Оглавление: - Институт фундаментальной биологии и
реклама
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт Фундаментальной биологии и Биотехнологии Базовая кафедра биотехнологии УТВЕРЖДАЮ Заведующий кафедрой _______ _____________ Подпись Ф.И.О. « _____» __________20 ___ г. МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ Конструирование резорбируемых матриксов функционирующих клеток на основе Биопластотана Магистрант Руководитель диссертации Гончаров Д. Б. ББ10-07М д.б.н. проф. Волова Т.Г. Красноярск 2011 Оглавление: 1. Метод электростатического формования ...........................................................................1 1.2 Исследования параметров влияющих на процесс ЭСФ ............................................2 1.3 Сферы применения полимерных нановолокон...........................................................5 1.3.1 Изготовление фильтров ............................................................................................5 1.3.2 Применение в биологии и медицине.......................................................................6 1.3.2.1 – Медицинское протезирование........................................................................6 1.3.2.2 – Матрицы для культивирования клеток ......................................................6 1.3.2.3 – Заживление ран и ожогов................................................................................6 1.3.2.4 – Дозировка лекарств .........................................................................................7 1.3.2.5 – Изготовление защитной одежды ...................................................................7 1. Метод электростатического формования К перспективным методам получения нетканых материалов из полимеров, которые могут использоваться в изготовлении волокон и мембран, относится метод электростатического формования (ЭСФ) – «electrospinning». С 80-х годов, и особенно в течение последних лет, процесс электростатического формования привлекает к себе всё больше внимания, связано это с возрастающим интересом к нанотехнологиям. Ультратонкие волокна или волокнистые структуры различных полимеров с диаметрами вплоть до субмикронов или нанометров могут легко быть изготовлены этим процессом. Исследование открытых публикаций связанных электростатическим формованием в течение последних 10 лет ясно демонстрировало, что метод электроспиннинга привлек к себе внимание сравнительно недавно [1]. Ультратонкие волокна уже были успешно получены более чем из ста полимеров. Нановолокна идеально подходят для создания комплексных матриц, которые могут сымитировать структурную и биологическую функции естественной клеточной матрицы (ECM). Человеческие клетки могут подключаться и хорошо организовываться вокруг волокон с диаметрами меньше их собственного [2]. В шаблонах изготовленных из нановолокон создаются оптимальные условия для засева и роста клеток. Конкретный интерес в проектировании тканей – это создание биоматричных смесей для регенерации различных тканей. Совсем недавно внимание учёных стали привлекать биополимеры, волокна сделанные из них более всего подходят для изготовления клеточных матриц [3]. Преобразование биополимеров в волокна и сети, повышает их способность имитировать морфологические характеристики исконных биологических структур [4]. 1.1 Принцип метода электростатического формования Чтобы процесс начал выполняться, необходимы три компонента: источник высокого напряжения, капиллярная трубка с пипеткой 1 или иглой небольшого диаметра, и электростатическом формовании металлический собирающий экран. В высокое напряжение используется для создания электрически заряженных нитей раствора полимера, вытекающих из капиллярной трубки. Перед достижением собирающего экрана, растворитель испаряется, а сам полимер затвердевает, и собирается в небольшие взаимосвязанные волокна. Один электрод установлен в капиллярную иглу, а другой приложен к коллектору. В большинстве случаев, коллектор просто заземлен. Раствор в трубке удерживается с помощью своего поверхностного натяжения, образуя ровную поверхность жидкости. После возрастания электрического напряжения, поверхность жидкости в конце капиллярной трубки начинает удлиняться, и приобретает коническую форму, известную как конус