На правах рукописи Никишина Марина Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ
реклама
На правах рукописи Никишина Марина Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АРИЛАМИН N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗ И АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО У ЕВРОПЕОИДОВ г. НОВОСИБИРСКА 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.А.Вавилин Научный консультант: доктор биологических наук, профессор С.Х.Дегтярев Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.Р.Колпаков кандидат медицинских наук В.Н.Максимов Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) Защита состоится "___" _______ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383)333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института биохимии СО РАМН ГУ Автореферат разослан "___" ____________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 2 Г.С.Русских Научно- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В современных молекулярно-эпидемиологических исследованиях многофакторных заболеваний, к которым относятся и онкологические, широко используется подход, основанный на исследовании ассоциаций полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально вовлечены в развитие и регуляцию тех или иных звеньев патогенеза заболевания, так называемый подход кандидатных генов (Пузырев, Степанов, 1997). С этих позиций перспективным объектом исследования представляются ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), которые ответственны за процессы токсификации и детоксификации чужеродных соединений, в том числе и канцерогенных веществ (Galton, Ferns, 1999). Соотношение процессов токсификации и детоксификации сильно варьирует между индивидуумами вследствие высокой популяционной вариабельности генов ФБК (Weber, 1999). Особое значение дисбаланс детоксификации/токсификации ксенобиотиков имеет для онкологической патологии, составляя важную часть процессов стадии инициации. Рак легкого – самое распространенное в мировой популяции злокачественное заболевание. Ежегодно в мире диагностируется около 1 млн новых случаев рака легкого (Трахтенберг, Чиссов, 2000). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью заболевания, но и поздней диагностикой, неудовлетворительными результатами лечения и, как следствие, высокой летальностью. Это делает актуальным изучение всех факторов, причастных к начальному этапу канцерогенеза, в том числе и ФБК. К группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков относятся ариламин N-ацетилтрансферазы (E.C. 2.3.1.5.): NAT1 и NAT2, осуществляющие Nи O-ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и гидразинов (Hein et al., 2000). Обширный скрининг субстратов показал, что NAT1 и NAT2 имеют перекрывающиеся, но четко отличающиеся профили специфических активностей (Kawamura et al., 2005). Давно известный полиморфизм NAT2 фенотипически проявляется наличием в популяции «быстрых» и «медленных» ацетиляторов, при этом у представителей европеоидной расы частота «медленных» ацетиляторов составляет 40-60% (Evans, 1989). Долгое время считалось, что для NAT1 не свойственен метаболический полиморфизм, но недавно показано, что около 8% европеоидов являются медленными ацетиляторами по специфическим субстратам NAT1 (Butcher et al., 1998). Причиной метаболического полиморфизма ацетилирования являются некоторые нуклеотидные замены в белок-кодирующем регионе гена NAT2 (Grant et al., 1990) и кодирующем и некодирующем регионе гена NAT1 (Weber, Vatsis, 1993). Молекулярные механизмы, ведущие к фенотипу «медленного» ацетилятора до сих пор не совсем понятны. Снижение активности ацетилирования в несколько сотен и даже тысяч раз происходит за счет снижения экспрессии белка (Leff et al., 3 1999), образования менее стабильного белка (Grant et al., 1997; Delomenie et al., 1997) или усиленной деградации белка (Butcher et al., 2004; Zang et al., 2004). Эти различия в механизмах реализации, а также характерная субстратная специфичность аллозимов (Hickman et al., 1995), свидетельствуют о гетерогенности группы медленных ацетиляторов. После того, как была показана роль ацетилирования в метаболической активации и детоксификации канцерогенов, присутствующих в табачном дыме, окружающей среде и потребляемой пище (Hein et al., 1993; 1994: Fretland et al., 2001; 2002), стали широко проводиться исследования ассоциаций между полиморфизмом NAT и онкологическими заболеваниями. К настоящему времени показано, что статус ацетилирования вносит изменения в риски возникновения рака мочевого пузыря (Inatomi et al., 1999; Hein, 2006) и толстой кишки (Hein et al., 2000; Tamer et al., 2006). Имеющиеся