(Phellinus linteus) подавляет рост, ангиогенез и инвазии клеток
реклама
Phellinus linteus подавляет рост, ангиогенез и инвазивное поведение клеток рака молочной железы путем ингибирования AKT сигнализации Phellinus linteus suppresses growth, angiogenesis and invasive behaviour of breast cancer cells through the inhibition of AKT signalling D Слива123* В Jedinak1 J Kawasaki1 K Харви1 V Slivova1 1Рак-Исследовательская Лаборатория, методист научно-Исследовательского института N 1800 Capitol Ave, E504, Индианаполис, В 46202, США 2Факультет Медицины, университет Индианы (Индианаполис, США 3Университет Индианы Симон онкологический Центр, Школа Медицины, университет Индианы (Индианаполис, США *Автор для переписки: [email protected] Противоопухолевую активность лекарственного гриба Phellinus linteus (PL), через стимуляцию иммунной системы или индукция апоптоза, была недавно описана. Однако молекулярные механизмы, ответственные за ингибирования инвазивном поведении раковых клеток остаются нерешенными. В настоящей работе мы показываем, что ЛП подавляет пролиферацию (Анкоридж-зависимые роста), а также формирование колонии (Анкоридждает рост) инвазионных клеток рака молочной железы человека. К торможению роста MDAMB-231 клеток опосредуется клеточного цикла в фазе S через upregulation Р27(Kip1) выражение. Phellinus linteus также подавляются инвазивном поведении MDA-MB-231 клетки за счет ингибирования адгезии клеток, миграция клеток и клеточных вторжения через подавление секреции урокиназы активатора плазминогена из клетки рака молочной железы. Кроме того, ЛП заметно тормозится ранних событий в кровеносных сосудов, капилляров формообразования человеческого аорты эндотелиальных клеток, через подавление секреции сосудистого эндотелиального фактора роста от MDA-MB-231 клеток. Эти эффекты возникают за счет ингибирования Серин-треонин киназы AKT сигнализации, поскольку PL подавлено фосфорилирования AKT в Thr(308) и Ser(473) в клетках рака молочной железы. Взятые вместе, наши исследования показывают, потенциальный терапевтический эффект PL против инвазивного рака молочной железы. Несмотря на то, что смертность от рака молочной железы рак молочной железы снизился на 22,9% с 1991 по 2003 год, рак молочной железы остается ведущей причиной смерти от рака среди 20-ти до 59-летний НАС женщинами оценивается в 40 460 новых смерти в 2007 г. (Джемал et al, 2007). Одна из причин такой высокой смертности является инвазивном поведении раковых клеток, что приводит к метастазов рака молочной железы. Метастазах рака состоит из нескольких взаимосвязанных технологических процессов, в том числе неконтролируемое пролиферации клеток, вторжение через окружающих тканей, миграции отдаленных участков человеческого тела, и адгезия, вторжения и колонизации других органов и тканей (Цена et al, 1997). Рост опухоли и метастазирование также требуют ангиогенеза, формирование кровеносных сосудов (капилляров прорастания от уже существующих судов (Folkman, 1995). Поэтому торможение роста, инвазивном поведении и рак клеточный ангиогенеза приведет к подавлению раковых метастаз и еще более повысит выживаемость больных раком молочной железы. Phellinus linteus (PL) - это базидиального гриба чаги, расположенных главным образом в тропиках Америки, Африки и Азии, где она получила широкое признание в качестве лекарственного гриба в традиционной Восточной медицине (Дай и Сюй, 1998). Биологически активные соединения изолированы от ЛП полисахариды (Песня et al, 1995), кислой proteo-со смешанным heteroglycans α- и β-связи, и (1перед 6)разветвленного типа (1перед 3)-glycan (Ким et al, 2003b). Эти сложные полисахариды были обнаружены в самых разных видов грибов и связаны иммуностимулирующее и противоопухолевые деятельности (Wasser, 2002). Поэтому, PL стимулировало пролиферации Т-лимфоцитов и активации в-клеток (Ким et al, 1996, 2003c), так и индуцированной созревания костного мозга, полученных дендритные клетки (Парк et al, 2003) и макрофагов реагирования (Ким et al, 2003a). С другой стороны, PL продемонстрировали противовоспалительный эффекты в липополисахарид-стимулирует макрофаги (Ким et al, 2006). Прямой противораковый эффект PL было продемонстрировано во время торможения инвазивных меланомы B16BL6 клеток через снижение экспрессии мРНК уровень урокиназы активатора плазминогена (УПА), и за счет ингибирования метастазы в легких мышей (Lee et al, 2005). Phellinus linteus подавлено, за счет ингибирования пролиферации циклин-зависимой киназы cdk2, 4 и 6, и индуцированного апоптоза через активацию каспазы-3 в клетки рака легких (Гуо et al, 2007) и апоптоз клеток рака предстательной железы (Коллинз et al, 2006; Чжу et al, 2007). В настоящем исследовании мы оценили эффект PL на инвазионных и метастазирующих клеток рака молочной железы человека. Здесь мы показываем, что ЛП не подавляет пролиферацию (Анкоридж-зависимые роста), а также формирование колонии (Анкоридждает рост) инвазионных клеток рака молочной железы человека. Кроме того, ЛП также подавляет инвазивном поведении MDA-MB-231 клетки за счет ингибирования адгезии клеток, миграция клеток и клеточных вторжения. Наконец, PL подавлено рака молочной железы клеточный ангиогенеза эндотелиальных клеток in vitro. В совокупности, наше исследование показывает механизм(ы), работающих в отношении ингибирования пролиферации, инвазивном поведении и ангиогенез инвазивного рака молочной железы клетки Выписка из лекарственных грибов PL. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культуры клеток и реагентов Человеческие клетки рака молочной железы (MCF-7, MDA-MB-231) и человеческих раковых клеток простаты (ПК-3, LNCaP) были получены из (ATCC, Манассас, штат Вирджиния, США). MCF-7 и MDA-MB-231 клетки культивировали в среде DMEM, ПК-3 клетки культивировали в F-12 средних и LNCaP клетки культивировали в RPMI 1640 среднего. Все носители, входящие пенициллина (U 50 мл-1), стрептомицина (U 50 мл-1), и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ФПС). СМИ и дополнений пришел из GIBCO BRL (Grand Island, NY, США). Фетальной сыворотки крупного рогатого скота была получена от Hyclone (Логан, ЮТА, США). Aqueus экстракт PL был поставлен майтаке Products Inc. (Paramus, NJ, США). Фондовый раствор готовят путем растворения PL в стерильной воде в концентрации 50 мг / мл-1 и хранят при температуре 4 с AKT ингибиторы LY294002 и AKT ингибитор III были получены от Calbiochem (Сан-Диего, Калифорния, США). Клеточная пролиферация анализа Пролиферация клеток определяли по tetrazolium соль метод, согласно инструкций производителя (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Кратко, раковые клетки культивировали в 96-луночный планшет и лечение в указанное время с ЛП (0-1 .0 мг / мл-1). В конце периода инкубации клеток были собраны и поглощения была определена с помощью ELISA ридером 570 нм, как описано (Цзян et al, 2004b). Данные пункты представляют собой среднее±С.О. в показательный эксперимент из трех экземплярах определений. Аналогичные результаты были получены в двух независимых экспериментов. Жизнеспособность клеток Жизнеспособность клеток MCF-7 и MDA-MB-231 клеток определяется после инкубации с ЛП (0-1 .0 мг / мл-1) на 24, 48 и 72 ч, окрасив с Трипановым Синим, как описано (Слива et al, 2002a). Анкоридж-дает рост MDA-MB-231 клетки были собраны и засевают в шесть-хорошо пластины, покрытой 1% агарозы. Анкоридж-дает рост оценивался после инкубации в течение 10-14 дней с культурой носителей с или без ЛП (0-1 .0 мг / мл-1), которые были заменены каждые 4 дня. Плиты были окрашены 0.005% кристаллический фиолетовый, и колонии были пересчитать вручную под микроскопом и фотографировал (Slivova et al, 2004). Анализ клеточного цикла MDA-MB-231 клеток (0,75 x 106) были посеяны и после 24 ч относиться с ЛП (0.5 мг / мл-1) за указанный период времени (0-48 ч). После инкубации клеток собирали trypsinisation, промывают dulbecco's фосфат-буферизованный солевой содержащий 2 мас.% FBS, и ресуспендировали в propidium йода (50 μg мл-1). Клеточный цикл анализ был проведен на FACStarПЛЮС проточный цитометр (Becton-Дикинсон, San Jose, CA, USA), как описано ранее (Слива et al, 2001). Данные среднее±С.