Антифибротическое действие сурамина в поврежденных скелетных мышцах после повреждения.

Антифибротическое действие сурамина в поврежденных скелетных мышцах после повреждения.
Мышечные травмы, наиболее часто встречающиеся в спортивной медицине, создают сложные проблемы в
травматологии. Мышечное повреждение может происходить через различные механизмы, начиная от прямой
механической деформации (например, разрыв мышц, деформация или ушиб) или косвенного повреждения,
связанного с ишемией и неврологической дисфункцией. Пострадавшие мышцы обычно проходят процесс
дегенерации и регенерации состоящий из трех фаз. Фаза разрушения характеризуется формированием гематомы,
некрозом мышечной ткани, дегенерацией, и воспалительно-клеточным ответом. Восстановительный этап
включает в себя фагоцитоз поврежденных тканей, регенерацию поперечно-полосатых мышц, производство
соединительнотканного рубца, и ростом капилляров. На заключительном этапе реконструкции регенерирующие
мышцы созревает вместе с реорганизацией рубцовой ткани. Хотя мышечная ткань сохраняет свою способность к
регенерации после травмы, процесс заживления, как правило, происходит медленно и часто не полностью. Полное
восстановление скелетных мышц препятствует развитию фиброза, который обычно появляется в течение второй
недели после повреждения мышц и увеличивается с течением времени. Мы создали различные животные модели
мышечной травмы и наблюдали процесс регенерации в поврежденных мышцах. Долгосрочная цель нашего
исследования - разработка биологических мероприятий по улучшению заживления мышц после травм. Для
достижения этой цели, наша исследовательская группа исследует две основные процедуры: повышение
регенерации мышц и предотвращение мышечного фиброза. Мы охарактеризовали влияния нескольких факторов
роста на повышение пролиферации миобластов и синтеза в лабораторных условиях. Это привело к идентификации
трех перспективных факторов роста [фактор роста нервов, основного фактора роста фибробластов, и, в
частности, инсулиноподобного фактора роста (IGF) -1], которые улучшают регенерацию мышц . Тем не менее,
полное восстановление пострадавших мышц продолжает быть ограничено развитием фиброза. Таким образом,
мы сосредоточили наши недавние усилия на развитии биологических подходов для предотвращения фиброза
мышц после травм. Перепроизводство трансформирующего фактора роста (TGF)-β в ответ на повреждение и
заболевание является основной причиной фиброза тканей в организме человека и других животных. В скелетных
мышцах, TGF-β1 экспрессируется на высоком уровне и связан с процессом фиброзирования в скелетных
мышцах у пациентов с миодистрофией Дюшенна. Кроме того, во время мышечной травмы, воспалительные
реакции, которые происходят в месте повреждения, приводят к координационному производству TGF-β1,
который вызывает фиброз через активацию внеклеточного матрикса и разрастание соединительной ткани. Мы
также сообщали, что TGF-β является основным фактором в запуске каскада фиброза в скелетных мышцах.
Блокируя фиброзный эффект TGF-β1 с помощью инъекции биологически активных молекул- декорина, прямого
антагониста TGF-β1 (51), мы обнаружили, что структура и функция мышц достигли почти полного
выздоровления. Тем не менее, очень большое количество декорина эффективно улучшало заживление очень
маленьких мышц мышей. Таким образом, мы сосредоточили наши усилия на выявление биологических агентов,
которые могут быть использованы клинически и имеют антифиброзные эффекты, сопоставимые с декорином.
Сурамин (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури) был первоначально разработан в качестве противопаразитарного
препарата и подавлял TGF-β путем конкурентного связывания с рецептором фактора роста. Имея это в виду, мы
предположили, что сурамин также может связываться с TGF-β рецептором обычно встречающимся в клетках в
месте мышечных травм и тем самым предотвращает активацию TGF-β1 и его влияние на миофибробласты.
Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели серию тестов в пробирке, чтобы определить влияние сурамина на
фибробласты. В естественных условиях, мы выбрали модель рваной раны, чтобы подтвердить антифиброзных
эффект сурамина и оценить ее влияние на мышцы.
Материалы и методы
Влияние Сурамина на фибробласты In Vitro.
Клеточные культуры NIH 3T3 клеток, известной линии фибробластов, культивировали в среде Дульбекко в
модификации Игла (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10%
лошадиной сыворотки, 0,5% экстракта куриного эмбриона, и 1% пенициллина / стрептомицина. Все клетки были
выращены при 37 ° С в 5% СО2 в течение 3 дней с периодическим изменениям среды. NIH 3T3 клетки (2.000
клеток / лунку) высевали в 12-луночные планшеты. После 12-часового инкубационного периода, среда была
полностью удалена, а свежую среду роста (без сыворотки) добавляют сурамин (50 мкг / мл). Свежая среда (с той
же концентрацией сурамина) добавляют каждые 2 дня. Для измерения пролиферации клеток, клетки обрабатывали
трипсином и подсчитывали в гемоцитометре. Пять отдельных пластин в группе на момент времени были оценены
и по сравнению с контролем (без сыворотки в среде, без сурамина) через 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч инкубации.
Вестерн-блоттинг.
