Оценка терапевтического потенциала ингибиторов карбоангидразы у двух животных моделей ... дистрофии.
advertisement
Оценка терапевтического потенциала ингибиторов карбоангидразы у двух животных моделей мышечной дистрофии. ВВЕДЕНИЕ Мышечная дистрофия Дюшенна ( МДД ) является прогрессирующим заболеванием, влияющим на поперечно-полосатую и сердечную мышцы. Это обусловлено мутациями в гене дистрофина (1,2) , одним из крупнейших генов в геноме человека. Этот ген кодирует большой белок цитоскелета- дистрофин, который связывает цитоскелет с внеклеточным матриксом ( 3-5). МДД является наиболее распространенным Хсцепленным рецессивным нервно-мышечным расстройством, диагностируемым у 1 из 3500 мальчиков. До сих пор нет радикального лечения против МДД. Текущее лечение МДД симптоматическое и значительно улучшает продолжительность и качество жизни, но его недостаточно, чтобы предотвратить потерю мышечной функции (6). Стандартным лечением, применяемым для пациентов с МДД, является преднизон (7). Несколько терапевтических стратегий были разработаны в последние десятилетия, для которых клинические испытания уже начались :восстановление экспрессии дистрофина , заменив мутировавшего гена использованием адено связанного вирусного (AAV ) вектора (8) , ремонт эндогенного гена антисмысловым пропуском экзона (9) , преждевременная остановка кодона, регуляция компенсирующих молекул, таких как атрофин (10) , блокада деградации мышц торможением миостатина, противовоспалительная терапия , клеточная терапия ( 11,12). Тем не менее, эффективность и безопасность этих новых терапевтических подходов все еще является предметом дискуссий. Следовательно, тестирование малых молекул с терапевтической эффективностью против МДД является ценным подходом. Кроме того, до сих пор нет искусственной модели, которая достаточно повторяет свойства этого заболевания. Беспозвоночные модели, такие как Caenorhabditis elegans дополняют модели мыши, поскольку они дешевы, быстро растут (13-15 ). Таким образом, основной целью опытов проводимых на C. elegans является функция первого фильтра , для того, чтобы выбрать соединения из химических библиотек , и , в конечном счете, проверить выбранные элементы на MDX мышах. Caenorhabditis elegans обладает дистрофин -подобным геном ( дис -1) , кодирующим белок -отображение тех же структурных особенностей, как у человеческого дистрофина (16). Изучение мускулатуры этих животных показывает дегенерацию мышц стенки тела , которые отвечают за передвижения. Эти мышцы имеют саркомерную структуру и состав белка тесно связан с поперечно-полосатыми мышцами млекопитающих (18). Тем не менее, поперечно-полосатые мышцы С. elegans, отличаются от млекопитающих в двух аспектах: мышечные клетки не сливаются , и они не способны к регенерации. Карбоангидразы (CA ) представляют собой семейство металлоферментов которые имеют различное распределение в ткани и внутриклеточные участки у млекопитающих (19-21 ) . Есть несколько цитозольных изоформ (CA I-III , VII и CA CA XIII) , пять мембраносвязанных изоферментов (CA IV , IX CA , CA XII, XIV и CA CA XV) , две митохондриальные формы (CA VA и VB) , а также секретируемые CA изофермента , CA VI. Эти ферменты катализируют взаимопревращение между диоксидом углерода и бикарбонат-ионом. Таким образом, они участвуют в важнейших физиологических процессах, связанных с дыханием и транспортировкой CO2/бикарбоната в метаболизме тканей и легких. Они также участвуют в регуляции рН , CO2 гомеостаза, секреции в различных тканях / органах, биосинтетических реакций, резорбции кости, кальцификации, канцерогенезе и многих других физиологических и патологических процессах ( 22,23 ). Так как СА участвует в большом множестве процессов , они представляют собой важную терапевтическую мишень. Расстройства в том числе отеки, глаукома, ожирение, рак , эпилепсия , остеопороз, периодический паралич и атаксия лечат ингибиторами CA (20,21). Тест около 1000 соединений на дис -1 ( cx18 ) , HLH -1 ( cc561 ) определил несколько веществ, которые уменьшают дисфункции C. elegans с дефицитным фенотипом. Два из пяти ведущих соединений: метазоламид ( МТЗ ) и дихлорфенамид ( DCPM ). Эти молекулы принадлежат к классу сульфонамидов , известных ингибиторов ферментов. В нашем исследовании ингибиторы CA оценивали по их терапевтическому потенциалу дистрофина в двух моделях животных , C. elegans и MDX мышей. РЕЗУЛЬТАТЫ Влияние МТЗ и DCPM на С. elegans дистрофина-дефицитные мышцы. Мы использовали модель