Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской
реклама
ПРОГРАММА КУРСА ПО ВЫБОРУ «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» для студентов медико-биологических факультетов В проекте программы курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» представлены важнейшие разделы биомедицинской науки, лежащие в основе современной медицинской биотехнологии. Новые медицинские биотехнологии приобретают все большее значение в самых разных направлениях медицинской науки и практики. Они легли в основу принципиально новых подходов при создании новых лекарственных препаратов, диагностике, прогностике и лечении многих социально значимых заболеваний, а также идентификации личности. Отдельные лекционные курсы программы посвящены молекулярной организации клетки (с акцентом на роль отдельных белков в макромолекулярной организации клеток и в их функционировании), молекулярным основам наследственной патологии (включая методы анализа генома, стратегию картирования патологических генов и ДНКдиагностику различных наследственных заболеваний), генной инженерии, а также генной терапии (с избранными главами вирусологии). Практические занятия включают два основных раздела: культивирование и методы исследовния эукариотических клеток и методы генной инженерии. Все разделы проекте программы составлены с учетом новейших достижений в области медицинской биотехнологии. Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» для студентов медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета (6-ой курс, XI семестр) включает лекционный материал и практические занятия. За время обучения студенты обязаны овладеть рядом основных методов медицинской биотехнологии, широко используемых в современной биомедицине. В конце XI семестра студенты сдают два зачета по практическим занятиям, теоретический зачет по курсам "Генная инженерия", "Молекулярные основы наследственной патологии", "Генная терапия" и экзамен по курсу "Молекулярная организация клетки". ПРОГРАММА СПЕЦКУРСА «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» Молекулярная организация клетки Настоящий курс не ставит цель охватить все современные направления молекулярной организации клеток; его главная задача, – опираясь на основополагающие представления клеточной биологии о клеточном цикле, позволяющие описывать жизнь клетки во всей ее полноте, показать студентам прежде всего особенности молекулярного и биологического поведения наиболее важных структурных компонентов клетки таких, как цитоскелет и интегрированные с ним белки, а также показать основные механизмы регуляции цитоскелета в разных состояниях клетки. Продемонстрировать те успехи, которые достигнуты в понимании роли факторов роста и других регуляторных экзо- и эндогенных молекул в их влиянии – на состояние фенотипа клетки, разнообразие форм движения клетки, ее адгезивные свойства, генотипические особенности. При знакомстве с этими фундаментальными явлениями в жизни клетки достаточно подробно рассматриваются особенности молекулярной организации главных компонентов внеклеточного матрикса, всех классов молекул адгезии, важнейших семейств факторов роста. Кроме того, в курсе представлены материалы о протоонкогенах и онкогенах, о регуляторном влиянии их продуктов на жизнь клетки. Значительное внимание уделено обзору структуры и молекулярным особенностям основных классов белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, а также другим важнейшим структурам и регуляторным молекулам, которые вовлечены в этот процесс. В каждом разделе курса особое внимание обращается на причины нарушений течения тех или иных регуляторных процессов в нормальной клетке, которые приводят к патологическим изменениям в ее биологическом поведении. Цитоскелет эукариотических клеток. Три типа филаментов участвующих в организации цитоскелета и строящих сложную двухмерноорганизованную сеть: микрофиламенты (актиновые филаменты), микротрубочки и промежуточные филаменты. Многообразие структурных и функциональных ролей каждого из типов филаментов в поведении клетки. Проблемы изучения взаимодействия элементов цитоскелета друг с другом и с плазматической мембраной; группы специфических белков, участвующих в организации таких связей. Самосборка микрофиламентов и микротрубочек; роль нуклеотидтрифосфатов. Цитоскелет и эпигенетическая информация. Актин и актиновые филаменты (микрофиламенты) Актин - один из наиболее широко представленных белков у эукариотических клеток. Актин – это прототип цитоскелетных белков. Структура молекулы актина; Gактин. Эволюционная консервативность структуры актина. Главные (основные) изоформы актинов млекопитающих. Три класса типов актина: , и . Уникальность одной из изоформ актина для определенного типа ткани. Актиновые филаменты - F-актин. Полимеризация актина in vitro и in vivo. Полярность актинового филамента. Скорость роста актинового филамента с «+» и «-» концов. Актин-АТФ и актин-АДФ, их участие в процессе полимеризации. Роль гидролиза АТФ в росте актинового филамента. Конформационные изменения молекул актина в формах, связанных с АТФ или АДФ. Деление механизма полимеризации актина на три стадии. Вещества, влияющие на поли- и деполимеризацию актинового филамента: цитохалазин A,B,C,D,E, фаллоидин, латринкулин A, B. Краткий обзор функций основных типов белков, связывающих актин и актиновые филаменты: связывающие мономеры актина, кэппируюшие, желатинирующие, связывающие актиновые филаменты в пучки; соучаствующие в поддержании структуры и функции филаментов; белки, ассоциирующие F-актин с плазматической мембраной, миозин. Доменная организация актин-связывающих белков: сходства и отличия. Понятие кортекса клетки, участие сети актиновых филаментов в его организации. Заякоривание актиновых филаментов на плазматической мембране, роль белков – понтикулина, кальпактина и липокортина. Спектрин – высоко специфический белок, участвующий в организации кортекса эритроцитов млекопитающих; его структура. Другие белки кортекса эритроцита: «bandIII» и гликофорин; анкирин, тропомиозин, белок 4.1, аддуцин; их структура и роль в организации кортекса эритроцита. Изоформы спектрина: эритроцитарные и неэритроцитарные формы – фордин и TW260/240. Роль актиновых филаментов в индукции формирования и сборки сайтов адгезии – фокальных контактов и фокальной адгезии. Зависимость течения фагоцитоза от специфической связи рецепторов фагоцитоза с актиновыми димерами. Структурная и функциональная роль актиновых филаментов в процессе сокращения эукариотических клеток. Миозиновая и актиновая регуляция сокращения клеток. Миозин II из скелетной мускулатуры. Тонкая организация саркомера. Структура молекулы миозина II. S1 фрагменты головки миозина; «декорирование» S1 фрагментами актиновых филаментов. Эссенциальные и регуляторные легкие цепи головки миозина; их роль в гидролизе АТФ при взаимодействии миозина с актином. Миозин – это АТФаза. Механизм движения головки миозина II вдоль актинового филамента. Структура хвоста миозина II, роль в ассоциации и образовании «толстых филаментов» саркомера. Общая схема миозиновой регуляции поперечно-полосатой мускулатуры. Роль альфа-актинина и десмина в структурной организации саркомера. Структура тропомиозина, его изоформы. Структура тропонинов T, I, С, их взаимодействие с тропомиозином и их роль. Взаимодействие комплекса тропонинов с тропомиозином и с актиновыми филаментами. Механизм регуляции мышечного сокращения, участие Са2+ , тропониновой системы, тропомиозина и F-актина. Изоформы миозина II - возможные функции у эукариотических клеток. Миозин I – миозин немышечных и гладкомышечных клеток. Структура и изоформы миозина I, сравнение с миозином II. Особенности поведения молекулы миозина I в акте сокращения: активация легких цепей путем фосфорилирования; роль киназы легких цепей миозина; роль Са2+ и кальмодулина; структура и функции кальмодулина. Фосфорилирование легкой цепи изоформ миозина I у немышечных клеток. Молекулярные механизмы миозиновой и актиновой регуляций сокращения немышечных и гладкомышечных клеток. Роль кальдесмона и кальпонина; структура и молекулярные свойства этих белков. Семейство миозинов I неспособных образовывать филаменты: их транспортная роль в клетке. Кортикальный F-актин и роль миозина I в сокращении сократительного кольца (кольца деления) у ана-телофазных клеток и в организации опоясывающих десмосом у интерфазных клеток, а также в движении и подвижности плазматической мембраны. Амебоидное движение и подвижность немышечных клеток: сходство и различия, роль субстрата для этих двух типов движения клеток. Амебоидное движение амеб и макрофагов; роль внеклеточных стимулов для образования псевдоподий. Структура псевдоподий; экто- и эндоплазма, переходы золь-гель. Роль актиновых филаментови альфа-актинина в образовании геля; структура альфа-актинина: доменная организация, особенности взаимодействия с актиновыми филаментами. Цитоплазматический золь – двумерноорганизованная структура, где решающая роль принадлежит группе актин-фрагментирующих белков – северину, гельзолину. Структура гельзолина, его изоформы, три актин-связывающих сайта гельзолина, роль ионов кальция в поведении гельзолина. Кэпирование гельзолином «+»концов фрагментов филаментов. Роль миозинов I и II в потоке цитоплазмы при амебоидном движении. Триггерная роль ионов кальция и инозитолфосфатов в индукции образования и роста псевдоподий. Роль пула G-актина в образовании клеточно-поверхностных выпячиваний. Структура и роль белков, связывающих мономеры актина в регуляции полимеризации кортикальных актиновых филаментов: (1) семейство тимозинов; (2) семейство ADF/кофилин; (3) профилин, локализация в клетке, влияние на конформацию молекулы актина, роль в обмене AДФ на АТФ в молекуле актина. Акросомная реакция спермиев. Общая организация неактивированного спермия. Копацитация. Молекулярный механизм сборки акросомного выроста. Роль профилина в быстром образовании связки актиновых филаментов акросомного выроста. Микроворсинки щеточной каемки – прекрасный пример роли актин-связывающих и некоторых структурных белков в упорядоченной сборке актиновых филаментов. Актиновый кор микроворсинки. Фимбрин и виллин – важнейшие актин-связывающие белки, участвующие в морфогенезе кора. Фимбрин: структура, распространение, роль в однонаправленной по полярности параллельной укладке актиновых филаментов. Виллин: структура, зависимое от Са2+ поведение белка; виллин как актин-фрагментирующий белок. Тканеспецифичность виллина. Роль экспрессии виллина в индукции самосборки микроворсинок. 110kDa белок - изоформа миозина I, роль в связывании кора микроворсинки с плазматической мембраной; локализация кальмодулина и АТФ; возможная сократительная функция миозина I в общем механизме противодействия микроворсинки механической деформации. Терминальная пластинка (сеть) микроворсинок; ее молекулярная организация; расположение и участие миозина II, фордина/спектрина (TW260/240), кальдесмона и тропомиозина. Заякоривающая роль пластинки для кора микроворсинки; возможное взаимодействие пластинки с промежуточными филаментами. Возможное участие одного из компонентов вершины ворсинки - эзрина – в заякоривании «+» концов кора на плазматической мембране. Семейство ЭРМ белков, или семейство эзрин/радиксин/ моезин. Степень гомологии этих белков, распространенность и роль в жизни различных типов клеток. Эзрин: общая структура молекулы, доменная организация, роль отдельных доменов в осуществлении функций молекулы. Роль PIP2 в активации эзрина, роль активной малой ГТФазы – Rho-ГТФ в увеличении содержания PIP2 в клетке, конформационные изменения активированного эзрина; общий механизм активации эзрина. Эзрин – линкер между плазматической мембраной и актиновыми филаментами. Олигомеризация эзрина, возможное участие олигомеров в создании временных «платформ» для полимеризации актина. Роль EGF, HGF, PDGF в активации эзрина и моезина и их влияние на быструю перестройку актинового цитоскелета с участием эзрина и моезина. Движение немышечных клеток. Три стадии движения клетки по субстрату. Выбор клеточной траектории движения; роль хемоаттрактантов и матриксассоциированных факторов роста; поляризация клетки; роль адгезионных матриксных белков в движении клетки. Лидирующий край клетки, роль филоподий (микрошипов) и ламеллоподий в движении клетки. Структура актинового скелета филоподий и ламеллоподий. Поведение кортекса клетки при движении; роль перестроек актиновой сети в формировании актиновых филаментов структур лидирующего края и раффлинге. Конкурентные и кооперативные взаимоотношения актин-связывающих белков в кортикальном актиновом цитоскелете - филамина, альфа-актинина, тропомиозина и миозина II; роль фимбрина в формировании скелета филоподий, роль филамина /спектрина в ортагональной упаковке филаментов ламеллоподий. Актиновые stress fibers, структура, молекулярный состав; роль stress fibers в прикреплении клетки к субстрату и формировании сайтов фокальной адгезии. Возможная роль миозина I, киназы легких цепей миозина, альфа-актинина, тропомиозина, кальмодулина, входящих в состав stress fibers. Роль альфа-актинина в антиполярной укладке фибрилл stress fibers. Роль винкулина и талина в ассоциации stress fibers к плазматической мембране и формировании сайтов фокальной адгезии. Фокальная адгезия клеток. Два класса сайтов фокальной адгезии: фокальные контакты и фокальная адгезия. Роль интегринов в организации фокальной адгезии; взаимодействие талина и винкулина с -субъединицей интегринового рецептора и stress fibers. Структура винкулина, паксилина, тензина, особенности их взаимлдействия; расположение сайтов фосфорилирования по остаткам тирозина, серина и треонина у двух последних белков. Регуляторная роль паксилина в сборке и диссоциации фокальной адгезии; кэпирующая роль белков семейства ЭРМ и тензина. Тирозинпротеинкиназы, ассоциированные с фокальной адгезией – FAK-киназа (p125FAK), c-src (p60src), fyn, csk; их роль в фосфорилировании паксилина и тензина; индукция активации p125FAK и p60src интегриновым сигналом; роль тирозинфосфатаз в индукции диссоциации фокальной адгезии. Регуляция полимеризации актина, сборки stress fibers и фокальной адгезии. Триггерные молекулы этой регуляции – субсемейство малых ГТФаз – “Rho”. Характеристика субсемейства Rho – rhoA, rhoB, rhoC, rac, cdc42; белки GAP, стимулирующие активацию rho, стимулирующие обмен нуклеотидов – smg GDS; ингибирующих диссоциацию ГДФ-rho и ГДФ-rac-rhoGDI1 . Роль интегринового сигнала и сигналов лиганд-связанных рецепторов факторов роста, в