1 На правах рукописи КРЫЛОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА
реклама
1 На правах рукописи КРЫЛОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА Клеточные и молекулярные механизмы противовирусной защиты при клещевом энцефалите 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 03.02.02 - вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна доктор медицинских наук, академик РАМН Беседнова Наталия Николаевна Официальные оппоненты: Бляхер Мария Сергеевна – доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Калюжин Олег Витальевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Карганова Галина Григорьевна – доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биологии арбовирусов ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук Ведущая организация: ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится 17 апреля 2014 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук, по адресу: г. Москва, Малый Казенный переулок, д.5А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН Автореферат разослан «___» ______________2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.В. Яковлева 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Многолетнее изучение клещевого энцефалита (КЭ) позволило решить целый ряд фундаментальных вопросов этой патологии. Установлены этиология и основы патогенеза, описаны клинические проявления заболевания, разработаны методы диагностики и лечения, внедрен ряд профилактических мероприятий. Однако до сих пор эта нейроинфекция остается одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций на Евразийском континенте (Злобин В.И., 2010; Погодина В.В., 2010; Ястребов В.К., 2012; Lindquist L. et al., 2008; Weidmann M. et al., 2011). Несмотря на проводимые санитарно-противоэпидемические мероприятия и на снижение уровня заболеваемости, наблюдаемое с начала XXI века, количество ежегодно регистрируемых случаев заболевания КЭ в Российской Федерации (РФ) остается высоким. Расширяется нозоареал инфекции, увеличивается число случаев КЭ среди городского населения, остаются высокими инвалидизация переболевших и число летальных исходов (Роспотребнадзор по РФ, 2013). В Приморском крае за последние пять лет (2008 – 2012 гг.) уровень заболеваемости КЭ находился в пределах общероссийских показателей – от 1,5 до 2,9 на 100 тыс. населения (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013), однако показатели летальности в Приморском крае в 2012г. (3,4%) в 2,4 раза превышали таковые по РФ (1,4%). Летальные случаи при КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно и составляют от 3,4% до 15,9%. Необходимо отметить наличие заболеваемости КЭ у лиц, ранее привитых от этой инфекции: в РФ уровень заболеваемости населения, вакцинированного от КЭ, в 2012 г. составлял 3,9%, в Приморском крае – 3,4 % (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013). В последнее десятилетие в Приморском крае, как и в целом по РФ, наблюдается изменение клинической картины КЭ, связанное с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012 г. число заболевших лихорадочной формой КЭ в крае составило 58,6%, инаппарантной - 17,2%, 4 менингеальной – 13,8%, очаговой – 10,3% (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013). Кроме того, следует отметить чёткую тенденцию к увеличению случаев длительной персистенции антигена вируса КЭ, выраженность клинических проявлений которой может варьировать от бессимптомного носительства до манифестации процесса (Насырова Р.Ф. и др., 2006; Зима А.П., 2008; Удинцева И.Н., 2010). Известно, патологического что клинический процесса во полиморфизм многом обусловлен заболевания и исход иммуноопосредованными механизмами, играющими существенную роль в патогенезе инфекции (Ратникова Л.И. и др., 2002; Tigabu B. et al., 2009; Ruzek D. et al., 2010, 2011). Однако, несмотря на проводимые исследования, функциональное состояние врожденного и адаптивного иммунитета на начальном этапе развития различных вариантов инфекционного изученным. процесса, Практически вызванного не вирусом исследованы КЭ, остается особенности недостаточно функционирования иммунной системы вакцинированных пациентов при инфицировании и заболевании КЭ. Большинство авторов, описывающих явление клинического полиморфизма КЭ, связывают его с генотипической и фенотипической вариабельностью региональных популяций вируса КЭ (Злобин В.И. и др., 2003; Погодина В.В. и др., 2007; Леонова Г.Н., 2007; Карганова Г.Г., 2009). К началу выполнения настоящей работы отсутствовали данные о взаимодействии штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с рецепторным аппаратом клеток врожденного и адаптивного иммунитета, не было сведений о влиянии этих штаммов на динамику продукции цитокинов. Это обусловило необходимость изучения способности штаммов вируса КЭ к модуляции иммунокомпетентных клеток на начальных этапах инфицирования и их влияния на последующее развитие инфекционного процесса. Основными нерешенными проблемами этиотропной терапии КЭ в современных условиях являются ее недостаточная эффективность и вероятность развития побочных эффектов (Иерусалимский А.П., 2001; Жукова Н.Г., 2002; 5 Скрипченко Н.В. и др., 2005; Конькова-Рейдман А.Б., 2009). В этой связи, поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние, остается актуальным. В настоящее время интерес ученых направлен на освоение и изучение морских гидробионтов в качестве источников получения новых биологически активных веществ. Среди природных морских биополимеров несомненный интерес представляют тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарин – полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae. Эти биополимеры обладают широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами (Беседнова Н.Н., 2004; Эпштейн Л.М. и др., 2004; Запорожец Т.С., 2007; Попов А.М. и др., 2009; Кривошапко О.Н., 2012), что явилось основанием для изучения эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ и для обоснования возможности их применения в комплексной терапии КЭ. Вышеизложенное определяет актуальность и необходимость изучения иммунных механизмов начального этапа инфекционного процесса, обусловленного штаммами вируса КЭ, что создает предпосылки для разработки иммунологических подходов к ранней диагностике, прогнозу, лечению и профилактике заболевания. Цель исследования: изучить клеточные и молекулярные иммуноопосредованные механизмы начального этапа инфекционного процесса, индуцированного штаммами дальневосточного субтипа вируса КЭ и установить роль этих механизмов в последующем формировании противовирусной защиты. Задачи исследования: 1. Определить варианты развития инфекционного процесса у пациентов с КЭ на эндемичной территории Приморского края Дальнего Востока. 2. Дать комплексную оценку состояния врожденного и адаптивного иммунитета у вакцинированных и невакцинированных пациентов на ранней стадии 6 инфицирования вирусом КЭ и установить иммунологические маркеры риска, предопределяющие длительную персистенцию возбудителя в организме; 3. Провести сравнительное изучение факторов клеточной и гуморальной защиты у привитых и непривитых пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде инфекционного процесса и определить иммунопатогенетические критерии тяжести течения и исхода заболевания; 4. Исследовать в экспериментах (ex vivo, in vitro и взаимодействия штаммов вируса КЭ дальневосточного in vivo) процесс субтипа с разной молекулярно-генетической характеристикой и биологическими свойствами с иммунокомпетентными клетками, используя в качестве критериев оценки экспрессию адгезивных и активационных молекул на поверхности клеток врожденного и адаптивного иммунитета; 5. Изучить на культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров, а также в крови и мозге мышей линии BALB/c инфекционный потенциал и цитокин-индуцирующую способность разных штаммов ВКЭ; 6. Дать сравнительную оценку эффективности некоторых официнальных препаратов и новых биологически активных веществ из морских гидробионтов (люромарин, тинростим) по отношению к вирусу КЭ на экспериментальных моделях in vitro и in vivo. Научная новизна исследования На основе комплекса полученных данных существенно расширена концепция иммунопатогенеза КЭ. Представлены данные о роли клеточно-молекулярных иммуноопосредованных механизмов начального этапа инфекционного процесса, индуцированного штаммами вируса КЭ дальневосточного субтипа, и последующего развития и исхода вирусной инфекции. На раннем этапе инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ выявлены различия в механизмах элиминации патогена, связанные с величиной антигенной нагрузки и особенностями активации иммунной системы. Установлено, что у невакцинированных пациентов с невысоким уровнем антигенемии ВКЭ 7 происходит активация ключевых эффекторов врожденного иммунитета (NK-, NKTклеток, IFNα), обусловливающая быструю элиминацию патогена, тогда как отсутствие их активации и более высокий уровень антигенемии приводит к длительной персистенции возбудителя. В остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ (лихорадочная, очаговые) выявлены значимые различия в субпопуляционном составе лимфоцитов, степени активации гуморального иммунитета, изменениях цитокинового профиля. Установлены иммунологические критерии, предопределяющие тяжелое течение КЭ: доминирование гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижение количества Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности. Показано, что у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, различное течение инфекционного процесса (быстрая или замедленная элиминация антигена ВКЭ, или легкое течение лихорадочной формы КЭ) определяется разной эффективностью поствакцинального вирусспецифического иммунного ответа и степенью активации эффекторной фазы адаптивного иммунитета, индуцированной вирусом. Установлено, что штаммы вируса КЭ, изолированные от пациентов с разными клиническими формами заболевания, в экспериментах ex vivo, in vitro, in vivo проявляют репродукции, различные биологические нейроинвазивность). свойства Способность (вирулентность, штаммов скорость разнонаправленно модулировать ранние этапы активации иммунокомпетентных клеток (экспрессию молекул CD11b, ICAM-1, CD69, CD25, CD95) и последующую продукцию цитокинов (IL-8, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6 и IL-10) оказывает существенное влияние на разнообразие течения и исходов инфекционного процесса. В экспериментах установлена вирусингибирующая и протективная активность в отношении вируса КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами. Их комбинированное применение с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) усиливает 8 протективный эффект, что свидетельствует о перспективности использования такой терапии при КЭ. Практическая значимость работы Полученные данные о начальных этапах иммунной защиты против вируса КЭ позволяют расширить стратегию прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса с целью своевременного проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений. Выявлены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать: на ранней стадии инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ замедленную элиминацию возбудителя, а в острой фазе заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ - тяжесть течения и исход вирусной инфекции. Показано, что наличие высокого уровня вирусспецифического иммунного ответа, обусловленного вакцинацией, является важным фактором, способным предотвратить заболевание КЭ, обеспечить быструю элиминацию вируса или легкое течение этой нейроинфекции. Полученные данные о различной способности штаммов ВКЭ модулировать рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию этими клетками цитокинов не только расширяют знания о патогенезе при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, но и открывают перспективы для новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Моделирование ex vivo взаимодействия штаммов ВКЭ с рецепторным аппаратом иммунокомпетентных клеток может быть использовано как при изучении функциональной активности клеток, участвующих в инфекционном процессе, так и для направленного поиска терапевтических средств, влияющих на инфицированные вирусом клетки-мишени. Возможность динамического мониторинга функционального состояния иммунокомпетентных клеток, инфицированных ex vivo, может быть использована и при других вирусных инфекциях. В экспериментах in vitro и in vivo показана перспективность использования в комбинированной терапии КЭ биополимеров из морских гидробионтов - 9 люромарина и тинростима, обладающих противовирусной активностью в отношении ВКЭ, а также иммуномодулирующими свойствами, что позволяет сочетать этиотропное и патогенетическое лечение данной вирусной инфекции. Основные положения, выносимые на защиту 1. На ранней стадии инфекционного процесса у пациентов, невакцинированных и вакцинированных против КЭ, выявлены различия в функциональной активности эффекторной фазы врожденного иммунитета: невысокая антигенная нагрузка и активации клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета способствует быстрой элиминации вируса; высокий уровень антигенемии и отсутствие активации врожденного иммунитета являются предикторами длительной персистенции вируса. 2. При манифестных формах КЭ в остром периоде заболевания умеренная активация клеточного, гуморального и цитокинового иммунного ответа у невакцинированных, предопределяет а также развитие вакцинированных более легкого против КЭ течения пациентов заболевания. Иммунопатогенетическими предикторами развития тяжелого течения КЭ являются: снижение содержания CD3+-, CD4+-Т-лимфоцитов, NK-клеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества В-лимфоцитов, увеличение концентраций цитокинов (IL-4, IL-10) и высокий уровень вирусспецифических IgM. 3. Штаммы вируса КЭ, изолированные от больных с разными клиническими формами инфекции, в зависимости от молекулярно-генетической характеристики и биологических свойств разнонаправлено модулируют рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию цитокинов. Высоковирулентный штамм ex vivo снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных (CD69, CD25, CD95) молекул на клетках врожденного и адаптивного иммунитета и in vivo индуцирует высокий уровень системного и локального цитокинового ответа (TNFα, IL-6, IFNγ). Слабовирулентные штаммы ex vivo усиливают экспрессию молекул адгезии и активации и in vivo стимулируют высокий уровень продукции IL-10. 10 4. Биополимеры из морских гидробионтов - люромарин и тинростим с широким спектром биологического действия и иммуномодулирующими свойствами, проявляют in vitro и in vivo вирусингибирующую и протективную активность в отношении вируса КЭ. Экспериментально обоснована эффективность использования этих иммуномодуляторов в комплексной терапии КЭ. Личный вклад автора Автором разработан дизайн исследования, проведено изучение иммунного и цитокинового статуса пациентов, выполнены экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов, подготовлены публикации по теме диссертации. Апробация материалов диссертации Основные положения межрегиональной и результаты конференции с работы были представлены международным на участием «Вакцинопрофилактика: проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), 4-ой межгосударственной научнопрактической конференции государств -участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), 6-ом конгрессе Северо-Балтийских стран по инфекционным болезням (Паланга, Литва, 2004), конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), 4-ой научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), международной научнопрактической конференции «Здоровье и образование» (Таиланд, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке» (Томск, 2006), X Международном симпозиуме по клещевым заболеваниям (Вена, 2009), III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011), XV Международном конгрессе по вирусологии (Саппоро, 2011), Всероссийских 11 форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008, 2009), юбилейных конференциях, посвященных 75-летию открытия клещевого энцефалита (Иркутск, 2012; Хабаровск, 2012; Москва, 2013). Апробация диссертации состоялась 22 октября 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 10 декабря на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 2 монографии, получено 3 патента на изобретение. Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ «Молекулярно-генетическая, биологическая и патогенетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита» (№ 4006 2010-2012 гг.). Объем и структура диссертационной работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 497 источников, из которых 175 работ отечественных и 322 зарубежных авторов. Работа изложена на 271 странице машинописного текста и иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Экспериментальные и клинико-лабораторные исследования проведены на базе лабораторий клещевого энцефалита и иммунологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН. Отдельные разделы работы выполнены в комплексе с лабораторией биотехнологии ФГБУН «Тихоокеанского института биоорганической химии имени Г.Б. Елякова» ДВО РАН, Центром по 12 борьбе с клещевым энцефалитом в Приморском крае и инфекционным отделением краевой клинической больницы № 2. Материалы исследования Клинический материал. В настоящей работе приведены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов с КЭ, наблюдавшихся в период 2008-2012 гг. (рис. 1). Пациенты с клещевым энцефалитом (n=252) Пациенты с манифестными формами КЭ (n=67) Пациенты с антигенемией ВКЭ (без клинических проявлений) (n=185) Пациенты с кратковрем. антигенемией (n=144) Невакц. (n=93) Вакц. (n=51) Пациенты с длител. антигенемией (n=44) Невакц. (n=30) Вакц. (n=11) Пациенты с лихорад. формой (n=45) Невакц. (n=28) Вакц. (n=17) Пациенты с очаг.формами (благ.исход) (n=16) Невакц. (n=16) Вакц. (n=0) Пациенты с очаг.формами (летал.исход) (n=6) Невакц. (n=6) Вакц. (n=0) Рисунок 1. Группы пациентов с клещевым энцефалитом, включенные в обследование Было обследовано 252 человека (141 мужчин и 111 женщин) в возрасте от 18 до 60 лет с верифицированным диагнозом КЭ (инаппарантная, лихорадочная и 13 очаговые формы) и отсутствием сопутствующих других клещевых инфекций. Контрольную группу составили 25 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (14 мужчины и 11 женщин в возрасте от 20 до 55 лет). Диагнозы инаппарантной и манифестных форм КЭ (рубрика А 84.0 по МКБ 10) устанавливали результатов на основании специфического клинико-эпидемиологических обследования (наличие антигена данных и вируса и вирусспецифических антител классов IgM и IgG). В зависимости от диагноза КЭ обследованные пациенты были разделены на две группы: первую группу составили 185 пациентов без клинических проявлений заболевания, вторую – 67 больных с манифестными формами КЭ. специфической противовирусной Обследование и проводили иммунокорригирующей до назначения терапии. Для иммунологических и вирусологических исследований использовали венозную кровь пациентов, взятую на 2 – 4 сутки после укуса клеща либо в острый период (первая неделя) заболевания. Лабораторные животные. Экспериментальные исследования выполнены на 480 мышах линии BALB/c (гаплотип Н-2d), а также на 1660 неинбредных мышах, полученных из питомника РАМН «Столбовая», возраст животных-самцов составил 2-3 месяца, масса 10-12 г. Региональные штаммы вируса КЭ. Использованы дальневосточные штаммы вируса КЭ - Dal´negorsk (Dal), Kiparis-94 (Kip-94), Primorye-196 (P-196), изолированные сотрудниками лаборатории КЭ НИИЭМ СО РАМН из разных источников в разных районах Приморского края. Штамм Dal (GeneBank - FJ402886) выделен из мозга умершего больного с очаговой формой КЭ. Штамм Kip-94 (GeneBank -JQ825146) изолирован из лейкоцитов крови больного с лихорадочной формой КЭ. Штамм P196 (GeneBank -JQ825155) выделен из лейкоцитов крови человека с инаппарантной формой КЭ. В работе использованы 5-6 пассажи этих штаммов вируса КЭ на мышах двухсуточного возраста. 14 Культура клеток. Титрование штаммов, реакцию нейтрализации и определение противовирусной активности препаратов in vitro проводили на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ). Исследуемые препараты. Выделение, изучение химического состава и структуры биополимеров из морских гидробионтов проведены в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (люромарин) и ФГУП Тихоокеанском рыбохозяйственном научном центре (тинростим) с применением современных методов. Люромарин - полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae (Z. marina и Z. asiatica) (Попов А.М. и др., 2010), содержит розмариновую кислоту (45%), дисульфат лютеолина (45%) и лютеолин (10%). Метод выделения – экстракция морских трав семейства Zosteraceae 96% этиловым спиртом и очистка целевого продукта на гидрофобном сорбенте (Патент РФ 2432959). Тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister (Эпштейн Л.М. и др., 2004), содержит 84% низкомолекулярных пептидов молекулярной массой от 1 до 12,5 кДа и >16% свободных аминокислот, представленных, в основном, аспарагиновой, глутаминовой кислотой и лизином. Метод выделения - экстракция водорастворимых пептидов в слабокислых использованием растворах ступенчатой с последующим ультрафильтрации, извлечением позволяющей их с разделять и концентрировать пептидные компоненты в зависимости от молекулярной массы (Патент РФ 2222337). Для сравнительной оценки эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ были использованы официнальные препараты, применяемые в клинике для лечения КЭ: рибавирин – синтетический аналог нуклеозидов (ЗАО «Вертекс», Санкт-Петербург); противоклещевой иммуноглобулин – антитела против клещевого энцефалита класса IgG, титры не менее 1:80 (НПО «Микроген», Хабаровск); реаферон-ЕС – рекомбинантный альфа-2b-интерферон (ЗАО «Вектор- 15 Медика», Новосибирск); циклоферон - метилглюкамина акридонацетат (ООО НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург); 4-йодантипирин - 1-фенил-2,3-диметил-4йодпиразолон (ООО «НТМ», Томск). Таблица 1. № 1 2 3 Направление исследования Методы исследования Методы исследования Объем исследований Верифицирова- 1. Для выявления антигена вируса КЭ в лейкоцитах крови 420 проб ние диагноза КЭ использовали экспресс-диагностику КЭ [патент 2217758] при помощи иммуноферментной тест-системы «ВектоВКЭантиген» («Вектор-Бест», Новосибирск). 2. Вирусспецифические антитела класса IgG и IgM 336 проб определяли в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «ВектоВКЭ-IgG» и «ВектоВКЭ-IgM» («Вектор-Бест», Новосибирск). 