- Торговый дом &quot

СТИМУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА МАЛЫХ si/miRNA - ИММУНОСОСТАВЛЯЮЩИХ В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ ОТ ПАТОГЕНОВ И ПАРАЗИТОВ
Цыганкова В. А.1, Саблук В. Т.2, Калатур К. А. 2, Стефановская Т. Р.3, Пономаренко С.
П.4, Эд Льюис5, Блюм Я. Б.6, Галкин А. П.1
1. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины
2. Институт сахарной свеклы НААН Украины
3. Национальный Университет биоресурсов и природопользования, кафедра энтомологии
4. Государственное предприятие "Межведомственный научно-технологический центр
"Агробиотех" НАН и МОН Украины, е-mail: [email protected]
5. Калифорнийский Университет, кафедра нематологии в городе Дэвис, США
6. Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины
В полевых опытах установлено, что обработка семян регуляторами роста растений
(РРР) снижает численность свекловичной нематоды в почве. Молекулярнобиологическими методами впервые установлено, что РРР значительно повышают устойчивость растений сахарной свеклы и рапса к нематодам путем стимуляции синтеза
si/miRNA.
Вступление. В течение последних 15 лет большое внимание уделяется выделению из
клеток эукариот и определению биологической роли малых регуляторных РНК (small
regulatory RNA) в RNAi (RNA interference) процессе, который принято формулировать как
посттранскрипционный сайленсинг генов (PTGS) у растений, животных и грибов [1 - 6].
За открытие этого феномена американским ученым Andrew Fire и Craig Mello в 2006 г.
была присуждена Нобелевская Премия в области физиологии и медицины [1-3].
Сайленсинг генов - процесс, в результате которого происходит или деградация, или
блокирование трансляции молекул-мишеней mRNA, который имеет большое значение в
адаптационной резистентности к вирусам, патогенам, грибам в защите генома против мобильных DNA элементов, а также в онтогенетической регуляции экспрессии генов. Главное участие в сайленсинге выполняют 2 типа малых регуляторных RNA: miRNA
(microRNA) и siRNA (short interfering RNA) [1 - 6].
miRNA образуются из молекул-предшественников путем двух раундов эндорибонуклеазного расщепления c помощью RNase-III подобных ферментов: сначала с помощью
рибонуклеазы RNase III Drosha образуется pre-miRNA - первичный "шпилько"-подобный
удлиненный (около 70 нуклеотидов) транскрипт с одноцепочечных отдельных геномных
локусов. Эти pre-miRNA молекулы экспортируются в цитоплазму, где происходит их процессинг с помощью эндорибонуклеазы RNase III Dicer, в результате которого образуются
зрелые одноцепные (длиной около 21-22 нуклеотидов) молекулы miRNA, которые инкорпорируются в miRNPs (micro-ribonucleoproteins) [3, 4].
siRNA (размером около 22-24 нт) образуются из удлиненных двуцепочных RNA предшественников - dsRNA (double-stranded RNA) в результате их расщепления эндорибонуклеазой RNase III Dicer на короткие одноцепные (ss)siRNA (single-stranded siRNA) [1, 2, 5,
6]. Одна часть (ss)siRNA используется для сайленсинга молекул-мишеней mRNA, тогда
как другие молекулы (ss)siRNA функционируют как праймеры к комплементарным последовательностям mRNA, на которых с помощью полимеразы RdRP (RNA-dependent
RNA polymerase) образуются новые молекулы dsRNA. Предполагается, что siRNA являются производными от удлиненных повторяющихся последовательностей, транспозонов и
трансгенов.