О. из трех независимых экспериментах. Клеточной адгезии, миграции и вторжение анализов Адгезии клеток была выполнена с Cytomatrix Адгезии Полоски, покрытые человеческой витронектином (Chemicon International, Temecula, CA, США). Кратко, MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-0 .5 мг / мл-1) в течение 24 ч, собранный и рассчитывал. Адгезии клеток определяли через 1,5 ч инкубации при температуре 37 ОС (Ллойд et al, 2003). Миграция клеток MDA-MB-231 клеток, обработанных PL (0-1 .0 мг / мл-1), был оценен в Transwell палат в DMEM среде, содержащей 10% FBS (Slivova et al, 2004). Вторжение MDAMB-231 клеток, обработанных PL (0-1 .0 мг / мл-1), был оценен в Transwell камер с покрытием 100 μл матригель ТМ (BD Biosciences, Бедфорд, Массачусетс, США) в соотношении 1:4 с DMEM, после 72 ч инкубации (Slivova et al, 2004). In vitro эндотелиальных клеток морфогенез анализа (капиллярной морфогенез) Человека аорты эндотелиальных клеток (HAEC) дифференциация в капиллярно-как-структур было наблюдать с помощью двумерной матригель-на основе анализа, как было описано ранее (Харви et al, 2002). Изначально, 200 μл ледяной фактор роста-сокращение матригель (Becton Dickinson лабораторное Оборудование, Бедфорд, Массачусетс, США), внеклеточного матрикса препарат, получаемый из Engelbreth-Хольм-Рой опухоли, был помещен в каждую лунку 24-ну культуры ткани, обработанного листа. Человека аорты эндотелиальных клеток были собраны, ресуспендировали в бессывороточной ДМ СМИ и попылил на 3,5 ч 104 клеток на лунку-покрытые матригель. Человека аорты эндотелиальных клеток были дополнительно инкубируются с ЛП (0-0 .5 мг / мл-1) или с кондиционером СМИ от MDAMB-231 клеток, которые были подготовлены по инкубации MDA-MB-231 клеток в присутствии PL (0-0 .5 мг / мл-1) в течение 24 ч. Эндотелиальная ХЭ клетки дифференцировались в капиллярных структур в течение 16 ч инкубации при температуре 37 ОС в присутствии 5% CO2. Эти структуры были изучены под микроскопом ( ч 40) с помощью перевернутого Olympus CK40 микроскоп. Чтобы облегчить анализ структур, nonсторонник клеток, зарегистрированная в избытке среды были удалены друг от скважины до количественного анализа. Фотографии микроструктуры были приняты для оценки степени капиллярно-как структурное образование. Количественная оценка капиллярных структур был проведен подсчет количества узлов в поле, где узла определяется как пересечение не менее трех клеток. Каждой пробы проанализированы в трех экземплярах и воспроизведена, по крайней мере, два дополнительных экспериментов. Вестерн-блот-анализ MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 24-72 ч как указано в тексте и целом-клеточные экстракты, приготовленные, как описано ранее (Слива et al, 2002a, 2002b). Равное количество белков (20 μг в пер.) были разделены на NuPAGE 4-12% Bis-трис лари (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и переносится PVDF мембраны (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Белка выражение было обнаружено соответствующие первичные антитела анти-циклин D1, анти-циклин-E, анти-циклин -, анти-cdk2, анти-cdk4, анти-Р21, анти-Р27, анти-β-актина, (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), антиAKT, анти-фосфо-AKT (Thr308) и анти-фосфо-AKT (Ser473) (Клеточной Сигнализации, Беверли, Массачусетс, США), соответственно. Экспрессия белков были визуализированы с помощью ECL Вестерн-Блоттинга Detection System (Amersham Biosciences, Бакингемшир, Великобритания). Урокиназа-активатора плазминогена секреции DMEM СМИ от MDA-MB-231 клеток, обработанных PL (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 24 ч были собраны и сосредоточены, и секрецию УПА была обнаружена с помощью Вестерн-блотанализ с анти-УПА антител (Онкоген Исследовательских Продуктов, Cambridge, MA, USA), как описано (Слива et al, 2002b). Денситометрические анализ Авторадиограммах Западной помарки были отсканированы с HP scanjet 5470c сканера. Оптических плотностей Р27, фосфо-AKT (Thr308), фосфо-AKT (Ser473), AKT, β-актина и УПА белков на фильмы были количественно определены и проанализированы с ООН-SCANЭТО программное обеспечение (Шелк Научных, Орем, UT, США). Коэффициенты p27/βактина и phosphoAkt/Akt были нормированы коэффициенты каждого элемента на единицу стоимости. Фактор роста эндотелия сосудов секреции MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-0 .5 мг / мл-1) в течение 24 ч, сотовый массовой информации, собранной и выделение фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) был определен с помощью соответствующих Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, США) в соответствии с инструкциями производителя. Статистический анализ Данные представлены в виде средств±С.О. Статистические сравнения между контрольной группой (0 μg мл-1 ЛП) и групп, обладающих различными PL дозы осуществляется с помощью двусторонней Студента т-тесты. Значение P<0.05 считался значительным. РЕЗУЛЬТАТЫ Phellinus linteus подавляет пролиферацию и колонии формированию высоко клетках инвазивного рака молочной железы Инвазивном поведении раковых клеток напрямую связано с их метастатический потенциал в результате высокой смертности от рака. Поэтому, если мы оценили PL тормозит рост инвазионных (MDA-MB-231) и плохо инвазивных (MCF-7) клетки рака молочной железы. Как видно в Рис. 1, повышенная концентрация ЛП (0-1 .0 мг / мл-1) заметно подавлен распространения MDA-MB-231, а также клетками MCF-7 дозы, и в зависимости от времени. Тем не менее, влияние на PL плохо инвазивных клеток был более ярко выражен, потому концентраций 0.25, 0.5 и 1.0 мг / мл-1 ЛП подавлено пролиферации клеток MCF-7 на 60.2, 70.1 и 78,0%, соответственно (На рис. 1Б), в то время как в той же концентрации подавлено распространения MDA-MB-231 клеток на 15,5, 21.5 и 43,1%соответственно (Рис. 1A), через 24 ч инкубации. Такую же чувствительность клеток MCF-7 бросалось в глаза и после дополнительных 48 и 72 ч инкубации, где только высокая концентрация ЛП (1.0 мг / мл-1) подавляет пролиферацию плохо инвазивных и инвазионных клеток рака молочной железы с тем же потенции (Рис. 1). Чтобы определить, если эффект от ЛП на раковые клетки-это цитотоксические или цитостатической, мы оценили жизнеспособность клеток через 24, 48 и 72 ч ЛП лечения. Хотя PL снизилась жизнеспособности MDA-MB-231 и клетками MCF-7, сильнейший угнетение клеточного жизнеспособность на высшем используется концентрация ЛП (1.0 мг / мл-1) после 72 ч было лишь 13,5% MDA-MB-231 клеток (Рис. 1C) и 10,6% за клетками MCF-7 (Рис. 1D), в то время как в той же концентрации подавлено распространения MDA-MB-231 клеток 86.6% (Рис. 1A) и клетками MCF-7-90,6% (На рис. 1Б). Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что ЛП подавляет рост клеток рака молочной железы преимущественно через его цитостатическое действие. Интересно, PL также подавляются распространения плохо инвазивных предстательной железы (LNCaP) и инвазионных предстательной железы (ПК-3) раковых клеток дозы, и в зависимости от времени, и LNCaP клетки были более чувствительны к ЛП лечения (не показано). В дополнение к пролиферации клеток (Анкоридж-зависимые роста), колониеобразования (Анкоридж-дает рост) является одним из характерная особенность метастатический потенциал раковых клеток in vitro и сильно коррелирует с онкогенез in vivo (Фридман и голени, 1974). Чтобы определить, является ли PL подавляет колонии формированию высоко клетках инвазивного рака молочной железы, мы оценили Анкоридж-дает рост MDA-MB-231 клеток. Как видно в Рис. 2, MDA-MB-231 клеток, сформированных на агаре колонии после 14 дней инкубации, и наличие повышенной концентрацией ЛП (0-1 .0 мг / мл-1), привело к значительному подавлению количества колоний (Рис. 2E). Поэтому, PL тормозит Анкориджзависимых, а также Анкоридж-дает рост высоко агрессивных клеток рака молочной железы. Phellinus linteus индуцирует клеточного цикла в фазе S Чтобы определить, является ли ингибирование пролиферации клеток связано с клеточного цикла, MDA-MB-231 клетки были обработаны в течение 24 и 48 ч с ЛП (0.5 мг / мл-1) и проанализированы методом проточной цитометрии. Клеточный цикл анализ показал, что ЛП не вызывает клеточного цикла в S-фазе клеточного цикла (Таблица 1), где количество клеток в S-фазе существенно увеличилось с 27% (контроль - 0 ч) до 34% (24 ч) и 44% (48 ч). Кроме того, ЛП лечение не привело, количество клеток в суб-G0/G1 этап, дальше, предполагая, что цитостатического эффекта ЛП на MDA-MB-231 клеток (Таблица 1). Для изучения механизма, ответственного за клеточного цикла в S-фазе, мы оценили экспрессии регуляторных белков клеточного цикла (cyclins) и cdks, участвующих в продвижении от стадии G1 S-фазы (Шерр и Робертс, 1999; Экхольм и Тростника, 2000). Поэтому, MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 24 ч и выражение циклин D1, E, A, cdk4, cdk2, p21 и Р27 в клеточных экстрактов, оценивали с помощью Вестерн-блот-анализ соответствующих антител. Ни G1 регуляторных белков циклин D1, cdk4 или p21, G1-поздней фазы G1/S-фазе регуляторных белков циклин Е, и cdk2 продемонстрировали изменения в выражении их после лечения ПЛ (Рис. 3A). Тем не менее, ЛП (0,5 и 1,0 мг / мл-1) заметно индуцированной экспрессии циклин-зависимых киназ ингибитор Р27 (Рис. 3Б). Поэтому, PL подавляет пролиферацию клеток рака молочной железы по регуляция Р27 результате в S-фазе клеточного цикла. Phellinus linteus подавляет инвазивном поведении клеток рака молочной железы Способность раковых заболеваний метастазировать, непосредственно связанные с клеточной адгезии, миграции и вторжения. Интегрина рецепторов αVβ3 участвует в адгезии клеток рака молочной железы за счет взаимодействия