Материалы для курса «Биотехнология растений»
реклама
Материалы для курса «Биотехнология растений» 1. Методы создания биотехнологических форм древесных растений. Гибридизация. Гибридизация представляет собой отдаленные внутри и межвидовые скрещивания. Они нередко приводят к получению высокопродуктивных гибридов, обладающих ценными хозяйственными качествами, что очень часто проявляется на гибридах первого поколения благодаря гетерозису. Преграды для скрещиваний могут иметь генетический, физиологический, фенологический, анатомический, морфологический характер. Преодоление этих преград у различных пород имеет свои трудности. Так, в роде Сосна (Pinus) скрещивания между видами, принадлежащими к разным секциям, но имеющими одинаковое количество хромосом, крайне затруднены. В то же время в роде Дуб (Qercus) скрещивания межсекционные удаются сравнительно легко. Природа гетерозиса не вполне ясна, и управление им пока невозможно. Однако использовать возможность получения гетерозисных гибридов чрезвычайно важно. По А. Густафсону, различают три вида гетерозиса — соматический, характеризующийся высокой интенсивностью роста, адаптивный, который проявляется в повышенной устойчивости к неблагоприятным условиям среды, и репродуктивный по обилию плодоношения. Следует отметить, что у древесных пород нередко гетерозис проявляется у гибридов второго и третьего поколений. Это было отмечено для гибридов лиственницы, вяза, клена, дуба, сосны и др. Особенности внутривидовой гибридизации. Внутривидовая гибридизация может применяться для получения гибридных растений от скрещиваний родительских пар, растущих в идентичных условиях, даже в одной популяции, или в резко различных климатических, эдафических условиях. В первом случае перед гибридизацией обычно ставится задача сочетания полезных в хозяйственном отношении признаков, которыми обладают родительские особи. Во втором случае используется скрещивание отдаленных географических и экологических форм деревьев. В таком варианте ставится задача получения высокого гетерозисного эффекта гибридного потомства за счет уникального сочетания генов. Примеров проявления гетерозиса при отдаленных внутривидовых скрещиваниях лесных пород накопилось довольно много. В Северной Швеции при скрещивании ели обыкновенной местного происхождения, отличающейся морозоустойчивостью, с быстрорастущей, но не морозостойкой елью из Средней Европы получены внутривидовые гибриды, сочетающие морозостойкость с высокой интенсивностью роста. Особенности межвидовой гибридизации. Методы межвидовой и особенно межродовой гибридизации позволяют получать совершенно новые формы, новые виды растений. И это издавна привлекало селекционеров. В настоящее время известно несколько сотен межвидовых гибридных форм лесных пород спонтанного и экспериментального происхождения. Они имеются почти во всех родах древесных пород. Но количество их невелико, а гибридов, имеющих большую ценность для лесного хозяйства, известно всего несколько. К ним можно отнести гибриды сосен жесткой и ладанной, елей — обыкновенной и сибирской, ситхинской и белой, ситхинской и обыкновенной; лиственниц — европейской и японской, японской и европейской. Описанные Ф. Л. Щепотьевым, Л. Н. Лебеденец, С. С. Калмыковым гибриды ореха грецкого с пеканом отличаются высокой морозо - и засухоустойчивостью, урожайностью, энтомоустойчивостью и ценными плодами. Сравнительно небольшое количество экспериментально полученных межвидовых и межродовых гибридов лесных пород объясняется большой трудоемкостью работ по организации межвидовых скрещиваний, нередко плохой скрещиваемостью, получением очень небольшого количества гибридных семян с плохой всхожестью. Для преодоления нескрещиваемости в нашей стране широко используются методы, разработанные И. В. Мичуриным. Следует заметить, что далеко не все полученные межвидовые или межродовые гибриды будут отличаться гетерозисом, но все они будут представлять интерес для исследований и дальнейшей селекции. Поэтому из гибридных растений целесообразно создавать лесные культуры, опытные участки. Апомиксис. Апомиксис растений — сложное биологическое явление образования зародышей семян без оплодотворения завязи. Апомиксис с теоретической точки зрения имеет большое значение в области эволюции, видообразования и эмбриологии растений. Исключительно велика ценность апомиксиса для генетики и селекции растений, в том числе и древесных пород. Любая апомиктическая форма будет легко размножаться семенами с сохранением в потомстве материнских признаков. Это объясняется тем, что у апомиктов отсутствует стадия мейоза (редукционное деление ядра перед образованием зародышевой клетки), а в связи с этим выключается весь механизм расщепления признаков при образовании бесполосеменного потомства. Явление апомиксиса широко распространено в растительном мире. С. С. Хохлов обнаружил его у 754 видов, относящихся к 290 родам 80 семейств покрытосеменных растений. Известны апомиктичные формы и у многих видов древесных растений из семейств березовых, бобовых, ореховых, смородиновых, розоцветных, цитрусовых, аралиевых и др. Рассмотренные вопросы позволяют прийти к выводу о необходимости расширения исследований проблемы апомиксиса у лесных древесных растений. Полиплоидия. Полиплоидия — это естественный природный процесс видо- и