немногочисленные данные литературы о связи полиморфизма NAT и рака легкого противоречивы (Cascorbi et al., 1996; Bouchardy et al., 1998; Wikman et al., 2001). В этих исследованиях по результатам генотипирования делили аллели на две группы: ведущие к фенотипу медленного или быстрого ацетилятора. Однако в свете последних данных о разнообразии проявлений полиморфных вариантов генов NAT, изучение их ассоциации с заболеванием имеет самостоятельное значение. Одним из наиболее востребованных методов обнаружения полиморфных вариантов генов является анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). В связи с открытием все новых полиморфизмов в генах NAT, иногда в непосредственной близости от ранее известных, важна более точная локализация выявляемых полиморфизмов (Hein et al., 2000). Поэтому оптимизация метода ПДРФ является актуальной задачей. Генетический полиморфизм NAT2 у европеоидов Западной Сибири, как и вообще России, остается малоизученным. Генетический полиморфизм NAT1 у европеоидов России не изучен вообще. В связи с этим, имеет большое значение изучение распределения частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT у европеоидов России, а также поиск возможных специфических полиморфизмов в нашей популяции. Целью настоящей работы является исследование полиморфизма генов NAT1 и NAT2 методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализ ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить возможность использования новых эндонуклеаз рестрикции для более надежного и точного обнаружения известных полиморфизмов генов NAT1 и NAT2 и поиска новых полиморфизмов. 2. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска. 4 3. Провести анализ ассоциаций аллелей, генотипов и комбинаций генотипов полиморфных вариантов генов NAT c раком легкого. Научная новизна исследования Впервые предложен способ обнаружения полиморфизма Δ1025 гена NAT1 методом ПДРФ-анализа и предложены способы однозначного определения полиморфизмов A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 этим методом. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов C97T, С190Т, 350,351G>C, T402C, A752T и Δ1025 гена NAT1 и С190Т, G191A, A434C, C759T, T859C, 859Del гена NAT2. Впервые у европеоидов Западной Сибири определены частоты встречаемости полиморфных вариантов C282T, A803G и G857A гена NAT2. Установлено, что аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. Комбинация генотипов гена NAT2 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого. Практическая значимость работы Предложены новые способы ПДРФ-анализа генов NAT, которые позволяют однозначно определить полиморфизмы A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2, а также различить полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. Эти способы применимы в исследованиях, направленных на изучение функциональных проявлений полиморфизмов генов NAT, кинетических характеристик аллозимов NAT и популяционногенетических исследованиях. Полученные данные о распределении аллелей и генотипов полиморфных вариантов NAT у жителей г. Новосибирска представляют интерес для геногеографических и генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний человека. Результаты настоящей работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют однозначно определять полиморфизмы C190T и G857A гена NAT2 и A752T гена NAT1, а также различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. 5 2. Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска соответствует таковому в других популяциях европеоидов. 3. В европеоидной популяции г. Новосибирска аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. 4. Комбинация генотипов 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG гена NAT2 в исследованной популяции ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого. Апробация работы. Материалы исследования были представлены на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004); на Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Современное состояние и перспективы развития клинической онкологии» (Томск, 2004); на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ (из них 4 в рецензируемой печати). Структура работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 20 таблиц и 14 рисунков и состоит из шести разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 230 ссылок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена с использованием банка образцов периферической крови, собранного при выполнении программы «Здоровье населения Сибири», проект «Оценка генетически полиморфных форм ферментов биотрансформации чужеродных соединений как факторов риска развития рака у жителей г. Новосибирска» (руководитель – академик РАМН Ляхович В.