Установлено, что si/miRNA близкие по структуре и функции (характеризуются антисенсовой комплементарной структуре к mRNA) и играют двоякую роль у растений [1-14]:
1) вместе с сайт-специфическими мульти-субединичными эндо- и экзонуклеазами, которые являются составляющими RISC комплекса (RNA-induced silencing complex), si/miRNA
определяют период жизни каждой из молекул mRNA, в первую очередь уничтожают путем или деградации (расщепление), или блокировки (сайленсинга) трансляции аберантные
и несовершенные по структуре молекулы mRNA, которые могут появляться по ошибке в
клетках; 2) выполняют защитные (антипатогенные и антипаразитарные) функции. В обоих
случаях эти биологические эффекты достигаются путем связывания si/miRNA с комплементарной полинуклеотидным звеном mRNA собственных клеток или mRNA болезнетворных вирусов, или mRNA паразитических организмов, например, нематод. В клетках
животных и растений si/miRNA функционируют разными путями: si/miRNA животных
связываются с 3'-UTR регионами (3'-untranslated regions) или с ORF (open reading frame)
молекул-мишеней mRNA, в то время как si/miRNA растений связываются с кодирующими
последовательностями mRNA [15].
Но в случаях инфицирования большой массы клеток в тканях растений вредителями
синтезируется недостаточно молекул si/miRNA против тех или иных паразитов и поэтому,
соответственно, не достигается защитный эффект. Ученые предлагают 2 подхода повышения количества si/miRNA в ответ на патогенез [1, 5, 7-9]: 1) методом введения в клетки
дополнительного числа копий генов si/miRNA путем генетической трансформации; 2) активацией экспрессии собственных клеточных генов синтеза si/miRNA некими специфическим индукторами.
Целью нашей работы было изучение возможностей усиления иммуно-защитных
свойств растений путем повышения синтеза si/miRNA с помощью регуляторов роста Радостим, Регоплант, Биоген и Стимпо, и как следствие, добиться повышения устойчивости
растений к вредителям (нематодам).
Материалы и методы исследований. Объектом исследования были растения сахарной свеклы и рапса, инфицированные цистообразующими корнепаразитирующими нематодами Heterodera shcachtii и обработанные регуляторами роста растений с биозащитным
эффектом.
2
Полевые опыты проводились в 2010 году в условиях Уладово-Люлинецкой опытноселекционной станции (Винницкая обл.) на природном инвазионном фоне путем закладки
мелкоделяночных опытов и в отделе фитопатологии и энтомологии Института биоэнергетических культур и сахарной свеклы НААН Украины. Для установления численности
свекловичной нематоды отбирались и анализировались образцы почвы перед посевом сахарной свеклы (06.05.2010 г.), после развития первого поколения нематоды (01.07.2010 г.)
и после уборки корнеплодов (14.09.2010 г.) согласно ДСТУ 6057:2008 «Свекла сахарная.
Методы определения вредоносности свекловичной нематоды». Для этого образцы почвы
отбирали по двум диагоналям участка или зигзагообразно. Отобранные образцы почвы
помещали в мешочки из полиэтилена или ткани, вкладывали этикетку с указанием даты
обследования, номера участка и передавали в отдел фитопатологии и энтомологии, где
проводили их анализ. Плотность популяции свекловичной нематоды в почве определяли
по количеству цист, личинок и яиц, выделенных из 100 см3 почвы (цист/100 см3; личинок+яиц/100 см3 почвы) с помощью флотационно - вороночного метода.
В лабораторных условиях почвенные образцы тщательно перемешивали, просеивали
через сито с диаметром отверстий 3 мм и сушили на воздухе до воздушно-сухого состояния. Далее навеску почвы объемом 100 см3 высыпали в химический стакан емкостью
1 литр и заливали на 2/3-3/4 водой. Почву размешивали стеклянной палочкой 2-3 минуты
и оставляли отстаиваться на протяжении 5 минут до появления осадка. Верхний слой воды с цистами, что всплыли, и органическими частицами сливали на сито с диаметром отверстий 0,1-0,2 мм. Такую процедуру повторяли трижды, добавляя в стакан воду. Осадок
из сита смывали с помощью резиновой груши в лейку с вложенным фильтром. После процеживания фильтр вынимали из лейки и смотрели под микроскопом МБС-9. Цисты,
найденные на фильтре, переносили в каплю воды на предметное стекло, где проводили их
подсчет.
Определение наполненности цист проводили путем подсчета количества личинок и
яиц (л+я/100 см3 почвы) в них, что служит показателем зараженности почвы свекольной
нематодой.
Исследования проводились на изолированном земельном участке общей площадью
2 га. Размер учетных участков - 13,5 м2, повторность опыта - трехкратная, размещения
участков рендомизированное. Сев проводили 23.04.2010 г. семенами гибрида Украинский
ЧМ 70. Уход за посевами - общепринятый для данной зоны.