формообразования, ведущий к улучшению существующих и возникновению новых, более совершенных форм растений. При полиплоидии в ядрах клеток происходит увеличение числа хромосом. Увеличение числа наборов хромосом в ядрах клеток может быть неограниченно большим, но чаше всего наиболее эффективны небольшие величины их на уровне три - и тетраплоидов. В процессе стихийной, а затем научной селекции были выделены лучшие сорта и формы культурных растений, которые оказались полиплоидами (пшеница, картофель, овес, лен, сахарный тростник, банан, кокосовая пальма, табак и др.). Особенно большое значение в лесном хозяйстве получают полиплоидные формы осины. Толчком к этому послужило открытие в Швеции в середине 30-х годов XX в. триплоидной гигантской осины с хромосомным набором Зn = 57. Шведская триплоидная осина отличалась высокой нормальную осину на 36 %. производительностью, превышающей диплоидную Мутагенез Мутагены (от мутация и др.-греч. γεννάω — рождаю) — химические и физические факторы, вызывающие наследственные изменения — мутации. Впервые искусственные мутации получены в 1925 году Г. А. Надсеном и Г. С. Филипповым у дрожжей действием радиоактивного излучения радия; в 1927 году Г. Мёллер получил мутации у дрозофилы действием рентгеновских лучей. Способность химических веществ вызывать мутации (действием иода на дрозофилы) открыта И. А. Рапопортом. У особей мух, развившихся из этих личинок, частота мутаций оказалась в несколько раз выше, чем у контрольных насекомых. Мутагенами могут быть различные факторы, вызывающие изменения в структуре генов, структуре и количестве хромосом. По происхождению мутагены классифицируют на эндогенные, образующиеся в процессе жизнедеятельности организма и экзогенные — все прочие факторы, в том числе и условия окружающей среды. По природе возникновения мутагены классифицируют на физические, химические и биологические: Физические мутагены: ионизирующее излучение, радиоактивный распад, ультрафиолетовое излучение, чрезмерно высокая или низкая температура. Химические мутагены: некоторые алкалоиды (колхицин - один из самых распространённых в селекции мутагенов, винкамин, подофиллотоксин), окислители и восстановители (нитраты, нитриты, активные формы кислорода), алкилирующие агенты (например, иодацетамид), нитропроизводные мочевины: нитрозометилмочевина, нитрозоэтилмочевина, нитрозодиметилмочевина часто применяются в сельском хозяйстве, этиленимин, этилметансульфонат, диметилсульфат, 1,4-бисдиазоацетилбутан (известный как ДАБ), некоторые пестициды, некоторые пищевые добавки (например, ароматические углеводороды, цикламаты), продукты переработки нефти, органические растворители, лекарственные препараты (например, цитостатики, препараты ртути, иммунодепрессанты). К химическим мутагенам условно можно отнести и ряд вирусов (мутагенным фактором вирусов являются их нуклеиновые кислоты — ДНК или РНК). Биологические мутагены: специфические последовательности ДНК — транспозоны; некоторые вирусы (вирус кори, краснухи, гриппа); продукты обмена веществ (продукты окисления липидов); антигены некоторых микроорганизмов. К наиболее мощным мутагенам относятся ионизирующие излучения (лучи рентгена, гамма-лучи, альфа-частицы, нейтроны, протоны и др.). Наибольшее количество мутаций в генах вызывают гамма-лучи. Сущность мутагенного действия ионизирующих излучений заключается в том, что все виды его обладают огромной энергией элементарных частиц (фотонов, электронов, нейтронов), глубоко проникающих не только в ткани и клетки их, но легко нарушающих молекулы органелл клетки и ядерного вещества ее. Если ионизирующие излучения действуют на молекулы ДНК в половых клетках, то возникают наследственные изменения — мутации потомства. Опыты показали, что сильные дозы воздействия ионизирующих излучений на семена вызывают мутации, слабые же повышают всхожесть их и стимулируют рост и развитие растений. В связи с этим применение ионизирующих излучений в растениеводстве и лесном хозяйстве может быть двояким: генетико-селекционным — для получения мутаций и выделения новых, улучшенных форм растений и агротехническим — с целью повышения всхожести семян и выращивания высококачественного посадочного материала древесных пород. Метод слияния протопластов. Протопласт клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить: скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов), получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого, слияние трех и более клеток, получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей, перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение, получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др. Слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984). Для отдаленных гибридов характерно: 1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей. 2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом). 