С. elegans дистрофин-зависимой мышечной дистрофии для выявления биоактивных молекул для идентификации потенциальных блокаторов дистрофии. Актуальность такого теста была ранее показана (24). Мы наблюдали при визуальном осмотре, что 7-дневные (cx18); HLH-1 (cc561) взрослые животные, выращенные в присутствии 0,5 мг / мл (2 мм) MTZ или 0,1 мг / мл (0,3 мм) DCPM перемещаются лучше, чем необработанные животные, что предполагает, что функция мышц стенки тела у этих животных частично сохраняется. Экспертиза мускулатуры путем окрашивания для выявления нитей актина, показала резкое сокращение дегенерация мышц у обработанных животных (рис. 1 и 2). В то время как необработанные животные показывают 5-6 умирающих или мертвых клеток на каждую пару квадрантов, у животных, обработанных MTZ или DCPM присутствуют только 1-2 таких клеток. Эксперименты доза-отклик (рис. 1) показали , что эффект MTZ и DCPM на мышечную дегенерацию оптимален при 0,5 мг / мл и 0,1 мг / мл в среде, соответственно ( фиг. 1). Положительный эффект качественно видимый до 0,1 мг / мл для MTZ и до 0,01 мг / мл для DCPM . Концентрация препаратов в среде выше 1 мг / мл МТЗ или 0,5 мг / мл DCPM была токсична для животных. Фактические концентрации лекарства в организме животного не известны, но , как полагают, 100-1000 × ниже. Дегенерация мышц в модели червя вызвана синергией между dys-1 ( cx18 ) и hlh -1 ( cc561 ) мутациями , в которой мягкая HLH -1 ( cc561 ) мутация служит усилителем dys -1 ( cx18 ) фенотипа (17). Доза-эффект эксперименты при dys -1 ( cx18 ) показали снижение мышечной дегенерации как у двойного мутанта (Рис. 1) . Дегенерация наблюдается в модели в зависимости от деятельности и зависит от времени (17). Следовательно, соединения, которые имеют седативный эффект или эффект снижения роста также уменьшат мышечную дистрофию. Чтобы убедиться, что MTZ и DCPM не действовали таким образом, а было реальное положительное влияние на мышцы , мы протестировали их влияние на эти параметры. Добавление 0,5 мг / мл MTZ или 0,1 мг / мл DCPM не имело седативного эффекта на передвижение и скорость роста dys -1 ( cx18 ) по сравнению с необработанными животными (фиг. 3А и В). Эти результаты показали, что выигрыш, получаемый при использовании MTZ и DCPM на дегенерацию мышц не связан с седативным эффектом или снижением темпов роста. Эффект торможения CA на С. elegans дистрофин-дефицитные мышцы. Так как мы обнаружили, что MTZ и DCPM могут уменьшить деградацию мышц у модели С. elegans, мы дополнительно исследовали механизм действия этих соединений. Сульфонамиды, как известно, сильные ингибиторы человеческой CA (20). У С. elegans этот класс ферментов плохо исследован. Единственной известной CA является САН-4 (25,26). Следовательно, мы первые исследовали СА у С. elegans. Набор из 14 последовательностей человека, полученных из участка NCBI, показал шесть предполагаемых центров в геноме С. elegans. Эти гены называются САН от 1 до 6. Диаграмма максимальных вероятностей была построена (рис. 4). Эта диаграмма показывает, что только САН-1 и САН-2 представляют высокую гомологию с человеческими CA-X и XI. Другие центры генома червя слишком расходятся с человеческой СА. Мы предположили, что эффект МТZ и DCPM можно имитировать с помощью разрушения одного или нескольких САН генов у С. elegans. Мы проверили эту гипотезу двухцепочечным РНК -опосредованным вмешательством ( РНК-интерференции ). РНК-интерференция является полезным методом для инактивации генов у С. elegans (27). Четыре клона можно получить через Geneservice банк ( III- 2NO3 , II- 5LN09 , X7M16 , X- 6I20 ), что позволило определению четырех из шести САН генов ( САН -1 , САН -2 , САН -3 и САН -4). Последние два клона были построены для целей данного исследования. РНК эксперименты с шестью клонами показали, что только ингибирование гена САН -4 значительно уменьшает мышечную дистрофию при dys -1 ( cx18 ) , HLH -1 ( cc561 ) мутации ( рис. 5). РНК эксперименты с комбинациями генов не принесли дополнительной информации, предполагая, что САН -4 несет полную ответственность за реакцию на лекарственные средства как МТZ и DCPM ( данные не представлены). Кроме того, САН -4 РНК не влияет на активность или рост червей, указывая, что это САН -4 как таковой отвечает за благоприятный эффект (фиг. 3А и В). Кроме того, этот эксперимент показал, частичное восстановление дисфункции 1 , 1 - HLH передвижения. Синергия между сульфаниламидами и CA РНК-интерференцией у С. Elegans. Для дальнейшего выяснения