биотехнологии в иммунологииx
advertisement
Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКОСТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра патофизиологии лечебного факультета Филатов О.Ю., Малышев И.Ю. КЛЕТОЧНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В ИММУНОПАТОЛОГИИ Учебное пособие для студентов лечебного факультета Москва 2010 1 СОДЕРЖАНИЕ стр. АННОТАЦИЯ Глава1. Полимеразная цепная реакция Глава 2. Моноклональные антитела Глава 3. Химерные, гуманизированные и рекомбинантные антитела Глава 4. Генные вакцины Глава 5. Растительные вакцины Глава 6. Рекомбинантные лекарственные препараты в медицине Глава 7. Эмбриональные стволовые клетки Глава 8. Взрослые стволовые клетки в иммунопатологии Глава 9. Мезенхимальные стволовые клетки Список литературы РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ Контроль знаний. Вопросы. 2 3 4 11 18 24 45 51 56 68 74 80 81 91 Аннотация: Учебное пособие посвящено использованию современных методов клеточных биотехнологий в иммунопатологии, и предназначено для методического обеспечения инновационнообразовательной деятельности медицинского ВУЗа. Учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных сотрудников медицинских ВУЗов. В пособии представлены биотехнологии в иммунологии, которые применяются как в диагностических, так и в лечебных целях. В контексте данной тематики в пособии рассмотрены аспекты молекулярной диагностики инфекций (полимеразная цепная реакция, нанотехнологии, применение моноклональных антител и рекомбинантных антигенов и т.д.). В пособии приведены результаты и перспективные направления использования биотехнологии в лечебных и профилактических целях, и прежде применение рекомбинантных вакцин. Вакцинация остается одним из наиболее значимых достижений медицины последнего столетия. В настоящее время вакцины, оказывающие стимулирующее воздействие на иммунную функцию, рассматриваются не только как средство профилактики и лечения инфекционных болезней, но также и злокачественных новообразований. Рекомбинантные технологии позволяют избежать осложнений, связанных с применением аттенуированных вакцин путем получения определенных белков (или фрагментов белков) патогена, на которые и активируется иммунный ответ. В пособии рассмотрены и различные способы и варианты получения рекомбинантных вакцин, включая векторные вакцины, вакцины растительного происхождения и другие. Кроме того, в пособии отражены методы получения генно-инженерных лекарственных препаратов, содержащих моноклональные антитела (в том числе рецепторов и антагонистов колониестимулирующих факторов; антител, блокирующих фактор некроза опухоли; анти-CD20-антител, вызывающих истощение В-клеточных клонов и др.), а также рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-интерфероны. В настоящее время среди наиболее активно разрабатываемых генно-инженерных продуктов находятся препараты группы цитокинов - интерлейкины, а также вещества родственной группы - антагонисты рецепторов интерлейкинов. В качестве продуцентов необходимых белков/пептидов используются различные организмы: от дрожжей до млекопитающих; каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки, описанию которых также уделено внимание в пособии. Заключает пособие глава, посвященная использованию стволовых клеток в иммунопатологии. область применения (факультет, учебный курс): Лечебный факультет и ФПДО; курсы «Патофизиология» и «Клеточные биотехнологии в современной медицине» характер издания (учебник, учебное пособие и др.): рукопись учебного пособия формируемые компетенции (знания, умения и навыки): Теоретические и практические основы использования клеточных биотехнологий в иммуннопатологии объем (печатных листов или др.): 92 стр. формата А4. 3 Глава1. Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, широко используемый в биологии и медицине, в т. ч. и в иммунологии для диагностики некоторых вирусных инфекций [1]. Значение ПЦР, позволяющего легко и быстро получить огромное количество копий фрагментов ДНК, содержащихся в биоматериале порой в ничтожно малом количестве, трудно переоценить. Почему так важно амлифицировать (т.е. умножать количество) ДНК? Все мы знаем, что каждый живой организм (животное, бактерия, вирус и т.д.) содержит в своем геноме участки ДНК (РНК) с уникальными для данного организма последовательностями нуклеотидов. Таким образом, обнаружив данный уникальный генетический материал, мы можем, по крайней мере, идентифицировать вид живого организма, послужившего его источником. Однако, для того, чтобы провести такой анализ, мы должны располагать достаточно большим количеством анализируемой ДНК (или РНК), а добыть ее в таком количестве из биоматериала далеко не всегда возможно. Вот тут то и приходит на помощь ПЦР. При помощи ферментов, называемых полимеразами (в природе они принимают участие в синтезе молекул ДНК или РНК по соответствующей матрице во время репликации или транскрипции), удается копировать выбранный фрагмент ДНК – первоначально по матрице ДНК, присутствующей в образце (крови, биоптате, соскобах и т.д.), а в последующих циклах по матрице получаемых в предыдущих циклах фрагментов, так что количество фрагментов ДНК, необходимых для анализа, увеличивается в геометрической прогрессии. Отметим впрочем, что рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, 4 присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». Для того, чтобы осуществить полимеразную цепную реакцию, мы должны иметь в наличии матричную ДНК или РНК, с которой начнется копирование изучаемого фрагмента (она содержится в анализируемом образце), а также пару одноцепочечных фрагментов ДНК, называемых праймерами. Что такое праймеры? Это короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные участкам ДНК, ограничивающим с двух сторон выбранный фрагмент ДНК (тот, который будет амплифицироваться в ПЦР). Праймеры подбираются так, чтобы связываться комплементарно именно с участками ДНК, ограничивающими наш искомый фрагмент, и никакими другими; чаще всего они синтезируются химическим путем и поэтому их последовательности должны быть четко определены. Зачем нужны праймеры? Все дело в том, что ДНК-полимераза не может начать синтез второй цепочки ДНК без затравки – начального короткого фрагмента второй цепочки, к которому она и присоединяет остальные нуклеотиды один за другим до конца. Вот такой затравкой и служат наши праймеры, с них ДНК-полимераза начинает синтез и они же ограничивают синтезируемый фрагмент, находящийся между ними. Синтез идет с двух комплементарных цепочек ДНК в противоположных направлениях, на каждой цепи – свой праймер. Один цикл ПЦР, при котором количество генетического материала удваивается, включает три этапа. Первый этап: денатурация двухцепочечной ДНК, т.е. разделение ее на отдельные цепочки, с которыми потом сможет «работать» ДНК-полимераза. Денатурация происходит при нагревании реакционной смеси до 90-96ºС. Второй шаг (называемый отжигом) – комплементарное соединение полученных одноцепочечных молекул ДНК с праймерами при температуре 30-65ºС. 5 Третий шаг – полимеразный синтез второй цепочки ДНК, начинаемый с присоединенных к обеим цепочкам ДНК праймеров, при температуре 6575 ºС. После того, как мы еще раз повторим этот цикл, количество ДНК снова удвоится и т.д. Один цикл занимает немного времени – всего 1-3 мин., так что за 45 мин мы можем получить миллионы копий одной молекулы (а, точнее, фрагмента) ДНК. (рис.1) Рис.1 Полимеразная цепная реакция. (По Powledge T.M. The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ. 2004; 28: 47.) Несмотря на то, что ПЦР – весьма простой в исполнении метод, в ходе его применения могут возникать разного рода сложности. Первая из них – возможность контаминации исследуемого биологического образца экзогенным генетическим материалом (а для этого достаточно попадания в образец даже нескольких молекул ДНК!), который в результате ПЦР – метода огромной чувствительности - будет также амплифицирован. При таком варианте развития событий полученный результат в лучшем случае посчитают бесполезным и проведут анализ повторно, а в худшем случае 6 такой результат может привести к ошибочному заключению. Поэтому в лабораториях особое внимание уделяется предотвращению контаминации исследуемого материала, особенно фрагментами ДНК, амплифицированными в предыдущих тестах. Теперь задумаемся о том, каким образом удалось достичь автоматизации процесса ПЦР, заключающейся в том, что нам достаточно поместить в пробирку исследуемый материал, все необходимые реагенты и положить пробирку в амплификатор (прибор, который обеспечивает периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C), после чего, задав необходимые параметры температуры и времени, можно отдыхать порядка 40-50 мин., а потом получить искомый генетический материал в количестве, достаточном для анализа. В первые годы использования метода после каждого цикла (а обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов) приходилось добавлять в реакционную смесь инактивировалась при ДНК-полимеразу, высокой поскольку температуре, она быстро необходимой для денатурации двухцепочечной спирали ДНК. Это делало процедуру очень неэффективной, требовалось много времени и фермента. В 1986 г. процесс проведения ПЦР был существенно оптимизирован. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз - Taq-полимераза - была выделена из бактерий Thermus aquaticus, обитателей термальных источников, выживающих при температурах, смертельных для других живых организмов. Разумеется, в наши дни Taq-полимеразу, получают уже из генно-инженерных бактерий. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения 7 ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Другие термостабильные полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq-полимеразы. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования. Для визуализации результатов амплификации чаще всего применяют метод горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле, в состав которого добавляют специальный краситель ДНК, например, бромистый этидий. При этом, двигаясь с разной скоростью в электрическом поле, фрагменты ДНК разделяются по размеру, образуя характерную картину полосок. Гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм). (рис.2) Рис.2 Визуализация продукта ПЦР с помощью гель-электрофореза. 8 Для чего сейчас используют ПЦР в медицине? Первая и важнейшая область применения ПЦР – диагностика инфекций. Метод помогает выявить в биоматериале патогенные микроорганизмы, которые трудно поддаются культивированию или присутствуют в очень малых количествах. К ним относятся различные виды бактерий, грибов и вирусов. Касаемо применения этой методики в иммунологии, можно заметить, что ПЦР позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию быстрее, чем стандартный ELISA-тест (основанный на определении антител) – уже в первые недели после заражения. Второй вариант применения ПЦР в медицине – определение предрасполагающих или генетических определяющих 9 вариаций проявления и мутаций, различных моногенных и комплексных заболеваний. Вообще же ПЦР имеет чрезвычайно широкую сферу использования: в биологии и биотехнологии – для секвенирования ДНК и клонирования генов (с помощью ПЦР амплифицируют нужный ген, который затем можно ввести с помощью вектора в организм-продуцент; так получают многие генно-инженерные белки); в криминалистике – для сравнения генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого (ДНК расщепляют на фрагменты, амплифицируют с помощью ПЦР и затем разделяют фрагменты в геле с помощью электрофореза – «генетический отпечаток пальцев»); для установления отцовства, а также для выявления эволюционного родства среди организмов. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Полимеразная цепная реакция – это технология умножения (амплификации) генетического материала • Один цикл ПЦР, при котором количество генетического материала удваивается, включает три этапа. Первый шаг: денатурация двухцепочечной ДНК. Второй шаг: отжигом. Третий шаг – полимеразный синтез второй цепочки ДНК. • Для визуализации результатов амплификации применяют метод горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле Использование полимеразной цепной реакции • В медицине - диагностика инфекций • В медицине - определение генетических вариаций и мутаций • В медицине - установление отцовства • В биологии и биотехнологии – секвенирование ДНК и клонирование генов • В биологии –выявление эволюционного родства среди организмов • В криминалистике – сравнение генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого 10 Глава 2. Моноклональные антитела Моноклональные антитела представляют собой важнейший инструмент в руках иммунолога-исследователя. Применение их в комбинации с такими методами, как эпитопное картирование и молекулярное моделирование, делает возможным составление антигенного профиля и визуализацию макромолекулярной поверхности. Кроме того, мы не можем представить себе современную клиническую лабораторную диагностику без использования моноклональных антител. Итак, что такое моноклональные антитела? Когда гуморальное звено иммунитета сталкивается с иммуногеном, например, столбнячным токсином, начинается продукция множества антител. Эти антитела различаются между собой, поскольку они специфичны к разным участкам молекулы антигена, называемым также антигенными детерминантами, или эпитопами. В непрерывную некоторых случаях (линейную) эпитопы аминокислотную представляют собой последовательность небольшого размера (чаще всего 6-8 а/к) в структуре белка-антигена, однако часто эпитопы включают в себя аминокислотые остатки, которые в линейной структуре белка отстоят далеко друг от друга, однако сближены в пространстве из-за трехмерной конформации белковой молекулы (так называемые, конформационные эпитопы). Для нас важно понимать, что каждое антитело специфично к одному эпитопу, и что все антитела, связывающиеся с максимальной афинностью с одним и тем же эпитопом есть продукт одного клона В-клеток (понятие специфичности подразумевает связывание антитела с эпитопом антигена с максимальной для данного антитела афинностью, поскольку антитела могут связываться и с другими эпитопами, если они похожи по структуре, но с меньшей афинностью). Таким образом, антитела, специфичные к одному эпитопу и 11 продуцируемые одним В-клеточным клоном называются моноклональными. В приведенном выше примере столбнячный токсин индуцирует образование целого спектра антител несколькими клонами В-клеток – это поликлональный антительный ответ. Если бы удалось выделить и размножить in vitro один клон В-клеток, то мы получили бы моноклональные антитела. Первой проблемой, вставшей перед учеными на этом пути явилось то, что В-клетки погибали через несколько дней после их изоляции, например, из селезенки мышей. Это повлекло за собой развитие методик иммортализации В-клеток: применялась трансформация клеток вирусами или слияние их с опухолевыми клетками (клетками миеломы), так что получались клеточные гибриды, секретирующие моноклональные антитела – «гибридомы» (рис.3). Рис.3 Получение гибридом. 12 Итак, каким образом можно получить моноклональные антитела? Имеются рекомбинантные технологии получения антител, которые будут рассмотрены ниже, а сейчас мы проиллюстрируем этот процесс на примере получения мышиных моноклональных антител. Для того, чтобы получить мышиные моноклональные антитела, необходимо пройти 4 стадии: 1) иммунизацию, 2) гибридизацию иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекцию, 3) скрининг, 4) исследование свойств полученных антител и их описание. Стадия 1. Иммунизация. Иммунизация BALB/с мышей осуществляется тем иммуногеном, к которому необходимо получить антитела, причем обычно в присутствии адьюванта. В качестве иммуногена может выступать белок, целая клетка, пептид достаточной протяженности или короткий пептид, присоединенный к белку-носителю. Белки, как правило, вводятся под кожу, а клетки – внутрибрюшинно. Для получения хорошего иммунного ответа необходимо, чаще всего, несколько инъекций. По прошествии нескольких дней после каждой инъекции у мышей берут кровь и оценивают титр антител при помощи иммуноферментного анализа (для проведения которого, кстати, тоже необходимы моноклональные антитела). Заметим, повторных иммунизаций способствует что проведение переключению типа вырабатываемых антител с IgM на IgG. В подавляющем большинстве случаев желательно получить моноклональные антитела класса IgG, т.к. они менее склонны к деградации и более применимы в качестве терапевтических агентов. В конце концов, выбирается мышь с наиболее активным иммунным ответом, и из ее селезенки или лимфоузлов изолируют В-лимфоциты для последующей гибридизации. Заметим также, что помимо иммунизации in vivo, описанной выше, существует еще 13 возможность иммунизации in vitro, проводимой на культивированных клетках селезенки с минимальным количеством антигена. Стадия 2. Гибридизация и селекция. Процесс гибридизации заключается в слиянии В-лимфоцитов от иммунизированной мыши с клетками миеломы, происходящем в присутствие полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефектны по ферменту гипоксантингуанинфосфорилрибозилтрансферразе (ГГФРТ), и это их свойство важно для последующей селекции гибридом. Для лучшего понимания этого процесса, заметим, что существует два пути биосинтеза нуклеотидов – путь de novo (проще говоря, с нуля) и альтернативный, осуществляемый как раз с помощью фермента ГГФРТ. Клетки миеломы, не имеющие этого фермента, не могут использовать альтернативный путь. Когда слияние произошло, необходимо удалить оставшиеся миеломные клетки из смешанной культуры, т.