В фазе 6-8 листьев сахарной свеклы (25.06.2010 г.) проведены опрыскивания растений
(варианты 2, 3, 4, 5) регулятором роста Стимпо (50 мл / 250 л воды на 1 га).
Эффективность действия регуляторов роста растений против свекловичной нематоды
в прикорневой почве определялась в процентах за разницей между допосевной численностью свекловичной нематоды в почве и плотностью ее популяции после развития первого
поколения.
Учет урожая сахарной свеклы (14.09.2010 г.) проводили путем взвешивания всех корнеплодов с каждого участка и перечисляли на гектар посева.
3
Сахаристость корнеплодов определяли на действующей линии "Венема" методом холодной дигестии в условиях опытной станции.
Возможность индукции регуляторами роста растений синтеза si/miRNA с антинематодною активностью проверяли с помощью молекулярно-биологических методов в отделе
биоинженерии Института биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины. С этой
целью семена сахарной свеклы и рапса с высокой всхожестью проращивали на чашках
Петри на безнематодной водной среде (контроль) и с суспензией цист нематод, из которых в процессе инкубации при 23 ºС появлялись личинки нематод (примерно на 5-й - 7-й
день). В параллельных пробах добавляли также регулятор роста Регоплант с высокой биозащитной активностью.
Предварительно для этих экспериментов нами был разработан метод выделения препаратов si/miRNA высокой чистоты для проверки родства si/miRNA к mRNA и функциональной (сайленсовой) активности в бесклеточной системе белкового синтеза.
На сегодняшний день существует много методов выделения si/miRNA [11-14]. Однако,
большинство из них являются трудоемкими и дорогостоящими для пользователя. Разработанный нами оригинальный метод выделения si/miRNA состоит из следующих этапов:
1) выделение суммарного препарата RNA из клеток растений [16 - 18]; 2) разделение
poly(А)+RNA (то есть mRNA) и poly(А)-RNA на олиго(dT)-целлюлозной колонке с целью
дальнейшего использования poly(А)+RNA для тестирования функциональной активности
si/miRNA в бесклеточных системах белкового синтеза из проростков пшеницы [16, 18];
3) осаждение высокомолекулярной poly(А)-RNA из элюата проводили 10% раствором полиэтиленгликоля (мол. масса 8000) с 0,5 М NaCl, а si/miRNA - равным объемом 96% этанола при 22 °C в течение суток; 4) осаждение poly(А)+RNA после элюции из колонки этанолом; 5) молекулярная гибридизация в растворе низкомолекулярных si/miRNA с фракцией poly(А)+RNA; 6) температурная денатурация гибридных молекул poly(А)+RNA из
si/miRNA и обособление poly(А)+RNA от si/miRNA на олиго(dT)-целлюлозной колонке;
7) повторное осаждения si/miRNA 96 % этанолом и проверка чистоты выделенных
si/miRNA с помощью электрофореза в 15 % полиакриламидном геле (ПААГэлектрофорез) и сайленсовой активности si/miRNA в бесклеточных системах белкового
синтеза из проростков пшеницы.
Для опытов по гибридизации si/miRNA с mRNA перед получением si/miRNA, ее интенсивно метили in vivo радиоактивным фосфором 33P с помощью Na2H33PO4 [17]. Для
опытов по проверке ее ингибирующей активности в бесклеточных системах белкового
синтеза мы использовали немеченную si/miRNA [18]. Дисперсионный статистический
анализ полученных данных проводили по Стьюденту.
Результаты исследований и их обсуждение. В проведенных нами полевых и лабораторных опытах было определено, что созданные в Государственном предприятии "Межведомственный научно-технологический центр "Агробиотех" НАН и МОН Украины регуляторы роста растений Радостим, Регопланти Стимпо значительно повышают устойчи-
4
вость растений к широкому кругу болезнетворных организмов, как вирусного происхождения, паразитических организмов (например, нематод), так и вредителей-насекомых.
