Устранение нонсенс мутаций у 4CVмышей при помощи пропуска экзона.

Устранение нонсенс мутаций у 4CVмышей при помощи пропуска экзона.
Chalermchai Mitrpant1,2, Sue Fletcher1, Patrick L. Iversen3, Steve D. Wilton1,*
Article first published online: 12 NOV 2008
DOI: 10.1002/jgm.1265
Copyright © 2008 John Wiley & Sons, Ltd.
Введение
Мышечная дистрофия Дюшенна разрушительное нервно-мышечное заболевание, характеризующиеся
прогрессирующей мышечной слабостью из-за отсутствия функционального дистрофина. Дистрофин и актиновый
цитоскелет в комплексе с протеинами сарколеммы играют важную роль в мышечном сокращении. Отсутствие или
снижение дистрофина в мышечных волокнах делает их уязвимыми к повреждению при сокращении.
Прогрессирующая потеря мышечных волокон, с инфильтрацией иммунными клетками и фиброзом подавляет
способность волокон к регенерации
Человеческий ген дистрофина один из самых больших, и его большая мышечная изоформа состоит из 79 экзонов,
охватывающих 2,4 миллиона пар оснований. Большинство мутаций при миодистрофии Дюшена- интрагенные
делеции и дупликации составляющие от 60 до 8%. Точечные мутации , включающие носенс мутации, также как
малые делеции или включения, нарушающие рамку считывания, встречаются в 25-35% всех случаев. Мутации при
МДД обычно нарушают рамку считывания, что препядствует синтезу функционального дистрофина. Мышечная
дистрофия Беккера (МДБ) также вызываетс я мутациями гена дистрофина, но это более умеренное аллельное
состояние в большинстве случаев вызывается дефектами гена без нарушения рамки считывания, что приводит к
продукции более короткого, но частично функционального белка. В зависимости от положения и природы мутации
некоторые случаи МДБ могут быть диагностированы в более позднем возрасте и проявляться незначительными
симптомами или не проявляться вообще, тогда как другие могут протекать как МДД с потерей способности к
передвижению к 15 годам.
АО- индуцированный пропуск экзона нацеленный на различные участки сплайсинга экзона 23 у мышей, модели
миодистрофии Дюшенна(mdx) , изучается как способ восстановления экспресии дистрофина. Дефект mdx мышей
вызван носенс мутацией в экзоне 23 гена дистрофина. Несмотря на ограничения, включающие мягкий клинический
фенотип, mdx мыши широко используются в развитии потенциальных методов лечения МДД, включая пропуск
экзонов 15-22, генную и клеточную терапию и преждевременное подавление завершения трансляции.
В данном исследовании, B6Ros. Cg-Dmdmdx-4Cv/J (4CV) мыши с мышечной дистрофией, неся носенс мутацию в
экзоне 53 гена дистрофина, использовалась, чтобы оценить двойной АО индуцированный пропуск экзона в области
гена дистрофина в главной точке делеций человеческого дистрофина. Обходя 4CV мутацияю и поддержание рамки
считывания, требуют удаления обоих экзонов 52 и 53 из зрелого транскрипта гена дистрофина. Серия AO была
разработана и оценена для удаления каждого экзона, и самые эффективные составы были объединены, чтобы
вызвать двойной пропуск экзона и в культурах миобластов и в в естественных условиях. AO двух различных
составов 2 ′-O-метил измененные олигомеры на фосфоротиоат основе (2OMeAOs), и фосфородиамидат морфолино
олигомеры (ФMO), конъюгированные с проникающим через клетку пептидом (P007), подверглись сравнению.
Материалы и методы
AO и праймеры
Номенклатура AO основана на описаннии Манн и соавторов. Последовательности и состав AO описаны в Таблице
1. 2OMeAOs, синтезировались на 8909 синтезаторах Нуклеиновых кислот (Прикладные Биосистемы, Фостер-Сити,
Калифорния, США) . AO были разработаны для последовательности экзона или к соединению экзона/интрона у
мышей в области экзонов 52 или 53. ФMO связанные с богатым аргинином пептидом для лучшего проникновения
в клетки (P007) 27, 28, синтезировались BioPharma AVI (Корваллис, Орегон, США). Праймеры для ОТ-ПЦР и
анализа последовательностей синтезировались Geneworks (Аделаида, Австралия) и перечислены в дополнительной
информации (Таблица S1).
Таблица 1.