3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток. 4. Ограниченная морфогенетическая способность. С помощью данного метода были получены межвидовые гибриды табака, гибрид картофеля и томата, сои и табака, капусты и редьки. В связи с трудоёмкостью выделения и подготовки протопластов древесных растений данный метод не находит широкого применения для получения новых генетических форм растений. Генная инженерия Агробактериальная трансформация. Получение трансгенных растительных клеток при помощи агробактерий (например, Agrobacterium tumefaciens) в настоящее время широко используется в генетической инженерии растений. Суть метода заключается в переносе чужеродного гена в геном растения с помощью Тi-плазмиды агробактерий. Применение данного метода объясняется простотой его использования и высокой эффективностью переноса гена в составе устойчивой генетической конструкции плазмиды и длительное пребывание и экспрессию гена в геноме растения - трансформанта. Важным условием для эффективной трансформации растительных клеток является выбор материала для генетических манипуляций. Чаще всего при агробактериальной трансформации используются экспланты растений, культивируемые на твердых средах. Трансформация в суспензионной культуре имеет свои преимущества по сравнению с трансформацией эксплантов, так как используемый объект уже стерилен. Поэтому количество потерь культур из-за микробной контаминации резко уменьшается. Кроме того, в суспензии можно добиться большей эффективности взаимодействия агробактерий с клетками растений. Недостатком этого метода является необходимость получения суспензионной культуры выбранного для трансформации вида. Кроме того, в современной литературе, на наш взгляд, недостаточно освещена проблема получения трансгенных клеток растений через суспензионную культуру растений. С помощью агробактериальной трансформации были получены трансгенные линии табака (впервые в 1982 г.), томатов, рапса, осины, каланхое, картофель, рис, и.тд. Среди древесных культур получены отдельные линии осины, яблони, вяза, 1. Sheng J. and Citovsky V. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1699-1710. 2. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D. Rogers S.G., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. V. 227. P. 1229-1231. 3. Rakoczy-Trojanowska M. Alternative methods of plant transformation - a short review // Cell Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7(3). P. 849-858. Биобаллистический метод трансформации. Суть метода: трансформация растений происходит при бомбардировке микроскопическими вольфрамовыми или золотыми частицами с нанесёнными на них генами в специальной вакуумной камере подготовленных растительных эксплантов. Этот метод применятся при создании трансгенных злаковых культур, т.к. трансформировать злаки возможно только при прямом введении чужеродных генов в их геном. Результатом использования данного метода являются некоторые сорта пшеницы и подсолнечника. Основным недостатком метода биобаллистики является низкий выход трансгенных растений (эффективность трансформации составляет менее 1 – 2%). Применение метода биобаллистики для древесных пород затруднено, для трансформации древесных пород чаще применяют метод агробактериальной трансформации. 2. Генетические методы изменения химического состава древесины. Генетическая трансформация растений генами целлюлозолитических и лигнолитических ферментов Основным звеном, определяющим комфортность жизни, являются растения. Древесные растения используются в целлюлозно-бумажной промышленности, в области лесного хозяйства, биоэнергетике, строительстве, химической промышленности, мебельном производстве, садоводстве и других отраслях. Состав и структура древесины, продуктивность растений являются ключевыми компонентами при оценке технологической ценности материала. В настоящее время разрабатываются стратегии оптимизации свойств древесины у древесных растений с помощью генной инженерии. Большое значение приобретают исследования направленные на изучение физиологических процессов формирования древесины и её расщепления. Эти данные можно успешно использовать для искусственного регулирования процессов метаболизма. Также благодаря исследованиям функциональной геномики и протеомики новые генымишени растительных и микробных организмов быстро становятся доступными для этой цели. Их использование открывает новые возможности для создания линий трансгенных древесных растений с улучшенными свойствами древесины. Изменение содержания лигнинов Лигнин является полимерной составляющей клеточной стенки растительной клетки, вторым, после целлюлозы, наиболее распространенным органическим соединением биосферы. Он представляет собой полимерный ароматический комплекс в основном состоящий из трех разных гидроксикоричных спиртов: р-кумариловый спирт, конифериловый спирт и синапиловый спирт. Содержание лигнина в древесине хвойных и лиственных пород соответственно 23-38% и 14-25% от общей массы. Лигнин расположен в клеточных стенках и межклеточном пространстве растений и скрепляет целлюлозные волокна. Вместе с гемицеллюлозами он определяет механическую прочность стволов и стеблей. Хотя лигнина очень важен для жизнеспособности растений, он представляет собой серьезное препятствие на пути использования растительной биомассы в качестве корма и в качестве сырья для целлюлозно-бумажной продукции. В настоящее время промышленный процесс получения целлюлозы сводится к освобождению химическим путём от других сопровождающих её в растительной ткани веществ. Поскольку основным веществом, от которого стремятся освободиться в результате такой обработки, является лигнин, процесс получения целлюлозы называют делигнификацией. Следовательно, наиболее