Тэйлора. При дальнейшем увеличении напряжения, достигается критическая величина, при которой отталкивающее электростатическое усилие преодолевает поверхностное натяжение, и заряженные капельки раствора извлекаются из иглы. После происходит процесс элонгации нитей, растворитель испаряется и получается волокно. Из полимеров, расплавленных при высокой температуре, также могут быть получены нановолокна методом ЭСФ. Тем не менее, в отличие от формования из растворов, процесс для расплава полимера должен выполняться в вакууме. А именно: капиллярная трубка, расстояние между электродами, и металлический собирающий экран должны быть изолированы в пределах вакуума. Нановолокна из расплавов были получены для меньшего количества полимеров. 1.2 Исследования параметров влияющих на процесс ЭСФ Множество параметров может повлиять на преобразование раствора полимера в нановолокна через ЭСФ. К таким параметрам относятся: (a) свойства растворов - вязкость, эластичность, удельная электропроводность, и поверхностное натяжение, (b) переменные - гидростатическое давление в капиллярной трубке, электрический потенциал на капиллярном конце, и расстояние между трубкой и собирающим экраном, (c) параметры 2 окружающей среды - температура, влажность, и скорость потоков воздуха в лаборатории. Влияние этих параметров на процесс образования волокон было исследовано, для других полимеров. Например, раствор окиси этилена в этаноле при вязкости в диапазоне от 1 до 20, и поверхностном натяжении от 35 до 55 был пригоден для образования волокон. При вязкости раствора более 20 процесс не шёл из-за сильной густоты раствора, а при слишком малой вязкости <1 наблюдалось большое количество капелек. Аналогичный опыт был проведён для раствора ацетата целлюлозы в ацетоне. Он дал результат, что вязкость между 1.2 и 10.2 были оптимальными. При вязкости раствора <1.2 он расходился в капли, и нить не тянулась. Таким образом, было показано влияние концентрации раствора на электростатическое формование Учёными были сформированы главные цели, которые должны быть достигнуты в последнее время: (1) диаметры волокон должны стать последовательными и управляемыми, (2) поверхность волокон должна быть без дефектов и (3) непрерывные одиночные волокна должны быть выровнены и собраны. Одна из наиболее важных характеристик производимых волокон связанных с ЭСФ – это их диаметр. Поскольку нановолокна получаются из жидких летящих струй раствора полимера, с которых испаряется растворитель, волоконные диаметры первоначально будут зависеть от размеров этих струй, а также от содержания полимера в них. На расстоянии между капиллярной иглой и собирающим коллектором первичная струя раствора может, быть разделена на многочисленные волокна меньших диаметров. Вязкость раствора это значимый параметр оказывающий своё влияние на диаметр волокон. Более высокая вязкость заканчивается большим диаметром волокна. Тем не менее, когда твердый полимер растворен в растворителе, вязкость раствора прямо пропорциональна концентрации полимера. Таким образом, более высокая концентрация полимера, даёт большие результирующие диаметры волокон. Опытным путём Дэйтзел 3 отметил, что волоконный диаметр возрастал при увеличении концентрации полимера. Также Демиром было обнаружено, что волоконный диаметр был пропорционален кубической концентрации полимера. Другой параметр который значительно влияет на диаметр и протяженность волокон – это электрическое напряжение приложенное к капилляру. Более высокое поданное напряжение извлекает больше жидкости из трубки, в результате волокна получаются большего диаметра. Другая проблема, с которой столкнулись ученые, изучающие процесс «electrospinning» - это образование цепочек (капелек большего диаметра включённых в нить). Обнаружено, что концентрация полимера также влияет на образование цепочек, Фонг показал, что более высокая концентрация полимера даёт малое количество цепочек. В его экспериментах с PEO, была использована концентрация полимера 1-4.5 %. Полученные волоконные мембраны были изучены под электронным микроскопом. Были сделаны выводы что с 4 % концентрацией PEO цепочки полностью не исчезают, а их диаметр увеличивается. Доши и Ренекер отметили, что уменьшая поверхностное натяжение раствора полимера, волокна