Автореферат - ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России
реклама
На правах рукописи Гришина Галина Викторовна ПРИМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА ПРИ ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 14.01.21– гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт - Петербург 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России). Научный руководитель: Доктор медицинских наук — Ремизова Марина Иосифовна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, главный трансфузиолог МЧС России, заведующий отделением трансфузиологии ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России Ганапиев Абдулбасыр Абдурахманович Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Российский Кардиологический Центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации Тимошин Александр Анатольевич Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита состоится « 30 » марта 2015 года в часов на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по адресу: 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России Автореферат разослан « » 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Татьяна Валентиновна Глазанова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Разработка новых схем инфузионно-трансфузионной терапии геморрагического шока является важной задачей современной трансфузиологии. Остро развивающаяся недостаточность кровообращения жизненно важных органов в условиях гиповолемии и развивающейся циркуляторной гипоксии нередко приводит к необратимому коллапсу и смерти [Аполлонова Л.А., 2011]. Лечение кровопотери, осложненной длительной постгеморрагической гипотензией, приобретает особую сложность в связи с развивающимся перенапряжением компенсаторных механизмов организма, глубокими нарушениями периферического кровообращения и метаболизма [Мазуркевич Г.С., Багненко С.Ф., 2004; Чернеховская Н.Е. и др., 2013]. Длительное снижение кровотока в органах сопровождается развитием необратимых повреждений тканей. Для коррекции расстройств кровообращения, как в крупных магистральных сосудах, так и в сосудах микроциркуляторного русла, помимо инфузионно-трансфузионных сред необходимы дополнительные средства, способные длительно поддерживать транскапиллярный обмен [Заривчацкий М.Ф., 2014]. Использование препаратов, непосредственно влияющих на тонус сосудов при шоке, может расширить возможности инфузионной терапии кровопотери, направленной на восстановление гемодинамики и метаболизма. Вероятно, именно поэтому внимание исследователей в последнее время привлечено к новому вазоактивному веществу – монооксиду азота (оксид азота, NO). Путем влияния на его синтез в организме можно осуществлять регуляцию сосудистого тонуса при шоке[Forstermann U., 2010; Szabo C., 2007]. Известно, что изменение содержания в организме NO оказывает влияние на артериальное давление (АД), регионарный кровоток, агрегацию тромбоцитов [Cabrales P. еt аl., 2009]. Относительно роли NO при геморрагическом шоке нет единого мнения. Согласно данным литературы, при геморрагическом шоке нарушается генерация NO, обусловленная изменением активности синтаз оксида азота. Снижается активность конститутивной эндотелиальной синтазы (eNOS) и повышается активность индуцибельной синтазы (iNOS), обусловливающей усиление генерации NO [Collins J.L. еt аl., 2003; Fleming I. еt аl., 2003]. Существуют работы, свидетельствующие о благоприятном действии повышенной продукции NO на течение геморрагического шока [Yao Y.M. еt аl., 1993]. Другие исследователи придерживаются противоположной точки зрения [Кочетыгов Н.И. и др., 2003; Сauwels A., 2007; Nachuraju P. еt аl., 2011]. Избыток оксида азота при шоке может вызывать изменение функций органов различными путями: нарушением 4 генной экспрессии и активности ряда ферментов, формированием мощного окислителя пероксинитрита, вызывающего клеточную дисфункцию [Szabo C. еt.аl., 2007]. Противоречивы данные о времени, при котором после кровопотери происходит увеличение содержания оксида азота. Недостаточно ясны условия, при которых защитное действие NO сменяется повреждающим [Сauwels A., 2007; Szabo C. еt аl., 2007]. В свете этих данных, представляется актуальным изучение веществ, влияющих на метаболизм NO при геморрагическом шоке [Anaya-Prado R. еt аl., 2003; Arora T.K. еt аl., 2012]. NO регулирует ряд физиологических процессов (состояние сосудистого тонуса, агрегацию тромбоцитов и их адгезию к сосудистой стенке), от которых в значительной мере зависит эффект инфузионной терапии при кровопотере и шоке. Разработка методов, направленных на изменение содержания NO, является актуальным и перспективным направлением исследований для создания новых схем инфузионной терапии геморрагического шока. Степень разработанности темы исследования Несмотря на большое количество работ, посвященных оксиду азота, пока не удалось определить все "точки приложения" NО. Роль оксида азота в патогенезе геморрагического шока не до конца ясна. При значительном числе работ, касающихся биологического значения NO, практически не исследованы медикаментозные механизмы воздействия на продукцию оксида азота при инфузионной терапии кровопотери и шока. Поэтому актуальным представляется изучение возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока с помощью регуляторов синтеза NO. Цель исследования – изучить влияние регуляторов синтеза оксида азота: донора – L-аргинина и селективных и неселективных ингибиторов NO-синтаз на течение экспериментального геморрагического шока и возможность их применения для повышения эффективности его инфузионной терапии. Задачи исследования 1. Изучить изменения содержания NO в тканях крыс при различных видах шока. 2. Выбрать рабочую модель шока, отличающуюся выраженным и ранним увеличением содержания NO в тканях крыс. 3. Изучить влияние неизбирательного ингибитора (NW-нитро-L-аргинина) и донора оксида азота L-аргинина на течение геморрагического шока. 4. Исследовать