Ключевым явлением в биоэнергетике клетки

Ключевым явлением в биоэнергетике клетки является синтез
аденозинтрифосфата (АТФ). Создание АТФ требует наличия градиента
электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, его
синтезирующих. Данный градиент создается посредством контролируемых
ферментами окислительно-восстановительных или фотохимических
реакций. Простейшим и наиболее изученным белком, преобразующим
энергию света в электрохимический потенциал, является бактериородопсин
(БР). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая
свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное (ВК) пространство.
БР, благодаря доступности в сравнительно больших количествах, простоте
очистки и стабильности, в течение последних 30 лет остается одним из самых
интенсивно изучаемых мембранных белков.
Для понимания молекулярного механизма работы БР необходимо знать
структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, которые
сопровождают фотоцикл белка и приводят к направленному транспорту
протона. Наиболее эффективным подходом к решению данной задачи в
настоящее время является получение атомарных структур функциональных
состояний рабочего цикла БР с помощью рентгеновской кристаллографии
высокого разрешения. Использование данного метода требует наличия
высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и
эффективных методов фиксирования промежуточных состояний с другой.
Кристаллы могут быть получены при использовании метода кристаллизации
in meso, заключающегося в использовании липидной биконтинуальной
мезофазы для кристаллизации мембранных белков1. Кристаллизация in meso
остается в настоящее время недостаточно изученным методом, что
существенно ограничивает его потенциальную применимость для
мембранных белков. Несмотря на это, in meso подход уже позволил получить
структуру основного и некоторых промежуточных состояний БР. Однако,
опубликованные структуры промежуточных состояний, полученные
разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым
заключениям относительно механизмов переноса протона 2–7. Причины этого
в настоящее время остаются до конца невыясненными. Предположительно,
отсутствие согласованности может быть связано с низким качеством
дифракционных данных, вызванным моноэдрическим двойникованием
кристаллов, радиационным повреждением кристаллов и возникновением
новых состояний белка под действием рентгеновских квантов.
Автором
предлагаемой
здесь
работы
последовательно
рассматриваются упомянутые причины, приводящих к возникновению
противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных
состояний БР, проводятся необходимые эксперименты и обработка
результатов. Как результат, автор предлагает пути решения данных проблем.
Основные результаты работы опубликованы в серии из трех статей с первым
авторством претендента на премию, каждая из которых посвящена одной из
упомянутых проблем5,7,8, и в главе в книге9. Второстепенные для данного
исследования результаты и подходы опубликованы в еще трех статьях10–12.
Исследуя проблему моноэдрического двойникования кристаллов БР,
автор впервые находит кристаллизационные условия, при которых фактор
двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем
визуального изучения. Это позволяет значительно упростить процедуру
поиска недвойниковых кристаллов. В дополнении к этому, обрабатывая
кристаллографические данные с более 300 кристаллов, автор демонстрирует,
что подбирая условия кристаллизации, способствующие медленному росту
кристаллов, возможно существенно увеличить процент слабодвойниковых
кристаллов. Используя эти результаты автор предлагает эффективную
процедуру выращивания и отбора слабодвойниковых кристаллов БР
необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных
данных функциональных состояний БР5,9.
Далее автор первые систематически исследует проблему
специфического повреждения БР рентгеновскими квантами при 100К8. В
результате продемонстрировано, что специфическое радиационное
разрушение, происходящее преимущественно в активном центре молекулы,
может приводить к артефактам при анализе структур переходных состояний
белка, а также впервые получена количественная зависимость доли белка с
разрушенным активным центром от дозы радиации, поглощенной
кристаллом белка. В данных расчетах была впервые использована методика
оценки дозы, поглощенной белковым кристаллом, основанная на увеличении
его В-фактора при радиационном повреждении кристалла. Обладая данной
информацией, возможно планировать кристаллографический эксперимент
таким образом, чтобы доля поврежденных белковых молекул в кристалле
была существенно меньше количества переходного состояния белка и не
приводила к возникновению артефактов при получении структур
переходных состояний.