с внеклеточного матрикса белка витронектином (Вонг et al, 1998). Для расследования если PL влияет на сцепление инвазивного рака молочной железы клеток MDA-MB-231 клетки были подавить с ЛП (0-0 .5 мг / мл-1) в течение 24 ч и адгезию витронектином была определена. Как видно в На рис. 4А адгезии MDA-MB-231 клеток был заметно подавлен PL лечения. Далее, мы оценили, если PL также препятствует миграции клеток. MDA-MB-231 клетки были подавить с ЛП (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 1 ч и миграции клеток определяли после дополнительных 5 ч инкубации. Как видно в Рис. 4б ЛП также заметно подавлен миграции клеток рака молочной железы в дозозависимый характер. Наконец, эффект от ЛП на сотовый инвазивности оценивали. MDA-MB231 клетки были покрытием на матригель покрытием фильтры в присутствии PL (0-1 .0 мг / мл-1) и количество клеток, вторглись через матригель насчитал 48 ч после инкубации. Как видно в Рис. 4C, PL тормозит вторжения MDA-MB-231 клеток в зависимости " доза-ответ образом. Потому что метастазов рака и инвазивности связанных с УПА-ОУН-УПА рецепторов (Улар) системы, мы оценили ли PL влияет на секрецию ОУН-УПА с раковыми клетками. MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 24 ч и УПА секреции оцениваться с помощью Вестерн-блот-анализ в номерах СМИ. В согласуются с данными, демонстрируя ингибирование клеточной адгезии, миграции и вторжение PL заметно снижение секреции ОУН-УПА с MDA-MB-231 клеток (Рисунок 4D). Phellinus linteus препятствует капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток путем подавления секреции VEGF Капиллярный морфогенеза (трубка формирования) эндотелиальных клеток человека является одним из первых важных шагов в ангиогенеза, связанные с прогрессирование рака и метастазов. Потому что рак микросреду содержит множество клеток, мы также оценили если ингибирование капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток могут быть опосредованы через клетки рака молочной железы. Поэтому мы определили если PL себя или кондиционированного СМИ из клеток рака молочной железы подвергаются PL подавить капиллярной морфогенез HAECs. Человека аорты эндотелиальных клеток, выращенных на матригель относились непосредственно с ЛП (0-0 .5 мг / мл-1) или с кондиционером СМИ от MDA-MB-231 клеток, обработанных PL (0-0 .5 мг / мл-1, PL-СМ) в течение 24 ч, и трубка формирования были оценены. Как видно в Рис. 5A, PL значительно уменьшается капиллярной морфогенез HAECs. Кроме того, кондиционером СМИ от MDA-MB-231 клетки без PL индуцированных капиллярной морфогенез HAECs (PL vs PL-СМ на PL 0), и-в СМИ из клеток, облученных PL PL-СМ) также подавляются капиллярной морфогенез HAECs в " доза-реакция " манере (Рисунок 5A-C). Потому что MDA-MB-231 экспрессируют проангиогенных VEGF (Basu et al, 2005), мы предположили, что выделяемый VEGF из этих клеток вызывает капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток, которые могут быть ограничены PL. Поэтому мы оценивали ли PL угнетает секрецию VEGF от MDA-MB-231 клеток, обработанных PL (0-0 .5 мг / мл-1). Как видно в Рис. 5D, секрецию VEGF от MDAMB-231 клеток было заметно сократились на PL доза-ответ образом. В совокупности, наши данные позволяют предположить, что ЛП не препятствует капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток как непосредственно, так и опосредованно, через подавление секреции VEGF из клетки рака молочной железы. Phellinus linteus ингибирует активность AKT киназы AKT Серин-треонин киназы (протеин-киназы B) регулирует различные клеточные процессы путем фосфорилирования широкого спектра вниз по течению субстратов, наконец, в результате экспрессии белков, участвующих в клеточной пролиферации, инвазивность и ангиогенеза (среди прочихWoodgett, 2005; Диллон et al, 2007). Чтобы определить, если PL модулирует AKT активности в клетках рака молочной железы, MDA-MB-231 клетки были обработаны PL (0-1 .0 мг / мл-1) в течение 24 ч и фосфорилирования статус AKT оценивать в целом-клеточные экстракты с помощью Вестерн-блот анализа. Как видно в Рис. 6A, PL подавляет фосфорилирование AKT в Thr308 в зависимости " доза-ответ образом. Кроме того, ЛП лечения также заметно снизился фосфорилирования AKT в Ser473 (Рис. 6Б). Чтобы оценить, если борьбе с AKT деятельности ЛП непосредственно отвечает за подавление капиллярной морфогенез через подавление экспрессии VEGF в MDA-MB-231 клеток, мы использовали фармакологический подход с конкретными AKT ингибиторы. Поэтому, MDA-MB-231 клетки были обработаны LY294002 (10 μМ) или AKT ингибитор III (10 μМ) в течение 24 ч, и секрецию VEGF оценивали. Как видно в Рис. 7А, AKT ингибиторы заметно подавляется секреция VEGF из клетки рака молочной железы. Кроме того, кондиционером СМИ от MDA-MB-231 клеток, обработанных и LY294002 AKT ингибитор III угнетал капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток (Рис. 7Б). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что подавление ангиогенеза in vitro ЛП является опосредованной, в какой-то степени, через подавление AKT деятельности, что приводит к подавлению секреции VEGF из клетки рака молочной железы. ОБСУЖДЕНИЕ Несмотря на различные теории биологии рака молочной железы, так как (i) местные заболевания, которое распространяется по времени для развития отдаленных метастазов; (ii) системное заболевание с самого начала, с отдаленными метастазами в настоящее время хорошо до диагностики (iii) или комбинации обоих как Гетерогенное заболевание, метастазах рака является одной из главных медицинских проблем больных раком молочной железы (Punglia et al, 2007). Хотя некоторые химиотерапевтические препараты или их комбинации (например. таксаны, trastumazab, гемцитабин или капецитабин) проявившие активность в метастатическим раком молочной железы, Настройка (Tripathy, 2007), существует нехватка природных антипролиферативное и антиметастатических нетоксичен агентов. Как показала практически четыре десятилетия назад, полисахарид выдержки из базидиального гриба чаги PL подавляется рост опухоли in vivo (Chihara et al, 1969). Кроме того, ЛП также снижение роста опухоли и частота легочных метастазов без токсических эффектов (Хан et al, 1999). Недавние исследования, освещены некоторые молекулярный механизм(ы), ответственных за подавление роста путем клеточного цикла и индукция апоптоза в легких и клетки рака простаты (Коллинз et al, 2006; Гуо et al, 2007; Чжу et al, 2007). Тем не менее, молекулярный механизм(ы), ответственных за подавление инвазивном поведении и ангиогенеза был не полностью решены. В настоящей работе мы показываем, что ЛП ингибирует пролиферацию клеток (Анкориджзависимые роста), а также формирование колонии (Анкоридж-дает рост) инвазионных клеток рака молочной железы через S-фазе клеточного цикла при посредничестве регуляция экспрессии Р27. Рост клеток, которое является отражением развития клеточного цикла, aberrantly регулируются в большинстве раковых заболеваний. Клеточный цикл регулируется ряд контрольно-пропускных пунктов найма cyclins, cdks и cdk ингибиторы (Шерр, 1966). Р27 является одним из cdk ингибиторы, который связывает S-фазе циклин-cdk комплексов и подавляет их стимулирующее клеточный цикл мероприятий. Потому что потеря Р27 выражение было связано с агрессивным поведением в различных человеческих эпителиальных опухолей, включая рак груди, индукция Р27 выражение может привести к клеточного цикла и ингибированию роста опухоли (Тан et al, 1997; Ллойд et al, 1999; Макри и лоды, 1999). Наши данные согласуются с недавних работ, также демонстрирует торможение роста предстательной железы и лейкемия клетки через S-фазе клеточного цикла по регуляция экспрессии Р27 (Чжан et al, 2006; Shishodia et al, 2007). Недавно, Гуо et al (2007) показал, что ЛП подавляет рост клеток рака легких через G1-фазе клеточного цикла при посредничестве ингибирование cdk2, 4 и 6 деятельности. Наши результаты показывают клеточного цикла в фазе S в клетках рака молочной железы через upregulation Р27. Тем не менее, наши данные не в несогласии с Guo et al потому что проход через стадии G1 в S-фазе регулируется деятельность cdk2, 4 и 6, которые контролируются cdk ингибитор Р27 (Slingerlan и Пагано, 2000). Кроме того, клеточного цикла в фазе S может также интерпретироваться как ареста на G1-S, потому что большинство клеток в G0/G1 и S, но не G2 (Таблица 1). Самое главное, PL подавляет рост раковых клеток клеточного цикла. Здесь мы показываем, что ЛП не препятствует адгезии, миграции и вторжение через подавление секреции ОУН-УПА с высоко клетках инвазивного рака молочной железы. Наши данные согласуются с исследованием Lee et al (2005) демонстрируя ингибирования адгезии, вторжения и выражение УПА мыши в клетках меланомы. Кроме того, наши данные позволяют предположить, механизма ингибирования инвазивности ЛП. Таким образом, ОУН-УПА с секретным клеток рака молочной железы взаимодействует с упар и преобразует