возможность применения L-аргинина (изучить его действие на состояние гемодинамики, газовый состав крови и кислотноосновное состояние (КОС) организма) при инфузионной терапии геморрагического шока. 5 5. Изучить влияние ряда селективных ингибиторов индуцибельной NOсинтазы на системную гемодинамику и микроциркуляцию (МЦ) при инфузионной терапии геморрагического шока. Выбрать наиболее эффективный регулятор синтеза оксида азота для введения в составе инфузионной среды при геморрагическом шоке. 6. На основании полученных результатов дать заключение о возможности разработки методов инфузионной терапии геморрагического шока, включающих регуляторы синтеза оксида азота. Научная новизна Впервые показано, что при геморрагическом шоке и его инфузионной терапии оксид азота, вырабатываемый под влиянием конститутивной синтазы, играет важную роль в централизации кровообращения, а именно, позволяет сохранить кровоток в жизненно важных органах. На основании полученных данных доказано, что введение соединений, способствующих усилению синтеза оксида азота в тканях крыс до кровопотери (донора оксида азота), задерживает нарушения кровообращения при геморрагическом шоке. Инфузия L-аргинина в составе солевого раствора после кровопотери улучшает деятельность сердечно-сосудистой системы, в результате чего возрастает продолжительность жизни экспериментальных животных. При инфузионной терапии геморрагического шока, проводимой с введением селективных ингибиторов синтеза оксида азота – производных лизина (L-NІL) и орнитина (L-NІО), аминогуанидина и S-метилизотиола, происходит коррекция нарушений системной гемодинамики, микроциркуляции, кислородного режима и кислотно-основного состояния организма. Наиболее высокая эффективность выявлена в отношении L-NІO и аминогуанидина, вводимых с изотоническим раствором натрия хлорида. Теоретическая и практическая значимость работы Решение поставленных в диссертации задач является существенным этапом в изучении патогенеза геморрагического шока. Полученные результаты позволяют определить роль NO в развитии централизации кровообращения при геморрагическом шоке. Результаты исследований обосновывают перспективность применения донора оксида азота L-аргинина и селективных ингибиторов индуцибельной NO-синтазы – L-NІO и аминогуанидина в комплексной терапии геморрагического шока. Положения, выносимые на защиту 1. При геморрагическом шоке происходят выраженные и ранние изменения содержания NO в тканях крыс. Генерация оксида азота необходима 6 для сохранения перфузии периферических тканей в начальном периоде кровопотери. 2. Введение донора оксида азота до начала кровопотери задерживает нарушения кровообращения. L-аргинин, введенный при геморрагическом шоке в составе инфузионной среды, восстанавливает деятельность сердечнососудистой системы. 3. При сочетанном применении при геморрагическом шоке селективных ингибиторов синтеза оксида азота (L-NІO и аминогуанидина) и инфузионной среды происходит стойкая коррекция нарушений гемодинамики по сравнению с инфузией только кровезаменителя. Степень достоверности и апробация результатов работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии” 5-6 июня 2011 г.; 24-25 октября 2012 г; 24-25 июня 2014 г; на первой конференции Российского национального общества по изучению шока в 2013 г. Публикации результатов исследований По результатам исследования опубликовано 18 научных работ, из них 4 – в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована тридцатью тремя таблицами и шестью рисунками. Библиография состоит из 261 источника, из них 84 отечественных и 177 иностранных авторов. Личный вклад автора Автором лично выполнялась экспериментальная часть, которая включала в себя моделирование шока, препаровку и катетеризацию сосудов, регистрацию исследуемых параметров. Автором проводился анализ полученных данных, статистическая обработка и обобщение результатов исследования, подготовка материалов к публикации. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методология и методы исследования Основой работы явились данные, полученные на 123 белых крысах обоего пола массой 170-230 г. Эксперименты проведены в соответствии с требованиями Женевской Конвенции International Guiding Principles for 7 Biomedical Research Involving Animals (Geneva, 1990) и согласованы с этическим комитетом ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Шок воспроизводился на наркотизированных животных (тиопентал натрия, 35-40 мг/кг). Работа состоит из трех разделов. В первом разделе приведены данные по изучению содержания оксида азота в тканях крыс при различных видах шока. Второй раздел посвящен изучению влияния регуляторов синтеза оксида азота, вводимых без кровезаменителя, на течение геморрагического шока. В третьем разделе представлены результаты применения при геморрагическом шоке кровезаменителя со средствами эндотелийзависимой регуляции сосудистого тонуса (донор и селективные ингибиторы синтеза оксида азота). Исследования выполнены на трех экспериментальных моделях шока: ожоговом, травматическом и геморрагическом. Ожог 20-25 % поверхности тела вызывали нанесением на область спины и боковых поверхностей туловища латунной пластинки, нагретой до 200-240°С. Травматический шок воспроизводили сдавливанием обоих бедер крыс с помощью миниатюрных тисков с винтовым зажимом в течение 4-х часов. Геморрагический шок вызывали кровопусканием из левой сонной артерии, снижая артериальное давление (АД) до 35-40 мм рт.ст., которое поддерживали на этом уровне в течение 50 минут и заканчивали при стойком снижении АД до 40 мм рт.ст. АД измеряли дискретно через каждые 2,5-5 мин в течение всего периода наблюдения. Кровопотеря в этих экспериментах составляла 2,6–2,8 мл на 100 г. Количественное определение содержания NO в тканях осуществляли в лаборатории физико-химических полимеров Института химической физики им. Н.