роли этих генов в ответ на сульфонамидны, мы протестировали их для выявления эффекта между наличием пропансульфонамида и уменьшением каждого САН транскрипта. Эксперимент «доза-ответ» был проведен в присутствии или отсутствии САН РНК . Мы не наблюдали статистических различий между доза-ответ контролем и доза-эффект в сочетании с ингибированием САН -1 , САН -2 , САН -3 , САН -5 и САН -6 транскриптов (рис. 6) . Оптимальная концентрация остается около 0,5 мг / мл в любых условиях, и сублетальная концентрация МТZ остается также неизменной (1 мг / мл). Напротив, ингибирование САН -4 транскриптов в присутствии MTZ или DCPM показали резкий сдвиг кривой доза-ответ влево. MTZ имеет летальную концентрацию 1 мг / мл в среде для отрицательного контроля и эта концентрация снижается до 0,1 мг / мл в сочетании с ингибированием САН -4 транскриптов. Оптимальная концентрация уменьшает вырождение и идет вниз от 0,5 до 0,01 мг / мл в сочетании с САН -4 иРНК . Для DCPM , токсичная концентрация смещается от 0,5 до 0,05 мг / мл в сочетании с САН -4 РНК и оптимальная концентрация смещена от 0,1 до 0,005 мг / мл. Эти результаты предполагают, что механизм является общим для обоих соединений. В качестве отрицательного контроля те же эксперименты проводились с имипрамином, нифедипином и тримипрамином. Эти препараты, как было ранее показано, снижают дегенерацию мышц у С. Elegans, но не являются ингибиторами CA (28). В присутствии САН-4 дцРНК, их соответствующие сублетальные концентрации остаются неизменными (данные не показаны), тем самым демонстрируя, что MTZ и DCPM взаимодействовуют с CAH-4 определенным образом. САН-4 распределение в тканях. Затем мы исследовали экспрессию в тканях САН-4. Для локализации CAH-4, плазмиды, несущей эндогенный промотор САН-4 в рамке с GFP, были построены и введены в червей. Пятьдесят червей (все стадии) анализировали при конфокальной микроскопии. Белок GFP был локализован на всех этапах в клетках, в нервной системе (нервное кольцо, спинной и брюшной мозг и двигательных нейронов спайки), в мышцах стенки тела и в анальной мышцы (рис. 7). Этот паттерн экспрессии согласуется с наблюдаемым эффектом. Влияние МТЗ и DCPM на мышцы мышей MDX. Лечение мышей MDX DCPM и МТZ. Затем мы проанализировали влияет ли МТZ и DCPM на модель МДД- мышей МДД . Соответствующих по полу и возрасту (70 -дневных ) MDX мышей кормили 120 дней препаратом с едой или контроль пищевыми продуктами с одинаковым составом , и животные были проанализированы. Для лечения DCPM использовали низкие дозы (15 мг / кг / день ) или высокие дозы (60 мг / кг / день ) , что , соответствовало 5 × 20 × средней дозировке у людей. Для MTZ использовали 20 × дозировку (86 мг / кг / день ), что было смертельным , поэтому препарат вводится в низкой концентрации, которая была 1 × дозировки ( 4,3 мг / кг / день) и высокая концентрация которого составляет 5 × дозировки (21,5 мг / кг / сутки). Концентрации препаратов в пищевых продуктах были рассчитаны на основе того , что у мышей MDX есть ~ 15% от их массы тела в день (LS , неопубликованные результаты). Все мыши имели одинаковый вес в конце лечения, предполагая, что потребление пищи был сопоставимо. Два типа исследований были проведены : гистологическое и измерения силы. Гистологическая оценка МТZ мышц. Мышцы после лечения животных подвергнуты гистологическому анализу. Мы провели окрашивание гематоксилином, эозином ( HE- окрашивание ), чтобы получить общее представление о гистологической структуре обеих групп для сравнения. Нет очевидных различий в гистологическом строении у 5 × MTZ рассматриваемых мышц по сравнению с контрольной группой (данные не показаны). Однако автоматизированный анализ распределения волокон показал тонкие различия (см. ниже). На рисунке 8А показаны BAlexa 488 конъюгированные WGA- окрашенные срезы необработанной и 5 × МТЗ группы MDX мышей. WGA- окрашивание позволило четкое разграничение границ волокна для определения минимального диаметра волокна. Двойное окрашивание тяжелой цепи миозина (МНС) (рис. 9а) предоставило информацию о распределении волокон, типах , изоформе MHC I, и типа IIa и IIb волокон . Оба вещества не показали влияние на состав типов волокна (данные не показаны). Автоматизированный гистологический анализ мышц. Для того чтобы получить надежные и достоверные при статистическом анализе критерии уменьшения патологии, соответствующих гистологических параметров дистрофических мышц у мышей MDX, критерии были стандартизированы и разработан