к. размножаясь, они могут «вытеснить» гибридомные клетки. Эта селекция производится в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин блокирует de novo путь синтеза нуклеотидов, и миеломные клетки, для которых альтернативного пути нет, погибают, а гибридомы, заполучившие этот фермент от В-лимфоцитов, остаются. Колония гибридомных клеток растет и через 20-30 дней ее начинают культивировать в среде без аминоптерина, т.к. он уже не нужен. Стадия 3. Скрининг. Теперь, получив гибридомы, мы должны найти и выделить те из них, которые продуцируют антитела нужной специфичности. Вначале тестируют клеточный супернатант на реактивность и специфичность содержащихся в нем антител, для чего применяют ИФА. В некоторых случаях используют иммуноцитохимический анализ. Гибридомы, секретирующие антитела, неспецифичные к данному антигену, стараются выявить и удалисть как 14 можно раньше. Выбранные гибридомы пересаживают в большие по размеру колбы и культивируют, в супернатанте при этом содержатся моноклональные антитела в концентрации, как правило, от 1 до 60 мкмоль/мл. Получаемые таким образом антитела замораживают и хранят до тех пор, пока они не понадобятся. Стадия 4. вышеописанными Анализ моноклональных действиями следует антител. исследование За всеми реактивности, специфичности и кросс-реактивности получаемых антител. Необходимо определить изотип секретируемых антител от каждой полученной гибридомы. Поскольку, как правило, мы имеем несколько стабильных позитивных гибридом, образовавшихся при слиянии различных Влимфоцитов с миеломными клетками, мы располагаем целой коллекцией моноклональных антител к данному антигену различного изотипа (к примеру, IgG1, IgG2a, IgG2b и т.д.). Антитела тестируются также на связывание с антигеном в условиях различных систем анализа. Это важно особенно в тех случаях, если антитела будут применяться в диагностических целях, поскольку в разных диагностических системах они могут вести себя по-разному, ведь при использовании некоторых технологий эпитопы антигена могут быть маскированы, разрушены или стать недоступными для антител в результате иммобилизации. Моноклональные антитела могут быть специфичны к нескольким эпитопам, поэтому проводят также эпитопное картирование, т.е. выявление тех последовательностей аминокислот, с которыми может связаться антитело. Каждое антитело с помощью ИФА тестируется на связывание с пептидами длиной порядка 10-20 а/к, перекрывающими всю структуру белка-антигена. Если антитела не связываются ни с одним пептидом, то, вероятно, они специфичны к конформационным эпитопам. Для анализа антигенных детерминант 15 таких антител применяют конкурентный ИФА [2]. Дальнейшая характеристика свойств антител может включать анализ аффинности их связывания с антигеном например, с помощью, поверхностного плазмонного резонанса (ППР). ППР – это оптический биосенсорный метод, позволяющий проводить наблюдения в реальном режиме времени, что позволяет не только регистрировать взаимодействие молекул, но и оценивать кинетические характеристики этого процесса Лазерный пучок света, проходящий через призму, падает на поверхность, покрытую золотом. Свет отражается от поверхности по всем направлениям за исключением критического угла. Лазерный пучок в этом направлении возбуждает плазмонную волну на поверхности металла, что и вызывает падение интенсивности отраженного света. Величина критического угла строго зависит от коэффициента преломления слоя, прилегающего к поверхности сенсора. Таким образом, оценивая изменения критического угла с течением времени, можно определить изменения, происходящие на поверхности сенсора (рис 4). Рис.4 Поверхностный плазмонный резонанс. После того, как моноклональные антитела получены и охарактеризованы, они могут применяться в различных целях. Как 16 правило, цели эти – научно-исследовательские (например, эпитопное картирование антигена) или диагностические (диагностика инфекций, гистопатологическая диагностика аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей и т.д.). Применение мышиных антител с лечебной целью затруднено, хотя они и могут быть эффективны, поскольку эти антитела являются чужеродными для иммунной системы человека и могут вызвать на себя иммунный ответ. Чтобы этого избежать, существуют способы создания химерных антител, с мышиным Fabдоменом и человеческим Fc-доменом. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Моноклональные антитела – это антитела, специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним В-клеточным клоном называются моноклональными Получение моноклональныех антител: 1) иммунизация, 2) получение клеток миеломы, 3) гибридизация иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекция, 4)скрининг и исследование свойств полученных антител. Анализ аффинности моноклональных антител поверхностным плазмонным резонансом (ППР). Применение моноклональных антител • В научных исследованиях • В диагностике • В терапии 17 Глава 3. Химерные, гуманизированные и рекомбинантные антитела В последние годы применение моноклональных антител в научноисследовательской и клинической практике сильно возросло, во многом благодаря такому специфичность. свойству Начали антител, создаваться как чрезвычайно моноклональные высокая антитела, «заточенные» под применение в той или иной сфере клинической практики: менее иммуногенные, меньших размеров, большей аффинности или несущие на себе специальные терапевтические или диагностические лиганды, например, радиометки, флуоресцентные метки, токсины или ферменты, превращающие неактивное пролекарство в активную цитотоксическую форму. После того, как был разработан способ получения мышиных моноклональных антител, чрезвычайно возрос интерес к применению иммунотерапии антителами злокачественных опухолей. Однако интерес этот начал быстро гаснуть, поскольку в клинической практике применения таких антител медики столкнулись с серьезными трудностями. Первая и наиглавнейшая из них – «анти-мышиный» антительный ответ человеческой иммунной системы, направленный на вводимые с лечебной целью антитела. К другим проблемам можно отнести менее выраженную антителозависимую цитотоксичность и меньшую продолжительность жизни мышиных моноклональных антител по сравнению с человеческими. Наладить продукцию человеческих моноклональных антител оказалось также затруднительным вследствие низкого уровня гибридизации (слияния человеческих лимфоцитов с клетками миеломы) и низкой стабильности с большим трудом полученных гибридом. Вследствие всех вышеописанных 18 обстоятельств начали развиваться технологии «очеловечивания» мышиных антител путем определенных их модификаций. Было предложено 3 подхода к модификации мышиных антител: 1. Химерные антитела первого поколения. Ген вариабельного домена мышиного антитела клонируется и экспрессируется в системе вместе с генами константного доменачеловеческого антитела. Получают гибридные антитела с мышиным Fab- и человеческим Fc-доменом. 2. Гиперхимерные антитела второго поколения. В этом подходе используются лишь минимальные фрагменты мышиного антитела, которые определяют его комплементарность к антигену, эти фрагменты как бы встроены в структуру человеческого антитела. Получаемые таким образом антитела больше похожи на человеческие, чем антитела первого поколения, и потому менее иммуногенны. Если химерное антитело содержит 30-35% мышиного и 65-70% человеческого белка, то в гиперхимерном (гуманизированном) антителе содержание человеческого белка достигает 90%, а мышиного остается только 10%. Частота образования нейтрализующих антител в ответ на введение этих модернизированных антител уменьшается с 74% в случае мышиных до 46% - химерных и 4% - гиперхимерных антител. 3. Получение Биспецифичные специфичных биспецифических антитела к получают совершенно из разным гуманизированных антител. моноклональных антител, антигенам. Так, например, биспецифическое антитело, применяемое для лечения опухоли, одним плечом гипервариабельного домена связывается с поверхностным антигеном опухолевой клетки (HER2), а другим с антигенным рецептором Т-клетки (CD3), что обеспечивает их тесный контакт. Технология получения рекомбинантных фаговых антител. Fab- и Fv-фрагменты антител имеют те же характеристики связывания с 19 антигеном, что и целое антитело, хотя их аффинность может быть ниже. Такие фрагменты намного легче получить рекомбинантным путем от бактерий, поскольку для их синтеза не требуется гликозилирование. Fabфрагменты состоят из легкой и тяжелой цепей, соединенных между собой в области CL- и CH1-доменов. Однако Fv-фрагменты, состоящие только из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей, трудно получить подобным образом, т.к. вариабельные домены не склонны к стабильной ассоциации. Был разработан способ конструкции одноцепочечных Fvфрагментов (scFv), в которых легкая и тяжелая цепи соединены между собой коротким пептидом (рис.5). Рис.5 Структура человеческого антитела (А), Fab-фрагмента (В) и одноцепочечного Fv-фрагмента (C) —scFv. VH,вариабельная область тяжелой цепи; VL,вариабельная область легкой цепи; CH,константная область тяжелой цепи; CL,константная область легкой цепи. (Smith K.A., Nelson P.N., Warren P., Astley S.J., Murray P.G., Greenman J. Demystified… recombinant antibodies. J Clin Pathol 2004; 57: 914.) 20 В 1990 году McCafferty и соавт. предложили методику, с помощью которой удалось добиться экспрессии scFv-фрагментов на поверхности нитевидного бактериофага. Остановимся на этой методике подробнее. Нитевидный фаг – это вирусоподобная частица, способная инфицировать бактерии E.сoli, вводя в бактериальную клетку свой генетический материал. Геном этого фага представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК, кодирующую пять оболочечных фаговых белков. После того, как ДНК фага оказывается в клетке, она начинает реплицироваться, внутри клетки происходит сборка фаговых частиц, и новые бактериофаги секретируются во внешнюю среду, не разрушая при этом саму бактериальную клетку. С помощью генной инженерии, ДНК, кодирующую антитела scFv-фрагмент амплифицированную с помощью ПЦР) (предварительно можно «вставить» в ген оболочечного белка бактериофага, так что в итоге на поверхности фага окажется составной белок, включивший в свою структуру scFv-фрагмент. Ген какого из пяти белков оболочки фага лучше всего избрать для этой цели? Часто используют ген белка рVIII, однако из-за того, что этот белок присутствует на поверхности фага в слишком большом количестве – 2700 копий – аффинность scFv-составных белков оказывается чересчур низкой. Поэтому чаще используется ген оболочечного белка рIII, так как он присутствует на поверхности фага всего лишь в трех-пяти экземплярах. Таким образом, на поверхности фага можно экспрессировать scFvфрагменты антител любой специфичности, что делает возможным создание т.н. фаговой библиотеки. Из такой библиотеки можно будет отобрать фага необходимой специфичности и легко размножить его, получив необходимое число копий scFv-фрагментов антител к какомулибо антигену. Самый простой способ провести селекцию фага нужной специфичности – инкубировать фаги с антигеном, сорбированным на 21 подложке. Все фаги, не связавшиеся с антигеном, удаляются при отмывке, а специфичные к антигену фаги (т.е. связавшиеся с ним) изолируются, размножаются, подвергаются очистке и используются в различных целях. Где и для чего можно использовать фаговые антитела? Чаще всего - в качестве лабораторных реагентов, заменяющих обычные антитела, например, в проточной цитометрии или иммуногистохимическом и иммуноферментном анализах. На иммуногистохимическое окрашивание применением антител, фаговых рис.6 аденомы специфичных продемонстрировано толстой к кишки с эндотелиальному ростовому фактору VEGF-A. Рис.6 Иммуногистохимическое окрашивание рака ободочной кишки с применением фаговых антител, специфичных к фактору роста эндотелия, х40 (по Smith K.A., Nelson P.N., Warren P., Astley S.J., Murray P.G., Greenman J. Demystified… recombinant antibodies. J Clin Pathol 2004; 57: 915.) 22 Также рекомбинантные терапевтических целях, антитела например для могут лечения применяться в злокачественных новообразований. Некоторой сложностью применения фаговых антител в диагностических целях является то, что они несут на себе лишь один сайт связывания с антигеном, в то время как у обычного антитела их, как минимум, два. Т.е. фаговые антитела должны иметь очень высокую аффинность связывания с антигеном, чтобы не быть случайно удаленными при отмывке. Однако с появлением таких методов, как плазмонный резонанс, позволяющий точно определять аффинность связывания молекул, эти трудности уже несложно преодолеть, тем более, что существуют способы повысить аффинность scFv-фрагментов к антигену путем направленного мутагенеза, например. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Химерные антитела – это антитела, имеющие в своей структуре составные части, происходящие из различных источников (видов антител) Виды химерных антител • Химерные антитела первого поколения • гибридные антитела с мышиным Fab- и человеческим Fc-доменом. Химерное антитело содержит 30-35% мышиного и 65-70% человеческого белка • Гиперхимерные (гуманизированные) антитела второго поколения • минимальные фрагменты мышиного антитела, которые определяют его комплементарность к антигену, встроены в структуру человеческого антитела. Антитело содержит 10% мышиного белка и 90% человеческого белка. • Биспецифические гуманизированные антитела • Биспецифичные антитела получают из моноклональных антител, специфичных к разным антигенам. 23 Глава 4. Генные вакцины Генные вакцины представляют собой новый подход к иммунизации и иммунотерапии, использующий не живые или инактивированные микроорганизмы, и даже не их антигенные фрагменты (субъединицы), а гены – один или несколько, - кодирующие белки патогена. В отличие от большинства выработки традиционных антител, генные вакцин, нацеленных вакцины на стимулируют стимуляцию и клеточные цитотоксические реакции, и антительный ответ. Целью этого подхода является выработка иммунитета в тех случаях, когда традиционные вакцины неэффективны, а также лечение хронических заболеваний – аллергических и аутоиммунных, а также рака. К генным вакцинам относятся вакцины, использующие вирусные векторы, и ДНК-вакцины. ДНК-вакцины ДНК-вакцины по критериям специфичности, эффективности и безопасности можно с полным правом назвать вакцинами третьего поколения [3]. К вакцинам первого поколения относятся вакцины, включающие цельные – живые ослабленные/инактивированные либо убитые – патогенные микроорганизмы. Таковыми являются вакцины от оспы или полиомиелита. Они индуцируют широкий спектр ответных иммунных реакций – активацию цитотоксических Т-лимфоцитов и Тхелперов, а также усиленную выработку антител В-лимфоцитами. Однако такие вакцины все-таки потенциально опасны, поскольку всегда сохраняется вероятность реактивации ослабленного патогена, особенно у лиц с недостаточно «сильным» иммунитетом (у маленьких детей и стариков, у больных СПИД, у больных тяжелыми хроническими заболеваниями и т.д.). Убитые вирусы с этой точки зрения не опасны, 24 однако они практически не индуцируют специфический Т-киллерный ответ. Для того, чтобы минимизировать риск инфекции, были созданы вакцины второго поколения – субъединичные. Как видно из названия, в основу этих вакцин включены отдельные белки патогенных организмов – например, столбнячный или дифтерийный токсины, либо рекомбинантные белки/пептиды, такие как поверхностные антигены вирусов гепатита В или гриппа. Субъединичные вакцины также генерируют Th-ответ и активацию продукции антител, но практически не влияют на цитотоксические иммунные реакции. Большая часть сведений о ДНК-вакцинах получена в экспериментах на животных, однако их эффективность была подтверждена и в ряде клинических испытаний. Так, к примеру, в 2006 году сообщалось об эффективном применении профилактической ДНК-вакцины от вируса птичьего гриппа, а в августе 2007 года появились первые – вполне обнадеживающие - результаты испытаний ДНК-вакцин против рассеянного склероза. Активно проводятся клинические исследования ДНК-вакцин при различных онкологических заболеваниях и, разумеется, ВИЧ-инфекции – в этих областях были также достигнуты некоторые успехи. ДНК-вакцины сочетают в себе преимущества вакцин предыдущих поколений – они безопасны и способны индуцировать цитотоксический Тклеточный ответ. Что представляет собой ДНК-вакцина? Основу ее составляют кольцевидной плазмиды формы), (маленькие в структуру молекулы бактериальной которых посредством ДНК генной инженерии вставлены гены (или один ген), кодирующие антигены микроорганизма. Когда такие плазмиды попадают в клетки человеческого организма, эти гены начинают «работать» и клетка синтезирует антигены данного патогенна, на которые и запускается иммунный ответ. Рассмотрим подробнее, как конструируются подобные плазмиды. 