Н. Семенова ФАНО (Москва) методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). Количество выработанного в тканях крыс NO оценивали по включению его в парамагнитные мононитрозильные комплексы ДЭТК-Fe2+ (диэтилдитиокарбамат). Для прямого количественного определения содержания NO использовали “ловушку”, которую вводили за 30 мин до окончания эксперимента. “Ловушка” состояла из раствора Na-ДЭТК (С5Н10NS2Na, 500 мг/2,5мл H2O/кг), вводимого внутрибрюшинно и раствора сульфата железа с цитратом натрия (FeSO4 20 мг и цитрат Na 95 мг/2,5 мл H2O/кг), который инъецировали подкожно. В отличие от эндогенных комплексов NO комплекс «ловушка-NO» стабилен в биологической среде при действии кислорода и других окислителей. Поэтому интенсивность соответствующего сигнала ЭПР отражает интенсивность синтеза NO в тканях [Ванин А.Ф., 2001]. Для анализа содержания оксида азота у животных при ожоговом, травматическом и геморрагическом шоке брали ткани печени, селезенки и почки. Контролем служили здоровые животные. Ткани органов измельчали, замораживали в пресс-форме и помещали в сосуд Дюара с жидким азотом 8 (-196°С), где они хранились до момента определения содержания NO. Содержание NO в тканях выражали в условных единицах. Одна условная единица соответствует 3,3-м нанограммам окиси азота на 1 г влажной ткани. Во втором разделе в 3-й серии (служившей контролем к 4-й и 5-й) животным перед началом кровопотери вводили 1,0 мл изотонического раствора натрия хлорида (ФР). В 4-й серии до начала кровопотери в том же объеме ФР вводили неизбирательный ингибитор NO-синтаз NW-нитро-L-аргинин (250 мг/кг) и в 5-й серии донор NO L-аргинин (300 мг/кг). Геморрагический шок вызывали кровопусканием, которое прекращали при наступлении выраженных нарушений микроциркуляции: прерывистость кровотока, агрегация форменных элементов крови, спазм большинства капилляров и стаз в части из них. В третьем разделе регуляторы синтеза оксида азота (донор и селективные ингибиторы) применяли при инфузионной терапии геморрагического шока. Общая кровопотеря составляла – 3,10 0,15 мл/100 г массы животного. В качестве инфузионной среды вводили ФР в объеме, в два раза превышающем объем кровопотери. Для оценки состояния кровообращения в исходном периоде, через 30 минут гипотензии (перед инфузией), через 10 мин, 60 мин после инфузии солевого раствора регистрировали показатели гемодинамики. Для определения ударного объема сердца (УО, мл/кг) методом тетраполярной реографии в ходе выполнения данной работы был создан комплекс, состоящий из реографа РПГ 2-02 и электрокардиографа ЭКЗЧ-01. Частоту сердечных сокращений (ЧСС) подсчитывали по электрокардиограмме. Определение УО позволило рассчитать показатели минутного объема кровообращения (МОК, мл/мин•100 г массы) по формуле: УО•ЧСС/10; общего периферического сопротивления (ОПС, дин•с•см-5•104/кг массы) по формуле: АД/МОК•1332•60•10-4/кг; рабочий индекс левого желудочка (РИЛЖ, кГм/кг•мин) по формуле: АД•МОК•0,0135. Микроциркуляцию (МЦ) исследовали методом прижизненной контактной микроскопии в отраженном свете в серозной оболочке тонкой кишки крыс. О состоянии МЦ судили по количеству функционирующих капилляров, замедлению скорости кровотока и агрегации эритроцитов, оцениваемым по балльной системе (по шкале, разработанной в лаборатории). За ноль принимали исходное состояние кровотока. Содержание газов в крови и показатели кислотно-основного состояния организма определяли на газоанализаторе ABL500 (Radiometer, Дания) В этом же (третьем) разделе в контрольной серии (6-й) изучали влияние изотонического раствора натрия хлорида на течение экспериментального геморрагического шока. В 7-й серии вводили L-аргинин до кровопотери с 9 последующей инфузией солевого раствора и в 8-й серии – L-аргинин при геморрагическом шоке в составе солевого раствора. В 9 –12-й сериях при геморрагическом шоке в инфузионный раствор вводили селективные ингибиторы синтеза NO. В качестве регуляторов синтеза оксида азота применяли: неселективный (неизбирательный) ингибитор синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинин (ICN Biomedicals Inc.) – в 4-й серии; донор NO Lаргинин моногидрохлорид (Merk) – в 5,7,8-й сериях; селективные ингибиторы синтеза оксида азота – N6-(1-иминоэтил)-L-лизин гидрохлорид (L-NIL, 50 мг/кг), N5-(1-иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорид (L-NIО, 50 мг/кг), аминогуанидин (150 мг/кг) и S-метилизотиол (2 мг/кг) (ICN Biomedicals Inc.) – в 9-12 сериях. Состояние животных оценивали до кровопотери, перед инфузией и через 10 и 60 мин после инфузии. Выжившими считали животных, проживших более 24 часов, как принято в экспериментальных исследованиях. Результаты обработаны методом вариационной статистики в программе Statistica 7.0. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при величине р≤0,05. Основные результаты исследования Исследование включало несколько этапов. На первом этапе изучалось изменение эндогенной генерации оксида азота при различных видах шока. В экспериментах на белых крысах при ожоговом, геморрагическом и травматическом шоке определяли содержание оксида азота в тканях печени, почек, селезенки. Контролем служили здоровые животные (таблица 1). Как видно из таблицы, при всех моделируемых видах шока генерация оксида азота усиливается, но в разные сроки после нанесения травмы. Содержание оксида азота в ранний период наблюдения при ожоговом и травматическом шоке остается таким же, как у здоровых животных, что объясняется, вероятно, низкой активностью iNOS. Синтез оксида азота в тканях при ожоговом и травматическом шоке увеличивается только через 18-24 часа после травмы. При геморрагическом шоке выявлено выраженное и раннее (через 1 час от начала кровопотери) усиление генерации оксида азота в печени и почках в сравнении с животными после ожоговой травмы или сдавливания мягких тканей (таблица 1). В ткани печени NO синтезируется интенсивнее, чем в тканях почек и селезенки. Исходя из полученных результатов, дальнейшие исследования проводили на модели геморрагического шока. Важные данные были получены при сопоставлении величины АД и содержания NO в печени крыс при геморрагическом шоке. Выявлена обратная зависимость величины АД от содержания оксида азота в печени после массивной кровопотери. 