Длина(bp)
Координаты Число экзонов
Последовательность
Икроножная мышца (bp)%
1
25
M52A + 17 + 41 52
5′-UCC AAU UGG GGG CGU CUC UGU UCC A-3′ 14
2
30
M52A − 15 + 15 52
5′-AUC UUG CAG UGU UGC CUG AAA GAA AAA AAA-3′ 10
33
3
30
M52D + 15 − 1552
5′-CAU UAA GAG ACU UAC UUC GAU CAG UAA UGA-3′ 10
33
4
30
M52A + 22 + 51 52
5′-AAU GAG UUC UUC CAA UUG GGG GCG UCU CUG-3′ 15
50
5
30
M52A + 32 + 61 52
5′-GGG CAG CAG UAA UGA GUU CUU CCA AUU GGG-3′ 15
50
6
30
M52A + 42 + 71 52
5′-UUC AAA UUC UGG GCA GCA GUA AUG AGU UCU-3′ 12
40
7
31
M53A + 39 + 69 53
5′-CAU UCA ACU GUU GUC UCC UGU UCU GCA GCU G-3′
15
8
30
M53A − 15 + 15 53
5′-UCU GAA UUC UUU CAA CUG GAA UAA AAA UAA-3′ 7
23
9
30
M53D + 15 − 1553
5′-AUG CUU GAC ACU AAC CUU GGU UUC UGU GAU-3′ 12
40
10
30
M53A + 29 + 58 53
5′-UGU CUC CUG UUC UGC AGC UGU UCU UGA ACC-3′ 15
50
11
30
M53A + 49 + 78 53
5′-UUA ACA UUU CAU UCA ACU GUU GUC UCC UGU-3′ 10
33
12
30
M53A + 59 + 88 53
5′-GUU GAA UCC UUU AAC AUU UCA UUC AAC UGU-3′ 9
30
13
30
M53A + 69 + 98 53
5′-CAG CCA UUG UGU UGA AUC CUU UAA CAU UUC-3′ 11
37
14
30
M53A + 19 + 48 53
5′-UCU GCA GCU GUU CUU GAA CCU CAU CCC ACU-3′ 15
50
15
30
M53A − 25 + 5 53
5′-UUC AAC UGG AAU AAA AAU AAG AAU AAA GAA-3′ 6
20
16
30
M53A + 129 + 158
53
5′-CCA UGA GUC AAG CUU GCC UCU GAC CUG UCC-3′ 17
57
17
30
M53A + 151 + 180
53
5′-CUA CUG UGU GAG GAC CUU CUU UCC AUG AGU-3′ 14
47
18
30
M53A + 176 + 205
53
5′-UCU GUG AUC UUC UUU UGG AUU GCA UCU ACU-3′ 11
37
19
30
M53D + 5 − 25 53
5′-UUU UAA AGA UAU GCU UGA CAC UAA CCU UGG-3′ 10
20
25
M53A − 25 − 1 53
5′-CUG GAA UAA AAA UAA GAA UAA AGA A-3′ 5
20
21
25
M53A − 20 + 5 53
5′-UUC AAC UGG AAU AAA AAU AAG AAU A-3′ 5
20
22
25
M53A + 69 + 93 53
5′-AUU GUG UUG AAU CCU UUA ACA UUU C-3′ 7
28
23
25
M53A + 74 + 98 53
5′-CAG CCA UUG UGU UGA AUC CUU UAA C-3′ 10
40
24
25
M53A + 99 + 123
53
56
5′-CCU GUU CGG CUU CUU CCU UAG CUU C-3′ 13
48
33
52
Животные
4CV (B6Ros.Cg-Dmdmdx–4Cv/J) мыши приобретены в лаборатории Джаксона (Bar Harbor, ME, USA), были
выращены в исследовательском центра животных. Использование животных согласовано с комитетом по
использованию животных Университета Западной Австралии
Клеточная культура и трансфекция АО
Клетки МdxH2Kb-tsA58 мыши (H-2K mdx) были размножены и инфицированы как описано ранее . Основные
культуры миобластов были подготовлены от 2-4-дневных мышей 4CV. Мышцы конечности четырех мышат были
удалены, гомогенизированы, и инкубированы при 37 °C в течение 30 минут с смесью ферментов, содержащей 2.4
единицы/мл диспазы (Invitrogen, Виктория, Австралия), 2 тип коллагеназы 5 мг/мл (Invitrogen), и 2.4 мМ CaCl2 в
среде Далбекко (Invitrogen). После центрифугирования культура была добавлена в 75 см2 емкости с 10 мл
пролиферативной среды и инкубирована 1 час. Свободные клетки были удалены и отобраны в 75-см2 емкости,
покрытые 100 мкг/мл матригелем. Когда почти сросшиеся клетки были отобраны на 24 пластины, покрытые 50
мкг/мл раствором поли -D-лизина и матригелем, их инкубировали 48 часов перед трансфекцией. Они были
инфицированы 2OMeAO липолекса с использованием липофектина (Invitrogen) в отношении 2: 1 липофектина к
AO. Кратко, липофектин был смешан с OptiMEM (Invitrogen) до объема 200 мкл и инкубирован в течение 30 минут
при комнатной температуре. 2OMeAO, который был растворен в 200 мкл OptiMEM, был объединен с
липофектином: смесь, инкубированная в течение еще 30 минут, перед добавлением OptiMEM до заключительного
объема 1 мл и последующим добавлением еще 500 мкл. Клетки были инкубированы 48 часов , затем РНК была
извлечена для анализа.