плазминогена, чтобы плазмина (Blasi и Carmeliet, 2002). Плазмина ухудшает ECM компонентов и стимулирует другие протеолитические ферменты (ММПС), которые посредством разложения ECM способствовать ячейки вторжения (Blasi и Carmeliet, 2002). Секретным УПА можно привязать к упар и образует комплекс с интегрина рецепторов αVβ3, которые в своем взаимодействии с витронектином участвует в адгезию и миграцию клеток рака молочной железы (Slivova et al, 2005). Ингибирование УПА секреции позволит снизить формирования УПА-Улар-αVβ3-витронектином комплекса с последующим подавлением адгезии, миграции клетках инвазивного рака молочной железы. Кроме того, ЛП также могут модулировать деятельности других белков, участвующих в инвазивном поведении клеток рака молочной железы (напр. матриксные металлопротеиназы, β1 и β4 интегрины, рецепторов эпидермального фактора роста и др. (Каррауэй и Суини, 2006; Бисселл, 2007)). Тем не менее, в настоящем исследовании мы предполагаем, что в PL подавляет инвазивности через ингибирование УПА секреции. И, наконец, мы и другие уже продемонстрировал, что подавление УПА подавлено инвазивности клеток рака молочной железы (Слива et al, 2002b; Das et al, 2003: Mi et al, 2006). Недавно, Песня et al (2003) продемонстрировали антиангиогенный деятельности ЛП в хориоаллантоисной мембраны (CAM) куриных эмбрионов анализа. Однако механизм подавление ангиогенеза ЛП, связанные с раком, ранее не обращался. В настоящей работе мы показываем, что ЛП тормозит одним из первых шагов в ангиогенеза - Тюбе формирование эндотелиальных клеток. А ЛП напрямую подавляется капиллярной морфогенез эндотелиальные клетки, полученные данные предполагают, что данный эффект может быть опосредован, за счет ингибирования секреции VEGF из клетки рака молочной железы. Хотя в наших экспериментальных условиях было невозможно удалить PL от обусловленного СМИ из клеток рака молочной железы (PL-СМ), и поэтому их ингибирующее действие на капилляры, морфогенез HEACs может рассматриваться как прямое воздействие на PL HEACs, наши данные позволяют предположить, что оба (прямые и косвенные) эффектов. Таким образом, (i) обусловлено массовой информации от клетки рака молочной железы без PL значительно увеличилось капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток, предположив, что проангиогенных фактором является выпущенный из клетки рака молочной железы, (ii) PL себя, а также кондиционером носитель, содержащий PL подавлено капиллярной морфогенез и (iii) выделение VEGF из клеток рака молочной железы был обитаем, ЛП. По согласованию с нашим наблюдениям, подавление эндотелия капилляров морфогенез через ингибирование секретным VEGF от различных видов раковых клеток был недавно описан (Fukumoto et al, 2005; Стэнли et al, 2005; Jang et al, 2007; Гонконг et al, 2007). Поэтому, подавления специфического проангиогенных белка в раковых клеток, влияют на всю рака микроокружения (содержащие различные клетки) и, наконец, в результате подавления ангиогенеза опухоли. Один из подходящих молекулярной рака целей AKT киназы, который торможения в клетках рака молочной железы в результате клеточного цикла, торможение роста и формирование колонии, торможению миграции, вторжения и подавление ангиогенеза (Das et al, 2003; Якуб et al, 2003; Цзян et al, 2004a; Basu et al, 2005; Fukumoto et al, 2005; Jallal et al, 2007). Наши данные наглядно демонстрируют, что ЛП не подавляет AKT деятельности за счет ингибирования AKT фосфорилирования в Thr308 и в Ser473 в MDA-MB-231 клеток, которые демонстрируют высокий уровень конститутивно активных AKT. Кроме того, торможение с AKT LY294002 и более конкретные AKT ингибитор III подавляется секреция VEGF от рака молочной железы клетки, что привело к снижению капиллярной морфогенез эндотелиальных клеток. Наши наблюдения находится в согласии с Xia et al (2006) кто продемонстрировал, используя siRNA против AKT, подавление экспрессии VEGF в клетки рака яичников, и подавление ангиогенеза в CAM куриных эмбрионов анализа. В заключение, наши исследования показывают, PL, как природные соединения, обладающие лекарственным антипролиферативным, и антиметастатической антиангиогенный эффекты, которые могли бы быть рассмотрены для лечения инвазивного рака молочной железы. Тем не менее, дальнейшие исследования необходимы для подтверждения и оценки этих эффектов противоопухолевых in vivo. Эта работа была поддержана методист фонда Здравоохранения, отделом Медицинских Исследований Армии и Materiel Command, Рак Молочной железы научной Программе и маитаке Products Inc. Phellinus linteus suppresses growth, angiogenesis and invasive behaviour of breast cancer cells through the inhibition of AKT signalling D Sliva123* A Jedinak1 J Kawasaki1 K Harvey1 V Slivova1 1Cancer Research Laboratory, Methodist Research Institute 1800 N Capitol Ave, E504, Indianapolis, IN 46202, USA 2Department of Medicine, Indiana University Indianapolis, IN, USA 3Indiana University Simon Cancer Center, School of Medicine, Indiana University Indianapolis, IN, USA *Author for correspondence: [email protected] Despite the fact that breast cancer mortality of breast cancer decreased by 22.9% from 1991 to 2003, breast cancer remains the leading cause of cancer death among 20- to 59-year-old US women with estimated 40 460 new death in 2007 (Jemal et al, 2007). One of the reasons for such a high mortality is the invasive behaviour of cancer cells, which results in the metastasis of breast cancer. Cancer metastasis consists of several interdependent processes including uncontrolled cell proliferation, invasion through surrounding tissues, migration to the distant sites of the human body, and adhesion, invasion and colonisation of other organs and tissues (Price et al, 1997). Tumour growth and metastasis also require angiogenesis, the formation of blood vessels by capillaries sprouting from pre-existing vessels (Folkman, 1995). Therefore, inhibition of growth, invasive behaviour and cancer cell-mediated angiogenesis will lead to the suppression of cancer metastasis and would further increase survival of breast cancer patients. Phellinus linteus (PL) is a basidiomycete fungus, located mainly in tropical America, Africa and Asia, where it gained significant recognition as medicinal mushroom in the traditional Oriental medicine (Dai and Xu, 1998). The biologically active compounds isolated from PL are polysaccharides (Song et al, 1995), acidic proteo-heteroglycans with mixed α- and β-linkages, and a (1 → 6)-branched type (1 → 3)-glycan (Kim et al, 2003b). These complex polysaccharides have been detected in a variety of different mushroom species and linked to the immunostimulatory and antitumour activities (Wasser, 2002). Therefore, PL stimulated proliferation of T lymphocytes and activated B cells (Kim et al, 1996, 2003c), and induced maturation of bone marrow-derived dendritic cells (Park et al, 2003) and the macrophage response (Kim et al, 2003a). On the other hand, PL demonstrated anti-inflammatory effects in lipopolysaccharide-stimulated macrophages (Kim et al, 2006). The direct anticancer effect of PL has been demonstrated by the inhibition of invasive melanoma B16BL6 cells through the downregulation of mRNA level of urokinaseplasminogen activator (uPA), and by the inhibition of pulmonary metastasis in mice (Lee et al, 2005). Phellinus linteus suppressed proliferation by the inhibition of cyclin-dependent kinases cdk2, 4 and 6, and induced apoptosis through the activation of caspase 3 in lung cancer cells (Guo et al, 2007) and apoptosis of prostate cancer cells (Collins et al, 2006; Zhu et al, 2007). In the present study, we evaluated the effect of PL on the highly invasive and metastatic human breast cancer cells. Here, we show that PL inhibits proliferation (anchorage-dependent growth) as well as colony formation (anchorage-independent growth) of highly invasive human breast cancer cells. In addition, PL also suppresses invasive behaviour of MDA-MB-231 cells by the inhibition of cell adhesion, cell migration and cell invasion. Finally, PL suppressed breast cancer cell-mediated angiogenesis of endothelial cells in vitro. Collectively, our study suggests the mechanism(s) employed for the inhibition of proliferation, invasive behaviour and angiogenesis of invasive breast cancer cells by an extract from medicinal mushroom PL. MATERIALS AND METHODS Cell culture and reagents Human breast cancer cells (MCF-7, MDA-MB-231) and human prostate cancer cells (PC-3, LNCaP) were obtained from ATCC (Manassas, VA, USA). MCF-7 and MDA-MB-231 cells were maintained in DMEM medium, PC-3 cells were maintained in F-12 medium and LNCaP cells were maintained in RPMI 1640 medium. All media contained penicillin (50 U ml−1), streptomycin (50 U ml−1), and 10% fetal bovine serum (FBS). Media and supplements came from GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA). Fetal