3. Авидность вирусспецифических антител класса IgG 336 проб определяли в сыворотке крови при использовании модифицированного варианта ИФА, выполняемого на тестсистемах «ВектоВКЭ-IgG» («Вектор-Бест», Новосибирск) [Распопин В.В. и др., 2007]. 4. Определение вируснейтрализующих антител в сыворотке 185 проб крови проводили в реакции нейтрализации на перевиваемой культуре клеток СПЭВ [Гайдамович С.Я., 1991]. Исследование 1.Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической 530 проб показателей крови определяли методом проточной цитометрии иммунного (FACSCalibur, BD) с использованием мАТ к CD3, CD4, CD8, статуса CD16, CD19, CD25, CD95, HLA-DR (Beckman Coulter) пациентов [Пинегин Б.В., 2001; Shapiro J.M., 2003]. 2. Исследование основных классов иммуноглобулинов в 530 проб сыворотке крови (IgG, IgM, IgA) методом радиальной иммунодиффузии [Manchini G.et al., 1964]. 3. Определение концентрации подклассов иммуноглобулина 530 проб IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «Подклассы IgG-ИФА-Бест» («Вектор-Бест», Новосибирск). 4. Исследование концентрации компонентов комплемента (С1-инг, C3, C3a, C4, C5, C5a) в сыворотке крови с помощью 530 проб иммуноферментных тест-систем для определения уровней компонентов комплемента человека («Цитокин», СанктПетербург). 5. Определение уровня и размеров ЦИК в сыворотке крови [Гриневич Ю.А., Алферов А.Н., 1981; Стручков П.В. и др., 530 проб 1985]. Исследование 1. Исследование концентрации цитокинов (IL-8, TNFα, IL- 530 проб показателей 1β, IFNα, IFNγ, IL-6, IL-4, IL-10) в сыворотке крови с цитокинового помощью иммуноферментных тест-систем для определения статуса уровней цитокинов человека («Цитокин», Санкт-Петербург). 16 пациентов 4 5 6 Моделирование инфекции КЭ ex vivo Моделирование инфекции КЭ in vitro Моделирование инфекции КЭ in vivo 2. Определение продукции цитокинов в культурах клеток цельной крови [De Groote D. et al., 1992] с помощью иммуноферментных тест-систем для определения уровней цитокинов человека («Цитокин», Санкт-Петербург). 1. Пробы цельной гепаринизированной крови здоровых доноров (n=10) инфицировали 2 lg ТЦД50/0,1мл штаммов Dal и P-196 вируса КЭ. Культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 24 часов. 2. Определение динамики накопления штаммов ВКЭ в клетках донорской крови непрямым методом флюоресцирующих антител с использованием антивидовых флуоресцирующих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человека («Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва) [Гайдамович С.Я., 1991]. 3. Исследование динамики репродукции штаммов ВКЭ в супернатантах клеток цельной крови (титрование на культуре клеток СПЭВ). 4. Исследование экспрессии активационных и адгезионных маркеров на иммунокомпетентных клетках донорской крови методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD) с использованием мАТ к CD45, CD14, CD3, CD4, CD8, CD56, CD11b, CD54, CD69, CD25, CD95 (Beckman Coulter) [Пинегин Б.В., 2001; Shapiro J.M., 2003]. 1. Выделение, культивирование и инфицирование клеток: - Мононуклеарные клетки периферической крови получали из периферической крови здоровых доноров (n=10) центрифугированием с использованием градиента фиколлверографина («Pharmacia»). - Мононуклеарные клетки инфицировали 2 lg ТЦД50/1х106 клеток штаммов (Dal, Kip-94, Р-196) вируса КЭ и культивировали в полной питательной среде: RPMI-1640 («Serva») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma»), L-глутамина («ПанЭко») и антибиотиков («Pharmacia») в СО2-инкубаторе при 37˚С в течение 5 сут. 2.Исследование динамики репродукции штаммов ВКЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток (титрование на культуре клеток СПЭВ). 3. Определение продукции цитокинов (IL-8, TNFα, IFNα, IFNγ) в культуре мононуклеарных клеток с помощью иммуноферментных тест-систем для определения уровней цитокинов человека («Цитокин», Санкт-Петербург). 1. Мышей линии BALB/c заражали подкожно 3 lg ТЦД50/0,2мл штаммов Dal, Kip-94, P-196 вируса КЭ и разделяли на две подгруппы. Первые подгруппы (n=20 для каждого штамма) служили для контроля летальности, которую оценивали по % погибших животных и средней продолжительности жизни. У животных вторых подгрупп (n=80 для каждого штамма) в течение 21 суток брали образцы мозга и крови. 530 проб 120 проб 120 проб 120 проб 120 проб 270 проб 270 проб 270 проб 480 мышей линии BALB/c 17 7 8 2. Исследование динамики накопления штаммов вируса КЭ в крови и мозге инфицированных мышей (титрование сывороток крови и супернатантов гомогенатов мозга на культуре клеток СПЭВ). 3. Изучение динамики продукции цитокинов (TNFα, IFNγ, IL-6, IL-10) в крови и мозге инфицированных мышей с использованием иммуноферментных тест-систем для определения уровня продукции цитокинов («R&D Systems», США). Исследование 1. Исследование цитотоксичности и ингибирующей противовирус- активности исследуемых препаратов in vitro по отношению к ной активности вирусу КЭ (штамм Dal) на культуре клеток СПЭВ [Хабриев БАВ из морских Р.У., 2005] гидробионтов 2. Исследование протективного действия препаратов in vivo при КЭ (in vitro на мышах, инфицированных подкожно 100 LD50/0,2 мл и in vivo) штамма Dal вируса КЭ [Хабриев Р.У., 2005]. Использована лечебная схема введения препаратов – через 1 час после заражения. Статистический Статистическую обработку полученных данных проводили с анализ помощью пакета программ «Statistica-6» и «Exсel» [Гланц С.А., 1999; Вуколов Э.А., 2004], используя W-критерий Шапиро-Уилка, t-критерий Стьюдента, U-критерий МаннаУитни, критерий Вилкоксона, логранговый критерий z (с поправкой Йетса). 960 проб 960 проб 380 проб 1660 неинбредных мышей РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с антигенемией вируса клещевого энцефалита Для проведения комплексного анализа состояния иммунной системы пациентов в начале инфекционного процесса было обследовано 185 человек, у которых на 2-4 сутки после укуса клеща в лейкоцитах крови выявлен антиген вируса КЭ. Пациенты значимо различались по показателям содержания антигена (p=0,000) и были разделены на две группы: 1-ая группа - 144 человека (уровень антигенемии 2,4±0,6), 2-ая группа - 41 человек (уровень антигенемии 5,8±1,7). В этих группах также значимо различались сроки элиминации возбудителя: при повторном обследовании через 4-5 недель у пациентов 1-ой группы антиген ВКЭ в крови не обнаруживали (кратковременная антигенемия), а у лиц 2-ой группы антиген ВКЭ обнаруживался через 6 и более месяцев (длительная антигенемия). Таким образом, количественный показатель содержания антигена ВКЭ в лейкоцитах крови в первые 18 дни после укуса клеща может стать важным предиктором длительности антигенемии. Среди обследованных пациентов с антигенемией ВКЭ были выявлены лица, вакцинированные против КЭ, в 1-ой группе привитых пациентов было 35,4%, во 2ой - 26,8%. Отличий в содержании антигена у привитых и непривитых лиц обеих групп не зарегистрировано. В 1-ой группе уровень антигенемии у вакцинированных и невакцинированных пациентов составлял 2,3±0,6 и 2,5±0,7 (p=0,182), во 2-ой группе – 5,6±1,7 и 5,9±1,9 (p=0,567), соответственно. В выделенных группах, различающихся по уровню антигенемии ВКЭ и скорости элиминации возбудителя, были изучены особенности реагирования иммунной системы пациентов на ранней стадии инфекционного процесса в ответ на тот или иной уровень антигенемии ВКЭ. При изучении состояния клеточного иммунитета у обследованных пациентов на 2-4 сутки после укуса клеща было установлено, что показатели, характеризующие структуру и соотношение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD4+/CD8+), не отличались у пациентов обеих групп от соответствующих показателей в группе здоровых доноров (p>0,05). Следует отметить более высокий уровень относительного содержания и абсолютного количества В-лимфоцитов (CD3-CD19+) у вакцинированных пациентов 1-ой группы по сравнению с таковым у других обследованных пациентов и здоровых доноров (p≤0,05). В то же время, у пациентов 1-ой группы наблюдались изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, характерные для начальной стадии вирусной инфекции: повышение относительного содержания и абсолютного количества цитотоксических клеток врожденного иммунитета - NK-клеток (15,2±3,8%, 0,33±0,08х109/л и 10,4±2,9%, 0,20±0,06х109/л, p=0,000, соответственно), NKT-клеток (7,0±1,4%, 0,15±0,04х109/л и 4,1±1,2%, 0,06±0,02х109/л, p=0,000) и Тлимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD25 (9,8±2,3%, 0,21±0,06х109/л и 6,9±1,9%, 0,14±0,04х109/л, p=0,000), по сравнению с таковыми у 19 здоровых доноров. У вакцинированных лиц этой группы степень активации Тлимфоцитов имела более выраженный характер: экспрессия CD25 и поздних активационных маркеров HLA-DR и CD95 была выше по сравнению с показателями у здоровых доноров (p≤0,05). В эти же сроки у пациентов 2-ой группы значения показателей, характеризующих структуру субпопуляций лимфоцитов периферической крови, не отличались от таковых у здоровых доноров (p>0,05). При исследовании функциональной активности гуморального иммунитета на ранних стадиях инфицирования ВКЭ у пациентов обеих групп не было зарегистрировано ни вирусспецифических антител класса IgM к антигену ВКЭ, ни клинических проявлений заболевания. В то же время содержание вирусспецифических антител класса IgG, приобретенных на основе предыдущих вакцинаций, у привитых лиц в обеих группах значимо различалось, как по количественным (уровень антител), так и по качественным (авидность антител) параметрам (табл. 2). У вакцинированных лиц 1-ой группы преобладали высокоавидные антитела класса IgG, уровень вирусспецифических антител IgG и вируснейтрализующих антител был значимо выше такового у привитых пациентов 2-ой группы (p=0,000). Таблица 2. Вирусспецифический иммунный ответ на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки после укуса клеща) Группы пациентов с разной длительностью АГ ВКЭ 1 группа 2 группа невакц. (n=93) вакц. (n=51) невакц. (n=30) вакц. (n=11) Уровень вирусспецифических антител IgG ИА IgG, % ВН отриц. 840±168 отриц. 171±43* отриц. 82,8±8,1 отриц. 37,5±3,4* отриц. 56±11 отриц. 13±3* Примечание: ВН – вируснейтрализующие антитела; ИА – индекс авидности антител. Значения ВН и IgG представлены в обратных величинах СГТА (средняя геометрических титров антител). * - значимость различий между показателями в 1-ой и 2-ой группах пациентов (p≤0,05) (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). 