Далее автор обращает внимание на то, что воздействие на кристаллы
БР небольшими дозами рентгеновского излучения (<10 Гр) при 100К
приводит к изменениям его спектра поглощения в видимом диапазоне и
образованию, так называемой, оранжевой формы белка. Эта доза примерно
на порядок меньше дозы необходимой для сбора дифракционных данных, и
потому структурные изменения, сопровождающие образование оранжевой
формы, оставались до сих пор невыясненными. Автор предлагает методику
снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль
кристалла БР, что впервые делает возможным установить структуру
оранжевой формы БР, образующейся при поглощении белком сверхмалых
доз рентгеновского излучения. При этом кристалл поглощает около 0.04МГр
при сборе одного набора данных, что на один-два порядка ниже, чем доза
рентгеновского облучения, которую поглощали кристаллы БР при сборе
рентгеноструктурных данных, опубликованных в литературе. Структурные
изменения при образовании оранжевой формы белка затрагивают активный
центр белка и их необходимо учитывать при анализе структурных изменений
рабочего цикла БР.
Таким образом в ходе работы были исследованы основные
противоречия в области рентгеноструктурного анализа функциональных
состояний БР и показаны пути решения основных проблем. Разработанные
подходы позволяют получить достоверные структуры основного и
переходных состояний, что имеет важное фундаментальное значение,
поскольку позволяет установить атомарные детали одного из наиболее
общих процессов в жизни клетки – создание электрохимического потенциала
на мембране. Кроме этого, решение конкретных подзадач работы имеет
собственное практическое значение. Так работа представляет интерес для
белковой кристаллографии в целом. Подходы к решению проблемы
двойникования могут быть использованы для устранения данного дефекта
других белковых кристаллов. Результаты исследования радиационного
повреждения активного центра БР могут быть использованы при
интерпретации рентгеноструктурных данных кристаллов других белков.
Методика оценки дозы, поглощенной кристаллом БР, основанная на
увеличении В-фактора кристалла, может быть использована, когда размер
кристалла белка больше или сравним с размером измерительного пучка.
В завершении следует сказать, что на сегодняшний день данная работа
уже позволила автору получить непротиворечивые данные основного и ряда
переходных состояний БР, публикация которых последует в ближайшем
будущем.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin.
Struct. Biol. 21, 559–66 (2011).
Wickstrand, C., Dods, R., Royant, A. & Neutze, R. Bacteriorhodopsin: Would the real structural
intermediates please stand up? Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 1850, 536–553 (2015).
Lanyi, J. K. What is the real crystallographic structure of the L photointermediate of bacteriorhodopsin?
Biochim. Biophys. Acta 1658, 14–22 (2004).
Hirai, T., Subramaniam, S. & Lanyi, J. K. Structural snapshots of conformational changes in a sevenhelix membrane protein: lessons from bacteriorhodopsin. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 433–9 (2009).
Borshchevskiy, V., Efremov, R., Moiseeva, E., Büldt, G. & Gordeliy, V. Overcoming merohedral
twinning in crystals of bacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase. Acta Crystallogr. D. Biol.
Crystallogr. 66, 26–32 (2010).
Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G. & Gordeliy, V. I. X-ray-radiation-induced
changes in bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 409, 813–25 (2011).
Borshchevskiy, V., Round, E., Erofeev, I., Weik, M., Ishchenko, A., Gushchin, I., Mishin, A., Willbold,
D., Büldt, G. & Gordeliy, V. Low-dose X-ray radiation induces structural alterations in proteins. Acta
Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 70, 2675–2685 (2014).
Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G. & Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced
Changes in Bacteriorhodopsin Structure. J. Mol. Biol. 409, 813–25 (2011).
Borshchevskiy, V. & Gordeliy, V. in Mod. Asp. Bulk Cryst. Thin Film Prep. (eds. Kolesnikov, N. &
Borisenko, E.) 477–496 (2012).
Borshchevskiy, V., Moiseeva, E., Kuklin, A., Büldt, G., Hato, M. & Gordeliy, V. Isoprenoid-chained
lipid β-XylOC16+4—A novel molecule for in meso membrane protein crystallization. J. Cryst. Growth
312, 3326–3330 (2010).
Polovinkin, V., Gushchin, I., Sintsov, M., Round, E., Balandin, T., Chervakov, P., Schevchenko, V.,
Utrobin, P., Popov, A., Borshchevskiy, V., Mishin, A., Kuklin, A., Willbold, D., Chupin, V., Popot, J.-L.
& Gordeliy, V. High-resolution structure of a membrane protein transferred from amphipol to a lipidic
mesophase. J. Membr. Biol. 247, 997–1004 (2014).
Shevchenko, V., Gushchin, I., Polovinkin, V., Round, E., Borshchevskiy, V., Utrobin, P., Popov, A.,
Balandin, T., Büldt, G. & Gordeliy, V. Crystal Structure of Escherichia coli-Expressed Haloarcula
marismortui Bacteriorhodopsin I in the Trimeric Form. PLoS One 9, e112873 (2014).