аминокислотные замены уже присутствовали в Е1-оболочечном белке ВВЭЛ. Предположение о том, что ВВЭЛ входит клетки с помощью холестерин-независимого эндоцитоза может указывать на дополнительную фундаментальную разницу между путями проникновения альфавирусов Старого и Нового Света и на необходимость прохождения к эндоцитозному компартменту, где холестерин отсутствует. Для проверки этого предположения был использован нистатин, который связывает клеточный холестерин. Недавно было показано, что обработка клеток нистатином блокировала холестерин-зависимое проникновение вируса Эбола 22 (Empig and Goldsmith, 2002). В нашем исследовании была проведена модификация метода включения люциферазы (не показано), которая позволила использовать псевдотип Эбола вируса в качестве контроля. Ранее было показано, что В-субъединица токсина холеры проникает в клетку с помощью холестерин-зависимого пути (Orlandi and Fishman, 1998). Это позволило нам подобрать минимальную концентрацию нистатина (60 мкг/мл), которая нарушала захват субъединицы токсина холеры без влияния на выживаемость клеток (токсин присутствовал на поверхности клетки, но практически отсутствовал внутри клетки). При этой концентрации проникновение Эбола было заблокировано более чем на 90%. Проникновение VSV и SFV также было заметно ингибировано: на 55% и 65% соответственно (рис. 11), что существенно отличало их от ВВЭЛ, который показал значительную устойчивость к обработке клеток нистатином, а проникновение было ингибировано лишь на 20%. Эти данные указывают на то, что ВВЭЛ входит в клетки с помощью механизма, независимого от свободного холестерина, что делает данный вирус отличным от альфавирусов Старого Света. Рисунок 11. Роль клеточного холестерина в механизме проникновения ВВЭЛ. (A) Фотография флюоресцентно меченной Б-субъединицы токсина холеры с 293 клетками, слева без нистатина, справа с нистатином. (Б) Проникновение вируса было измерено в необработанных (открытые столбики) или в клетках обработанных нистатином (сплошные столбики) с помощью измерения люциферазной активности. Значения были нормализованы к контрольным клеткам обработанным DMSO. * Достоверность различий между ВВЭЛ и SFV (p<0,05). 23 Заключение Изучение механизмов проникновения вирусных частиц в клетку хозяина является одной из актуальных проблем современной биохимии и вирусологии. Известно, что существует множество разнообразных механизмов проникновения, причем все они высоко специфичны для каждого конкретного вируса. Поэтому изучение специфичных потребностей вируса в клеточных факторах имеет огромное значение как для фундаментальной науки, изучающей патогенез вирусов, так и для прикладной науки, где важно выявление мишеней для рационально разрабатываемых противовирусных препаратов. В настоящей работе для измерения слияния вирусной и клеточной мембран разработан новый метод. Этот метод основан на идее, что люцифераза, заключенная внутри вирусной оболочки, остается неактивной до того момента, пока не произойдет слияния клеточной и вирусной мембран, а люциферазный субстрат (люциферин, ATP и кислород) не получит доступ к ферменту. Такой подход имеет большое преимущество по сравнению с предыдущими методами, которые нуждаются в добавлении флюоресцентных красителей к вирусной и/или клеточной мембране, обнаружении освобождения вирусного генетического материала и прямом микроскопическом обнаружении процессов слияния. Предложенный метод является высокочувствительным, позволяющим количественно измерять процессы ранней инфекции и обеспечивающим измерение кинетики в реальном времени процесса проникновения. Результаты по использованию ингибиторов эндосомального закисления показали, что ВВЭЛ входит в клетки с помощью рН-зависимого механизма. Каждый из использованных в работе ингибиторов проникновения: хлорид аммония, хлорохин, моненсин и Бафиломицин А1 блокировал развитие вирусной инфекции ВВЭЛ и VSV псевдотипов, тогда как для eco-MLV эффекта не было. Экспрессия доминантно-негативных генов показала, что для проникновения ВВЭЛ, так же как и для VSV, необходим клатрин-зависимый эндоцитоз и формирование ранних эндосом. Однако ВВЭЛ отличался от VSV и от близкородственного SFV тем, что для него было необходимым еще и функционирование поздних эндосом, что делает ВВЭЛ более похожим на вирус гриппа, нежели на SFV или VSV. Различия могут быть обусловлены более низким рН, необходимым для слияния мембран, или зависимостью от вторичных факторов, присутствующих в поздних эндосомах. Вторым отличием от близкородственного SFV оказалась зависимость от холестерина. Различия в чувствительности к холестерину могут