активации белков субсемейства Rho. Последовательный каскад активации cdc42, rac, rho и индукция полимеризации актина и сборки филаментов. Зависимость морфологического типа сборки филаментов от активации соответствующей малой ГТФ-азы: активация cdc42 – скелет филоподий и фокальной адгезии; активация rac –скелет ламеллоподий, stress fibers и фокальных контактов на периферии лидирующего края; активация rho – индукция сборки stress fibers и фокальной адгезии. Роль cdc42, rac, rho в координации пространственных и временных изменений кортикального и цитоплазматического цитоскелета. Эффекторные молекулы Rho – два семейства серин-треониновых протеинкиназ, а также PIP-5 киназа. Участие rhoГТФ в активации FAK-киназы и некоторых актин-связывающих белков, участвующих в фокальной адгезии. Активация винкулина с участием rho-ГТФ и PIP2 – обязательный этап сборки фокальной адгезии. Активация протеинкиназы N, активный Rho и фосфорилирование паксилина – индукция дезагрегации фокальной адгезии. Роль RhoГТФ в каскаде фосфорилирования, завершающемся фосфорилированием легкой цепи миозина, и активации миозина I; участие миозина I в инициации упорядоченной сборки актиновых филаментов, их сократимости и формировании stres fibers. Контроль и механизмы сборки актиновых филаментов внутриклеточными патогенными бактериями. Перемещение бактерий в клетке происходит за счет формирования «актиновых хвостов». Построение актиновых хвостов протекает за счет системы клетки-хозяина. Поверхностный Act-А белок Listeria monocytogenes – индуктор сборки хвоста. Доменная структура Act-A; ABM-1 последовательности и их роль в связывании с VASP-сAMP и cGMP зависимой протеинкиназой. VASP (vasodilator – stimulated phosphoprotein) – доменная организация. Роль VASP в связывании профилина, зиксина. Комплексы из тетрамеров VASP, связанных с ActA и с профилином-G-актином, а также зиксином, стимулируют полимеризацию и рост актиновых филаментов и образование актинового хвоста Listeria. Использование Shigella flexneri другого механизма для сборки актиновых хвостов. IcxA – белок бактериальной стенки Shigella. Источником ABM-1 последовательности является винкулин клетки-хозяина. Протеолиз винкулина и обнажение ABM-1. Взаимодействие IcxА с р90 полипептидом винкулина, содержащем ABM-1; взаимодействие последнего с комплексом тетрамер VASP-профилин; индукция полимеризации актина и формирование актинового хвоста Shigella. Микротрубочки Роль микротрубочек в жизни эукариотических клеток. Их значение для поддержаниия симметрии клетки и в определении ее полярности; участие в движении и морфогенезе клеток. Стабильность микротрубочек - сравненис с F-актиновым. Структура микротрубочки. Тубулин – глобулярный димерный белок, из которого построены протофиламенты микротрубочек. - и -тубулин, особенности структуры; тип укладки - димеров в протофиламенты. Сравнение мономеров актина и тубулина. Полярность микротрубочек. Спонтанная самосборка полимеров тубулина in vitro, роль ГТФ. Индуцирующая роль центра организации микротрубочек в их сборке in vivo; эксперименты, доказывающие эту роль. Структура центра организации; центриоли, их структура и репликация, -тубулин и перицентриолярный материал, его роль в ассоциации «-» концов микротрубочек. Различные варианты полярности микротрубочек у разных типов клеток; полярность микротрубочек митотического веретена. Структурная и кинетическая полярность микротрубочек. Опережающий рост микротрубочек с “+” конца. Сравнение скорости диссоциации микротрубочек с “+” и “-” концов. Микротрубочки – ассоциированные белки (МАРs). Разнообразие МАРs; роль в контроле полимеризации микротрубочек; уникальные МАРs, характерные для определеных типов клеток или для различных участков одной клетки. Роль МАРs в определении уникальности тех структур, которые собираются из микротрубочек. “tau”-белок, разнообразие изоформ; роль “tau”-белка в усилении полимеризации тубулина и стабилизации микротрубочек аксонов. Нервные клетки содержат МАР1А и В, МАР2А и В. Низкая страбильность микротрубочек; эксперименты, демонстрирующие рост и турновер микротрубочек in vivo. Срудняя продолжительность жизни микротрубочек в клетке. Популяции стабильных и нестабильных (динамичных) микротрубочек; возможная их роль в жизни клетки. Гипотеза динамичной нестабильности микротрубочек. ГТФ-кэп и ГДФкэп у полимеризующихся микротрубочек. Конформационные изменения -субъединиц, связавших ГТФ; роль этих изменений в полимеризации тубулина; гидролиз ГТФ в составе полимера. Гетерогенность - и -тубулинов. Доказательства существования различных изотипов - и -тубулинов. Число генов - и -тубулиновСравнительный анализ кДНК, кодирующих шесть различных типов - и -тубулина. Экспрессия шести классов изотипов -тубулина в различных тканях птиц и мышей; степень гомологии этих изотипов. Тканеспецифическая экспрессия III, IVa, IVb и VI классов -тубулинов. Различные МАРs связываются с определенными классами -тубулинов. Особенности -тубулинов при формировании жгутиков спермиев экспрессии изотипов млекопитающих в норме и патологии. Посттрансляционная ковалентная модификация -тубулинов. Ацетилирование лизинового остатка -тубулинов;их участие в морфогенезе ресничек. Деацетилирование -тубулина. Отщепление тирозинового остатка от COOH-концевого участка -тубулина. Детирозиназы. Стабильная популяция микротрубочек и детирозинированный -тубулин. Влияние внешних сигналов (факторов роста и др.) на быструю перестройку и дезагрегацию микротрубочек, связанную с движением клетки, изменением ее полярности; роль стабильной популяции микротрубочек в этих процессах. Стабильные микротрубочки, обогащенные детирозинорованным -тубулином, участники начальных этапов установлении ассиметрии (апикальная-базальная части) эпителия. Посттрансляционные модификации -тубулинов – маркеры высоко стабильных микротрубочек. Роль кэпирования «+»-концов микротрубочек для достижения их стабильности. Транспортная роль микротрубочек. Движение везикул вдоль микротрубочек; роль цитоплазматического динеина и кинезина. Структура этих белков, АТФ-азная активность. Движение везикул с помощью динеина к «+»-концу микротрубочек, а с помощью кинезина к «-»-концу. Разнонаправленность транспорта везикул в одной клетке, например нервной и фибробласте. Движение гранул меланина в меланофоре. Роль “stop-protein” в стабилизации микротрубочек при их холодовой дестабилизации. Структура и состав ресничек и жгутиков: периферийные дублеты – А- и В-трубочки; динеиновые ручки; нексиновые связки; радиальные спицы; внутренняя капсула. Структура и функции динеина ресничек. Кинетическая модель движения жгутиков и ресничек; роль динеиновых ручек во взаимном скольжении наружных дублетов микротрубочек и возникновении изгиба реснички. Специфические агенты, связывающие тубулин: колхицин, колцемид, гризеофульвин, винбластин, винкристин, нокодазол; структура, источники происхождения и особенности действия. Агенты, поддерживающие полимеризацию тубулина и рост микротрубочек: таксол; структура, происхождение, механизм действия. Промежуточные филаменты Роль промежуточных филаментов в жизни клетки: формирование высокостабильной скелетной сети в составе цитоскелета. Главное отличие промежуточных филаментов от актиновых филаментов и микротрубочек – высочайшая стабильность. Структура субъединиц белков промежуточных филаментов и сборка цитоплазматических филаментов. Шесть классов белков промежуточных филаментов. Тканеспецифический характер экспрессии белков этих классов. Значение паттерна экспрессии промежуточных филаментов для ранней диагностики патологических изменений тканей. Субъединица белков промежуточных филаментов - -спиральный димер; гомо- и гетеродимеры; полимеризация димеров, протофиламенты; их антипараллельность; аполярность протофибрилл; сборка филамента. Доменная организация мономерных белков протофиламентов: голова, хвост, -спиральный центральный домен; вариабельные и константные части мономера; тандемные повторы аминокислотных остатков; их роль во взаимном скручивании и латеральных взаимодействиях при димеризации мономеров. Сравнение структуры мономеров кератина, виментина, нейрофиламентов и ядерной ламины. Положение потенциальных сайтов фосфорилирования киназой p34cdc2. Клеточноспецифическая экспрессия белков, входящих в состав промежуточных филаментов: виментина, десмина, трех белков нейрофиламентов – NF-L, NF-M, NF-H, кислого фибриллярного белка, ядерной ламины, кератинов. Особенности молекулярной организации кератинов: гетеродимеры. Примеры тканеспецифической экспрессии белков промежуточных филаментов в процессе развития и ходе дифференцировки: кератинов у эмбриональных тканей и кожного эпителия человека; виментина – при развитии производных мезодермы, дифференцировке мезенхимы и нервной ткани; транзиторный характер экспрессии виментина; десмина – в ходе развития сердечной, поперечнополосатой мускулатуры и гладкомышечных клеток; -интернексина – в развитии ЦНС, периферина – в развитии периферической нервной системы; нестина – экспрессия в нейроэпителиальных стволовых клетках зародыша человека и мыши. Белки промежуточных филаментов – как тканеспецифические маркеры in vivo в норме и при патологии. Изменение паттерна экспрессии белков промежуточных филаментов при культивировании клеток. Диагностика типа раковых опухолей и стадий ракового перерождения путем типирования белков- маркеров промежуточных филаментов. Особенности расположения «скелетной» сети промежуточных филаментов в клетке или ее отростках. Механические свойства цитоскелета, построенных промежуточными филаментами. Роль промежуточных филаментов в интеграции клеток в эпителиальные пласты; десмосомы; короткие десмосомы, интеркалярные диски, плотные тельца гладкомышечных клеток, гемидесмосомы, их структура, молекулярный состав, распространение и функции. Экстрацеллюлярный матрикс Роль экстрацеллюлярного матрикса (ЭцМ) в поддержании целостности тканей и органов. Разнообразие типов ЭцМ у многоклеточных животных и многообразие выполняемых функций: механическая, фильтрационная, адгезионная. Специализированные формы ЭцМ – базальные мембраны. Основные компоненты ЭцМ: коллагены, фибронектин, ламинины, протеогликаны и гликозамингликаны. Продукция клетками типоспецифического по составу матрикса; примеры: рыхлая и оформленная соединительная ткань. Информационная роль ЭцМ в жизни клетки: влияние на поведение клетки адгезионных молекул ЭцМ – при морфогенезе тканей и органов в ходе развития, при миграции клеток на ранних этапах онтогенеза; при ранозаживлении, влияние на течение воспалительных процессов; роль в онкогенезе. Матрикс - ассоциированные информационные молекулы – факторы роста, их роль в поведении клетки. Обновление ЭцМ, роль различных классов внеклеточных протеиназ: сериновые протеиназы, эластаза, коллагеназа и другие металлопротеиназы, липопротеинлипазы, гиалуронидаза и другие. Коллагены Коллагены – обширное семейство одного из главных гликопротеинов ЭцМ. Структурномеханическая роль коллагенов в организации ЭцМ. 12 типов коллагенов высших позвоночных: фибриллярные и нефибриллярные коллагены. Роль коллагенов в контроле адгезии клеток; взаимодействие интегринов с соответствующими типами коллагена. Структура коллагена I типа. Трехспиральность, размеры субъединицы; особенности организации их первичной структуры, повторяемость триплетов аминокислотных остатков, роль остатков глицина в возникновении -спирали субъединицы. Обогащенность субъединицы коллагена I типа остатками пролина и гидроксипролина; роль этих «жестких» аминокислотных остатков в дополнительной стабилизации полипептидной цепи -спирали субъединицы; стабилизирующая роль лизиловых и гидроксилизиловых остатков в возникновении межцепочечных поперечных сшивок. Формирование коллагеновых фибрилл. Синтез коллагена I типа. Препроколлаген, структура. Проколлаген; ферменты гидроксилирования лизиновых и пролиновых остатков. Роль аскорбиновой кислоты; цинга. Последовательность гликозилирования проколлагена. Образование трехспиральной молекулы проколлагена: N- и С-концевые пропептиды; роль S-S-связей в возникновении глобулярной структуры пропептидов. Особенности гликозилирования и процессов скручивания проколлагенов в тройную спираль в аппарате Гольджи. Экзоцитоз трехспиральных молекул проколлагена в ЭцМ. Роль внеклеточных пептидаз в отщеплении N- и С-концевых пропептидов. Тропоколлаген. Сборка фибрилл коллагена в ЭцМ. Агрегация фибрилл в коллагеновые волокна. Поперечная исчерченность коллагеновых фибрилл и волокон; механизм возникновения. Особенности организации и структуры гена коллагена I типа. Мутации генов коллагена, затрагивающие его структуру или синтез; их многообразие; характерный пример синдром Марфана. Коллагенозы. Особенности структуры фибрилл коллагенов III и V типов. Коллаген III типа – эмбриональный коллаген. Ассоциация коллагена I типа с III и V типами. Относительная тканеспецифичность продукции коллагенов I, III и V типов у взрослых млекопитающих. Коллаген II типа – специфический тип для хрящевой ткани. Особенности организации коллагенов IX и XI типов. Ассоциация коллагена II типа с IX и XI типами; значение для структурной организации хрящевого матрикса. Гетеротипические фибриллы, встречаемость и возможная роль. Смена типов коллагена в ходе нормального развития; смена типов - как отражение патологических процессов в ткани, на примерах развития атеросклеротического поражения сосудистой стенки, ранозаживления и регенерации ткани. Нефибриллярные коллагены: IX, XII и XIV типы – так называемые коллагены с прерывистой тройной спиралью; ассоциация этих типов с фибриллярными коллагенами. Особенности структуры коллагена IX типа, взаимодействие с коллагеном II типа; роль в формировании гиалинового хряща и стекловидного тела глаза. Особенности экспрессии XII и XIV типов в ходе эмбрионального развития человека; близость к структуре IX типа, особенности ассоциации с коллагенами I и III типов. IV, VIII и X типы коллагенов – способны образовывать структуры типа “сетей”. Структура VIII типа; роль несовершенных последовательностей в сетеобразовании. Десцеметова мембрана ретины глаза. Структура X типа. Паттерн экспрессии. Образование гексагональных решеток при эндохондральном окостенении; устойчивость к коллагеназам. Структура IV тип - молекулярного маркера базальных мембран. VI тип; особенности структуры; способность образовывать филаментоподобные структуры типа «четок»; RGD-последовательности; их возможная роль. Особенности экспрессии; изоформы VI типа коллагена в различных тканях. Возможная роль коллагена VI