10 Таблица 1 Содержание оксида азота в тканях белых крыс в норме и при различных видах шока Вид эксперимента Здоровые животные (контроль, 1 серия), n=9 Ожоговый шок (24 ч после травмы), n=7 Травматический шок (18 ч после травмы), n=7 Геморрагический шок, n=6 (2 серия) Содержание оксида азота в тканях (усл. ед.), Mm печень почки селезенка 3,40,4 0,20,1 5,60,8 10,00* 2,20,5* 10,62,3 10,81,9* 2,60,9 10,01,6 36,25,6* 3, 30,1* 5,32,2 Примечание: статистически значимые различия (р 0,05) между здоровыми животными и при различных видах шока отмечены знаком –*. Оказалось, что чем выше АД, тем меньше оксида азота содержится в печени, а при понижении АД количество оксида азота в печени возрастает. Взаимосвязь выработки оксида азота от величины АД позволяет говорить о его важной роли в патогенезе геморрагического шока. Для выяснения этого предположения были поставлены три серии экспериментов. Третья серия служила контролем к 4-й и 5-й. Выявлено, что предварительное введение неселективного ингибитора NW-нитро-L-аргинин (4 серия) и донора оксида азота L-аргинина (5 серия) существенно изменяет развитие геморрагического шока (таблица 2). Сопоставление величины АД, объема кровопотери, времени наступления выраженных нарушений МЦ и продолжительности жизни экспериментальных животных при введении регуляторов синтеза оксида азота показало, что инфузия неселективного ингибитора синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинина вызывает ранние и тяжелые нарушения МЦ в стенке тонкого кишечника крыс, что способствует быстрой гибели животных. При этом АД не падает ниже исходного, а происходит значительный его подъем, что свидетельствует о выраженном спазме периферических сосудов. Таким образом, введение неселективных ингибиторов, блокирующих конститутивную еNOS и вызывающих выраженные нарушения кровотока в жизненно важных органах при геморрагическом шоке, контрпродуктивно. При уменьшении образования NO в организме в ответ на кровопотерю развивается выраженная централизация кровообращения, о чем свидетельствует высокое АД при значительных нарушения МЦ в тканях крыс, что приводит к уменьшению продолжительности жизни животных (таблица 2). 11 Таблица 2 Объем кровопотери, артериальное давление, время наступления нарушений микроциркуляции при введении регуляторов синтеза оксида азота до начала кровопотери, Мm Cерии опытов 3 Контроль (n=6) 4 Ингибитор NO (n=8) 5 Донор NО (n=4) Объем кровопотери (мл/ 100 г массы) Время наступления выраженных нарушений МЦ после начала кровопотери (мин) 3,20,1 АД, мм рт.ст. Исходное К моменту выраженных нарушений МЦ Продолжительность жизни крыс (мин) 363 1414 536 658 2,40,2 183* 1267 1277* 524 4,20,2*+ 708*+ 1315 6010*+ 8312 Примечание: статистически значимые различия (р 0,05) между 3 и 4 сериями отмечены знаком *, между 4 и 5 сериями +. При введении донора NO требуется бóльшая кровопотеря для развития шока и сопоставимых с введением неселективного ингибитора нарушений микроциркуляции. Увеличение содержания оксида азота в результате инфузии L-аргинина позволяет обеспечить устойчивый уровень АД, способствует более длительному сохранению микрокровотока. Возможность большей кровопотери у крыс до наступления выраженных нарушений микроциркуляции при введении донора оксида азота свидетельствует о том, что NO задерживает нарушения кровообращения, развивающиеся при шоке, уменьшая степень централизации кровообращения. Следовательно, возникает необходимость поддерживать так называемый “базальный” уровня NO на ранних стадиях геморрагического шока. Анализ представленных экспериментальных материалов о зависимости изменения АД от содержания NO в печени крыс, а также результатов по влиянию неконкурентного ингибитора и донора оксида азота на течение геморрагического шока явились основанием для изучения возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока, сочетаемой с различными регуляторами синтеза NO. В экспериментах исследовали влияние донора оксида азота- L-аргинина и избирательных ингибиторов синтаз оксида азота на гемодинамику, кислотно- 12 основное состояние и содержание газов в крови крыс. Введение как доноров, так и ингибиторов NO проводилось на фоне инфузии двойного объема ФР. Донор NO применяли как до начала кровопотери, после которой вводили солевой кровезаменитель, так и по ее окончании в составе инфузионой среды. К окончанию кровопотери как в контроле, так и в опытных сериях отмечались практически не отличающиеся друг от друга изменения гемодинамических показателей (таблица 3). Инфузия изотонического раствора натрия хлорида приводила к частичной коррекции системной гемодинамики и в меньшей степени к восстановлению микроциркуляции (6 серия). Статистически значимо повышалось АД, но не достигало исходных величин. МОК и УО также увеличивались, хотя и в разной степени. В контроле МОК после замещения кровопотери был ниже, чем до начала инфузии. Введение L-аргинина как до начала кровопотери, так и после нее в составе инфузионной среды, приводило к значительному росту УО и МОК (таблица 3). Причем, в большей степени оказывал положительное воздействие донор NО, вводимый после кровопотери в составе инфузионной среды. РИЛЖ, резко сниженный в результате кровопотери, возрастал во всех сериях экспериментов, но менее всего – в контроле. L-аргинин способствовал достоверно большему увеличению РИЛЖ по сравнению с инфузией только кровезаменителя. ОПС после проведения инфузионной терапии уменьшалось. Самым низким оно было в результате введения L-аргинина в составе инфузионной среды (таблица 3). Таким образом, применение L- аргинина как до начала кровопотери, после которой инфузировали солевой кровезаменитель, так и по ее окончании в составе инфузионой среды, значительно