отражать различия в композиции мембран пузырьков, с которыми вирус сливается, и из которых выходит в цитоплазму. Действительно, было показано, что поздние эндосомальные компартменты почти не содержат мембранного холестерина, в то время как ранние эндосомы и рециклинговые пузырьки 24 обогащены холестерином (Kobayashi et al., 1998; Kobayashi et al., 2002). Роль холестерина в проникновении SFV может отражать необходимость выхода вируса из ранних эндосом, в то время как ВВЭЛ адаптировался к меньшему количеству холестерина из-за необходимости выхода из поздних эндосом, содержащих мало холестерина. В дополнение к рН, холестерин может обеспечивать для вируса новый механизм определения состояния эндосомального пузырька в процессе созревания для оптимизации условий вирусной репликации. ВЫВОДЫ 1. Присоединение люциферазы к С-концу оболочечного белка MLV вируса через линкерный пептид Glu-Phe обеспечивает эффективное включение люциферазы в вирусную частицу, что позволяет использовать эту конструкцию для измерения проникновения вируса в клетку в реальном времени. 2. Для проникновения вируса MLV в клетку необходим оболочечный белок дикого типа, так как добавление этого белка к белку, слитому с ферментом, приводит к получению интактного вируса с целостной мембраной и повышает его титр до титра вируса дикого типа. 3. Разработан новый, универсальный и чувствительный метод, с помощью которого подтверждено, что вирусы VSV и MLV входят в клетку через специфичный рецептор-зависимый механизм. 4. При использовании искусственного кодона инициации трансляции, который предшествовал открытой рамке считывания, кодирующей белки Е3Е1, впервые получен псевдотип вируса ВЭЛ, имеющий высокий титр (106 к.ф.е./мл) и несущий на своей поверхности нативные эпитопы, узнаваемые моноклональными антителами к вирусу дикого типа. 5. Впервые установлено, что присоединение люциферазы к оболочечному белку вируса ВЭЛ с помощью удлиненного полилинкера, состоящего из 3-х копий НА-эпитопа, позволяет включить люциферазу в псевдотип вируса ВЭЛ. Добавление оболочечного белка дикого типа оказалось необходимым для получения вируса с ненарушенной мембраной и позволило количественно измерять проникновение ВЭЛ псевдотипа в клетку в реальном времени. 6. Впервые показано, что ВВЭЛ проникает в клетки с помощью клатринзависимого эндоцитоза и нуждается в функционально активных ранних и поздних эндосомах, причем процесс проникновения не зависит от холестерина. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Тикунова Н. В., Колокольцов А. А. и Чепурнов А. А. (2001) Рекомбинантные моноклональные человеческие антитела против вируса Эбола// Доклады Академии Наук, 378, 195-197. 25 2. Kolokoltsov, A. A. and Davey, R. A. (2004) Rapid and sensitive detection of retrovirus entry by using a novel luciferase-based content-mixing assay// Journal of Virology, 78, 5124-5132. 3. Kolokoltsov, A. A., Weaver, S. C. and Davey, R. A. (2005) Efficient functional pseudotyping of oncoretroviral and lentiviral vectors by Venezuelan equine encephalitis virus envelope proteins// Journal of Virology, 79, 756-763. 4. Kolokoltsov, A. A., Fleming, E. H. and Davey, R. A. (2006a) Venezuelan equine encephalitis virus entry mechanism requires late endosome formation and resists cell membrane cholesterol depletion// Virology, 347, 333-342. 5. Kolokoltsov, A. A., Wang, E., Colpitts, T. M., Weaver, S. C. and Davey, R. A. (2006b) Pseudotyped viruses permit rapid detection of neutralizing antibodies in human and equine serum against Venezuelan equine encephalitis virus// The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 75, 702-709. 6. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A. and Davey, R. A. (2006) Novel, rapid assay for measuring entry of diverse enveloped viruses, including HIV and rabies// Journal of Virological Methods, 135, 143-150. Список используемых сокращений: ВВЭЛ – вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей ВИЧ – вирус иммунодифицита человека к.ф.е. – колонию формирующая единица Л/НЛ – соотношение люциферазной активности лизированного вируса к активности нелизированного о.е.с. – относительная единица света ПЦР – полимеразная цепная реакция 293 HEK – эмбриональные клетки почки человека env – оболочечный белок вируса env-luc – оболочечный белок вируса, слитый с люциферазой GFP – зеленый флюоресцирующий белок luc – люцифераза MLV – вирус лейкоза мышей MOI – множественность заражения RRV – вирус долины реки Росс SFV – вирус леса Семлики SINV- вирус Синдбис TM – трансмембранный фрагмент VSV – Вирус Везикулярного Стоматита Соискатель А.А. Колокольцов 26