20 Установлено, что у пациентов 1-ой и 2-ой групп содержание общих иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) и подклассов IgG1-IgG4 было в пределах нормальных значений. Исключением явились вакцинированные пациенты 1-ой группы, у которых уровни IgG, IgG1 и IgG3 значимо превышали таковые показатели у здоровых доноров и вакцинированных пациентов 2-ой группы (p≤0,05). При изучении цитокинового профиля пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ исследовали концентрацию цитокинов в сыворотке крови пациентов (табл.3) и продукцию цитокинов ex vivo в условиях дополнительной стимуляции митогеном (КонА), клеток. Установлено, характеризуется что умеренным позволяющую оценить резервный потенциал цитокиновый статус пациентов увеличением концентраций 1-ой группы провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα), усилением продукции этих цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток периферической крови. Повышение уровня иммунорегуляторного цитокина IFNγ у вакцинированных пациентов этой группы обусловливает активацию механизмов адаптивного иммунитета, что, в свою очередь, способствует быстрой элиминации вируса КЭ. У пациентов 2-ой группы повышенное содержание в крови противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) указывало на раннюю поляризацию иммунного ответа в сторону Th2-типа. Кроме того, у пациентов этой группы отсутствовало увеличение продукции IFN I и II типа. Вместе взятые, данные показатели являются прогностически неблагоприятным признаком замедленной элиминации вируса. Таким образом, были установлены различия в процессе элиминации антигена вируса КЭ из крови пациентов после присасывания клеща. При невысокой антигенной нагрузке у пациентов на ранней стадии инфицирования запускаются разные иммунологические механизмы: у невакцинированных лиц активируется эффекторная фаза врожденного иммунитета, у вакцинированных лиц наблюдается ранняя активация факторов адаптивного иммунитета, приводящие к быстрому уничтожению и элиминации вируса. Отсутствие ранней активации клеточного, гуморального иммунитета и цитокиновой системы у пациентов с высоким уровнем 21 Таблица 3. Концентрация цитокинов в сыворотке крови пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки) Цитокины (пкг/мл) Зд. доноры (n=25) M±δ IL–8 16,1 ±4,8 24,2±6,2 0,000 19,6±5,0 0,031 IL-1b 25,3±6,3 38,7±9,7 0,000 31,4±9,4 0,021 IFNα 14,3±3,6 21,3±5,1 0,000 18,9±4,7 0,035 TNFα 5,5±1,7 10,9±2,9 0,000 8,0±2,0 0,000 IFNγ 21,3±5,6 26,4±5,9 0,000 32,5±6,8 0,000 IL-6 3,9±1,1 4,2±1,3 0,406 4,0±1,2 0,789 IL-4 5,6±1,7 6,1±1,5 0,153 6,8±2,0 0,016 IL-10 9,4±2,7 9,9±2,5 0,385 10,8±2,7 0,037 TNFα/IL-4 1,0±0,3 1,7±0,5 0,000 1,2±0,3 0,008 IFNγ/IL-4 4,0±1,0 4,3±1,1 0,220 4,8±1,3 0,019 Пациенты с кратковременной антигенемией Невакцинир. (n=93) Вакцинир. (n=51) M±δ p1 M±δ p1 Пациенты с длительной антигенемией Невакцинир. (n=30) Вакцинир. (n=11) M±δ p1, p2 M±δ p1, p2 p1=0,027 p1=0,043 19,1±4,9 20,1±5,0 p2=0,036 p2=0,561 p1=0,020 p1=0,041 29,8±7,4 30,3±7,0 p2=0,039 p2=0,532 p1=0,915 p1=0,715 14,4±3,3 14,8±4,1 p2=0,000 p2=0,010 p1=0,000 p1=0,000 8,2±2,2 8,6±2,4 p2=0,000 p2=0,387 p1=0,201 p1=0,020 23,3±5,8 27,0±8,1 p2=0,007 p2=0,022 p1=0,116 p1=0,348 4,4±1,2 4,3±1,3 p2=0,457 p2=0,461 p1=0,005 P1=0,011 7,1±2,0 7,4±2,2 p2=0,004 P2=0,379 p1=0,002 P1=0,012 12,0±3,1 12,3±3,7 p2=0,000 P2=0,124 p1=0,224 p1=0,106 1,1±0,3 1,2±0,4 p2=0,000 p2=0,998 p1=0,018 p1=0,306 3,3±1,1 3,6±1,2 p2=0,000 p2=0,007 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; p1 – значимость различий между показателями в группах здоровых доноров и пациентов с АГ ВКЭ; p2 – значимость различий между показателями в группах пациентов с различной длительностью АГ ВКЭ (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). 22 антигенемии указывает как на недостаточную активность противовирусного иммунитета у этих пациентов, так и на вирусиндуцированную супрессию иммунного ответа и является предиктором длительной персистенции вируса. Иммунологическими маркерами риска, предопределяющими на ранней стадии инфицирования длительную персистенцию возбудителя в организме, являются следующие показатели: высокий уровень антигенемии ВКЭ, отсутствие повышения уровня NK- и NKT-клеток и активированных Т-лимфоцитов, незначительная стимуляция цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток, активация продукции противовоспалительных цитокинов при отсутствии стимуляции продукции IFN I и II типа. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания Среди 67 обследованных пациентов с зарегистрированным диагнозом КЭ (рубрика А 84.0 по МКБ 10) были выделены 3 группы: 1 группа – больные лихорадочной формой КЭ средней степени тяжести (невакцинированные и вакцинированные); 2 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом; 3 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и летальным исходом. В числе больных КЭ были пациенты, вакцинированные против этой инфекции. В период 2008 - 2012 гг. среди заболевших привитых лиц в 100% были выявлены случаи только лихорадочной формы заболевания. Для тяжести установления течения прогностических инфекции было иммунопатогенетических проведено сравнительное маркеров изучение функциональной активности клеточного и гуморального иммунитета, цитокиновой системы пациентов манифестными формами в остром периоде заболевания КЭ (первая неделя заболевания). В начальные дни заболевания (3-7 день) у пациентов 1-ой группы абсолютное количество лейкоцитов и лимфоцитов находилось в пределах нормальных значений. В этот же период у пациентов 2-ой и 3-ей групп наблюдался умеренный лейкоцитоз (абсолютное количество лейкоцитов составило 9,1±2,3х109/л и 10,2 (8,3-12,2)х109/л, 23 соответственно), а у больных 3-ей группы - относительная лимфопения (абсолютное количество лимфоцитов было - 1,4 (1,1-1,5) х109/л). У пациентов 1-ой группы лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) не отличался от такового у здоровых доноров (0,65±0,15 и 0,51±0,10, p=0,380, соответственно), что свидетельствовало об удовлетворительном состоянии их иммунной системы. Значимое повышение ЛИИ у пациентов с очаговыми формами КЭ (2-ая и 3-я группы) (2,62±0,7 и 6,43 (3,2-8,4), p≤0,05) по сравнению со здоровыми донорами (0,51±0,10) расценивалось как недостаточность иммунной системы. В острый период заболевания у невакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ на фоне относительного Т-клеточного дефицита выявлено увеличение количества активационные антигены лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние (CD3+CD25+, HLA-DR+, CD3+CD95+), и значимое повышение содержания NK- и NKT-клеток (табл. 4). В этот период у привитых лиц с лихорадочной формой КЭ относительное содержание и абсолютное количество CD3+CD19- и CD3+CD4+-лимфоцитов не отличалось от такового у здоровых доноров (p>0,05), и по сравнению с непривитыми лицами этой группы у них зарегистрировано умеренное повышение содержания NK-клеток и В-лимфоцитов. У пациентов с очаговыми формами КЭ выявлено значимое уменьшение относительного содержания и абсолютного количества CD3 +CD19- и CD3+CD4+лимфоцитов, NK-клеток, отсутствовали признаки Т-клеточной активации, кроме того, при летальном исходе у пациентов обнаружено снижение содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+) и экспрессии активационных маркеров по сравнению со здоровыми донорами (p≤0,05). Установленные в настоящем исследовании изменения в субпопуляционном составе Т-лимфоцитов не только подтверждают наличие Т-клеточного дефицита у невакцинированных пациентов с разными формами КЭ, но и позволяют рассматривать эти изменения как дополнительные лабораторные критерии, указывающие на прогрессирование заболевания. Наиболее важным в плане прогноза течения КЭ является определение 24 изменений относительного содержания и абсолютного количества следующих популяций лимфоцитов: CD3+, CD4+, CD8+, NK, CD25+, CD95+ (табл.4). Для верификации КЭ в остром периоде решающее значение имеет обнаружение в крови больных вирусспецифических антител класса IgM. У пациентов с лихорадочной формой КЭ в этот период уровень вирусспецифических IgM был невысоким: у вакцинированных пациентов – КП=1,2±0,3, у невакцинированных – КП=2,0±0,5 (p=0,004) (табл. 4). Уровень антител класса IgM у пациентов с очаговыми формами КЭ было значимо выше (8,6 ± 1,8 и 8,9±2,1), чем у лиц 1-ой группы (p=0,000). Только у пациентов 1-ой группы, ранее привитых против КЭ, в остром периоде выявлялись вирусспецифические антитела класса IgG и вируснейтрализующие антитела (СГТА составила 45±11) (табл.4). Сравнительное изучение факторов гуморального иммунитета манифестными формами КЭ в остром периоде выявило пациентов с предикторы тяжести течения инфекционного процесса (табл. 4). У пациентов с очаговыми формами КЭ тяжелое течение КЭ сопровождалось повышенной продукцией общих и вирусспецифических антител класса IgM на фоне сниженного содержания общего сывороточного IgG и его подклассов IgG1 и IgG3, гиперактивацией системы комплемента и повышением содержания ЦИК средних и мелких размеров. Комплексный анализ ранних цитокиновых реакций (продукция цитокинов IL8, IL-1β, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6, IL-4 и IL-10, а также продукция цитокинов ex vivo в культуре интактных и митоген-индуцированных клеток крови) позволил дифференцировать различия в функционировании системы цитокинов у пациентов с манифестными формами КЭ в острой фазе заболевания (табл. 4). У невакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ средней тяжести цитокиновый статус в первую неделю заболевания характеризовался умеренной активацией цитокинов Th1-типа и цитокининдуцирующей способности клеток. Концентрации провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα) - основных участников регуляторной сети при развитии острого воспаления, у этих пациентов в 2-3 раза превышали аналогичные показатели у здоровых лиц (p≤0,05). 25 Таблица 4. Характер изменений показателей иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания невакц. (n=28) вакц. (n=17) очаговые формы КЭ (благопр. исход) (n=16) N N ↓ ↓↓ ↑↑ ↑↑ N ↓ ↑ ↑ N ↓ N N N ↓ ↑↑↑ ↑↑ ↓ ↓↓ ↑↑ N ↑ N ↑↑ ↑↑↑ ↓ ↑↑ ↑↑↑ отсутст. отсутст. отсутст. отсутст. N N N ↑ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ N N N ↑ ↑↑ ↓ ↓ ↓ ↑↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ провоспалительные цитокины (IL-8, IL-1β, TNF-α) (пкг/мл) ↑↑↑ ↑↑ ↑ ↑↑↑↑ IFN I типа (IFN-α) (пкг/мл) IFN II типа (IFN-γ) (пкг/мл) IL-6 (пкг/мл) ↑↑↑ ↑ ↑ ↑↑ ↑↑↑ N N ↑ ↑↑↑ N ↑↑ ↑↑↑↑ противовоспалительные цитокины (IL-4, IL-10) (пкг/мл) N N ↑↑ N лихорад. форма КЭ Показатели иммунной системы Т-лимфоциты (CD3+CD19-), (CD3+CD4+) (109/л) активированные Т-лимфоциты - CD3+25+, + - HLA-DR , CD3+CD95+ (109/л) цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) (109/л) NK- клетки (CD3-CD16+CD56+) (109/л) NKT-клетки + (CD3 CD16+CD56+) (109/л) B-клетки (CD3-CD19+) (109/л) вирусспецифические IgM вирусспецифические IgG вируснейтрализующие антитела общий IgM (мг/мл) общий IgG (мг/мл) общий IgG1 (мг/мл) общий IgG3 (мг/мл) компоненты комплемента (C3, C3a, C4, C5, C5a) (мкг/мл) отсутст. отсутст. очаговые формы КЭ (летал.