повышает эффективность инфузионной терапии геморрагического шока и ведет к восстановлению системной гемодинамики. Защитное действие L-аргинина на сердце, возможно, связано с тем, что аргинин защищает кардиомиоциты от действия свободных радикалов, поскольку аргинин через орнитин может превращаться в глютаминовую кислоту, обладающую антиоксидантным действием. Однако аргинин является субстратом не только для NO - синтаз, но и для другого фермента – аргиназы, превращающего аргинин в орнитин, далее в мочевую кислоту. При предварительном введении аргинина, до начала кровопотери, вероятно, субстрат накапливался в организме в большем количестве и только его часть расходовалась на образование NO. Возможно, увеличение продукции NO, благодаря поступлению субстрата, оказывало кардиопротекторный эффект, реализующийся в значительной степени за счет вазодилататорных реакций коронарных и периферических сосудов. Вероятно, при этом в эндотелиальных клетках увеличивалось и количество промежуточного продукта метаболизма 13 аргинина – гидрокси-L-аргинина, который обладает способностью облегчать процессы окисления аргинина NOS, а также тормозить активность аргиназы. Таблица 3 Системная гемодинамика у крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия ФР (контроль, n=16), 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10), 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели АД, мм рт. ст. МОК, мл/мин х 100 г УО, мл/кг ОПС, дин х сек х см-5 10-4 /кг РИЛЖ, кгм / кг х мин Серии Исх. Конец кровопотери 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 140±3 135±4 139±6 15,3±0,2 15,0±0,3 15,2±0,4 0,36±0,01 0,38±0,01 0,39±0,02 7,3±0,1 7,2±0,2 7,4±0,2 289±7 274±5 283±12 57±5+ 54±4+ 48±6+ 4,2±0,2+ 5,6±0,5+ 6,1±0,5+ 0,12±0,01+ 0,17±0,01+ 0,17±0,02+ 10,8±0,7+ 8,3±0,8+ 7,0±1,3+ 34±4+ 43±7+ 39±6+ Время после окончания инфузии, мин 10 60 +# 99±2 100±3+# 100±2+# 101±3+# 102±5+# 91±6+# 13,1±0,5# 11,8±0,6+# 19,1±0,4+#* 17,9±1,3+#* 24,1±2,2+#• 23,5±2,0+#• 0,34±0,01# 0,31±0,02# 0,52±0,03+#* 0,48±0,03+#* 0,66±0,06+#• ^ 0,60±0,07+#• 6,2±0,3+# 7,2±0,6# 4,0±0,2+#* 4,6±0,6+#* 3,5±0,2+#• 3,3±0,2+#• 180±11+# 161±13+# 280±16+#* 245±16+#* 337±46+#• 292±31#• Примечание – здесь и в последующих таблицах статистически значимые различия (р<0,05) отмечены: по сравнению с исходными данными – +, с данными после окончания кровопотери – #, между данными 6и 7 серий – *, –6 и 8 серий – •, – 7 и 8 серий – ^. При анализе данных о состоянии МЦ (таблица 4) оказалось, что КФК, резко сниженное в результате кровопотери, восстанавливалось после проведения инфузионной терапии. Это восстановление было одинаковым во всех сериях экспериментов. Увеличивалась скорость кровотока в капиллярах. Причем, введение L-аргинина в составе кровезаменителя способствовало даже полному восстановлению скорости кровотока, до нормы снижалось количество агрегатов эритроцитов. После кровопотери рО2 увеличивалось, а рСО2 снижалось (таблица 5). В ходе экспериментов рО2 изменялось незначительно, что свидетельствовало о нормальной перфузии легочной ткани. В результате проведения инфузионной терапии наибольшая коррекция ацидоза отмечалась в серии экспериментов с 14 введением L-аргинина в составе ФР. К окончанию инфузии дефицит буферных оснований уменьшился и в серии с предварительным введением донора NО. Таблица 4 – Микроциркуляция у крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия ФР (контроль, n=16), 7серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10), 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели Серии Исх. Конец кровопотери Количество капилляров в поле зрения, % исх. 6 7 8 6 7 8 6 7 8 100±0 100±0 100±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 50±3+ 55±6+ 43±3+ -3,56±0,07+ -3,30±0,21+ -3,71±0,4+ 2,56±0,07+ 2,40±0,10+ 2,71±0,14+ Замедление кровотока в капиллярах, баллы Агрегация эритроцитов, баллы Время после окончания инфузии, мин 10 60 # 85±5 96±5# 93±7# 96±3# 97±3# 97±3# -0,81±0,20# -0,93±0,14+# -0,90±0,41# -0,80±0,10+# 0±0#•^ 0±0#•^ 1,15±0,14+# 1,33±0,09+# 1,10±0,31+# 0,80±0,21+# 0±0#•^ 0,14±0#•^ Таким образом, L- аргинин, применяемый, как до начала кровопотери, так и введенный в составе инфузионной среды, улучшает работу сердца, восстанавливает МЦ, способствует коррекции ацидоза и обеспечивает восстановление периферического кровообращения, несмотря на снижение ОПС, вызванное вазодилататорным действием донора оксида азота. Результаты экспериментов показали, что предпочтительнее вводить аргинин в составе инфузионной среды, а не предварительно до начала инфузии, т.к. при этом отмечалась значительная коррекция гемодинамики: значительно восстанавливался МОК, УО сердца, увеличивался РИЛЖ, возрастала скорость кровотока в капиллярах и при низком ОПС наблюдали выраженное восстановление микроциркуляции. Вероятно, увеличение продукции NO из Lаргинина усиливало генерацию базального уровня NO и поддерживало нормальную перфузию жизненно важных органов. Все это способствовало увеличению количества выживших животных. Выживаемость в группе с предварительным (до кровопотери) введением L-аргинина составляла 80%, при введении L- аргинина в составе инфузионной среды– 86%, что значительно выше, чем в контроле (54%). Известно, что массивная кровопотеря стимулирует активацию индуцибельной синтазы NO, под влиянием которой продуцируются избыточные количества NO. При геморрагическом шоке избыточную генерацию оксида азота можно уменьшить сочетанием кровезаменителей с 15 избирательными ингибиторами, не влияющими на eNOS. В качестве селективных ингибиторов синтеза оксида азота в работе использовали производные лизина(L-NІL) и орнитина(L-NІО), аминогуанидин и Sметилизотиол, которые вводили в сочетании с двойным объемом ФР. Таблица 5 – Содержание газов и КОС в артериальной крови крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия изотонического раствора натрия хлорида (контроль, n=16); 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10); 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели Серии Исх. Конец кровопотери рО2, мм рт.