bovine serum was obtained from Hyclone (Logan, UT, USA). Aqueus extract of PL was supplied by the Maitake Products Inc. (Paramus, NJ, USA). Stock solution was prepared by dissolving PL in sterile water at a concentration 50 mg ml−1 and stored at 4°C. AKT inhibitors LY294002 and AKT inhibitor III were obtained from Calbiochem (San Diego, CA, USA). Cell proliferation assay Cell proliferation was determined by the tetrazolium salt method, according to the manufacturer's instructions (Promega, Madison, WI, USA). Briefly, cancer cells were cultured in a 96-well plate and treated at indicated times with PL (0–1.0 mg ml−1). At the end of the incubation period, the cells were harvested and absorption was determined with an ELISA plate reader at 570 nm, as described (Jiang et al, 2004b). Data points represent mean±s.d. in the representative experiment of triplicate determinations. Similar results were obtained in two independent experiments. Cell viability Cell viability of MCF-7 and MDA-MB-231 cells was determined after incubation with PL (0– 1.0 mg ml−1) for 24, 48 and 72 h by staining with Trypan Blue as described (Sliva et al, 2002a). Anchorage-independent growth MDA-MB-231 cells were harvested and seeded in six-well plates coated with 1% agarose. Anchorage-independent growth was assessed after incubation for 10–14 days with culture media with or without PL (0–1.0 mg ml−1), which were replaced every 4 days. Plates were stained with 0.005% crystal violet, and the colonies were counted manually under a microscope and photographed (Slivova et al, 2004). Cell cycle analysis MDA-MB-231 cells (0.75 × 106) were seeded and after 24 h treated with PL (0.5 mg ml−1) for the indicated period of time (0–48 h). After incubation, the cells were harvested by trypsinisation, washed with Dulbecco's phosphate-buffered saline containing 2% FBS, and resuspended in propidium iodine (50 μg ml−1). Cell cycle analysis was performed on a FACStarPLUS flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), as previously described (Sliva et al, 2001). Data are the mean±s.d. from three independent experiments. Cell adhesion, migration and invasion assays Cell adhesion was performed with Cytomatrix Adhesion Strips coated with human vitronectin (Chemicon International, Temecula, CA, USA). Briefly, MDA-MB-231 cells were treated with PL (0–0.5 mg ml−1) for 24 h, harvested and counted. Cell adhesion was determined after 1.5 h of incubation at 37°C (Lloyd et al, 2003). Cell migration of MDA-MB-231 cells treated with PL (0– 1.0 mg ml−1) was assessed in Transwell chambers in the DMEM medium containing 10% FBS (Slivova et al, 2004). Invasion of MDA-MB-231 cells treated with PL (0–1.0 mg ml−1) was assessed in Transwell chambers coated with 100 μl of Matrigel™ (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) diluted 1:4 with DMEM, after 72 h of incubation (Slivova et al, 2004). In vitro endothelial cell morphogenesis assay (capillary morphogenesis) Human aortic endothelial cell (HAEC) differentiation into ‘capillary-like' structures was observed using a two-dimensional Matrigel-based assay as we described previously (Harvey et al, 2002). Initially, 200 μl of ice-cold growth factor-reduced Matrigel (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, USA), an extracellular matrix preparation derived from the Engelbreth–Holm–Swarm tumour, was placed into each well of a 24-well tissue culture-treated plate. Human aortic endothelial cells were harvested, resuspended in serum-free EBM media and plated at 3.5 × 104 cells per well-coated with Matrigel. Human aortic endothelial cells were further incubated with PL (0–0.5 mg ml−1) or with conditioned media from MDA-MB-231 cells, which were prepared by the incubation of MDAMB-231 cells in the presence of PL (0–0.5 mg ml−1) for 24 h. Endothelial HAE cells differentiated into capillary-like structures within 16 h of incubation at 37°C in the presence of 5% CO2. These structures were examined microscopically ( × 40) using an inverted Olympus CK40 microscope. To facilitate analysis of the structures, non-adherent cells incorporated in excess medium were removed from each well prior to quantitative analysis. Photomicrographs were taken to assess the extent of capillary-like structural formation. Quantification of the capillary-like structures was performed counting the number of nodes per field, where a node is defined as an intersection of at least three cells. Each sample was assayed in triplicate and reproduced in at least two additional experiments. Western blot analysis MDA-MB-231 cells were treated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 24–72 h as indicated in the text and whole-cell extracts prepared as described previously (Sliva et al, 2002a, 2002b). Equal amounts of proteins (20 μg per lane) were separated on NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transferred to a PVDF membrane (Millipore, Bedford, MA, USA). The protein expression was detected with the corresponding primary antibodies: anti-cyclin-D1, anti-cyclin-E, anti-cyclin-A, anti-cdk2, anti-cdk4, anti-p21, anti-p27, anti-β-actin, (Santa, Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-AKT, anti-phospho-AKT (Thr308) and anti-phospho-AKT (Ser473) (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), respectively. Protein expression was visualised using the ECL Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Urokinase-plasminogen activator secretion DMEM media from MDA-MB-231 cells treated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 24 h were collected and concentrated, and the secretion of uPA was detected by western blot analysis with anti-uPA antibody (Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA), as described (Sliva et al, 2002b). Densitometric analysis Autoradiograms of the western blots were scanned with HP scanjet 5470c scanner. The optical densities of p27, phospho-AKT (Thr308), phospho-AKT (Ser473), AKT, β-actin and uPA proteins on the films were quantified and analysed with the UN-SCAN-IT software (Silk Scientific, Orem, UT, USA). The ratios of p27/β-actin and phosphoAkt/Akt were calculated by standardising the ratios of each control to the unit value. Vascular endothelial growth factor secretion MDA-MB-231 cells were treated with PL (0–0.5 mg ml−1) for 24 h, cell media collected and secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) was determined using a respective Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) according to the manufacturer's instructions. Statistical analysis Data are presented as means±s.d. Statistical comparison between the control group (0 μg ml−1 of PL) and groups with different PL doses was carried out using two-sided Student's t-tests. The value of P<0.05 was considered to be significant. RESULTS Phellinus linteus suppresses proliferation and colony formation of highly invasive breast cancer cells Invasive behaviour of cancer cells is directly linked to their metastatic potential resulting in the high cancer mortality. Therefore, we evaluated if PL inhibits growth of highly invasive (MDA-MB-231) and poorly invasive (MCF-7) breast cancer cells. As seen in Figure 1, increased concentration of PL (0–1.0 mg ml−1) markedly suppressed proliferation of MDA-MB-231 as well as MCF-7 cells in a dose- and time-dependent manner. Nevertheless, the effect of PL on poorly invasive cells was more pronounced, because the concentration 0.25, 0.5 and 1.0 mg ml−1 of PL suppressed proliferation of MCF-7 cells by 60.2, 70.1 and 78.0%, respectively (Figure 1B), whereas the same concentration suppressed proliferation of MDA-MB-231 cells by 15.5, 21.5 and 43.1%, respectively (Figure 1A), after 24 h of incubation. The same sensitivity of MCF-7 cells was evident also after additional 48 and 72 h of incubation, where only the highest concentration of PL (1.0 mg ml−1) suppressed proliferation of poorly invasive and highly invasive breast cancer cells with the same potency (Figure 1). To determine if the effect of PL on cancer cells is cytotoxic or cytostatic, we evaluated the cell viability after 24, 48 and 72 h of PL treatment. Although PL decreased the viability of MDA-MB-231 and MCF-7 cells, the strongest inhibition of cell viability at the highest used concentration of PL (1.0 mg ml−1) after 72 h was only 13.5% for MDA-MB-231 cells (Figure 1C) and 10.6% for MCF-7 cells (Figure 1D), whereas the same concentration suppressed proliferation of MDA-MB-231 cells by 86.6% (Figure 1A) and MCF-7 cells by 90.6% (Figure 1B). Therefore, these data suggest that the PL inhibits growth of breast cancer cells predominantly through its cytostatic effect. Interestingly, PL also suppressed proliferation of poorly invasive prostate (LNCaP) and highly invasive prostate (PC-3) cancer cells in a dose- and time-dependent manner, and