исход) (n=6) Примечание: N- показатели, находящиеся в пределах вариабельности значений у здоровых доноров («норма»); ↑(↓)- выше (ниже) нормы на 20-40%; ↑↑ (↓↓)- выше (ниже) нормы на 40-60%; ↑↑↑ (↓↓↓) - выше (ниже) нормы в 2раза; ↑↑↑↑- выше нормы в 3 и более раз. 26 У вакцинированных лиц 1-ой группы с более легким течением заболевания уровень провоспалительных цитокинов был значимо ниже такового у невакцинированных лиц этой группы (p≤0,05). Содержание иммунорегуляторного цитокина - IFNγ у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ значимо превышало таковое у невакцинированных пациентов этой группы (p=0,006). К прогностически неблагоприятным признакам, соответствующим тяжелому течению болезни, относятся: снижение цитокининдуцирующей функции иммунокомпетентных клеток и гиперпродукция либо незначительная продукция провоспалительных цитокинов. Неадекватно низкие уровни продукции IL-8, IL-1β, TNFα, IFNγ, отсутствие стимуляции продукции IFNα, повышение содержания IL-6 в крови и ранний дисбаланс продукции Th1/Th2 цитокинов, направленный в сторону Th2-цитокинов, явились серьезной предпосылкой формирования выраженной иммуносупрессии, приведшей к развитию очаговых форм КЭ у пациентов с благоприятным исходом заболевания. Неблагоприятный исход у пациентов сопровождался дисфункцией характеризующейся системы гиперпродукцией превалированием Th1-типа иммунного цитокинов активационного провоспалительных типа, цитокинов, ответа, резким снижением резервного потенциала иммунокомпетентных клеток. Таким образом, степень выраженности вирусиндуцированной иммуносупрессии, связанная как со свойствами вируса КЭ, так и уровнем иммунокомпетентности организма, во многом предопределяет различную тяжесть течения и исход инфекционного процесса. Особенности взаимодействия дальневосточных штаммов вируса КЭ с клетками иммунной системы ex vivo, in vitro и in vivo Для воспроизведения инфекционного процесса ex vivo, in vitro и in vivo нами были выбраны штаммы вируса КЭ, изолированные от людей с разными клиническими формами заболевания и по своей молекулярно-генетической характеристике принадлежащие разным кластерам филогенетического древа дальневосточных штаммов ВКЭ. Штамм Dal'negorsk (Dal), выделенный из мозга 27 умершего с очаговой формой КЭ, относится к группе Sofjin-подобных штаммов. Штамм Kiparis-94 (К-94), изолированный из крови пациента с лихорадочной формой КЭ, расположился в группе Oshima-подобных штаммов. Штамм Primorye-196 (P196), изолированный из крови пациента с инаппарантной формой КЭ, находится в группе Senzhang-подобных штаммов. При моделировании вирусной инфекции ex vivo были использованы два штамма ВКЭ (Dal и P-196), которые вносили в пробы цельной крови здоровых доноров. Через 3 и 24 часа инкубации определяли накопление вируса в клетках и в супернатантах (рис. 2), а также оценивали экспрессию молекул адгезии и активации на поверхности клеток крови (табл. 5). Применение модельной системы in vitro позволило более длительно (в течение 5 суток) наблюдать за особенностями накопления штаммов (Dal, Kip-94, Р-196) ВКЭ в культуре мононуклеарных лейкоцитов (рис. 3) и дать характеристику изменений продукции цитокинов в зависимости от штамма вируса и продолжительности антигенной стимуляции (табл. 6). Механизмы развития инфекционного процесса in vivo (рис. 4) были изучены нами на мышах линии BALB/c, наиболее часто используемых для моделирования КЭ (Игнатьев Г.М. и др., 2003, 2006; Карганова Г.Г., 2009). Для понимания механизма развития инфекционного процесса в модельных системах, зараженных разными штаммами ВКЭ, первоначально была изучена динамика накопления вируса. Инфицирование проб цельной крови и культуры мононуклеарных лейкоцитов позволило установить, что исследуемые штаммы вируса КЭ различаются по динамике репликации их в иммунокомпетентных клетках и в супернатантах клеток (рис. 2, рис. 3). Установлено, что высоковирулентный Sofjin-подобный штамм Dal быстро проникает в мононуклеарные лейкоциты, активно реплицируется в них на протяжении 24 час, и только потом поступает в культуральную жидкость, где происходит его дальнейшее накопление. Oshima-подобный штамм Kip-94 и Senzhang-подобный штамм P-196 характеризовались замедленным проникновением, 28 А Б Рисунок 2. Динамика накопления штаммов вируса КЭ (ex vivo) в пробах цельной крови (n=10 доноров): А) в клетках крови (в реакции НМФА; Б) в супернатантах клеток (титрование на культуре клеток СПЭВ). По оси абсцисс – время наблюдения в часах, по оси ординат: А) обратные титры антител; Б) титры вируса в lg ТЦД50 . Рисунок 3. Динамика накопления штаммов вируса КЭ (in vitro) в культуральной жидкости мононуклеарных клеток человека (n=10 доноров). По оси абсцисс – время наблюдения в часах и сутках, по оси ординат – титры вируса в lg ТЦД50 (титрование на культуре клеток СПЭВ). 29 невысоким уровнем репликации в клетках крови и медленным накоплением в супернатантах клеток. Необходимо отметить задержку (в течение первых 24 часов) продукции и выхода вирусных частиц во внеклеточное пространство штаммом Dal. Аналогичная замедленная фаза с продукцией небольшого количества вирусных частиц была описана ранее для флавивируса Kunjin (Westaway E.G., 1973) и высоковирулентного Sofjin-подобного штамма Hypr вируса КЭ (Overby A.K. et al., 2010; Miorin L. et al., 2012). Вероятно, и Sofjin-подобный штамм Dal может использовать комбинацию двух стратегий уклонения от иммунных механизмов (задержку IFN индукции и блокирование IFN сигналинга), позволяющую вирусу быстро распространяться в организме, до того как будет запущен эффективный противовирусный ответ. Штаммы Kip-94 и P-196, отличающиеся по своим молекулярно-генетическим характеристикам от штамма Dal, могут не обладать такой стратегией «ускользания» от иммунного контроля, следствием чего является более быстрое распознавание их иммунокомпетентными клетками и запуск механизмов врожденной противовирусной защиты, что приводит к сдерживанию их размножения. Характер развития инфекционного процесса in vivo оценивался по динамике накопления вируса в крови и мозге мышей линии BALB/c, подкожно инфицированных исследуемыми штаммами ВКЭ (рис. 4). При инфицировании мышей штаммом Dal, обладающим высокой нейроинвазивной активностью, уже на 3-и сутки в крови и на 5-ые сутки в мозге регистрировали высокие титры вируса. Пик накопления этого штамма ВКЭ в мозге был сопряжен с началом гибели животных (7-е сутки), 100% летальный исход отмечался на 9-е сутки, средняя продолжительность Инфицирование жизни мышей (СПЖ) штаммом животных Kip-94, составила обладающим 7,1±1,8 средней дней. степенью нейроинвазивности, обусловило пик вирусемии на 5-е сутки, максимальное накопление вируса в мозге на 9-е сутки, СПЖ - 13,4±3,4 дня. Штамм P-196, отличающийся слабой нейроинвазивной способностью, характеризовался невысокими титрами вирусемии, прохождением гематоэнцефалического барьера 30 (ГЭБ) только на 7-е сутки и пиком накопления вируса в мозге на 11 сутки. При введении штамма P-196 только некоторые животные заболевали на 9-10 сутки, СПЖ составила 17,7±4,4 дня. Сравнение показателей выживаемости, выявило значимые различия в СПЖ мышей, инфицированных разными штаммами ВКЭ. Так, z логранговый критерий (характеризующий различия в выживаемости животных двух групп) для мышей, зараженных штаммами Dal и Kip-94, составил 4,992 (p=0,000), для животных, зараженных штаммами Kip-94 и P-196, z=2,444 (p=0,015). Полученные результаты, показавшие высокую скорость накопления штамма Dal в крови, преодоление им ГЭБ и репликацию в мозге мышей, коррелируют с исследованиями других Sofjin-подобных штаммов ВКЭ (Карганова Г.Г., 2009; Ruzek D. et al., 2009, 2011; Tigabu B. et al., 2009, 2010). Данные по изучению биологических свойств штамма Кip-94, во многом совпадают с результатами изучения некоторых Oshima-подобных штаммов ВКЭ (Hayasaka D. et al., 2009). А Б Рисунок 4. Динамика накопления вируса КЭ (in vivo) в органах мышей линии BALB/c, зараженных разными штаммами ВКЭ (А – в крови, Б – в мозге). По оси абсцисс – титр вируса в lg ТЦД50, по оси ординат – дни наблюдения; n=10 животных (для каждого срока наблюдения в каждой группе). 31 В то же время, проведенное нами сравнительное изучение Sofjin-, Oshima- и Senzhang-подобных штаммов, имеющих разную молекулярно-генетическую характеристику, показало, что эти штаммы отличаются по ряду биологических свойств (вирулентность, скорость репликации вируса), но при этом обладают достаточно высокой степенью патогенного потенциала для мышей линии BALB/c. Исследование механизмов формирования иммунного ответа при инфекционном процессе, индуцированном исследуемыми штаммами вируса КЭ, касались, в первую очередь, начальных этапов взаимодействия вируса с клетками врожденной и адаптивной иммунной системы. В модельной системе ex vivo было установлено, что штаммы вируса КЭ с разной вирулентностью разнонаправленно изменяли экспрессию адгезивных молекул (CD11b и ICAM-1) и раннего активационного маркера – CD69 на мембранах гранулоцитов, моноцитов и NK-клеток (табл. 5). При 24-х часовой инкубации клеток крови со штаммом P-196 ВКЭ, изолированным от пациента с инаппарантной формой КЭ, отмечалось значимое повышение уровня экспрессии этих молекул на клетках врожденного иммунитета. При культивировании клеток крови со штаммом Dal ВКЭ, выделенным от больного с очаговой формой КЭ, было выявлено снижение экспрессии этих молекул на моноцитах и угнетение активации NK-клеток. Оценка и анализ активационного профиля (CD69, CD25 и CD95) клеток крови, инкубированных со штаммами ВКЭ, выявили разнонаправленное влияние этих штаммов на этапы активационного процесса разных субпопуляций лимфоцитов: Тлимфоцитов (CD4+, CD8+) и NK-клеток. (табл. 5). Через 24-часа культивирования клеток крови со штаммом P-196 вируса КЭ наиболее активированными оказались клетки, обладающие цитотоксическим потенциалом – NK-клетки и CD8+лимфоциты, что подтверждалось высоким уровнем экспрессии СD69 и CD25 на этих клетках. К этому времени на CD4+-лимфоцитах штамм P-196 индуцировал экспрессию только самого раннего активационного маркера – CD69. Штамм Dal вируса КЭ, супрессирующий активацию антигенпрезентирующих клеток 32 Таблица 5. Уровень экспрессии адгезионных и активационных молекул на поверхности иммунокомпетентных клеток через 24 часа инкубации со штаммами ВКЭ Инфицирование клеток Клетки Моноциты Гранулоциты NK-клетки (CD56) Молекулы Контроль Штамм P-196 Штамм Dal Me (LQ-UQ) Me (LQ-UQ) Me (LQ-UQ) CD11b (MFI) 2110 (1900-2430) 3250 (3010-3450)* 1640 (1400-1890)* ICAM-1 (MFI) 133 (123-154) 216 (182-250)* 104 (85-115)* CD69 (MFI) 46 (38-51) 199 (170-220)* 31 (26-36)* CD11b (MFI) 1540 (1330-1710) 2604 (2180-2920)* 1300 (1250-1520) ICAM-1 (MFI) 86 (70-93) 158 (136-170)* 74 (66-92) CD69 (MFI) 26 (21-31) 119 (100-135)* 29 (25-36) CD11b (MFI) 216 (183-240) 315 (262-338)* 220 (180-250) ICAM-1 (MFI) 22 (16-25) 26 (19-30) 21 (18-28) CD69 (%) 25,5 (20,0-30,0) 71,4 (60,5-81,0)* 15,1(10,0-18,2)* CD25 (%) 6,5 (5,0-7,0) 18,6 (16,0-19,5)* 3,0 (2,0-4,0)* CD95 (%) 6,1 (5,0-7,0) 13,0 (10,0-14,5)* 2,5 (0 – 3,5)* CD69 (%) 11,1 (9,0-12,2) 19,9 (18,0-24,5)* 7,6 (5,0-9,5) CD25 (%) 11,8 (10,0-14,0) 12,9 (11,0-14,0) 8,7 (7,0- 10,5) CD95 (%) 7,3 (6,5-8,5) 8,2 (7,0-10,0) 6,3 (5,0-7,5) CD69 (%) 13,7 (10,0-16,6) 36,1 (30,5-41,0)* 7,1 (5,5-9,0)* CD25 (%) 4,2 (3,0-5,5) 9,3 (7,0-10,5)* 1,5 (0-2,5)* CD95 (%) 3,8 (1,0-4,5) 5,5 (3,0-7,0) 1,2 (0 -2,0) CD4+Т-лимфоциты CD8+Т-лимфоциты Примечание: Me (LQ-UQ) - медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей). Данные, характеризующие экспрессию CD11b, ICAM-1 и CD69 на моноцитах, гранулоцитах и NK-клетках, представлены в виде средней интенсивности флюоресценции клеток (MFI). Результаты анализа экспрессии CD69, CD25 и CD95 представлены как процент клеток (NKклетки, CD4+- и CD8+-Т-лимфоциты), экспрессирующих эти маркеры. *- значимое изменение показателей по сравнению с контролем (p≤0,05), использован критерий Вилкоксона для связанных выборок; n=10 доноров. 33 (моноцитов), вызывал угнетение активации на CD8+-лимфоцитах и NK-клетках. Таким образом, исследуемые штаммы вируса КЭ обладают способностью модулировать ранние этапы активационного процесса иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих последующие стадии развития их функционального ответа. Механизм индукции экспрессии мембраноассоциированных структур клеток штаммами ВКЭ может быть сопряжен с особенностями молекулярно-генетических характеристик штаммов. Кроме того, мы согласны с мнением О.