Для анализа влияния TGF-β1 в мышцах, липофектин (Invitrogen) использовали для трансфекции в C2C12 клетки
плазмидой, кодирующей TGF-β1 и неомицин, как описано ранее. После выбора G418 (500 мкг / мл, Invitrogen),
C2C12 клетки, экспрессирующие TGF-β1, были названы "CT клетки". Такое же количество (105) СТ клеток клона
помещали в различные Т-25 колбы и обрабатывали сурамином в концентрации 0, 1, 10 и 50 мкг / мл. Параллельно
с ростом проведены три независимые испытания. Экспрессия α-актина гладких мышц (α-SMA) и виментина, оба
из которых являются маркерами миофибробластов, была оценена в этих клетках. После 72-часового периода
инкубации клетки дважды промывают фосфатным буферным раствором (PBS; Roche, Indianapolis, IN) и
лизировали лизат буфера [отношение β-меркаптоэтанола в буфере для образцов (62,5 мМ Tris · HCl, рН 6,8, 2%
SDS, 25% глицерина) = 1:20]. После этого весь лизат клеток центрифугировали при 3000 г в течение 5 мин и
супернатант собирали и хранили при 4 ° C. Образцы были проанализированы с помощью 12% SDSполиакриламидного геля. Концентрации белка определяли с помощью методологии Брэдфорд . Четыре мкг белка
из каждого образца были загружены, и разделены при 55 В в течение 1 ч и 75 В в течение 3 часов. Затем мы
передали общий белок на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием 60 V.
Мембраны промывали в PBS в течение 5 мин и блокировали 1% обезжиренного сухого молока и 2% лошадиной
сыворотки в Triton-PBS (T-PBS, 0,01%) в течение 1 ч при комнатной температуре ( 60 циклов / мин). Первичные
антитела против α-SMA (1: 1000, Sigma Chemical) были применены при комнатной температуре в течение 1 ч, во
время которого блоты промывают четыре раза в T-PBS. Вторичные антитела анти-IgG мыши конъюгированные с
пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce, Rockford, IL) были применены в течение 1 ч, после чего пятна снова
промывают 4 раза в T-PBS (15 мин / цикл). После чего блоты промывают, они были оценены с помощью
усиленной хемилюминесценции , а положительные группы были определены с помощью рентгеновской пленки.
Для оценки экспрессии виментина, тот же протокол был выполнен с помощью различных антител. Первичные
антитела против виментина (1:1000, Sigma Chemical) и вторичные антитела анти-IgG козы конъюгированные с
пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce) были использованы. Рентгеновские пленки из трех независимых блотов для
каждого антитела были отсканированы и оценены (версии 6.0, Empix Imaging, North Tonawanda, Нью-Йорк) путем
расчета оптической плотности каждой полосы белка. Анализ изображений был выполнен в черно-белом, а
сигналы изображения на линейной части были выражены в сером значении в диапазоне от 0 до 256 пикселов.
Определение биологического и физиологического эффекта Сурамина на регенерацию мышц после
повреждения.
Животные модели.
Модель рваной раны была разработана на мышах (C57BL10J + / +; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) на основе
ранее описанных исследованиях. Сорок четыре мыши, в среднем возрасте 8 недель и примерным весом 18-22 г,
были использованы в эксперименте. Животных содержали в клетках и кормили коммерческим кормом и не
ограничены в воде. Комитет по исследованию на животных утвердил протоколы исследований, используемые
для этих экспериментов (протокол №. 5/01). Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы
тела животного) пентобарбитала натрия (Anpro Pharmaceuticals, Arcadia, CA). Мышцы поврежденные
хирургическим лезвием (№ 11) на 50% от их ширины и 100% от их толщины. Полидиоксанон шовный материал
(PDSII 5-0, Ethicon, Somerville, NJ), 4 мм в длину, был помещен в медиальные края на каждой стороне каждой
ноги. После того, как рваная рана была сделана, кожа была закрыта 4-0 черным шелком. Сурамин вводили по
шовному материалу микрошприцом. Мыши были разделены на три группы на основании различных моментов
времени после рваной раны (0, 7 и 14 дней). В каждый момент времени, четыре различные концентрации
сурамина (0, 0,25, 1 и 2,5 мг в 20 мкл PBS) были использованы. В группе (отрицательный контроль), мышцы были
повреждены , как в экспериментальных группах, но вводили только PBS. Два животных в группе были оценены
гистологически. Все животные были убиты для оценки заживления и регенерации через 2 постинъекционных
недели. Икроножные мышцы были изолированы и замораживали в 2-метилбутан предварительно охлаждается в
жидком азоте. Регулярные гистологические и иммуногистохимические методы для оценки экспрессии виментина
были использованы для оценки развития рубцовой ткани после травмы.
Оценка мышечного фиброза после лечения сурамином.
24 мыши использовали для этого эксперимента. Обе икроножные мышцы мышей повреждены. Мыши были
разделены на 12 групп по 2 мыши / группа (4 мышцы / группы). Различные концентрации сурамина (0, 0,25, 1 и
2,5 мг в 20 мкл PBS) вводили в каждый момент времени (0, 7 и 14 дней). Через две недели после инъекции все
животные были убиты для оценки заживления и регенерации мышц. Шестнадцать мышц в момент времени (4
мышцы / концентрация) были использованы для регулярного гистологического и иммуногистохимического
окрашивания. Окрашивание коллагена и виментина проводили для выявления фиброза в поврежденной мышце,
как описано ранее. Промежуточные филаменты виментина были использованы в качестве маркера рубцовой
ткани в данном исследовании, поскольку он экспрессируется в соединительной ткани. Виментин экспрессируется
в мышечных волокнах на ранних стадиях развития, и вскоре после травмы (<2 недели), однако, зрелые мышечные
волокна не выражают этого белка. Короче говоря, для окрашивания коллагена срезы фиксировали в 10%
формалине в течение 10 мин. После чего срезы промывали в деионизированной воде, трехцветная изменение
окраски было выполнено в соответствии с протоколом производителя (IMEB, Сан-Маркос, Калифорния).