типа в организации ЭцМ. Изменение уровня экспрессии VI типа коллагена при фиброзных изменениях различной этиологии; остеохондрозах; при синдроме Дауна, при синдроме рыхлой кожи. Базальная мембрана Базальная мембрана – высокоспециализированный ЭцМ. Продукция базальных мембран эпителиями, мезенхимой и ее производными, эндотелием, скелетной, гладкой и сердечной мускулатурой. Роль базальных мембран в ходе эмбрионального развития и в поддержании структурной целостности и функциональных особенностей тканей в постнатальный период. Соотношение компонентов в составе базальных мембран; типоспецифичность базальных мембран. Базальная меммбрана – как адгезионная платформа для клетки; роль в движении клеток и их распластывании. Роль базальных мембран в ходе воспаления, ранозаживления, неоваскуляризации. Устойчивость базальных мембран к протеолитической деградации. Роль в предотвращении метастазирования. Просвечивающая и электронная микроскопия структуры базальных мембран. Особенности организации базальных мембран в различных тканях и органах. Два слоя базальных мембран с различной плотностью – Lamina lucida и Lamina densa. Роль базальных мембран в поддержании цитоархитектоники тканей и их функциональной гетерогенности. Самосборка базальной мембраны из «протомеров»; состав протомера – коллаген IV типа, ламинин, нидоген/энтактин, протеогликаны. Взаимодействие протомеров и два этапа возникновения супрамолекулярной архитектоники базальной. Коллаген IV типа. Особенность структурной организации молекулы - неотщепление NH2 и COOH-терминальных пропептидов. Чередование спирализованных и неспирализованных участков в молекуле - основа структурной “рыхлости” филаментов коллагена IV типа. Самосборка молекул коллагена IV типа, роль цистеиновых остатков COOH-концевых участков; NH2 –концевые домены определяют антипараллельный характер укладки молекул в ди-, три- и тетрамерные структуры, которые способны путем латеральных взаимодействий образовывать сетчатоподобные структуры. Сеть, образованная коллагеном IV типа, - структурная основа базальной мембраны. Доменная структура молекул коллагена IV типа , его способность взаимодействовать с ламинином, протеогликанами, нидогеном и клетками. Гены коллагена IV типа, локализация, особенности структуры и активации генов. Ламинин - высокоадгезионный гликопротеидный компонент базальных мембран. Присутствие (количественное) ламинина в различных типах базальных мембран определяет их структурные и функциональные особенности. Доменная организация ламинина. Характеристика каждой из трех полипептидных цепей молекулы ламинина: В1, В2 и А. Локализация и роль S-S-связей в образовании крестообразной структуры молекулы ламинина. Домены IV и VI типов - мелкие глобулярные домены, их роль. Домены III и V типов – прутикоподобные, их роль. I и II типы доменов COOH-концов цепей. спиральная структура, большой глобулярный домен А-цепи. Гликозилирование ламинина, сайты связывания с олигосахаридными цепями. Транскрипционный контроль продукции каждого типа цепей ламинина в клетке. Способность ламинина к олигомеризации, роль глобулярных доменов коротких плеч в этом процессе. Локализация сайтов связывания в молекуле ламинина с коллагеном IV типа. Роль нидогена в инициации связывания этих двух молекул. Изоформы ламинина in vivo. Отсутствие Ацепи в молекуле ламинина у Шванновских клеток и в матриксе ранних эмбрионов млекопитающих, а также при продукции базальных мембран нефрогенной мезенхимой в морфогенезе почек. Сайты связывания ламинина с клеткой, их локализация. Зависимость авидности связывания интегриновых рецепторов от структуры ламинина. Нидоген/энтактин – гликопротеин, образующий прочный комплекс с молекулой ламинина. Структура молекулы; доменная организация; локализация сайтов связывания с ламинином и клеткой. Соотношение ламинин-нидоген в базальной мембране. Сайты связывания нидогена с коллагеном III типа; возможный механизм. Инициация связывания молекул ламинина с коллагеном IV типа и нидогеном. Отсутствие сайтов связывания у молекулы нидогена с гепарином и протеогликанами. Протеогликаны и гликозаминогликаны базальной мембраны. Гепарансульфатпротеогликаны (ГСПГ) – доминирующий из протеогликанов компонент базальной мембраны. ГСПГ высокой и низкой плотности; их распространенность, соотношение и особенности связывания с ламинином, фибронектином и коллагеном IV типа. Структура кора низкоплотного ГСПГ. Биологические свойства гепарина и гепарансульфата, входящих в состав ГСПГ; их роль в связывании с молекулой ламинина. Гепарансульфат – уникальный накопитель в ЭцМ фибробластного фактора роста (FGF); роль FGF и базальных мембран в ангиогенезе; роль активного гепарина или гепариназы в высвобождении с последующей активацией FGF. Коллаген VII типа, структура, особенности доменной организации. Димеризация коллагена VII типа и сборка сети «заякоривающих фибрилл»; локализация сайтов связывания с коллагеном IV типа. Роль сети «заякоривающих фибрилл» во взаимодействии с коллагеном I типа и в дополнительном механическом укреплении базальной мембраны. Современная модель организации и сборки базальной мембраны (Yurchenco P. и Schittny J.C., 1995-1997). Фибронектин – важнейший класс адгезивных гликопротеинов ЭцМ. Распространенность фибронектина в царстве животных. Три формы фибронектина млекопитающих: растворимая, клеточноповерхностная и матриксная. Краткая история изучения фибронектина – результаты исследований Carl G. Gamberg и Sen-itiroh Hakomori, и происхождение названия “фибронектин”, открытие поверхностного фибронектина Erkki Ruoslahti и Antti Vaheri, и открытие Irwin I. Singer по взаимодействию матриксного фибронектина через специфичные рецепторы - интегрины на плазматической мембране клетки с актиновыми филаментами; открытие D.R.Critchly, M.A.England (Великобритания) и B.W.Mayer, E.D.Hay (США) на модели раннего развития цыпленка, что фибронектин играет ведущую роль в миграции клеток; J.P.Thiery (Франция) – доказательство того, что фибронектин не только «рельсы» для мигрирующих клеток нервного гребня, и что локальные изменения концентрации фибронектина играют роль субстрата позиционных сигналов мезенхимы для остановки мигрирующих клеток и начала формирования периферических ганглиев. Информационная роль матриксного фибронектина; влияние на форму, поведение и дифференцировку клеток; участие в направленной миграции клеток при ранозаживлении; роль в агрегации тромбоцитов и формировании кровяного сгустка. Структура димера фибронектина. Модель образования фибрилл матриксного фибронектина. Шесть глобулярных доменов, из которых построена субъединица; три типа коротких повторов, из различного сочетания которых построены домены. Функциональные различия трех типов повторов по способности связывания с различными лигандами. Многофункциональность молекулы фибронектина: первый домен отвечает за связь с гепарансульфатом и фибрином; второй – с коллагенами, III и IV домены – за взаимодействие с интегринами поверхности клеток, V домен – с гепарансульфатом, VI домен – с фибрином. Положение сайтов сплайсинга в молекуле фибронектина. Варианты альтернативного сплайсинга большой ядерной мРНК фибронектина – основной механизм возникновения многообразия форм фибронектина на примере плазменного и матриксного фибронектина, варианты возникновения фибронектина, отвечающего за взаимодействие с иммунными лимфоцитами. Особенности экзон-интронной организации гена фибронектона млекопитающих. Возможная роль различных вариантов фибронектина, продуцируемых разными типами клеток. Особенности взаимодействия фибронектина с фибриллярными коллагенами, ассоциированными с различными протеогликанами. Роль рецепторов фибронектина во взаимодействии клеток с различными по составу внеклеточными матриксами, продуцируемыми раличными типами клеток. Формирование сайтов фокальной адгезии и фокальных контактов клетки с внеклеточным матриксом; участие RGD-последовательности IV домена и роль III домена в этом процессе. Сравнение доменной организации двух важнейших адгезионных гликопротеинов – фибронектина и ламинина. Протеогликаны и гиалуроновая кислота Протеогликаны и гиалуроновая кислота– важнейшие компоненты ЭцМ. Распространение в царстве животных. Сравнение химического состава, размеров и молекулярных масс олигосахаридов, протеогликанов и гликопротеинов. Структура протеогликанов: белковый кор и гликозаминогликаны. Структура гликозаминогликанов; дисахаридные компоненты, образованные аминосахарами (D- глюкозамином и D-галактозамином); сульфатированность аминосахаров; второй компонент – уроновые кислоты (L-глюкуроновая и L-идуроновая). Три типа связи полисахаридов с полипептидной цепью (кором) протеогликанов. Роль шероховатой эндоплазматической сети и аппарата Гольджи в синтезе и процессинге протеогликанов. Роль нуклеотидсахаров в процессе элонгации полисахаридных цепей. Химические модификации полисахаридных цепей – включение сульфатных групп, эпимеризация. Структура семи типов гликозаминогликанов – хондроитин-6-сульфата, кератансульфата, хондроитин-4-сульфата, гепарансульфата, гепарина, двух форм дерматансульфата. Различия гликозаминогликанов по составу мономеров, гликозидным связям и числу сульфатных заместителей. Гликозаминогликаны – это полианионы; функциональные свойства гликозаминогликанов и их роль в создании высокоотрицательной по заряду среды в ЭцМ и поддержании равновесной среды в ЭцМ. Участие протеогликанов в создании в ЭЦМ гелей с различным размером пор и различной плотностью зарядов; роль как биологических фильтров. Гиалуроновая кислота; уникальность структуры; состав дисахарида: глюкуроновая кислота и N-ацетилглюкозамин. Возникновение конформации «рыхлого клубка»; положение отрицательно заряженных карбоксильных групп. Размеры молекулы. Химическая основа гидрофильности гиалуроновой кислоты; гиалуроновая кислота – обязательный компонент большинства изученных ЭцМ и основа создания гидратированного геля в матриксе. Механическая роль гиалуроновой кислоты в создании давления набухания (тургора), в соединительнотканном матриксе. Регулирующее влияние клеток и коллагена матрикса в регуляции тургора. Участие гиалуроновой кислоты в ингибировании межклеточной адгезии и в инициации миграции клеток на примере морфологичесикх изменений в склеротомах; контролирующая роль гиалуронидазы в этих процессах. Протеогликаны клеточной поверхности; особенности и типы заякоривания в плазматической мембране. Роль различных протеогликанов, представленных на поверхности клетки: механическая, регуляторная, «санитарная», метаболическая, информационная, рецепторная. Представленность на поверхности сходных типов клеток одного типа корового белка, связанного с определнным типом олигосахаридных цепей; исключения из этого правила. Различные типы клеток содержат различные по молекулярной массе и структуре коровые белки, связанные с различными по составу гликозаминогликанами; возможная роль таких различий. Эндоцитоз матриксных и связанных с плазматической мембраной протеогликанов; роль специфической по структуре группы протеогликанов, встроенных в плазматическую мембрану. Вовлеченность клеточно-поверхностных протеогликанов в межклеточные взаимодействия, влияние гепарансульфатпротеогликанов клеточной поверхности на конформационные изменения N-CAM. Самоассоциация гепарансульфатпротеогликанов; роль в кластеризации протеогликанов клеточной поверхности; значение этого явления для распластывания клеток, мигрирующих в очаг воспаления. Роль гепарансульфатпротеогликана в контроле клеточного роста; высокое сродство фибробластного фактора роста к этому типу протеогликанов; роль в морфогенезе капилляров. Особенности взаимодействия гепарансульфат- и хондроитин-4-сульфат-протеогликанов с липопротеинами плазмы крови. Роль хондроитин-4-сульфата в возникновении пенистых клеток из макрофагов сосудистой стенки в атерогенезе. Роль хондроитин-4-сульфата в оседании в матриксе рыхлой соединительной ткани гранулоцитов, лимфоцитов и NKклеток; взаимодействие хондроитин-4-сульфат-протеогликана клеточной поверхности с растворимыми коллагенами I и III типов и эластином матрикса. Протеоглаканы хрящевой ткани; структура и молекулярная организация; роль гиалуроновой кислоты; нековалентное присоединение хондроитинсульфат- и кератинсульфат-протеогликана; участие и роль линкерных белков. Молекулярная организация матрикса хрящевой ткани – основа ее уникальных свойств. Гепарин. Уникальность первичной структуры белкового кора гепарина. Химический состав олигосахаридных цепей; высокий отрицательный заряд гепарина. Особенности взаимодействия гепарина с факторами свертывания крови IX иXI. Антикоагулянтная активность гепарина; взаимодействие с 2 –гликопротеином плазмы крови, или антитромбином III; влияние образованного комплекса на активность тромбина. Роль взаимодействия гепарина с липопротеинлипазой на капиллярной стенке; роль в поддержании нормального кровотока в сосудах малого диаметра. Клеточная адгезия и ее типы Исследования J. Holfreter (1935-1955) и A. Moscona (1952) по диссоциации и агрегации клеток зародышей амфибий и птиц; гипотеза о существовании специфических клеточноповерхностных молекул адгезии, обуславливающих гомо- и гетеротипическое узнавание клеток и их роль в поддержании целостности клеточных пластов или тканей. Открытие двух типов (классов) молекул адгезии - мембранных рецепторов: (1) рецепторов, обуславливающих связь клетки с экстрацеллюлярным матриксом; (2) рецепторов, отвечающих за гомо- и гетеротипическое узнавание между клетками. Четыре основных семейства молекул адгезии: иммуноглобулиноподобное суперсемейство, семейство кадгеринов, суперсемейство интегринов и семейство селектинов. Иммуноглобулиноподобное суперсемейство Общая структурная организация трансмембранных белков этого суперсемейства. Сходство экстрацеллюлярного домена с С-доменом молекулы иммуноглобулинов. Однои двухсубъединичные рецепторы: из двух - субъединиц - семейство рецепторов Тклеток: CD3, CD4, CD8, MHC класс I, MHC класс II; из одной - субъединицы - семейство N-CAM, семейство ICAM-VCAM. Семейство N-CAM (от англ. neural cells adhesion molecule); представитель N-CAM прототип этого семейства. Исследования C. Edelmann и сотр (1972) - N-CAM вовлечен в межклеточную адгезию при росте и дифференцировке нервной ткани. Первичная структура N-CAM, клонирование гена N-CAM. Структура N-CAM. Изобилие изоформ NCAM у птиц и млекопитающих; ген N-CAM; "эмбриональные" и "взрослые" N-CAM. Разнообразие цитоплазматических участков N-CAM и особенности их взаимодействия с плазматической мембраной