автоматизированный количественный метод с S.CO Lifescience ( Мюнхен , Германия) (рис. 9) . Два адекватных параметров для анализа гистологического статуса были выбраны: минимальный диаметр волокон, и процент централизованно зарождающихся ядер в волокне (показатель регенерации мышц ) (29). Дистрофические мышцы обычно отображают высокую изменчивость диаметра мышечного волокна по сравнению с диким типом мышцы. Дисперсия коэффициента (VC) диаметров всех мышечных волокон минимального поперечного сечения обеспечивает численное значение изменчивости размера волокна (29). Минимальный диаметр очень устойчив к экспериментальной ошибке, такой как ориентация углов среза. Что касается второго гистологического параметра мышцы мышей дикого типа редко содержат централизованные ядра , в то время как мышцы MDX мышей показывают средний процент до 66 % централизованного зарождающихся ядер после первого кризиса дегенерации и регенерации в пределах 7 -недельного возраста. В этой работе мы исследовали около 3000 волокон ТА и диафрагмы (АСВ ) 5 × МТZ лечения и контрольной группы для выявления обоих параметров. Автоматизированный гистологический анализ проводили только в 5 × MTZ обработанной группе и ее необработанной контрольной группе, так как качество мышц , принадлежащих к группе DCPM было недостаточно, и, таким образом анализ не представляется возможным. Гистологический анализ мышц TA показали значительное снижение процентного содержания центральных ядер в волокнах у 5 × MTZ обработанной группы ( MTZ : 57,4 ± 14,9 ; контроль: 65,1 ± 11,2 , р = 0,03) (фиг. 10А). В соответствии с более высоким VC в 5 × MTZ- обработанной группе, мы смогли выделить сдвиг минимального диаметра в сторону меньших волокон с диаметром <20 мкм (фиг. 10С) в 5 × MTZ обработанной группе (Р = 0,03 ), тогда как количество волокон от 30 до 40 мкм были выше в контрольной группе (р = 0,02) (фиг. 10С) . В DIA нет значительного изменения доли централизованно зарождающихся ядер в 5 × MTZ обработанной группе ( 72,1 ± 6,7 ) и необработанной контрольной группе ( 75,1 ± 7,0 ) (p = 0,085 ) (фиг. 10B ) и VC мышц была несколько ниже, с Z = 425 в группе лечения по сравнению с Z = 439 в контрольной группой (Р> 0,05). Кроме того, очень сходное распределение размеров волокон наблюдали в обеих группах (фиг. 10D ). Измерение силы мышц MDX мышей, получавших МТZ и DCPM Способность лекарственных препаратов к улучшению формирования сил определялся измерением изометрической силы с использованием различных протоколов, которые в состоянии различить максимальные возможности формирования сил ( тетаническое силы ) и устойчивость к эксцентрическим сокращениям. Лечение мышей DCPM значительно увеличило тетаническую удельную силу длинного разгибателя пальцев (EDL ) на 30% в группе, получавшей лечение ( DCPM : 282 ± 64. Необработанные: 198 ± 53 , р = 0,034 ) (рис. . 11б). Это улучшение мышечной силы не было замечено во второй группе лечения при более низкой концентрации ( данные не показаны). Кроме того, мы рассмотрели в мышцах MDX максимальную силу поколения с использованием протокола эксцентричных сокращений с удлинением мышц на 10 % своей длины покоя (Lo). Лечение с DCPM во всех концентрациях, однако, не было способно улучшить этот параметр. Напротив, результаты на рисунке 11А показывают значительно (р = 0,034 ) более высокий процент среднего снижения силы в DCPM мышей (67 ± 14 %) по сравнению с необработанными мышей MDX (46 ± 15%) . Эти результаты показывают, что DCPM лечение улучшило эффективную мышечную силу, но не было в состоянии увеличить сопротивление мышечного волокна. В 5 × МТZ группе лечения отображается незначительно более высокий процент среднего снижения силы ( 55 ± 17 против 49 ± 15% в контрольной группе ) ( рис. 11в ), тогда как тетаническая удельная сила увеличилась у 5 × МTZ мышей на 25% ( MTZ : 264 ± 57 ; необработанных : 197 ± 86 Р = 0,05 ), как показано на рисунке 11D .