По результатам лабораторного анализа отобранных образцов почвы установлено, что
допосевная численность свекловичной нематоды на опытных участках составляла в среднем 4647 яиц+личинок/100 см3 почвы, то есть в 23 раза превышала экономический порог
вредоносности нематоды (200 я+л/100 см3 почвы) (табл. 1). Результатами исследований
установлено, что эффективность действия регуляторов роста растений по обработки ими
семян сахарной свеклы и опрыскивание в период вегетации против свекловичной нематоды неодинакова и колеблется в пределах от 22,4 до 74,2% (табл. 1). Высокую эффективность действия в снижении численности свекловичной нематоды получены при применении регулятора роста Регоплант. Численность нематоды в почве в данном случае снизилась с 4375 к 1131 я+л/100 см3 почвы или на 74,2%. Несколько ниже противонематодное
действие обеспечила обработка семян регулятором роста Биоген. Его использование позволило уменьшить плотность популяции паразита в 2,2 раза или на 55,2%. Применение
регуляторов роста Биолана и Радостима обеспечило снижение численности свекловичной
нематоды в почве соответственно на 22,4% и 32,2% или в 1,3-1,5 раза.
Таблица 1
Влияние регуляторов роста растений на численность свекольной нематоды в почве
Численность свекольной
Норма затрат нематоды, я+л/100 см3
Снижение плотности
Вариант опыта
препарата,
популяции нематод,
почвы
мл/т
раз
после
до посева
I генерации
Радостим
250
3671±112
2487±96*
1,5
Регоплант
250
4375±134
1131±34*
3,9
Биоген
250
4625±142
2074±63*
2,2
Биолан
25,0
4336±116
3367±107
1,3
* - наименьшая существенная разница, р<0,05, n=3
Опытами также установлено, что применение регуляторов роста в начале вегетации
сахарной свеклы не только уменьшило численность свекловичной нематоды в почве, но и
положительно повлияло на урожайность. Так, на всех вариантах опыта с применением регуляторов роста урожайность сахарной свеклы и сбор сахара существенно превышали
контрольный вариант - соответственно на 1,7-6,5 % и 0,6-1,4 т/га (табл. 2). Наивысшие показатели получены на вариантах, где применяли регуляторы роста Биоген и Радостим соответственно 40,3 и 40,0 т/га корнеплодов и 6,1 и 6,2 т/га сахара. Использование регуляторов роста растений Радостим и Биолан обеспечило прибавку урожая корнеплодов соответственно на 2,7 га и 1,7 т/га по сравнению с вариантом, где эти препараты не применяли.
5
Таблица 2
Влияние регуляторов роста растений на продуктивность сахарной свеклы
Продуктивность культуры
Норма использоВарианты опыта
вания препарата, урожай- сахаристость, сбор сахара,
ность,
мл/т
%
т/га
т/га
Контроль (обработка водой)
Радостим
Регоплант
Биоген
Биолан
250
250
250
25,0
33,6±1,2
36,3±1,6
40,0±1,8*
40,1±1,7*
35,3±1,1
14,2±0,02
15,2±0,03*
15,6±0,05*
15,3±0,02*
15,2±0,01*
4,8±0,01
5,5±0,02*
6.2±0,03*
6,1±0,03*
5,4±0,02*
* - наименьшая существенная разница, р<0,05, n=3
При проведении лабораторных опытов мы исходили из того, что влияние на растение
различными типами патогенов или паразитов, индуцирует синтез специфических к структуры их mRNA пул si/miRNA и это позволило нам также предположить, что регуляторы
роста стимулируют синтез si/miRNA, благодаря чему осуществляется повышение иммунитета растений по указанному механизмом действия si/miRNA. Следовательно, получения ответов на эти поставленные вопросы может помочь созданию нового поколения регуляторов роста со свойствами выборочной активации синтеза si/miRNA, специфических
к mRNA того или иного патогена, или паразита.
Результаты ПААГ-электрофореза, представлены на рис.1 свидетельствуют, что нами
были получены препараты si/miRNA высокой чистоты, размером от 21 до 25 нуклеотидов,
что соответствует классическим параметрам этих типов RNA.