25 От активности экспрессии векторных плазмид напрямую зависит сила иммунного ответа на вакцину, поэтому особенно важно сконструировать плазмиду так, чтобы обеспечить максимальный уровень экспрессии включенных в нее генов. Итак, кроме гена (или нескольких генов), кодирующего антигенный белок патогена, в плазмиду непосредственно перед этим геном встраивают вирусный промотор (последовательность ДНК, запускающая начало транскрипции гена; часто используют ранний цитомегаловирусный промотор), а в конце гена – сигнал полиаденилирования, означающий конец транскрипции гена и присоединение к мРНК поли-А «хвоста» - необходимого элемента зрелой мРНК, готовой к трансляции. Как правило, нуклеотидные последовательности, являющиеся сигналом полиаденилирования, берут из генов гормона роста быка или -глобулина кролика. Иногда в интересующий нас ген вставляют также интрон А с целью увеличения стабильности мРНК, в ряде случаев используют еще энхансерные последовательности, повышающие уровень транскрипции. Помимо дизайна векторной плазмиды, имеет немаловажное значение, какой иммуноген мы вибираем, от этого может зависеть тип иммунного ответа. Если целью является индукция преимущественно антительного ответа, то обычно выбираются мембрано-связанные или секретируемые иммуногены. В том, же случае, когда необходимо вызвать цитотоксический Т-клеточный ответ, выбираются иммуногены, деградирующие в цитоплазме клетки с тем, чтобы быть представленными на ее поверхности в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса. С этой целью к N-концу антигена могут добавлять сигнальную последовательность для убиквитина – белка, принимающего участие в цитозольной осуществляемой протеасомами. 26 деградации белков, Огромный интерес представляет механизм действия ДНК-вакцин. Как уже было сказано, огромным преимуществом ДНК-вакцин перед другими вакцинами является их способность активировать цитотоксический иммунный ответ, однако в представлениях о том, как именно это происходит, остается еще много «белых» пятен. Долгое время считалось, что «голая» молекула кольцевой ДНК, не окруженная белковым чехлом, не может быть поглощена клеткой и достичь ее ядра. Однако в 1990 году Wolff и соавт. убедительно показали, что это совсем не так и плазмидной ДНК можно трансфецировать клетки in vivo. Эта находка открыла новые возможности для исследователей, поскольку теперь стало возможным доставлять нужные гены внутрь клетки, не используя вирусные векторы. В 1993 году Ulmer и соавт. показали, что иммунизация мышей внутримышечной инъекцией плазмидной ДНК, кодирующей антиген вируса гриппа, вызывает специфический цитотоскический Тклеточный ответ, инфицировании играющий мышей защитную живым вирусом роль при гриппа. последующем Эта защита, выражающаяся в снижении заболеваемости и смертности животных, проявлялась не только по отношению к тому же варианту вируса, от которого брали антигены, но и к другим вариантам (в частности, к подтипу вируса, появившемуся спустя 34 года после первоначально исследуемого подтипа). Этот эффект объясняется тем, что Т-киллеры распознают эпитопы как правило консервативных (внутренних) белков вируса, в отличие от антител, в основном распознающих наружные – наиболее изменчивые – вирусные антигены. Это – одна из причин, заставившая ученых столь упорно искать способы создания вакцины, индуцирующей цитотоксический Т-клеточный ответ. Итак, все мы знаем, что, для того, чтобы развился цитотоксический иммунный ответ, антиген должен быть представлен в комплексе с 27 молекулой MHC I типа для распознавания «наивными» Т-лимфоцитами. Сделать это могут только профессиональные антиген-представляющие клетки (АПК) костномозгового происхождения (главным образом, дендритные клетки и макрофаги/моноциты), что и было неоднократно подтверждено экспериментально. АПК, наряду с другими клетками, могут захватить плазмидную ДНК, синтезировать закодированный в ней белок, расщепить его и выставить на поверхности. В частности, при плазмид в эпидермис с помощью технологии «генной пушки» (метод бомбардировки клеток микрочастицами: на золотые или вольфрамовые микроскопические шарики наносят плазмидную ДНК и выстреливают по ткани), они подвергаются захвату кератиноцитами и клетками Лангерганса, последние незамедлительно мигрируют в регионарные лимфоузлы, чтобы представить новый антиген лимфоцитам. Однако возможны и другие варианты. В экспериментах упомянутой выше исследовательской группы (Fu, Ulmer и др.) было показано, что при внутримышечном введении ДНК, кодирующей антиген, наиболее активно захватывают плазмиды и экспрессируют этот антиген клетки мышечной ткани – миоциты. Более того, при пересадке таких миоцитов неиммунизированным мышам, у последних также развивался специфический иммунный ответ на антиген. Исследователям удалось доказать, что и в этом случае необходимо участие АПК мышей-реципиентов для представления антигена, источником которого служили пересаженные миоциты. Так возникло понятие кросспрайминга, при котором АПК каким-то образом получают и представляют антиген, продуцируемый не-антигенпрезентирующими клетками. Последние служат своеобразным депо антигена, однако сами при этом антиген Т-клеткам практически не представляют и, следовательно, не вызывают аутоиммунную реакцию. Конкретный механизм кросс- прайминга остается неизвестным. В качестве гипотез предлагается захват 28 АПК апоптотичеких телец, содержащих данный ген, либо транспорт продукта гена – целого белка или пептидов, образовавшихся при его расщеплении. ДНК-вакцины векторных плазмид последовательность, второго поколения. С применением обычных (содержащих лишь необходимые элементы кодирующую выбранный антиген, – промотор, терминатор транскрипции и т.д.), ДНК-вакцины эффективно индуцируют иммунный ответ у животных, однако проявляют весьма умеренную эффективность в клинических испытаниях. В связи с этим родилась потребность в разработке вакцин второго поколения, «работающих» более эффективно, путем внесения ряда модификаций. Одной из первых появилась стратегия добавления в вакцину плазмид, несущих гены различных факторов, стимулирующих иммунный ответ: хемокинов, цитокинов и ко-стимуляторных молекул (или не плазмид, а самих белков). Такие «генетические адьюванты» могут сосуществовать с антигеном в нескольких вариантах: в виде двух различных плазмид, одна из которых кодирует антиген, а вторая – цитокин; в структуре одной плазмиды, разделенные спейсерными участками ДНК; в структуре одного гена, с которого будет синтезироваться химерный белок. Сочетание в вакцине провоспалительных факторов (различных интерлейкином, ФНО, ГМ-КСФ) и Th2-индуцирующих цитокинов способствует развитию антительного ответа, а сочетание провоспалительных и Th1-индуцирующих факторов подавляет антительный и повышает цитотоксический ответ. Говоря об иммуногенности вакцин, нельзя не упомянуть о том, что бактериальная плазмида и сама по себе не инертна, а может вызывать иммунную реакцию, выступая в качестве адьюванта. Активность этой реакции, например, зависит от количества т.н. CpG-мотивов в структуре плазмиды, узнаваемый иммунными клетками. 29 Эта динуклеотидная поседовательность в 20 раз чаще встречается в бактериальной ДНК по сравнению с ДНК эукариот. В эукариотических клетках все CpG-мотивы подвергаются метилированию по цитозиновому нуклеотиду. Меняя число CpG-мотивов, можно в некоторой степени управлять иммуногенностью плазмиды. Свои иммуностимуляторные свойства CpG-мотивы проявляют в том, случае, когда они фланкированы двумя пуриновыми нуклеотидами с 5-конца и двумя пиримидиновыми основаниями с 3-конца, а участки ДНК, прилегающие к этому гексамеру, богаты гуанином – тогда клеткаммишеням будет легче связать и поглотить такую плазмиду. Были также применены подходы прямых модификаций самих антигенных плазмид с целью повышения экспрессии закодированного в них антигена тем или иным образом. Более предпочтительно использование синтетических генов, а не эндогенных вирусных или бактериальных последовательностей ДНК. Когда ген искусственно синтезируется, из него можно исключить т.н. негативные регуляторные последовательности, тормозящие экспрессию данных генов в клетке, а также адаптировать состав кодонов к эукариотической клетке. Модификации антигена, приводящие к его секреции или экспрессии на поверхности клетки (путем добавления определенных сигнальных последовательностей в структуру гена) повышают его антигенность. Можно также «привязать» белок к нужному компартменту клетки, например путем убиквитинилирования или присоединения к лизосомально-ассоциированному мембранному белку – это повышает эффективность представления антигена в комплексе с молекулами ГКГ I класса. Если наряду с векторной ДНК вводить антиапоптотические факторы, то можно продлить жизнь АПК и также увеличить активность CD8+ Т-клеточного ответа. К этому добавим, что в том, случае, когда важнее вызвать антительный ответ, существует подход, при котором с 30 плазмиды экспрессируется антиген, соединенный с фактором С3d или CTLA4. Кроме того, существуют методики, облегчающие попадание плазмидной ДНК внутрь клеток-мишеней, поскольку было показано, что лишь очень небольшая доля вводимых в организм плазмид попадает в клетки-мишени. В качестве таких подходов можно упомянуть сорбцию ДНК на поверхность микрочастиц, применение липидных комплексов (липосом), облегчающих трансфекцию, электропорацию и использование классических всевозможные адьювантов. комбинации Липидные катионных комплексы липидов могут и включать холестерина. Микрочастицы, несущие молекулы ДНК (сорбированные на поверхности или «инкрустированные» в структуру микрочастиц) как правило, делают из биодеградирующих материалов, например, хитозана; также применяют ДНК в комплексе с поликатионами, например, полиэтиленимином. Электропорация при внутримышечном введении вакцины является одним из наиболее эффективных методов повышения захвата ДНК клетками: она создает в клетках поры, способствуя проникновению в них ДНК, а, кроме того, повреждает мышечные клетки, заставляя их регенерировать, активно экспрессируя при этом антигенный белок/пептид. Недостатком электропорации является то, что она способствует интеграции плазмид в собственный геном клетки-хозяина. Альтернативной стратегией является модификация ДНК вакцин с тем, чтобы их основной мишенью стали В-лимфоциты, которые, как известно, также обладают способностью презентировать антиген. Для этого плазмиду конструируют так, что продуктом ее экспрессии является антигенный белок, соединенный с тяжелой цепью иммуноглобулина, экспрессия же антигена находится под контролем специфичного для Вклеток промотора. Такие вакцины, вводимые внутривенно или внутрь 31 селезенки, эффективно трансфецируют В-лимфоциты, которые затем представляют антиген CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитам. Вирусные рекомбинантные вакцины Суть технологии создания вирусных векторных вакцин [4] можно описать следующим образом: в качестве вектора берут «проверенный» безопасный вирус (например, аденовирус) и вставляют в него гены, кодирующие антигенные белки других патогенных микроорганизмов. Вирус имеет свой аппарат проникновения в клетку (либо введения в нее своего генетического материала), поэтому использовать вирус в качестве вектора удобно – это позволяет эффективно трансфецировать клетки требуемым геном. Векторный вирус сам по себе играет роль адьюванта для иммунной системы, а, кроме того, появляется возможность избирательно «заражать» АПК. Так же, как и ДНК-вакцины, вирусные рекомбинантные вакцины могут индуцировать и гуморальный, и клеточный цитотоксический иммунный ответ, что и не удивительно, ведь принцип действия этих вакцин, в общем, одинаков. В последние годы активно изучается целесообразность применения нескольких типов вирусов в качестве векторов: поксивирусов, аденовирусов, альфавирусов, а также полиовирусов и ретровирусов (последние два находятся на начальной стадии изучения). Рассмотрим достоинства и недостатки каждого из этих векторов. Поксивирусы. Вирусы, принадлежащие к семейству Poxviridae наиболее часто используются в качестве векторов для генных вакцин, а, следовательно, и наилучшим образом охарактеризованы. Поксивирусы – это крупные ДНК-содержащие вирусы, размер нома которых составляет 130-300 тпн (тпн – тысяч пар нуклеотидов), реплицирующиеся в цитоплазме благодаря наличию собственного механизма транскрипции 32 вириона. Размер генома вируса имеет немаловажное значение для генной инженерии, поскольку, как правило, чем больше геном, тем больший фрагмент «чужеродной» ДНК мы можем в него ввести без потери стабильности вектора. Семейство Poxviridae делится на два подсемейства, одно из которых – Chordopoxviridae – включает в себя вируы 8 родов, инфицирующих клетки позвоночных. Из этих восьми два рода Orthopoxvirus и Avipoxvirus - широко применяются в качестве векторов для вакцинации. К роду Orthopoxvirus относятся вариола вирус, возбудитель натуральной оспы, и вирус вакциния, послуживший основой вакцины против оспы. К роду Avipoxvirus относятся вирусы, вызывающие оспу у птиц, в частности, fowlpox (FPV) и canarypox (CPV) вирусы. Каковы основные характеристики поксвирусов, обусловившие столь широкое их применение. Прежде всего, эти векторные вирусы очень стабильны: в лиофилизированном состоянии их можно заморозить и хранить около 2 месяцев. Была доказана эффективность и безопасность вакцин с применением этих вирусов при различных способах введения: интрадермальном, интраназальном, интравагинальном и интраректальном. При пероральном введении рекомбинантных вакциния вирусов, индуцируются как местный, так и системный иммунный ответ, причем ответ этот весьма долговременный. Огромным преимуществом вирусов вакциния перед вирусами других типов является то, что они могут нести достаточно большие фрагменты инородной ДНК без нарушения вирусной стабильности, что позволяет вводить в геном вируса сразу несколько генов и создавать мультивалентные вакцины – эти гены могут кодировать антигены одного микроорганизма или разных (например, поверхностный антиген вируса гепатита В, гликопротеин D вируса простого герпеса и гемагглютинин вируса гриппа), так что иммунный ответ сразу к нескольким инфекциям. 33 индуцируется защитный Наиболее применяемая стратегия создания рекомбинантного вектора на основе рекомбинации вакциния ДНК – использование внутри процесса инфицированных гомологичной клеток, процесса происходящего и в норме во время вирусной репликации. Для этого ген, который нужно встроить в ДНК вируса, сначала вводят в структуру векторной плазмиды, содержащую все необходимые элементы для экспрессии гена. К таким элементам относится, в частности, специальный промотор, направляющий рекомбинацию к заранее выбранному участку ДНК вируса. Кроме того, плазмида содержит еще и ген тимидинкиназы (ТК) – фермента, позволяющего впоследствии произвести селекцию вирусных рекомбинантов при выращивании их на специальных средах. Несколько лет назад вирус вакциния послужил вектором для генной вакцины от бешенства, которую вводили диким животным – лисицам - с тем, чтобы ограничить распространение этой инфекции. Однако этот вирус при использовании в качестве вектора имеет ряд недостатков, ограничивающих масштаб его применения у людей. Вирус вакциния может передаваться от зараженных лиц незараженным, и если иммунитет последних окажется скомпрометированным (например, у инфицированных ВИЧ), могут возникнуть известного рода проблемы. Вследствие этого обстоятельства в качестве более безопасных кандидатов на векторное использование рассматриваются аттенуированные штаммы вакцинии: MVA (modified vaccinia Ankara) и NYVAC. Первый штамм получают путем многократных пассажей вируса в культуре фибробластов куриного эмбриона, второй штамм был получен методом генной инженерии (делеционные мутации генов, кодирующих факторы вирулентности). Оба штамма в экспериментах на животных и в клинических исследованиях продемонстрировали свою эффективность и безопасность. Однако оставалась еще одна сложность: большая часть населения уже получила 34 когда-то прививку от оспы и, следовательно, приобрела иммунитет к вирусу вакциния – а мы знаем, что векторный вирус, на который развивается активный иммунный ответ, будет нейтрализован и не сможет эффективно «работать». Теперь все внимание исследователей обратилось к представителям второго подсемейства поксивирусов - вирусам FPV и CPV. Авипоксивирусы, в природе поражающие птиц, в других клетках вызывают лишь абортивную форму инфекции, при которой возможна экспрессия вирусных генов, однако ДНК не может реплицироваться и новые копии вирусов не образуются. Вскоре выяснилось, что в клетках млекопитающих боле эффективно работают векторы на основе CPV, с их помощью были созданы вакцины против цитомегаловирусной инфекции, бешенства и кори. CPV не вызывает перекрестных иммунных реакций против вируса вакциния и потому может успешно применяться у людей, перенесших в прошлом прививку от оспы. Аденовирусы. позвоночных, Аденовирусы лишенные - ДНК-содержащие липопротеиновой оболочки, вирусы содержащие единичную двухцепочечную молекулу ДНК. Аденовирусные векторы также обладают рядом преимуществ перед другими вакцинами: их безопасность хорошо установлена, они относительно стабильны и ими легко манипулировать, их легко получить. После лиофилизации, эти вирусы не требуют заморозки, что может быть важно для вакцинации населения слаборазвитых стран. Вакцины эффективны при различных путях введения и помимо системного иммунного ответа, вызывают активный иммунный ответ слизистых оболочек. ДНК аденовирусов существует в клетке в виде эписомы и не склонна интегрировать в клеточный геном. Наконец, аденовирусные вакцины не требуют введения адьювантов. Аденовирусная вакцина бывает двух видов: с нормальной репликацией и с дефектной. Что это значит? Чаще всего чужеродные гены 35 вставляют в ДНК вируса в области под названием Е1. Гены Е1 необходимы вирусу для репликации, поэтому рекомбинантные вирусы теряют способность к репликации. Чтобы такие вирусы можно было размножить in vitro, в среде необходимо наличие другого источника недостающих белков – им может быть т.