клетки; взаимодействие с кортикальными актиновыми филаментами. Различия в степени гликозилирования экстрацеллюлярных доменов NCAM; роль полисиаловых цепей в модификации адгезивных свойств N-CAM. N-CAM обуславливает кальций-независимую гомотипическую адгезию клеток; ведущая роль домен-домен взаимодействий внеклеточного участка молекулы, сходство с взаимодействием иммуноглобулинов. Роль гепарансульфатпротеогликанов во взаимодействиях N-CAM. Важнейшие функции N-CAM при формировании синапсов, в морфогенезе эктодермы и части производных мезодермы в развитиии нервной системы. Особенности экспрессии эмбриональных и взрослых N-CAM; эксперименты J.P.Thiery, доказывающие смену экспрессии типов N-CAM в эмбриогенезе цыпленка и участие фибронектина матрикса и N-CAM и Ng-CAM в формировании спинальных ганглиев. Другие представители семейства N-CAM. MAG (от англ. Myelin-associated glycoprotein); гомотипическая молекула адгезии; структура MAG, экспрессия MAG олигодендроцитами и ее связь с процессом миелинизации. Особенности взаимодействия MAG с элементами экстрацеллюлярного матрикса. Выявление аутоантител к MAG при некоторых видах периферических невропатий. Ng-CAM, или L1 (от англ. neuralglial cells adhesion molecule), участвует в гомотипическом узнавании нейрон-нейрон и гетеротипическом – нейрон-глия, а также в фасцикуляции нейронов. Особенности доменной структуры: наличие фибронектиновых повторов, присутствие RGD-последовательностей и иммуноглобулиновых повторов. Структура экстрацеллюлярного участка позволяет Ng-CAM участвовать в большом числе разноообразных процессов роста и дифференцировки нервной ткани. Семейство ICAM-VCAM Семейство включает ICAM-1,-2,-3 (от англ. intercellular adhesion molecule-1,-2,-3) и VCAM-1 (от англ. vascular cells adhesion molecule-1). Близость структуры ICAM-VCAM к молекуле N-CAM. Сравнение доменной организации экстрацеллюлярной части ICAM-1,-2,-3 и VCAM-1: разная степень гликозилирования; участие домена D1 во взаимодействии с лигандом (контррецептором); мутации, возникновение которых в экстрацеллюлярных участках ICAM приводит к отмене адгезивных свойств молекул. Варианты альтернативного сплайсинга мРНК VCAM-1. IL1, TNF- и INF- - индукторы экспрессии ICAM-VCAM. Особенности экспрессии ICAM1,-2,-3 и VCAM-1 фибробластами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками в нормальных тканях в пре- и постнатальном онтогенезе, а также при остром и хроническом воспалении и при иммунном ответе. Молекулы ICAM-VCAM участвуют в гетеротипическом узнавании; различные интегрины – это лиганды, или контррецепторы молекул ICAM-VCAM; особенности экспрессии интегринов клетками гематогенного происхождения. Различия в тканевой экспрессии ICAM-VCAM у млекопитающих обеспечивает согласованный ответ организма на воспаление и иммунный ответ. Суперсемейство кадгеринов Суперсемейство кадгеринов – это гомотипические молекулы адгезии, осуществляющие адгезию только в присутствии ионов Ca2+ . Два семейства этого суперсемейства: первое – кадгерины, второе – кадгерины десмосом. Семейство кадгеринов включает более 14 близкородственных молекул; наиболее изучены – E-, P-, и N-кадгерин; характеристика каждой из молекул адгезии; особенности экспрессии в пре- и постнатальном онтогенезе млекопитающих и птиц. Эксперименты Edelmann (1987), Jacob (1988), Takeihi (1987), показавшие ведущую роль кадгеринов в морфогенезе эпителиев зародыша человека и млекопитающих. Доменная организация трансмемдранного кадгеринового рецептора. Степень гомологии внеклеточного участка E-, P-, и N-кадгеринов. Димеризация кадгериновых рецепторов. Модель “одежной молнии”, объясняющая структуру межклеточных контактов при участии кадгериновых рецепторов. Полная гомология цитоплазматических участков; ассоциация этих участков с актиновым цитоскелетом через специальную группу белков – катенины. , и катенины; структура, особенности экспрессии; роль каждого из катенинов в образовании ассоциата цитоплазматического участка кадгеринового рецептора с актиновыми филаментами. Влияние эпидермального фактора роста (EGF) на фосфорилирование катенина через активацию c-src, c-yes; катенин (плакоглобин) – обязательный компонент структурных белков десмосом; взаимодействие плакоглобина с цитокератиновыми филаментами. Современные представления о роли каждого из катенинов в образовании специализированных контактов между эпителиальными клетками: апикального опоясывающего комплекса (zonula adherens и zonula occludens), латеральных контактов и настоящих десмосом (zona macula adherens). Отвечают ли комплексы кадгерин/катенины за развитие полярности эпителиальной клетки? Представление о кадгеринах как о поверхностных рецепторах, вовлеченных в передачу сигнала в клетку. Роль так называемого «X-белка» (предположительно одного из членов семейства кадгерин/катенины – X-белок – актиновые филаменты. АРС-белков) в комплексе Второе семейство – рецепторы адгезии в десмосомах – десмоглеины и десмоколлины; наличие изоформ у обоих белков; паттерны экспрессии изоформ; взаимодействие десмосомных кадгеринов с катенином (плакоглобином) или десмоплакином. Фенотипические проявления некоторых генетически-наследуемых аутоиммунных заболеваний, связанных с мутациями генов десмоглеинов и нарушением структуры десмосом. Ведущая роль кадгеринов/катенинов в сохранении целостности и поддержании полярности различных типов эпителиев в постнатальном онтогенезе. Кадгерины и рак. Суперсемейство интегринов Интегрины – поверхностные гликопротеины клетки, являющиеся рецепторами белков экстрацеллюлярного матрикса, или же выступающие как контррецепторы при взаимодействии с другими клетками. Интегрины - важнейший структурно-регуляторный компонент в инициации сборки фокальных контактов и фокальной адгезии. Роль интегринов в заякоривании клеток на внеклеточном матриксе; их значение для миграции и распластывании клеток на субстрате; роль в передаче информации от матрикса в клетку, влияние на рост, пролиферацию и дифференцировку клетки. Интегрины – непосредственные участники важнейших биологических процессов –иммунных, воспаления и посттравматического восстановления тканей, тромбообразования, поддержания гомеостатического состояния тканей; участие в процессах онкогенеза. Структура интегринового рецептора; особенности доменной организации - и субъединиц; особенности экстрацеллюлярного, трансмембранного и цитоплазматического участков рецептора. Нековалентное взаимодействие - и -субъединиц рецептора; положение лиганд-связывающего сайта; роль цистеиновых остатков в -субъединице; остатки тирозина как потенциальные сайты фосфорилирования у некоторых субъединиц; Ca2+- и Mg2+-связывающие сайты -субъединиц и роль ионов Ca2+ во взаимодействии с лигандом. Разнообразие -субъединиц (16) и -субъединиц (8 и более). 20 и более различных типов интегринов млекопитающих. Деление суперсемейства на семейства -1, -2, -3, -4, -5, -6 и -7 интегринов. Взаимодействие интегринового рецептора через -субъединицу с актиновым цитоскелетом; участие актин-связывающих белков – талина, винкулина и др., а также некоторых тирозинпротеинкиназ во взаимодействии интегриновых рецепторов с цитоскелетом клетки. Роль RGDпоследовательности, представленной в важнейших адгезионных белках матрикса – фибронектине, ламинине, коллагенах, витронектине и некоторых других, в распознавании лиганда -субъединицей рецептора. Модель т.наз. «-пропеллера», образуемого лигандсвязывающим участком. Активация интегринового рецептора; роль процессов ди- и олигомеризации рецепторов; конформационные изменения рецептора, вызванные активацией; интегриновый сигнал в клетку; возможные участники начальных этапов передачи сигнала – FAK-киназа, MAP-киназы, c-src-киназа, рр60-киназа, малые ГТФфзы семейства rho. Влияние интегринового сигнала на перестройку актинового цитоскелета кортекса и цитоплазмы и инициацию сборки сайтов адгезии. Аффинность интегриновых рецепторов. Моно- и полиспецифичность интегриновых рецепторов в распознавании и связывании с лигандом или лигандами ЭцМ. Многообразие типов интегриновых рецепторов, представленных на поверхности клетки; ансамбли интегринов как отражение стерени дифференцированности клеток; различия в аффинности связывания; взаимодействие с различными изоформами лигандов; возможная биологическая роль. Интегрины – как контррецепторы (лиганды) молекул адгезии ICAM-VCAM при гетеротипическом взаимодействии клетка-клетка. Регуляция экспрессии интегриновых молекул в пре- и постнатальном онтогенезе. Характеристика семейств 1-, 2-, 3-, 4интегринов и их роль в биологических процессах. Суперсемейство селектинов Семейство высокогликозилированных адгезионных белков клеточной поверхности, впервые идентифицированных на лимфоцитах, эндотелиальных клетках и активированных тромбоцитах: L-селектин (хоминг-рецептор), E-селектин (ELAM), Pселектин (GMP-140, или PADGEM). Структура доменов трех типов селектинов: присутствие на NH2-конце молекул лектинового домена и следующих за ним различного числа аминокислотных последовательностей, характерных для комплемент-связывающих белов; трансмембранный и цитоплазматический участки; роль каждого из участков в молекуле селектина в осуществлении ее функций. Структура лиганда – сиалил-Lewisx (CD15S) – общего для всех селектинов; экспрессия этого антигена на гранулоцитах, моноцитах и некоторых миелоидных лейкемических клетках. Селектины-типичные представители молекул адгезии, участвующие в гетеротипическом узнавании между некоторыми типами клеток крови и эндотелием; уникальная роль селектинов в адгезии клеток крови на эндотелий, осуществляемая в потоке крови; вовлеченность Е- и Рселектинов эндотелия в этапы адгезии лейкоцитов на эндотелий и их проникновение в очаг воспаления; Е-селектины и т. наз.. “rolling” лейкоцитов по поверхности эндотелия; Рселектины и их роль в более прочном связывании лейкоцитов с эндотелием; роль медиаторов воспаления в усилении экспрессии Р-селектина на эндотелии; активация адгезированного нейтрофила хемотактическими агентами. Усиление экспрессии интегриновых рецепторов 1, 2 и 7 семейств на активированных нейтрофилах и их контррецепторов на эндотелии - ICAM-1, -2, -3, VCAM-1. Механизм миграции нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов в очаг воспаления. Высокая эволюционная специализация селектинов. Примеры других возможных функций селектинов. Факторы роста клеток, или цитокины. Обмен информацией клеток многоклеточного организма друг с другом необходим для регуляции своего развития, организации в ткани, контроля процессов роста и деления, а также для координации функций. Три способа взаимодействия клеток животных осуществляются: (1) путем выделения клетками химических веществ (сигнальных молекул), действующих на некотором расстоянии или в непосредственной близи от секретирующей клетки; (2) при непосредственном физическом контакте клеток за счет сигнальных молекул, связанных с плазматическими мембранами; (3) через щелевые межклеточные контакты. Три формы сигнализации с помощью секретирующих молекул: эндокринная, паракринная и синаптическая. Запрограммированность ответа каждой клетки на специфическую комбинацию сигнальных молекул. Селективность ответа клетки на внешние сигналы является продуктом их дифференцировки. Специализированные белки, называемые рецепторы, связывающие определенную внеклеточную сигнальную молекулу, инициируют ответ клетки. Три класса поверхностных рецепторов: рецепторы, образующие ионные каналы, рецепторы, сопряженные с G-белками и каталитические рецепторы. Характеристика механизмов каждого из трех классов этих рецепторов. Важнейшие внутриклеточные посредники или внутриклеточные медиаторы – циклический AMP (cAMP) и Ca2+. Действие внутриклеточных посредников на поведение белков-мишеней в клетке. Разнообразие белков-мишеней. Сравнение различных путей генерирования сигналов с образованием вторичных посредников во всех типах животных клеток при взаимодействии их рецепторов с лигандами; лиганды, влияющие на изменение внутриклеточного содержания c-AMP, сопряжение рецепторов с аденилатциклазой через Gs –белок; путь, наиболее распространенный у эукариот, – сопряжение активированного рецептора через инозитолфосфат с высвобождением Ca2+ из внутриклеточных хранилищ; роль фосфоинозитидов в передаче сигнала; роль активированного рецептора в активации фосфоинозитид-специфической фосфолипазы С; роль этого фермента в образовании из фосфотидилинозитолбифосфата (PIP2 ) двух важнейших продуктов – инозитолтрифосфата (InsP3 или IP3) и диацилглицерола. Роль InsP3 в повышении внутриклеточного содержания ионов Ca2+; диацилглицерол -активатор протеинкиназы С (С-киназа); зависимость активности С-киназы от Ca2+ . Каскад фосфорилирований ряда регуляторных (протеинкиназы) и структурных белков с различными функциями в клетке-мишени. Участие активированной С-киназы в усилении транскрипции определенных генов; предполагаемый механизм участия. Полипептидные факторы роста, их роль в прямом или опосредованном действии на скорость роста, пролиферацию или дифференцировку эукариотических клеток. Следствие тканевого разнообразия многоклеточных - появление большого разнообразия факторов роста, обеспечивающих коммуникативные взаимодействия как в однородных клеточных популяциях, так и в межтканевых взаимодействиях, что обеспечивает скоординированность процессов роста и пролиферации клеток в ходе формирования тканей и органов; поддержание их стабильности; интегративный контроль работы физиологических систем. Молекулярная природа биологической активности факторов роста. Отличие полипепетидных факторов роста от классических гормонов. Типы факторов роста. Индукция и продукция клеткой фактора(ов) роста. Паракринный и аутокринный механизм действия факторов роста. Относительность деления факторов роста на факторы компетенции и прогрессии. Связывание фактора роста с поверхностными рецепторами клетки. Рецепторы факторов роста относятся к типу каталитических поверхностноклеточных рецепторов. Пять классов каталитических белков-рецепторов; большинство из них относится к классу гликопротеинов с тирозин-специфической протеинкиназной активностью, однократно пронизывающих мембрану. Структура этого типа рецепторов; особенности структурной организации внеклеточного и цитоплазматического (киназного) доменов. Активация этого типа рецепторов – связь димеризации и аутофосфорилирования тирозиновых остатков в цитоплазматическом домене рецептора. Роль лигандов в разнообразии механизмов димеризации рецепторов различных факторов роста. Активированные каталитические рецепторы