выгодными древесными породами для получения целлюлозы будут те породы, у которых содержание лигнинов будет наименьшим. Поэтому современные разработки генной инженерии древесных растений направлены на получение линий растений с пониженным содержанием лигнинов в древесине. Большинство работ по созданию линий растений с низким содержанием лигнинов основывается на изменении биосинтеза лигнинов (Li et al., 2003). Нижнее регулирование лигнификации обеспечивается 4- кумарат: КоА лигазой (4CL) Трансгенные растения с пониженной активностью 4CL были созданы на основе линий табака (Kajita et al.,1996, 1997), арабидопсиса (Lee и et al., 1997) и осины (Hu et al., 1999;. Li et al., 2003). В тополе снижение деятельности гена 4CL на 90% привело к сокращению лигнина на 45-50%. Низкая деятельность гена 4CL приводит к побурению гемицеллюлозы (Kajita et al.,1996). Мономерный состав лигнинов у трансгенов изменился и характеризовался 3-кратным увеличением р-гидроксибензальдегида, а также 80% и 67%-ным снижением количества серина и валина соответственно (Kajita и et al., 1997). Количество эфира и эфира связанный веществ р- кумаровая и кофейной кислот увеличился, что привело к формированию коричневой ткани ксилемы. Трансгенный тополь по гену 4CL со 45%-снижениеем лигнина имел нормальную морфологию клеток и более высокие темпы роста, чем в контрольной (Hu et al., 1999). Это скорее всего связано с плейотропными эффектами. Поскольку все связи в лигнине не гидролизуемы, единственным возможным способом разрушить его является окисление. В настоящее время ведущую роль в окислительной деструкции лигнина отводят ферментам, относящимся к классу оксидоредуктаз, а именно к суперсемейству пероксидаз растений. Установлено, что наиболее перспективное применение для процесса окисления лигнина и его соединений имеют следующие пероксидазы: лигнинпероксидаза, марганецпероксидаза и лакказы (Shimada M. et al.,1991). Лигниназы оказались гемсодержащими пероксидазами, способные окислять не только лигниноподобные вещества, устойчивых к действие других окислительных ферментов, но также другие полициклические канцерогенные углеводы, хлорсодержащие пестициды и даже диоксины. К этим соединениям относятся пероксидазы класса III. Пероксидазы класса III – пероксидазы растений, наиболее применимы в генетической инженерии растений. к этому классу относятся такие изученные пероксидазы хрена (HRP), арахиса и сои. Они представляют собой гем-содержащие ферменты примерно 300 аминокислот. Большинство из них N-гликозилированные и, как полагают, локализованы в клеточной стенке или вакуоли. Особенностью этих пероксидаз является способность окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина (Van Haandel M.J. et al., 1999). Внесение изменений работы этих ферментов активно применяют при создании древесных трансгенов с изменёнными свойствами древесины. Например, было показано, что гиперэкспрессия гена пероксидазы хрена (prxC1a) также стимулировала увеличение темпов роста табака (Nicotiana tabacum), более того по сравнению с контрольными растениями, время цветения был сокращено примерно на 20% (Kawaoka et al., 1994). Дальнейшие исследования коснулись модификации древесных растений. Тополь (род Populus) является одной из наиболее быстро растущих лиственных пород и наиболее неприхотлива. Использование деревьев рода Populus в настоящее время является наиболее перспективными в целлюлозно-бумажной, мебельной, химической и строительной отраслях. Поэтому генетическая модификация этих растений перспективна. С этой целью на линиях гибридной осины (Populus sieboldii х Populus grandidentata) были получены трансгены также с гиперэкспрессией гена пероксидазы хрена prxC1a по контролем промотора CaMV 35S. В результате, темп роста модифицированной гибридной осины, также как и у табака, существенно увеличился – средняя длина ствола трансформированных растений была на 25% больше, чем у контрольных. Не существовали другие очевидные фенотипические различия между трансформированными и контрольными растениями. Кроме того, каллусы, полученных на основе преобразованных гибридных растений осины, росли быстрее, чем от контрольных растений. Они также показывали увеличение устойчивости к окислительному стрессу при введении перекиси водорода. Таким образом, повышение активность гена пероксидазы хрена prxC1a повлияло на темпы роста растений и на увеличение устойчивости к окислительному стрессу (Kawaoka A., et al. 2003). Лакказы – оксидоредуктазы, обладающие широкой субстратной специфичностью и высокой удельной активностью. Это медьсодержащие фенолоксидазы, Они выделены из растений, грибов, насекомых и бактерий. Лакказы растений представляют собой монофилетическую группу. Они характеризуются синим цветом, который является результатом содержания в них меди. Они содержат два каталитических центра, где расположены четыре иона меди. Координация ионов меди основана на местоположении в ферменте остатков гистидина. Лакказы окисляют большинство о-и р-фенолы, и даже монофенолы. Лакказы обладают тремя основными функциями, которые связаны с образованием пигментов, биодеградацией лигнинов и детоксикацией фенолов. Лакказы чаще атакуют фенольные соединения лигнина, способствуют его конденсации, медленно окисляет нефенольные модели лигнина. Проведены исследования, которые