ст. 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 83,5±3,4 76,7±3,4 81,7±6,4 43,7±1,1 40,6±1,9 43,7±2,3 7,39±0,01 7,41±0,01 7,38±0,02 0,9±0,5 0,2±0,4 0,5±1,2 104,4±5,0+ 88,2±6,7+ 89,0±4,1+ 23,6±1,2+ 25,8±1,5+ 30,3±2,7+ 7,35±0,02+ 7,36±0,02+ 7,34±0,02+ -11,9±0,6+ -10,1±0,8+ -7,8±1,3+ рСО2, мм рт.ст. рН ВЕ, ммоль/л Время после окончания инфузии, мин 10 60 # 94,6±2,4 95,7±3,7+ 86,9±8,3 87,7±7,6 88,6±6,5 84,4±5,1 +# 32,1±0,9 27,1±1,6+ 30,8±1,3+ 29,1±2,5# 29,9±1,2+ 30,5±1,8+ 7,36±0,02 7,37± 0,03 7,39±0,01 7,41±0,03# 7,40±0,02# 7,42±0,02# -6,6±0,8+# -7,6±1,5+ -5,9±0,9+# -5,6±1,1+#* -4,0±1,4+# -4,5±1,6+# Общая характеристика изменений показателей системного кровообращения при инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективных ингибиторов синтеза оксида азота сводится к тому, что они вызывают увеличение МОК и УО сердца (правда, в разной степени), тогда как АД и ОПС меняются неоднозначно (таблица 6). При действии S-метилизотиола в составе инфузионной среды при геморрагическом шоке АД и ОПС увеличивались, тогда как при введении L-NІL АД повышалось незначительно, не достигая исходных значений, а ОПС снижалось. Казалось бы, при введении ингибиторов ОПС не должно снижаться. Вероятно, селективное ингибирование избыточной продукции NO уменьшало его содержание и способствовало улучшению сердечной деятельности. МОК и УО сердца возрастали более всего при введении L-NІО, менее после инфузии S-метилизотиола. Возможно, Sметилизотиол, ингибируя значительное количество NO, затрагивал активность конститутивной eNOS и снижал базальный уровень оксида азота, что неблагоприятно при геморрагическом шоке. 16 Таблица 6 – Изменения системной гемодинамики у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (6 серия, n=16) и селективных ингибиторов синтеза оксида азота - L-N1L (9 серия, n=9), L-NIO (10 серия, n=7), аминогуанидина (11 серия, n=6), S-метилизотиола (12 серия, n=9) в составе инфузионной среды Показатели Серии Исх. После кровопотери Время после окончания инфузии, мин 10 60 99±2 100±3 97±4 96±6 АД, 101±5 99±8 мм рт. ст. 122±5# 124±7# 133±4x 124±9x 13,1±0,5 11,8±0,6 МОК, 22,6±1,3+ 18,2±2,2+ мл/мин х 100 г 26,4±1,6* 25,9±2,8* 21,4±3,0# 22,9±2,9# 15,1±2,0x 11,3±2,0 0,34±0,01 0,31±0,02 УО, 0,58±0,05+ 0,47±0,06+ мл/кг 0,64±0,03* 0,65±0,05* 0,56±0,06# 0,60±0,07# 0,39±0,02 0,31±0,04 6,2±0,3 7,2±0,6 ОПС, 3,6±0,3+ 4,5±0,4+ дин х сек х см 3,2±0,1* 3,2±0,3* 5 10-4 /кг 5,0±0,6# 4,8±0,9# 8,5±1,6 9,8±1,6 180±11 161±13 РИЛЖ, 296±22+ 241±26+ кГм / кг х мин 376±20* 355±54·* 373±36# 378±45# 272±36x 189±12 * Примечание: в этой и последующих таблицах статистически значимые 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 140±3 142±4 125±4 138±2 148±5 15,3±0,2 15,3±0,2 15,5±0,5 15,0±0,3 15,5±0,5 0,36±0,01 0,38±0,02 0,42±0,03 0,35±0,02 0,37±0,01 7,3±0,1 7,5±0,3 6,5±0,2 7,4±0,2 7,8±0,3 289±7 293±8 263±14 279±5 310±7 57±5 58±4 49±8 53±9 60±4 4,2±0,2 4,2±0,4 5,4±0,9 4,3±0,6 5,2±0,5 0,12±0,01 0,13±0,01 0,16±0,03 0,14±0,02 0,14±0,01 10,8±0,7 11,6±1,2 9,2±2,2 10,7±1,7 10,2±0,8 34±4 33±5 41±10 33±11 42±5 различия (р0,05) отмечены: по сравнению с окончанием кровопотери - , между данными 6 и 9 серией - +; 6 и 10 - *; 6 и 11 - #; 6 и12 – x. Состояние микрокровотока в серозной оболочке стенки тонкого кишечника крыс, линейная скорость кровотока и КФК изменялись однонаправлено при использовании всех четырех ингибиторов, но в разной степени и, несмотря на снижение ОПС, отмечалось восстановление МЦ 17 (таблица 7). Скорость кровотока в капиллярах после инфузии увеличивалась во всех экспериментах, более всего после сочетанного введения изотонического раствора натрия хлорида с L-NІL и аминогуанидином и менее всего – после инфузии S-метилизотиола. Рост КФК был наименьшим после введения Sметилизотиола и практически оставался таким же, как в контроле. Число агрегатов эритроцитов также снизилось во всех сериях, причем, наиболее значительно в результате введения L-NIО и аминогуанидина, менее всего – после инфузии S-метилизотиола. Вероятно, L-NIО и аминогуанидин оказались достаточно селективны и ингибировали необходимое количество оксида азота, что способствовало уменьшению числа агрегатов эритроцитов при геморрагическом шоке. Анализ экспериментального материала выявил различия механизмов изменения гемодинамических параметров после введения селективных ингибиторов, а именно, неодинаковое участие сердечного и сосудистого компонентов в восстановлении уровня АД. Повышение АД при инфузии изотонического раствора натрия хлорида в сочетании с S-метилизотиолом обеспечивалось преимущественно за счет сосудистого компонента, поскольку ОПС несколько повышалось, а величины МОК и УО восстанавливались в меньшей степени, чем при использовании L-NІL, L-NІО и аминогуанидина. При инфузии S-метилизотиола наблюдалась все же умеренная централизация кровообращения, о чем свидетельствуют довольно высокие значения АД и возрастание ОПС. Однако не следует игнорировать и частичное участие сердечного компонента после инфузии S-метилизотиола, поскольку под влиянием его введения к 10 мин после окончания инфузии МОК и УО все же достигали исходных величин. Можно полагать, что участие сосудистого компонента недостаточно эффективно по сравнению с сердечным для восстановления перфузии тканей при инфузионной терапии геморрагического шока. Поскольку при введении неселективного ингибитора синтеза оксида азота (NW-нитро-L-аргинина, 4-я серия) выявлено усиление централизации кровообращения, можно сделать заключение о меньшей селективности Sметилизотиола по сравнению с L-NІL, L-NІО и аминогуанидином. Sметилизотиол, являясь менее селективным ингибитором, ингибирует не только индуцибельную, но и конститутивную синтазу, что нежелательно при геморрагическом шоке, так как нарушается перфузия ряда органов и тканей. Инфузия менее селективного ингибитора S-метилизотиола свидетельствует о необходимости сохранения при геморрагическом шоке базального уровня оксида азота, т.