связываются в различных комбинациях с сигнальными белками в клетках-мишенях, что обеспечивает различия в клеточном ответе на действие одного и того же лиганда. Роль SH2- и SH3-доменов сигнальных цитозольных белков во взаимодействии с киназным доменом рецептора. Структура SH2- и SH3доменов. Разнообразие типов сигнальных белков. Короткий путь передачи сигнала при взаимодействии лиганда с рецептором приводит к активации протеинкиназы С. Примеры того, как активация в клетке-мишени сигнальных белков - фосфолипазы С и протеинкиназы А в сопряжении с протеинкиназой С приводит к быстрому и мощному ответу клетки на действие сигнальной молекулы. Роль факторов роста в регуляции клеточного цикла; участие факторов роста компетенции и прогрессии в выходе клетки из состояния покоя и переходу к фазе G1 клеточного цикла; роль факторов роста в поддержинии фазы G1. Фактор роста тромбоцитов (ТФР, или PDGF) Тромбоциты и клетки мезенхимного происхождения – место синтеза, накопления и секреции PDGF. Особенности первичной структуры мономеров цепей PDGF. Три изоформы PDGF человека и млекопитающих - AA, BB, AB. Локализация генов А и В цепей в хромосомах человека, особенности экспрессии этих генов. Протоонкоген c-sis и онкоген v-sis кодируют В-цепь; особенности их экспрессии в нормальных и раковых клетках. Клетки соединительной ткани и крови, способные к синтезу и секреции PDGF, создают условия его локального накопления в тканях и плазме крови. Рецептор PDGF относится к суперсемейству иммуноглобулиноподобных рецепторов факторов роста. Структура рецептора PDGF; особенности организации внеклеточного домена, цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена. и типы рецепторов PDGF; степень их гомологии и особенности структуры; особенностив связывании PDGF-АА и PDGF-ВВ; лигандная специфичность - и -типов рецепторов. Особенности экспрессии - и -типов рецепторов PDGF нормальными и раковыми клетками. Димеризация рецепторов PDGF, их активация. Активация сигнальных белков – PI3-киназы; белка, активирующего ГТФ-азу, и фосфолипазы С-, содержащих SH2- и SH3-домены. Активация протеинкиназы С с последующей активацией ядерного фактора каппа В (NFkB), активация гена IFN/ при участии NF-kB, аутокринная регуляция поддержания клеткой дифференцированного состояния IFN/. Примеры механизмов действия PDGF как типичного фактора компетенции, способного удерживать клетки в дифференцированном состоянии. Приобретение клетками компетентности к воздействию факторов прогрессии (т.е. переходу из G0- в G1-фазу клеточного цикла) зависит от концентрации PDGF и продолжительности его действия. Примеры, когда PDGF выступает как митоген клеток мезенхимного происхождения в условиях хронического воспаления, посттравматической регенерации соединительной ткани. PDGF и модификация внеклеточного матрикса. PDGF как стимулятор хемотактической активности клеток. Влияние PDGF на поведение гладкомышечных клеток в нормальной и атеросклеротически измененной сосудистой стенке. Роль PDGF в эмбриональном развитии. PDGF и трансформация клеток. Современная модель ауто- и паракринного влияния PDGF на пролиферативное поведение клетки. Семейство эпидермального фактора роста (ЭФР, или EGF) Представители семейства: EGF, трансформирующий фактор роста альфа (TGF-) и некоторые джругие. EGF – типичный представитель этого семейства. Работы S. Cohen (1960-1975гг.) по выделению и изучению биологического действия EGF. Структура нативной формы EGF. Структура внутриклеточного предшественника EGF. Структура гена EGF и особенности его тканевой экспроссии. Трансформирующий фактор роста альфа - TGF- – эмбриональная форма EGF (G. Todaro ,1978). Секреция TGF- карциномными и эмбриональными клетками. Рецептор EGF – трансмембранный гликопротеид; особенности организации внеклеточного домена; цитоплазматический домен – типичная тирозинпротеинкиназа. Протоонкоген c-erbB кодирует рецептор EGF, а онкобелок v-erbB – это «усеченный» вариант рецептора EGF. Особенности экспрессии генов c-erbB и v-erbB. Лигандная специфичность рецепторов EGF. Особенности димеризации рецептора EGF. EGF – яркий представитель факторов прогрессии. Представление о механизмах внутриклеточной передачи сигнала после взаимодействия EGF с рецептором. Примеры митогенного влияния EGF на различные типы клеток; EGF стимулирует переход клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла. Роль EGF в ингибировании синтеза коллагена I в костной ткани. Влияние EGF на экспрессию ядерных протоонкогенов c-fos и c-myc; значение для процессов дифференцировки. Раковые клетки не синтезируют EGF, но экспрессируют либо нормальный, либо “усеченный” рецепторы EGF; TGF- является их лигандом. Секреция проEGF эндокринными железами желудочно-кишечного тракта. Гомеостатическая роль EGF в поддержании целостности эпителиальной выстилки желудочно-кишечного тракта. Механизм действия EGF в поддержании целостности кишечного эпителия и поддержании полярности и целостности эпителия дистальных отделов почечных канальцев. Семейство фибробластного фактора роста (ФФР, или FGF) Девять представителей семейства FGF. Исследования D. Gospodarowicz по выделению и изучению структуры кислого и основного FGF. Современая номенклатура представителей семейства FGF. Структура FGF-1 (aFGF) и FGF-2 (bFGF); отсутствие сигнальных последовательностей у FGF-1, -2 и –9, в отличие от FGF-3 – FGF-8. Проблемы понимания механизма секреции FGF-1 и FGF-2. FGF-1 и FGF-2 секретируют эмбриональные и взрослые клетки; FGF-3-8 – эмбриональные, трансформированные и раковые клетки. Локализация генов FGF1-9 в геноме человека; особенности их экспрессии. Множественность изоформ представителей семейства FGF; разнообразие способов возникновения изоформ. Интернализация экзогенного FGF-1 и FGF-2 клеткой. Обнаружение стабильных фрагментов FGF-1 и –2 в ядре; возможная их роль в ядре. Особенности связывания FGF с рецепторами. «Высокоаффинные» сигнальные рецепторы с тирозинпротеинкиназной активностью и «низкоаффинные» рецепторы – различные по структуре трансмембранные гепарансульфатпротеогликаны. Структура четырех типов «высокоаффинных» рецепторов, наличие изоформ у каждого из типов; значение каждой из иммуноглобулиноподобных петель экстрацеллюлярного домена и межпетлевых участков в «высокоаффинном»связывании лиганда с рецептором; роль степени гликозилирования для функциональной активности связывания рецептора с лигандом. Структура цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена. Лигандная специфичность сигнальных рецепторов FGF-1-4; представленность определенных сочетаний типов рецепторов на различных типах клеток; современные представления и гипотезы, объясняющие биологическую роль столь большого разнообразия изоформ лигандов и рецепторов. Структура «низкоаффинного» рецептора FGF, относящегося к семейству синдеканов трансмембранных гепарансульфатпротеогликанов (ГсПГ); роль корового белка в секреции и закреплении этого типа рецептора в плазматической мембране. Шесть сайтов связывания с гепарансульфатными цепями; роль связывания цитоплазматического домена с кортикальным актином. Роль ГсПГ-рецептора в депонировании FGF, защите от протеолитической деградации; участие ГсПг-рецептора в индукции ди- и олигодимеризации «высокоаффинных» рецепторов. Модель, предложенная Schlessinger, (1996) для объяснения функций «низкоаффинного» рецептора, как презентирующего лиганд «высокоаффинному» рецептору. Активация сигнального рецептора. Важнейшая активируемая сигнальная молекула в клетке – PLC-; ее активация обуславливает множество функции FGFs – в эмбриональной индукции, дифференцировке, хемотаксисе, но не в индукции пролиферации. В стимуляции пролиферации (под действием FGF-2) главным участником является активированная протеинкиназа С. Ее участие в активации генов быстрого, или первичного, ответа (переход из G0 в G1 фазу). Экспрессия второй группы - генов медленного ответа, непосредственно связанная с работой первой группы, приходится на середину – конец G1 фазы и обеспечивает переход к S –фазе – это гены определенных типов циклинов, негистоновых хромосомных белков, синдекана и некоторых других. Особенности влияния FGF на культивируемые клетки. Роль FGF-1 и-2 в ангиогенезе опухолей (J.Folkmann). Роль FGF-2 в миграции и пролиферации эндотелия и гладкомышечных клеток при нарушении целостности сосудистой стенки. Значение FGF-2 в развитии рестенозов сосудистых трансплантатов и протезов; возможные методы и подходы для борьбы с рестенозами. FGF-1 и –2 – как обязательные участники острых и хронических воспалений и посттравмвтического восстановления тканей. Суперсемейство трансформирующего фактора роста бета (ТФРбета, или TGF s) Девятнадцать представителей суперсемейства TGF включает четыре близких семейства: TGF, Vg/DPP/BMP (вегетализирующий фактор роста, определяющий дорзовентральную ось/фактор морфогенеза кости), Inhibin/Activin (ингибин/активин – факторы контроля дифференцировки и индукции мезодермы), MIS (фактор регрессии мюллерова протока). Эволюционная консервативность представителей суперсемейства TGFs. Краткая характеристика биологического действия представителей каждого семейства, многообразие изоформ. TGF - характерный представитель суперсемейства. Структура молекулы TGF, особенности синтеза и секреции. Латентный предшественник TGF. Образование гомо- и гетеродимеров. Особенности депонирования предшественника в экстроцеллюлярном матриксе, поступление и транспорт в плазме крови; молкулы, участвующие в его депонировании и транспорте. Представления об ограниченном протеолизе предшественника. Шесть типов рецепторов TGF. Ser/Thr-протеинкиназа – сигнальный тип рецептора TGF, представленность на различных типах клеток у млекопитающих. Краткая характеристика молекулярной организации основных четырех типов сигнальных рецепторов: Daf-1, TGF-II-R, Act-IIB-R, Act-II-R; структура и гомология киназных доменов; изоформы этого типа рецепторов; спорные вопросы о роли различных участков экстрацеллюлярного домена. Лиганд-препрезентирующий тип рецепторов - бетагликан III типа, а также эндоглин. Структура презентирующих рецепторов, их молекулярное разнообразие. Образование рецепторных комплексов между двумя типами рецепторов, необходимое для связывания лиганда с сигнальным рецептором. Современные представления о механизмах презентации лиганда и связывания с сигнальным рецептором. Экспериментальные данные о механизмах передачи сигнала сигнальным рецептором; возможные кандидаты в субстратные белки, их многообразие; роль эффекторных цитоплазматических молекул - SMAD в передаче информации в ядро; структура SMAD, их разнообразие; трудности интерпретации результатов. TGFs – как типичные факторы компетенции; сочетание пара- и аутокринных путей регуляции, современные представления. Бифункциональность биологического действия TGF - с одной стороны, временные ингибиторы пролиферации эпителиальных клеток и клеток мезодермального и мезенхимного происхождения, выступающие как мощные факторы дифференцировки и индукторы синтеза компонентов внеклеточного матрикса, а с другой – в сочетании с работой других факторов – как активатора пролиферации, что обеспечивает выход клеток из состояния покоя и переходу в активный клеточный цикл. Различие биологического действия TGF in vitro и in vivo. Современные представления о молекулярных механизмах действия TGF как ингибитора пролиферации. Роль TGF в ингибировании роста и пролиферации раковых клеток эпителиального происхождения, представление о механизме такого ингибирующего действия. Роль представителей семейства TGF в хемотаксисе, в перестройке костной ткани. Роль TGFs в дифференцировке IL-2-зависимых Т-лимфоцитов, влияние на поведение макрофагов – роль TGFs в реализации воспалительных реакций. Представители суперсемейства TGF - важнейшие регуляторы индукции мезодермы; регуляторы дифференцировки. Роль в определении паттерна симметрии зародышей позвоночных и морфогенеза зародышевых тканей. Возможные последствия нарушения таких механизмом и развитие позвоночных животных. Семейство фактора некроза опухолей альфа (ФНОальфа, или TNF) Краткая историческая справка о биологических эффектах, наблюдаемых у экспериментальных животных и человека при действии TNF. Природа эндотоксина и лимфотоксина; TNF - это кахектин; TNF - лимфотоксин, сравнительный анализ их первичной структуры. Секретируемая и трансмембранная формы TNF, особенности секреции. Роль карбонильного и аминоконцевого участков в молекуле TNF для ее биологического действия; генноинженерные экспериментальные данные по этому вопросу. Различия в биологических эффектах трансмембранной и секретируемой форм TNF. Особенности локализации и структуры гена TNF. Индукторы экспрессии гена TNF. Главный источник TNF у млекопитающих – макрофаги, другие типы нормальных и раковых клеток, которые являются продуцентами TNF. Роль IFN- и M-CSF в продукции TNF макрофагами; другие молекулы-мишени для этих индукторов; роль активации транскрипционных факторов NF-kB и AP-1 в активации гена TNF. Два типа рецепторов TNF; особенности их экспрессии на различных типах клеток у млекопитающих. Структура рецепторов TNF гомология с другими представителями суперсемейства рецепторов TNF-R. Особенности первичной структуры цитоплазматических доменов p80 TNF-R и p60 TNF-R, роль в различиях биологических эффектов, вызванных взаимодействием лиганда с определенным типом рецептора. Структура генов рецепторов TNF и особенности регуляции их экспрессии, роль интерферонов. Слабая перекрываемость сигнальных каскадов, вызванных взаимодействием мембранносвязанной и растворимой формами лиганда с каждым из типов рецепторов у нормальных и раковых клеток. TNF - типичный представитель факторов компетенции; TNF - как трофический фактор. Плейотропный эффект действия TNF на нормальную клетку. Роль различных Ser/Thr-протеинкиназ и MBP-киназ в реализации передачи сигнала у разных типов клеток. Роль продуктов активации определенных факторов транскрипции (каскад активаций) в усилении транскрипционной активности клетки. Ассоциация цитоплазматического домена TNF-R с казеинкиназой 1 и некоторыми подмембранными Ser/Thr-протеинкиназами, а также с кислой и нейтральной сфингомиелинидазой. Каскад активаций сфингомиелинидаз и последующая активация церамид-активируемой протеинкиназы, протеинкиназы Сzeta и протеинфосфатаз, активации NF-kB и усиление экспрессии c-myc и c-jun. Продукция клеткой церамида и механизм ингибирования ее роста, вызванная действием TNF. Возможные механизмы активации клеточной пролиферации при действии TNF. “Домен смерти” в составе