Внутримышечная поставка
Олигомеры в физиологическом растворе были введены в переднюю большеберцовую мышцу в указанных дозах.
Каждый эксперемент включал группу негативного контроля, которая получала физиологический раствор. Мышцы
были удалены и заморожены в изопентане для анализа белка и РНК
Экстракция РНК и ОТ-ПЦР, секвенирование ДНК
РНК была получена из культур H-2K mdx, 4CV и замороженных секций ткани использую тризол, согласно
протоколу исследования. Первый шаг ОТ-ПЦР был предпринят с использованием 120 нг РНК как шаблона в 12,5
мкл реактивов в течение 30 циклов амплификации. После обратной транскрипции в течение 30 минут при 55 °C
температуру повысили до 94 °C в течение 2 минут перед основными тепловыми циклами при 94 °C 40 сек, 60 °C в
течение 1 минуты, и 68 °C в течение 1 минуты. ПЦР был выполнена с 1 мкл AmpliTaQ Gold (Прикладные
Биосистемы, Фостер-Сити, Калифорния, США). Циклические условия для вторичного ПЦР - 94 °C в течение 6
минут, чтобы активизировать полимеразу, 20 циклов при 94 °C в течение 40 сек, 60 °C в течение 1 минуты, и 72 °C
в течение 1 минуты. Продукты ПЦР были отделены на 2%-ых гелях агарозы в TAE буфере. Группы повышенного
интереса были повторно усилены непосредственно после геля агарозы, и очищены, используя колонки вращения
UltraClean (Лаборатории Mobio, Карлсбад, Калифорния, США),а затем упорядочены на ABI 377 BigDye v3.1
(Прикладные Биосистемы).
Вестерн блот анализ
Экстракты белка были подготовлены в растворе буфера, содержащего 125 мМTris/HCl, pH 6.8, 15%-ый натрия
сульфат, 10%-ый глицерин, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторид, 50 мМ дейтиотрейтол, синий бромфенол, и
коктейль ингибиторов протеаз (Сигма, Св. Луи, МО, США) из секций мышц мышей. Образцы были нагреты в 95 °C
в течение 5 минут, затем проведен электрофарез в 4-10 % dodecyl геле с pH 8.8 с 4 % связывающим гелем с pH 6.8.
Денситометрия групп миозина после окрашивания была проведена, чтобы облегчить движение белка. Экстракты из
мышц мышей получавших AO (2.75 мг) и группы
контроля (0.275 мг) были загружены на второй
многоакриламидный гель для вестерн блот анализа. Дистрофин визуализировался, используя NCL-DYS2
моноклональные антидистрофиновые антитела (Novocastra, Ньюкасл-эпон-Тайн, Великобритания) как описано
ранее . Изображения были получены при помощи Vilber Lourmat CHEMISMART-3000. Процент экспрессии
дистрофина был вычислен относительно экспрессии дистрофина в клетках контроля .
Иммунофлюоресценция
ПБМ взятые у мышей заморожены в изопентане жидким азотом. Дистрофин обнаружен в 6мкл нефиксированных
секций , используя NCL-DYS2. Иммунофлюоресценция выполнена с использованием Zenon Alexa Fluor 488 labelling
kit (Invitrogen),, согласно протоколу после фиксации. Первичные антитела использовались в разведении 1:10 и
секции были окрашены Hoechst (Sigma) в развкдении 1: 10000 ддля визуализации ядер.
Рузультаты
Нацеливание на единственный экзон.
Набор АО сконструирован с учетом акцепторов и доноров сайтрв сплайсинга и потенциальных энхансеров в экзоне
52 и 53. Для разработки экзонных сплайсинговых энхансеров(ЭСЭ) для гена дистрофина мышей использована
программа ESEfinder 3.0 Рисунок 1 показывает разработанные ЭСЭ для экзонов 52 и 53, последовательности АО
разработанные для пропуска экзона приведены в таблице 1. 6 АО, разработанных для экзона 52 гена дистрофина,
были оценены на культуре миогенных клеток H-2Kb-tsA58 mdx (H-2K mdx) Использование культур клеток
уменьшает использование животных для исследований. Подобные эксперементы подтверждают данный подход.
Согласно найденным ЭСЭ, нонсенс мутации в гене дистрофина, в экзоне 53 происходят при кчастии двух
предикторов SF2/ASF и SRp40
Рисунок 1 Схематическое изображение предикторов ЭСЭ для экзона 52 и 53
Не было АО, нацеленных на акцептор и донор экзона 52, действующих на другие участки гена.( Рис. 2а), поскольку
использование всех АО нацеленных на участок + 17 + 51, эффективно выключали экзон 52 в мРНК (Рис. 2в)
Титрование последовательностей для исследования показало, что наиболее эффективными были АО 1 и 4, которые
действовали в более низких концентрациях. Поэтому для исследования выбран АО4.
Рисунок 2 Индуцирование пропуска экзона в H-2K mdx клетках.
