Инструкции - ИнтерЛабСервис

ИНСТРУКЦИЯ
по применению тест-системы «ЧИС» для определения видовой принадлежности
тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции
(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)
Тест-система «ЧИС» для выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus
gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
выпускается в одном формате:
Формат EPh – для выявления ДНК Gallus gallus и Sus scrofa методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном
геле.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Форматы и формы выпуска тест-системы:
1
Формат EPh
Тест-система «ЧИС» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая
контроли, выпускается в двух формах комплектации:
Форма 1 включает:

«ДНК-сорб-С» вариант 50 – комплект реагентов для экстракции ДНК из
клинического материала, продуктов питания и кормов для животных;
 «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Gallus
gallus и Sus scrofa;
 «ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции
продуктов амплификации в агарозном геле.
Форма 2 включает:
 «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Gallus
gallus и Sus scrofa.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию ДНК, амплификацию ДНК Gallus gallus и Sus scrofa и
электрофоретическую детекцию.
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Gallus
gallus и Sus scrofa. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать
комплекты
реагентов
для
экстракции
ДНК,
электрофоретической
детекции,
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
1.1 Комплект реагентов «ДНК-сорб-С» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Буфер для лизирующего реагента
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Лизирующий реагент
1 пробирка, 0,85 см3 (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 15,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 2
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Сорбент универсальный
1 пробирка, 1,25 см3 (мл)
ТЕ-буфер для элюции ДНК
1 пробирка, 5,0 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию ДНК из 50 проб, включая контроли.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 1 из 12
1.2 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-R Gallus gallus / Sus scrofa
55 пробирок по 0,005 см3 (мл)
ПЦР-смесь-1-R ВКО
55 пробирок по 0,005 см3 (мл)
ПЦР-смесь-2 blue
2 пробирки по 0,6 см3 (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 флакон, 4,0 см3 (мл)
К+ Gallus gallus
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
К+ Sus scrofa
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
К–
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ОКО
1 пробирка, 1,6 см3 (мл)
ВКО комплексный
1 пробирка, 1,0 см3 (мл)
1.3 Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ)
концентрированный с бромидом этидия
1 флакон, 50 см3 (мл)
Агароза для электрофореза ДНК
2 флакона по 1,7 г
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета
100 мл геля – 5 рядов по 24 лунки).
Упаковка и маркировка.
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с
указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номера
серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные
застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают)
этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект,
количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке
(флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На
каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой
указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы,
перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок
годности, условия хранения, обозначения ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую
упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
2
Транспортирование и хранение.
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Комплект реагентов «ДНК-сорб-С» (кроме лизирующего реагента) хранить при температуре
от 2 до 25 С. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» и лизирующий реагент (из комплекта
реагентов «ДНК-сорб-С») хранить при температуре от 2 до 8 °С. Комплект реагентов «ЭФ»
хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте.
3
4
Срок годности тест-системы – 12 месяцев с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5 Метод выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи
домашней (Sus scrofa) основан на экстракции ДНК из материала совместно с ДНК
экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО) и проведении
амплификации полученной ДНК. Детекция продуктов амплификации осуществляется с
помощью электрофореза в агарозном геле.
6 Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать основные этапы ПЦР-анализа
(экстракцию ДНК и проведение амплификации ДНК).
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 2 из 12
III. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность
Вид биологического
материала
- Рыбная и мясная
мука;
- комбикорма для
крупного и мелкого
рогатого скота;
- комбикорма для
племенной птицы;
- сухие и
консервированные
корма для
непродуктивных
животных;
- сырые мясные
продукты и мясные
продукты,
подвергшиеся
кулинарной
обработке.
Комплект для
экстракции ДНК
«ДНК-сорб-С»
вариант 50
Комплект для
амплификации
и детекции
Аналитическая
чувствительность,
копий ДНК/мл
«ПЦР-комплект»
вариант 50 R
5х103
для последовательностей
ДНК Gallus gallus и
Sus scrofa
Аналитическая специфичность
Отсутствует положительная реакция при тестировании с ДНК животных, не
принадлежащих к видам Gallus gallus и Sus scrofa.
IV. ПОРЯДОК ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ
7
Тест-система предназначена для выявления и идентификации ДНК курицы домашней
(Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) в кормах для животных и продуктах питания:
 в рыбной и мясной муке;
 в комбикормах для крупного и мелкого рогатого скота;
 в комбикормах для племенной птицы;
 в сухих и консервированных кормах для непродуктивных животных (собак, кошек);
 в сырых мясных продуктах (частях туши, фарше и т.д.) и в мясных продуктах,
подвергшихся кулинарной обработке.