В.). Группа больных раком легкого состояла из 122 чел. (мужчин - 78, женщин - 44), средний возраст составил 60.4 ± 10.4 лет. Постановка диагноза по совокупности рентгенологических, клинических и, в части случаев, на основании результатов гистологического исследования, сбор учетной информации и биологического материала проведен врачем-онкологом Наровым Ю.Э. на базе поликлинического отделения онкологического диспансера г. Новосибирска. 6 Контрольная группа людей без признаков онкологических заболеваний состояла из 167 чел. (мужчин - 119, женщин – 48), средний возраст составил 56.8 ± 18.9 лет. Все обследованные индивиды являлись европеоидами и не состояли в родстве. Часть образцов ДНК контрольной группы предоставлена ГУ НИИ терапии СО РАМН, собранных при проведении эпидемиологического исследования по программе ВОЗ «MONIKA». К группе курящих в нашем исследовании относили лиц, курящих на момент исследования, и учитывали суточную дозу в пачках. В качестве объекта исследования были использованы образцы тотальной геномной ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови. Методы. Выделение ДНК проводили из образцов цельной периферической крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Маниатис, 1984). Фрагменты генов NAT1 размером 1552 п.н. и NAT2 размером 1000 п.н., которые включали единственный транслируемый экзон размером 870 п.н., амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Hickman, Sim, 1991; Payton, Sim, 1998). Подбор эндонуклеаз рестрикции проводился с использованием программ Dnasis и Vector NTI в первичных последовательностях генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059) и NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1). Полиморфные варианты генов NAT (табл. 1) выявляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью опубликованных (Hickman, Sim, 1991; Bell et al., 1993; Lin et al., 1994; Cascorbi et al., 1995; Woolhouse et al. 1997; Lin et al., 1998; Leff et al., 1999) и оригинальных способов. Все использованные в работе эндонуклеазы рестрикции произведены в НПО «СибЭнзим» (Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли путем горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере и визуализировали в проходящем УФ-свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Россия). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059), NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1) и NATP (GenBank, Acc. Number X17060) проводили при помощи компьютерной программы для сравнения нуклеотидных последовательностей CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных статистических программ SPSS 11.5 и программы EpiInfo 6. Об ассоциации аллелей, генотипов и комбинаций генотипов с раком легкого судили по величине отношения шансов (ОШ) (Флетчер и др., 1998). Достоверность различий в частотах встречаемости изучаемых признаков между группой больных и контрольной группой оценивалась по критерию 2 с коррекцией Йейтса или по двустороннему критерию Фишера, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений. 7 Таблица 1 Общая характеристика изученных полиморфных вариантов генов NAT Ген NAT1 NAT2 Нуклеотидная замена C97T C190T G350,351C T402C A752T 1025 T111C C190T G191A C282T A434C C481Т G590A C759T A803G G857A T859C 859Del Аминокислотная замена Arg33Stop Arg64Trp Arg117Thr Asp251Val Arg64Trp Arg64Gln Gln145Pro Arg197Gln Lys268Arg Gly286Glu Ser287Pro Ser287Frameshift Локализация в гене ORF ORF ORF ORF ORF 3'-UTR ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF ORF РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAT Полиморфизм 1025 гена NAT1 обнаружен Lo-Guidice J-M. et al. (2000). К настоящему времени не было разработано способа его обнаружения методом ПДРФ-анализа. Нами предложено использовать эндонуклеазу Sse9I для обнаружения полиморфизма 1025, при наличии которого наблюдается исчезновение сайта узнавания (рис. 1). Более предпочтительно обнаружение полиморфизма по появлению нового сайта узнавания при его наличии, но в данном случае анализ сайтов узнавания известных эндонуклеаз рестрикции показал отсутствие такой возможности. 