В. Сергеева (2011), что этот строго избирательный механизм вирусиндуцированной активации или подавления экспрессии рецепторов иммунокомпетентных клеток лежит в основе таких фундаментальных свойств вируса как вирулентность и патогенность. Все клеточные события (пролиферация, дифференцировка, апоптоз и функциональная активность клеток) находятся под контролем системы цитокинов, которая формирует и регулирует весь комплекс защитных реакций организма при внедрении патогенов (Кетлинский С.А., 2008; Маркелова Е.В. и др., 2008; Ершов Ф.И., 2012). Исследование продукции цитокинов в модельных системах in vitro (культура мононуклеарных лейкоцитов) и in vivo (мыши линии BALB/c) позволило оценить ранний вклад цитокинов в развитие и исход инфекционного процесса, вызванного штаммами вируса КЭ (табл. 6). Следует отметить, что при инфицировании мышей вирусом КЭ зарегистрирован более высокий уровень локального цитокинового ответа (в мозге) по сравнению с системным (в крови), обусловленный нейроинвазивной активностью исследуемых штаммов ВКЭ. Установлено, что высоковирулентный штамм Dal in vitro и in vivo индуцировал значимое повышение продукции цитокинов IL-8, TNFα, IL-6, IFNγ и низкие уровни секреции IFNα и противовоспалительного цитокина IL-10 (табл.6). Максимальный уровень продукции этих цитокинов совпадал с пиком накопления вируса в модельных системах: в культуре клеток – на 2-3 день, в крови мышей на 5 сутки, в мозге – на 7 сутки после инфицирования. Показатели соотношения концентраций IFNγ/IL-10 свидетельствовали о преобладании ярко выраженного Th1-типа иммунного ответа в группе животных, инфицированных штаммом Dal. 34 Таблица 6. Сравнительная характеристика цитокининдуцирующей активности штаммов ВКЭ на моделях in vitro и in vivo Максимальный уровень продукции цитокинов (pg/ml) Инфицирование штаммами вируса КЭ Цитокины Контроль Штамм P-196 Штамм Kip-94 Штамм Dal В супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека IL-8 TNFα IFNγ IFNα 450 (380-540) 790* (705-950) 990** (926-1155) 1360** (1260-1400) 4,8 (3,8-6,3) 30,8** (23,1-35,0) 36,2** (30,0-41,1) 62,9** (54,0-71,3) 18,9* (15,3-21,4) 35,0** (28,3-39,4) 31,9** (25,3-38,1) 25,0** (20,5-29,5) 14,3** (10,5-16,5) 5,6* (4,0-7,0) 8,5 (6,3-9,8) 1,6 (1,0-2,0) В супернатантах гомогенатов мозга мышей линии BALB/c TNFα 8,0 (6,0-11,0) 26,0* (18,0-33,0) 64,6** (56,5-70,0) 96,5** (90,3-110,0) IL-6 8,3 (6,5-12,1) 17,2* (15,3-21,5) 56,0** (45,0-67,0) 83,3** (75,8-100,5) IFNγ 10,5 (8,0-13,0) 27,1* (23,0-31,7) 105,0** (90,0-118,0) 176,0** (158,0-205,0) IL-10 15,6 (11,7-19,5) 48,0** (40,0-55,0) 28,6* (25,1-32,8) 25,0 (19,0-29,5) IFNγ/IL-10 0,67 (0,50-0,80) 0,56 (0,50-0,65) 3,7** (3,5-4,0) 7,0** (6,5-8,0) Примечание: Данные представлены в виде Mе (LQ-UQ) – медианы и интерквартильного размаха (значения 25 и 75 процентилей). Максимальный уровень продукции цитокинов в культуре клеток зарегистрирован для штамма P-196 на 5 сут, штамма Kip-94 – на 4 сут, штамма Dal - на 3 сут. Уровень IFNα был максимальным для всех штаммов на 1 сут. Максимальный уровень продукции цитокинов в мозге мышей зарегистрирован для штамма P-196 на 11 сут, штамма Kip-94 – на 9 сут, штамма Dal – на 7 сут. * - различия значимы по отношению к показателям контроля (p≤0,05). ** - различия значимы по отношению к показателям контроля (p≤0,001). Использован критерий Вилкоксона для связанных выборок и U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок. 35 Очевидно, что обусловленная дисфункция цитокиновой индуцированной системы вирусом активационного избыточной типа, продукцией провоспалительных медиаторов, является важным патогенетическим звеном неблагоприятного исхода заболевания. Цитокининдуцирующая способность штамма Kip-94, выделенного от пациента с лихорадочной формой КЭ, оказалась иной (табл. 6). Этот штамм активнее индуцировал продукцию IFNα мононуклеарными лейкоцитами и менее выраженно повышал уровни цитокинов TNFα, IL-6, IFNγ у мышей BALB/c по сравнению со штаммом Dal. У животных, инфицированных штаммом Kip-94, зарегистрированы невысокие концентрации противовоспалительного цитокина IL10, что предопределило поляризацию иммунного ответа в направлении Th1-типа. В конечном итоге, менее выраженный дисбаланс продукции цитокинов, вызванный штаммом Kip-94, способствовал большей функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток и иммунной системы в целом, что обусловило замедленное размножение вируса и увеличило продолжительность жизни животных. Штамм P-196, выделенный от пациента с инаппарантной формой КЭ, в модельной системе in vitro на ранних этапах инфицирования мононуклеарных клеток продемонстрировал интерферониндуцирующую активность, превосходящую таковую у штамма Dal (табл. 6). Однако в ходе развития инфекционного процесса концентрации цитокина IFNα снижались. В то же время активно индуцируемая в первые сутки продукция цитокинов IL-8, TNFα, IFNγ лейкоцитами, инфицированными штаммом P-196, затем не изменялась, что сдерживало размножение вируса, но титры его не снижались. Повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови и мозге инфицированных этим штаммом мышей BALB/c наблюдалось лишь на 9-11 сутки. При этом на протяжении всего эксперимента в крови и мозге животных зарегистрированы высокие показатели продукции противовоспалительного цитокина IL-10, супрессирующего синтез Th-1 цитокинов, что могло способствовать замедленному накоплению вируса в крови и 36 мозге и увеличить продолжительность жизни животных. Однако индуцированный штаммом P-196 ВКЭ дисбаланс продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками приводил к незавершенной элиминации вируса, что сформировало предпосылки для длительной персистенции его в организме. Таким образом, выявленные на разных модельных системах (ex vivo, in vitro и in vivo) отличительные особенности течения и исхода инфекционного процесса, вызванного разными штаммами ВКЭ, обусловлены совокупностью биологических свойств, а также способностью штаммов модулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Инфекционный потенциал исследованных штаммов ВКЭ отражает гетерогенность дальневосточной вирусной популяции и во многом предопределяет клинический полиморфизм заболевания. Изучение противовирусной активности биологически активных веществ морских гидробионтов при экспериментальном клещевом энцефалите Противовирусную эффективность в отношении вируса КЭ новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима изучали на моделях in vitro и in vivo согласно требованиям Фармакологического государственного комитета РФ (Хабриев Р.У, 2005) по доклиническому изучению новых лекарственных средств. При исследовании цитотоксичности исследуемых препаратов изучали воздействие различных концентраций этих препаратов (1, 10, 100 и 1000 мкг/мл) на интактную культуру клеток СПЭВ. Установлено, что МПК (максимально переносимая концентрация, составляющая половину максимальной концентрации препарата, не оказывающей на клетки токсичного действия), для всех изучаемых препаратов была ≥ 1000 мкг/мл, т.е. эти препараты практически не токсичны для используемой культуры клеток. Изучение противовирусной активности препаратов in vitro показало, что только рибавирин в концентрации 500 мкг/мл и цельный иммуноглобулин против КЭ полностью подавляют репродукцию вируса КЭ в культуре клеток. Внесение в культуру клеток 250 мкг/мл рибавирина, или противоклещевого иммуноглобулина 37 (в разведении 1:10), или 125 мкг/мл циклоферона снижало инфекционный титр вируса на 4,5-5,0 lg ТЦД50/мл (Ки=75-83%). Максимальные концентрации других референс-препаратов (реаферон-ЕС - 104 МЕ/мл, 4-йодантипирин – 1000 мкг/мл) вызывали снижение титров вируса на 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл (Ки=50-60%) (табл. 7). Для люромарина и тинростима максимальный коэффициент подавления цитопатической активности вируса КЭ составил 58,3 (50,0-66,7)%. Необходимо отметить, что указанный уровень подавления репликации вируса зарегистрирован при использовании люромарина и тинростима в невысоких концентрациях – 100 и 10 мкг/мл, соответственно (табл. 7). Минимально эффективная вирусингибирующая концентрация (МЭК), снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ТЦД50 (Хабриев Р.У, 2005), для люромарина и тинростима составляла 1 и 0,1 мкг/мл, соответственно. Известно, что комбинированное использование противовирусных препаратов, имеющих различную химическую структуру и принципиально различный механизм действия, приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного или синергидного характера (Яковлев В.П., 2003). Нами было изучено противовирусное действие сочетанного применения химиопрепарата - рибавирина и исследуемых препаратов – люромарина и тинростима в инфицированной вирусом КЭ культуре клеток СПЭВ. Монопрепараты применялись в минимально эффективных вирусингибирующих концентрациях, снижающих накопление вируса КЭ на 2 lg ТЦД50/мл. Установлено, что комбинированное использование рибавирина и люромарина, рибавирина и тинростима (в соотношении 1:1) в указанных минимальных концентрациях снижало титр вируса КЭ на 4,1 (3,7-4,5) lg ТЦД50/мл, подавляя репродукцию вируса на 68,3 (61,7-75,0)%, т.е. эффект комбинации препаратов может быть оценен положительно и имеет аддитивный характер. Результаты исследований на модели in vitro продемонстрировали вирусингибирующую активность иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ. Полученные данные свидетельствовали о целесообразности изучения in vivo как самих препаратов, так и их совместного применения с официнальным препаратом – рибавирином. 38 Таблица 7. Оценка влияния препаратов на репродукцию вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ Препараты Вирус (контроль) Иммуноглобулин против КЭ Рибавирин Реаферон-ЕС Циклоферон 4-йодантипирин Люромарин Тинростим Концентрация препаратов, мкг/мл Титр вируса, lg ТЦД50/мл Цельный 1:10 1:100 1:1000 500 250 125 62 31 104 МЕ/мл 103 МЕ/мл 102 МЕ/мл 10 МЕ/мл 125 60 12,5 1,25 1000 100 10 1 1000 100 10 1 100 10 1 0,1 6,0 (5,5-7,0) 0 1,0 (0,9-1,2)* 2,0 (1,8-2,1)* 2,3 (2,0-2,5)* 0 1,0 (0,8-1,2)* 2,0 (1,8-2,3)* 3,1 (2,8-3,3)* 4,0 (3,8-4,3)* 2,5 (2,0-3,0)* 3,0 (2,7-3,2)* 4,1 (3,8-4,5)* 5,0 (4,6-5,2) 1,5 (1,2-1,8)* 3,0 (2,6-3,4)* 3,9 (3,5-4,2)* 6,0 3,0 (2,7-3,2)* 4,2 (3,8-4,4)* 5,0 (4,6-5,2) 6,0 3,0 (2,6-3,4)* 2,5 (2,0-3,0)* 3,5 (3,0-4,0)* 4,0 (3,8-4,3)* 4,0 (3,5-4,5)* 2,5 (2,0-3,0)* 3,3 (3,0-3,5)* 3,9 (3,5-4,2)* Подавление репродукции вируса, ∆, lg ТЦД50/мл 6,0 (5,5-6,5) 5,0 (4,8-5,3) 4,0 (3,7-4,3) 3,7 (3,5-4,0) 6,0 (5,5-6,5) 5,0 (4,7-5,3) 4,0 (3,7-4,2) 2,9 (2,7-3,2) 2,0 (1,7-2,2) 3,5 (3,0-4,0) 3,0 (2,8-3,3) 1,9 (1,7-2,0) 1,0 (0,9-1,3) 4,5 (4,3-4,7) 3,0 (2,9-3,1) 2,1 (1,8-2,4) 0 3,0 (2,8-3,3) 1,8 (1,6-2,2) 1,0 (0,9-1,3) 0 3,0 (2,6-3,4) 3,5 (3,0-4,0) 2,5 (2,0-3,0) 2,0 (1,7-2,2) 2,0 (1,5-2,5) 3,5 (3,0-4,0) 2,7 (2,5-3,0) 2,1 (1,8-2,4) Коэффициент ингибирования (Ки), % 100 83,3 (81,5-87,3) 66,7 (65,1-68,5) 61,7 (58,5-63,6) 100 83,3 (81,5-85,5) 66,7 (62,1-70,0) 50,0 (47,0-53,1) 33,3 (28,2-36,7) 58,3 (50,0-66,7) 50,0 (46,7-55,0) 31,6 (28,3-33,3) 16,7 (15,0-21,7) 75,0 (71,7-78,3) 50,0 (48,3-52,7) 35,0 (30,0-40,0) 0 50,0 (46,7-55,0) 30,0 (26,7-36,7) 16,7 (15,0-21,7) 0 50,0 (43,3-56,7) 58,3 (50,0-66,7) 41,7 (33,3-50,0) 33,3 (28,2-36,7) 33,3 (25,0-41,6) 58,3 (50,0-66,7) 45,0 (41,7-50,0) 35,0 (30,0-40,0) Примечание: Препараты вносили через 1 час после инфицирования культуры клеток штаммом Dal вируса КЭ. Снижение уровня накопления вируса под влиянием препарата - ∆ (lg) = Ак – Ао, где Ак – уровень накопления вируса без внесения препарата, Ао - уровень накопления вируса с препаратом. Коэффициент ингибирования – Ки (%) = (Ак – Ао)/Ак •100%. * - различия значимы по отношению к показателям контроля (p≤0,05). Использован критерий Вилкоксона для связанных выборок. 