В целом, за исключением теста эксцентрического сжатия, эти вещества демонстрируют заметное улучшение фенотипа дистрофии у MDX мышей. ОБСУЖДЕНИЕ Caenorhabditis Elegans в качестве модели для открытия новых лекарств. Наши данные подтверждают использование C. Elegans в качестве модельного организма для скрининга, идентификации и характеристики потенциальных фармакологических агентов. В этом исследовании мы показываем терапевтический потенциал ранее неожиданного класса молекул для лечения МДД. Одной из проблем использования модели C. Elegans для открытия новых лекарств является определение эффективной дозы для соединения. C. . Elegans имеет внешний экзоскелет ( кутикулы ), который обеспечивает защиту от экологических химических веществ ( 30). Таким образом, эффективная концентрация всасывающаяся через кутикулу и / или в просвете кишечника не известна и составляет примерно в 100-1000 раз ниже, чем в среде ( 28). Однако это ограничение не препятствует использованию C. . Elegans. Данные должны быть рассмотрены в основном качественным образом. Сульфаниламиды и CA в C. . Elegans. Сульфаниламиды , как известно, сильные ингибиторы нескольких CA у человека ( 20). После определения СА у червей, разрушение их экспрессии РНК-интерференции, мы обнаружили, что ингибирование РНКинтерференции САН -4 понижает дегенерацию мышц (рис. 4) . САН -4 уменьшение имитирует эффект лечения сульфаниламидами и, вполне вероятно, что оно является объектом для этих соединений ( рис. 5). Кроме того, некоторые сульфаниламиды в том числе МТZ и DCPM уже определены для активной работы с САН -4, мутации с ее полным отсутствием являются смертельными. Мы предположили, что эта летальность связана с отсутствием CAH -4 активности, так как мы могли имитировать ее высокой концентрацией MTZ (1 мг / мл) или DCPM (0,5 мг / мл). Кроме того , черви отображали повышенную чувствительность к МТZ и DCPM , когда эти методы лечения использовались в сочетании с САН -4 РНК-интерференцией (рис. 6) . Все вместе эти результаты показывают, что выигрыш, получаемый у дистрофин-дефицитных C. . Elegans обусловленингибированием CAH -4 активности сульфонамидами. Кроме того, САН -4 :: GFP, ген-репортер был локализован в мышцах стенки тела и в нервной системе. Хотя механизм и не может быть формально продемонстрирован, вполне вероятно, что сульфаниламиды действуют непосредственно на мышцы по следующим причинам : (i ) соединения не снижает передвижение dys -1 и дикого типа червей, что указывает на отсутствие значительного влияния на центральную нервную систему ( рис. 3а). (II) РНК-интерференция плохо воздействует на нервную систему C. Elegans (31) , но она имеет большое влияние в нашем эксперименте. МТZ и DCPM как известно, вызывают метаболический ацидоз и механизмы их действия, скорее всего, связаны с изменениями, которые изменяют рН трансмембранного потенциала и возбудимости (32). Более низкие значения рН уменьшают проводимости клеточной мембраны для калия и оказывают влияние на активацию и инактивацию натриевых и кальциевых каналов , соответственно (33). С другой стороны, подкисление саркоплазматического ретикулума индуцирует уменьшение унитарной проводимости Ca2 + канала (34). Так как мы обнаружили, что активность кальциевых каналов является критическим фактором в прогрессировании дистрофин-зависимой дегенерации мышц у C. . Elegans (35), мы предполагаем, что в соответствующей концентрации МТZ или DCPM может снизить Ca 2 + переходных процессов и, следовательно, уменьшит мышечную дистрофию у C. Elegans. Влияние МТZ и DCPM на мышцы мышей MDX. Несмотря на то, что мышечная патология при дефиците дистрофина отличается у модели MDX мышей и человека, модель MDX мыши является наиболее важной животной моделью для исследования в доклинических исследованиях МДД ( 36,37 ) . В настоящем исследовании мы применили рекомендуемые методы доклинического анализа в исследованиях МДД. Индикация параметров, включающих измерения силы мышц на изолированных мышцах и гистологическое исследование, включая долю центральных ядер в волоконах и VC размера, который отражает вырождение и процесс регенерации. Гистологический анализ мышц TA показал статистически значимое снижение процента от центральных ядер в волокнах у 5 × MTZ мышей , подразумевая снижение дегенерации / регенерации , происходящих в течение периода лечения . Этот результат особенно примечателен, так как лечение было начато в возрасте 70 дней , момент времени, когда дегенеративная и регенеративная активность уже имела место (38-40) .