8
Взятие, транспортирование и хранение материала для исследования.
8.1 Пробы рыбной муки, сухого корма для непродуктивных животных, комбикорма,
находящихся в мешках или небольших насыпях на складе, отбирают по ГОСТ 13496.0
«Комбикорма, сырье. Методы отбора проб».
8.2 Консервированные корма отбирают по ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые
консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».
8.3. Каждый образец отбирают отдельным набором инструментов.
8.4 Образцы сырья, продуктов питания и кормов для животных транспортируют и хранят
согласно условиям хранения, указанным производителем. Образцы скоропортящихся
продуктов рекомендуется хранить при температуре не выше минус 16 C. Длительность
транспортирования не должна превышать срока годности продукта.
9
Подготовка исследуемого материала.
9.1 Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые
пробирки, стерильные инструменты – пинцеты, скальпели, ножницы. Гомогенизацию
образцов проводят с использованием стерильных ступок и пестиков или автоматических
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 3 из 12
гомогенизаторов.
9.2 Пробы плотных продуктов, сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в
ступку по 5 – 10 г и растирают до гомогенного состояния.
9.3 Пробу мясных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом
1 - 2 г, измельчают ножницами, затем растирают до гомогенного состояния.
10
V. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА.
ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
10.1 ЗОНА 1 (этап 1) – для экстракции ДНК из проб:
 стерильный
ламинарный
шкаф
(например,
«БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2»,
«Ламинарные системы», Россия).
 термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 2415», «Биоком», Россия).
 вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия).
 микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например,
MiniSpin, Eppendorf, Германия).
 вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
 набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл
и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например,
Axygen, США).
 одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).
 штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и
наконечников (например, Axygen, США).
 холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
 емкость с дезинфицирующим раствором.
 комплект средств для обработки рабочего места.
10.2 ЗОНА 2 (этап 2) – для проведения амплификации:
 амплификатор для пробирок 0,5 мл (например, «Терцик», ЗАО «НПФ ДНКТехнология», Россия, или эквивалентный); для пробирок 0,2 мл (например, GeneAmp
PCR System 2700 (Applied Biosystems), США, или эквивалентный).
 ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
 вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
 набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл
(например, Axygen, США).
 штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок (например,
«ИнтерЛабСервис», Россия).
 холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
 емкость для сброса наконечников.
 комплект средств для обработки рабочего места.
10.3 ЗОНА 3 (этап 3) – для детекции продуктов амплификации методом электрофореза в
агарозном геле:
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 4 из 12
 камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например,
SE-2, «Хеликон», Россия).
 источник постоянного тока с напряжением 150-460 В (например, «Эльф-4», ЗАО
«НПФ ДНК-Технология», Россия).
 ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например,
«Биоком», Латвия).
 видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов («Биотест-1»,
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; BioRad, США).
 аквадистиллятор.
 холодильник от 2 °С до 8 °С.
 микроволновая печь для плавления агарозы.
 колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы
на 250 мл.
 мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).
 штатив для пробирок на 0,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 отдельный дозатор объемом 10-40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).
 пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид
этидия.
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
11
Порядок работы.
11.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала.
Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при
температуре от 2 °С до 8 °С) прогреть при температуре 64 °С до полного растворения
кристаллов. Проверить сорбент – при отстаивании он должен занимать половину объема
суспензии.
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл (включая
отрицательный и положительный контроли экстракции). В пробирки, предназначенные для
исследуемых проб, внести по 10–30 мг исследуемых проб. В пробирки контролей экстракции
ДНК внести по 50 мкл ОКО.
Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 400 мкл буфера
для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента. Тщательно перемешать
содержимое пробирок.
Инкубировать пробирки при температуре 64 °С в течение 1 ч, периодически встряхивая
на вортексе (не менее 5 раз).
Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием при 12–14 тыс об/мин
в течение 5 мин.
Надосадочную жидкость в объеме 200 – 350 мкл очень аккуратно (так, чтобы не попали
взвешенные частицы и капли жира) отобрать отдельными наконечниками с фильтром и
перенести в новые пробирки.
Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 20 мкл ВКО
комплексного. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе.
Пробы прогреть 5 мин при температуре 64 °С. Еще раз перемешать и
процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для сброса капель с крышки
пробирки.
Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую
пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента
универсального. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10–15 мин, перемешивая
через каждые 2 мин.
Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в
течение 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и
отдельный наконечник для каждой пробы.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 5 из 12
Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный
центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 1 мин. Удалить
надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для
каждой пробы.
Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 1 мин при 1012 тыс об/мин на микроцентрифуге. Отобрать надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, отобрать надосадочную
жидкость полностью.
Поместить пробирки в термостат при температуре 64 °С на 5-10 мин для подсушивания
сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на
вортексе. Поместить в термостат при температуре 64 °С на 5–8 мин, периодически (1 раз в
мин) встряхивая на вортексе.
Процентрифугировать пробирки при 12-14 тыс об/мин в течение 1 мин на
микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК (ДНК-проба).
Указанный материал готов к постановке ПЦР.
Раствор ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 °С до 8 °С или
длительно при температуре не выше минус 16 С.
11.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации.
А.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus
scrofa и ПЦР-смесью-1-R ВКО для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна
проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa или
ПЦР-смесью-1-R ВКО.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При
использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не
добавлять.
В подготовленные для ПЦР пробирки под масло или непосредственно на масло,
используя наконечники с фильтрами, внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или
контроля этапа экстракции.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль (К–) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus
gallus / Sus scrofa и в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО по 10 мкл К–;
б) положительный контроль (К+Gallus) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus
gallus / Sus scrofa 10 мкл К+ Gallus gallus;
в) положительный контроль (К+Sus) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus
gallus / Sus scrofa 10 мкл К+ Sus scrofa;
г) положительный контроль (К+ВКО) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО
10 мкл ВКО комплексного, разведенного в 10 раз К–.
Б.
Проведение амплификации
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1 и 2). Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (при использовании амплификатора GeneAmp PCR System 2700 (Applied
Biosystems) – 93 °С), поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки
амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1–3 с).
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 6 из 12
Таблица 1. Программа амплификации ДНК Gallus gallus, Sus scrofa
(ПЦР-смесь-1-R Gallus gallus/Sus scrofa)
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в Амплификаторы с матричным
пробирке):
регулированием температуры:
«Ампли-3» («Биоком»);
«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНКGeneAmp PCR System 2700
Biometra; MiniCycler, PTCТехнология»); Omn-E
(Applied Biosystems)
100 (MJ Research)
(Hibaid)
цикл температура время циклы температура время циклы температура время циклы
0
пауза
пауза
пауза
95 °С
93 °С
95 °С
1
5 мин
1
5 мин
1
5 мин
1
95 °С
93 °С
95 °С
10 с
10 с
1 мин
95 °С
93 °С
95 °С
2
10 с
40
25 с
40
1 мин
40
65 °С
65 °С
65 °С
10 с
25 с
1 мин
72 °С
72 °С
72 °С
3
1 мин
1
1 мин
1
1 мин
1
72 °С
72 °С
72 °С
4
хранение
хранение
хранение
10 °С
4 °С
10 °С
Таблица 2. Программа амплификации ДНК ВКО (ПЦР-смесь-1-R ВКО)
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в Амплификаторы с матричным
пробирке):
регулированием температуры:
«Ампли-3» («Биоком»);
«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНКGeneAmp PCR System 2700
Biometra; MiniCycler, PTCТехнология»); Omn-E
(Applied Biosystems)
100 (MJ Research)
(Hibaid)
цикл температура время циклы температура время циклы температура время циклы
0
пауза
пауза
пауза
95 °С
93 °С
95 °С
1
5 мин
1
5 мин
1
5 мин
1
95 °С
93 °С
95 °С
10 с
10 с
1 мин
95 °С
93 °С
95 °С
2
10 с
42
25 с
42
1 мин
42
63 °С
63 °С
63 °С
10 с
25 с
1 мин
72 °С
72 °С
72 °С
3
1 мин
1
1 мин
1
1 мин
1
72 °С
72 °С
72 °С
4
хранение
хранение
хранение
10 °С
4 °С
10 °С
После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в
помещение для детекции продуктов ПЦР (зону 3).
Образцы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в
течение недели при температуре от 2 °С до 8 °С и длительно при температуре не выше минус
16 °С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной
температуры для размягчения воска).
11.3 ЭТАП 3 (зона 3). Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в
агарозном геле.
Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении
сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.
А.
Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.
Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести
дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.
ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним
следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания
на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть
соответствующий участок водой.