определяли роль лакказ. Были выдвинуты предположения, что эти вещества влияют на биосинтез лигнинов. С этой целью были получены четыре популяции трансгенных тополей, в каждой популяции ингибировался определённый ген синтеза лакказы с помощью антисмысловой последовательности. Выявлено, что подавление экспрессии генов лакказы не влияет на общий рост и развитие, однако у некоторых экземпляров было отмечено троекратное увеличение фенольных соединений. На основании результатов, полученных с трансгенных тополей (lac3AS), выяснено, что одна из многих предполагаемых ролей лакказы в растениях может связана с обеспечением формирования правильной структуры клеточной стенки в ксилемных волокнах. Существовали предположения, что лакказы участвуют в биосинтезе лигнинов, однако последние исследования это не подтверждают (Ranocha P. et al., 2002). Одной из гипотез является то, что лакказы и пероксидазы работают совместно при синтезе лигнина. Есть предположения, что лакказы функционируют на ранних стадиях одревеснения, участвуя в полимеризации монолигнолов в олиголигнолы, пероксидазы могут функционировать на более поздних стадиях развития ксилемы, когда образуется H2O2 (Ranocha P., et al., 2002). Изменение содержания целлюлозы Рост растительных клеток зависит от механических свойств клеточной стенки, представляющий собой сложный материал, состоящий из волокнистых целлюлозных микрофибрилл встроенных в аморфный матрикс из полисахаридов и белков. Целлюлоза - один из многих полимеров, встречающихся в природе. Она является основным компонентом клеточной стенки и представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков D-глюкозы, соединенных р-1,4-связями. Общая формула [С6Н7О2(ОН)3]n. Полимеры целлюлозы существуют как упорядоченные структуры (арматура) и их основная функция — обеспечение жесткости клеточной стенки растений в обмене веществ они почти не участвуют (Pauly M., et al., 1999). Мировой объем ежегодного прироста 104-105 т. Содержание целлюлозы (% по массе) в волокнах семян хлопчатника 95-98, лубяных 60-85, тканях древесины 40-44, у низших растениях 10-25. Гемицеллюлозы – высокомолекулярные (молярная масса 1000—12000) гетерополисахариды. Встречаются в значительном количестве (от 6 до 27%) в одревесневших частях растений (соломе, семенах, орехах, древесине) вместе с целлюлозой и лигнином. В отличие от целлюлозы гемицеллюлоза легко гидролизуются с образованием галактозы, ксилозы, арабинозы и уроновых кислот. Макромолекулы гемицеллюлоз разветвлены и построены из пентоз (ксилозы, арабинозы) или гексоз (маннозы, галактозы, фруктозы); степень полимеризации 50-300. Молекулярная масса значительно меньше, чем у целлюлозы. В древесине хвойных пород преобладают полисахариды, состоящие из гексоз (гексозаны, чаще глюко- и галактоглюкоманнаны), в лиственных из пентоз (пентозаны). Основным гемицеллюлозным полимером злаков и лиственных деревьев является ксилан. Основная цепь ксилана построена из остатков D-ксилозы, соединенных (3-1,4-связями, и может содержать различные заместители (или короткие боковые цепи), такие как L-арабинозу, D-глюкуроновую кислоту, D-ксилозу, а также ацетил- ферулоил- и и-кумароильные группы (Carpita N.C.,etal.,1993). Другими распространенными гемицеллюлозными полимерами являются галактоманнаны и галактоглюкоманнаны. Применение целлюлоз в промышленности очень обширно. Однако, процесс лигнификации, а также низкое содержание целлюлозы в древесине заставляет решать задачу получения более ценных пород деревьев с высоким содержанием целлюлозы. Одним из направлений при получении пород деревьев с высоким содержанием целлюлозы является использование целлюлолитических ферментов, способствующий созданию высокопродуктивных пород деревьев. Целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) способны расщеплять целлюлозу. Целлюлазы растений, которые катализируют расщепление внутренних 1,4 –β-связей целлюлозы были предложены для управления различными аспектами развития растений, таких как опадение листьев, созревание плодов, размегчение клеточной стенки при увеличении размеров клетки, дифференцировке сосудов (Fischer and Bennett, 1991). С этой целью была проведена модификация Arabidopsis thaliana геном целлюлазы тополя (PaPopCell). Изменение роста сопровождалось изменениями биомеханических свойств, что свидетельствует из данных о снижении ксилоглюкана сшивающего микрофибриллы целлюлозы в тканях растений. Показано, что гиперэкспрессия целлюлазы тополя изменила клеточные стенки Arabidopsis thaliana путем деструкции неупорядоченной цепочки глюкозы из микрофибрилл. Массовая деградация целлюлозы не была отмечена, так как количество целлюлозы в трансгенных растениях составляло почти тоже значение, что и растениях дикого типа. Однако наблюдались не только биохимические изменения химического состава клеток, но и фенотипические отличия контрольных растений от модифицированных. Трансгенные A. thaliana с гиперэкспрессией целлюлазы тополя (PaPopCell) увеличили размер всех органов, в том числе черешков и листовой пластинки,увеличили длину стебля и количество междоузлий, а также гипокотилей этиолированных саженцев. Вполне вероятно, что снижение сшивания компонентов клеточной стенки и увеличение её пластичности, а следовательно и увеличение размеров органов может зависеть