могут получаться без цепочек. Признано, что поверхностное натяжение зависит от типа растворителя. Разные растворители по-разному действуют на поверхностное натяжение раствора полимера. Тем не менее, существует самый низкий предел поверхностного натяжения, ниже которого процесс ЭСФ уже не возможен. В своей работе с ацетатом целлюлозы, Лью в качестве растворителя были выбраны ацетон, диметилацетамид, и смесь обоих растворителей. Использованный ацетон имел величину поверхностного натяжения 23.7 dyne/cm это ниже, чем диметилацетамид, поверхностное натяжение которого было 32.4 dyne/cm. Но, используя эти растворы, не удалось получить волокна свободные от цепочек. Тем не менее, используя смесь этих растворителей с пропорциями 2 (ацетон) к 1 (диметилацетамид), Лью получил нановолокна без цепочек при диапазоне концентрации 15-25 %. В растворителе с пропорциями 10:1 и 4 концентрацией 15 % раствора ацетата целлюлозы, были сгенерированы волокна с очень плавной поверхностью и однородным диаметром около 700 нм. Кроме того, добавление разных материалов наполнителей в раствор полимера тоже даёт возможность получать волокна без цепочек. Зонг провёл такой эксперимент с биодеградируемым полимером (PLDA) [2]. Он обнаружил, что при добавлении 1% солей в раствор с полимером, на полученных нитях отсутствовали цепочки. Он доказал, что добавление солей дает более высокую плотность раствора на поверхности летящей нити в течение формования, но для запуска процесса требуется больше энергии. Дэйтзелом было исследовано влияние электрического напряжения на морфологию нитей. Более высокие силы элонгации нитей обусловлены более высоким электрическим напряжением, нити имеют ровную поверхность и небольшой диаметр, но дальнейшее увеличение напряжения делает нити более грубыми. Но это, тем не менее, не подразумевает, что чем выше электрическое напряжение то все волокна будут без дефектов. 1.3 Сферы применения полимерных нановолокон 1.3.1 Изготовление фильтров Из нановолокон полученных методом электростатического формования могут быть изготовлены фильтры с очень высокой степенью фильтрации [5]. Эффективность фильтрации, тесно связана с тонкостью волокон тонкостью, один из наиболее важных параметров учитывающихся при производстве фильтра. В промышленности, давно уже присутствует необходимость в фильтрующих материалов, для очистки воздуха. Фильтры должны захватывать масляные капельки диаметром от 0.3 микронов. Метод ЭСФ даёт возможность материалы, со свойствами задержки частиц в субмикронном диапазоне. Такие частицы могут быть захвачены только структурами, приближёнными к ним по размерам. Нановолокна как раз подходят для этой роли, их высокая площадь поверхности в единице объема даёт высокую поверхностную связность. 5 Дополнительно к более традиционной цели в фильтрации, нановолоконные мембраны, изготовленные из специфических полимеров или покрытые специальными агентами могут быть использованы как молекулярные фильтры и для обнаружения химических веществ [6]. 1.3.2 Применение в биологии и медицине. С биологической точки зрения, почти все человеческие ткани представляют из себя нановолоконные формы и структуры. Такие как дентин, коллаген, хрящи, и кожа. Все они охарактеризованы организованными иерархическими волокнистыми структурами. В связи с этим полимерные нановолокна имеют широкие перспективы применения в различных биомедицинских областях и биоинженерии [7]. 1.3.2.1 – Медицинское протезирование Протезы, изготовленные из полимерных нановолокон могут широко использоваться в протезировании сосудов [8]. Также они подходят для нанесения ультратонких покрытий на протезы и импланты, для повышения их биосовместимости. 1.3.2.2 – Матрицы для культивирования клеток Ультратонкие волокна идеально подходят для создания комплексных матриц, которые могут сымитировать структурную и биологическую функции естественной клеточной матрицы (ECM). Человеческие клетки могут подключаться и хорошо организовываться вокруг волокон с диаметрами меньше их собственного. В шаблонах изготовленных из нановолокон создаются оптимальные условия для засева и роста клеток. Конкретный интерес в проектировании тканей – это создание биоматричных смесей для регенерации различных тканей [9]. Совсем недавно внимание учёных стали привлекать биополимеры, волокна сделанные из них более всего подходят для изготовления клеточных матриц. Преобразование биополимеров в волокна и сети, повышает их способность имитировать морфологические характеристики исконных биологических структур. 