Удаление экзона 53 сопровождалось большими сомнениями и несмотря на то что было сконструировано
множество АО, среди них не обнаружено достаточно эффективного препарата , исключающего экзон 53 из гена
дистрофина мышей. Несмотря на эти неудачные попытки, как показано на рисунке 2с, некоторые исключали экзон
53 совместно с экзоном 54.(Рис. 2д) 2 АО активные в сайтах сплайсинга и приводили к частичному исключению
экзона 53 (РИС. 2е). 13 различных комбинаций АО были оценены и выбрана одна смесь для
индуцирования пропуска экзона 53 (Рис. 2ф).
Пропучк экзонов 52 и 53 2OMeAO
Как показала оценка эффективности различных экзонов, необходимо использовать комбинацию АО для
оптимизации воздействия. (Таб. 2) 4 2OMeAO (4, 8, 9 и 13) комбинированы в отношениях A1, A2, A3, A4 и A5, и
использованы для трансфекции миобластов (Рисунок 3а и 3с). Идентификация транскрипта с пропущенным экзоном
52 и 53 подтверждена ДНК секвенированием.(Рис. 3 д) Через 2 дня после трансфекции А2 и А3 смесь показали
большую эффективность при пропуске экзонов 52 и 53, что установлено при анализе конечных продуктов (Рис 3а и
3с) , смесь А2 была использована для дальнейших исследований.
Рисунок 3 Индуцирование пропуска экзона в клетках 4CV после трансфекции 2OMeAO смесью АО А1(а), А2(в), А3
(с),
Таблица 2 Состав смеси АО для исследования in vitro и in vivo
A1
A2
A3
A4
A5
2OMe AO
1:3
1.66 : 1 3.33 : 1 6.66 : 1 12.33 : 1
4
150
375
460
520
555
8
150
75
46
26
15
9
150
75
46
26
15
13
150
75
46
26
15
Общая концентрация (mM) 600
600
600
600
600
Смесь B1
B2
B3
P007-PMO
1:3
1.66 : 1 3.33 : 1 6.66 : 1 12.33 : 1
4
2.5
6.25
7.7
8.8
9.25
8
2.5
1.25
0.77
0.44
0.25
9
2.5
1.25
0.77
0.44
0.25
13
2.5
1.25
0.77
0.44
0.25
Общая концентрация (µM)
10
10
Смесь C1
C2
C3
C4
C5
P007-PMO
1:3
1.66 : 1 3.33 : 1 6.66 : 1 12.33 : 1
4
10
25
30
35
37
8
10
5
3.3
1.8
1
9
10
5
3.3
1.8
1
13
10
5
3.3
1.8
1
40
40
Общее количество (µg)
B4
B5
10
40
10
40
10
40
Хотя ОТ-ПЦР указал на существенный пропуск экзонов 52 и 53 на 3 и 5 дни, на 8 и 9 дни после лечения
обнаружены только следы транскрипта (данные, не показаны). Дистрофин не был обнаружен в рассматриваемых
культурах. РНК и белок были проанализированы на 14 день, после двух трансфекций, на 0 и 9 дни пропуск экзона
или восстановление дистрофина не наблюдалась (данные, не показаны).
В общей сложности 100 мкг 2OMeAO коктейля A2, было совмещено с с F127 и введен внутримышечно или
внутрибрюшинно 4CV мышам. Образцы взяты спустя 3, 5 и 7 дней после инъекции и РНК из диафрагмы, и ПБМ
оценены на наличие пропуска экзона. Хотя спорадический пропуск экзонов 52 и 53 было обнаружено в ПБМ,
существенное восстановление дистрофина не обнаружено при иммунофлюоресценции или вестерн-блот-анализе
(данные, не показаны).
Вызванный пропуск экзона 52 и 53 при помощи ФМО
Мы ранее установили, что, хотя 2OMeAO хорошо подходили на роль AO, краткосрочные исследования in vitro по
восстановлению дистрофинав в культуре клеток были более проблематичны. AOs 4, 8, 9 и 13 были подготовлены
как ФMO, соединенные с пептидом P007. Эти олигомеры не вызывали пропуска экзона, когда применялись
индивидуально (данные, не показанны). Комбинация была оценена на 4CV культурах миобластов . Коктейли ФMO
B2, B3 и B4 вызвали образование транскриптов, с исключенными экзонами при таких концентрациях как 0.5 мкM
in vitro. B2 и B3 ФMO комбинации, сопоставимые с A2 и A3 2OMe, казалось, были самыми эффективными смесями,
и были отобраны для дальнейшего исследования (Иллюстрации 3e к 3 g). И B2 и смесь B3 смогли вызвать пропуск
экзонов 52 и 53 спустя 2 недели в концентрация 40 мкM in vitro (рисунок 3h), с появлением синтеза дистрофина,
что установлено при вестерн блот анализе (рисунок 3i). Нормализация дистрофина в соответствии с денситометрией
densitrometry указывает на то, что B2, и смесь B3 приводили к синтезу 11 % и 8 % нормальных уровней
дистрофина, соответственно (Рисунок 3i, Таблицу S2).