н. хелперный вирус, несущий гены Е1, либо, что бывает чаще, Е1-экспрессирующая клеточная линия. В таких клетках вирус может размножаться, однако при попадании в организм человека или животного, он теряет способность к размножению и вызывает абортивную форму инфекции. Другая область вирусного генома, подходящая для вставки инородной ДНК – область Е3; она не важна для репликации и такие векторные вирусы реплицируются нормально (что повышает и эффективность, и опасность вакцины). Иногда ДНК необходимых для вакцины антигенов вставляют и в ту, и в другую область, получая Е1/Е3-делеционные векторы. Принцип конструкции аденовирусного вектора схож с вышеописанным для вируса вакциния. Сначала антиген-экспрессирующую кассету включают в состав плазмиды. Этими плазмидами наряду с Е1/Е3-делеционными мутантными аденовирусами заражают культуру клеток, экспрессирующих белки области Е1. В клетках антиген-экспрессирующая кассета встраивается в состав вирусной ДНК путем гомологичной рекомбинации. При этом используются рекомбиназы бактериофагов или дрожжей, распознающие специфические последовательности нуклеотидов в вирусной ДНК и в плазмиде, так что гены антигенов встраиваются не лишь бы куда, а в определенные места вирусного генома. Аденовирусные вакцины индуцируют и гуморальный, и клеточный иммунитет. С применением аденовирусных векторов были разработаны вакцины к вирусным папилломавирусной, ВИЧ, инфекциям: кори и 36 герпетической, др. Помимо гепатита В, многочисленных экспериментов на животных, было проведено также несколько клинических испытаний с вполне обнадеживающими результатами. Однако, как и любой вирусный вектор, аденовирус имеет свои недостатки. Говоря о безопасность, нельзя забывать, что предпочтительнее использование векторов с дефектной репликацией; некоторые серотипы аденовирусов потенциально патогенны и онкогенны для иммуноскомпрометированных лиц. Другое ограничение заключается в том, что аденовирусы чрезвычайно широко распространены и большинство населения уже имеет вирус-нейтрализующие антитела к наиболее часто встречающимся серотипам. В клинических испытаниях было показано, что вакцины неэффективны у лиц с предсуществующим иммунитетом к аденовирусам. Наконец, последнее ограничение – значительная иммуногенность аденовирусных белков, не позволяющая использовать эти векторы для повторных вакцинаций. Альфавирусы. Использование альфавирусов в качестве векторов набирает популярность, однако значительно отстает от аденовирусных или поксивирусных вакцин. Альфавирусы принадлежат к семейству Togaviridae, ним относятся, например, возбудители Восточного, Западного и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Вирус Венесуэльского энцефаломиелита наряду с вирусами Semliki Forest и Sindbis применяются в качестве векторов для вакцин, каких-либо весомых различий между этими тремя векторными вирусами нет. Альфавирусы содержат однонитчатую +РНК длиной около12 тпн, разделенную на две открытые рамки считывания (ОРС). Первая ОРС кодирует неструктурные белки, ответственные за транскрипцию и репликацию вирусной РНК (в т.ч. вирусную репликазу), вторая ОРС кодирует структурные белки вируса. Репликация альфавирусов происходит в цитоплазме клетки, что является безусловным преимуществом, т.к. снижает вероятность интеграции генома 37 вируса в геном клетки-хозяина. Другим достоинством этого вектора является то, что зараженные клетки зачастую подвергаются апоптозу; апоптотические тельца поглощаются АПК, в результате чего происходит кросс-прайминг. Эти преимущества вкупе с отсутствием иммунитета к альфавирусам у населения делают этот вирус весьма привлекательным для использования в качестве вектора. Принципы создания вакцин на основе альфавирусов таковы: гетерологичные гены встраиваются в геном вируса на место структурных генов. Для этого синтезируется плазмидная молекула ДНК, содержащая все необходимые гены (т.е. гены первой ОРС вируса и гетерологичные гены), а по ее матрице in vitro получают РНК. Получаемые РНК-векторы, называемые репликонами, вводят в клетки с помощью электропорации, где они могут реплицироваться и транскрибироваться, однако вирусных копий при этом не образуется. Репликоны можно размножать и поддерживать посредством котрансфекции клеток хелперной РНК, кодирующей структурные белки альфавируса. Репликаза векторной РНК реплицирует обе молекулы, но сборка вириона происходит только вокруг векторной РНК, т.к. ген репликазы содержит специальную последовательность для сборки капсида (рис.7). Рис.7 Создание ДНК-вакцины. 38 сигнальную 39 При такой методике остается вероятность образования небольшого числа векторных частиц, способных размножаться и инфицировать другие клетки за счет гомологичной рекомбинации между векторной и хелперной РНК. Для того, чтобы этого не происходило, была разработана система с двумя хелперными РНК, одна из которых кодирует капсидные, а другая мембранные белки. Была также создана специальная клеточная линия, экспрессирующая структурные белки альфавируса. В последние годы стало известно, что точечная мутация в Е2гликопротеине вируса Sindbis повышает инфицирование человеческих дендритных клеток in vitro. Таким образом, появляется возможность управлять клеточным тропизмом вирусного вектора, меняя свойства его гликопротеиновой оболочки. Первое клиническое испытание вакцины против ВИЧ на основе альфавирусного вектора, кодирующего ген ВИЧ gag началось несколько лет назад и должно подтвердить или опровергнуть целесообразность использования альфавирусных векторов в целях вакцинации. Полиовирусы. Полиовирусы принадлежат к семейству Picprnaviridae и имеют +РНК геном длиной примерно 7400 нп. Полиовирус является этиологическим полиовирусные векторы агентом произошли полиомиелита от и потому аттенуированного все хорошо охарактеризованного вакцинального штамма Sabin. Безопасность этого штамма подтверждена на миллонах провакцинированных от полиомиелита людей, а, кроме того, известно, что вакцинация этими вирусами вызывает надежный долговременный иммунитет. Полиовирусные векторы имеют и другие достоинства: они подходят для перорального применения, не разрушаясь в пищеварительном тракте и инфицируя при этом М-клетки слизистой, играющие роль АПК. Процесс производства аттенуированного 40 штамма полиовируса уже давно налажен, не требует больших финансовых затрат и позволяет получать векторный вирус в высоких титрах. На сегодняшний день разработано два подхода к созданию полиовирусных векторов: с нормальной репликацией и с дефектной. В первом случае гены, кодирующие иммуногенные пептиды другого микроорганизма, вставляются внутрь генов капсидных белков вируса, так что в результате внутри зараженной клетки синтезируются химерные белки вируса, представляющие собой капсидный белок, соединенный с пептидным иммуногеном. Такие вирусы могут нормально реплицироваться в клетках и не требуют хелперных вирусов для своего размножения. Недостатком этого подхода является то, что количество генетического материала, которого можно «ввести» в вирусный вектор, очень мало. Втора методика подразумевает конструкцию вирусных репликонов, в которых гены оболочечных белков вируса (области Р1) заменены на гетерологичные гены. РНК репликона, полученная путем транскрипции с синтезированной ДНК in vitro, вводится в клетку, инфицированную хелперным полиовирусом или вирусом вакциния, экспрессиющим гены области Р1 полиовируса – в результате осуществляется упаковка векторной РНК в вирусные частицы. Несмотря на то, что полиовирусы могут служить эффективными векторами для вакцин, они имеют и недостатки. Первый и наиболее значимый – ограничение по размеру встраиваемых в вектор гетерологичных генов (они могут кодировать не более 200 а/к, иначе вектор потеряет стабильность). Вторая проблема состоит в наличии иммунитета к полиовирусным векторам в большой части общей популяции. Вирусы герпеса. Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) является оболочечным вирусом, содержащим двуспиральную ДНК длиной 152 тпн, 41 реплицирующуюся в клеточном ядре. Первоначально вектор оказался удобен тем, что ДНК герпесвируса несет достаточно много генов, не являющихся необходимыми для роста вируса в культуре клеток, следовательно, эти гены потенциально подходят для замены на гетерологичные гены. Таким образом, мы может ввести в вирусный геном достаточно большое количество инородной ДНК, не влияя на способность вируса к репликации. Важно также и то, что вирусы герпеса персистируют в организме пожизненно, благодаря чему создается возможность длительной экспрессии необходимого нам антигена. Позже с целью повышения уровня безопасности вакцины стали разрабатываться методики получения герпесвирусного вектора с дефектной репликацией. Один из таких подходов – удаление из вирусного генома гликопротеина h, необходимого для репликации вирусных частиц. Такие вирусы размножают на культуре клеток, экспрессирующих гликопротеин h. Рекомбинация происходит, как и в предыдущих случаях, при трансфекции клеток векторным вирусом и плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, фланкированный гомологичными ВПГ-1 последовательностями. Несколько рекомбинантных векторов ВПГ-1 уже были использованы при вакцинации в ветеринарии и в клинической практике. Возможность «вставлять» в вектор большие количества ДНК привела к созданию мультивалентных вакцин на основе ВПГ-вектора. Тем не менее, токсичность ВПГ является основным препятствием для широкого применения этого векторного вируса. ВПГ-1, так же, как и другие герпесвирусы, нейротоксичен, некоторые белки вириона блокируют синтез ряда собственных белков клеток. Кроме того, следует учитывать наличие предсуществующего иммунитета к ВПГ у большей части населения. Перспективы. Вирусные векторы по многим причинам удобно использовать при разработке вакцин, при этом каждый векторный вирус 42 имеет свои индивидуальные характеристики, кратко суммированные в таблице 1. Вирусы могут проникать в различные типы клеток и, что наиболее значимо, все рассмотренные вирусные векторы способны трансфецировать АПК, которые затем смогут представить новый антиген иммунной системе. Кроме того, вирусы обладают адьювантными свойствами, поэтому нет нужды применять в вирусных вакцинах другие адьюванты. Конечно, нельзя рассматривать какой-то определенный тип вируса как универсальный вектор для всех вакцин, но особенности тех или иных векторных вирусов необходимо учитывать при разработке конкретной вакцины для определенных целей. Так, чтобы выбрать правильно вектор, нам необходимо знать, например, сколько генов мы хотим ввести в вектор и какие они по протяженности, будет ли вакцина моновалентной или оливалентной, какие клетки должны быть трансфецированы в первую очередь, какой тип иммунного ответа должен развиться, будет ли применяться вакцина у лиц с ослабленным иммунитетом, потребуется ли повторная вакцинация и т.д. В любом случае, вирусные вакцины можно успешно сочетать с другими видами вакцин, в т. ч. с ДНК-вакцинами. Таблица 1. Характеристика вирусных векторов. вектор биология предсуществующий преимуществен длительност иммунитет ный ь экспрессии против вектора иммунного тип безопасность размер вставки гена ответа вакциния двуспиральная да (у (аттенуирова ДНК, репликация провакцинированных нные не нарушена от оспы лиц) авипоксивиру двуспиральная нет сы ДНК, у ЦТЛ, CD4 транзиторная безопасен (но не для 30 тпн и (дни) иммуносупрессирован более ных лиц) штаммы) ЦТЛ, CD4 транзиторная (дни) млекопитающих не реплицируются 43 абсолютно безопасен 30 тпн и более аденовирус альфавирусы двуспиральная да (вирус высоко ДНК иммуногенен) РНК (репликон) нет Ат, ЦТЛ, CD4 транзиторная безопасен 8-9 тпн безопасен у животных, До 8 тпн (дни) Ат, ЦТЛ длительная на людях нет данных ВПГ двуспиральная да Ат транзиторная ДНК ассоциирован с 30 тпн нейровирулентностью, инсерционным мутагенезом полиовирус односпиральная (аттенуирова РНК да Ат, ЦТЛ транзиторная безопасен менее 1 тпн нный штамм) ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты, CD4 – хелперные Т-лимфоциты, Ат - антитела РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Генные вакцины – это вакцины, включающие в своей основе гены микроорганизмов, один или несколько, кодирующие белки патогена. Они активируют как механизмы гуморального, так и клеточного иммунитета. Виды генных вакцин • ДНК-вакцины (первого и второго поколения) • Вирусные рекомбинантные вакцины • на основе поксивирусов • на основе аденовирусов • на основе альфавирусов • на основе полиовирусов • на основе ретровирусов • ДНК-вакцины. Основу ДНК-вакцины составляют плазмиды (маленькие молекулы бактериальной ДНК кольцевидной формы), в структуру которых посредством генной инженерии вставлены гены (или один ген), кодирующие антигены микроорганизма. Второе поколение ДНК-вакцин предполагает добавление в вакцину плазмид, несущих гены различных факторов, стимулирующих иммунный ответ: хемокинов, цитокинов и костимуляторных молекул (или не плазмид, а самих белков). • Вирусные вакцины. Суть технологии создания вирусных векторных вакцин можно описать следующим образом: в качестве вектора берут «проверенный» безопасный вирус (например, аденовирус) и вставляют в него гены, кодирующие антигенные белки других патогенных 44 микроорганизмов. Глава 5. Растительные вакцины В соответствие с призывом Гиппократа «пусть твоя пища будет твоим лекарством», исследователям-медикам пришла в голову мысль – а что, если с помощью генной инженерии изменить свойства растений или вирусов растений так, что они начнут производить рекомбинантные белки, которые можно будет использовать в качестве вакцины от самых разнообразных болезней, начиная с кариеса и кончая опасными для жизни инфекциями, вроде ВИЧ-инфекции. Разрабатывая растительные вакцины, ученые, прежде всего, преследуют цель создания вакцин дешевых в производстве, не требующих сложных способов введения (т.е. такие вакцины должны быть эффективны при приеме внутрь) и сложных условий хранения [5]. Особенно актуально создание съедобных вакцин для развивающихся стран. Какова общая концепция создания таких вакцин? Необходимые гены вводят в геном растения, заставляя последнее производить зашифрованные этими генами белки. Такие растения будут называться трансгенными. Подобно обычным субъединичным вакцинам, вакцины растительные несут в себе антигенные белки, но не гены, поэтому они безопаснее, чем, например, вирусные вакцины. Антигены, содержащиеся в трансгенных растениях, имеют возможность попасть в кишечник, не разрушаясь по дороге, т.к. наружная стенка клеток растений защищает их от воздействия желудочного сока. В кишечнике освобожденные из растительных клеток антигены захватываются М-клетками, а затем попадают в пейеровы бляшки и в регионарные лимфоузлы, где они могут быть представлены АПК. В результате индуцируется иммунный ответ – как локальный, так и системный. 45 Ввести инородную ДНК в геном растения можно двумя способами: путем бомбардировки из генной пушки культур эмбриональных растительных клеток в суспензии, либо, что и происходит чаще, с помощью Agrobacterium tumefaciens - бактерии, которая в природе обитает в почве и проникает в растения через микроповреждения растительного покрова. В этой бактерии содержится т.н. Ti-плазмида, которая встраивается в геном растительной клетки, при этом клетки начинают пролиферировать, образуя нечто наподобие опухоли. Эти-то микроорганизмы и используют для того, чтобы ввести в растительный геном нужный ген, помещая этот ген в Ti-плазмиду. Однако, прежде чем это сделать, Ti-лазмиды обезвреживают – удаляют из них гены, ответственные за синтез ауксина и цитокинина, так что при инфицировании растений «опухоль» уже не образуется. В плазмиду также вводят гены устойчивости к определенному антибиотику с тем, чтобы потом отобрать трансформированные клетки. ДНК встраивается в геном растения случайным образом, так что различные линии трансформированных растений экспрессируют антиген по-разному. В связи с этим трансформируют одновременно до 50-100 растений, а затем выбирают из них те, которые вырабатывают антиген в наибольших количествах. Создание трансгенного растения, подходящего для использования в качестве вакцины, занимает в среднем 3-9 месяцев, и в настоящее время предпринимаются усилия сократить этот срок до 6-8 недель. Каждый антиген, экспрессируемый растением, должен быть тестирован в экспериментах на животных, а также in vitro с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблотинга. Существуют усложненные варианты растительных вакцин, т.