к. оксид азота позволяет поддержать кровоток в жизненно 18 важных органах. Это еще раз подтверждает полученные нами данные о роли NO в централизации кровообращения при геморрагическом шоке. Под влиянием L-NІL в составе инфузии АД восстанавливалось в той же мере, что и в контроле, но показатели сердечной деятельности существенно улучшались. Особенно выражено участие сердечного компонента в экспериментах с L-NІО и аминогуанидином, где зарегистрировано повышение АД и высокие УО и МОК. РИЛЖ значительно возрастал и даже превышал исходные значения (таблица 6). Таблица 7 Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (6 серия, n=16) и селективных ингибиторов синтеза оксида азота – L-N1L (9 серия, n=9), L-NIO (10 серия, n=7), аминогуанидина (11 серия, n=6), S-метилизотиола (12 серия, n=9) в составе инфузионной среды Показатели Серии Исх. После кровопотери Количество функционирующих капилляров в поле зрения, в % от исх. 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 6 9 10 11 12 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0,11±0,11 0±0 0±0 0±0 0±0 0,11±0,11 50±3 54±6 47±4 48±4 45±5 -3,56±0,07 -3,67±0,11 -3,29±0,14 -3,67±0,16 3,33±0,11 2,56±0,07 2,67±0,11 2,29±0,14 2,67±0,16 2,33±0,11 Линейная скорость кровотока в капиллярах, баллы Агрегация эритроцитов, баллы Время после окончания инфузии, мин 10 60 85±5 96±5 102±4+ 95±6 95±7* 93±3 92±7 95±5 86±7 83±5 -0,81±0,20 -0,93±0,14 -0,44±0,11+ -0,78±0,22 -0,86±0,14 -0,71±0,14 -0,17±0,16# -0,17±0,16# 1,00±0,25 1,00±0 1,06±0,14 1,20±0,14 0,89±0,11 1,11±0,11 0,86±0,14* 0,71±0,14* 0,67±0,16# 0,50±0,16# 1,29±0,14 1,29±0,14 Увеличение ударного объема было вызвано усилением сократительной активности миокарда. Возможно, улучшение работы сердца под влиянием селективных ингибиторов связано с активацией деятельности митохондриального аппарата клеток миокарда (процессов тканевого дыхания в кардиомиоцитах). При анализе содержания газов и показателей КОС в артериальной крови животных существенных отличий между сериями экспериментов не выявлено. Можно лишь отметить, что дефицит буферных оснований уменьшался более заметно после использования L-NΙО. 19 Сравнение действия применявшихся селективных ингибиторов при инфузионной терапии показало, что L-NΙО и аминогуанидин являются более эффективными ингибиторами, чем L-NΙL и S-метилизотиол, что позволяет говорить об их высокой селективности при использовании на данной модели геморрагического шока. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что селективное ингибирование избыточной продукции NO благоприятно, вероятно, оно не затрагивало eNOS. Можно полагать, что избирательные ингибиторы синтеза NO, снижая его генерацию при инфузионной терапии геморрагического шока, улучшают деятельность сердечно-сосудистой системы, вероятно, за счет увеличения коронарного кровотока и как следствие, сократительной активности миокарда, и, несмотря на сниженное ОПС, отмечается восстановление МЦ. Ингибиторы с большей степенью селективности способствуют высокой выживаемости (таблица 8). Таблица 8 – Выживаемость животных при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективных ингибиторов синтеза оксида азота Серии Контроль L-NIО L-NIL Аминогуанидин S-метилизотиол n 6 9 10 11 12 Выживаемость животных выжили погибли 8 8 7 0 6 3 6 0 4 5 % выживаемости 50 100 67 100 44 Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что при инфузионной терапии геморрагического шока необходимо эндотелийзависимое регулирование сосудистого тонуса. L-аргинин, как донор NO, можно рекомендовать при геморрагическом шоке в клинической практике для улучшения деятельности сердечно-сосудистой системы. При введении Lаргинина с инфузионной средой восстанавливается МОК, что происходит не в результате изменения частоты сердечных сокращений, а благодаря увеличению ударного объема сердца, т.е. усиливается сократительная активность миокарда. Кроме того, L-аргинин увеличивает скорость кровотока в капиллярах. Lаргинин можно рассматривать как перспективное средство для применения в предоперационном периоде. Результаты экспериментов выявили высокую эффективность избирательных ингибиторов NO при инфузионной терапии геморрагического шока. Большинство из них, регулируя содержание оксида азота при 20 кровопотере и шоке, селективно уменьшают избыток NO. Полученные результаты согласуются с данными ряда зарубежных исследователей [D'Annunzio V. еt.al., 2012; Menezes J.M. еt.al., 2002,], показавших, что применение при геморрагическом шоке селективных ингибиторов iNOS вызывает рост сердечного выброса, увеличение венозного возврата крови, а также увеличение почечного кровотока и скорости фильтрации. Ингибиторы оказывают защиту против органных повреждений и увеличивают выживаемость экспериментальных животных [Moochhala S.M., 2004]. Полученные результаты, позволяют выяснить роль оксида азота при геморрагическом шоке и открывают новые возможности повышения эффективности инфузионной терапии шока регуляторами синтеза оксида азота. ВЫВОДЫ 1. При геморрагическом шоке происходит изменение содержания оксида азота в органах и тканях крыс по сравнению со здоровыми животными. Отмечается раннее и значительное усиление генерации оксида азота в тканях печени и почек. 2. Неселективный ингибитор синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинин, введенный до начала кровопотери, снижая продукцию оксида азота, приводит к росту АД, выраженным нарушениям микроциркуляции, расстройствам метаболизма и быстрой гибели животных, что свидетельствует о необходимости сохранения базального уровня оксида азота для адекватной перфузии тканей при геморрагическом шоке. 3. Донор оксида азота L-аргинин сохраняет базальный уровень оксида азота при геморрагическом шоке, задерживая нарушения микроциркуляции и уменьшая степень централизации кровообращения. 