Оценка эффектов вне цели
Чтобы подтвердить специфику мулти-олиго смеси по экспрессии дистрофина был проведен ОТ-ПЦР транскриптов
дистрофина, используя пять наборов вложенных пар праймеров, покрывающих области
экзонов 13-70
(Иллюстрации 4a к 4e). Рисунки 4a к 4e представляют усиленные сегменты транскриптов дистрофина. Хотя
спорадический ‘реверантные’ транскрипты были обнаружены в рассматриваемых культурах , обработанных ФMO,
число альтернативно транскриптов не очень отличались в шести невылеченных культурах (рисунок 5).
Рисунок 4. Анализ ОТ-ПЦР в невылеченных и обработанных ФMO 4CV культурах через (a) экзоны 13-26, (b)
экзоны 37-50, (c) экзоны 58-70, (d) экзоны 20-35 и (e) экзоны 48-58
Рисунок 5. Анализ ОТ-ПЦР транскриптов дистрофина в невылеченных и обработанных ФMO 4CV культурах через
экзоны 20-35, указывающие на альтернативные транскрипты дистрофина
Исследования In vivo.
Единственную инъекцию 40 мкг каждой смеси ФMO, в отношениях, показанных в Таблице 2, получили TAs 4CV
мыши. Спустя две недели после инъекции, ОТ-ПЦР РНК, извлеченной из мышц 4CV продемонстрировал пропуск
экзонов 52 и 53 во всех рассматриваемых образцах (рисунок 6a), вестерн блот анализ показал уровень экспрессии
дистрофина приблизительно 5-7 % нормальных уровней(Таблицу S2). Последовательно с исследованиями РНК,
проводилась иммунофлюоресценция дистрофина на секциях мышц TAs 4CV мышей, получавших смеси C1 и C2,
она показала наличие дистрофин-положительных волокон (Рисунки 7a и 7b).
Рисунок 6. Исследования РНК. (a); и (b) вестерн-блот-анализ экстрактов мышц 4CV мышей, получавших смеси
ФMO (C1 к C5)
Рисунок 7. Иммунофлюоресценция дистрофина в срезах мышц 4CV мышей, получавших смесь АО (a) C1, (b) C2,
(c) C3, (d) C4, (e) C5 и (f) физ раствор; (g) невылеченых C57
Дискуссия
Состав олигомеров, оценка различных химических составов, системная доставка широко изучаются у mdx мышей,
как модели миодистрофии Дюшенна. Настоящее исследование описывает АО-индуцированный двойнй пропуск
экзона у другой мышиной модели, 4CV мышей. Эта модель может быть рассмотрена как модель достаточно близко
соответствующая условиям человеческого организма, поскольку нацеленный пропуск экзона индуцирован без
больших откликов для делеций в гене дистрофина.
Акцепторные и донорные сайты сплайсинга представляют собой очевидные цели для АО-индуцированого пропуска
экзона, и последовательное удаление экзона 23 доступно как первый донорный сайт сплайсинга- цель для
олигомеров. Однако всесторонние исследования, нацеленные на все экзоны гена дистрофина показали, что
донорные сайты сплайсинга редко являются оптимальными целями. Действительно, кажется, что пре-мРНК сайт не
отвечает за вмешательство олигомеров, или изменение длины или структуры АО вряд ли достигнет походящих
уровней исключения экзона. Подобные тенденции наблюдались у 4CV мышей в гене дистрофина, экзонах 52 и 53,
где каждый из олигомеров, действующих на донорные и акцепторные сайты сплайсинга, недостаточно индуцирует
пропуск экзона.
Экзон 53 мышинного гена дистрофина исключается из мРНК. У 18 олигомеров, разработанные для воздействия на
акцепторные и донорные сайты сплайсинга,также как интреэкзонные цели предсказаны эффекты при помощи ЭСЭ.
Хотя эта программа базируется на человеческих последовательностях, большое сходство между человеческими и
мышиными последовательностями может быть оправданием ее использования для конструирования АО. Начальная
конструкция АО исследована на миогенных клетках mdx мышей, в ожидании клеточной культуры 4CV мышей.
Последовательность экзона 52 гена дистрофина идентична и
идентифицированные образцы сплайсинга
произведены в обеих клеточных культурах. Подобным образом АО, управляющие пропуском экзона 53 в клетках
mdx мышей показали идентичные результаты в культуре клеток 4CV мышей. В контрольных группах 4CV мышей
не наблюдалось отклонирующего сплайсинга, предпологалось что мутация не влияет на сплайсинг.
Большинство составов, предназначающихся для экзона 53, использующиеся индивидуально, были неэффективны,
активизировали скрытые сайты сплайсинга(потеря 78 оснований конца экзона 53) или привели к производству
транскриптов дистрофина с недостающими экзонами 53 и 54, в дополнение к экзону 53 (Иллюстрации, 2d к 2f).