н. съедобные вакцины второго поколения – к ним можно отнести, например, многокомпонентные вакцины, содержащие сразу несколько антигенов. Их 46 получают путем скрещивания двух растительных линий, экспрессирующих разные антигены. Кроме того, в геном растений помимо антигенов могут быть введены адьюванты, повышающие иммуногенность вакцины. Необходимо заметить, что чужеродные белки синтезируются растением в относительно небольшом количестве и мало иммуногены, поэтому необходимо чтобы количество антигена в пероральной дозе вакцины значительно превышало это количество в аналогичной по эффективности дозе парентеральной/интраназальной вакцины. Так, например, одна доза вакцины от гепатита В для применения внутрь содержит в 10-100 раз больше антигена, чем эквивалентная доза парентеральной вакцины. Попытки увеличения количества и активности экспрессии инородных генов могут приводить к замедлению роста растения и его созревания, т.к. чрезмерная экспрессия чужеродного белка зачастую подавляет экспрессию собственных белков растения. Разрабатываются различные технологии преодоления вышеописанной проблемы: к ним можно отнести, например, оптимизацию нуклеотидного состава кодирующей последовательности гена для его экпрессии в клетках растений, экспрессию гена в пластидах, создание рекомбинантных вирусов растений, экспрессирующих данный антиген (часто для этой цели используют вирус CPMV – мозаичный вирус коровьего гороха, а также табачный мозаичный вирус, альфа-альфа мозаичный вирус) и некоторые другие. Каждый вид растений, используемых для создания растительных вакцин, имеет свои преимущества и недостатки, кратко отраженные в таблице 2. Таблица 2. Основные достоинства и недостатки трансгенных растений. 47 растение достоинства недостатки табак удобство хранения вакцины (множество содержит токсичные компоненты семян, хранящихся длительное время), большой урожай, получаемый быстро картофель много клинических исследований, легко необходимо готовить, что приводит к трансформировать и размножать из разрушению антигена. «глазков», долго хранится без заморозки бананы не нуждаются в кулинарной обработке, для созревания необходимо 2-3 года, часто произрастают в развивающихся трансформированный растения дают странах плоды через год, плоды быстро портятся после сбора, содержат мало белка помидоры быстро растут, содержат много витамина быстро портятся А, потенцирующего иммунный ответ, можно избежать проблему быстрой порчи плодов путем применения сухой заморозки рис высокая экспрессия белка, медленно растет, сложно выращивать экспрессируемые белки не разрушаются при кулинарной обработке, легко хранить и транспортировать салат-латук быстро растет, не нуждается в быстро портится кулинарной обработке соя большой урожай, получаемый быстро дыня канталупа быстро растет, легко трансформировать Первое клиническое испытание растительной вакцины было проведено в США в 1997 году. Вакцина на основе картофеля была нацелена против энтеротоксигенной кишечной палочки. 11 добровольцев ели трансгенный картофель, экспрессирующий лейкотриен В. У 10 из них появились нейтрализующие антитела, а у 6 – местный (на слизистых) иммунитет. На животных были успешно тестированы вакцины: картофель, содержащий антиген CT-B вибриона холеры; табак, экспрессирующий гемагглютинин вируса кори; картофель, содержащий HBS-антиген вируса гепатита В (зараженный мозаичным вирусом, экспрессирующим данный антиген); помидоры, экспрессирующие антигены вируса бешенства, а также помидоры, зараженные вирусом, экспрессирующим антигены ВИЧ. Помимо собственно вакцин, трансгенные растения могут применяться в медицине и в иных целях. Они могут служить 48 продуцентами моноклональных антител, цитокинов, интерферонов и других рекомбинантных белков, полезных при лечении инфекционных, онкологических и аутоиммунных болезней. В качестве примера можно привести моноклональные антитела BR-96 для направленной доставки доксорубицина в опухоли молочной железы, яичников, кишечника и легких, синтезируемые соей, химерные антитела IgG/IgA против Streptococcus mutans (для лечения кариеса) или интерлейкин-10 для лечения болезни Крона, синтезируемые табаком. Говоря об антителах, следует заметить, что трансгенные растения могут не только синтезировать цельные антитела классов IgM и IgG, а также их фрагменты (Fab-фрагменты, scFv-фрагменты), но также и рекомбинантные секреторные антитела класса IgA. Секреторные IgA, которые в будущем могут быть использованы для топической иммунотерапии, были успешно экспрессированы табаком. Рекомбинантные антитела, синтезируемые растениями все-таки не совсем похожи на человеческие, поскольку процессы гликозилирования в клетках растений и млекопитающих различны. Растительные антитела могут быть гликозилированы в «неправильных» местах или не гликозилированы вовсе (если сайты гликозилирования удалены). Гликозилирование антител в определенных местах необходимо для того, чтобы эти антитела при связывании с антигеном смогли активировать систему комплемента или цитотоксический иммунный ответ – очевидно, что антитела, полученные из растений, могут не выполнять этих функций. Преимущество это или недостаток растительных антител – зависит от того, для чего их будут использовать, поскольку во многих случаях активация комплемента или цитотоксических реакций может быть как раз нежелательна. Препятствием для разработки и широкого применения растительных вакцин может послужить неизбежность «трансгенной контаминации», 49 осуществляемой при переносе генетически модифицированной пыльцы на обычные растения (насекомыми, например), почвенными бактериями. Кроме того, не утихают дебаты по поводу использования генетически модифицированных пищевых продуктов, а количество исследований потенциальной опасности для здоровья трансгенных растений еще слишком мало, чтобы делать какие-либо окончательные выводы. Тем не менее, преимущества (прежде всего экономического характера) использования растений для продукции антител, вакцин и других биологически активных веществ становятся все более очевидными, в связи с чем можно ожидать активного развития этой отрасли биотехнологии. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Растительные вакцины – это вакцины, созданные на основе растений, в геном которых введены необходимые гены, заставляя эти растения производить зашифрованные инородными генами белки. Такие растения будут называться трансгенными. Концепция создания растительных вакцин • Инородную ДНК в геном растения можно ввести двумя способами: путем бомбардировки из генной пушки культур эмбриональных растительных клеток в суспензии, либо, с помощью Agrobacterium tumefaciens • Антигены, содержащиеся в трансгенных растениях, имеют возможность попасть в кишечник, не разрушаясь по дороге, т.к. наружная стенка клеток растений защищает их от воздействия желудочного сока • В кишечнике освобожденные из растительных клеток антигены захватываются М-клетками, а затем попадают в пейеровы бляшки и в регионарные лимфоузлы, где они могут быть представлены АПК. В результате индуцируется иммунный ответ – как локальный, так и системный 50 Глава 6. Рекомбинантные лекарственные препараты в медицине Лекарственные препараты, применяемые в иммунологической лечебной практике и получаемые с помощью технологии рекомбинантной ДНК, можно разделить на три основные группы: 1) рекомбинантные вакцины – белковые (пептидные) или генные, 2) рекомбинатные антитела и слитые (химерные) белки, 3) рекомбинантные цитокины (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухоли и др.) и антагонисты рецепторов цитокинов. О генных вакцинах мы подробно говорили выше. Рекомбинантные белковые вакцины могут содержать цельный антиген микроорганизма или его фрагменты, распознаваемые иммунными клетками – В-клеточные и Тклеточные эпитопы. Белковые рекомбинантные вакцины синтезируют с применением технологии рекомбинантной ДНК, похожей на ту, что была описана при получении инсулина. Кратко ее суть можно описать следующим образом: выбирают антиген данного патогенного микроорганизма – цельный белок или его фрагмент, на который может развиться защитный иммунный ответ, затем идентифицируют нуклеотидную последовательность и синтезируют ДНК, кодирующую этот антиген, после чего вводят ген в организм-продуцент с помощью подходящего вектора. Когда клетки продуцента синтезируют антиген, его изолируют и подвергают процедуре очистки. Продуцентами рекомбинантных белков могут служить различные организмы. Чаще всего, это бактерии E.coli или дрожжи. Так, например, клетки дрожжей синтезируют HBS-антиген, на основе которого производится вакцина от гепатита В в Индии. Продуцентами могут быть также клетки млекопитающих в культуре (например, клетки яичников китайского хомячка, синтезирующие HBS-Ag или клетки линии С-127), 51 трансгенные растения (с их помощью получают эпитоп ВИЧ, HBS-Ag). Каждый тип продуцента имеет свои преимущества и недостатки. Так, например, дрожжи в отличие от бактерий могут осуществлять посттрансляционные модификации продукта, что является их основным преимуществом; трансгенные растения можно выращивать в достаточно больших количествах при низких затратах, их продукция более безопасна (не содержит бактериальных токсинов, вирусов, способных вызвать инфекцию у человека и т.д.), однако выход рекомбинантного белка у растений низкий, кроме того, имеются отличия в посттрансляционных модификациях продукта. Перспективными продуцентами являются трансгенные млекопитающие, которые могут секретировать нужный белок, например, с молоком или мочой. Чтобы привязать секрецию белка к определенному органу, к кодирующему его гену добавляют промотор, работающий активно только в определенных клетках. По некоторым оценкам использование трансгенных животных для синтеза рекомбинантных белков является в 4-5 раз экономически более выгодным, чем применение для той же цели культур клеток млекопитающих. Рекомбинантные антитела и слитые белки весьма широко применяются в терапевтических целях. Слитые белки получают путем модификации гена таким образом, что организм-продуцент синтезирует Fc-фрагмент антитела, присоединенный к другому белку, как правило, рецептору какого-либо цитокина. Примером такого химерного белка, может послужить этанерсепт – гибридный белок, состоящий из Fcфрагмента IgG1, соединенного с рецептором ФНО. Каковы мишени рекомбинантных антител, применяющихся в терапевтических целях? Прежде всего, это ФНО - провоспалительный цитокин, играющий важную роль в патогенезе иммуновоспалительных заболеваний. Терапия, направленная на нейтрализацию этого фактора, хорошо зарекомендовала 52 себя при лечении болезни Крона и ревматоидного артрита. В клинике применяются такие препараты, как инфликсимаб, адалимумаб (моноклональные антитела к ФНО), этанерсепт. При неэффективности обычной терапии, их можно использовать также для лечения псориаза, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, васкулитов, аутоиммунных нефритов. Другой мишенью для моноклональных антител и гибридных белков являются поверхностные антигены лимфоцитов: CD2 (алефасепт, применяемый для лечения псориаза), CD3 (муромонаб, первоначально созданный для профилактики отторжения трансплантата, с 2002 г. исследуется эффективность при лечении диабета 1 типа), CD20 (рутиксимаб). CD20 – поверхностный антиген В-лимфоцитов, в 1999 г. была показана эффективность препарата моноклональных антител к этому рецептору - рутиксимаба при лечении неходжкинской лимфомы. В настоящее время возрастает интерес к возможности применения рутиксимаба при заболеваниях, где основную патогенетическую роль играют аутоантитела, например, при некоторых формах васкулитов, ревматоидном артрите и др. Рутиксимаб вызывает истощение клонов Влимфоцитов, при этом количество периферических В-клеток падает и возвращается к норме лишь через 9-12 мес. после окончания терапии. В последние годы были получены антитела и к другим поверхностным лейкоцитарным антигенам: CD25 (даклизимаб), CD33, CD52 (алемтузумаб). Мишенями для моноклональных антител и химерных белков могут служить также молекулы адгезии (CD11a, интегрины), костимуляторные молекулы, IgE, ростовые факторы, провоспалительные цитокины, антигены микроорганизмов [6]. Говоря о рекомбинантных цитокинах, следует начать, безусловно, с интерферонов – главных союзников иммунологов и инфекционистов в борьбе с хроническими вирусными заболеваниями. В 1980 году был 53 впервые получен рекомбинантный интерферон путем введения соответствующего гена в геном E.coli (технология рекомбинантной ДНК), это событие позволило начать производство интерферона в больших масштабах, в результате чего препарат стал гораздо доступнее по своей цене. В настоящее время основными продуцентами интерферонов являются E.coli, хотя интерферон -1а производится в культурах клеток млекопитающих. Рекомбинантный интерферон используют для лечения вирусных гепатитов, иных вирусных инфекций, а также некоторых форм хронического лейкоза. Интерферон обладает противовоспалительными свойствами, и его применяют при лечении рассеянного склероза. Рекомбинантный , интерферон также обладающий иммуномодулирующим действием (имеет меньшую противовирусную активность, чем другие интерфероны), применяют для лечения вирусных гепатитов, онкологических заболеваний, а также для профилактики и лечения инфекционных осложнений у пациентов с хроническим грануломатозом. В России зарегистрировано три зарубежных препарата рекомбинантного интерферона : роферон-А, интрон-А, реальдирон. Первые два препарата имеют пегелированную (пролонгированную) форму: пегасис и заключается пегинтрон в соответственно. конъюгации белковых Технология пегелирования препаратов с молекулой полиэтиленгликоля, которая защищает их от разрушения сывороточными ферментам, в результате чего период полураспада действующего вещества удлиняется на несколько суток и терапевтическая эффективность препарата повышается. Также в России выпускается целая гамма разнообразных препаратов на основе рекомбинантного интерферона -2b: реаферон-ЕС, интераль, виферон, кипферон, гиаферон, генферон, гриппферон, офтальмоферон, инфагель, герпферон, реаферон-ЕС-липинт. 54 К препаратам интерферона относятся авонекс, бетаферон и ребиформ, все они являются зарубежными. Рекомбинантный интерферон представляет отечественный ингарон и зарубежный имукин. В качестве привести примера рекомбинантных интерлейкинов отечественные препараты беталейкин можно – рекомбинантный интерлейкин-1 (применяемый для лечения токсической лейкопении, а также для устранения иммунодепрессии после тяжелых травм, операций и т.д.) и ронколейкин – рекомбинантный интерлейкин-2 (использующийся в комплексном лечении сепсиса и тяжелых инфекционно-воспалительных процессов различной локализации. В США и Европе активно изучается перспектива применения в клинической практике рекомбинантного интерлейкина-10 (препарат теновил). Это иммуносупрессорный и противовоспалительный цитокин, который, как предполагается, может быть с успехом использован в лечении аутоиммунных болезней – ревматоидного артрита, болезни Крона, рассеянного склероза, псориаза. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ В медицине применяются: рекомбинантные вакцины – белковые (пептидные) или генные рекомбинатные антитела и слитые (химерные) белки рекомбинантные цитокины (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухоли и др.) и антагонисты рецепторов цитокинов. 55 Глава 7. Эмбриональные стволовые клетки Общие вопросы Что такое эмбриональные стволовые клетки и как их получают? Понятно, что источником таких клеток является эмбрион. Человеческие ЭСК получают из эмбрионов, образовавшихся в результате экстракорпорального оплодотворения и используют в исследовательских целях, разумеется, при информированном согласии доноров. Такие эмбрионы имеют возраст 4-5 дней и представляют собой полый шарик из клеток – бластоцисту. Напомним, что бластоциста состоит из трофобласта – наружного слоя клеток, бластоцеле – внутренней полости и внутренней клеточной массы, состоящей примерно из 30 клеток, находящихся внутри «шарика». Внутренняя клеточная масса, из которой в последующем и развивается зародыш, как раз и является источником плюрипотентных стволовых клеток. Человеческие ЭС клетки (чЭС клетки) успешно изолируют из внутренней клеточной массы бластоцист двумя методами: с помощью избирательного комплемент-зависимого лизиса бластоцист с последующим удалением трофобластов или путем растворения гликопротеиновой мембраны бластоцист ферментом проназой (рис.8, рис.9). Рис. 8. Получение внутренней клеточной массы микрохирургическим путем. Слева направо: бластоцисты; процедура комплемент-индуцированного лизиса трофобласта; полученные клетки внутренней клеточной массы (ЭСК). 56 Рис.9. Сепарация внутриклеточной массы и трофоэктодермы механическим путем. Для поддержания недифференцированного состояния (что весьма непросто, ибо стволовые клетки самой природой запрограммированы на 57 дифференцировку) стволовые клетки выращивают в специальной среде на т.