Иммуногистохимия виментина была выполнена с фиксацией секций, как описано выше. После 45 минут
блокировки в 5% лошадиной сыворотке (Vector, Burlingame, CA), эти слайды инкубировали
с анти-виментин сопряженными Cy3 (1:500, Sigma Chemical). Площадь поверхности фиброза в различных группах
была измерена с помощью ранее описанной методике. Эти измерения были получены
независимым
исследователем, который не знал, какие группы лечили или использовались как элементы контроля , обеспечивая
тем самым объективность результатов. Для измерения общего виментина или коллагена использовали
флуоресцентный микроскоп, 10 случайных полей были выбраны для каждого образца. Изображения были собраны
с помощью Olympus эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus Optical, Токио, Япония) и Sony 970 3 (Sony,
Токио, Япония). После того как они были оцифрованы с помощью Coreco Imaging (Coreco, Сен-Лоран, Квебек,
Канада) и доводится до монохромного цвета, характеристики были извлечены, и абсолютные области с
виментина-положительным окрашиванием измерялась в каждом поле изображения.
Оценка восстановления мышц после терапии сурамином.
Гематоксилин и эозин были использованы для мониторинга числа регенерирующих мышечных волокон в
поврежденных областях, обработанных сурамином (0, 0,25, 1 или 2,5 мг в 20 мкл PBS), и результаты были
сопоставлены между различными группами. Клетки с центрально расположенными ядрами считаются
регенерирующими мышечными волокнами. Ядра без какой-либо заметной окружающей цитоплазмы были
отброшены. Независимый наблюдатель осуществлял подсчет. Общее количество регенерирующих мышечных
волокон в месте повреждения оценено количественно, используя пять случайных полей, выбранных из каждого
образца в соответствии с ранее описанным протоколом.
Физиологическая оценка сократительных свойств мышц после терапии сурамином.
Двадцать четыре мыши были использованы для физиологических испытаний, которые были основаны на ранее
описанных протоколах. Икроножные мышцы левой ноги у каждой мыши повреждены, как описано выше, и в них
вводят сурамин через 14 дней после травмы. Икроножная мышца правой ноги у каждой мыши была извлечена и
сохранены. Шесть мышей в каждой группе [вводили 0 (контроль), 0,25, 1 или 2,5 мг сурамина в 20 мкл PBS] были
подвергнуты физиологическому тестированию для определения восстановления функций через 14 дней после
инъекции. Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы тела животного) пентобарбитала
натрия при внутрибрюшинном введении. Обе икроножные мышцы были извлечены и смонтированы в двойной
оболочке в ванночку из 5 мл при 36 ° C в раствор Кребса (в мм: 113 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 CaCl2, 1,2 MgSO4, 25
NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,5 глюкоза) и постоянно перемешивают с смесью из 95% кислорода и 5% углекислого
газа. Время между извлечением мышцы и началом измерения силы была <1 мин для всех мышц. Начальная
напряженность была установлена на уровне 20 мН; изометрические сокращения измеряли с помощью
тензометрических преобразователей в сочетании с TBM4 тензометрическим усилителем (инструменты
Всемирного Precision, Сарасота, Флорида) и записан на компьютере с помощью программы сбора данных (Windaq,
DATAQ инструменты , Акрон, Огайо). Частота дискретизации на канал была установлена на уровне 500 Гц.
Амплитуда стимуляции сокращений была вычислена по расчету программы (WindaqEx, DATAQ). Через 20 мин
мышцы выведены из равновесия электрическим стимулом через два платиновых электрода, расположенных на
верхнем и нижнем концах
ванны (разделенных на 4 см). Мышцы были стимулированы импульсом
длительностью по 0,25 мс с максимальным напряжением (50 В). Во-первых, стимуляция в 1-Гц была
использована, и сокращения мышц записаны. Тетаническое раздражение затем было применено с 0,5-с
продолжительностью в 100 Гц каждые 10 с. Наконец, каждая мышца была взвешена с помощью микровесов
(Mettler Toledo, Greifensee, Швейцария). Измерения напряженности были записаны и выражается в мг-ньютонов
на грамм.
Статистический анализ.
Различия в пролиферации клеток между контрольной группой и экспериментальными группами, обработанными
сурамином (50 мкг / мл) были проанализированы с помощью Стьюдент-теста. Статистическое сравнение
фиброзных площадей, количества регенерирующих мышечных волокон, и
силы в различных группах
проводились при помощи анализа ANOVA. Различия между группами были проанализированы с помощью
Bonferroni (должность специального теста). Статистическая значимость определяется как P <0,05.
Результаты
Влияние Сурамина на фибробластах In Vitro
Антипролиферативное влияние сурамина на пролиферацию фибробластов NIH 3T3 описано на рис. 1. После
инкубации в диапазоне от 72 ч до 144 ч, в экспериментальной группе получавших сурамин (50 мкг / мл)
наблюдалось значительное снижение числа фибробластов по сравнению с контрольной группой (без сыворотки
среде без сурамина).
Влияние сурамина на внутриклеточные α-SMA и виментин, Вестерн-блот анализ.
Чтобы оценить насколько сурамин влияет на α-SMA и виментин, мы исследовали влияние сурамина на
содержание белка в клетках. Чтобы убедиться в том, что клетки реагируют на сурамин, темп роста был определен.
После 72 ч инкубации с сурамином (50 мкг / мл), один набор клеток подсчитывали, чтобы подтвердить, что рост
NIH 3T3 фибробластов подавляется значительно. Вестерн-блот анализ показал снижение экспрессии
внутриклеточных α-SMA и виментина при концентрации сурамина 50 мкг / мл. Денситометрическая оценка
показала 100% снижение α-SMA и виментина в клетках, которые инкубировали с 50 мкг / мл сурамина, 73 и 81%
снижение соответствующих белков при концентрации 10 мкг / мл сурамина , и снижение 53 и 45%
соответствующих белков при 1 мкг / мл сурамина по сравнению с контролем (0 мкг / мл сурамина) (таблицы 1 и
2).
Определение биологического и физиологические эффекты Сурамина на регенерацию мыш после повреждения.