В таблице 3 приведены данные относительно уровня синтеза si/miRNA у растений в
контроле, в опытах с растениями, обработанными регулятором роста Регоплант, у растений при инкубации с нематодами, а также у растений в условиях действия регулятора роста Регоплант на фоне инфицирования нематодами. Как свидетельствуют полученные результаты, под влиянием регулятора роста Регоплант резко повышается синтез клеточных
si/miRNA, а инфицирование растений нематодами, наоборот, резко снижает синтез этого
класса RNA. Стимулятор роста Регоплант несколько выравнивает синтез si/miRNA, но
этот уровень, хотя и выше показателя контроля, но не достигает уровня синтеза, индуцированного регулятором роста без нематод.
6
Рис. 1. ПААГ - електрофорез si/miRNA с проростков рапса
Маркерные полинуклеотиды (в цифрах приведена длина в нуклеотидах) и препарат
si/miRNA на дорожках геля (соответственно 1 и 2) были насыщены етилумбромидом; радиоавтограф 33P меченых si/miRNA с геля (дорожка 3).
В таблице 4 приведены данные, которые раскрывают суть результатов, указанных в
таблице 3. Это, как можно видеть связано с тем, что нематодная инфекция снижает синтез
собственно клеточных si/miRNA, который значительно повышается при стимуляции регулятором роста и развития растений Регоплант, но этот ускоренный рост подавляется личинками и в то же время усиливается синтез защитных антинематодних si/miRNA с комплементарной структурой к mRNA нематод (то есть осуществляется, перепрограммирование генома клеток растений).
Аналогичные результаты были получены в наших опытах и с растениями рапса при
инфицировании их личинками нематод (таблица 5). Известно, что тот же вид нематод, который поражает растения свеклы, поражает и рапс (у энтомологов существует предположение, что вспышка нематодной эпизоотии на растениях свеклы связана с привнесением
на поля массовой нематодной популяции вместе с рапсом, который широко культивируется в Украине).
7
Таблица 3
Влияние регулятора роста Регоплант на включение Na2H33PO4 в si/miRNA в клетках
5-дневных проростков сахарной свеклы, инкубированных и неинкубированных с нематодами.
имп/мин/мг
Варианты опытов
si/miRNA
1. Контроль
(проростки растений, инкубированных на водной среде)
2680 ± 98,0
2. Проростки, полученные в водной среде с препаратом Регоплант
4309 ± 121*
3. Проростки, выращенные на водной среде с личинками нематод
1970 ± 83*
4. Проростки, выращенные на водной среде с препаратом Регоплант и личинками нематод
3760 ± 112*
* - наличие отличий от контроля, р<0,05, n=3
5-ти дневные проростки растений инкубировали с Na2H33PO4 в течение 1 ч в чашках
Петри. Регуляторные si/miRNA - антисенсовые, комплементарные к mRNA, выделяли по
разработанной нами методике получения высокоочищенных нативных препаратов
si/miRNA. Аликвоты радиоактивных si/miRNA помещали на нитроцеллюлозные подложки с последующим подсчетом радиоактивности.
Таблица 4
Усиление антинематодных свойств si/miRNA 5-дневных проростков сахарной свеклы,
под влиянием регулятора роста Регоплант и личинок нематод.
Показатель ингибирования
белкового синтеза в
Степень гомобесклеточной системе,
логии по гибридизации
имп/мин/мг белка*
Варианты опытов
mRNA
mRNA из расте- mRNA с личис 33Р si/miRNA
ний +
нок +
33
33
(имп/мин/20
Р si/miRNA
Р si/miRNA
мкг mRNA)
из растений
из растений
Гибриды mRNA с 33Р si/miRNA
контрольных растений
8724 ± 146
(100%)
100 %
10 %
Гибриди mRNA контрольных растений с 33Р si/miRNA растений, обработанных препаратом Регоплант
6850 ± 224
(83%)**
82 %
15 %
Гибриды mRNA контрольных растений с 33Р si/miRNA растений, инкубированных с личинками нематод
6358 ± 182
(73%)**
65 %
36 %
46 %
58 %
Гибриды mRNA контрольных растений с 33Р si/miRNA растений, инкубированный с препаратом Регоплант и личинками нематод
5583 ± 164
(64%)**
8
Примечание: использовали бесклеточную систему белкового синтеза из проростков
в качестве меченного предшественника использовали аминокислоту - 35S метионин.