Кроме того, автоматизированный гистологический анализ показал увеличение изменчивости размера волокон у 5 × MTZ- группы. Подробный анализ распределения волокон по размерам показал возникновение более меньших и больших волокон, которые обычно возникают в ходе циклов регенерации и дегенерации, в эту группу. Кроме того окрашивание на нейронные молекулы клеточной адгезии ( NCAM ) для регенерирующих волокон четко показало большее количество NCAM положительных волокон (данные не показаны). АСВ представляет наиболее сильно пострадавшие в мышцах мышей MDX . В этом исследовании лечение MDX мышей с 5 × MTZ не улучшило гистологические параметры мембраны. Возможно, повреждения, связанны с дефицитом дистрофина в диафрагме слишком серьезны, чтобы быть облегчены лечением применяемым в данном исследовании. Кроме того, лечение, используемое здесь, можно провести до конца , чтобы показать, любое улучшение в диафрагме. Затем мы исследовали функциональный анализ мышечной силы мышц конечностей. Значительные различия между MDX и мышами дикого типа, которые легче наблюдаются у старых мышей (41). У МТZ- и DCPM - групп высокого дозировки препарата увеличение тетанической удельной силы привело к улучшению максимальной силы. Увеличение мышечной силы не из-за различий в мышечной массе или размере, так как проведена нормализация изолированной мышцы в отношении к этим двум параметрам. Максимальная сила, но не общее сопротивление мышц, была увеличена. Возможный механизм действия МТZ и DCPM может быть за счет сокращения активных форм кислорода, в частности путем блокирования CAIII ( 42-44 ) . Однако, поскольку CAIII более чем в 10 000 раз менее чувствительны к МТZ по сравнению с другими изоформами CA, эта гипотеза еще остается гипотезой. Ветцель и др. проанализировали эффект ингибиторов CA на мышечную силу и поколение Ca 2 + - переходных процессов. Ингибирование CA ( SR CA) изоформ саркоплазматического ретикулума было предложено. Действительно, MTZ сильно ингибировал мембранную CAIX и САН -4, и было установлено, что ингибирование только одной SR -CA изоформы не влияет на сокращение мышцы, тогда как ингибирование всех трех СА IV , IX и XIV оказывает эффект ( 26,45 ) . Лечение изолированных мышечных пучков одним конкретным ингибитором L- 645151 или 6ethoxyzolamide увеличило пик сигналов силы подергивания EDL и камбаловидной мышцы и показало длительный T1 / 2 релаксации. Авторы предположили, что СА порождает H + снаружи SR и поставляет ионы для связанного Ca 2 + -H + двунаправленного транспорта через мембрану SR и буферных входящих ионов Н + внутри SR путем катализа обратной реакции (46). Брунс и др. . (47) показали ускорение СО2 - HCO3 - реакции ~ 1000 раз поSr-Ca. Катализ CAII сократил половину времени с 7 с до ~ 7 мс. Ингибирование САС сульфаниламидов замедляло Ca 2 + изСР. Следовательно, высвобождение и поглощение Ca 2 + , а также время нарастания подергиваний ( увеличение силы) были продлены , обеспечивая правдоподобное объяснение для увеличения максимальной силы ингибиторами CA. Несмотря на снижение сопротивления мышечных волокон r эксцентричному сокращению анализируемые вещества DCPM и МТZ показали эффективность у мышей MDX и увеличили конкретную тетаническую мышечную силу, демонстрируя, что C. Elegans в сочетании с проверкой стратегии на мышах может вести к идентификации и характеристике потенциальных препаратов против редких заболеваний. В это время сульфонамиды такие, как MTZ и DCPM, не могут использоваться в дальнейшем для доклинических исследований для лечения МДД , но развитие блокаторов конкретного изофермента или по крайней мере органо- селективных ингибиторов СА может быть весьма полезно для улучшения их эффективности против МДД. Ссылки ↵ Kunkel L.M., Monaco A.P., Bertelson C.J., Colletti C.A. Molecular genetics of Duchenne muscular dystrophy. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986;51:349-351. Abstract/FREE Full Text ↵ Koenig M., Hoffman E.P., Bertelson C.J., Monaco A.P., Feener C., Kunkel L.M. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell 1987;50:509-517. CrossRef Medline Web of Science ↵ Rando T.A. The dystrophin-glycoprotein complex, cellular signaling, and the regulation of cell survival in the muscular dystrophies. Muscle Nerve 2001;24:1575-1594. CrossRef Medline Web of Science Rentschler S., Linn H., Deininger K., Bedford M.T., Espanel X., Sudol M. The WW domain of dystrophin requires EFhands region to interact with beta-dystroglycan. Biol. Chem. 1999;380:431-442. CrossRef Medline Web of Science ↵ Campbell K.P., Kahl S.D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature 1989;338:259262. CrossRef Medline ↵ Wells D.J. Treatments for muscular dystrophy, increased treatment options for Duchenne and related muscular dystropies. Gene Ther. 2008;15:1077-1078. CrossRef Medline Web of Science ↵ Manzur A.Y., Kuntzer T., Pike M., Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst. Rev. 2004;2. CD003725. Search Google Scholar ↵ Rodino-Klapac L.R., Chicoine L.G., Kaspar B.K., Mendell J.R. Gene therapy for duchenne muscular dystrophy, expectations and challenges. Arch. Neurol. 