Оценка мышечного фиброза после инъекции сурамина .
Гистологическая оценка в сочетании с количественным анализом коллагена и виментина на поврежденном
участке дает предположение , что введение высоких концентраций сурамина (2,5 мг в 20 мкл PBS) более
эффективно предотвращает фиброз, чем введение более низких концентрациях сурамина (1, 0,25 и 0 мг; рис. 2, 3,
4, 5).. Значительно меньше рубцовой ткани образуется в экспериментальной группе, получавшей 2,5 мг сурамина,
чем в контрольной группе (P <0,05).Тормозящее действие сурамина на развитие фиброза мышц, казалось, зависит
от дозы, однако, значительное снижение фиброза наблюдается при дозах от 1,0 и 2,5 мг сурамина (указано
содержание виментина и коллагена), никаких существенных различий в результатах не было обнаружено между
0,25-и 1-мг и 1 - и 2,5-мг. Процент рубцовой ткани через 4 недели после травмы колебался от ~ 12,8% от общей
площади в контрольной (0 мг сурамина) до 7,9% в 0,25-мг группе, 4,7% в 1-мг и 2,6% в 2,5-мг.
Оценка восстановления мышц после инъекции сурамина.
После инъекции сурамина в мышцы отображаются многочисленные мышечные волокна регенерирующие на
месте разрыва. Эти регенерирующие мышечные волокна были расположены равномерно по всему региону в
поверхностных, так и в глубоких частях мышцы (рис. 2).Контроль мышц содержащих регенирирующие
мышечные волокона установил , что они были в основном расположены в более глубоких районах области
повреждения. В поверхностной области наблюдалась инфильтрация мононуклеарных клеток и всего несколько
регенерирующих мышечных волокон, большинство в этой области составляла фиброзная ткань (рис. 2). На
рисунке 6 показано среднее количество регененрирующих мышечных волокон. Все
мышечные волокна
с центрально расположенными ядрами присутствуют
были
подсчитаны и сравнены между группами. Мы наблюдали увеличение количества регенирирующих мышечных
волокон во всех группах, получавших лечение по сравнению с контрольной группой. Однако, только высокие
дозы сурамина (2,5 мг) привели к значительно большому количеству регенерирующих мышечных волокон по
сравнению с контрольной (P <0,01;. Рис. 6).
Физиологическая оценка сократительных свойств мышц после инъекции сурамина.
Сила мышц измерялась при помощи физиологического тестирования и сравнивалась с результатами у животных
из контрольной группы (PBS инъекции).Сила мышц составила 217,2 ± 26,3 мН / г в нормальных мышцах, 119,6 ±
32,0 мН / г в контрольной группе, 148,2 ± 36,7 мН / г в группе больных, получавших 0,25 мг сурамина, 164,8 ± 51,2
мН / г в группе, получавшей 1,0 мг сурамина и 184,5 ± 20,4 мН / г в группе, получавшей 2,5 мг сурамина. Не
существовало никаких существенных различий между нормальными мышцами и мышцами из группы,
получавшей 2,5 мг сурамина (рис. 7). Тем не менее, существует значительная разница между контрольной группой
(ранения + PBS), и группой, получавшей 2,5 мг сурамина (рис. 7).Тетаническая сила мышц составила 321,4 ± 25
мН / г в нормальных мышцах, 172,5 ± 21,1 млн / г в контрольной группе, 169,7 ± 15,4 мН / г в группе больных,
получавших 0,25 мг сурамина, 201,7 ± 25,0 мН / г в группе больных, получавших 1 мг сурамин и 275,7 ± 68,7 мН /
г в группе, получавшей 2,5 мг сурамина. Не существовало разницы между нормальными мышцами и мышцами
в группе, получавшей 2,5 мг сурамина (рис. 7). Тем не менее, существует значительная разница между
контрольной группой (ранения + PBS) и группой, получавшей 2,5 мг сурамина.
Чтобы свести к минимуму различия между животными, данные также были нормализованы по отношению к
контролю, т. е. сила экспериментальных мышц была разделена на силу контрольных мышц на
противоположной стороне и умножена на 100, чтобы определить процентное изменение. Для силы сокращения
контрольной группой производится 55%, группа 0,25 мг сурамина - 63%, группа 1 мг сурамина -69%, и группа
2,5 мг сурамина - 82% от силы в интактных мышцах через 4 недели после травмы (рис. 8).Разница между
контрольной группой и группой, получавшей 2,5 мг сурамина оказалась значимой (р <0,05). Кроме того,
тетаническая сила мышц составила 54% в контрольной группе, 59% - 0,25 мг сурамина , 72% -1 мг сурамина и
87% - 2,5 мг сурамина от силы неповрежденной мышцы. Опять же существует значительная разница между
тетанической силой в контрольной группе (ранения + PBS) и измеренной в группе, получавшей 2,5 мг сурамина.
ОБСУЖДЕНИЕ
Хотя ышечные травмы часто встречаются в профессиональном и любительском спорте, но оптимальное лечение
не было четко определено. Кроме того, значительную заболеваемость, в том числе ранние функциональные и
структурные дефициты, атрофия мышц, контрактуры, и боль, часто возникает после травмы мышц. Скелетные
мышцы способны к обширной регенерации после травмы через активацию спутниковых клеток, пролиферацию
и слияние в зрелые мышечные волокна. Тем не менее, формирование рубцовой ткани происходит одновременно и
конкурирует с восстановлением мышц во время процесса заживления.Различные факторы роста могут
стимулировать рост и секрецию белков мышечных клеток. Во время восстановления мышц факторы роста и
цитокины освобожденные при ранении мышц, как полагают, активируют клетки-сателлиты. Предварительные
данные также показали, что факторы роста играют дополнительную роль в процессе восстановления мышц.