Все реагенты, содержащие бромид этидия, перед утилизацией следует подвергать
специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).
Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу
из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл готового рабочего буфера, перемешать
вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время
плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности
1 колбой – 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 7 из 12
агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой
из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить
колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу
до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до
температуры 65–70 С.
Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.
Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
Толщина геля должна быть около 0,6 см.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из
него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки
должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к
положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм
сверху.
Б.
Порядок работы
Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать
из-под слоя масла по 10–15 мкл проб и внести в лунки геля (необходимо использовать
новый наконечник для каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть
обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.
Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к
положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE-2
(«Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» (ЗАО «НПФ ДНК Технология») параметры
источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза –
18-20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.
По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно
половину длины геля – 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на
трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить
изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения,
занести в базу данных.
ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть
защищены маской или стеклянной пластиной!
В.
Дезактивация буфера и гелей.
Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также
использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с
требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами».
VI. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
12. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или
электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.
отсутствию
на
Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК:
Gallus gallus
– 219 п.н.
Sus scrofa
– 380 п.н.
ВКО комплексный
– 750 п.н.
В образце обнаружена ДНК Gallus gallus, если в дорожке, соответствующей этой
пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa присутствует
специфическая светящаяся полоса на уровне 219 п.н. большей или меньшей интенсивности,
независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью1-R ВКО.
В образце обнаружена ДНК Sus scrofa, если в дорожке, соответствующей этой пробе
на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa присутствует
специфическая светящаяся полоса на уровне 380 п.н. большей или меньшей интенсивности,
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 8 из 12
независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью1-R ВКО.
В образце не обнаружены ДНК Gallus gallus и Sus scrofa, если в дорожке,
соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus
scrofa отсутствуют специфические светящиеся полосы на уровне 219 и 380 п.н. и
присутствует полоса внутреннего контроля на уровне 750 п.н. на электрофореграмме с ПЦРсмесью-1-R ВКО.
Если в дорожке какого-либо образца отсутствуют все полосы (219, 380 и 750 п.н.), то
результат анализа по данной пробе считается невалидным. Требуется повторно провести
исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Таблица 3. Интерпретация результатов анализа
Результат ПЦР-анализа
Обнаружена ДНК Sus scrofa
Обнаружена ДНК Gallus gallus
Обнаружены ДНК Sus scrofa
и ДНК Gallus gallus
Не обнаружены ДНК Sus scrofa
и ДНК Gallus gallus
Невалидный
Специфическая
полоса с ПЦРсмесью-1-R ВКО
полоса 750 п.н.
Есть/Нет
Специфическая полоса с ПЦРсмесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa
полоса 380 п.н.
Есть
полоса 219 п.н.
Нет
Есть/Нет
Нет
Есть
Есть/Нет
Есть
Есть
Есть
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и
отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки
результатов контрольных реакций (см. табл. 4).
Таблица 4. Результаты постановки контролей
Контрольный
образец
Контролируемый
этап ПЦР-анализа
Специфическая
полоса на
электрофореграмме
с ПЦР-смесью-1-R
ВКО
полоса 750 п.н.
Специфическая полоса на
электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R
Gallus gallus / Sus scrofa
полоса 380 п.н.
полоса 219 п.н.
ОК
Экстракция ДНК
Нет
Нет
Есть
К+Sus
ПЦР
Нет
Есть
Амплификация не
проводится
К+Gallus
ПЦР
Нет
Есть
Амплификация не
Амплификация не
К+ВКО
ПЦР
Есть
проводится
проводится
К–
ПЦР
Нет
Нет
Нет
Если для положительного контроля ПЦР (К+ Gallus gallus) отсутствует специфическая
светящаяся полоса на уровне 219 п.н., необходимо повторить амплификацию для всех
образцов, в которых не обнаружена ДНК Gallus gallus.
Если для положительного контроля ПЦР (К+ Sus scrofa) отсутствует специфическая
светящаяся полоса на уровне 380 п.н., необходимо повторить амплификацию для всех
образцов, в которых не обнаружена ДНК Sus scrofa.
Появление специфической полосы (219 или 380 п.н.) на электрофореграмме с ПЦРсмесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa в любом из отрицательных контрольных образцов (ОК,
К–) или 750 п.н. на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО в отрицательном контроле
ПЦР (К–) указывает на контаминацию реактивов или проб. В этом случае результаты
анализа по всем пробам с соответствующей ПЦР-смесью-1-R ВКО считаются
недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа
экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника
контаминации.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 9 из 12
VII. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
13 Работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997г. № 13-7-2/840
«Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод
полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом
ветеринарии.