цитоплазматического домена двух типов рецепторов TNF и его роль. Возможный молекулярный механизм участия TNF в супрессии генов, вовлеченных в рост раковых клеток; ингибирование гена Rb, усиление экспрессии генов р53 и TNF. Биологические эффекты TNF: TNF как аутокринный фактор дифференцировки макрофагов и гранулоцитов и активации макрофагов в усилении продукции иммунорегуляторов и медиаторов воспаления. Роль TNF в активации гранулоцитов при остром воспалении; ее молекулярный механизм. Роль TNF в кахексии, анорексии и ожирении. Использование TNF для клинических целей – современное состояние вопроса. Протоонкогены и онкогены Определение терминов “протоонкоген” и “онкоген”. Основные процессы в жизни клетки куда вовлечены продукты протоонкогенов –регуляция контроля нормального роста и пролиферации, течения клеточного цикла, а также дифференцировки. Мутации и другие нарушения в структуре или работе протоонкогенов – главные причины появления признаков онкотрансформации клетки. Экспериментальные данные, позволяющие разделить онкогены на несколько групп: иммортализующие клетку, снижающие потребность клетки к экзогенным факторам роста; изменяющие характер взаимодействия клетки с субстратом, влияющие прямо или опосредованно на контроль пролиферации. Трансгенные мыши – прекрасная модель для изучения роли онкогенов в онкогенезе. Модели, используемые в экспериментах in vitro для идентификации новых онкогенов. Открытие онкогенов; вирусные онкогены. Структура генома ретровирусов; особенности интеграции вирусного генома в геном клетки-хозяина. Деление ретровирусов на два класса. Современные представления об активации онкогенов через ретровирусную трансдукцию; активация онкогенов путем инсерции вируса. Выявление онкогенов в раковых клетках человека. Хромосомные транслокации (характерные примеры) и места выявления онкогенов в раковых клетках; использование различных технологий по трансфекции ДНК, выделенных из трансформированных или раковых клеток в слаботрансформированные клетки линии NIH 3T3; химический канцерогенез и выявление онкогенов. Примеры химерных генов, механизмы их возникновения. Амплификация протоонкогенов и онкогенез; их выявление и прогностическое значение при диагностике и лечении некоторых типов рака человека. Эволюционная консервативность протоонкогенов и их продуктов у эукариот. Группы вирусных онкогенов и их продуктов гомологичные таковым протоонкогенам: факторов роста; рецепторов, лишенных протеинкиназной активности; тирозинпротеинкиназ, интегрированных в плазматическую мембрану, т.е. рецепторов факторов роста; цитоплазматических и подмембранных тирозинпротеинкиназ; семейство мембранносвязанных G-белков; семейство белков GFF (guanine nucleotide exchange proteins); цитоплазматических Ser/Thr-протеинкиназ; семейство ядерных белков. Краткая характеристика молекулярных и фенотипических изменений в клетке, происходящих вследствие гиперактивации или гиперпродукции продуктов тех онкогенов, которые гомологичны основным группам протоонкогенов: факторам роста, на примере vsis; рецеторам факторов роста с тирозинпротеинкиназным (ТПК) доменом на примерах verbB, v-fms, met, trk, ras, v-kit, bck; рецепторам факторов роста без ТПК домена, на примере mas нерецепторных ТПК – на примере v-scr, v-fes, v-fos, v-yes и lck; белков с активностью ГТФаз –ras-онкогенов;нарушение основных молекулярных механизмов, наблюдаемых при передаче сигнала в клетке с участием ras p21; ядерных онкобелков, участвующих в контроле экспрессии важнейших групп генов регулирующих клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку и адгезию. Структура протоонкогенов и протоонкобелков fos, jun, myc; гомо- и гетеродимерные белки; «лейциновые застежки» и “basic domain’ы”, их роль во взаимодействии протоонкобелков с соответствующими участками геномной ДНК. Особенности изменений структуры онкогенов v-fos, v-jun и других и влияние таких мутаций на их экспрессию и поведение у онкотрансформированных клеток in vitro и in vivo. Онкогены и онкобелки – как диагностические и прогностические маркеры различных типов рака у человека; их значение для ранней дианостики рака и химиотерапии. Клеточный цикл Определение “клеточный цикл”, “митотический (пролиферативный) цикл”. Создание метода авторадиографии, разделение интерфазы на G1-, S- и G2-периоды. М-период. Параметры клеточного цикла - по модели цикла, разработанной Pardee A. и соавт. (1975, 1978). Относительная стабильность и варьирование продолжительности периодов (фаз) клеточного цикла клеток млекопитающих. Примеры, когда не выявляются G1, G2+G2, S+G1+G2. Эксперименты, показывающие, что самостоятельность механизма контроля определенной фазы цикла относительна и является составной частью общего механизма контроля цикла, жестко контролирующего нормальную последовательность прохождения фаз клеточного цикла. Регуляция интенсивности клеточной пролиферации зависит от G1и G2-фазы. Рост и дифференцировка клеток связаны с изменением интенсивности их пролиферации. Разделение тканей млекопитающих на три группы (по Leblond C.P., 1964,1982) в зависимости от темпа их пролиферации: неразмножающиеся (static) популяции; популяции с очень низким темпом пролиферации (expanding); обновляющиеся (renewing) популяции. Общая характеристика обновляющихся тканей, определение понятий «стволовые клетки» (stem cells), “коммитированные клетки”, “клеткипредшественники”, “зрелые клетки” – сходства и различия. Понятия “пролиферативный пул”, “пролиферативный потенциал”, “лаг-период клеточного цикла”, “ пролиферативный период”. Наблюдения и эксперименты, свидетельствующие о периоде покоя (G0, или R) в клеточных системах многоклеточных. Выход клеток в покой по завершении М-фазы, либо - S-фазы; сходство и различия клеток вышедших в покой и составляющих т.наз. R1- и R2популяции; примерв таких популяций. Понятие «углубление в покой»; эксперименты, показывающие, что клетки по разному углублены в покой. Выход клеток из состояния покоя; экспериментальные модели in vitro и in vivo; современные представления о механизмах выхода клеток из покоя; роль факторов роста. Разнообразие механизмов умножения генома в митотическом цикле, примеры таких клеточных популяций у человека и млекопитающих. Современная модель клеточного цикла эукариот; понятие “точек перехода” (рестрикции, R) в G1- и G2-фазе; теоретические предпосылки и экспериментальные модели поиска молекул-регуляторов, координирующих вступление и прохождение каждой из фаз клеточного цикла; общие теоретические представления о механизме контроля клеточного цикла эукариот. Механизм молекулярного контроля клеточного цикла Краткий анализ результатов исследований по генетическому контролю клеточного цикла дрожжей и поиску молекул, контролирующих прохождение клеточного цикла в овогенезе и раннем развитии амфибий. Консервативность механизмов контроля клеточного цикла эукариот. Работа L. Hartwell и P. Nurse (1990-1991) на дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe – открытие гомологичных генов (cdc2 и CDC28) и их продуктов, участвующих в реализации программы контроля прохождения клеткой фаз клеточного цикла у этих двух видов с различным ядерным (жизненным) циклом. Предложенная этими авторами фундаментальная идея клеточной биологии об организации молекулярного контроля клеточного цикла. Точки “Start” в клеточном цикле у S.cerevisiae и S.pombe и “Checkpoint control”. Совпадение точки “Start” и точки перехода (R) в клетках дрожжей и млекопитающих.Открытие фактора промотирующего переход к М-фазе (MPF) в овогенезе и раннем развитии амфибий (Masul H.,et al., 1971). Очистка MPF и изучение его димерной структуры; в состав MPF входит циклин-зависимая киназа (cdk) - каталитическая субъединица, и активирующая киназу субъединицу – циклин; cdks – Ser/Thr-потеинкиназы; циклины – уникальная группа белков, контролирующая способность cdk, связываться и фосфорилировать определенные белкимишени.Особенности экспрессии этих субъединиц в ходе клеточного цикла. Основа контрольного механизма клеточного цикла – периодическое объединение, активация и распад коемплексов циклин-cdk. Парадигма Murray A. (1989) о контроле клеточного цикла у эукариот как цикле cdk1 (в частности p34cdc2 дрожжей), активация соответствующей киназной субъединицы необходима как для прохождения определенной фазы цикла, так и для осуществления точек перехода из G1- в S-фазу и из G2- в М-фазу. У дрожжей S.cerevisiae и S.pombe киназная субъединица р34 – CDC28 и cdc2 – единственный и главный «контролер» в клеточном цикле. Уникальность сочетаний паттерна экспрессии и активаций cdks , характерных для каждой фазы клеточного цикла у млекопитающих. Семейство циклинов; первичная структура циклинов D, E, B, A, H, “cyclin box” и роль “destruction box” в молекуле циклина. Конформационные изменения молекул циклина и cdk в ходе их взаимодействия с (образование MPF). Разнообразие циклинов млекопитающих и дрожжей; особенности паттерна их экспрессии в зависимости от фазы клеточного цикла. Молекулярная модель активации cdk; G1-, S-, G2-циклины и их партнеры – соответствующие cdk в клеточном цикле млекопитающих. Регуляция циклинзависимой протеинкиназы осуществляется путем ее фосфорилирования и дефосфорилирования; участники этих процессов. Гены, участвующие в контроле клеточного цикла гаплоидных дрожжей S.pombe: cdc2 (Ser/Thr-протеинкиназа, p34cdc2), cdc13 (циклин М-киназы, р60), cdc25 (специфическая фосфатаза), suc1 (p13), wec1 (Ser/Thr-протеинкиназа), nim1 (протеинкиназа, негативный регулятор wec1), Mo15 (активирующая киназа), cdc10; особенности экспрессии этих генов; структура и функция продуктов этих генов в контроле цикла S.pombe. Отличительные особенности течения и регуляции клеточного цикла у диплоидный дрожжей S. сerevisiae - p34cdc28 остается главным и единственным регулятором клеточного цикла диплоидных дрожжей, но увеличивается число типов циклинов, участвующих в регуляции более сложного по течению клеточного цикла S. сerevisiae. Ингибиторы циклин-зависимых киназ; семейство INK4 белков и семейство CIP/KIP белков; их структура, особенности экспрессии в ходе клеточного цикла. Субстратымишени для активированных cdk – т.наз. «М-киназы» (MPF): H1-гистон, MAP-киназы, MAP-белки, белки ядерной ламины; особенности структуры этих белков и их фосфорилирования для осуществления перехода из G2- в M-фазу. Субстраты-мишени “Start kinase” (определенные комплексы циклин-cdk) необходимые для перехода из G1- в S-фазу: Rb-белок, s6 и некоторые факторы, участвующие в репликации ДНК.Особенности этапов фосфорилирования Rb-белка; высвобождение фактора транскрипции E2F; его роль в усилении транскрипции генов необходимых для осуществления S-фазы, а также экспрессии гена циклина Е, последующего образования активного комплекса циклин Еcdk2, необходимого для преодоления точки перехода (R1) из G1- в S-фазу; роль комплекса циклин А-cdk2 в инактивации фактора E2F. Протеолиз и регуляция клеточного цикла. Деградация циклина В обеспечивает необратимый переход от метафазы к анафазе. Структура протеосом (26S комплексы); убиквитин, его структура, селективно-сигнальная роль убиквитина при его связывании с белком, впоследствии подвергающемся деградации в протеосоме. Убиквитинактивирующие ферменты. “Destruction box” – особый мотив в молекуле циклина В, распознаваемый убиквитином. АРС-комплексы, их структура и состав, роль АРСкомплексов в убиквитинилировании циклинов В в мета- анафазе и циклинов в G1-фазе. Общая схема молекулярных механизмов, участвующих в регуляции клеточного цикла млекопитающих. Генная инженерия Основные понятия генной инженерии: клонирование, трансформация, вектор. Основные свойства векторов, используемых в генной инженерии. Векторы замещения. Инсерционные векторы. Векторы на основе плазмид. Участок ori, селективные маркеры, полилинкер. Система селекции с использованием альфа цепи бетта-галактозидазы. Компетентные клетки. Сравнительная характеристика различных штаммов. Бактериофаг М13. Эффективность трансформации, ее зависимость от длины плазмиды. Векторы на основе фага лямбда. Векторы ВАС, РАС, YAC. Области применения рассматриваемых векторов. Система модификации-рестрикции бактерий. Рестриктазы второго типа. Изошизомеры. Другие ферменты, используемые в генной инженерии: ДНК-лигазы, ДНКполимеразы, полинуклеотидкиназа фага Т4, фосфатазы. Способы встраивания чужеродной ДНК в вектор. Геномные клонотеки. Представительность клонотеки, минимальное число анализируемых клонов. Анализ нуклеиновых кислот с помощью электрофореза. Разрешающая способность геля. Агарозные и акриламидные гели. Методы визуализации нуклеиновых кислот в геле. Конформация молекул нуклеиновой кислоты при электрофорезе. Денатурирующий электрофорез. Капиллярный электрофорез. Импульс-электрофорез. Плавление ДНК. Температура плавления, интервал плавления. Гибридизация. Примеры «+» и «-»-гибридизации. Мембраны для иммобилизации нуклеиновых кислот. Получение ДНК- и РНК- зондов для гибридизации, Саузерн- и Нозерн-гибридизация. Использование изотопов и флюоресцентных красителей. Создание геномных клонотек, покрывающих геном. Скрининг геномных клонотек. Картирование. Физические карты, генетические карты. Масштаб физической и генетической карты. Рекомбинационные единицы. Клонотеки, представляющие отдельные хромосомы. "Шаги" и "прыжки" по хромосоме. Энциклопедии генов. Определение последовательности нуклеотидов. Метод полимеразной достройки ДНК с использованием модифицированных нуклеотидов-терминаторов (метод Сэнгера), метод специфической химической модификации оснований с последующим расщеплением ДНК (метод Максама-Гильберта). Автоматическое секвенирование. Определение последовательностей нуклеотидов длинных фрагментов ДНК. Полимеразная цепная реакция. Области применения. Основные параметры реакции. Термостабильные ДНК-полимеразы. Подходы к картированию геномов высших эукариот. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), ДНК-маркирующие сайты (STS). Различные нуклеотидные повторы и их использование для картирования. Микросателлитные маркеры. Геномная дактилоскопия. Определение полной последовательности нуклеотидов организмов. Программа «Геном человека». Создание клонотек кДНК. Методы скрининга клонотек кДНК: гибридизация нуклеиновых кислот, иммунологическая детекция специфических антигенов, гомологичная рекомбинация, отбор по продуцированию биологически активных молекул. Определение точки начала транскрипции. Метод «футпринтинга». Основы биоинформатики: сравнение последовательностей нуклеотидов, сравнение последовательностей аминокислотных остатков. Гомология. Идентификация функциональных областей генома на основе нуклеотидного состава. Базы данных. Знание полной последовательности нуклеотидов генома: что это дает? Клонирование новых генов. Открытые рамки считывания. Переход к последовательности аминокислотных остатков. Анализ экзон - интронной структуры. Определение хромосомной локализации. Поиск регуляторных элементов. Предсказание функции клонированного гена по первичной структуре. Позиционное клонирование. Ген-кандидат. Анализ сцепления. Генетические маркеры. Прямая и непрямая генная диагностика. Генная инженерия высших эукариот. Модельные организмы. Генная терапия: задачи, подходы, векторные системы. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регуляция экспрессии внесенных генов. Моральноэтические проблемы генной терапии. Оценка и возможное уменьшение биологического риска, связанного с созданием и распространением рекомбинантной ДНК. Получение продуцентов интересующих белков. Векторные системы. Способы оптимизации продуцентов. Выделение и очистка слитных белков. Получение белков в активной форме. Посттрансляционная модификация. Взаимосвязь генов в клетке. Генные сети. Методы изучения экспрессии генов. Подходы к изучению экспресси генов на уровне целой клетки. Array, EST. Проблемы интерпретации полученных результатов. Протеом. Молекулярные основы наследственной патологии Анализ генома Геном человека. Различные уровни анализа генома: цитогенетический, молекулярно-цитогенетический, молекулярно-биологический. Хромосомный набор, морфология хромосом. Дифференциальная окраска хромосом (G-, C-, R-, Q-, T-, Ag-). Анализ хромосом на разных стадиях митоза: метафазные хромосомы, раннеметафазные хромосомы, прометафазные хромосомы, профазные хромосомы. Гетерогенность Gокраски гомологичных хромосом на разных стадиях митоза. Молекулярная организация хромосомы: нуклеосомная упаковка ДНК, хроматиновое волокно и его упаковка, петли хроматина, сестринские хроматиды. Взаимосвязь упаковки хроматина и дифференциального окрашивания хромосомы: R-петли, Q-петли, районы прикрепления петель хроматина к каркасу, эухроматин, факультативный гетерохроматин, структурный гетерохроматин Временные параметры репликации хромосом Хромосомные аномалии классификация, механизмы и примеры. Численные аномалии хромосом: три- и тетраплоидии, анеусомии: трисомии хромосом 21 (синдром Дауна), 18 (синдром Эдвардса), 13 (синдром Патау), Х (синдромы ХХХ и Клайнфельтера), Y, моносомия Х (синдром Шерешевского-Тернера). Структурные аномалии хромосом: реципрокные и нереципрокные транслокации, робертсоновские транслокации, тандемные транслокации, инсерции прямые и инвертированные, делеции терминальные и интерстициальные, дупликации прямые и инвертированные, кольцевые хромосомы, изохромосомы моно- и дицентрические. Ломкость хромосом - фрагильные участки. Биодозиметрия Операционные уровни в цитогенетике: светооптический, молекулярный. Молекулярная цитогенетика - методы: флуоресцентная гибридизация in situ, ПЦР на хромосомах, сравнительная геномная гибридизация, спектроскопический анализ хромосом. Операционные уровни в молекулярной биологии: крупные фрагменты ДНК, гены, мРНК, экзоны, нуклеотиды. Методы анализа ДНК: анализ сцепления, электрофорез в пульсирующем поле, молекулярное клонирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР, методы поиска мутаций, секвенирование. Композиция генома человека: ядерный и митохондриальный геномы. Ядерный геном: гены и генные последовательности, кодирующие и некодирующие ДНК, псевдогены, фрагменты генов, нетранслируемые последовательности, повторяющиеся последовательности. Клиническая цитогенетика и онкоцитогенетика - база картирования генов наследственных заболеваний человека . Стратегии картирования генома Стратегия «Функциональное клонирование»: геноспецифические олигонуклеотиды, специфические антитела, скрининг антител, экспрессионные библиотеки кДНК, функциональная комплементация. Список наследственных заболеваний человека, картированных с использованием этой стратегии. Стратегия «Позиционное клонирование». Алгоритм исследования. Генетическое картирование, анализ сцепления: генетические маркеры, генетические карты, анализ гаплотипов, генетическое расстояние (сантиморган), кроссинговер, позитивный и негативный лод-балл, мультилокусное сцепление. Делеционное картирование и клонирование точек разрыва. Микродиссекция и клонирование фрагментов ДНК. Анализ потери гетерозиготности и сравнительная геномная гибридизация. Физическое картирование определенного района, физические маркеры: искусственные дрожжевые хромосомы, клоны на основе вирусной и бактериальной ДНК, радиационные гибриды, хромосомоспецифические ДНК-библиотеки, контиги клонов, флуоресцентная гибридизация на нити ДНК, секвенированные маркерные участки (STS). Тонкое генетическое картирование: анализ рекомбинаций, неравновесие по сцеплению. Идентификация гена в определенном районе: скрининг кДНК-библиотек с использованием геномных клонов, кДНК селекция, нозерн-блоттинг на панели тканей, зоо-блоттинг, идентификация CpG-островков, экзон-треппинг, компьютерный анализ последовательности: поиск гомологии, предсказание экзонов, поиск мотивов и сигнальных последовательностей, выявление мутаций. Стратегия «Ген-кандидат»: «позиционно-независимый ген-кандидат», «позиционный ген-кандидат». Усредненные характеристики гена: размеры генов, экзонов, интронов, организация промоторных районов, гены внутри генов, антисмысловые генные последовательности. ДНК-диагностика - практический подход Основные типы мутаций: нуклеотидные замены, инсерции, делеции, хромосомные аномалии. Полиморфизмы ДНК (SNP). Методы косвенной ДНК-диагностики: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей. Методы прямой ДНК-диагностики: множественная ПЦР, анализ однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP), анализ гетеродуплексов (HA), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), градиентный по температуре гель-электрофорез (TGGE), химическое расщепление неспаренных участков (CCM), энзиматическое расщепление неспаренных участков, белок-усеченный тест (PTT), секвенирование. Анализ функционального состояния ДНК: метилчувствительная ПЦР, метилспецифическая ПЦР, метилспецифический фингерпринтинг. Анализ однородительской изодисомии. Анализ крупных структурных перестроек ДНК: электрофоретический анализ в пульсирующем поле, дозовый блотгибридизационный анализ. Анализ экспансии тринуклеотидных повторов. Классификация мутаций по функции: потеря функции, приобретение новой функции, изменение дозы гена. Классификация мутаций по структуре: миссенс-мутации, нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания. Мутации сайтов сплайсинга: механизмы возникновения мутаций сплайсинга, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты ветвления, криптические сайты сплайсинга. Номенклатура и правила записи мутаций. Характерные мутации при распространенных наследственных заболеваниях. Молекулярные основы наследственной патологии Картирование и клонирование генов EXT1 и EXT2 при множественной экзостозной хондродисплазии: синдром Лангера-Гидиона, трихо-рино-фаланговый синдром, множественная экзостозная хондродисплазия, делеция хромосомы 8q24.1, делеция хромосомы 11р12, анализ сцепления, критические рекомбинации, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, дозовый блот-гибридизационный анализ, анализ длин рестрикционных фрагментов, контиги космидных клонов, микросателлитные ДНК-маркеры, уникальные ДНК-маркеры, скрининг кДНК-библиотек, 5’- и 3’- RACE, нозерн блоттинг-гибридизация, зоо-блоттинг, анализ ДНК-последовательности по базам данных, определение экзон-интронной организации генов, скрининг и секвенирование мутаций. потеря гетерозиготности и мутации во вторичных хондросаркомах. Картирование и клонирование генов PAX6 и WT1 при синдроме WAGR. Синдром аниридии, нефробластомы, аномалий мочеполового тракта, умственной и физической задержки развития, изолированная аниридия, изолированная нефробластома, делеция хромосомы 11р13, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, контиг космидных клонов. радиационные гибриды, флуоресцентная гибридизация на хромосомах, дозовый блот-гибридизационный анализ, дозовая ПЦР, экзон-интронная организация генов, скрининг и секвенирование мутаций. Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена, варианты дистрофина в результате альтернативного сплайсинга в различных тканях, делеции гена дистрофина, молекулярная диагностика аномалий гена дистрофина. Муковисцидоз: история картирования и клонирования гена. экзон-интронная организация гена, частота и спектр мутаций, методы детекции мутаций, генымодификаторы, влияющие на течение заболевани. Ретинобластома: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена. белковый продукт гена и его функция. взаимодействие pRB с другими генами в цепи регуляции клеточного цикла, частота и спектр герминальных мутаций, потеря гетерозиготности и мутации в опухоли, функциональная инактивация гена в опухоли, методы детекции мутаций. Множественная эндокринная неоплазия, типы 2А и 2В, семейный медуллярный рак щитовидной железы и синдром Гиршпрунга: история картирования и клонирования гена RET, экзон-интронная организация гена, белковый продукт гена и его функция, частота и спектр герминальных мутаций при МЭН2А и 2В и медуллярном раке, частота и спектр герминальных мутаций при синдроме Гиршпрунга, структурные перестройки гена RET при папиллярной карциноме щитовидной железы, типы химерных генов на основе RET, приобретение новой функции, методы детекции химерных генов. Создание диагностических протоколов. Болезни экспансии Повторяющиеся последовательности генома. Классификация. Мультигенные семейства: классические генные семейства (рРНК), генные семейства, кодирующие большие консервативные домены (PAX-гены, гомеобоксные гены), генные семейства, кодирующие короткие консервативные мотивы (DEAD-мотив), генные суперсемейства (гены иммуноглобулинов, комплекса гистосовместимости), кластерированные генные семейства (различные формы псевдогенов, глобиновый кластер), РНК-кодирующее генное семейство. Внегенные повторяющиеся последовательности и мобильные элементы: тандемные повторы: сателлитная ДНК и центромерный гетерохроматин, минисателлитная ДНК (теломерное семейство, гипервариабельное семейство), микросателлитная ДНК, рассеянные повторы: SINE (Alu-повторы), LINE (Kpn-повторы), ME, THE-1, RTLV. Механизмы возникновения структурной патологии и мутаций в повторяющихся районах генома: проскальзывание неспаренной нити ДНК (репликационное проскальзывание), неравный кроссинговер, неравный обмен сестринских хроматид, генная конверсия. Примеры генетических заболеваний, связанных с районами повторяющихся последовательностей: вело-кардио-фациальный синдром, синдром Вильямса, синдром Смита-Магениса, азооспермия (DAZ), синдром Шарко-Мари-Тус. Синдром МартинаБелл, как пример структурной и функциональной патологии: ломкость хромосомы Xq27.3, экспансия CGG-повтора, механизмы, методы ДНК-диагностики, метилирование повтора и промоторной области, область отсроченной репликации и нестабильность микросателлитов, ремоделирование хроматина. Другие болезни, связанные с динамическими мутациями: хорея Гентингтона, болезнь Кеннеди, спино-церебральные атаксии (SCA1-7), миотоническая дистрофия, миоклональная эпилепсия. Днк-диагностика в онкологии Двухударная теория канцерогенеза Кнудсона. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста. ДНК-диагностика моногенных и дигенных наследственных онкологических заболеваний: р53 и синдром Ли-Фраумени, АРС и семейный полипоз, АТМ и атаксиятелангиоэктазия, BRCA1, BRCA2 и наследственный рак молочной железы, NF1, NF2 и нейрофиброматоз, р16 и наследственная меланома, VHL и синдром фон Хиппель-Ландау. ДНК-диагностика маркеров неблагоприятного прогноза: гиперэкспрессия/инактивация определенных генов в различных типах опухолей, клиникобиологические типы нейробластомы, молекулярная эволюция рака толстого кишечника и опухолей мозга. ДНК-диагностика микрометастазов, РТ-ПЦР - как основной метод, определение экспрессии опухолеспецифических маркеров в периферической крови, тирозиназа при меланоме, тирозинкиназа при нейробластоме, цитокератин 19 при раке молочной железы. Диагностика полиморфизмов ДНК, определяющих риск развития злокачественных новообразований: полиморфизмы гена ароматазы и риск развития рака молочной железы, полиморфизмы андрогенового рецептора и риск развития рака предстательной железы, полиморфизмы генов NAT1, PADPRP и риск развития рака легкого. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухоли: инактивация гена hMLH при карциноме желудка, инактивация генов GSTP1, BRCA1, ER при раке молочной железы, инактивация MGMT, DAP, р16 при раке легкого. Определение маркеров, свидетельствующих о злокачественном процессе на ранних стадиях, в плазме крови, метилирование р16, Е-кадгерина, BRCA1, мутации р53, потеря гетерозиготности по маркерам хромосом 3р, 9р, 17р, 18q. Исследование генных регуляторных цепей в опухоли. Разработка диагностических протоколов. Эпигенетические механизмы регуляции генной экспрессии и наследственная патология. Структура хроматина и механизмы ее определяющие, нуклеотидные «сторожевые» районы, метилирование цитозинов, ацетилирование/деацетилирование гистонов, белковые комплексы, осуществляющие модификацию хроматина. Эффект положения. Классические примеры: мозаичный эффект положения у дрозофилы, аниридия и ген PAX6, цефалополисиндактилия Грейга и ген GLI3, акроцефалосиндактилия и ген TWIST, синдром Ригера и ген PITX2, кампомелическая дисплазия и ген SOX9, Х-сцепленная глухота и ген POU3F4, голопрозэнцефалия и ген sonic hedgehog, XY-реверсия пола ген SRY, эктродактилия и ген DSS1, лице-плечелопаточная мышечная дистрофия и ген FRG1, азооспермия и ген DAZ, механизмы ЭП, конформация ДНК, деацетилирование гистонов, эухроматиновый домен, гетерохроматиновый домен, время-зависимая экспрессия генов, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, конкуренция за регуляторный элемент, инактивирующий белковый комплекс. Импринтинг. Определение. Примеры импринтинга: трансплантация пронуклеусов, андрогенетические зиготы, гиногенетические зиготы, пузырный занос, тератома, андроид, гиноид, синдром Шерешевского тернера, делеция хромосомы 15q11.2, синдром Прадера- Вилли, синдром Ангельмана, синдром Миллера-Дикера, синдром ДиДжорджи, синдром «кошачьего крика», болезни экспансии, синдром Видеманна-Беквита, дупликация хромосомы 11р15.5. Моноаллельная экспрессия, метилирование, однородительская изодисомия, импринтированный ген, ген-импринтор, центр импринтинга, потеря импринтинга, глобальное деметилирование, кластеризация импринтированных генов, асинхронность репликации, онтогенетическая регуляция импринтинга, тканевая регуляция импринтинга, повторяющиеся последовательности, нетранслируемая РНК, антисмысловая РНК, метилспецифическая ПЦР, метилчувствительная ПЦР, микросателлитный анализ, инактивирующее влияние структурного гетерохроматина, метилспецифические белки, консервативность импринтинга. Генная терапия и избранные главы по вирусологии Генная терапия (ГТ) – новое направление современной биомедицины. Природа заболеваний, являющихся объектом ГТ. Наследственные болезни, обусловленные мутациями или отсутствием существенных генов. Онкологические заболевания, вызванные перестройкой и другими модификациями генома. Молекулярно-биологические и медицинские предпосылки создания и развития ГТ. Геномика. Реализация международного проекта «Геном человека». Достижения в структурно-функциональном анализе нормальных и дефектных генов. Локализация генов. Современные методы выделения и поддержания in vitro клеток человека различной специфичности. Методы создания функционирующих клеток с измененными свойствами. Генетически модифицированные организмы – трансгенные животные. Основные подходы и приемы генной терапии. Перенос и экспрессия целевых генов в тканях больных. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регулируемая экспрессия внесенных генов. Подавление экспрессии активированных онкогенов. Подавление развития инфекционных заболеваний методами ГТ за счет переноса и экспрессии неприродной рекомбинантной ДНК и РНК. Генная терапия соматических клеток Искусственные железы. Идеология этого подхода. Экспрессия в клетках больного цитокинов, гормонов, ферментов для восполнения соответствующего дефицита. Генная терапия моногенных и полигенных заболеваний. МЗ – дефект одного гена. Примеры. Дополнительная ГТ МЗ. успешное лечение иммунодефицита, вызванного недостаточностью ADA. ПЗ – множественный склероз, волчанка, ревматоидный артрит. Заместительная и дополнительная генная терапия. Преимущества заменительной терапии. Трудности осуществления и способы их преодоления. Модельные эксперименты на перевиваемых клетках и лабораторных животных. LoxP – cre система. Преимущества и недостатки дополнительной генной терапии. Примеры клинического применения ДГТ: миодистрофия Дюшена, муковисцидоз; заболевания, вызванные дефицитом гормонов или цитокинов. Генная терапия злокачественных и вирусных заболеваний. 2/3 одобренных ГТ протоколов направлены на лечение злокачественных заболеваний. Основной подход – усиление иммунного отввета за счет усиления иммуногенности раковых клеток. Способы достижения. Антисмысловые РНК и антисмысловые олигонуклеотиды. Молекулярные основы действия антисмысловых последовательностей нуклеиновых кислот. Подавление на уровне трансляции. РНКазная деградация. Рибозимы. Основной молекулярный механизм действия рибозимов. 2 основных типа рибозимов. Подавление онкогенов рибозимами. Генная терапия репродуктивных клеток. Исправление гентических дефектов в репродуктивных клетках. Направленное изменение генома. Мораторий на ГТ репродуктивных клеток человека. Морально-этические проблемы генной терапии. Возможность направленного изменения генома – разрешительные органы, контролирующие органы. Проблема принятия решения. Церковь и генная терапия. Биологический риск. Оценка риска. Создание рекомбинантной ДНК и контроль за ее распространением, использованием и уничтожением. Спонтанное возникновение генетически модифицированных вирусов и микроорганизмов – возможные издержки генноинженерных технологий, используемых при ГТ. Методы переноса и экспрессии генов Невирусные методы переноса генов. «Химические методы» переноса экспрессируемых генов. Ca-фосфатная и DEAE-декстрановвая трансфекции. Принцип действия, использование при трансгенозе. Липосомы, типы липосом, использование при ГТ. Ограничения этих методов. «Физические методы» переноса экспрессируемых генов. Электропробой. Преимущества и недостатки. Баллистические методы доставки ДНК. Инъекция, струйный метод. Использование при ДНК-вакцинации. Вирусные методы переноса генов. Общая характеристика методов. Вирусы, используемые для конструирования векторов. Преимущества. Примеры использования. Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов. Основные характеристики вируса осповакцины. История использования вируса осповакцины в медицинской практике,. жизненный цикл и особенности строения генома. Существенные и несущественные гены. Векторы на основе осповакцины. Клонирование в векторах на основе вируса осповакцины. Использование гомологичной рекомбинации при клонировании генов в векторах на основе осповакцины. Векторы на основе аденовирусов. Структура аденовирусного генома. Ранние и поздние гены. Стратегия модификации генома. Жизненный цикл аденовирусов. Конструирование векторов на основе аденовирусов. Способы увеличения емкости этих векторов. Высокая иммуногенность аденовирусных векторов. Использование в целях генной терапии. Риск, связанный с их использованием. Адено-ассоциированный вирус, структура генома, жизненный цикл. Особенности вируса. Интеграция в определенный участок 19 хромосомы человека. Конструирование векторов на основе адено-ассоциированного вируса. Системы переноса терапевтических генов в рекомбинантных векторах на основе ААВ. Использование этих векторов в генной терапии. Преимущества и недостатки. Ограничения при использовании. Примеры использования в ГТ. Векторы на основе вирусов герпеса. Особенности структуры генома вирусов герпеса. Жизненный цикл вирусов герпеса. Конструирование векторов на основе вирусов герпеса и их использование в генной терапии. Удаление несущественных генов вируса и змаена их «терапевтическими генами». Использование при внесении генов в нервные клетки. Ограничения. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Ретровирусные векторы. Особенности жизненного цикла. Обратная транскриптаза. Молекулярный механизм действия ОТ. Классификация ретровирусов. Принципы классификации ретровирусов. Вирусы группы MLV. Спумавирусы (пенящие вирусы). Лентивирусы (HIV 1,2). Ретровирусы B-типа (MMTV). Ретровирусы группы лейкозов человека и крупного рогатого скота. Простые и сложные ретровирусы. Особенности структуры геномов простых и сложных ретровирусов. Жизненные циклы простых и сложных ретровирусов. Взаимодействие белков оболочки вируса с клеточными рецепторами. Тропизм вирусов. Экотропные, амфотропные и ксенотропные вирусы. Онкогенные ретровирусы. Природный перенос генов от одних клеток другим ретровирусами. Природа клеточных протоонкогенов. Захват геномом ретровирусов онкогенов. Переход протоонкогенов в активированные онкогены. Конструирование векторов на основе ретровирусов. (Вирусы группы лейкозов мышей, лентивирусы, пенящие вирусы). Цис- и транспоследовательности генома ретровирусов. Их функции. Емкость ретровирусных векторов. Упаковывающие клетки (УК). Принципы конструирования УК. УК первого, второго и третьего поколения. Псевдотипирование.Использование псевдотипирования для повышения титра. Ретровирусные векторы в генной терапии. Использование; преимущества и недостатки. Емкость векторов. Включение в состав ретровирусных векторов участков генома вирусов другой природы и регуляторных элементов генома человека. Регулируемая экспрессия. Настоящее и будущее генной терапии. Перспективы развития. Благо или зло. Первые 10 лет генной терапии. Конкретные достижения. Основные направления развития ГТ. Клонирование человека. Методические основы клонирования. Клонирование животных. Человечество перед выбором: аргументы за и против. Клонирование тканей и органов в целях трансплантации. Ответственность исследователей и врачей. Готово ли общество к клонированию? Культивирование и методы исследования эукариотических клеток (практические занятия) Использование культур эукариотических клеток в биологии и медицине. Преимущества работы с культурами клеток. Среды для культивирования клеток. Сбалансированные солевые растворы. Естественные среды, среды с определенным составом и среды с определенным составом с добавлением естественных компонентов. Роль сыворотки при культивировании клеток. Ростовые среды. Поддерживающие среды. Газовая фаза. Посуда и оборудование, используемые для культивирования клеток. Условия культивирования клеток. Принципы стерильной работы. Методы стерилизации. Контроль бактериального загрязнения. Основные принципы культивирования клеток млекопитающих. Первичные и пассируемые культуры. Суспензионные культуры. Монослойные культуры. Субкультивирование. Факторы, лимитирующие рост клеток. Стабильные клеточные линии, характеристика, особенности. Анализ кривой роста. Методы получения клеточных суспензий: механические, использования протеаз, хелатирующих агентов. Подсчет живых клеток в камере Горяева. Методы выделения лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов. Митогены. Сохранение и оценка качества клеток. Замораживание клеток. Размораживание и оценка выхода клеток. Основные подходы к масштабированному культивировыанию клеток млекопитающих в биотехнологических целях. Техника получения моноклональных антител. Принципы соматической гибридизации. Подбор партнерских линий. Способы иммунизации. Гибридизация. Основы селекции, селективные среды. Методы тестирования моноклональных антител. Клонирование клеток. Кондиционированныые среды. Фидерный слой. Способы наращивания и выделения моноклональных антител. Гетерологичные гибридомы. Использование моноклональных антител. Использование радиоактивных изотопов в клеточной культуре. Типы ядерных распадов, используемые в клеточной биологии. Единицы измерения радиоактивности. Принципы измерения бета-радиоактивности. Принципы измерения гаммарадиоактивности. Изотопы, используемые в биологических исследованиях, их характеристики. Радиоавтография. Фотографическая эмульсия. Возникновение скрытого изображения. Проявление. Область применения радиоавтографии. Использование двойной метки. Сочетание радиоавтографии с другими методами (иммуноцитохимией, гистологическим окрашиванием и др.). Применение радиоавтографии при изучении клеточного цикла. Метод «меченых митозов». Метод «разведения метки» для изучения пролиферативного поведения клеток. Определение пролиферативного пула клеточной популяции. Иммуноцитохимия, принцип метода. Условия успешного проведения иммуноцитохимических исследований. Сохранность и доступность антигена. Антитела и специфичность окрашивания. Визуальзация реакции антиген-антитело. Иммунофлуоресцентные методы. Иммуноферментные методы. Прямой метод Кунса. Непрямой метод Веллера и Кунса. Метод пероксидазы-антипероксидазы (ПАП). Метод гаптенового сэндвича. Авидин-биотиновые методы. Мечение при помощи коллоидного золота. Окрашивание по двум антигенам одновременно. Использование лектинов, ингибиторов. Область применения иммуноцитохимических методов. Практические занятия по генной инженерии Масштабы и методы анализа геномов. Основные этапы молекулярно-генетических исследований, связанных с анализом геномов: 1) конструирование клонотек, поиск отдельных генов и определение их нуклеотидной последовательности; 2) установление взаимного расположения клонированных фрагментов и воссоздание строения более протяженных участков генома; 3) подходы к исчерпывающей структурной характеристике геномов любых размеров. Клонотека (библиотека) генома. Карты генома - физические и генетические. Энциклопедии генов. Масштабы разрешения методов молекулярного клонирования и генетического картирования. Клонирование ДНК. Общие принципы конструирования библиотек. Поиск и характеристика индивидуальных клонов. Скрининг библиотек методом гибридизации нуклеиновых кислот. Отбор клонов с помощью гомологичной рекомбинации. Использование иммунологической детекции для идентификации нужных клонов в экспрессирующих библиотеках. Другие методы скрининга экспрессирующих библиотек. Системы вектор – хозяин. Основные типы векторов для клонирования фрагментов чужеродной ДНК и размножения их в E. coli : бактериофаг , космиды, плазмиды, бактериофаг M13. Соотношение размеров молекул различных векторов и вставок (клонирующая емкость векторов). Основные свойства плазмидных векторов. Клонирование в плазмидах. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами. Проведение реакции рестрикции. Обработка рестрицированной ДНК щелочной фосфатазой. Лигирование ДНК. Электрофорез ДНК в агарозном геле. Общие принципы метода. Основные параметры, определяющие скорость миграции ДНК в агарозном геле при электрофорезе - размер молекул ДНК, концентрация агарозы, конформация ДНК, напряженность электрического поля, состав оснований и температура. Приготовление агарозного геля и нанесение проб. Метод визуализации ДНК в агарозных гелях с помощью окрашивания ее флуоресцирующим красителем - бромистым этидием. Извлечение ДНК из агарозного геля. Трансформация E. coli плазмидной ДНК. Общие принципы метода. Выбор конкретного штамма Е. coli. Приготовление основных сред и растворов для трансформации. Стандартная методика трансформации. Оценка результатов трансформации. Частота (эффективность) трансформации. Доля компетентных клеток. Выделение плазмидной ДНК. Сравнительные характеристики различных методов выделения плазмидной ДНК. Растворы для выделения плазмидной ДНК. Микрометод выделения плазмидной ДНК. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах, с радиоактивными зондами. Основные принципы метода. Растворы для блоттинга и гибридизации ДНК. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр. «Предгибридизация» фильтра в растворе, компоненты которого насыщают его неспецифические ДНК-связывающие центры. Виды ДНК-зондов для гибридизации. Способы включения метки в ДНК. Никтрансляция ДНК. с помощью ДНК-полимеразы I (E.coli). Включение метки в 5'-концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Гибридизация на фильтрах по Саузерну. Отмывка от несвязавшейся метки. Параметры гибридизации и отмывки. Время полуренатурации зонда. Радиоавтография. Полимеразная цепная реакция. Общая схема экспоненциального увеличения количества копий ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Параметры реакции. Температурные циклы ПЦР, включающие последовательные стадии денатурации, отжига и элонгации цепей ДНК. Компоненты реакции. Основные типы ДНК-матрицы. Принципы подбора праймеров. Оптимизация условий ПЦР.