Особый интерес представляет IGF-1 и -2, способные стать митогенным фактором для миобластов. IGF-1 имеет
решающее значение в качестве посредника рост мышечной и других тканей. Мы охарактеризовали эффективность
восстановления мышц после различных моделей мышечных травм. В этих моделях наблюдается активный процесс
регенерации мышц, который имел место на ранних этапах лечения, что в конечном итоге вело к нарушениям в
развитии рубцовой ткани в поврежденных мышцах . Кроме того, мы определили конкретные факторы роста (IGF1, основной фактор роста фибробластов, и фактор роста нервов), которые способны к повышении пролиферации и
дифференциации миобластов в пробирке и исследовали доставку этих факторов роста в поврежденную мышцу для
улучшения исцеления мышц в естественных условиях. Хотя непосредственная инъекция рекомбинантного
основного фактора роста фибробластов дает некоторое положительное влияние на заживление мышц после
травм(например, разрыв , ушиб, и напряжение). Эти факторы роста мышц могут улучшить регенерацию, но не
могут предотвратить образование рубцовой ткани, что в конечном итоге ухудшает процесс заживления. Большое
количество рубцовой ткани, которая появляется в поврежденных мышцах через 3-4 недели после травмы
предпологает , что естественное заживление ушибленных, рваных мышц является неполным. Фиброз обычно
развивается в течение второй недели после повреждения мышц и увеличивается с течением времени. Недавно мы
попытались разработать биологические подходы к непосредственной блокаде фиброза. Предыдущий доклад
нашей лаборатории показал, что иммобилизация рваных мышц не оказали существенного влияния на развитие
фиброза, а шов был способен ограничить фиброза в глубине раны, но не на поверхности. Мы недавно
установили, что миогенные клетки под влиянием TGF-β1 могут дифференцироваться в клетки соединительной
ткани в ответ на мышечную травму. На основе этого открытия, декорин, антифиброзные протеогликаны, которые
подавляет эффект TGF-β, были использованы для предотвращения фиброза и тем самым способны улучшить
заживления после травмы мышц у мышей. Мы заметили, что при непосредственном введении, декорин смог
эффективно предотвращат фиброз и улучшать восстановление мышц. Сурамин изначально синтезированный и
предназначенный для использования в качестве противопаразитарного препарата, потому что его тормозящее
действие на обратную транскриптазы, недавно был введен в клинических испытаниях по борьбе со СПИДом,
злокачественными новообразованиями, и метастатическими заболеваниями, в том числе предстательной железы,
коры надпочечников, молочной железы и рака толстой кишки, лимфомой. Поскольку сурамин является аналогом
гепарина, он связывается с гепарин-связывающими белками. Вещество блокирует действие факторов роста на
опухолевые клетки в пробирке и вмешивается в действия факторов роста путем конкурентного связывания с
рецепторами фактора роста. Факторы роста подавляемыми сурамином включают TGF-β1, -2 и -3; PDGF А и В, и
EGF. Из многих факторов роста, TGF-β1 и -2 и PDGF А и В имеют сильное влияние на фибробласты. В начале
эксперимента в естественных условиях крысам лечили кожные раны инъекциями сурамина. У кроликов при
изучении глаукомы, субконъюнктивальные инъекции сурамина широко подавляют действие фактора роста на
клетки-мишени в условиях заживления раны в тканях глаза. Сурамин также показал высокую эффективность в
предотвращении рубцевания без тяжелых токсических эффекто. Нашей целью в данном исследовании было
изучение влияния антифиброзного действия сурамина в скелетных мышцах. В пробирке мы определили
последствия воздействия сурамина на пролиферацию фибробластов и экспрессию фиброзно-родственных белков.
В естественных условиях, мы исследовали антифиброзные последствия сурамина в поврежденных мышцах путем
прямой инъекции различных концентраций сурамина в разные моменты времени после повреждения. Наши
результаты показывают, что сурамин имеет сильное антипролиферативное действие на NIH 3T3. Похожие
результаты были получены в различных клетках, в том числе опухалевых и неопухалевых клеток. α-SMA и
виментин были вовлечены в развитие фиброза и являлись маркерными белками для миофибротического
фенотипа. Мы лечили сурамином CT клетки (C2C12 клетки, трансфицированные плазмидой, кодирующей TGFβ1 и неомицин), которые показывают высокий уровень экспрессии α-SMA и виментина. Количественный вестерн
блот анализ показал 100% снижение α-SMA и виментина белков в клетках, которые инкубировали с 50 мкг / мл
сурамина, сокращение на 73 и 81% соответствующих белков после лечения 10 мкг / мл, а 53 и 45% снижение этих
белков при 1 мкг / мл, по сравнению с контролем. Мы показали, что сурамин отменяет стимулирующий эффект
TGF-β1 на производство белков соединительной ткани в клетках CT клона. Наши результаты поддерживают
теорию, что сурамин снижает биологическую активность внеклеточных факторов роста в зависимости от дозы
путем конкурентного связывания с рецепторами фактора роста, и таким образом инактивируют их. На животной
модели мы обнаружили, что непосредственного введения сурамина в поврежденных мышцах уменьшается
количество фиброза в травмированной области. Гистологическое исследование и количественное исследование
виментина и коллагена в месте повреждения показали, что инъекция высокой концентрации
сурамина (2,5 мг в 20 мкл PBS) для предотвращения фиброза действует лучше, чем введение более низких
концентраций сурамина (1, 0,25 или 0, мг). Способность сурамина препятствовать фиброзу, как представляется,
зависит от дозы. Мы также оценивали влияние инъекций сурамина на восстановления мышц. Было много
регенерирующих мышечных волокон в месте повреждения в экспериментальных группах, получавших сурамин,