2007;64:1236-1241. Abstract/FREE Full Text ↵ Wilton S.D., Fletcher S. Antisense oligonucleotides in the treatment of Duchenne muscular dystrophy, Where are we now? Neuromuscul. Disord. 2005;15:399-402. CrossRef Medline Web of Science ↵ Miura P., Jasmin B.J. Utrophin upregulation for treating Duchenne or Becker muscular dystrophy, how close are we? Trends Mol. Med. 2006;12:122-129. CrossRef Medline Web of Science ↵ Cossu G., Sampaolesi M. New therapies for Duchenne muscular dystrophy, challenges, prospects and clinical trials. Trends Mol. Med. 2007;13:520-526. CrossRef Medline Web of Science ↵ Grounds M.D., Radley H.G., Lynch G.S., Nagaraju K., De Luca A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol. Dis. 2008;31:1-19. CrossRef Medline Web of Science ↵ Kaletta T., Hengartner M.O. Finding function in novel targets, C. elegans as a model organism. Nat. Rev. Drug Discov. 2006;5:387-398. CrossRef Medline Web of Science Segalat L. Invertebrate animal models of diseases as screening tools in drug discovery. ACS Chem. Biol. 2007;2:231236. CrossRef Medline Web of Science ↵ Nass R., Merchant K.M., Ryan T. Caenohabditis elegans in Parkinson's disease drug discovery, addressing an unmet medical need. Mol. Interv. 2008;8:284-293. CrossRef Medline Web of Science ↵ Bessou C., Giugia J.B., Franks C.J., Holden-Dye L., Segalat L. Mutations in the Caenorhabditis elegans dystrophin-like gene dys-1 lead to hyperactivity and suggest a link with cholinergic transmission. Neurogenetics 1998;2:61-72. CrossRef Medline Web of Science ↵ Gieseler K., Grisoni K., Segalat L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 2000;10:1092-1097. CrossRef Medline Web of Science ↵ Moerman D.G., Williams B.D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. WormBook 2006:1-16. Search Google Scholar ↵ Lindskog S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacol. Ther. 1997;74:1-20. CrossRef Medline Web of Science ↵ Supuran C.T., Scozzafava A., Casini A. Carbonic anhydrase inhibitors. Med. Res. Rev. 2003;23:146-189. CrossRef Medline Web of Science ↵ Pastorekova S., Parkkila S., Pastorek J., Supuran C.T. Carbonic anhydrases, current state of the art, therapeutic applications and future prospects. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2004;19:199-229. CrossRef Medline Web of Science ↵ Hewett-Emmett D. Evolution and distribution of the carbonic anhydrase gene families. EXS 2000;90:29-76. Medline ↵ Supuran C.T., Scozzafava A. Activation of carbonic anhydrase isozymes. EXS 2000;90:197-219. Medline ↵ Gaud A., Simon J.M., Witzel T., Carre-Pierrat M., Wermuth C.G., Segalat L. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscul. Disord. 2004;14:365-370. CrossRef Medline Web of Science ↵ Hall R.A., Vullo D., Innocenti A., Scozzafava A., Supuran C.T., Klappa P., Muhlschlegel F.A. External pH influences the transcriptional profile of the carbonic anhydrase, CAH-4b in Caenorhabditis elegans. Mol. Biochem. Parasitol 2008;161:140-149. CrossRef Medline Web of Science ↵ Crocetti L., Maresca A., Temperini C., Hall R.A., Scozzafava A., Muhlschlegel F.A., Supuran C.T. A thiabendazole sulfonamide shows potent inhibitory activity against mammalian and nematode alpha-carbonic anhydrases. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009;19:1371-1375. CrossRef Medline ↵ Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998;391:806-811. CrossRef Medline ↵ Carre-Pierrat M., Mariol M.C., Chambonnier L., Laugraud A., Heskia F., Giacomotto J., Segalat L. Blocking of striated muscle degeneration by serotonin in C. elegans. J. Muscle Res. Cell Motil. 2006;27:253-258. CrossRef Medline Web of Science ↵ Briguet A., Courdier-Fruh I., Foster M., Meier T., Magyar J.P. Histological parameters for the quantitative assessment of muscular dystrophy in the mdx-mouse. Neuromuscul. Disord. 2004;14:675-682. CrossRef Medline Web of Science ↵ Page A.P., Johnstone I.L. The cuticle. WormBook 2007:1-15. Search Google Scholar ↵ Kennedy S., Wang D., Ruvkun G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature 2004;427:645-649. CrossRef Medline ↵ Spacey S.D., Hildebrand M.E., Materek L.A., Bird T.D., Snutch T.P. Functional implications of a novel EA2 mutation in the P/Q-type calcium channel. Ann. Neurol. 