6 1.3.2.3 – Заживление ран и ожогов Полимерные нановолокна могут также использоваться для обработки ран или ожогов человеческой кожи. Было разработано устройство с уникальными характеристиками, с помощью электрического поля, тонкие волокна биодеградируемых полимеров могут непосредственно разбрызгиваться на поврежденные участки кожи, для формирования волокнистой плёнки, которая позволяет излечивать раны, способствуя образованию нормального роста кожи и устранению шрамов, которые образуются при традиционной обработке [1]. В образованной плёнке обычно имеются небольшие поры, размеры которых 500 нм, это достаточно, чтобы защищать рану от бактериального проникновения. 1.3.2.4 – Дозировка лекарств Дозировка лекарств и фармацевтических препаратов в наиболее физиологически нановолокна приемлемом могут способе использоваться для для пациентов. изолирования Полимерные лекарственных препаратов, обеспечивая их дозированный выход, пригодный для пациента [9]. Поставка лекарства основана на принципе, что показатель растворения лекарства возрастает с повышением поверхностной области, как лекарства, так и соответствующего носителя. 1.3.2.5 – Изготовление защитной одежды Нановолокна солдатской повышают системы защиты боевую против эффективность ядерного, индивидуальной биологического, и химического оружия. Они могут служить материалами для изготовления, противогазов и защитной одежды с конкретной функцией против средств химической войны (таких как зарин, иприт и др.) и использоваться в армии, а также гражданским населением при террористических атаках. Абсорбенты из древесного угля имеют недостатки с точки зрения водной проницаемости, вода задерживается ими, тем самым увеличивает вес одежды. Из-за большой поверхностной области, ткани из нановолокон способны нейтрализовать химические агенты, сохраняя при этом полную воздушную и водную 7 проницаемость одежды. Такие материалы имеют высокую пористость, но очень небольшой размер поры, это свойство и обеспечивает сопротивление вредным химическим веществам, поступающим из окружающей среды в виде паров или аэрозолей [1]. Предварительные исследования показали чрезвычайную эффективность таких тканей, в изготовлении ловушек для паров и аэрозолей [5]. 8 1. Z. Huang, A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites / Huang, Z. - Composites Science and Technology – 2003 - № 63 – p. 22232253. 2. R. Murugan and S. Ramakrishna, Nano-featured scaffolds for tissue engineering: a review of spinning methodologies / Murugan R. and Ramakrishna S. - Tissue Engineering – 2006 - №12 p. 435–467. 3. Ying, T.H. et al. Scaffolds from electrospun polyhydroxyalkanoate copolymers: fabrication, characterization, bioabsorption and tissue response / T.H. Ying. – Biomaterials – 2008 - № 29 p.1307-17. 4. Rai, R., Keshavarz, T., Roether, J. a, Boccaccini, a R. & Roy, I. Medium chain length polyhydroxyalkanoates, promising new biomedical materials for the future / R. Rai, T. Keshavarz, J. Roether, R. Boccaccini, & I. Roy. - Materials Science and Engineering: R: Reports – 2011 - № 72 – p. 29-47. 5. Gopal, R. et al. Electrospun nanofibrous filtration membrane / R. Gopal. - Journal of Membrane Science – 2006 - № 281 – p. 581-586. 6. Homaeigohar, S.S., Buhr, K. & Ebert, K. Polyethersulfone electrospun nanofibrous composite membrane for liquid filtration / S.S. Homaeigohar, K. Buhr, K. Ebert. - Journal of Membrane Science – 2010. - №365 – p. 68-77. 7. Liao, S., Chan, C. & Ramakrishna, S. Stem cells and biomimetic materials strategies for tissue engineering / S. Liao, C. Chan & S. Ramakrishna. - Materials Science and Engineering - 2008. № 28 – p. 1189-1202. 8. Huang, C. et al. Colloids and Surfaces B : Biointerfaces Electrospun collagen – chitosan – TPU nanofibrous scaffolds for tissue engineered tubular grafts / C. Huang et al. - Colloids and Surfaces - 2011. - № 82 – p. 307-315. 9. Sill T.J., Recum von H.A., Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering / T.J. Sill, H.A. von Recum. - Biomaterials – 2008. - №29. 9