в то время как место повреждения, как правило, заполнено фиброзной рубцовой тканью в группах, не получавших
лечение. Статистический анализ показал существенное повышение мышечной регенерации в группе получавшей
2,5 мг сурамина через 14 дней после травмы. Эти данные показали, что размер области фиброза снизился, и число
регенирирующих мышечных волокон было увеличено в группе получавшей сурамин. Этот факт позволяет
предположить, что непосредственное введение сурамина может предотвратить образование рубцовой ткани и,
следовательно, улучшить восстановление мышц. Результаты физиологического тестирования
проведены
параллельно гистологическому исследованию. Оценка тетанической силы и силы сокращения не показали
существенное различия между группой не леченных мышц и группой, получавшей 2,5 мг сурамина. Тем не
менее, существует значительная разница между группой, получавшей 2,5 мг сурамина и контрольной группой
(рваная мышцу вводят только с PBS). Чтобы свести к минимуму изменения, данные были нормированы по
отношению к контролю, не получавшему лечение. В контрольной группе производится 55%,а группе,
получавшей 2,5 мг сурамина производится 82% от интактной мышцы через 4 недели после травмы. Аналогичные
результаты были получены при оценке тетанической силы мышц. Эти данные убедительно свидетельствуют, что
инъекции 2,5 мг сурамина через 2 недели после травмы могут эффективно улучшить функциональное
восстановление поврежденных мышц. Результаты этого исследования показывают, что сурамин (50 мкг / мл)
может подавлять пролиферацию фибробластов и экспрессию фиброзных белков (α-SMA и виментина)
эффективно в пробирке. В естественных условиях, инъекции сурамина (2,5 мг) через 2 недели эффективно
предотвращают фиброз мышц и повышают регенерацию мышц, что приводит к эффективному восстановлению
функций мышц. В будущем, мы должны изучить влияние сурамина при других травмах мышц, особенно при
растяжении мышц, наиболее распространенный тип мышечных травм в спортивной медицине. Процесс
заживления мышц после растяжение похож на том, что происходит после разрыва, т. е. развитие выраженного
фиброза, кажется, препятствует эффективной, полной регенерации мышц . Таким образом, мы должны применять
подобные методы в будущих исследованиях. Тем не менее, безопасность использования сурамина как
антифиброзного агента должна быть определена прежде, чем эти результаты могут быть применены в клинике для
лечения мышечных травм.
Ссылки
1. ↵ Alameddine HS, Dehaupas M, and Fardeau M. Regeneration of skeletal muscle fibers from autologous satellite
cells multiplied in vitro: an experimental model for testing cultured cell myogenicity. Muscle Nerve 12: 544-555,
1989. CrossRef Medline
2. ↵ Anderson JE, Liu L, and Kardami E. Distinctive patterns of basic fibroblast growth factor (bFGF) distribution in
degenerative and regenerating areas of dystrophic (mdx) striated muscle. Dev Biol 147: 96-109, 1991. CrossRef
Medline
3. ↵ Aronen JG and Chronister RO. Quadriceps contusion: hastening the return to play. Phys Sportsmed 20: 130-136,
1992.
4. ↵ Barbero A, Benelli R, Minghelli S, Tosetti F, Dorcoratto A, Ponzetta C, Wernig A, Cullen M, Albini A, and Noonan
D. Growth factor supplemented matrigel improves ectopic skeletal muscle formation—a cell therapy approach. J
Cell Physiol 186: 183-192, 2001. CrossRefMedline
5. ↵ Bernasconi P, Di Blasi C, Mora M, Morandi L, Galbiati S, Confalnieri P, Cornelio F, and Mantegazza R.
Transforming growth factor-β1 and fibrosis in congenital muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 9: 28-33,
1999. CrossRef Medline
6. ↵ Bernasconi P, Torchiana E, Confalonieri P, Brugnoni R, Barresi R, Mora M, Cornelio F, Morandi L, and
Mantegazza R. Expression of transforming growth factor-β in dystrophic patient muscles correlates with fibrosis:
pathogenetic role of a fibrogenic cytokine. J Clin Invest 96: 1137-1144, 1995. Medline
7. ↵ Bischoff R. The satellite cell and muscle regeneration. In: Myology (2nd ed.), edited by Eagle AG and FranziniArmstrong C. New York: McGraw-Hill, 1994, p. 97-118.
8. ↵ Bornemann A and Schmalbruch H. Desmin and vimentin in regenerating muscles. Muscle Nerve 15: 14-20,
1992. CrossRef Medline
9. ↵ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254, 1976. CrossRef Medline
10. ↵ Brocks L, Jap PHK, Ramaekers FCC, and Stadhouders AM. Vimentin and desmin expression in degenerating and
regenerating dystrophic murine muscles. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 61: 89-96, 1991. Medline
11. ↵ Caplan A, Carlson B, and Faulkner J. Injury and repair of the musculoskeletal soft tissue. In: Skeletal Muscle,
edited by Woo SLY and Buckwalter JA. Park Ridge, IL: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1988, p. 213291.
12. ↵ Carlson BM and Faulkner JA. The regeneration of skeletal muscle fibers following injury: a review. Med Sci
Sports Exerc 15: 187-196, 1983. CrossRef Medline
13. ↵ Chamberlain J, Shah M, and Ferguson MW. The effect of suramin on healing adult rodent dermal wounds. J
Anat 186: 87-96, 1995.
14. ↵ Chambers RL and McDermott JC. Molecular basis of skeletal muscle regeneration. Can J Appl Physiol 21: 155184, 1996. Medline
15. ↵ Confalonieri P, Bernasconi P, Cornelio F, and Mantegazza R. Transforming growth factor-β1 in polymyositis and
dermatomyositis correlates with fibrosis but not with mononuclear cell infiltrate. J Neuropathol Exp Neurol 56:
479-484, 1997. Medline
16. ↵ Crisco JJ, Jokl P, Heinen GT, Connell M, and Panjabi M. A muscle contusion injury model: biomechanics,
physiology, and histology. Am J Sports Med 22: 702-710, 1994. Abstract/FREE Full Text
17. ↵ Engert JC, Berlund EB, and Rosenthal N. Proliferation precedes differentiation in IGF-1 stimulated myogenesis
[letter]. J Cell Biol 125: 431-440, 1996.