2004;56:213-220. CrossRef Medline Web of Science ↵ Shapiro M.S., Gomeza J., Hamilton S.E., Hille B., Loose M.D., Nathanson N.M., Roche J.P., Wess J. Identification of subtypes of muscarinic receptors that regulate Ca2+ and K+ channel activity in sympathetic neurons. Life Sci. 2001;68:2481-2487. CrossRef Medline Web of Science ↵ Rousseau E., Pinkos J. pH modulates conducting and gating behaviour of single calcium release channels. Pflugers Arch. 1990;415:645-647. Medline Web of Science ↵ Mariol M.C., Segalat L. Muscular degeneration in the absence of dystrophin is a calcium-dependent process. Curr. Biol. 2001;11:1691-1694. CrossRef Medline Web of Science ↵ Willmann R., Possekel S., Dubach-Powell J., Meier T., Ruegg M.A. Mammalian animal models for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul. Disord. 2009;19:241-249. CrossRef Medline Web of Science ↵ Spurney C.F., Gordish-Dressman H., Guerron A.D., Sali A., Pandey G.S., Rawat R., Van Der Meulen J.H., Cha H.J., Pistilli E.E., Partridge T.A., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse, assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve 2009;39:591-602. CrossRef Medline Web of Science ↵ Carnwath J.W., Shotton D.M. Muscular dystrophy in the mdx mouse, histopathology of the soleus and extensor digitorum longus muscles. J. Neurol. Sci. 1987;80:39-54. CrossRef Medline Web of Science Coulton G.R., Morgan J.E., Partridge T.A., Sloper J.C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy, I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1988;14:53-70. Medline Web of Science ↵ Torres L.F., Duchen L.W. The mutant mdx, inherited myopathy in the mouse. Morphological studies of nerves, muscles and end-plates. Brain 1987;110:269-299. Abstract/FREE Full Text ↵ Dunant P., Larochelle N., Thirion C., Stucka R., Ursu D., Petrof B.J., Wolf E., Lochmuller H. Expression of dystrophin driven by the 1.35-kb MCK promoter ameliorates muscular dystrophy in fast, but not in slow muscles of transgenic mdx mice. Mol. Ther. 2003;8:80-89. CrossRef Medline Web of Science ↵ McKenna M.J., Medved I., Goodman C.A., Brown M.J., Bjorksten A.R., Murphy K.T., Petersen A.C., Sostaric S., Gong X. N-acetylcysteine attenuates the decline in muscle Na+, K+-pump activity and delays fatigue during prolonged exercise in humans. J. Physiol. 2006;576:279-288. Abstract/FREE Full Text Reid M.B. Free radicals and muscle fatigue, Of ROS, canaries, and the IOC. Free Radic. Biol. Med. 2008;44:169-179. CrossRef Medline Web of Science ↵ Räisänen S.R., Lehenkari P., Tasanen M., Rahkila P., Härkonen P.L., Väänäen H.K. Carbonic anhydrase III protects cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis. FASEB J. 1999;13:513-522. Abstract/FREE Full Text ↵ Scheibe R.J., Mundhenk K., Becker T., Hallerdei J., Waheed A., Shah G.N., Sly W.S., Gros G., Wetzel P. Carbonic anhydrase IV and IX, subcellular localization and functional role in mouse skeletal muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008;294:402-412. CrossRef ↵ Wetzel P., Kleinke T., Papadopoulos S., Gros G. Inhibition of muscle carbonic anhydrase slows the Ca(2+) transient in rat skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002;283:C1242-C1253. Abstract/FREE Full Text ↵ Bruns W., Dermietzel R., Gros G. Carbonic anhydrase in the sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal muscle. J. Physiol. 1986;371:351-364. Abstract/FREE Full Text ↵ Waterston R.H., Hirsh D., Lane T.R. Dominant mutations affecting muscle structure in Caenorhabditis elegans that map near the actin gene cluster. J. Mol. Biol. 1984;180:473-496. CrossRef Medline Web of Science ↵ Galtier N., Gouy M., Gautier C. SEAVIEW and PHYLO_WIN, two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny. Comput. Appl. Biosci. 1996;12:543-548. Abstract/FREE Full Text ↵ Edgar R.C. MUSCLE, multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004;32:1792-1797. Abstract/FREE Full Text ↵ Timmons L., Fire A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature 1998;395:854. CrossRef Medline ↵ Mello C., Fire A. DNA transformation. Methods Cell. Biol. 1995;48:451-482. Medline Web of Science Gorospe J.R., Hoffman E.P. Duchenne muscular dystrophy. Curr. Opin. Rheumatol. 1992;4:794-800. Medline Petrof B.J., Shrager J.B., Stedman H.H., Kelly A.M., Sweeney H.L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90:3710-3714. Abstract/FREE Full Text Оригинал статьи: http://hmg.oxfordjournals.org/content/18/21/4089.full?view=long&pmid=19648295 Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