н. фидерном слое клеток (традиционно, это митотически инактивированные эмбриональные мышиные фибробласты [mouse embryo fibroblasts, MEF], но могут быть и другие клетки) – эти клетки позволяют ЭСК находиться в адгезированном состоянии (что необходимо, для регулировки их пролиферации и дифференцировки) и поставляют питательные вещества. В последние годы, впрочем, начинают развиваться методики культивирования ЭСК без применения фидерного слоя. ЭСК размножаются и, пока они еще не начали дифференцироваться, их пересевают (пассируют). Пересев (пассаж), как правило, производят каждые 2-3 дня, чтобы предотвратить дифференцировку. Существуют определенные параметры, по которым можно установить плюрипотентность и исключить дифференцировку ЭСК. К ним относится, в частности, анализ плюрипотентности in vitro. Если начать выращивать ЭСК в суспензии, они начинают формировать эмбриоидные тела, из которых можно изолировать производные всех трех зародышевых листков. Можно индуцировать дифференцировку ЭСК и альтернативным способом: оставить колонии на фидерном слое без пересева на срок, превышающий неделю. Также применяется анализ плюрипотентности in vivo: при трансплантации ЭСК мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, из ЭСК формируются опухоли – тератомы, состоящие из клеток-производных эктодермы, мезодермы и эндодермы. После того, как удается получить стабильную линию ЭСК остается, пожалуй, наиболее сложная задача – заставить эти клетки дифференцироваться в нужном направлении, с тем, чтобы использоваться их, например, в терапевтических целях. В общем, для достижения этой цели существует несколько подходов, которые применяют изолированно или в комбинациях: 58 добавление 1. в культуральную среду определенных ростовых факторов совместное культивирование и трансплантация ЭСК с 2. другими клетками, индуцирующими дифференцировку (часто это клетки мезенхимального происхождения) 3. имплантация ЭСК в органы животных 4. стимуляция экспрессии генов, действующих на ранних стадиях эмбриогенеза Применяют также изолирование клеток-предшественников с необходимыми свойствами при помощи метода FACS (флуоресцентноактивированной сортировки клеток) или изолирование клеток с определенным набором активированных генов. Можно ли с помощью ЭСК лечить болезни? Не возникает сомнений, что в будущем это станет возможным, однако на сегодняшний день проблема применения ЭСК в терапевтических целях только начинает исследоваться. Так, существуют эксперименты, изучающие возможность применения человеческих ЭСК на модели различных заболеваний у животных: диабета, нейродегенеративных и демиелинизирующих заболеваний, а также иммунодефицита. До клиники исследования по большей части еще не дошли, что и не удивительно, ведь эксперименты по изучению ЭСК начались лишь в 1998 году, когда эти клетки научились выделять и выращивать, за прошедшее с тех пор десятилетие наука, безусловно, добилась многого, но возникло и множество новых вопросов. Существует ряд проблем и сложностей, ограничивающих потенциальное применение ЭСК в практической медицине. Не в последнюю очередь, это вопросы этики: эмбрион – эта форма жизни, которую, как правило, необходимо разрушить с тем, чтобы получить человеческие ЭСК. Конечно, остается возможность получения ЭСК из 59 бластомеров (клеток преимплантационного эмбриона в стадии бластулы), при этом «остаток» эмбриона можно имплантировать обратно в матку и из него разовьется плод (существует даже диагностическая процедура, когда на исследование берут один из бластомеров), однако до сих пор не доказано, что такое весьма инвазивное вмешательство не оказывает никакого влияния на здоровье и развитие будущего ребенка. Другой проблемой, встающей перед современными исследователями, является необходимость разработки культуральных сред, не содержащих ксеногенных примесей. Дело в том, что традиционно ЭСК выращивают в среде, содержащей сыворотку крови животных, являющуюся источником питательных веществ, на фидерных слоях мышиных фибробластов, регилирующих пролиферацию ЭСК. Подобная технология не позволяет широко использовать ЭСК в клинической практике, поскольку они могут содержать патогенные и ксеногенные примеси от животных, способные запустить впоследствии нежелательные иммунные реакции.. В последние годы разрабатываются подходы к использованию бессывороточных сред и фидерных клеток человеческого происхождения (либо от фидерных клеток отказываются вовсе, заменяя их бесклеточным адгезивным материалом), так что вышеописанная проблема, скорее всего, уже в ближайшем будущем будет разрешена. Следующая сложность – риск опухолей, образующихся из недифференцированных популяций трансплантированных клеток. Так, в культуре клеток для терапевтического применения, присутсвие даже единственной недифференцированной клетки может стать причиной развития тератомы. При всем этом до сих пор не удавалось получить на 100% чистую дифференцированную культуру клеток из человеческих или мышиных ЭСК. Каковы подходы к решению этой проблемы? 1) убедиться в том, что ни одна из клеток в культуре не экспрессирует маркеры Oct4 60 или Nanog; 2) с помощью генной инженерии модифицировать ЭСК так, чтобы в будущем можно было подвергнуть дифференцировавшиеся из ЭСК клетки негативной селекции – например, все недифференцированные клетки будут чувствительными к какому-либо токсичному веществу, а дифференцированные клетки станут устойчивы к нему, 3) в 2004 году было показано, что добавление в культуральную среду аналога церамидов N-олеоилсеринола индуцирует избирательный апоптоз ЭСК, не затрагивая дифференцированные клетки. Как бы то ни было, не известно, позволяют ли вышеупомянутые методы достичь полного элиминирования недифференцированных клеток из клеточной культуры. Остаются также не решенными вопросы генетической нестабильности ЭСК (т.е. накопление мутаций в процессе пролиферации), реакции отторжения трансплантата при пересадке клеток в организм реципиента, эпигенетических модификаций (метилирование ДНК, модификации гистонов), возникающих как у эмбрионов, от которых берут ЭСК, так и по мере поддерживания ЭСК в культуре [7]. Эмбриональные стволовые клетки в иммунологии Пожалуй, одним из наиболее значимых для иммунологии исследований ЭСК явилась работа американских ученых Galic и соавт., опубликованная в 2006 году. В чем состояла ее суть? Дело в том, что этим исследователям популяции впервые удалось получить функциональных Т-клеток. из человеческих Более того, ЭСК перед дифференцировкой, ЭСК были трансфецированы вирусным вектором, содержащим репортерный ген (рис.10). Рис.10 Генноиженерная модификация человеческих ЭСК. Линия Н1 человеческих ЭСК была трансфецирована лентивирусным вектором, содержащим ген EGFP, затем были отобраны колонии гомогенно зеленого цвета (флуоресцентная окраска на продукт 61 трансгена EGFP). (а и b) фазово-контрастное и флуоресцентное изображение EGFPэкспрессирующей колонии Н1 при 71 пассаже. (с,e и f) иллюстрация недифференцированного фенотипа и продолжающейся экспрессии трансгена при 122 пассаже ЭСК: окрашивание на ранние маркеры СК Oct-4 (с) и щелочную фосфатазу (f), а также на EGFP (e). Окраска хромосом красителем DAPI (d). (по Galic Z, Kitchen SG, Kacena A, Subramanian A, Burke B, Cortado R, Zack JA. T lineage differentiation from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 1;103(31):11743). Получившиеся от таких модифицированных клеток тимоциты продолжали экспрессировать данный ген. Последнее означает, что теоретически из человеческих ЭСК можно не только получать тимоциты, но и задавать им нужные свойства (например, устойчивость к ВИЧ) путем генноинженерных модификаций. Получение Т-лимфоцитов из ЭСК – нелегкая задача, поскольку способы произвести все остальные клетки крови и иммунной системы из ЭСК были найдены до вышеупомянутого исследования: ученые к тому времени уже научились выводить клетки миелоидного и эритроидного ростков, 62 В-лимфоциты, натуральные киллеры, дендритные клетки и макрофаги. Т-лимфоциты тоже удалось получить, но из мышиных стволовых клеток. Каким образом Galic и соавт. удалось получить человеческие Т-клетки из ЭСК? Они использовали следующую комбинацию условий выращивания ЭСК: вначале их растили на фидерном слое клеток ОР9 (линия стромальных клеток костного мозга мышей), а затем предшественники уже частично переселяли в дифференцировавшиеся клетки- ткань тимуса, человеческого имплантированную иммунодефицитным мышам (мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом пересаживали кусочек человеческого фетального тимуса и печени под капсулу почки: в такой модели печень поставляла гемопоэтические СК, а тимус – стромальные элементы для их диффернцировки). В процессе роста на фидерном слое ЭСК начинали дифференцироваться и приобретать фенотип кроветворных клеток – экспрессировать характерные для них маркеры CD34, CD133, CD117. Кроме того, еще до начала дифференцировки в ЭСК был введен ген EGFP, которых также продолжал экспрессироваться. Затем клетки разделили на две группы: CD34+ и CD133+/CD34- и подселили в ткань тимико-печеночного имплантата сублетально облученных мышей. Клетки прижились примерно у трети облученных иммунодефицитных мышей (причем в отсутствие облучения приживления не наблюдалось), далее они проходили все стадии созревания тимоцитов, в результате чего дифференцировались в зрелые CD4+/CD8- и CD8+/CD4- Т-лимфоциты (продолжающие экспрессировать EGFP). Степень приживления трансплантированных клеток повышалась при проведении эксперимента на RAG2-/- мышах (RAG-/- мыши имеют пораженный аппарат рекомбинации V(D)J локусов TCR генов, что означает полную утерю функции Т и В лимфоцитов) при повышении дозы облучения и количества трансплантируемых клеток. Исследователи 63 доказали также, что полученные таким образом Т-клетки функциональны: было показано, что при взаимодействии с антителами к CD3 и CD28, эти клетки начинают усиленно экспрессировать рецептор к ИЛ-2, т.е. ведут себя так же, как и обыкновенные человеческие Т-лимфоциты [8]. Чтобы оценить значение вышеизложенной работы и возвращаясь немного назад, отметим, что к тому времени исследователями применялось два общих подхода к получению клеток крови из ЭСК (рис.11). Рис.11 Образование клеток крови из эмбриональных стволовых клеток. (Слева) мышиные ЭСК выращивают на фидерном слое из клеток линии ОР9, с последующим переселением на клетки линии DII-1+ OP9, а затем переселяют в органную культуру клеток фетального тимуса (FTOC). Трансплантация тимической органной культуры, населенной ЭСК, мышам RAG−/− приводит к генерации функциональных Тлимфоцитов, активирующихся при воздействии вируса. (Центр) человеческие ЭСК формируют эмбриоидные тельца за 10-дневный промежуток, из этих телец изолируются клетки CD45−, PECAM-1+, Flk-1+, VE-кадгерин +, выращиваются в бессывороточной среде и затем инъецируются в бедренную вену мышей. При этом получают несколько прижившихся линий кровяных клеток, но Т-лимфоцитов среди них нет. (Справа) человеческие ЭСК культивируют на фидерном слое ОР9 в течение 10-14 дней, затем изолируют CD34+ и CD33+ клетки. Тем временем мыши линии RAG−/− или мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) с приживленным под почечной капсулой трансплантатом, состоящим их фрагментов человеческого тимуса и печени, подвергаются облучению и полученные в культуре клеткипредшественники инъецируются в тимико-печеночный орган-трансплантат. Последующие биоптаты трансплантата содержат функциональные Т-лимфоциты, которые могут быть активированы антителами к CD3 in vitro. Fleming HE, Scadden DT. Embryonic stem cells make human T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(33): 12214. 64 Один из них включал этап образования эмбриоидных тел (которое начинает происходить, если клетки лишить поддерживающего адгезивного слоя), внутри которых образуются клетки экто-, энто- и мезодермы. Эмбриоидные тела выращивали в 65 различных условиях, затем диспергировали и среди прочих получали кроветворные клеки- предшественники, могущие in vitro дать начало нескольким росткам кроветворения. Второй подход заключался в переселении ЭСК с фидерного слоя MEF, на слой стромальных клеток, запускающих гемопоэтическую дифференцировку. Получить Т-лимфоциты долгое время не удавалось, существовало даже предположение, что ЭСК не обладают потенциалом дифференцироваться в этот тип клеток. Опровергнуть эту гипотезу удалось исследователям из лаборатории Zuniga-Pflucker: они культивировали мышиные ЭСК на фидерном слое OP9, затем переносили их на аналогичный, но модифицированный слой фидерных клеток (экспрессирующий Notch лиганд Delta-like 1), а завершали дифференцировку тимоцитов посредством пересадки их в органную культуру фетального тимуса. Полученные Т-клетки при трансплантации мышам могли играть защитную роль при вирусной инфекции. Это исследование, подтвердившее, что при правильном подборе условий культивирования можно добиться дифференцировки мышиных ЭСК в зрелые Т-клетки, позволило родиться предположению, что то же самое можно сделать и с человеческими ЭСК, что, собственно, Galic и соавт. и претворили в жизнь в своей работе. Разработанная ими система может использоваться для оценки влияния специфических генных модификаций на дифференцировку Т-лимфоцитов in vivo. Кроме того, данная исследовательская лаборатория много сил отдала изучению синдромов дефицита Т-клеток (особенно ВИЧ-инфекции), поэтому возможность создания предшественников Т-лимфоцитов, которые можно трансплантировать лицам с иммунодефицитом, может иметь огромное значение в лечении таких заболеваний. В этом случае отличие от обычной аллогенной трансплантации предшественников Т-лимфоцитов заключается еще и в возможности модифицировать геном таких клеток, задавая им 66 нужные свойства (например, способность эффективно и с большой специфичностью поражать клетки, зараженные ВИЧ, сохраняя при этом резистентность к вирусу) [9]. Таковы перспективы и мы будем надеяться, что для их осуществления потребуется не слишком много времени. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Методы индукции дифференцировки эмбриональных стволовых клеток: • Первый этап • • добавление в культуральную среду определенных ростовых факторов Второй этап • совместное культивирование и трансплантация ЭСК с клетками, индуцирующими дифференцировку • Третий этап • • имплантация ЭСК в органы животных Четвертый этап • стимуляция экспрессии генов, действующих на ранних стадиях эмбриогенеза Получение клеток крови из эмбриональных стволовых клеток • мышиные ЭСК выращивают на фидерном слое, а затем переселяют в органную культуру клеток фетального тимуса. Трансплантация тимической органной культуры, населенной ЭСК, приводит к генерации функциональных Т-лимфоцитов, активирующихся при воздействии вируса. • человеческие ЭСК формируют эмбриоидные тельца, из этих телец изолируются клетки, выращиваются в бессывороточной среде и затем инъецируются в бедренную вену мышей. При этом получают несколько прижившихся линий кровяных клеток, но Т-лимфоцитов среди них нет. • человеческие ЭСК культивируют на фидерном слое, затем изолируют клетки. Тем временем мыши с приживленным под почечной капсулой трансплантатом, состоящим их фрагментов человеческого тимуса и печени, подвергаются облучению и полученные в культуре клетки-предшественники инъецируются в тимико-печеночный орган-трансплантат. Последующие биоптаты трансплантата содержат функциональные Т-лимфоциты. 67 Глава 8. Взрослые стволовые клетки в иммунопатологии Трансплантация кроветворных стволовых клеток при аутоиммунной патологии В наше время в клинике действительно широко применяются только взрослые стволовые клетки – причем, не любые, а только кроветворные: речь идет, прежде всего, о трансплантации кроветворных стволовых клеток (ТКСК) при различных формах лейкозов, врожденных болезнях крови и аутоиммунных болезнях. В последние годы начало изучаться применение взрослых стволовых клеток при сахарном диабете 1 типа, а также некоторых других патологиях, однако количество клинических исследований, посвященных данной проблеме, еще слишком мало. В последние годы ТКСК находит все большее применение при лечении тяжелых форм аутоиммунных заболеваний. В медицине для лечения аутоиммунной патологии уже неоднократно предпринимались попытки элиминации лимфоцитов, индуцирующих или поддерживающих аутоиммунный процесс. Сначала подход к системной элиминации Тхелперов с помощью антиCD3- и антиCD4-антител казался многообещающим, однако из-за тяжелых побочных эффектов оказался неприменим в клинической практике. За ним последовала методика системной элиминации В-лимфоцитов при помощи рутиксимаба – препарата антиCD20-антител. Но, поскольку известно, что хроническаое аутоиммунное воспаление поддерживается за счет взаимодействий между В-клетками, АПК и Т-хелперами (рис.12), можно предположить, что после удаления одного участника процесса (В-лимфоцитов) останется интактная популяция клеток памяти противоположного типа (Т-клеток), готовых начать патологический процесс вновь, как только В-лимфоциты вновь восстановятся из стволовых клеток. 