18. ↵ Florini JR, Ewton DZ, and Coolican SA. Growth hormone and the insulin-like growth factor system in
myogenesis. Endocr Rev 17: 481-517, 1996. Abstract/FREE Full Text
19. ↵ Florini JR and Magri KA. Effect of growth factors on myogenic differentiation. Am J Physiol Cell Physiol 256:
C701-C711, 1989. Abstract/FREE Full Text
20. ↵ Foster W, Li Y, Usas A, Somogyi G, and Huard J. Gamma interferon as an antifibrosis agent in skeletal muscle. J
Orthop Res. In press.
21. ↵ Fukushima K, Badlani N, Usas A, Riano F, Fu F, and Huard J. The use of antifibrosis agent to improve muscle
recovery after laceration. Am J Sports Med 29: 394-402, 2001. Abstract/FREE Full Text
22. ↵ Garrett WE Jr. Muscle strain injuries: clinical and basic aspects. Med Sci Sports Exerc 22: 436-443, 1990.
23. ↵ Garrett WE Jr, Seaber AV, Boswick J, Urbaniak J, and Goldner J. Recovery of skeletal muscle after laceration and
repair. J Hand Surg [Am] 9: 683-692, 1984.
24. ↵ Grounds MD. Towards understanding skeletal muscle regeneration. Pathol Res Pract 187: 1-22, 1991. Medline
25. ↵ Hannafin JA, Pedowitz RA, and Hidaka C. Pathophysiology and healing of musculoskeletal tissues. In:
Orthopaedic Knowledge Update, edited by Griffin LY. Rosemont, IL: American Academy of Orthopaedic Surgeons,
1994, p. 17-33.
26. ↵ Hawking F. Suramin: with special reference to onchocerciasis. Pharmacol Chemother 106: 216-221, 1987.
27. ↵ Holbrook TL, Grazier K, Kelsey JL, and Stauffer RN. The Frequency, Occurrence, Impact and Cost of Selected
Musculoskeletal Conditions in the United States. Park Ridge, IL: American Academy of Orthopedic Surgeons,
1984.
28. ↵ Huard J, Li Y, and Fu F. Muscle injury and repair: current trends in research. J Bone Joint Surg Am 84: 822-832,
2002.
29. ↵ Hughes CIV, Hasselman CT, Best TM, Martinez S, and Garrett W. Incomplete, intrasubstance strain injuries of
the rectus femoris muscle. Am J Sports Med 23: 500-506, 1995. Abstract/FREE Full Text
30. ↵ Hurme T and Kalimo H. Activation of myogenic precursor cells after muscle injury. Med Sci Sports Exerc 24: 197205, 1992.
31. ↵ Jackson DW and Feagin JA. Quadriceps contusions in young athletes: relation of severity of injury to treatment
and prognosis. J Bone Joint Surg Am 55: 95-105, 1973. Medline
32. ↵ Jarvinen MJ and Lehto MU. The effects of early mobilisation and immobilisation on the healing process
following muscle injuries. Sports Med 15: 78-89, 1993. Medline
33. ↵ Jarvinen TA, Kaariainen M, Jarvinen M, and Kalimo H. Muscle strain injuries. Curr Opin Rheumatol 12: 155-161,
2000. CrossRef Medline
34. ↵ Jennische E. Sequential immunohistochemical expression of IGF-1 and the transferrin
receptor in regenerating rat muscle in vivo. Acta Endocrinol 121: 733-738, 1989.
35. Jennische E and Hansson HA. Regenerating skeletal muscle cells express insulin-like growth factor 1. Acta Physiol
Scand 130: 327-332, 1987. Medline
36. ↵ Johnson SE and Allen RE. Activation of skeletal muscle satellite cells and the role of fibroblast growth factor
receptors. Exp Cell Res 219: 449-453, 1995. CrossRef Medline
37. ↵ Kalimo H, Rantanen J, and Jarvinen M. Soft tissue injuries in sport. Balliere Clin Orthop 2: 1-24, 1997.
38. ↵ Kasemkijwattana C, Menetrey J, Bosch P, Somogyi G, Moreland M, Fu F, Buranapanitkit B, Watkins S, and Huard
J. Use of growth factors to improve muscle healing after strain injury. Clin Orthop 370: 272-285, 1999.
39. ↵ Kasemkijwattana C, Menetrey J, Day CS, Bosch P, Buranapanitkit B, Moreland M, Fu F, and Huard J. Biologic
intervention in muscle healing and regeneration. Sports Med Arthrosc Rev 6: 95-102, 1998.
40. ↵ Kasemkijwattana C, Menetrey J, Somogyl G, Moreland M, Fu F, Buranapanitkit B, Watkins S, and Huard J.
Development of approaches to improve the healing following muscle contusion. Cell Transplant 7: 585-598, 1998.
CrossRef Medline
41. ↵ Lefaucheur JP and Sebille A. Muscle regeneration following injury can be modified in vivo by immune
neutralization of basic fibroblast growth factor, transforming growth factor β1 or insulin-like growth factor-1. J
Neuroimmunol 57: 85-91, 1995. CrossRef Medline
42. ↵ Lehto M, Jarvinen M, and Nelimarkka O. Scar formation after skeletal muscle injury: a histological and
autoradiographical study in rats. Arch Orthop Trauma Surg 104: 366-370, 1986. CrossRef Medline
43. ↵ Levine A, Gill P, Cohen J, Hawkins J, Formenti S, Aguilar S, Meyer P, Krailo M, Parker J, and Rasheed S. Suramin
antiviral therapy in the acquired immunodeficiency syndrome. Ann Intern Med 105: 32-37, 1986. Abstract/FREE
Full Text
44. ↵ Li Y, Cummins J, and Huard J. Muscle injury and repair. Curr Opin Orthop 12: 409-415, 2001.