от уменьшения связанного ксилоглюкана. Это согласуется с предыдущими исследованиями, где доказано, что интеграция олигосахаридов ксилогликана в стволовые сегменты гороха может стабилизировать эндогенный ксилогликан клеточной стенки, ослабляя её и ускоряя удлинение побега. Сверхэкспрессия целлюлазы тополя в А. thaliana вызвало ускорение клеточного роста и привело к увеличению общего содержания целлюлозы в листьях. Содержание общей целлюлозы в в листьях растений было увеличено в 2-3 раза, хотя количество клетчатки в сухом весе было постоянным (Park et al., 2003). Аналогичным образом, трансгенные Populus tremula с гиперэкспрессией целлюлазы Arabidopsis (cel7) имели более длинные междоузлия и увеличение их количества (Shani et al., 1999). Доказано, что в листьях тополя экспрессия целлюлаз способствует синтезу целлюлозы и формированию более крупной листовой пластинки. Подобная модификация способствует также образованию не только более крупных листьев, но и увеличивает их количество. Так линия трансгенных тополей (S7) с гиперэкспрессией целлюлозы тополя имела в 1,28 раза больше число листьев по сравнению с диким типом. (Ohmiya et al., 2002). Это явление было связывают с двукратным увеличением удельной активности целлюлазы и отношением между повышенной активностью целлюлаз и перестройкой тканей. Таким образом, подтверждается, что целлюлазы тополя могут способствовать увеличению роста трансгенных тополей путем упорядочивания разобщённого 1,4-β-глюкана. Ксилоглюкан является широко распространенным гемицеллюлозным полисахаридом клеточной растительной стенки всех двудольных и некоторых однодольных растений (Bauman et al., 2007). Он представлен в основном D-глюкозой и D-ксилозой в соотношении примерно 4: 3, намного меньшее количество D-галактозы, а также L-фукозы и L-арабинозы. Основу полимерных молекул ксилоглюкана составляют β-1,4-связанные остатки D-глюкопиранозы (Hayashi, T.,1989). Связывание ксилоглюканов с целлюлозой может быть выражено изотермой адсорбции Лангмюра, в котором полисахариды связывается в виде монослоя на поверхности микрофибрилл. Анализ связывающей способности для микрофибрилл целлюлозы различной площади показали, что мощность была зависит от площади поверхности микрофибрилл. Известно, что прилегающие микрофибриллы целлюлозы, кросс- сшиты ксилоглюканами. Разделение микрофибрилл при росте растения обеспечивают ферменты - ксилоглюканазы, которые расщепляют ксилогликаны или ослабляют их связывание с микрофибриллами. Поэтому существует предположение, что гиперэкспрессия ферментов, действующих на ксилогликан, может способствовать увеличению накопления целлюлозы древесных растений (Takeda et al., 2002). Ксиланазы расщепляют гликозидные связи в основной цепи β-1,4-ксилана. Основную цепь таких полисахаридов как ксилоглюкан и β-глюкан злаков могут расщеплять по эндо-деполимеразному механизму многие эндо-β-1,4-глюканазы (целлюлазы). Однако, ферменты, специфичные только к данному полисахариду (βглюкану или ксилоглюкану) и неактивные по отношению к другим β-1,4-глюканам крайне мало изучены. Исключением являются бактериальные лихеназы (эндо-β-1,31,4глюканазы), расщепляющие 3-глюканы. В случае же ксилоглюканаз довольно хорошо изучены лишь специфические ферменты растений - ксилоглюкан-эндо-трансглюкозилазы. Описаны (XG), которые весьма специфичны по отношению к ксилоглюканам, но инертны к карбоксиметилцеллюлозам (КМЦ). Были проведены генетические модификации древесного растения Paraserianthes falcataria (L.). Оно является ценным многоцелевым деревом во влажных тропиках. Одно из наиболее быстро растущих пород деревьев, и используется для получения целлюлозы и других изделий из древесины, а также древесного топлива. Целью работы было получить трансгенные ратания с гиперэкспрессией гена ксилоглюконазы (pAaXEG). В результате полученные трансгенные растения имели высоту ниже, чем у контрольной группы. Это явление может быть вызвано эффектом оказываемым антибиотиками в селективной среде. Тем не менее, преобразованный побег имел большую длину междоузлия, чем в контрольной линии. Подобные результаты была показаны при влиянии гиперэкспрессии ксилоглюконазы у тополя, трасгены которого также имели увеличения длины стволовых междоузлий (Park et al., 2004). Поскольку уменьшение ксилоглюканов в клеточной стенке растения способствует повышению роста растений. Была проведена попытка создания тансгенных древесных растений с гиперэкспрессией ксилоглюканаз. Тополь белый (Populus alba) был модифицирован геном ксилоглюканазы Aspergillus (AaXEG2). В результате наблюдалось увеличение длины стеблей опытных растений по сравнению с контрольными даже в присутствии сахарозы. Увеличение стволового роста у трансгенов сопровождалось уменьшением модуля упругости Юнга в ростовой зоне, но увеличенная эластичность в зрелых тканях. Увеличилась длина междоузлия, что соответствовало увеличению содержания целлюлозы. Снижение модуля Юнга в регионах удлинения у трнасгенных линий согласуется с пониженным содержанием уровня ксилоклюканов между микрофибриллами целлюлозы. Уменьшение ксилоглюкана привело к увеличению плотности целлюлозы. Эксперссия ксилоглюконаз приводит к расщеплению ксилоглюканов, сшитых поперечно ориентированными целлюлозными микрофибриллами, что как раз и способствует «ослаблению» клеточной