68 Рис.12. Хроническая аутоиммунная реакция. Эффекторные иммуноциты, секретирующие цитокины Т-хелперы (в том числе, клетки памяти) и секретирующие аутоантитела плазматические клетки играют ключевую роль в аутоиммунной реакции. Кроме того, активированные АПК также принимают активное участие в инициации и поддерживании аутоиммунного воспаления. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 97.) Таким образом, элиминация обоих типов лимфоцитов посредством полной иммуноабляции циклофосфамидом в комбинации с антитимоцитарным и антилимфоцитарным глобулинами с последующим проведением ТКСК – единственный подход, способный привести к излчению или стойкой ремиссии тяжелой аутоиммунной патологии (рис.13). Рис.13 Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при аутоиммунной патологии. (А) хроническая аутоиммунная реакция нарушает гомеостаз 69 периферических популяций иммуноцитов. (В) При иммуноабляции антитимоцитарный глобулин (ATG) и антилимфоцитарный глобулин (ALG) элиминируют долгоживущие плазматические клетки, АПК, а также лимфоциты памяти, в то время как циклофосфамид (Су) препятствует дифференцировке В- и Т-лимфоцитов памяти в эффекторные иммуноциты. (С) Аутологичные стволовые клетки подвергаются очистке с тем, чтобы не допустить реинфузии аутореактивных лимфоцитов. Происходит замена иммунных лимфоцитов на наивные Т- и В-клетки, что приводит к установлению толерантности и нормального иммуноцитарного гомеостаза. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 99.) Этот метод весьма эффективен, хотя и опасен вследствие индукции транзиторного, но тяжелого иммунодефицита. Для проведения этой процедуры были разработаны различные протоколы, однако все они включают три основных этапа. Первый – мобилизация кровяных клетокпредшественников на периферии путем болюсной инфузии циклофосфаида и подкожного введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Второй шаг – полная иммуноабляция – высокодозная химиотераия с применением антилимфоцитарных антител или без оных, либо тотальное облучение. Наконец, финальный этап – 70 введение кровяных клеток-предшественников (чаще аутологичных, но иногда и аллогенных), дающих начало Т- и В-лимфоцитам. ТКСК во многих случаях дает длительную ремиссию заболевания вплоть до полного излечения, однако сопряжена с определенным риском летального исхода, а также развития реакции отторжения трансплантата. ТКСК без проведения иммуноабляции (но при поддержке иммуносупрессорной терапии, чтобы предотвратить отторжение) может применяться также для лечения первичных иммунодефицитов – в этом случае вводимые извне стволовые клетки восстанавливают пул лимфоцитов в организме. Однако в большинстве случаев тяжелых комбинированных иммунодефицитов достигается приживление в основном Т-лимфоцитов, в то время как антительный иммунодефицит остается [10]. ТКСК – метод неспецифичный, поэтому внимание ученых обратилось к изучению свойств отдельных клеточных популяций и осознанию той роли, какую они играют в индукции иммунологической толерантности. В этой связи нельзя не упомянуть о регуляторных Тлимфоцитах (CD4+CD25+ Т-лимфоциты), играющих не последнюю роль в поддержании периферической толерантности и модулирующих предрасположенность к аутоиммунным болезням (рис.14). Рис.14 Контроль аутоиммунной реакции регуляторными Т-клетками. (А) Захват аутоантигена слизистыми может привести к индукции in vivo регуляторных Тлимфоцитов, продуцирующих ТФР (Th3-клетки) или ИЛ-10 (Tr1-клетки). Оба типа регуляторных лимфоцитов негативно влияют на активированные АПК, представляющие аутоантиген, кроме того, цитокины ТФР и ИЛ-10 модулируют функции Т-лимфоцитов. Однако активные хронические иммунные реакции могут быть рефракторными к модуляции посредством индукции оральной толерантности. (В) альтернативная стратегия включает изоляцию регуляторных Т-лимфоцитов из периферической крови ациентов с аутоиммунной реакцией. После изоляции аутоантиген-специфичные регуляторные Т-лимфоциты можно размножить in vitro и ввести обратно тому же пациенту. В месте аутоиммунного воспаления эти клетки активируются АПК, а затем подавляют иммунную реакцию, конкурируя с антиген- 71 специфичными Т-лимфоцитами за взаимодействие с антигеном, а также секретируя противовоспалительные цитокины. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 100.) Было показано, что пересадка регуляторных Т-клеток эффективно предотвращает реакцию отторжения трансплантата. Известно также, что после проведения ТКСК число этих клеток вырастает, что подтверждает восстанавливающее влияние ТКСК на иммунорегуляторные механизмы (есть мнение, что регуляторные Т-клетки более устойчивы к иммуноабляции, чем собственно иммунные Т-лимфоциты). Так, например, на мышиной модели рассеянного склероза было продемонстрировано, что после трансплантации костного мозга количество CD4+CD25+ Тлимфоцитов возросло, а количество аутоантител резко уменьшилось [11]. 72 Другими клетками, оказывающими выраженное иммуномодулирующее действие, являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Свойства этих клеток и возможность их применения при лечении аутоиммунной патологии активно изучаются и кратко описаны в следующем разделе. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Применение взрослых стволовых клеток • Трансплантация СК при лейкозах • Трансплантация СК при врожденных заболеваниях крови • Трансплантация СК при аутоиммунных болезнях • Трансплантация СК при сахарном диабете Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при аутоиммунной патологии: • хроническая аутоиммунная реакция нарушает гомеостаз периферических популяций иммуноцитов. • При иммуноабляции антитимоцитарный глобулин (ATG) и антилимфоцитарный глобулин (ALG) элиминируют долгоживущие плазматические клетки, АПК, а также лимфоциты памяти, в то время как циклофосфамид (Су) препятствует дифференцировке В- и Т-лимфоцитов памяти в эффекторные иммуноциты. • Аутологичные стволовые клетки подвергаются очистке с тем, чтобы не допустить реинфузии аутореактивных лимфоцитов. Происходит замена иммунных лимфоцитов на наивные Т- и В-клетки, что приводит к установлению толерантности и нормального иммуноцитарного гомеостаза. 73 Глава 9. Мезенхимальные стволовые клетки Сразу заметим, что термин «мезенхимальная стволовая клетка» применяющийся обычно для обозначения различных стромальных клетокпредшественников, иммуномодуляторные свойства которых столь активно изучаются, не совсем верен. То есть, конечно, истинная мезенхимальная стволовая клетка существует на самом деле, но речь пойдет не о ней, а о клетках-предшественниках, не являющихся в строгом смысле стволовыми. Важнейшее свойство истинной стволовой клетки таково, что она при делении образует две дочерние клетки, одна из которых также является стволовой, а вторая начинает дифференцироваться (рис.15). Рис.15 Отличительные черты клеток-предшественников и стволовых клеток. Стволовая клетка при делении образует еще одну стволовую клетку и специализированную клетку. Клетка-предшественник уже частично специализирована и при делении образует две специализированные клетки. 74 Примером такой клетки является костномозговая стволовая клетка. В данной же главе речь пойдет о клетках, которых более корректно было бы назвать «мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками», хотя мы, следуя сложившейся традиции, оставим за ними более привычное название и аббревиатуру МСК. Каковы основные свойства МСК, позволяющие отличать их от других типов клеток? Это клетки, адгезирующие к субстрату, внешне напоминающие фибробласты (рис.16), экспрессирующие на поверхности маркеры CD73, CD90 и CD105, и не экспрессирующие маркеры кроветворных клеток CD14, CD34 и CD45. Рис.16 Человеческие мезенхимальные стволовые клетки. Фазово-контрастная микроскопия, x100 75 Все МСК обладают способностью дифференцироваться по трем основным направлениям: остеогенному, адипогенному и хондрогенному. Однако, клеточные популяции, удовлетворяющие всем вышеперечисленным требованиям, могут быть в то же время весьма гетерогенными. Первоначально МСК были найдены и описаны в строме костного мозга, однако позже выяснилось, что они присутствуют и в других тканях: периостальной и синовиальной оболочках, в синовиальной жидкости, в мышцах, в печени и крови, а также в жировой ткани. Наиболее интересным с точки зрения практической медицины свойством МС является их выраженная иммуномодулирующая активность. На мышах было показано, что МСК подавляют размножение стимулированных Т-клеток, предотвращая вход в S-фазу клеточного цикла, а также необратимо блокируя переход из G0 в G1-фазу. Впрочем, у приматов и людей, последний эффект оказался обратимым. Вместе с тем, МСК очень мало влияют, либо не влияют вовсе на эффекторную функцию или активацию Т-лимфоцтов. Ингибирование пролиферации Т- лимфоцитов, опосредованное МСК, не является антиген-специфичной, действует «сквозь» HLA-барьеры (как при аллотрансплантации, так и при ксенотрансплантации) и проявляется как при первичном, так и при вторичном иммунном ответе. гипотеза о том, что Рядом исследователей была выдвинута иммуносупрессия не является свойством исключительно МСК, а присуща стромальным клеткам как таковым, поскольку остеобласты, к примеру, оказывают аналогичный антипролиферативный эффект. Имеются данные о том, что МСК подавляют также пролиферацию В-лимфоцитов и угнетают синтез антител рецепторов хемокинов, осуществляемый активированными В-клетками. МСК оказывают влияние не только на лимфоциты, но и на другие типы клеток, участвующих в иммунном 76 ответе. Они препятствуют дифференцировке моноцитов в незрелые дендритные клетки и созреванию незрелых дендритных клеток, угнетают экспрессию дендритными клетками костимуляторных молекул и цитокинов, что приводит к снижению способности последих активировать Т-лимфоциты. Сообщается также о влиянии МСК на функции натуральных киллеров (снижение секреции интерферона , снижение пролиферации неактивных NK-клеток). Интересно и то, что МСК не только снижают иммунореактивность некоторых эффекторных клеток, но и сами каким-то образом избегают иммунного отторжения. В экспериментах in vitro эти клетки не являются мишенями цитотоксических Т-клеток или натуральных киллеров, а после in utero трансплантации овцам человеческие МСК персистировали длительное время и демонстрировали сайт-специфическую дифференцировку [12]. Американским исследователям Trivedi и соавт. удалось получить CD73(+) МСК наряду с CD34(+) гемопоэтическими клетками из человеческих ЭСК при культивировании последних на фидерном слое мышиных стромальных клеток ОР9. Впоследствие исследователям удалось получить МСК, культивируя ЭСК в отсутствие фидерного слоя клеток на пластинах, покрытых Матригелем. При этом были получены клетки, апоминающие фибробласты, экспрессирующие характерные для МСК маркеры и способные к мультилинейной дифференцировке. По своим характеристикам эти клетки оказались полностью аналогичными взрослым МСК из костного мозга человека. Подобно последним, полученные МСК экспрессировали только антигены MHC I класса, но не II класса. Кроме того, также как и их костномозговые «собратья» МСК, полученные из ЭСК, проявляли иммуносупрессивные свойства, подавляя пролиферацию Т-лимфоцитов в тесте смешанной лейкоцитарной реакции (MLR-тест) [13]. 77 Иммуносупрессивный продемонстрирован на эффект МСК обезьянах, МСК у размноженных донорских отторжения гистонесовместимого in vivo которых достоверно был инфузия отсрочила кожного впервые ex vivo реакцию трансплантата. Гаплоидентичные МСК были применены для лечения 9-летнего мальчика с тяжелой болезнью «трансплантат против хозяина», поразившей кишечник, кожу и печень после аллогенной ТКСК. Симптомы заболевания заметно уменьшились после трансплантации МСК, взятых от матери. Было продемонстрировано иммуносупрессивное действие МСК на модели экспериментального аллергического энцефаломиелита, эффект от лечения проявлялся в наибольшей степени, если МСК пересаживали в начале заболевания. Противовоспалительные эффекты МСК были подтверждены на модели блеомицин-индуцированного фиброза легких у мышей: инъекция МСК способствовала уменьшению степени фиброза и воспаления. Не удалось получить ожидаемого результата на модели артрита у мышей при системном или интрасуставном введении МСК. Отсутствие эффекта в последнем случае, возможно, было связано с высоким уровнем фактора некроза опухоли в данной модели экспериментального артрита, а фактор этот, как стало известно, нивелирует иммуносупрессивные эффекты МСК. Сейчас перед исследователями стоит задача исследовать более полно свойства МСК, определить наиболее оптимальный источник этих клеток, оптимальную «дозу» для трансплантации, найти способы эффективной очистки МСК от других клеточных популяций. Изучается также безопасность трансплантаций МСК. Несмотря на то, что аллогенные и ксеногенные пересадки МСК иммунокомпетентным мышам переносятся чаще всего хорошо без значимых побочных эффектов, все же известно, что МСК несут на себе небольшое количество антигенов HLA I класса, а, 78 следовательно, повторные инфузии эти клеток могут вызвать реакцию отторжения. Помимо этого, МСК культивируют в среде, содержащей сыворотку бычьей крови, и уже имеются данные об образовании антител к белкам бычьей сыворотки у некоторых больных с несовершенным остеогенезом, леченых МСК. Эту проблему можно решить, заменив сыворотку животных на лизат человеческих тромбоцитов, что уже и происходит в некоторых лабораториях. Наконец, вызванная МСК иммуносупрессия может спровоцировать рост опухолей, что и было продемонстрировано на модели меланомы у мышей. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Мезенхимальные клетки-предшественники • Отличительные черты клеток-предшественников и стволовых стволовая клетка при делении образует еще одну стволовую клетку и специализированную клетку. Клетка-предшественник уже частично специализирована и при делении образует две специализированные клетки. Иммуномодулирующий эффект мезенхимальных стволовых клеток: • подавляют размножение стимулированных Т-клеток • подавляют пролиферацию В-лимфоцитов и угнетают синтез антител, рецепторов хемокинов, осуществляемый активированными В-клетками • препятствуют дифференцировке моноцитов в незрелые дендритные клетки и созреванию незрелых дендритных клеток, угнетают экспрессию дендритными клетками костимуляторных молекул и цитокинов • влияют на функции естественных киллеров (снижение секреции интерферона , снижение пролиферации неактивных NK-клеток) 79 Список литературы Использованная литература: 1. Powledge T.M. The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ. 2004; 28: 44–50. Полимеразная цепная реакция. 2. Webber R.J., Rodriguez J.G., Webber D.S., Dunnebacke T.H. Development, characterization, and epitope mapping of a panel of twenty-four monoclonal antibodies specific for human inducible nitric oxide synthase. Hybridoma (Larchmt). 2005 Feb; 24(1): 6-13. 3. Donnelly J.J., Wahren B., Liu M.A. DNA vaccines: progress and challenges. J Immunol. 2005 Jul 15; 175(2): 633-9. 4. Souza A.P., Haut L., Reyes-Sandoval A., Pinto A.R. Recombinant viruses as vaccines against viral diseases. Braz J Med Biol Res. 2005 Apr; 38(4): 509-22. 5. Lal P., Ramachandran V.G., Goyal R., Sharma R. Edible vaccines: current status and future. Indian J Med Microbiol. 2007 Apr; 25(2): 93-102. 6. Johnston S.L. Biologic therapies: what and when? J Clin Pathol. 2007 Jan; 60(1): 8-17. 7. Deb K.D., Sarda K. Human embryonic stem cells: preclinical perspectives. J Transl Med. 2008;6:7. 8. Galic Z., Kitchen S.G., Kacena A., Subramanian A., Burke B., Cortado R., Zack J.A. T lineage differentiation from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 1;103(31):11742-7. 9. Fleming H.E., Scadden D.T. Embryonic stem cells make human T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(33): 12213-4. 10. García J.M., Español T., Gurbindo M.D., Casas C.C. Update on the treatment of primary immunodeficiencies. Allergol Immunopathol (Madr). 2007 Sep-Oct;35(5):184-92. 11. Dazzi F., van Laar J.M., Cope A., Tyndall A. Cell therapy for autoimmune diseases. Arthritis Res Ther. 2007;9(2):206. 12. Tyndall A., Walker U.A., Cope A., Dazzi F., De Bari C., Fibbe W. et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 31 October 2005. Arthritis Res Ther. 2007;9(1):301. 13. Trivedi P., Hematti P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp Hematol. 2008 Mar; 36(3): 350-9. Рекомендуемая литература: 1. Патологическая физиология. Учебник под ред. В.В.Новицкого, Е.Д.Гольдберга, О.И.Уразовой. Москва, «Гэотар-мед», 2009. 2. Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто с участием Т. Улрихса и А.Айхер. Наглядная иммунология. Москва, «Бином. Лаборатория знаний», 2007 80 Рабочая тетрадь и руководство к методическому пособию Цели изучения После изучения данного методического пособия, обучающийся: 1. Получит представление о принципах метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также о его применении в медицине и биологии. См. стр. 4-10 и рис. 1-2 методического пособия. ПЦР позволяет амплифицировать ДНК, иными словами получить огромное количество копий фрагментов ДНК, содержащихся в биоматериале порой в ничтожно малом количестве. При помощи ферментов, называемых полимеразами (в природе они принимают участие в синтезе молекул ДНК или РНК по соответствующей матрице во время репликации или транскрипции), удается копировать выбранный фрагмент ДНК – первоначально по матрице ДНК, присутствующей в образце (крови, биоптате, соскобах и т.