4. Введение L-аргинина до начала кровопотери с инфузией солевого раствора по окончании кровопотери повышает устойчивость животных к геморрагическому шоку. L-аргинин, вводимый в составе солевого раствора после кровопотери, улучшает работу сердца, увеличивает рабочий индекс левого желудочка и восстанавливает микроциркуляцию, в результате чего возрастает продолжительность жизни экспериментальных животных. Lаргинин можно рассматривать как перспективное средство предоперационной подготовки пациентов и в качестве лечебного средства для включения в схемы инфузионной терапии геморрагического шока. 5. Избирательные ингибиторы синтеза оксида азота, введенные после кровопотери с солевым раствором, существенно улучшают деятельность сердечно-сосудистой системы, что приводит к увеличению выживаемости. Более селективные ингибиторы оказывают более выраженный эффект, увеличивают продолжительность жизни животных. При введении 21 аминогуанидина и L-NΙО выживаемость крыс, перенесших тяжелую кровопотерю, составляет 100% (в контроле 54%). СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ: 1. Кочетыгов Н.И. Применение регуляторов синтеза оксида азота при геморрагическом шоке и его инфузионной терапии в эксперименте/ Н.И. Кочетыгов, К.А. Гербут, М.И. Ремизова, Г.В. Гришина// Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2011. – №3. – С.35-39. 2. Гришина Г.В. Применение продуцента оксида азота – L-аргинина при инфузионной терапии геморрагического шока в эксперименте/ Г.В. Гришина, К.А. Гербут, М.И. Ремизова, Е.А. Селиванов//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 154, № 9. – С. 290-293. 3. Гришина Г.В. Современные кровезаменители при кровопотере и шоке// Вестник службы крови России. 2013. – № 4. С. 38-45. 4. Ремизова М.И. ″Действие доноров оксида азота на микроциркуляцию при инфузионной терапии геморрагического шока в эксперименте″/М.И. Ремизова. К.А. Гербут, Г.В. Гришина, К.Н.Нагорная // Патол. физиол. и экспер. терапия. 2014. – Т. 58, № 4. – С. 91-95. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ В ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ 1. Кочетыгов Н.И. Влияние регуляторов синтеза оксида азота на течение геморрагического шока в эксперименте/ Н.И. Кочетыгов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина //Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии (материалы Российской научно-практической конф., посвященной 70 - летию РоссНИИГТ) – СПб, 2002. – С. 314-315 2. Kochetygov N. The Hemodynamic effects of regulators of the nitric oxide in the experimental haemorrhagic shock/ N. Kochetygov, M. Remizova, K. Gerbut, G. Grishina // Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. Internation Conference. – Smolensk, Russia. – 2003. – P. 40-41. 3. Кочетыгов Н.И. Влияние регуляторов синтеза оксида азота на гемодинамику при геморрагическом шоке в эксперименте/ Н.И. Кочетыгов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина // Медицинский академический журнал. – 2003. – Т.3, приложение 4.– №3. – С. 133-134. 4. Кочетыгов Н.И. Применение эндотелийзависимых регуляторов синтеза оксида азота при инфузионной терапии геморрагического шока/ Н.И. Кочетыгов, Ю.С. Суханов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии (материалы Российской научно-практической конференции). – СПб., 2004. – С. 201-202. 5. Кочетыгов Н.И. Роль оксида азота при инфузионной терапии острой кровопотери/ Н.И. Кочетыгов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. 22 Гришина//Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии (материалы Российской научно-практической конференции). – СПб., 2004. – С. 206-207. 6. Кочетыгов Н.И. Роль оксида азота при геморрагическом шоке и его инфузионной терапии/ Н.И. Кочетыгов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина //Дезрегуляционная патология органов и систем” (материалы третьего российского конгресса по патофизиологии с международным участием). – М., 2004. – С.198. 7. Ремизова М.И. Регуляция кровообращения селективными ингибиторами синтеза оксида азота при геморрагическом шоке в эксперименте/ М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина, Н.И. Кочетыгов //Медицинский академический журнал. 2010. – № 1. С. 57-63. 8. Гербут К.А., Кочетыгов H.И., Гришина Г.В. Применение продуцента оксида азота – L-аргинина при инфузионной терапии геморрагического шока в эксперименте // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (материалы Всероссийской научно-практической конференции ФГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России). – Киров, 2010. – С. 172-173. 9. Ремизова М.И., Гербут К.А., Гришина Г.В. Регуляторы синтеза оксида азота при инфузионной терапии геморрагического шока в эксперименте // Трансфузиология. – 2011. – Т. 12, № 2. – С. 97. 10. Кочетыгов Н.И. Применение регуляторов синтеза оксида азота при геморрагическом шоке в эксперименте/ М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина // Медицина экстремальных ситуаций. – 2011. – № 3. – С. 105-110. 11. Гришина Г.В., Гербут К.А., Ремизова М.И. Влияние продуцента оксида азота – L-аргинина на кровообращение при геморрагическом шоке в эксперименте // Трансфузиология. – 2012. – Т. 13, № 3. – С.47-48. 12. Ремизова М.И. Роль оксида азота в патогенезе геморрагического шока и регуляция его содержания в эксперименте / М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина, Е.Н. Бургова, А.Ф. Ванин // Первая конференция Российского национального общества по изучению шока. – М., 2013. – С.53-54. 13. Ремизова М.И. Протекторное действие донора оксида азота оксакома при геморрагическом шоке в эксперименте/ М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина, А.Ф Ванин // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2013. – Т. 11, Спецвыпуск. – С. 120. 14. Гришина Г.В., Гербут К.А., Ремизова М.И. Сравнительная эффективность избирательных ингибиторов синтеза оксида азота при инфузионной терапии геморрагического шока в эксперименте// Трансфузиология. – 2014. – Т. 15, № 2. – С. 52-53.