* в бесклеточной системе белкового синтеза применяли те же варианты
опытов, что в опытах по гибридизации.
** - наличие отличий от контроля, р<0,05, n=3
Анализ данных таблицы 5 позволяет увидеть ту же самую закономерность в изменениях синтеза si/miRNA в рапсе, которая наблюдается и у растений свеклы: значительное повышение уровня синтеза si/miRNA под влиянием регулятора роста Регоплант, снижение
уровня синтеза собственных клеточных si/miRNA при инфицировании растений личинками нематод и уменьшение поражения нематодами под влиянием регулятора роста благодаря повышению уровня синтеза очевидно si/miRNA с антинематодной активностью.
Таблица 5
Влияние регулятору роста Регоплант на включение Na2H33PO4 в si/miRNA в клетках 5дневных проростков рапса, инкубированных и неинкубированных с нематодами.
имп/мин/мг
Варианты опытов
si/miRNA
Контроль
(проростки растений, инкубированные на водной среде)
4760 ± 146
Проростки,
полученные на водной среде с препаратом Регоплант
6420 ± 208*
Проростки,
выращенные на водной среде с личинками нематод
2910 ± 117*
Проростки, выращенные на водной среде препаратом
Регоплант и с личинками нематод
5380 ± 185*
* - наличие отличий от контроля, р<0,05, n=3
5-ти дневные проростки растений инкубировали с Na2H33PO4 в течение 1 ч в чашках
Петри. Регуляторные si/miRNA - антисенсовые, комплементарные к mRNA, выделяли по
разработанной нами методике получения высокоочищенных нативных препаратов
si/miRNA. Аликвоты радиоактивных si/miRNA помещали на нитроцеллюлозные подложки с последующим подсчетом радиоактивности.
Выводы. Таким образом, результаты полевых исследований показали, что благодаря
обработке семян регуляторами роста растений (Радостим, Регоплант, Биоген, Биолан) и
опрыскивания (Стимпо) посевов сахарной свеклы в фазе 6-8 листьев численность свекловичных нематод в почве снижается на 22,4-74,2 % в зависимости от препарата, что позволяет повысить урожайность корнеплодов сахарной свеклы и сбор сахара. В лабораторных
экспериментах впервые показано, что повышение иммунитета растений сахарной свеклы
и рапса против нематодной инвазии достигается путем усилением синтеза малых регуляторных si/miRNA, схожих (комплементарных) к структуре mRNA нематод, что приводит к
9
блокированию (сайленсинга) трансляции mRNA нематод. Разработанный нами метод выделения si/miRNA дальше используется для синтеза кДНК на матрицах si/miRNA и конструирование векторов на основе cDNA копий генов с экспрессией si/miRNA в трансформированных нами растениях.
Нематоды – класс круглые черви. Тело покрыто кутикулой, голова практически не
выражена, пищевой тракт сквозной, органы дыхания и кровообращения отсутствуют.
мышечные волокна только продольные. Нематоды как правило раздельнополые, причем
самцы гораздо мельче самок. Крупные самки содержат до 1 млн. яиц и откладывают их
по четверти миллиона в сутки. В теплой сырой земле или теле организма хозяина из яиц
вылупляются молодые черви, сходные с взрослыми особями во всем, за исключением общих размеров и развития репродуктивной системы. В 1 дм3 поверхностного слоя почвы
может быть до 2 млн. особей.
Annotation
Field studies showed that sugar beet seed processing by plant growth regulators (PGR)
reduced the number of beet nematode in the soil. Using molecular-biological methods it is found
at first that PGR enhance sugar beet and rape plants’ resistant against nematode stimulating
synthesis of si/miRNA.
Аннотация
В полевых опытах определено, что обработка семян сахарной свеклы регуляторами
роста растений (РРР) снижает численность свекловичной нематоды в почве. Молекулярно-биологическими методами впервые установлено, что РРР значительно повышают
стойкость растений сахарной свеклы и рапса к нематодам путём стимуляции синтеза
si/miRNA.