Интересно что, AO 7, который нацелен на точно те же координаты, идентифицированные как оптимальная цель,
чтобы вытеснить экзон 53 в человеческом гене дистрофина, индуцировал синтез транскриптов дистрофина с
недостающими экзонами 53 и 54, в дополнение к экзону 53. Несколько других AO, вызвали подобное удаленияе
экзона, подразумевая, что эта область может быть вовлечена в процессинг обоих экзонов во время соединения preмРНК, по крайней мере у мышей. Планирование вырезания экзона 53 из человеческого транскрипта гена
дистрофина только привело к определенному удалению, выдвигая на первый план некоторые ограничения в
экстраполяции состава олигомеров. Планирование AO для экзона 23 mdx мышей для удаления также вызвало
удаление экзонов 22 и 23 в транскрипте гена дистрофина , транскриптов из структуры, которая не может привести к
производству дистрофина.
Поскольку мы ранее заметили, что некоторые комбинации очевидно неэффективных AO смогли вызвать очень
эффективный пропуск экзона, различные смеси AO, предназначающиеся для экзона 53, были оценены. Комбинация
AO 8 и 9, предназначаясь для акцепторных и донорных сайтов, соответственно, смогла вызвать некоторый пропуск
экзона 53, хотя и не на удовлетворительном уровне. Впоследствии, AO 8 и 9 были объединены с другим AO (7, 10,
11, 12, 13, 14 и 16), чтобы идентифицировать смесь, способная к стимулированию пропуска определенного экзона
53. Когда AO 13 был объединен с AO 8 и 9, эффективное и определенное удаление экзона 53 могло быть вызвано
после трансфекции при низких концентрациях AO. Смесь AO 8 и 13 произвела тот же самый эффект, вызванный
одним AO 13 , не указывая на преимущество, тогда как комбинация AO 9 и 13 только вызвала непоследовательное
удаление экзона 53. Комбинация этих трех AO была необходима и для эффективности и для специфики пропуска
экзона.
Поскольку экзон 53 был удален из зрелой мРНК в более высокой степени, чем экзон 52, были предприняты
попытки, чтобы уравновесить отношение АО 4, предназначавшегося для пропуска экзона 52, с AO 8, 9 и 13, и
максимизировать индукцию транскриптов. Когда было применено эквимолярное количество всех четырех
олигомеров, транскрипты во всю длину наблюдалась, в дополнение к мРНК дистрофина с недостающими экзоном
53 и экзонами 52 и 53. Изменение состава смеси с увеличенными пропорциями АО 4 привело к уменьшенному
количеству продукта во всю длину и более высокой пропорции транскриптов в структуре имеющих пропуск
экзонов 52 и 53.
Хотя значительное количество транскриптов с удаленными экзонами 52 и 53 были обнаружены в дни 3 и 5 после
трансфекции 2OMeAO, дистрофин не наблюдалося при вестерн-блот-анализе (данные, не показаны). Только следы
пропуска экзона могли быть отмечены на 8–14 день после трансфекции, и это также не производило достаточного
количества дистрофина, обнаружимого вестерн блот анализом (данные, не показаны). Предполагалось, что это
ограничение является результатом метаболизма2OMeAO в клетках. 2 ′-O-модифицированные олигомеры на
фосфоротиоат основе увеличивают сопротивление олигомеров воздействию нуклеазы, но, в отличие от ФMO,
которые не усвоены, 2OMeAO постепенно расщепляются нуклеазами. В отличие от этого, существенные ФMOвызванная пропуском экзона транскрипты были обнаружены с меньшим количеством промежуточного продукта в
течение 14 дней после трансфекции в vitro. Однако, после применения ФMO тех же самых последовательностей,
эффективный пропуск экзона мог быть вызван и поддержан в пробирке или ex vivo, чтобы позволить обнаружить
дистрофин при помощи вестерн блот анализа через 7 дней после трансфекции .
У применения любого олигомера в клетке есть потенциальная возможность пересечься, реагируя с другими
последовательностями и/или проявления неопределенных эффектов. Использование смесей AO потенциально
увеличило бы этот риск и, хотя подробная экспертиза других генов не была предпринята, мы показали, что смесь
только вызвала предназначенные изменения вмРНК дистрофина. Мы отметили в других исследованиях, что
добавление олигомеров, кажется, незначительно увеличивает появление альтернативно соединенных транскриптов.
Однако, применение четырех олигомеров не очень изменяло уровень альтернативных транскриптов в
рассматриваемых клетках по сравнению с контрольными культурами.
Применение ФMO, соединенного с богатым аргинином проникающим через клетку пептидом, вызвало более
сильный пропуск экзона в пробирке и в естественных условиях в клетках 4CV, чем эквивалент 2OMeAO.