45. ↵ Li Y, Foster W, Badlani N, Sato K, Chan Y, Payne T, and Huard J. TGF-beta1 promotes differentiation of muscle
cells toward fibrotic cells (Abstract). Trans 48th Ann Meeting Orthopaed Res Soc 27: O655, 2002.
46. ↵ Li Y, Han B, Li K, Jiao L, Habib M, and Wang H. TGF-β1 inhibits HLA-DR and β2-microglobulin expression in Hela
cells induced with r-INF. Transplant Proc 31: 2143-2145, 1999. CrossRef Medline
47. ↵ Li Y and Huard J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J
Pathol 161: 895-907, 2002. Medline
48. ↵ Menetrey J, Kasemkijwattana C, Day CS, Bosch P, Vogt M, Fu F, Moreland M, and Huard J. Growth factors
improve muscle healing in vivo. J Bone Joint Surg Br 82: 131-137, 2000. Abstract/FREE Full Text
49. ↵ Menetrey J, Kasemkijwattana C, Fu FH, Moreland M, and Huard J. Suturing versus immobilization of a muscle
laceration. A morphological and functional study in a mouse model. Am J Sports Med 27: 222-229, 1999.
Abstract/FREE Full Text
50. ↵ Mietz H, Chevez-Barrios P, Feldman RM, and Lieberman M. Suramin inhibits wound healing following filtering
procedures for glaucoma. Br J Ophthalmol 82: 816-820, 1998. Abstract/FREE Full Text
51. ↵ Mietz H, Chevez-Barrios P, Lieberman MW, Wendt M, Gross R, and Basinger S. Decorin and suramin inhibit
ocular fibroblast collagen production. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 399-403, 1997. CrossRef
Medline
52. ↵ Moller-Pederson T, Cavanag HD, Petroll WM, and Jester J. Neutralizing antibody to TGF-β moderates stromal
fibrosis but not regression of photoablative effect following PRK. Curr Eye Res 17: 736-747, 1998. CrossRef
Medline
53. ↵ Nikolaou PK, Macdonald BL, Glisson RR, Seaber AV, and Garrett WE Jr. Biomechanical and histological
evaluation of muscle after controlled strain injury. Am J Sports Med 15: 9-14, 1987. Abstract/FREE Full Text
54. ↵ Quinn LS and Haugk KL. Overexpression of the type-1 insulin-like growth factor receptor increases liganddependent proliferation and differentiation in bovine skeletal myogenic culture. J Cell Physiol 168: 34-41, 1996.
CrossRef Medline
55. ↵ Ryan JB, Wheeler JH, Hopkinson WJ, Arciero R, and Kolakowski K. Quadriceps contusions. West Point Update.
Am J Sports Med 19: 299-304, 1991. Abstract/FREE Full Text
56. ↵ Schrell UMH, Gauer S, Kiesewetter F, Bickel A, Hren J, Adams E, and Fahlbusch R. Inhibition of proliferation of
human cerebral meningioma cells by suramin: effects on cell growth, cell cycle phase, extracellular growth
factors, and PDGF-BB autocrine growth loop. J Neurosurg 82: 600-607, 1995. Medline
57. ↵ Schultz E. Satellite cell behavior during skeletal muscle growth and regeneration. Med Sci Sports Exerc 21:
S181-S186, 1989.
58. ↵ Schultz E, Jaryszak DL, and Valliere CR. Response of satellite cells to focal skeletal muscle injury. Muscle Nerve
8: 217-222, 1985. CrossRef Medline
59. ↵ Serini G and Gabbiani G. Mechanism of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res 250:
273-283, 1999. CrossRefи Medline
60. ↵ Stein CA. Suramin, a novel antineoplastic agent with multiple potential mechanisms of action. Cancer Res 53:
2239-2248, 1993. FREE Full Text
61. ↵ Sullivan KM, Lorenz HP, Meuli M, Meuli M, Lin R, and Adzick N. A model of scarless human fetal wound repair is
deficient in transforming growth factor β. J Pediatr Surg 30: 198-203, 1995. CrossRef Medline
62. ↵ Taylor DC, Dalton JD Jr, Seaber AV, and Garrett WE. Experimental muscle strain injury: early functional and
structural deficits, and the increased risk for reinjury. Am J Sports Med 21: 190-194, 1993. Abstract/FREE Full Text
63. ↵ Thomas DW, O'Neill ID, Harding KG, and Shephard J. Cutaneous wound healing: a current perspective. J Oral
Maxillofac Surg 53: 2239-2248, 1995.
64. ↵ Tiggelman AM, Linthorst C, Boers W, Brand HS, and Chamuleau RA. Transforming growth factor-β induced
collagen synthesis by human liver myofibroblasts inhibited by α2-macroglobulin. J Hepatol 26: 1220-1228, 1997.
CrossRef Medline
65. ↵ Yokozeki M, Moriyama K, Shimokawa H, and Kuroda T. Transforming growth factor-β1 modulates
myofibroblastic phenotype of rat palatal fibroblasts in vitro. Exp Cell Res 231: 328-336, 1997. CrossRef
Medline
66. ↵ Zumkeller W and Schofield PN. Growth factors, cytokines and soluble forms of receptor molecules in cancer
patients. Anticancer Res 15: 344-348, 1995.
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
Оригинал статьи: http://jap.physiology.org/content/95/2/771.full