39 При моделировании in vivo вирусной инфекции (табл. 8) для официнальных препаратов, используемых как препараты сравнения, применялись способы введения и дозы, эквивалентные дозам, рекомендуемым для применения в клинике, при перерасчете на вес животного (Машковский М.Д., 2011). Дозы и способ введения тинростима были установлены А.К. Гажа (1994) и Т.С. Запорожец, Н.Н. Беседновой (2007). При изучении противовирусной активности люромарина нами был выявлен наиболее эффективный способ введения препарата (пероральный) и диапазон применяемых доз (Крылова Н.В. и др., 2011). Изучение протективного действия изучаемых препаратов при острой летальной инфекции мышей показало, что животные, не получавшие препаратов (контрольная группа), погибали, начиная с 9 суток после заражения (СПЖ составила 9,8±1,9дней). Наибольший защитный эффект в отношении вируса КЭ зарегистрирован при применении 0,25 мл/кг противоклещевого иммуноглобулина. Однократное введение этого препарата после заражения животных защищало от гибели 45,0±8,0% мышей, СПЖ увеличивалась на 6,4 дня, по сравнению с контрольной группой животных (z=3,646, a=0,000). Выживаемость мышей, получавших иммуномодулирующие препараты люромарин и тинростим, а также индуктор интерферона – циклоферон, значимо отличалась от таковой у нелеченых животных (z>1,960, a≤0,05). Эти препараты защищали от гибели в среднем 25-35% животных, увеличивая СПЖ на 2,7-4,7 дней (табл. 8). Наименьшее протективное действие установлено для рибавирина, реаферона-ЕС и 4-йодантипирина: в указанных дозах эти препараты защищали около 5-15% инфицированных животных, удлиняя срок их жизни лишь на 0,8-2,0 дня по сравнению с контрольной группой (z≤1,960, a>0,05). Изучение сочетанного применения рибавирина и циклоферона с люромарином и с тинростимом при остром летальном КЭ у мышей показало, что комбинация официнальных препаратов с исследуемыми иммуномодулирующими препаратами значимо повышает выживаемость животных и срок их жизни по сравнению с таковыми в контрольной группе (табл. 9). 40 Таблица 8. Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при лечебной схеме введения препаратов Препараты Рибавирин Способ и кратность введения препаратов Перорально 10 дней Противоклещевой иммуноглобулин Внутримышечно однократно Реаферон - ЕС Внутримышечно 5 дней Циклоферон 4-йодантипирин Люромарин Тинростим Контроль вируса (без препаратов) Внутримышечно 5 дней Перорально 5 дней Перорально 7 дней Подкожно 5 дней Дозы препаратов, мг/кг % выживших животных СПЖ, дни Логранговый критерий z 50 5,0±1,0 10,8±2,0 z=0,891, a=0,346 100 13,3±3,2 11,8±2,4 z=1,516, a=0,130 200 0 9,1±1,8 z=0,379, a=0,744 0,15 мл/кг 30,0±5,0 13,9±2,8 z=2,240, a=0,029 0,25 мл/кг 45,0±8,0 16,2±3,2 z=3,646, a=0,000 103 МЕ/кг 0 10,0±2,0 z=0,936, a=0,875 104 МЕ/кг 5,0±1,0 10,6±2,1 z=0,771, a=0,441 0,6 0 10,2±2,0 z=0,399, a=0,711 6 21,7±4,3 12,3±2,5 60 35,0±8,0 14,5±2,8 z=2,490, a=0,013 1,25 0 10,0±2,0 z=0,936, a=0,875 12,5 15,5±3,1 11,5±2,3 z=1,020, a=0,308 25 16,7±3,3 11,4±2,0 z=1,363, a=0,174 50 30,0±6,2 13,7±2,7 z=2,268, a=0,024 100 25,5±5,7 12,1±2,0 z=2,013, a=0,043 5 мкг/кг 23,3±5,8 12,5±2,5 z=2,080, a=0,041 50 мкг/кг 10,0±2,0 11,0±2,8 z=1,056, a=0,411 0 9,8±1,9 z=2,065, a=0,039 Примечание: z - логранговый критерий выживаемости с поправкой Йейтса, характеризует различия в выживаемости животных опытной и контрольных групп (1,960 – критическое значение для уровня значимости 0,05); a – уровень значимости различий в выживаемости животных двух групп; n=30 животных (в каждой группе). 41 Следует отметить, что совместное применение рибавирина с люромарином (z2=2,144, a=0,033) и рибавирина с тинростимом (z2=2,060, a=0,043) более эффективно, чем монотерапия рибавирином (z=1,516, a=0,130). В то же время эффективность комбинации иммуномодуляторов с рибавирином значимо не отличалась от монотерапии люромарином (z1=0,871, a=0,384) и тинростимом (z1=0,316, a=0,752). Наиболее эффективной оказалась комбинация циклоферона с исследуемыми иммуномодулирующими препаратами, которая значимо превышала таковую каждого монопрепарата (z>1,960, a≤0,05). Кроме того, сочетанное применение циклоферона и люромарина защищало от гибели 60,0±10,0% мышей, СПЖ увеличивалась на 7,0 дней, по сравнению с контрольной группой животных (z=3,975, a=0,000). Комбинированное введение циклоферона и тинростима защищало от гибели 50,0±5,0% инфицированных животных, удлиняя срок их жизни на 6,1 дня по сравнению таковой у нелеченых мышей (z=3,121, a=0,000). Таким образом, комбинация препаратов с различным механизмом действия (люромарина и тинростима с рибавирином и циклофероном) оказывает выраженный защитный эффект аддитивного характера. Полученные в настоящем исследовании результаты протективного действия новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима и эффективности их сочетанного применения с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) свидетельствуют о перспективности их использования в комбинированной терапии КЭ. Таким образом, экспериментальных в результате исследований проведенных установлена роль комплексных клинико- клеточно-молекулярных механизмов начальных этапов иммунной защиты против инвазии вируса КЭ, что расширяет существующую концепцию иммунопатогенеза КЭ. Выявлены принципиальные различия в способности штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ модулировать иммунокомпетентных клеток ранние и этапы активационного последующую секрецию процесса цитокинов. 42 Таблица 9. Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при комбинированном применении препаратов Препарат Контроль вируса (без препаратов) Способ введения препаратов Доза препарата, мг/кг % выживших животных СПЖ, дни 0 9,8±1,9 Логранговый критерий z Перорально 100 13,3±3,2 11,8±2,4 z=1,516, a=0,130 10 дней Внутримышечно Циклоферон 60 35,0±8,0 14,1±2,8 z=2,390, a=0,018 5 дней Перорально Люромарин 50 30,0±6,2 13,7±2,7 z=2,268, a=0,024 7 дней Подкожно Тинростим 5 мкг/кг 23,3±5,8 12,5±2,5 z=2,080, a=0,041 5 дней Люромарин перорально 50 z=2,535, a=0,012 + + + 41,7±6,3 14,9±3,0 z1=0,871, a=0,384 Рибавирин перорально 100 z2=2,144, a=0,033 Люромарин перорально 50 z=3,975, a=0,000 + + + 60,0±10,0 16,8±3,3 z1=2,166, a=0,031 Циклоферон внутримышечно 60 z2=2,056, a=0,040 Тинростим подкожно 5 мкг/мл z=2,153, a=0,028 + + + 33,3±6,7 13,8±2,5 z1=0,316, a=0,752 Рибавирин перорально 100 z2=2,060, a=0,043 Тинростим подкожно 5 мкг/мл z=3,121, a=0,000 + + + 50,0±5,0 z1=2,368, a=0,021 15,9±3,0 Циклоферон внутримышечно 60 z2=2,077, a=0,039 Примечание: z – значимость различий в выживаемости между животными опытной и контрольных групп. z1 – между животными, получавшими комбинированную терапию, и животными, получавшими монотерапию люромарином и тинростимом. z2 – между животными, получавшими комбинированную терапию, и получавшими монотерапию официнальными препаратами. a – уровень значимости различий в выживаемости животных двух групп. n=30 животных (в каждой группе). Рибавирин 43 Установлена взаимосвязь уровня антигенемии вируса КЭ с функциональной активностью эффекторной фазы врожденного иммунитета пациентов. Определены общие закономерности и различия иммунного ответа, характерные для острого периода инфекционного процесса, у пациентов с разными манифестными формами КЭ. Выявлены особенности течения вирусной инфекции у лиц, ранее вакцинированных против КЭ. Экспериментально обоснована противовирусная эффективность в отношении вируса КЭ новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима и их комбинированного применения с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном). ВЫВОДЫ 1. На эндемичной территории Приморского края у пациентов с КЭ в 73,4% случаев выявлены инаппарантные, в 26,6% случаев - манифестные варианты течения инфекции. В последнем случае у 67,2% больных наблюдалась лихорадочная форма заболевания, у 23,8% - очаговые формы, у 9% - зарегистрирован летальный исход. Среди пациентов с КЭ вакцинированные лица составили 31,3%, заболевание у них протекало только в лихорадочной форме. 2. Установлено, что на начальной стадии инфекционного процесса у невакцинированных пациентов быстрая элиминация патогена ассоциирована с невысоким уровнем антигенной нагрузки ВКЭ, увеличением в периферической крови концентрации IFNα, количества NK-, NKT-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации (CD25). Отсутствие повышения этих показателей на фоне увеличения концентраций IL-4, IL-10, а также высокий уровень ВКЭ-антигенемии являются предикторами длительной персистенции возбудителя. 3. Показано, что у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, быстрая элиминация антигена ВКЭ связана с высоким уровнем поствакцинальных высокоавидных IgG и вируснейтрализующих антител, невысокой антигенной нагрузкой, умеренным повышением количества NK-, NKT-клеток, В-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов и увеличением содержания IFNγ в сыворотке крови. При замедленной элиминации антигена установлено отсутствие изменений 44 субпопуляционного состава лимфоцитов, повышенное содержание IL-4 и IL-10 в сыворотке крови, высокий уровень ВКЭ-антигенемии на фоне невысокого уровня поствакцинальных низкоавидных IgG и вируснейтрализующих антител. 4. В остром периоде заболевания при лихорадочной форме КЭ у невакцинированных пациентов выявлено умеренное повышение количества NK-, NKT-клеток, активированных Т-лимфоцитов, увеличение содержания IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα и невысокий уровень вирусспецифических антител класса IgM в сыворотке крови. У привитых пациентов зарегистрированы невысокие показатели содержания вирусспецифических IgM и поствакцинальных вируснейтрализующих антител, значимое увеличение количества NK-, NKT-клеток, активированных Тлимфоцитов, повышение содержания IFNγ в сыворотке крови. 5. У пациентов с очаговыми формами КЭ в острой фазе инфекционного процесса наблюдалось снижение содержания CD3+-, CD4+-Т-лимфоцитов, NKклеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества В-лимфоцитов, увеличение содержания цитокинов (IL-4, IL-10) в сыворотке крови, высокий уровень вирусспецифических IgM. Предикторами неблагоприятного течения КЭ с летальным исходом явилось выраженное снижение числа Т-лимфоцитов (CD3+-, CD4+-, CD8+, CD25+), NK- и NKT-клеток, уменьшение концентраций IgG, IgG1, IgG3 и IFNα, а также значимое повышение содержания цитокинов (IL-8, IL-1β, TNFα, IL-6 и IFNγ) и вирусспецифических IgM в сыворотке крови. 