Поскольку мы ранее показали, что иерархия эффективности пропуска экзона, вызванного 2OMeAO, была также
отмечена, когда те же самые последовательности были оценены как ФMO, самые эффективные смеси 2OMe и ФMO
AO сопоставимы у 4CV модели, хотя было незначительное изменение в относительных пропорциях вырезанных
экзонов в транскриптах. Оптимальные 2OMeAO смеси вызвали удаление приблизительно эквивалентного
количества экзонов 52 и 52 и 53, тогда как эквивалентные комбинации ФMO произвели транскрипты с
недостающийм экзоном 53. Приблизительно 10 % восстановленного дистрофина было обнаружено при вестернблот-анализе.
Смеси ФМО, состоя из в общей сложности 40 мкг олигомеров, направленных на экзоны 52 и 53 у TAs 4CV мышей
при единственной внутримышечной инъекции. Две недели спустя иммунофлюоресценция выявила дистрофин
после лечения C1, C2 или C3. Вестерн-блот-анализ продемонстрировал приблизительно 5-10 % восстановленного
дистрофина после лечения C1, C2 или C3. Дальнейшие исследования в этой области могут обеспечить
дополнительную информацию, чтобы усовершенствовать более эффективные комбинации для двойного АОиндуцированного пропуска экзона.
Ссылки
1 Blake DJ, Weir A, Newey SE, et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.
Physiol Rev 2002; 82: 291–329.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 283
2 Emery AE. Muscular dystrophy into the new millennium. Neuromuscul Disord 2002; 12: 343–349.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 38
3 Emery AE. The muscular dystrophies. Lancet 2002; 359: 687–695.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 181
4 Yan J, Feng J, Buzin CH, et al. Three-tiered noninvasive diagnosis in 96% of patients with Duchenne muscular dystrophy
(DMD). Hum Mutat 2004; 23: 203–204.
Direct Link:
AbstractPDF(84K)References
5 White SJ, Aartsma-Rus A, Flanigan KM, et al. Duplications in the DMD gene. Hum Mutat 2006; 27: 938–945.
Direct Link:
AbstractPDF(212K)References
6 Deburgrave N, Daoud F, Llense S, et al. Protein- and mRNA-based phenotype-genotype correlations in DMD/BMD with
point mutations and molecular basis for BMD with nonsense and frameshift mutations in the DMD gene. Hum Mutat 2007;
28: 183–195.
Direct Link:
AbstractPDF(326K)References
7 Ashton EJ, Yau SC, Deans ZC, et al. Simultaneous mutation scanning for gross deletions, duplications and point
mutations in the DMD gene. Eur J Hum Genet 2008; 16: 53–61.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 11
8 Tuffery-Giraud S, Chambert S, Demaille J, et al. Point mutations in the dystrophin gene: evidence for frequent use of
cryptic splice sites as a result of splicing defects. Hum Mutat 1999; 14: 359–368.
Direct Link:
AbstractPDF(363K)References
9 Bosone I, Bortolotto S, Mongini T, et al. Late onset and very mild course of Xp21 Becker type muscular dystrophy. Clin
Neuropathol 2001; 20: 196–199.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 5
10 Heald A, Anderson LV, Bushby KM, et al. Becker muscular dystrophy with onset after 60 years. Neurology 1994; 44:
2388–2390.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 25
11 Jennekens FG, ten Kate LP, de Visser M, et al. Diagnostic criteria for Duchenne and Becker muscular dystrophy and
myotonic dystrophy. Neuromuscul Disord 1991; 1: 389–391.
CrossRef,PubMed
12 Prior TW, Bartolo C, Papp AC, et al. Nonsense mutations in a Becker muscular dystrophy and an intermediate patient.
Hum Mutat 1996; 7: 72–75.
Direct Link:
AbstractPDF(334K)References
13 Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, et al. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle
cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 1998; 7: 1083–1090.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 85
14 Wilton SD, Lloyd F, Carville K, et al. Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using
antisense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 1999; 9: 330–338.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 89
15 Graham IR, Hill VJ, Manoharan M, et al. Towards a therapeutic inhibition of dystrophin exon 23 splicing in mdx mouse
muscle induced by antisense oligoribonucleotides (splicomers): target sequence optimisation using oligonucleotide arrays. J
Gene Med 2004; 6: 1149–1158.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(424K)References
16 Sirsi SR, Williams JH, Lutz GJ. Poly (ethylene imine)-poly (ethylene glycol) copolymers facilitate efficient delivery of
antisense oligonucleotides to nuclei of mature muscle cells of mdx mice. Hum Gene Ther 2005; 16: 1307–1317.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 18
17 Gebski BL, Mann CJ, Fletcher S, et al. Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin exon 23 skipping in
mdx mouse muscle. Hum Mol Genet 2003; 12: 1801–1811.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 61
18 Mann CJ, Honeyman K, McClorey G, et al. Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse
model of muscular dystrophy. J Gene Med 2002; 4: 644–654.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(299K)References
19 Alter J, Lou F, Rabinowitz A, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression
bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med 2006; 12: 175–177.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 113
20 Fletcher S, Honeyman K, Fall AM, et al. Morpholino oligomer-mediated exon skipping averts the onset of dystrophic
pathology in the mdx mouse. Mol Ther 2007; 15: 1587–1592.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 31
21 Fletcher S, Honeyman K, Fall AM, et al. Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic
administration of a morpholino antisense oligonucleotide. J Gene Med 2006; 8: 207–216.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(494K)References
22 Mitrpant C, Fletcher S, Wilton SD. Personalised genetic intervention for Duchenne muscular dystrophy: Antisense
oligomers and exon skipping. Curr Mol Pharm 2008.