8 а) б) Рис. 1. Обнаружение полиморфизма 1025 гена NAT1 методом ПДРФанализа. (а) Положение сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sse9I (выделен сайт узнавания ААТТ). Звездочкой обозначено положение полиморфизма. (б) Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой Sse9I. Дорожки 1-12 – «дикая» гомозигота; М – маркер точных длин фрагментов ДНК. Полиморфизм А752T гена NAT1 был открыт Lin H.J. et al. (1998), для обнаружения которого методом ПДРФ-анализа этими авторами предложено использовать эндонуклеазу рестрикции BglII. Для BglII в последовательности аллеля «дикого» типа гена NAT1 имеется единственный сайт узнавания, который затрагивает нуклеотиды 750-755. Нами предложено для обнаружения А752Т использовать эндонуклеазу Bst4CI, что дает возможность определенно локализовать полиморфизм по появлению нового сайта узнавания в аллеле 752T (рис. 2). Дополнительным преимуществом использования эндонуклеазы рестрикции Bst4СI является наличие в последовательности гена NAT1 двух константных сайтов узнавания, что позволяет контролировать полноту протекания гидролиза. Рис. 2. Обнаружение полиморфизма A752T (Asp251Val) гена NAT1 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BglII и Bst4CI. Звездочкой обозначено положение 752. 9 В исследованной нами выборке обнаружен один гетерозиготный носитель полиморфизма А752T. При этом результаты ПДРФ-анализа для эндонуклеазы рестрикции BglII совпадают с таковыми для Bst4CI (рис. 3). Рис. 3. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазами рестрикции BglII (а) и Bst4CI (б). Дорожка 5 – генотип 752АT; М – маркер точных длин фрагментов ДНК. Для обнаружения полиморфизма G191A (Arg64Gln) гена NAT2 методом ПДРФ-анализа было предложено использовать эндонуклеазу MspI (Bell et al., 1993). Для MspI в интересующем районе сайт узнавания имеется в аллеле «дикого» типа и затрагивает нуклеотиды 189-192 (рис. 4). Рис. 4. Обнаружение полиморфизмов С190Т и G191A гена NAT2 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MspI, Bse1I и Bst2UI. Звездочками обозначены положения полиморфизмов. После того, как был открыт полиморфизм C190T (Arg64Trp) гена NAT2 (Shishikura et al., 2000) стало понятно, что при выявлении полиморфизма G191A эндонуклеазой MspI часть образцов может содержать полиморфизм C190T. До настоящего времени не был разработан способ различать эти два полиморфизма методом ПДРФ-анализа. Нами предложено проводить гидролиз исходных амплифицированных образцов с выявленным MspIполиморфизмом последовательно эндонуклеазами Bse1I и Bst2UI. Для эндонуклеазы Bse1I появляется новый сайт узнавания в аллеле 190Т, что свидетельствует о наличии полиморфизма C190T и об отсутствии полиморфизма G191A. Если электрофоретическая картина гидролиза 10 эндонуклеазой Bse1I свидетельствует об отсутствии C190T, следующий этап заключается в гидролизе исходных амплифицированных образцов эндонуклеазой Bst2UI, для которой появляется новый сайт узнавания в аллеле 191A (рис. 4). Рис. 5. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой рестрикции MspI. Дорожки 1-10 – «дикая» гомозигота; М – маркер точных длин фрагментов ДНК. В исследованной нами выборке не обнаружено индивидуумов с MspIполиморфизмом, что свидетельствует об отсутствии полиморфных вариантов С190Т и G191A (рис. 5), однако при исследовании популяций с высокой частотой встречаемости MspI-полиморфизма, например афро-американской, предложенный нами комплексный подход может иметь большое прикладное значение. В гене NAT2 одним из первых был открыт полиморфизм G857A (Gly286Glu) (Ohsako, Deguchi, 1990), для обнаружения которого методом ПДРФ-анализа было предложено использовать эндонуклеазу BamHI (Hickman, Sim, 1991). Для BamHI в последовательности аллеля «дикого» типа гена NAT2 имеется единственный сайт узнавания, который затрагивает нуклеотиды 856-861 (рис. 6). Недавно были открыты полиморфизмы T859C (Ser287Pro) и 859Del, который приводит к сдвигу рамки считывания (Anitha, Banerjee; 2003). Соответственно, выявленный по предложенному методу (Hickman, Sim, 1991) аллель 857A на самом деле может оказаться 859C или 859Del. Способ, позволяющий различать эти полиморфизмы с помощью ПДРФ-анализа, до настоящего времени не был разработан. Нами предложено проводить гидролиз исходных амплифицированных образцов с выявленным BamHI-полиморфизмом последовательно эндонукеазами HinfI и AspS9I. Для эндонуклеазы HinfI появляется новый сайт узнавания в аллеле 857A, что свидетельствует о наличии полиморфизма G857A и об отсутствии полиморфизмов T859C и 859Del. Дополнительным преимуществом 11 использования эндонуклеазы HinfI, по сравнению с BamHI, является наличие константных сайтов в последовательности гена, что позволяет контролировать полноту протекания ферментативного гидролиза. Если электрофоретическая картина гидролиза эндонуклеазой HinfI свидетельствует об отсутствии G857A, следующий этап будет заключаться в гидролизе эндонуклеазой AspS9I, для которой появляется новый сайт узнавания при наличии полиморфизмов T859C или 859Del, при этом различить эти два полиморфизма не представляется возможным. Рис. 6. Обнаружение полиморфизмов G857A, T859C и 859Del гена NAT2 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI, HinfI и AspS9I. Звездочками обозначены положения полиморфизмов. При проведения рестрикционного анализа в нашей выборке образцы с выявленным BamHI-полиморфизмом подвергались гидролизу HinfI. Для всех образцов с BamHI-полиморфизмом при гидролизе HinfI наблюдалось появление нового сайта узнавания, что свидетельствует о наличии полиморфизма G857A во всех образцах и отсутствии полиморфизмов T859C и 859Del в исследованной нами выборке. Типичные электрофореграммы гидролиза представлены на рисунке 7. Рис. 7. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазами рестрикции BamHI (а) и HinfI (б). М – маркер точных длин фрагментов ДНК. (а) 2, 3, 4,5 – «дикий» генотип; 1 – генотип 857AG. (б) 4, 7, 8, 9 – «дикий» генотип; 1, 2, 3, 5, 6 – генотип 857AG. 12 Обобщенная характеристика длин фрагментов, образующихся в ходе ферментативного гидролиза по оригинальным методикам ПДРФ-анализа, представлена в таблице 2. Таблица 2 Оригинальные методики обнаружения полиморфных вариантов генов NAT ПДРФ-анализом Ген Замена NAT1 A752T 1025 Эндонуклеаза Bst4CI Sse9I C190T G191A G857A Bse1I Bst2UI HinfI NAT2 Длина образующихся фрагментов «Дикий» аллель Полиморфный аллель 879, 194, 479 879, 194, 53, 426 226, 27, 51, 99, 26, 226, 27, 51, 99, 26, 358, 110, 73, 139, 358, 110, 73, 139, 392, 289, 103, 46, 5 46, 5 227, 62, 18, 693 188, 39, 62, 18, 693 204, 273, 367, 156 186, 18, 273, 367, 156 467, 137, 396 467, 137, 249, 147 Поиск новых полиморфизмов в гене NAT2 Несмотря на то, что генетический полиморфизм NAT2 давно известен (Grant et al., 1990), до настоящего времени продолжается активный поиск новых полиморфных вариантов этого гена. В результате проведенных работ к 1995 г. было открыто 9 полиморфизмов в гене NAT2 (Vatsis et al., 1995), к 2000 г. – 13 полиморфизмов (Hein et al., 2000), а в 2003 г. было обнаружено еще 4 полиморфизма (http://louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html). Такая динамика открытия новых полиморфных вариантов гена NAT2 наталкивает на мысль о существовании еще неописанных полиморфизмов. Поскольку ПДРФ-анализ позволяет не только выявлять известные полиморфизмы, но также дает возможность поиска новых, нами был проведен такой поиск. Для формирования набора эндонуклеаз рестрикции предварительно были определены положения сайтов узнавания для различных эндонуклеаз в первичной последовательности гена NAT2 (GenВank, Acc. Number X14672) с использованием программы Dnasis. Из этого списка была отобрана группа эндонуклеаз рестрикции, для которых уже имеются сайты узнавания и возможно появление новых сайтов в нуклеотидной последовательности гена NAT2: AccB1I, AluI, AspS9I, Bme18I, BstACI, Bst4CI, BstDSI, ErhI, Fsp4HI, HinfI, RsaI, SfaNI, SmiMI. Для отобранной группы эндонуклеаз рестрикции был проведен анализ появления новых сайтов узнавания при наличии возможных полиморфизмов в участках последовательности, частично совпадающих с сайтами узнавания этих эндонуклеаз. 13 В результате, при частичном перекрывании имеющихся и появляющихся при возможных полиморфизмах сайтов узнавания, данным набором эндонуклеаз тестировали в сумме 254 нуклеотида (29.7% транслируемой последовательности гена). Среди этих нуклеотидов выявление замены на любой из трех других нуклеотидов (например, замена Т на А, G или C) было возможно в 50 положениях нуклеотидной последовательности гена (6.2%); на два из трех – в 37 положениях (4.3%); только на определенный нуклеотид – в 167 положениях (19.2%). В качестве иллюстрации выявления любой замены приведем тимин в положении 709. В этой области первичная последовательность частично совпадает с сайтами узнавания для нескольких эндонуклеаз (табл. 3). Во втором варианте выявление замены в двух из трех возможных нуклеотидов достигалось в 37 положениях. Например, на участке последовательности 5-87GCACCAGA в положении 90 у «дикого» типа находится цитозин, в случае мутации C90T появляется новый сайт узнавания для эндонуклеазы SfaNI (5-87GCATC); при мутации С90G - для эндонуклеазы Fsp4HI (5-87GCAGC); выявление мутации C90A используемым набором эндонуклеаз невозможно. Таблица 3 Возникновение новых сайтов узнавания в результате возможных замен в положении 709 Варианты Участок Распознающая полиморфизма последовательности эндонуклеаза «Дикий» тип 5-705GGGCTTCAT Полиморфизм Т709А SfaNI (GCATC) 5-705GGGCАTCAT Полиморфизм Т709С AspS9I (GGNCС) 5-705GGGCСTCAT 705 Полиморфизм Т709G BstACI (GRCGYR) 5- GGGCGTCAT Примечание: подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз. В исследованной выборке европеоидов мы не обнаружили новых полиморфизмов в гене NAT2. Объем исследованной выборки (79 человек, 158 аллелей) позволяет заключить, что при возможном обнаружении этих полиморфизмов в большей выборке европеоидов, они с высокой вероятностью будут относиться к категории редких мутаций. Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT в контрольной выборке европеоидов г. Новосибирска Нами проведено генотипирование по шести описанным в литературе полиморфным вариантам гена NAT1 (Deitz et al., 1997; Lin et al., 1998; LoGuidice, 2000) у 74 индивидуумов контрольной группы (табл. 4). 14 Таблица 4 Частоты встречаемости полиморфных аллелей гена NAT1 у европеоидов г. Новосибирска в сравнении с литературными данными Аллель Результаты исследования Данные литературы*, частота Абс. Частота 97T 0 0 0-0.015 190T 0 0 0.001-0.005 350,351C 0 0 0 402C 0 0 0-0.002 752T 1 0.007 0.004-0.006 1025 0 0 0.002 Примечание: * - Lin et al., 1998; Lo-Guidice et al., 2000; Cascorbi et al., 2001; Fronhoffs et al., 2001; Soucek et al., 2004. Генотипирование NAT2 проведено по двенадцати описанным в литературе полиморфным вариантам (Hein et al., 2000; Anitha, Banerjee; 2003) у 167 индивидуумов контрольной группы (табл. 5). Таблица 5 Частоты встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2 у европеоидов г. Новосибирска в сравнении с литературными данными Аллель Результаты исследования Абс. Частота Данные литературы*, частота 111C 0 0 190T 0 0 0 191A 0 0 0 282T 108 0.323 0.279-0.347 481T 137 0.410 0.388-0.442 434C 0 0 0.004 590A 110 0.329 0.268-0.317 759T 0 0 0.009 803G 137 0.410 0.395-0.428 857A 9 0.027 0.020-0.034 859C 0 0 0.003 859Del 0 0 0.003 Примечание: * - Lin et al., 1994; Brockmoller et al., 1996; Woolhouse et al., 1997; Gross et al., 1999; Anitha, Banerjee, 2003; Gaikovitch et al., 2003. 15 Полученные нами результаты свидетельствуют о схожей картине распределения частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT в Западно-Сибирской популяции европеоидов с другими европеоидными популяциями. Исследование ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска Исследование ассоциаций проведено для полиморфных вариантов C282T, C481T, G590A, A803G и G857A гена NAT2 с раком легкого. По всем исследованным полиморфным вариантам гена NAT2 наблюдается соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга. Анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов C282T, C481T, G590A, A803G и G857A гена NAT2 показал отсутствие статистически значимых различий между общей группой больных раком легкого и контрольной группой (табл. 6). Таблица 6 Распределение генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 у больных раком легкого и в контрольной группе Генотипы СС СТ ТТ CC CT TT GG GA AA AA AG GG GG GA Рак легкого Контроль Абс. Частота Абс. Частота С282Т 53 0.434 78 0.467 55 0.451 70 0.419 14 0.115 19 0.114 С481Т 39 0.320 59 0.353 68 0.557 79 0.473 15 0.123 29 0.174 G590A 59 0.484 72 0.431 51 0.418 80 0.479 12 0.098 15 0.090 A803G 53 0.434 55 0.329 53 0.434 87 0.521 16 0.131 25 0.150 G857A 116 0.951 158 0.946 6 0.049 9 0.054 16 р 0.667 0.667 0.872 0.638 0.195 0.308 0.444 0.363 0.967 0.089 0.182 0.783 0.928 0.928 Опыт молекулярно-эпидемиологических исследований показывает, что сила ассоциации признака с заболеванием в объединенных группах может быть слабой и не достигать уровня достоверности вследствие разнонаправленных эффектов многих неучтенных факторов (Garte, 2001). Поэтому был выполнен анализ распределения частот аллелей и генотипов гена NAT2 c учетом фактора курения и пола. В результате проведенного анализа с учетом пола выявлены достоверные различия в частоте встречаемости аллеля 803G у мужчин больных раком легкого (30.8%) по сравнению с мужчинами контрольной группы (42.4%) (2 = 4.97, p = 0.026). Значение ОШ = 0.60 свидетельствует об ассоциации аллеля 803G с устойчивостью к возникновению рака легкого у мужчин. При анализе распределения генотипов по этому полиморфизму выявлено, что «дикий» генотип 803AA достоверно чаще встречался у больных раком легкого мужчин (47.4%) по сравнению с мужчинами контрольной группы (31.9) (2 = 4.17, р = 0.041). Значение ОШ = 1.92 свидетельствует об ассоциации данного генотипа с предрасположенностью к раку легкого у мужчин. По полиморфным вариантам C282T, C481T, G590A и G857A гена NAT2 статистически значимых различий между группой больных раком легкого и контрольной группой при учете фактора курения не обнаружено. % 60 рак легкого контроль 51,3 50 р=0,026 42,4 40 30,8 30 43,6 p=0,041 47,4 31,9 20 16,8 9 10 0 G аллель GG AG генотип AA Рис. 8. Распределение частот генотипов полиморфного варианта A803G гена NAT2 и аллеля 803G у мужчин в группе больных раком легкого и в контрольной группе. Далее был проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 с учетом и пола, и фактора курения. В подгруппе больных раком легкого не оказалось курящих женщин, поэтому анализ выполнен для трех подгрупп (некурящих женщин, курящих мужчин и некурящих мужчин). 