6. В экспериментах ex vivo и in vitro установлено, что штамм Dal вируса КЭ, изолированный от пациента с очаговой формой заболевания, проникает и активно реплицируется в клетках крови, снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных молекул (CD69, CD25, CD95), индуцирует усиление продукции IL8, TNFα, IFNγ мононуклеарными клетками. Штаммы Kip-94 и P-196, изолированные от пациентов с лихорадочной и инаппарантной формой КЭ, отличались невысоким уровнем репликации в клетках, усилением экспрессии молекул адгезии и активационных антигенов, мононуклеарными клетками. индукцией высокого уровня продукции IFNα 45 7. Инфицирование мышей линии BALB/c штаммом Dal сопровождается высоким уровнем репликации вируса и продукции цитокинов (TNFα, IL-6, IFNγ) в крови и мозге животных; штаммом Kip-94 - умеренным уровнем репликации вируса и продукции TNFα, IL-6, IFNγ; штаммом P-196 – низким уровнем репликации вируса и высоким уровнем IL-10. 8. В экспериментах in vitro и in vivo установлена вирусингибирующая и протективная активность биополимеров – люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ. Комбинированное применение биополимеров с рибавирином и циклофероном усиливает протективный эффект и определяет перспективность их использования при КЭ. Список основных научных работ, опубликованных по теме диссертации 1.Сравнительное изучение in vitro эффективности различных иммуномодулирующих препаратов при клещевом энцефалите / Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // Вопросы вирусологии. - 2001. - № 1. – С. 25-28. 2. Изменение показателей иммунного статуса и их коррекция при разных формах клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Якушева С.С., Борисевич В.Г., Леонова Г.Н. // Антибиотики и химиотерапия. – 2001. – Т. 46. - № 7. - С. 23-26. 3. Итоги изучения действия некоторых иммуномодуляторов интерферона и иммуностимуляторов при клещевом энцефалите / Леонова Г.Н., Крылова Н.В., Беседнова Н.Н. // Антибиотики и химиотерапия. – 2001. – Т. 46. - № 7. - С. 34-37. 4. Морфофункциональная характеристика макрофагов, зараженных вирусом клещевого энцефалита / Плехова Н.Г., Исачкова Л.М., Леонова Г.Н., Крылова Н.В. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2001. - № 2. - С. 40-42. 5. Изучение эффективности различных иммунокорригирующих препаратов, применяемых для лечения клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // В кн. «Клещевой энцефалит: к 65-летию открытия». – Владивосток. – 2002. С. 157-165. 6. Разработка методологического подхода для оценки специфической активности вакцин против клещевого энцефалита на примере вакцины Энцепур ® / Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Майстровская О.С., Крылова Н.В., Ковальчук Н.В., Мизеров К.С., Д. Гниель // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2004. – Т. 2. - № 15. – С. 30-36. 7. Клинико-иммунологическая эффективность вакцины «Энцепур» при вакцинации против клещевого энцефалита жителей Приморского края / Леонова Г.Н., Мизеров К.С., Крылова Н.В., Майстровская О.С., Борисова О.Н., Д. Гниель // Биопрепараты. – 2004. - Т. 2. - № 14. - С. 24-28. 8. Клинико-иммунологические критерии диагностики клещевых микст инфекций в Приморском крае / Леонова Г.Н., Якушева С.С., Иванис В.А, Дададова 46 О.Б., Крылова Н.В., Симакова А.И., Майстровская О.С. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2005. - № 4. – С. 25-31. 9. Реактогенность вакцины против клещевого энцефалита «Энцепур®Взрослый» и иммунный ответ на ее введение / Леонова Г.Н., Крылова Н.В., Павленко Е.В., Майстровская О.С. // Медицинская иммунология. – 2005. Т.7. - №4. – С. 391-396. 10. Оценка серологических методов исследования иммунного ответа у лиц, привитых вакциной против клещевого энцефалита Энцепур®Взрослый / Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Крылова Н.В. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. – 2005. - № 5. – С. 33-36. 11. Зависимость специфического иммунного ответа от возраста и пола у лиц, привитых вакциной против клещевого энцефалита / Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В., Майстровская О.С., Ковальчук Н.В. // Медицинская иммунология. – 2006. - Т. 8. - № 1. - С. 73-80. 12. Динамика специфического иммунного ответа у жителей Дальневосточного региона, привитых вакциной против клещевого энцефалита «Энцепур®Взрослый» / Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Майстровская О.С., Ковальчук Н.В., Крылова Н.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - С. 91-94. 13. Продукция цитокинов лейкоцитами крови, инфицированной дальневосточными штаммами вируса клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Майстровская О.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - С. 95-99. 14. Влияние реактогенности вакцин против клещевого энцефалита на иммунный ответ у вакцинированных людей / Леонова Г.Н., Крылова Н.В, Павленко Е.В., Майстровская О.С. // Бюллетень сибирской медицины. – 2006. - Т. 5. Приложение 1. - С. 73-78. 15. Изменение метаболической активности макрофагов под влиянием вируса клещевого энцефалита / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Дробот Е.И., Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // Биохимия. – 2007. - Т. 72. - № 2. - С. 236-246. 16. История и перспективы изучения иммунологических аспектов патогенеза клещевого энцефалита / Крылова Н.В. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. – 2007. - № 11. – С. 46-51. 17. Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика дальневосточной популяции вируса КЭ и ее патогенетическое значение / Леонова Г.Н., Беликов С.И., Павленко Е.В., Кулакова Н.В., Крылова Н.В. // Вопросы вирусологии. – 2007. - № 6. – С. 13 -17. 18. Некоторые особенности иммунопатогенеза клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н. / Тихоокеанский медицинский журнал. - 2007. - № 3. - С. 21-25. 19. NO-образующая активность макрофагов при заражении вирусом клещевого энцефалита / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // 47 Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. - № 3. - С. 316320. 20. Динамика цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита у лиц после укуса клеща / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В. // Цитокины и воспаление. – 2008. – Т.7. - №1. - С. 35-39. 21. Сравнительное изучение гуморальных факторов иммунитета у инфицированных вирусом клещевого энцефалита лиц, не вакцинированных и вакцинированных против клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Максема И.Г. // Медицинская иммунология. – 2009. - Т.11. - № 23. - С.197-204. 22. Противовирусная активность комплексного препарата розмариновой кислоты, полученной из Zostera asiatica, в отношении возбудителя клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Попов А.М., Артюков А.А., Майстровская О.С., Козловская Э.П. // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. - № 3. - С. 86-88. 23. Протективное действие фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japonica при экспериментальном клещевом энцефалите / Макаренкова И.Д., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3. - С. 89-92. 24. Изучение активности препарата Люромарин in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Попов А.М., Артюков А.А., Козловская Э.П. // Антибиотики и химиотерапия. – 2010. – Т. 55. - № 7-8. – С. 17-19. 25. Оценка иммунного ответа в отдаленные сроки после полного курса вакцинации против клещевого энцефалита / Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Крылова Н.В. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2011. – Т. 9. - № 2. – С. 39-44. 26. Особенности противовирусного иммунного ответа у вакцинированных и невакцинированных пациентов на примере лихорадочной формы клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Запорожец Т.С., Смолина Т.П., Гажа А.К., Новиков Д.В., Ченцова И.В. // Бюллетень СО РАМН. – 2011. - № 4. – С. 79-85. 27. Изучение эффективности препарата Люромарин при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Попов А.М., Артюков А.А., Козловская Э.П. // Антибиотики и химиотерапия. – 2011. – Т. 56. № 7-8. – С. 13-15. 28. Сравнительное изучение противовирусной активности лютеолина и 7, 3׳дисульфата лютеолина / Крылова Н.В., Попов А.М., Леонова Г.Н., Артюков А.А., Майстровская О.С. / Антибиотики и химиотерапия. – 2011. – Т. 56. - № 11-12. – С. 7-10. 29. Значение дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита в инфекционной патологии / Леонова Г.Н., Крылова Н.В., Павленко Е.В., Беликов С.И., Кондратьев И.Г. // Здоровье населения и среда обитания. - 2012. - №1.-С.4-6. 48 30. Индукция апоптоза нейтрофилов вирусом клещевого энцефалита / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Ляпун И.Н., Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153. - № 1. – С. 118-122. 31. Комплексная оценка состояния иммунной системы при различных формах клещевого энцефалита в остром периоде / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Запорожец Т.С., Смолина Т.П., Гажа А.К., Новиков Д.В., Ченцова И.В. // Медицинская иммунология. – 2012. - Т. 14. - № 4-5. - С. 313-320. 32. Особенности цитокинового профиля на ранних стадиях инфицирования вирусом клещевого энцефалита у вакцинированных и невакцинированных людей / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - № 4. - С. 77-80. 33. Особенности цитокинового профиля мышей, инфицированных различными штаммами вируса клещевого энцефалита / Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Майстровская О.С. // Цитокины и воспаление. – 2012. – Т. 11. - № 3. – С. 34 -38. Монографии: 1. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита / Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В.// Владивосток: ОАО «Приморский полиграфкомбинат», 2006. 100 с. 2. The Cell of Innate Systems in Tick-borne Encephalitis / Plekhova N.G., Somova L.M., Lyapun I.N., Kondrashova N.M., Krylova N.V., Leonova G.N., Pustovalov E.V. // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus Encephalitis». In Tech. – 2011. - P. 167-194. Патенты: 1. Патент RU 2432959 C1. Заявка: 2010141686/15 от 11.10.2010. Опубликовано: 10.11.2011. Бюл. № 31. Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием / Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Козловская Э.П. 2. Патент RU 2439566 C1. Заявка: 2010138768/15 от 20.09.2010. Опубликовано: 10.01.2012. Бюл. № 1. Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита / Леонова Г.Н., Крылова Н.В. 3. Патент RU 2466190 C1. Заявка: 2011112215/10 от 30.03.2011. Опубликовано: 10.11.2012. Бюл. № 1. Способ определения степени цитопатогенности вирусов / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Ляпун И.Н. 49 Список сокращений ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ИФА - иммуноферментный анализ КонА - конканавалин А КЭ - клещевой энцефалит МКБ-10 – Международная классификация болезней Десятого пересмотра МКБ-10 рубрика А84.0 – Дальневосточный клещевой энцефалит СПЭВ - перевиваемая культура клеток почек эмбриона свиньи СГТ (СГТА) - средняя геометрических титров антител ТЦД50 – 50% тканевая цитопатическая доза ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЦНС – центральная нервная система CD - антигены кластеров дифференцировки клеток С1, -3, -4, -5 – компоненты комплемента IL - интерлейкин IgA-, -M, -G – иммуноглобулины соответствующих классов ICAM - молекулы межклеточной адгезии IFN - интерферон LD50 – 50% летальная доза NK - естественные киллеры NKT - клетки — натуральные киллеры-Т-лимфоциты Thl, Th2 - субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов) TNFα - фактор некроза опухоли