LNCaP cells were more sensitive to the PL treatment (not shown). In addition to cell proliferation (anchorage-dependent growth), colony formation (anchorageindependent growth) is one of the typical characteristic of the metastatic potential of cancer cells in vitro and strongly correlates with tumorigenesis in vivo (Freedman and Shin, 1974). To determine whether PL suppresses colony formation of highly invasive breast cancer cells, we evaluated the anchorage-independent growth of MDA-MB-231 cells. As seen in Figure 2, MDA-MB-231 cells formed colonies on agar after 14 days of incubation, and the presence of increased concentration of PL (0–1.0 mg ml−1) resulted in the significant suppression of number of colonies (Figure 2E). Therefore, PL inhibits anchorage-dependent as well as anchorage-independent growth of highly aggressive breast cancer cells. Phellinus linteus induces cell cycle arrest at S phase To determine whether the inhibition of cell proliferation is associated with cell cycle arrest, MDAMB-231 cells were treated for 24 and 48 h with PL (0.5 mg ml−1) and analysed by flow cytometry. Cell cycle analysis demonstrated that PL causes cell cycle arrest at S phase of cell cycle (Table 1), where the amount of cells in S phase significantly increased from 27% (control – 0 h) to 34% (24 h) and 44% (48 h). In addition, PL treatment did not induce the amount of cells in sub-G0/G1 phase, further suggesting the cytostatic effect of PL on MDA-MB-231 cells (Table 1). To examine the mechanism responsible for the cell cycle arrest at S phase, we evaluated the expression of cell cycle regulatory proteins (cyclins) and cdks involved in the progression from G1 phase to S phase (Sherr and Roberts, 1999; Ekholm and Reed, 2000). Therefore, MDA-MB-231 cells were treated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 24 h and the expression of cyclin D1, E, A, cdk4, cdk2, p21 and p27 in cell extracts was evaluated by western blot analysis with respective antibody. Neither of the G1 regulatory proteins cyclin-D1, cdk4 or p21, G1-late phase or G1/S-phase regulatory proteins cyclin E, A and cdk2 demonstrated changes in their expression after the treatment with PL (Figure 3A). Nevertheless, PL (0.5 and 1.0 mg ml−1) markedly induced expression of a cyclin-dependent kinase inhibitor p27 (Figure 3B). Therefore, PL inhibits proliferation of breast cancer cells by the upregulation of p27 resulting in S-phase cell cycle arrest. Phellinus linteus suppresses invasive behaviour of breast cancer cells The ability of cancers to metastasise is directly associated to cell adhesion, migration and invasion. Integrin receptor αVβ3 is involved in adhesion of breast cancer cells through its interaction with extracellular matrix (ECM) protein vitronectin (Wong et al, 1998). To investigate if PL affects adhesion of invasive breast cancer cells, MDA-MB-231 cells were pretreated with PL (0– 0.5 mg ml−1) for 24 h and their adhesion to vitronectin was determined. As seen in Figure 4A, adhesion of MDA-MB-231 cells was markedly suppressed by the PL treatment. Next, we evaluated if PL also inhibits cell migration. MDA-MB-231 cells were pretreated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 1 h and cell migration was determined after additional 5 h of incubation. As seen in Figure 4B, PL also markedly suppressed migration of breast cancer cells in a dose-dependent manner. Finally, the effect of PL on cell invasiveness was evaluated. MDA-MB-231 cells were plated on the Matrigelcoated filters in the presence of PL (0–1.0 mg ml−1) and the amount of cells invaded through Matrigel counted after 48 h of incubation. As seen in Figure 4C, PL inhibits invasion of MDA-MB231 cells in a dose–response manner. Because cancer metastasis and invasiveness are associated with the uPA–uPA receptor (uPAR) system, we evaluated whether PL affects secretion of uPA from cancer cells. MDA-MB-231 cells were treated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 24 h and uPA secretion evaluated by western blot analysis in conditioned media. In agreement with the data demonstrating inhibition of cell adhesion, migration and invasion PL markedly decreased secretion of uPA from MDA-MB-231 cells (Figure 4D). Phellinus linteus inhibits capillary morphogenesis of endothelial cells through the suppression of VEGF secretion Capillary morphogenesis (tube formation) of human endothelial cells is one of the first important steps in angiogenesis associated with the cancer progression and metastasis. Because cancer microenvironment contains a variety of cells, we also evaluated if the inhibition of capillary morphogenesis of endothelial cells can be mediated through breast cancer cells. Therefore, we determined if PL itself or conditioned media from breast cancer cells exposed to PL suppress capillary morphogenesis of HAECs. Human aortic endothelial cells grown on Matrigel were treated directly with PL (0–0.5 mg ml−1) or with the conditioned media from MDA-MB-231 cells treated with PL (0–0.5 mg ml−1, PL-CM) for 24 h, and tube formation were evaluated. As seen in Figure 5A, PL significantly suppressed capillary morphogenesis of HAECs. Moreover, conditioned media from MDA-MB-231 cells without PL induced capillary morphogenesis of HAECs (PL vs PL-CM at 0 PL), and conditioned media from cells exposed to PL (PL-CM) also suppressed capillary morphogenesis of HAECs in a dose–response manner (Figure 5A–C). Because MDA-MB-231 cells express pro-angiogenic VEGF (Basu et al, 2005), we hypothesised that secreted VEGF from these cells induces capillary morphogenesis of endothelial cells, which can be inhibited by PL. Therefore, we evaluated whether PL inhibits secretion of VEGF from MDA-MB-231 cells treated with PL (0– 0.5 mg ml−1). As seen in Figure 5D, secretion of VEGF from MDA-MB-231 cells was markedly decreased by PL in a dose–response manner. Collectively, our data suggest that PL inhibits capillary morphogenesis of endothelial cells directly as well as indirectly through the suppression of secretion of VEGF from breast cancer cells. Phellinus linteus inhibits activity of AKT kinase AKT serine-threonine kinase (protein kinase B) regulates a variety of cellular processes through the phosphorylation of a wide spectrum of downstream substrates finally resulting in the expression of proteins involved in cell proliferation, invasiveness and angiogenesis among others (Woodgett, 2005; Dillon et al, 2007). To determine if PL modulates AKT activity in breast cancer cells, MDAMB-231 cells were treated with PL (0–1.0 mg ml−1) for 24 h and the phosphorylation status of AKT evaluated in whole-cell extracts by western blot analysis. As seen in Figure 6A, PL inhibits phosphorylation of AKT at Thr308 in a dose–response manner. In addition, PL treatment also markedly decreased phosphorylation of AKT at Ser473 (Figure 6B). To evaluate if the suppression of AKT activity PL is directly responsible for the inhibition of capillary morphogenesis through the downregulation of expression of VEGF in MDA-MB-231 cells, we used a pharmacological approach with specific AKT inhibitors. Therefore, MDA-MB-231 cells were treated with LY294002 (10 μM) or AKT inhibitor III (10 μM) for 24 h, and secretion of VEGF was evaluated. As seen in Figure 7A, AKT inhibitors markedly suppressed secretion of VEGF from breast cancer cells. Moreover, conditioned media from MDA-MB-231 cells treated with LY294002 and AKT inhibitor III also inhibited capillary morphogenesis of endothelial cells (Figure 7B). Therefore, these data suggest that the inhibition of angiogenesis in vitro by PL is mediated, to some extent, through the suppression of AKT activity, which results in the suppression of secretion of VEGF from breast cancer cells. DISCUSSION Regardless of different theories of biology of breast cancer as (i) a local disease that spreads over time to develop distant metastases; (ii) a systemic disease from the outset, with distant metastases present well before diagnosis (iii) or the combination of both as a heterogeneous disease, cancer metastasis is one of the major medical problems in breast cancer patients (Punglia et al, 2007). While several chemotherapeutic agents or their combinations (e.g. taxanes, trastumazab, gemcitabine or capecitabine) demonstrated activity in the metastatic breast cancer setting (Tripathy, 2007), there is a paucity of natural antiproliferative and anti-metastatic nontoxic agents. As demonstrated practically four decades ago, polysaccharide extracts from basidiomycete fungus PL suppressed tumour growth in vivo (Chihara et al, 1969). In addition, PL also reduced tumour growth and the frequency of pulmonary metastasis without toxic effects (Han et al, 1999). Recent studies elucidated some of the molecular mechanism(s) responsible for the inhibition of growth