17 Анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов C282T, C481T, G590A и G857A гена NAT2 показал отсутствие статистически значимых различий между группой больных раком легкого и контрольной группой при учете и пола, и фактора курения. При анализе распределения генотипов полиморфного варианта A803G выявлено, что «дикий» генотипа 803АА (рис. 9) чаще встречался в подгруппе курящих больных раком легкого мужчин (52.5%) по сравнению с курящими мужчинами контрольной группы (34.1%) (2 = 4.09, p = 0.043). При этом значение ОШ = 2.13 свидетельствует об ассоциации данного генотипа с предрасположенностью к раку легкого у курящих мужчин. рак легкого % 60 p=0,043 контроль 52,4 50 39,6 40 30 39,3 27,9 20 8,2 10 52,5 34,1 13,4 0 G аллель GG AG генотип AA Рис. 9. Распределение частот генотипов полиморфного варианта A803G гена NAT2 и аллеля 803G у курящих мужчин в группе больных раком легкого и в контрольной группе. Проведенный сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов C282T, C481T, G590A, A803G и G857A гена NAT2 у больных раком легкого разных гистологических типов не выявил статистически значимых различий. Исследование ассоциаций комбинаций генотипов гена NAT2 с раком легкого у жителей г. Новосибирска Анализ распределения частот комбинаций генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 (рис. 10) выявил достоверные различия в частоте встречаемости комбинации 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG в группе больных раком легкого (6.6%) по сравнению с контрольной группой (0.6%) (2 = 6.44, p = 0.005) и комбинации 282TС/590AG/481СC/803GA/857GG в группе больных раком легкого (0%) по сравнению с контрольной группой (3.6%) (2 = 2.88, р = 0.041). При этом комбинация генотипов 18 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого (ОШ = 11.65), а комбинация 282TС/590AG/481СC/803GA/857GG (ОШ = 0.22 при допущении единичного случая в подгруппе больных раком легкого) ассоциирована с устойчивостью к заболеванию. Эти комбинации генотипов характеризуются наличием аллеля, содержащим С481T без A803G или во втором случае, наоборот, A803G без С481T. Известно, что в популяции европеоидов наиболее часто встречаются аллели, в которых сочетаются полиморфизмы С282Т и G590A; C481T и A803G (Barrett et al., 2003; Gaikovitch et al., 2003). Поэтому полученный факт свидетельствует о большом эпидемиологическом значении этих комбинаций. % рак легкого 25 20 5 23 22,2 21,6 17 14,816,8 15 10 контроль 10,7 10,8 11,5 11,4 р=0,005 7,4 4,8 6,6 0 0,6 0 1 2 9 р=0,041 3 4 5 8,4 3,6 6 7 8 9 Рис 10. Распределение частот комбинаций генотипов гена NAT2 у больных раком легкого и в контрольной группе. 1 – 282CC/590GG/481CC/803AA/857GG; 2 – 282CC/590GG/481TC/803AA/857GG; 3 – 282CC/590GG/481TC/803GA/857GG; 4 – 282CC/590GG/481TT/803GG/857GG; 5 – 282TC/590AG/481CC/803AA/857GG; 6 – 282TC/590AG/481CC/803GA/857GG; 7 – 282TC/590AG/481TC/803GA/857GG; 8 – 282TT/590AA/481CC/803AA/857GG; 9 – редкие комбинации. Собственные результаты и данные литературы (Cascorbi et al. 1996; Wikman et al. 2001; Borlak, Reamon-Buettner, 2006) свидетельствуют о том, что на определенных территориях, под воздействием присущего им спектра (про-)канцерогенных веществ, на предрасположенность к раку легкого будут влиять определенные комбинации генотипов. У европеоидов г. Новосибирска комбинации генотипов 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG, 282TС/590AG/481СC/803GA/857GG, а также индивидуальный полиморфизм 19 (A803G) могут оказать влияние на предрасположенность к раку легкого. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения роли полиморфизма генов ФБК в этиологии и патогенезе заболевания. ВЫВОДЫ 1. Использование эндонуклеаз рестрикции Bse1I и HinfI позволяет однозначно определить полиморфизмы C190T и G857A гена NAT2, соответственно, а Bst4CI – полиморфизм A752T гена NAT1. Сочетанное использование эндонуклеаз рестрикции MspI, Bse1I и Bst2UI позволяет различить полиморфизмы С190Т и G191A, а эндонуклеаз BamHI, HinfI и AspS9I – полиморфизмов G857A и Т859С, 859Del гена NAT2. 2. В результате поиска методом ПДРФ-анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции AccB1I, AluI, AspS9I, Bme18I, BstACI, Bst4CI, BstDSI, ErhI, Fsp4HI, HinfI, RsaI, SfaNI и SmiMI новых мутаций в транслируемой последовательности гена NAT2 не обнаружено. 