стенки. Отложение целлюлозы также увеличилось во вторичной ксилеме трансгенной линии растений. Таким образом, гиперэкспрессия гена ксилоглюканазы может способствовать повышению роста и накоплению целлюлозы трансформированного белого тополя (Populus alba). Приобретённые свойства могут сделать древесину этого растения более ценной для промышленности. Несмотря на высокий уровень ксилоглюканаз, в трансгенных тополях отмечалось содержание остаточного количества связанного ксилоглюкана в клеточной стенке. Это способствует формированию здорового фенотипа. Так как подобного рода модификации генотипа могут повлечь за собой коренные изменения, которые чаще проявляются в виде редуцированных органов, карликовости, замедленном росте и неспособности к размножению (Park Y.W. et al., 2003). Генетически модифицированные организмы (ГМО), как считается, могут оказать неблагоприятное воздействие на биологическое разнообразие, а также могут включать в себя вредные вещества, которые прямо или косвенно могут повлиять на жизнь диких живых организмов, изменив экосистему. Таким образом, встала необходимость принятия единых требований к выращиванию, созданию и введению в природные условия трансгенных растений. Меры предосторожности были приняты при заключении Картахенского протокола в 2000 году. Его создание помогает избежать возможные неблагоприятные воздействие ГМО на биоразнообразие планеты. В Японии были созданы трансформанты растений рода Populus (Populus alba) с гиперэкспрессией ксилоглюконазы (AaXEG2) из Aspergillus aculeatus, которые были способны к быстрому расту, с высоким содержанием целлюлозы и повышенной плотностью древесины, которые были проверены по всем критериям (конкурентоспособность, производительность вредных веществ, кросс-способность и другие свойства) на биобезопасность и считаются пригодными для выращивания в природных условиях. Листья выращенных в асептических условиях растений Populus alba были модифицированы с помощью Agrobacterium tumefaciens LBA4404 при использовании бинарного вектора pBE2113AaXEG2. Вектор состоял из гена ксилоклюконазы выделенного из Aspergillus aculeatus AaXEG2 (регистрационный номер AY160774) с PopCel1 сигналом под контролем промотора CaMV35S и геном устойчивости к канамицину. В результате, полученные две трансгенные линии тополя (trg300-1, trg300-2), которые быстрее росли и увеличивали диаметр стебля по сравнению с контролем. Листья в обеих линиях трансгенных тополей были заметно зеленее, толще и меньше, чем у дикого типа. Содержание целлюлозы и удельный вес ксилемы трансгенных линий был увеличен на 10% и 16% по сравнению с контрольной линией. Деградация ксилоклюканов увеличила содержание целлюлозы в древесине и её удельный вес за счет увеличения плотности целлюлозы в трансгенных тополях. Таки образом, были получены ценные линии трансгенных тополей с улучшенными свойствами и которые не представляют угрозы для биоразнообразия и являются биобезопасными (Taniguchi T. et al., 2008). При сравнении нескольких трансгенных линий тополей с гиперэкспрессией ксилоглюканазы, целлюлазы, ксиланазы или галактазы с точки зрения осахаривания ксилемы выявлено, что заметно выше гидратация целлюлозы в ксилемы достигается при гиперэкспрессии ксилоглюконазы по сравнению с растениями с гиперэкспрессией ксиланазы и целлюлазы. Выяснено, что деградации целлюлозы достигается за счет подготовки её целлюлазой для дальнейшего действия ферментов. Гиперэксперссия ксилоназы, целлюлазы, ксиланазы и галактозидазы подтверждалась расшиплением конкретных целевых полисахаридов с химическим анализом ксилемы. Полученные данные исследования трансгенов говорят, что уменьшение количества ксилоглюкана может ускорить осахаривание микрофибрилл целлюлозы. Гиперэкспрессия некоторых целлюлолитических ферментов может привести к смягчению микрофибрилл в результате расщепления сшитого ксилогликана с ними, что может ускорить гидратацию целлюлозы во время роста. Активность ферментов в трансгенных растениях может превышать в 120 раз их работу в растениях дикого типа. Снижение содержания ксилана и глюкоманнана не влияет на уменьшение отложения лигнина в растениях с гиперэкспрессией ксиланазы и целлюлазы, хотя более избыточная экспрессия этих ферментов, как ожидается, будет способствовать снижению содержание лигнина в этих растениях (Kaida et al.,, 2009). Эти результаты показывают, что ксилогюкан служит основным элементом гемицеллюлозы и играет большую роль в повышении жесткости микрофибрилл целлюлозы во вторичных стенках. Если эта жёсткость ослабляется, с помощью ксилоглюканаз, то ростовые процессы идут быстрее в следствии появления возможности растяжения клетки. Однако микрофибриллы целлюлозы также могут быть гидролизованы и целлюлазами. Таким образом, генетическое снижение ксилоглюканов, а точнее общей жёсткости микрофибрилл способствует увеличению роста ксилемы (Kaida et al.,, 2009). 1. Baumann M.J., J.M. Eklo G. Michel M. Kallas T.T. Teeri M. Czjzek & H. Brumer. 2007. Structural Evidence for the Evolution of Xyloglucanase Activity from Xyloglucan Endo-Transglycosylases : Biological Implications for Cell Wall Metabolism. The Plant Cell. 19: 1947–1963. 2. Carpita N.C., Gibeaut D.M Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth //Plant J., 1993, 31-30. 