д.), а в последующих циклах по матрице получаемых в предыдущих циклах фрагментов, так что количество фрагментов ДНК, необходимых для анализа, увеличивается в геометрической прогрессии. Наиболее распространено применение ПЦР для диагностики инфекций. Например, применение ПЦР позволяет диагностировать ВИЧинфекцию быстрее, чем стандартный ELISA-тест (основанный на определении антител) – уже в первые недели после заражения. Кроме того, ПЦР применяется для определения генетических вариаций и мутаций, определяющих проявления различных моногенных и комплексных заболеваний. В биологии и биотехнологии применяют ПЦР для секвенирования ДНК и клонирования генов, а также для выявления эволюционного родства среди организмов. В криминалистике – для 81 сравнения генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого; для установления отцовства. Контроль полученных знаний 1. В чем состоит суть метода ПЦР? 2. Какова сфера применения ПЦР в биологии и медицине? 3. Какие циклы включает ПЦР? 4. Что такое праймеры и для чего они необходимы? 5. Какие ДНК-полимеразы применяют в ПЦР? 6. Какой метод чаще всего применяют для визуализации результатов амплификации? 2. Изучит основные принципы получения и использования в медицине и биологии моноклональных антител. См. стр. 11-17 и рис. 3-4 методического пособия. Антитела, специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним В-клеточным клоном называются моноклональными. Для получения мышиных моноклональных антител, необходимо пройти 4 стадии: 1) иммунизацию, 2) гибридизацию иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекцию, 3) скрининг, 4) исследование свойств полученных антител и их описание. Моноклональные антитела могут применяться в различных целях. Как правило, цели эти – научно-исследовательские (например, эпитопное картирование антигена) или диагностические (диагностика инфекций, гистопатологическая диагностика аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей и т.д.). Применение их в комбинации с такими методами, как эпитопное картирование и молекулярное моделирование, делает возможным составление антигенного профиля и визуализацию макромолекулярной поверхности. 82 Контроль полученных знаний 1. Что такое моноклональные антитела и для чего их используют? 2. Что такое антигенные эпитопы и какие они бывают? 3. Какие этапы включает в себя процесс получения мышиных моноклональных антител? 4. Опишите, как происходит процесс иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител. 5. Опишите стадию гибридизации полученных В-клеток и селекции гибридом. 6. Что такое скрининг гибридом? 7. Как производится анализ полученных моноклональных антител? Что такое эпитопное картирование? 8. Какова суть метода поверхностного плазмонного резонанса? 3. Познакомится с принципом получения и использования в медицине и биологии химерных, гуманизированных и рекомбинантных антител. См. стр. 18-24 и рис. 5-6 методического пособия. В биотехнологии налажено получение различных видов моноклональных химерных антител. Это химерные антитела первого поколения – гибридные антитела с мышиным Fab- и человеческим Fcдоменом. Это и гиперхимерные антитела второго поколения, в которых используются лишь минимальные фрагменты мышиного антитела, определяющие его комплементарность к антигену, эти фрагменты как бы встроены в структуру человеческого антитела. Наконец, это – биспецифические гуманизированные антитела. Биспецифичные антитела получают из моноклональных антител, специфичных к совершенно разным антигенам. 83 Чаще всего рекомбинантные антитела применяются в качестве лабораторных реагентов, заменяющих обычные антитела, например, в проточной цитометрии или иммуногистохимическом и иммуноферментном анализах. Также рекомбинантные антитела могут применяться в терапевтических целях, например для лечения злокачественных новообразований или аутоиммунных заболеваний. Контроль полученных знаний 1. Для чего потребовалась «гуманизация» мышиных моноклональных антител? 2. Какие подходы к модификации мышиных моноклональных антител были предложены? 3. Что такое scFv-фрагмент антитела? 4. Опишите технологию получения рекомбинантных фаговых антител. 5. Для чего применяют фаговые антитела? 4. Познакомится с принципом получения и использования в медицине и биологии генных вакцин. См. стр. 24-44, рис. 7 и табл. 1 методического пособия. Генные вакцины представляют собой новый подход к иммунизации и иммунотерапии, использующий не живые или инактивированные микроорганизмы, и даже не их антигенные фрагменты (субъединицы), а гены – один или несколько, - кодирующие белки патогена. В отличие от большинства выработки традиционных антител, генные вакцин, вакцины нацеленных на стимулируют стимуляцию и клеточные цитотоксические реакции, и ответ с участием антител. К генным вакцинам относятся вакцины, использующие вирусные векторы, и ДНК-вакцины. Основу ДНК-вакцины составляют плазмиды, в структуру которых посредством генной инженерии вставлены гены, кодирующие антигены 84 микроорганизма. Суть технологии создания вирусных векторных вакцин можно описать следующим образом: в качестве вектора берут «проверенный» безопасный вирус (например, аденовирус) и вставляют в него гены, кодирующие антигенные белки других патогенных микроорганизмов. Контроль полученных знаний 1. Какие вакцины относятся к вакцинам первого, второго и третьего поколения? Какие достоинства и недостатки присущи каждому поколению вакцин? 2. Дайте определение понятию «генная вакцина». 3. Что представляет собой ДНК-вакцина? 4. Какие компоненты включает векторная плазмида ДНК-вакцины? 5. Зависит ли выбор иммуногена для ДНК-вакцины от типа иммунного ответа, который желательно получить и если зависит, то как? 6. Каковы предполагаемые механизмы действия ДНК-вакцин? Что такое кросс-прайминг? 7. Что такое ДНК-вакцины второго поколения? Почему возникла необходимость в разработке таких вакцин? Какими модификациями можно повысить эффективность ДНК-вакцин? 8. Что представляют собой вирусные рекомбинантные вакцины? Какие преимущества они имеют перед другими типами вакцин? 9. Какие типы вирусов можно использовать в качестве векторов для вирусных генных вакцин? 10.Охарактеризуйте достоинства и недостатки поксивирусов как векторов для генных вакцин. Каков принцип конструкции вектора на основе вируса коровьей оспы? 11.Каковы достоинства и недостатки аденовирусных векторов? Какие виды аденовирусных векторов вы знаете? Как конструируются 85 аденовирусные векторы? Какие потенциальное использование вакцин факторы ограничивают на аденовирусных основе векторов? 12.Опишите преимущества альфавирусных векторов. Каковы основные принципы создания вакцин на их основе? 13.Каковы достоинства и недостатки полиовирусных векторов? Какие виды полиовирусных векторов существуют и как их создают? 14.Дайте характеристику ВПГ-векторам. В чем заключается их основной недостаток? 15.Какие факторы необходимо учитывать при выборе вирусного вектора для генной вакцины? 5. Познакомится с принципом получения и использования в медицине и биологии растительных вакцин. См. стр. 45-50 и табл. 2 методического пособия. Суть создания растительной вакцины заключается в том, что с помощью генной инженерии изменяют свойства растений или вирусов растений так, что они начнут производить рекомбинантные белки, которые можно будет использовать в качестве вакцины от самых разнообразных болезней. Антигены, содержащиеся в трансгенных растениях, имеют возможность попасть в кишечник, не разрушаясь по дороге, т.к. наружная стенка клеток растений защищает их от воздействия желудочного сока. В кишечнике освобожденные из растительных клеток антигены захватываются М-клетками, а затем попадают в пейеровы бляшки и в регионарные лимфоузлы, где они могут быть представлены АПК. В результате индуцируется иммунный ответ – как локальный, так и системный. Помимо собственно вакцин, трансгенные растения могут применяться в медицине и в иных целях. Они могут служить 86 продуцентами моноклональных антител, цитокинов, интерферонов и других рекомбинантных белков, полезных при лечении инфекционных, онкологических и аутоиммунных болезней. Контроль полученных знаний 1. Что представляют собой растительные вакцины и каков механизм их действия? 2. Каким способом можно ввести гетерологичную ДНК в геном растения? 3. Приведите примеры трансгенных растений, использующихся в медицине. Укажите их достоинства и недостатки. 4. В каких целях могут применяться трансгенные растения? 6. Познакомится с использованием в медицине рекомбинантных лекарственных препаратов. См. стр. 51-55 методического пособия. Лекарственные препараты, применяемые в иммунологической лечебной практике и получаемые с помощью технологии рекомбинантной ДНК, можно разделить на три основные группы: 1) рекомбинантные вакцины – белковые (пептидные) или генные, 2) рекомбинатные антитела и слитые (химерные) белки, 3) рекомбинантные цитокины (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухоли и др.) и антагонисты рецепторов цитокинов. Контроль полученных знаний 1. Назовите основные группы рекомбинантных лекарственных препаратов, применяемых в иммунологической практике 2. Какие организмы могут служить продуцентами рекомбинантных белков? 3. Что такое слитые белки? 87 4. Каковы мишени рекомбинантных антител и слитых белков, применяющихся в терапевтической практике. Приведите примеры соответствующих препаратов. 5. Как получают и в каких целях применяют рекомбинантные интерфероны? В чем заключается технология пегелирования интерферонов? 6. Приведите примеры рекомбинантных интерлейкинов. В каких целях используются эти препараты? 7. Познакомится со способами получения и использованием в медицине стволовых клеток. См. стр. 56-79 и рис 8-16 методического пособия. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из эмбрионов, образовавшихся в результате экстракорпорального оплодотворения и используют в исследовательских целях. После того, как удается получить стабильную линию ЭСК эти клетки заставляют дифференцироваться в нужном направлении. Для этого существует несколько подходов, которые применяют изолированно или в комбинациях: 1. добавление в культуральную среду определенных ростовых факторов 2. совместное культивирование и трансплантация ЭСК с другими клетками, индуцирующими дифференцировку (часто это клетки мезенхимального происхождения) 3. имплантация ЭСК в органы животных 4. стимуляция экспрессии генов, действующих на ранних стадиях эмбриогенеза Были проведены успешные попытки получения из человеческих ЭСК популяции функциональных Т-клеток. 88 Более того, перед дифференцировкой, ЭСК были трансфецированы вирусным вектором, содержащим репортерный модифицированных клеток ген. Получившиеся тимоциты продолжали от таких экспрессировать данный ген. Это означает, что из человеческих ЭСК можно не только получать тимоциты, но и задавать им нужные свойства (например, устойчивость к ВИЧ) путем генноинженерных модификаций. Кроме того, в медицине при различных формах лейкозов, врожденных болезнях крови и аутоиммунных болезнях стали использоваться методы трансплантации кроветворных стволовых клеток (ТКСК). В медицине для лечения аутоиммунной патологии уже неоднократно предпринимались попытки элиминации лимфоцитов, индуцирующих или поддерживающих аутоиммунный процесс. В качестве терапевтической процедуры производится элиминация обоих типов лимфоцитов посредством полной иммуноабляции циклофосфамидом в комбинации с антитимоцитарным и антилимфоцитарным глобулинами с последующим проведением ТКСК. Такой подход способен привести к излечению или стойкой ремиссии тяжелой аутоиммунной патологии. Для пересадки используются также мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки которые, следуя по традиции называют мезенхимальными стволовыми клетками (МСК). Наиболее интересным с точки зрения практической медицины свойством МСК является их выраженная иммуномодулирующая активность. Гаплоидентичные МСК были с успехом применены для замедления реакции «трансплантат против хозяина». Было также продемонстрировано иммуносупрессивное действие МСК на модели экспериментального аллергического энцефаломиелита. Контроль полученных знаний 89 1. На какой стадии развития эмбриона производится забор ЭСК и какие эмбриональные клетки являются их источником? 2. Каким образом можно поддерживать недифференцированное состояние ЭСК? 3. По каким параметрам можно установить плюрипотентность ЭСК? 4. Как можно индуцировать дифференцировку ЭСК? 5. Какие сложности ограничивают потенциальное использование ЭСК в практической медицине? 6. Каким образом удалось получить Т-лимфоциты из человеческих ЭСК? Какие подходы применялись для получения клеток крови из ЭСК до вышеупомянутого эксперимента? 1. Каковы способы элиминации лимфоцитов при тяжелой аутоиммунной патологии? Опишите достоинства и недостатки метода ТКСК? Какие этапы включает в себя его проведение? 2. Применяется ли метод ТКСК для лечения иммунодефицитов? 3. Опишите функции регуляторных (CD4+CD25+) Т-лимфоцитов. Как влияет ТКСК на численность этих клеток в организме? 4. Как вы понимаете термин «мезенхимальная стволовая клетка»? 5. Перечислите основные свойства МСК. 6. В каких тканях обнаруживается присутствие МСК? 7. В чем заключается иммуномодулирующее действие МСК? 8. Какие факторы определяют безопасность трансплантации МСК? 90 КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ Выберите правильный вариант ответа: 1. В чем состоит суть метода ПЦР? 1. Удлинение цепей ДНК с помощью полимераз 2. Амплификация ДНК с помощью полимераз 3. Фрагментация цепей ДНК с помощью полимераз 4. Дефрагментация цепей ДНК с помощью полимераз 5. Амплификация ДНК с помощью транскриптаз 2. Какие антитела называют моноклональными? 1. Специфичные к разным эпитопам и продуцируемые одним клоном плазматических клеток 2. Специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним клоном плазматических клеток 3. Специфичные к одному эпитопу и продуцируемые разными клонами плазматических клеток 4. Специфичные к разным эпитопам и продуцируемые разными клонами плазматических клеток 5. Вырабатываемые к суперантигенам и продуцируемые одним клоном плазматических клеток 3. Какие антитела нывают химерными? 1. Состоящие из фрагментов антител мыши (Fab) и человека (Fc) 2. Состоящие из синтетического фрагмента (Fab) и фрагмента антитела человека (Fc) 3. Состоящие из фрагментов антител мыши (Fс) и человека (Fаb) 4. Состоящие из синтетического фрагмента (Fc) и фрагмента антитела человека (Fab) 91 5. Состоящие из фрагментов антител пекинской утки (Fс) и человека (Fаb) 4. Чем действие генной вакцины отличается от действия традиционной вакцины? 1. Возможностью стимуляции неспецифического иммунного ответа 2. Возможностью стимуляции специфического гуморального иммунного ответа 3. Возможностью стимуляции специфического клеточного иммунного ответа 4. Невозможностью стимуляции гуморального иммунного ответа 5. Невозможностью стимуляции клеточного иммунного ответа 5. Что такое растительная вакцина? 1. Вакцины, получаемые при введении животным антигенов растений 2. Рекомбинантные белки, произведенные трансгенными растениями 3. Вакцины, получаемые при введении растениям антигенов человека 4. Рекомбинантные белки, произведенные полигенными растениями 5. Рекомбинантные белки, произведенные гетерогенными растениями 6. Как получают рекомбинантный интерферон-α? 1. Включением гена интерферона в геном дрожжей 2. Включением гена интерферона в геном мыши 92 3. Включением гена интерферона в геном растения 4. Включением гена интерферона в геном E.coli 5. Включением гена интерферона в геном морской свинки 7. Чем достигается дифференцировка эмбриональных стволовых клеток? 1. Добавлением в культуру стволовых клеток ростовых факторов 2. Воздействием векторов на культуру стволовых клеток 3. Добавлением в культуру стволовых клеток хемокинов 4. Добавлением в культуру стволовых клеток антигенов 5. Воздействием антител на культуру стволовых клеток 8. Особенности гиперхимерных антител второго поколения? 1. Содержат минимальные фрагменты антител человека 2. Не содержат фрагментов мышиных антител 3. Не содержат фрагментов антител человека 4. Содержат максимальные фрагменты мышиных антител 5. Содержат минимальные фрагменты мышиных антител 9. Чем действие вирусной вакцины отличается от действия традиционной вакцины? 1. Возможностью стимуляции неспецифического иммунного ответа 2. Возможностью стимуляции специфического гуморального иммунного ответа 3. Возможностью стимуляции специфического клеточного иммунного ответа 4. Невозможностью стимуляции гуморального иммунного ответа 93 5. Невозможностью стимуляции клеточного иммунного ответа 10. Из чего получают биспецифичные антитела? 1. Моноклональных антител, специфичных к разным антигенам 2. Поликлональных антител, специфичных к разным антигенам 3. Моноклональных антител, специфичных к одному антигену 4. Поликлональных антител, специфичных к одному антигену 5. Поликлональных антител, специфичных к двум антигенам 94 ОТВЕТЫ: 1–2 2–2 3–1 4–3 5–2 6–4 7–1 8–5 9–5 10 – 1 95