3. Частоты встречаемости шести полиморфных вариантов гена NAT1 (C97T, C190T, G350,351C, T402C, A752T и 1025) и двенадцати полиморфных вариантов гена NAT2 (T111C, C190T, G191A, C282T, C481T, A434C, G590A, C759T, A803G, G857A, T859C, 859Del) в исследованной выборке европеоидов г. Новосибирска достоверно не отличаются от таковых в других популяциях европеоидов. 4. В европеоидной популяции г. Новосибирска отсутствует ассоциация полиморфных вариантов C282T, С481T, G590A и G857A гена NAT2 с раком легкого. 5. В европеоидной популяции г. Новосибирска аллель 803G гена NAT2 у мужчин (ОШ = 0.60; p = 0.026) ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин (ОШ = 1.92; р = 0.041), в том числе курящих (ОШ = 2.13; р = 0.043) ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. 6. Комбинация генотипов 282ТС/590АG/481СC/803GA/857GG гена NAT2 в исследованной популяции ассоциирована с устойчивостью к раку легкого (ОШ = 0.22; р = 0.041), а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого (ОШ = 11.65; р = 0.005). Практические рекомендации При проведении молекулярно-эпидемиологических исследований использование эндонуклеаз рестрикции Bse1I и HinfI позволит однозначно определить полиморфизмы C190T и G857A гена NAT2, а Bst4CI – полиморфизм A752T гена NAT1. Сочетанное использование эндонуклеаз рестрикции MspI, Bse1I и Bst2UI позволит различить полиморфизмы С190Т и G191A, а эндонуклеаз BamHI, HinfI и AspS9I – полиморфизмов G857A и Т859С, 859Del гена NAT2. 20 Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах: 1. Никишина М.В., Макарова С.И., Акишев А.Г., Вавилин В.А., Дегтярев С.Х., Ляхович В.В. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена ариламин N-ацетилтрансферазы 2 у больных раком легкого // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества, 26 июня-1 июля 2002, С. 305-306. 2. Никишина М.В., Акишев А.Г., Вавилин В.А., Макарова С.И., Дегтярев С.Х., Ляхович В.В. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена NAT1 у европеоидов Западной Сибири // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2003. – Т. 136. – № 11. – С. 544-546. 3. Никишина М.В. Полиморфизм гена NAT2 у здоровых и больных раком легкого жителей г. Новосибирска // Материалы Российской научнопрактической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Современное состояние и перспективы развития клинической онкологии», Томск, 24-25 июня 2004, С. 152-153. 4. Никишина М.В. Полиморфизм генов N-ацетилтрансфераз (NAT1 и NAT2) у жителей г. Новосибирска // Материалы V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», Новосибирск, 2004, С. 138-139. 5. Никишина М.В., Макарова С.И. Полиморфизм гена NAT2 у европеоидов Западной Сибири // Сборник тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 17-21 мая 2004, С. 22. 6. Никишина М.В., Акишев А.Г. Рестрикционный анализ гена NAT1 у европеоидов Западной Сибири // Сборник тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 17-21 мая 2004, С. 22-23. 7. Никишина М.В. Полиморфизм гена N-ацетилтрансферазы (NAT2) у европеоидов Западной Сибири. Выявление ассоциации с раком легкого // Материалы конкурса работ молодых ученых «Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики», СО РАМН, Новосибирск, 2004, С. 47-57. 8. Никишина М.В., Акишев А.Г., Макарова С.И., Вавилин В.А., Дегтярев С.Х., Ляхович В.В. Применение эндонуклеаз рестрикции Bst2UI и Acc65I для обнаружения KpnI-полиморфизма гена NAT2 // Биомед. Хим. – 2004. – T. 50. № 3. – С. 269-272. 9. Никишина М.В., Макарова С.И., Акишев А.Г., Вавилин В.А., Дегтярев С.Х., Ляхович В.В. Рестрикционный анализ гена N-ацетилтрансферазы (NAT2) у европеоидов Западной Сибири // Генетика. – 2004. – Т. 40. – № 11. – С. 1557-1561. 10. Никишина М.В., Вавилин В.А., Макарова С.И., Ляхович В.В. Анализ ассоциаций полиморфизмов гена NAT2 с риском возникновения рака легкого // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2007. – Т. 143. - № 1. – С. 89-92. 21 Список используемых сокращений: Del, – делеция Frameshift – сдвиг рамки считывания NAT – ариламин N-ацетилтрансфераза ORF – открытая рамка считывания 3'-UTR – 3'-нетранслируемый регион ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ОШ – отношение шансов п.н. – пар нуклеотидов ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР – полимеразная цепная реакция ФБК – ферменты биотрансформации ксенобиотиков Автор выражает благодарность коллективу НИИ терапии СО РАМН за предоставленную часть образцов контрольной выборки, к.б.н. Макаровой С.И. за помощь в проведении ферментативного гидролиза при поиске новых полиморфизмов в гене NAT2, а также с.н.с. Акишеву А.Г. за помощь в освоении методов и научные консультации на всех этапах работы. 22