3. Elfstrand M., Fossdal· C.G.,· Sitbon F., · Olsson O., Lönneborg A., Arnold· S. Overexpression of the endogenous peroxidase-like gene spi 2 in transgenic Norway spruce plants results in increased total peroxidase activity and reduced growth. Plant Cell Rep (2001) 20:596– 603. 4. Guo D., Chen F., Inoue K., Blount J.W., and Dixon R.A. 2001. Downregulation of caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa: impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin. Plant Cell 13:73–88. 5. Hayashi T. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 139-168. 6. Hibino T., Takabe K., Kawazu T., Shibata D., and Higuchi T. 1995. Increase of cinnamaldehyde groups in lignin of transgenic tobacco plants carrying an antisense gene for cinnamyl alcohol dehydrogenase. Biosci Biotechnol Biochem 59:929–931. 7. Hu W.-J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.-J., and Chiang, V.L. 1999. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.Nature Biotechnol 17:808–812. 8. Kaida R., Kaku T., Baba K., Oyadomari M., Watanabe T., Nishida K., Kanaya T., Shani Z., Shoseyov O.and Hayashi T. Loosening Xyloglucan Accelerates the Enzymatic Degradation of Cellulose in Wood, Molecular Plant • Volume 2 • Number 5 • Pages 904–909 • September 2009. 9. Kajita S., Hishiyama S., Tomimura Y., Katayama Y., Omori S. 1997. Structural characterization of modified lignin in transgenic tobacco plants in which the activity of 4coumarate: coenzyme A ligase is depressed. Plant Physiol 114:871–879. 10. Kajita S., Katayama Y., and Omori S. 1996. Alterations in the biosynthesis of lignin in transgenic plants with chimeric genes for 4-coumarate: coenzyme A ligase. Plant Cell Physiol 37:957–965. 11. Kawaoka A., Matsunaga E., Endo S., Kondo S., Yoshida K., Shinmyo A., Ebinuma H. Ectopic expression of a horseradish peroxidase enhances growth rate and increases oxidative stress resistance in hybrid aspen. Plant Physiology, July 2003, Vol. 132, pp. 1177–1185. 12. Kawaoka, A. Ebinuma, H. (2001) Transcriptional control of lignin biosynthesis by tobacco LIM protein. Phytochemistry 57, 1149–1157. 13. Lagrimini L. M. Wound-induced deposition of polyphenols in transgenic plants overexpressing peroxidase. Plant Physiol. (1991) 96, 577-583. 14. Lagrimini L.M., Gingas V., Finger F., Rothstein S., Liu T-T.Y. Characterization of antisense transformed plants deficient in the tobacco anionic peroxidase. Plant Physiol (1997) 114:1187–1196. 15. Lee D., Meyer K., Chapple C., and Douglas C.J. 1997. Antisense suppression of 4coumarate: coenzyme A ligase activity in Arabidopsis leads to altered lignin subunit composition. Plant Cell 9:1985–1998. 16. Li Y., Kajita S., Kawai S., Katayama Y., Morohoshi N. Down-regulation of an anionic peroxidase in transgenic aspen and its effect on lignin characteristics. J Plant Res (2003) 116:175–182. 17. Ohmiya, Y., Nakai, T., Park, Y.W., Aoyama, T., Oka, A., Sakai, F. and Hayashi,T. (2003) The role of Popcel1 and PopCel2 in poplar leaf growth and cellulose biosynthesis. Plant J. 33, 1087-1097. 18. Park Y.W., Tominaga R., Sugiyama J., Furuta Y., Tanimoto E., Samejima M., Sakai F. and Hayashi T. (2003) Plant J. 33, 1099-1106. 19. Park Y.W., Babaa K., Furutab Y., Iidab I., Sameshimac K., Araid M., Hayashi T. Enhancement of growth and cellulose accumulation by overexpression of xyloglucanase in poplar /FEBS Letters 564 (2004) 183-187. 20. Pauly M., Albersheim P., Darvill A., York W.S. Molecular domains of the cellulose/xyloglucan network in the cell walls of higher plants // The Plant J.,1999, 20(6), 629639 21. Ranocha P., Chabannes M., Chamayou S., Danoun S., Jauneau A., Boudet A. M., Goffner D. Laccase Down-Regulation Causes Alterations in Phenolic Metabolism and Cell Wall Structure in Poplar. Plant Physiology, May 2002, Vol. 129, pp. 145–155. 22. Ranocha P., McDougall G., Hawkins S., Sterjiades R., Borderies G., Stewart D., Cabanes-Macheteau M., Boudet A. M., Goffner D. Biochemical characterization, molecular cloning and expression of laccases - a divergent gene family - in poplar. Eur. J. Biochem. 259, 1999, 485-495. 23. Shani, Z., Dekel, M., Tzbary, G., Jensen, C.S., Tzfira, T., Goren, R., Altman, A. and Shoseyov, O. (1999) Expression of Arabidopsis thaliana endo-1,4-p-glucanase (cell) in transgenic plants. In Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century (Altman, A., Ziv, M. and Izhar, S., eds), Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers, pp. 209-212. 24. Shimada M., Higuchi L. Degradation of lignin // Wood and cellulosic chemistry / Ed. D. N.-S. Hon, N. Shiraishi.: N. Y. and Basel: Mercek Dekker. 1991. P. 525–591. 25. Takeda T., Y. Furuta T. Awano K. Mizuno Y. Mitsuishi & T. Hayashi. 2002. Suppression and Acceleration of Cell Elongation by Integration of Xyloglucans in Pea Stem Segments. PNAS. 99 (13): 9055–9060. 26. Taniguchi T., Ohmiya Y., Kurita M., Tsubomura M., Kondo T., Park Y. W., Baba K., Hayashi T. Biosafety assessment of transgenic poplars overexpressing xyloglucanase (AaXEG2) prior to field trials, The Japan Wood Research Society (2008) 54:408–413. 27. Van Haandel M.J., Claassens M.M., Van der Hount N. Differential substrate behavior of phenol and aniline derivatives during conversion by HRP // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1435. P. 22–29.