23 Foster K, Foster H, Dickson JG. Gene therapy progress and prospects: Duchenne muscular dystrophy. Gene Ther 2006;
13: 1677–1685.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 21
24 Odom GL, Gregorevic P, Chamberlain JS. Viral-mediated gene therapy for the muscular dystrophies: successes,
limitations and recent advances. Biochim Biophys Acta 2007; 1772: 243–262.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 28
25 Welch EM, Barton ER, Zhuo J, et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature 2007; 447:
87–91.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 111,ADS
26 Chapman VM, Miller DR, Armstrong D, et al. Recovery of induced mutations for X chromosome-linked muscular
dystrophy in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 1292–1296.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 77,ADS
27 Deas TS, Binduga-Gajewska I, Tilgner M, et al. Inhibition of flavivirus infections by antisense oligomers specifically
suppressing viral translation and RNA replication. J Virol 2005; 79: 4599–4609.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 71
28 Yuan J, Stein DA, Lim T, et al. Inhibition of coxsackievirus B3 in cell cultures and in mice by peptide-conjugated
morpholino oligomers targeting the internal ribosome entry site. J Virol 2006; 80: 11510–11519.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 26
29 Errington SJ, Mann CJ, Fletcher S, et al. Target selection for antisense oligonucleotide induced exon skipping in the
dystrophin gene. J Gene Med 2003; 5: 518–527.
Direct Link:
AbstractFull Article (HTML)PDF(308K)References
30 Rando TA, Blau HM. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene
therapy. J Cell Biol 1994; 125: 1275–1287.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 412
31 Wilton SD, Lim L, Dye D, et al. Bandstab: a PCR-based alternative to cloning PCR products. Biotechniques 1997; 22:
642–645.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 26
32 Cartegni L, Wang J, Zhu Z, et al. ESEfinder: a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res
2003; 31: 3568–3571.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 427
33 Smith PJ, Zhang C, Wang J, et al. An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic
splicing enhancers. Hum Mol Genet 2006; 15: 2490–2508.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 67
34 Morgan JE, Beauchamp JR, Pagel CN, et al. Myogenic cell lines derived from transgenic mice carrying a thermolabile T
antigen: a model system for the derivation of tissue-specific and mutation-specific cell lines. Dev Biol 1994; 162: 486–498.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 145
35 McClorey G, Moulton HM, Iversen PL, et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restores dystrophin
expression in vitro in a canine model of DMD. Gene Ther 2006; 13: 1373–1381.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 55
36 Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, et al. Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx
mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 42–47.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 136
37 Lu QL, Mann CJ, Lou F, et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx
dystrophic mouse. Nat Med 2003; 9: 1009–1014.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 126
38 Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker E, et al. Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene:
FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet 1989; 45: 835–847.
PubMed,Web of Science® Times Cited: 350
39 Wilton SD, Fall AM, Harding PL, et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin
gene transcript. Mol Ther 2007; 15: 1288–1296.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 24
40 Arechavala-Gomeza V, Graham IR, Popplewell LJ, et al. Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences
for targeted skipping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle. Hum Gene Ther 2007; 18: 798–
810.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 17
41 Harding PL, Fall AM, Honeyman K, et al. The influence of antisense oligonucleotide length on dystrophin exon
skipping. Mol Ther 2007; 15: 157–166.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 13
42 McKay RA, Miraglia LJ, Cummins LL, et al. Characterization of a potent and specific class of antisense oligonucleotide
inhibitor of human protein kinase C-alpha expression. J Biol Chem 1999; 274: 1715–1722.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 131
43 Gebski BL, Errington SJ, Johnsen RD, et al. Terminal antisense oligonucleotide modifications can enhance induced
exon skipping. Neuromuscul Disord 2005; 15: 622–629.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 10
44 McClorey G, Fall AM, Moulton HM, et al. Induced exon skipping in human muscle explants. Neuromusc Disorders
2006; 16: 583–590.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 27
45
Fall AM, Johnsen R, Honeyman K, et al. Induction of revertant fibres in the mdx mouse using antisense
oligonucleotides. Genet Vaccines Ther 2006; 4: 3.
CrossRef,PubMed
46 Adams AM, Harding PL, Iversen PL, et al. Antisense oligonucleotide induced exon skipping and the dystrophin gene
transcript: cocktails and chemistries. BMC Mol Biol 2007; 8: 57.
CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 13
Оригинальная статья http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jgm.1265/abstract
Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org