10
Список литературы
1. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22nucleotide RNAs // Genes @ Development. – 2001. – V. 15. – P. 188 – 200.
2. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L. et al. Two classes of short interfering RNA in RNA
silencing // The EMBO Journal. – 2002. – V. 21, № 17. – P. 4671 – 4679.
3. Lee Y., Ahn C., Han J., et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing //
Nature. – 2003. – Vol. 425. – P. 415 – 419.
4. Mourelatos Z., Dostie J., Paushkin S., et al. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins
containing numerous microRNAs // Genes Dev. – 2002. – Vol. 16. – P. 720 – 728.
5. Leung R. K. M., Whittaker P. A. RNA interference: from gene silencing to gene-specific
therapeutics // Pharmacology and Therapeutics. - 2005. – № 107. – P. 222 – 239,
6. Aravin A., Tuschl T. Identification and characterization of small RNAs involved in RNA
silencing // FEBS Letters. – 2005. – V. 579. – P. 5830 – 5840.
7. Bakhetia M., Charlton W. L., Urwin P. E. et al. RNA interference and plant parasitic
nematodes // Trends in Plant Science. – 2005. - V.10, № 8. – P. 362 – 367
8. Gheysen G., Vanholme B. RNAi from plants to nematodes // Trends in Biotechnology. –
2006. – V. 25, № 3. – P. 89 – 92
9. Knox D.P., Geldhof P., Visser A., Britton C. RNA interference in parasitic nematodes of
animals: a reality check? // Trends in Parasitology. – 2007. – V. 23, № 3. – P. 105 – 107.
10. Jian X., Zhang L., Li G. et al. Identification of novel stress-regulated microRNAs from
Oryza sativa L. // Genomics. – 2010. – V. 95. – P. 47 – 55.
11. Chen R., Hu Z., Zhang H. Identification of MicroRNAs in Wild Soybean (Glycine soja) // J.
of Integrative Plant Biology. – 2009. - V. 51, № 12. – P. 1071–1079.
12. Park W., Li J., Song R., Messing J. and Chen X. CARPEL FACTORY, a Dicer Homolog,
and HEN1, a Novel Protein, Act in microRNA Metabolism in Arabidopsis thaliana induced
silencing complex (RISC), which targets homologous RNAs for degradation // Current Biology.
– 2002. - V. 12. – P. 1484–1495.
13. Llave C., Kasschau K. D., Rector M. A. and Carrington J. C. Endogenous and SilencingAssociated Small RNAs in Plants // Plant Cell. – 2002. - V. 14. – P. 1605–1619.
14. Lu C., Meyers B. C., Green P. G. Construction of small RNA cDNA libraries for deep
sequencing // Methods. –2007. - V. 43. – P. 110 – 117.
15. Yang T., Xue L., An L. Functional diversity of miRNA in plants // Plant Science. – 2007. –
V. 172. – P. 423 – 432.
16. Tsygankova V. A., Blume Ya.B. et al. An unusual minor protein appearing in embryonic
axis cells of haricot bean seeds following germination process stimulated by 6-methylthiouracil
// Biopolymers and cell. – 1998. – V. 14, №5. – P. 438 – 448.
17. Tsygankova V. A. Concerning the peculiarities of gene expression changes in plant leaf cells
during twenty-four-hour period // Biotechnology. – 2010. – V. 3, № 4. – Р. 86 – 95.
18. Tsygankova V.A., Musatenko L.I., Ponomarenko S.P., Galkina L.A., Andrusevich Ja. V.,
Galkin A.P. Change of functionally active cytoplasmical mRNA populations in plant cells under
growth regulators action and biological perspectives of cell-free systems of protein synthesis //
Biotechnology. – 2010.– V. 3, № 2. – P. 19 – 32.
19. Tsygankova V.A., Galkin A.P., Galkina L.A., Musatenko L.I., Ponomarenko S.P., Iutynska
H.O. Gene expression under regulators’ stimulation of plant growth and development. – In
Chapter 3 of the Monograph “New plant growth regulators: basic research and technologies of
application”/ Editors: S.P. Ponomarenko, H.O. Iutynska. – Kyiv: Nichlava, 2011. – 211 p.
11