through cell cycle arrest and induction of apoptosis in lung and prostate cancer cells (Collins et al, 2006; Guo et al, 2007; Zhu et al, 2007). Nevertheless, the molecular mechanism(s) responsible for the inhibition of invasive behaviour and angiogenesis was not fully addressed. In the present study, we demonstrate that PL inhibits cell proliferation (anchorage-dependent growth) as well as colony formation (anchorage-independent growth) of highly invasive breast cancer cells through the S-phase cell cycle arrest mediated by the upregulation of expression of p27. Cell growth, which is the reflection of the progression of cell cycle, is aberrantly regulated in the majority of cancers. The cell cycle is regulated by a series of checkpoints employing cyclins, cdks and cdk inhibitors (Sherr, 1966). p27 is one of the cdk inhibitors, which binds to S-phase cyclin–cdk complexes and inhibits their cell cycle stimulatory activities. Because a loss of p27 expression has been linked to the aggressive behaviour in a variety of human epithelial tumours including breast cancer, the induction of p27 expression could lead to cell cycle arrest and inhibition of tumour growth (Tan et al, 1997; Lloyd et al, 1999; Macri and Loda, 1999). Our data are in agreement with recent papers also demonstrating the inhibition of growth of prostate cancer and leukaemia cells through the S-phase cell cycle arrest by the upregulation of expression of p27 (Zhang et al, 2006; Shishodia et al, 2007). Recently, Guo et al (2007) demonstrated that PL suppresses growth of lung cancer cells through G1-phase cell cycle arrest mediated by the inhibition of cdk2, 4 and 6 activities. Our results show cell cycle arrest at S phase in breast cancer cells through the upregulation of p27. Nevertheless, our data are not in a disagreement with Guo et al because the passage through G1 phase into S phase is regulated by the activities of cdk2, 4 and 6, which are controlled by cdk inhibitor p27 (Slingerlan and Pagano, 2000). Moreover, cell cycle arrest at S phase can also be interpreted as the arrest at G1-S, because the majority of cells are at G0/G1 and S but not G2 phases (Table 1). Most importantly, PL suppresses growth of cancer cells by the cell cycle arrest. Here, we show that PL inhibits adhesion, migration and invasion through the suppression of secretion of uPA from highly invasive breast cancer cells. Our data are in agreement with the study by Lee et al (2005) demonstrating the inhibition of adhesion, invasion and expression of uPA in mouse melanoma cells. Furthermore, our data suggest the mechanism of inhibition of invasiveness by PL. Therefore, secreted uPA from breast cancer cells interacts with uPAR and converts plasminogen to plasmin (Blasi and Carmeliet, 2002). Plasmin degrades ECM components and stimulates other proteolytic enzymes (MMPs), which through the degradation of ECM contribute to cell invasion (Blasi and Carmeliet, 2002). Secreted uPA can bind to uPAR and forms a complex with integrin receptor αVβ3, which through its interaction with vitronectin is involved in adhesion and migration of breast cancer cells (Slivova et al, 2005). Inhibition of uPA secretion will reduce the formation of uPA–uPAR–αVβ3–vitronectin complex, with the consequent suppression of adhesion and migration of invasive breast cancer cells. Alternatively, PL can also modulate activities of other proteins involved in the invasive behaviour of breast cancer cells (e.g. matrix metalloproteinases, β1 and β4 integrins, epidermal growth factor receptors and others (Carraway and Sweeney, 2006; Bissell, 2007)). Nevertheless, in the present study, we propose that PL suppresses invasiveness through the inhibition of uPA secretion. Finally, we and others have previously demonstrated that inhibition of uPA suppressed invasiveness of breast cancer cells (Sliva et al, 2002b; Das et al, 2003: Mi et al, 2006). Recently, Song et al (2003) demonstrated anti-angiogenic activity of PL in chorioallantoic membrane (CAM) chick embryo assay. However, the mechanism of the inhibition of angiogenesis by PL, related to cancer, was not previously addressed. In the present study, we demonstrate that PL inhibits one of the first steps in angiogenesis – tube formation of endothelial cells. While PL directly suppressed capillary morphogenesis of endothelial cells, our data further suggest that this effect can be mediated by the inhibition of secretion of VEGF from breast cancer cells. Although in our experimental conditions it was impossible to remove PL from the conditioned media from breast cancer cells (PL-CM), and therefore their inhibitory effect on capillary morphogenesis of HEACs could be considered as a direct effect of PL on HEACs, our data suggest that both (direct and indirect) effects are involved. Thus, (i) conditioned media from breast cancer cells without PL significantly increased capillary morphogenesis of endothelial cells, suggesting that proangiogenic factor is released from breast cancer cells, (ii) PL itself as well as conditioned media containing PL suppressed capillary morphogenesis and (iii) the secretion of VEGF from breast cancer cells was inhibited by PL. In agreement with our observation, suppression of endothelial capillary morphogenesis through the inhibition of secreted VEGF from a variety of cancer cells was described recently (Fukumoto et al, 2005; Stanley et al, 2005; Jang et al, 2007; Kong et al, 2007). Therefore, inhibition of specific pro-angiogenic protein within cancer cells will affect the whole cancer microenvironment (containing different cells) and will finally result in the suppression of tumour angiogenesis. One of the suitable molecular cancer targets is AKT kinase, which inhibition in breast cancer cells resulted in cell cycle arrest, inhibition of growth and colony formation, inhibition of migration, invasion and suppression of angiogenesis (Das et al, 2003; Yacoub et al, 2003; Jiang et al, 2004a; Basu et al, 2005; Fukumoto et al, 2005; Jallal et al, 2007). Our data clearly demonstrate that PL suppresses AKT activity through the inhibition of AKT phosphorylation at Thr308 and at Ser473 in MDA-MB-231 cells, which demonstrate high levels of constitutively active AKT. Furthermore, inhibition of AKT with LY294002 and more specific AKT inhibitor III suppressed secretion of VEGF from breast cancer cells resulting in the decrease of capillary morphogenesis of endothelial cells. Our observation is in agreement with Xia et al (2006) who demonstrated, by using siRNA against AKT, the downregulation of VEGF expression in ovarian cancer cells, and the inhibition of angiogenesis in CAM chick embryo assay. In conclusion, our study suggests PL as a natural compound possessing antiproliferative, antimetastatic and anti-angiogenic effects, which could be considered for the therapy of invasive breast cancers. However, further studies are necessary to confirm and evaluate these anticancer effects in vivo. This work was supported by the Methodist Health Foundation, by the Department of the Army Medical Research and Materiel Command, Breast Cancer Research Training Program and by Maitake Products Inc. References Basu GD,Pathangey LB,Tinder TL,Gendler SJ,Mukherjee P. Mechanisms underlying the growth inhibitory effects of the cyclo-oxygenase-2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cellsBreast Cancer Res 2005;7:R422–R435. [pmid: 15987447] Bissell MJ. Modeling molecular mechanisms of breast cancer and invasion: lessons from the normal glandBiochem Soc Trans 2007;35:18–22. [pmid: 17212581] Blasi F,Carmeliet P. uPAR: a versatile signaling orchestratorNat Rev Mol Cell Biol 2002;3:932–943. [pmid: 12461559] Carraway KL III,Sweeney C. Co-opted integrin signaling in ErbB2-induced mammary tumor progressionCancer Cell 2006;10:93–95. [pmid: 16904607] Chihara G,Maeda Y,Hamuro J,Sasaki T,Fukuoka F. Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes (Berk.) singNature 1969;222:687–688. [pmid: 5768289] Collins L,Zhu T,Guo J,Xiao ZJ,Chen CY. Phellinus linteus sensitises apoptosis induced by doxorubicin in prostate cancerBr J Cancer 2006;95:282–288. [pmid: 16868541] Dai YC,Xu MQ. Studies on the medicinal polypore, Phellinus baumii, and its kin, P. linteusMycotaxon 1998;67:191–200. Das R,Mahabeleshwar GH,Kundu GC. Osteopontin stimulates cell motility and nuclear factor kappaB-mediated secretion of urokinase type plasminogen activator through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways in breast cancer cellsJ Biol Chem 2003;278:28593–28606. [pmid: 12771144] Dillon RL,White DE,Muller WJ. The phosphatidyl inositol 3-kinase signaling network: implications for human breast cancerOncogene 2007;26:1338–1345. [pmid: 17322919] Ekholm SV,Reed SI. Regulation of G(1) cyclin-dependent kinases in the mammalian cell cycleCurr Opin Cell Biol 2000;12:676–684. [pmid: 11063931] Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseaseNat Med 1995;1:27–31. [pmid: 7584949] Freedman VH,Shin SI. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth in semi-solid mediumCell 1974;3:355–359. [pmid: 4442124] Fukumoto S,Morifuji M,Katakura Y,Ohishi M,Nakamura S. Endostatin inhibits lymph node metastasis by a down-regulation of the vascular endothelial growth factor C expression in tumor cellsClin Exp Metastasis 2005;22:31–38. [pmid: 16132576] Guo J,Zhu T,Collins L,Xiao ZX,Kim SH,Chen CY. Modulation of lung cancer growth arrest and apoptosis by Phellinus LinteusMol Carcinog 2007;46:144–154. [pmid: 17131292] Han SB,Lee CW,Jeon YJ,Hong ND,Yoo ID,Yang KH,Kim HM. The inhibitory effect of polysaccharides isolated from Phellinus linteus on tumor growth and metastasisImmunopharmacology 1999;41:157–164. [pmid: 10102797] Harvey K,Siddiqui RA,Sliva D,Garcia JGN,English D. Serum factors involved in human microvascular endothelial cell morphogenesisJ Lab Clin Med 2002;140:188–198. [pmid: 12271276] Jallal H,Valentino ML,Chen G,Boschelli F,Ali S,Rabbani SA. A Src/Abl kinase inhibitor, SKI-606, blocks breast cancer invasion, growth, and metastasis in vitro and in vivoCancer Res 2007;67:1580–1588. [pmid: 17308097] Jang YJ,Kim DS,Jeon OH,Kim DS. Saxatilin suppresses tumor-induced angiogenesis by regulating VEGF expression in NCI-H460 human lung cancer cellsJ Biochem Mol Biol 2007;40:439–443. [pmid: 17562297] Jemal A,Siegel R,Ward E,Murray T,Xu J,Thun MJ. Cancer statistics, 2007CA Cancer J Clin 2007;57:43–66. [pmid: 17237035] Jiang J,Slivova V,Harvey K,Valachovicova T,Sliva D. Ganoderma lucidum suppresses growth of breast cancer cells through the inhibition of Akt/NF-kappaB signalingNutr Cancer 2004a;49:209–416. [pmid: 15489214] Jiang J,Slivova V,Valachovicova T,Harvey K,Sliva D. Ganoderma lucidum inhibits proliferation and induces apoptosis in human prostate cancer cells PC-3Int J Oncol 2004b;24:1093–1099. [pmid: 15067330] Kong D,Li Y,Wang Z,Banerjee S,Sarkar FH. Inhibition of angiogenesis and invasion by 3,3′-diindolylmethane is mediated by the nuclear factor-kappaB downstream target genes MMP-9 and uPA that regulated bioavailability of vascular endothelial growth factor in prostate cancerCancer Res 2007;67:3310–3319. [pmid: 17409440] Kim BC,Choi JW,Hong HY,Lee SA,Hong S,Park EH,Kim SJ,Lim CJ. Heme oxygenase1 mediates the anti-inflammatory effect of mushroom Phellinus linteus in LPS-stimulated RAW264.7 macrophagesJ Ethnopharmacol 2006;106:364–371. [pmid: 16488096] Kim HM,Han SB,Oh GT,Kim YH,Hong DH,Hong ND,Yoo ID. Stimulation of humoral and cell mediated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteusInt J Immunopharmac 1996;18:295–303. Kim GY,Oh YH,Park YM. Acidic polysaccharide isolated from Phellinus linteus induces nitric oxide-mediated tumoricidal activity of macrophages through protein tyrosine kinase and protein kinase CBiochem Biophys Res Commun 2003a;309:399–407. [pmid: 12951063] Kim GY,Park HS,Nam BH,Lee SJ,Lee JD. Purification and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting body of Phellinus linteus (Berk. & M.A. Curtis) TengBioresour Technol 2003b;89:81–87. [pmid: 12676504] Kim GY,Park SK,Lee MK,Lee SH,Oh YH,Kwak JY,Yoon S,Lee JD,Park YM. Proteoglycan isolated from Phellinus linteus activates murine B lymphocytes via protein kinase C and protein tyrosine kinaseInt Immunopharmacol 2003c;3:1281–1292. [pmid: 12890426] Lee HJ,Lee HJ,Lim ES,Ahn KS,Shim BS,Kim HM,Gong SJ,Kim DK,Kim SH. Cambodian Phellinus linteus inhibits experimental metastasis of melanoma cells in mice via regulation of urokinase type plasminogen activatorBiol Pharm Bull 2005;28:27–31. [pmid: 15635158] Lloyd FP Jr,Slivova V,Valachovicova T,Sliva D. Aspirin inhibits highly invasive prostate cancer cellsInt J Oncol 2003;23:1277–1283. [pmid: 14532966] Lloyd RV,Erickson LA,Jin L,Kulig E,Qian X,Cheville JC,Scheithauer BW. p27kip1: a multifunctional cyclin-dependent kinase inhibitor with prognostic significance in human cancersAm J Pathol 1999;154:313–323. [pmid: 10027389] Macri E,Loda M. Role of p27 in prostate carcinogenesisCancer Metastasis Rev 1999;17:337–344. [pmid: 10453277] Mi Z,Guo H,Wai PY,Gao C,Kuo PC. Integrin-linked kinase regulates osteopontindependent MMP-2 and uPA expression to convey metastatic function in murine mammary epithelial cancer cellsCarcinogenesis 2006;27:1134–1145. [pmid: 16474180] Park SK,Kim GY,Lim JY,Kwak JY,Bae YS,Lee JD,Oh YH,Ahn SC,Park YM. Acidic polysaccharides isolated from Phellinus linteus induce phenotypic and functional maturation of murine dendritic cellsBiochem Biophys Res Commun 2003;312:449–458. [pmid: 14637158] Price JT,Bonovich MT,Kohn EC. The biochemistry of cancer disseminationCrit Rev Biochem Mol Biol 1997;32:175–253. [pmid: 9239493] Punglia RS,Morrow M,Winer EP,Harris JR. Local therapy and survival in breast cancerN Engl J Med 2007;356:2399–2405. [pmid: 17554121] Sherr CJ. Cancer cell cyclesScience 1966;274:1672–1677. [pmid: 8939849] Sherr CJ,Roberts JM. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progressionGenes Dev 1999;13:1501–1512. [pmid: 10385618] Shishodia S,Sethi G,Ahn KS,Aggarwal BB. Guggulsterone inhibits tumor cell proliferation, induces S-phase arrest, and promotes apoptosis through activation of c-Jun N-terminal kinase, suppression of Akt pathway, and downregulation of antiapoptotic gene productsBiochem Pharmacol 2007;74:118–130. [pmid: 17475222] Slingerlan J,Pagano M. Regulation of the Cdk inhibitor and its deregulation in cancerJ Cell Physiol 2000;183:10–17. [pmid: 10699961] Sliva D,Harvey K,Mason R,Lloyd F Jr,English D. Effect of phosphatidic acid on human breast cancer cells exposed to doxorubicinCancer Invest 2001;19:781–788. Sliva D,Labarrere C,Slivova V,Sedlak M,Lloyd FP Jr,Ho NWY. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cellsBiochem Biophys Res Commun 2002a;298:603–612. [pmid: 12408995] Sliva D,Rizzo MT,English D. Phosphatidylinositol 3-kinase and NF-κB regulate motility of invasive MDA-MB-231 human breast cancer cells by the secretion of urokinase-type plasminogen activator (uPA)J Biol Chem 2002b;277:3150–3157. [pmid: 11689575] Slivova V,Valachovicova T,Jiang J,Sliva D. Ganoderma lucidum inhibits invasiveness of breast cancer cellJ Cancer Integr Med 2004;2:25–30. Slivova V,Zaloga G,DeMichele SJ,Mukerji P,Huang YS,Siddiqui R,Harvey K,Valachovicova T,Sliva D. Green tea polyphenols modulate secretion of urokinase plasminogen activator (uPA) and inhibit invasive behavior of breast cancer cellsNutr Cancer 2005;52:65–72. Song KS,Cho SM,Lee JH,Kim HM,Han SB,Ko KS,Yoo ID. B-lymphocyte-stimulating polysaccharide from mushroom Phellinus linteusChem Pharm Bull (Tokyo) 1995;43:2105–2108. [pmid: 8582012] Song YS,Kim SH,Sa JH,Jin C,Lim CJ,Park EH. Anti-angiogenic, antioxidant and xanthine oxidase inhibition activities of the mushroom Phellinus linteusJ Ethnopharmacol 2003;88:113–116. [pmid: 12902060] Stanley G,Harvey K,Slivova V,Jiang J,Sliva D. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-beta1 from prostate cancer cellsBiochem Biophys Res Commun 2005;330:46–52. [pmid: 15781230] Tan P,Cady B,Wanner M,Worland P,Cukor B,Magi-Galluzzi C,Lavin P,Draetta G,Pagano M,Loda M. The cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small (T1a,b) invasive breast carcinomasCancer Res 1997;57:1259–1263. [pmid: 9102210] Tripathy D. Capecitabine in combination with novel targeted agents in the management of metastatic breast cancer: underlying rationale and results of clinical trialsOncologist 2007;12:375–389. [pmid: 17470680] Wasser SP. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharidesAppl Microbiol Biotechnol 2002;60:258–274. [pmid: 12436306] Wong NC,Mueller BM,Barbas CF,Ruminski P,Quaranta V,Lin EC,Smith JW. Alphav integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell linesClin Exp Metastasis 1998;16:50–61. [pmid: 9502077] Woodgett JR. Recent advances in the protein kinase B signaling pathwayCurr Opin Cell Biol 2005;17:150–157. [pmid: 15780591] Yacoub A,Han SI,Caron R,Gilfor D,Mooberry S,Grant S,Dent P. Sequence dependent exposure of mammary carcinoma cells to Taxotere and the MEK1/2 inhibitor U0126 causes enhanced cell killing in vitroCancer Biol Ther 2003;2:670–676. [pmid: 14688474] Xia C,Meng Q,Cao Z,Shi X,Jiang BH. Regulation of angiogenesis and tumor growth by p110 alpha and AKT1 via VEGF expressionJ Cell Physiol 2006;209:56–66. [pmid: 16775835] Zhang Y,Wang Z,Ahmed F,Banerjee S,Li Y,Sarkar FH. Down-regulation of Jagged-1 induces cell growth inhibition and S phase arrest in prostate cancer cellsInt J Cancer 2006;119:2071–2077. [pmid: 16823852] Zhu T,Guo J,Collins L,Kelly J,Xiao ZJ,Kim SH,Chen CY. Phellinus linteus activates different pathways to induce apoptosis in prostate cancer cellsBr J Cancer 2007;96:583– 590. [pmid: 17262078]