14 Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в
Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы и реактивы в зону, в которой была
проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе
дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго
стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Запрещается
перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения
лаборатории.
15 Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время
работы с образцами и реактивами.
16 Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром.
17 Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер,
содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для
обеззараживания
биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли
дихлоризоциануровой кислоты).
18 Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы,
пинцеты),
использованные
для
гомогенизации,
выдерживаются
в
растворе
дезинфицирующего
средства
(например,
0,2 %
раствор
натриевой
соли
дихлоризоциануровой кислоты) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в
течение 30 минут, моется водопроводной водой с поверхностно-активными моющими
средствами и после отмывания в проточной и деионизованной воде высушиваются в
сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 С.
19 Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до
начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в
течение 30 мин.
20 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным
экраном или защитной маской.
21 Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.
Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 10 из 12
Лист вносимых изменений
Редакция
Место внесения
изменений
По всему тексту
28.03.08
24.11.08
25.02.09
23.10.09
16.03.10
25.01.13
VN
Суть вносимых изменений
Уточнены названия реагентов.
Удален прибор «GeneAmp PCR System 2400», «Applied
Biosystems».
п. Транспортирование
Уточнены условия хранения тест-системы.
и хранение
п. Порядок
Уточнены материалы и оборудование, требуемые для
проведения ПЦР
работы.
Комплект реагентов «АмплиСенс» заменен на «ПЦРПо всему тексту
комплект». Уточнены термины и сокращения.
п. Состав
Описание ОКО - прозрачная бесцветная жидкость
п. Проведение
В программе амплификации увеличено время денатурации
амплификации
с 2 до 5 минут.
Уточнены каталожные номера: VET-26-R0,2; VET-26-R0,5
Нижний колонтитул
(вместо VET-26-R)
«Выделение» заменено на «Экстракция»
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на
«В–»
По тексту
Удален регистрационный номер и печати
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Добавлены формы комплектации 1 и 2
Общие положения
Изменены единицы измерения объемов реагентов с мл на
см3 (мл)
23.07.13
FN
Изменены
каталожные
номера
VET-26-R0,2-К;
Нижний колонтитул VET-26-R0,5-К вместо каталожных номеров VET-26-R0,2;
VET-26-R0,5
Инструкция приведена в соответствие с шаблоном
Выделение заменено на экстракцию
Название раздела «Принцип проведения реакции» изменено
на «Принцип метода», раздел актуализирован
Срок годности тест-системы заменен на 12 месяцев
Изменена нумерация разделов
Добавлен раздел «Аналитические характеристики»
Название раздела «Отбор и подготовка материала для
исследования» изменено на «Порядок отбора и подготовки
проб»
По тексту
ВКО-Л заменен на ВКО комплексный
ПЦР-смесь-1-R Свинина-курятина заменена на ПЦР-смесь1-R Gallus gallus / Sus scrofa
ПЦР-смесь-1-R ВКО-Л заменена на ПЦР-смесь-1-R ВКО
ПКО ДНК Gallus gallus заменен на К+ Gallus gallus
ПКО ДНК Sus scrofa заменен на К+ Sus scrofa
ДНК-буфер заменен на К–
Название раздела «Меры личной профилактики» заменено
на «Меры предосторожности», раздел актуализирован
Раздел приведен в соответствие с шаблоном и
актуализирован
Микропробирки заменены на пробирки
Проведение ПЦРАэрозольный барьер заменен на фильтр
анализа
Емкость с дезинфицирующим раствором заменена на
емкость для сброса наконечников
Температура морозильной камеры изменена с «не выше
минус 16 °С» на «от минус 24 °С до минус 16 °С»
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 11 из 12
31.07.13
FN
Удалены кавычки из следующих названий: MiniSpin,
Eppendorf, Axygen, SE-2, BioRad, GeneAmp PCR System 2700,
Applied Biosystems, Biometra, MiniCycler, PTC-100, MJ
Research, Omn-E, Hibaid
Учет результатов
Раздел актуализирован
«Кат. №№: Формат EPh Форма 2» заменено на «Формат
Нижний колонтитул
EPh Форма 2 Кат. №№»
Проведение ПЦРанализа.
В таблице 1 количество циклов для амплификатора
Проведение
«Терцик» исправлено с 42 на 40
амплификации
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К / Дата изменения: 31.07.13 / стр. 12 из 12