выводы - Институт цитологии и генетики СО РАН
реклама
На правах рукописи Алямкина Екатерина Анатольевна ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТИРОВАННОЙ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК НА РОСТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШИ И АКТИВАЦИЮ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук Богачев Сергей Станиславович Официальные оппоненты: Таранин Александр Владимирович доктор биологических наук, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск Маркель Аркадий Львович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск. Защита диссертации состоится «__»___________2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090 тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); факс: (383) 333-12-78; e-mail: [email protected]. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан «__»___________2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова 2 ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Онкологические заболевания занимают третью строку в списке заболеваний человека, имеющих неблагоприятный прогноз. Стандартный подход к лечению рака представляет собой физическое удаление опухолевой массы и многократные курсы циторедуцирующей терапии. При этом часто остаточные опухолевые клетки рассредоточиваются по организму и формируют новые очаги опухолевой ткани. Одной из основных характеристик опухоли является ее способность подавлять активность иммунной системы, и тем самым создавать условия для беспрепятственного распространения по организму. В этой связи перспективным в борьбе с раком на разных этапах его развития является возможность активировать противоопухолевый иммунитет. Важнейшим направлением в современной клинической практике лечения онкологических заболеваний является постредукционная иммунотерапия опухолей, связанная с активацией противоракового иммунитета. Существует два основных подхода к индукции противораковой активности иммунной системы: 1) in vivo адьювантная терапия с использованием пептидов, содержащих известные раковые антигены; 2) ex vivo активация профессиональных свойств антигенпрезентирующих дендритных клеток (ДК) с одновременным введением ракового антигена и последующей реинфузией пульсированных дендритных клеток в организм онкологического больного. Оба подхода связаны с активацией дендритных клеток и либо с индукцией иммунного ответа непосредственно в организме больного, либо с получением высокоспецифических дендритноклеточных вакцин. В современной мировой практике описано несколько препаратов, стимулирующих дендритные клетки и влияющих на формирование противоракового адаптивного иммунитета. К хорошо известным препаратам относятся липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий (Cowdery et al., 1996; Hartmann, Krieg, 1999) и препараты ДНК на основе CpG-олигонуклеотидов (Hartmann, Krieg, 1999; Krieg et al., 1995; Pulendran, 2005). В последнее время установлено, что двуцепочечная ДНК (дцДНК) также приводит к созреванию дендритных клеток и индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет (Barber, 2011; Kawai, Akira, 2011). При этом охарактеризованы сигнальные пути, запускающие иммунный ответ клетки на появление в цитоплазме фрагментов дцДНК (Barber, 2011; Vilaysane, Muruve, 2009). Настоящая работа посвящена исследованию противоракового действия препарата на основе дцДНК человека в сочетании с химиотерапевтическими цитостатическими препаратами на мышиные опухоли и его влияния на антигенпрезентирующие дендритные клетки. Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение роли фрагментированной экзогенной двуцепочечной ДНК в индукции 3 противоракового иммунитета в экспериментальных условиях. Основными задачами, которые необходимо было решить в рамках настоящего исследования, были следующие: 1) Определить влияние препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в сочетании с кросслинкирующим цитостатическим препаратом циклофосфаном на рост экспериментальных опухолей мыши и на иммунную систему экспериментальных животных, в частности, на дендритные клетки. 2) Исследовать влияние препарата фрагментированной ДНК человека на активацию антигенпрезентирующих свойств дендритных клеток на примере экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток человека. 3) Подобрать условия использования препарата геномной ДНК человека в сочетании с клиническими цитостатическими препаратами доксорубицином и циклофосфаном, оптимальные для проведения успешной противораковой терапии экспериментальных опухолей. Научная новизна. 1) Впервые установлено, что обработка мышей с привитыми опухолями цитостатиком циклофосфаном в сочетании с препаратом фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека размером 200-6000 п.о. приводит к достоверному торможению роста экспериментальных опухолей мыши. При этом совместное введение цитостатиков доксорубицина и циклофосфана в сочетании с препаратом ДНК подавляет рост сформированной опухоли достигшей размера более 1 см3, а в случаях недавно перевитых опухолевых клеток в количестве до 300 тыс. полностью прекращает рост опухолевого графта. Обнаружено, что развивающийся противораковый эффект сопровождается увеличением содержания во фракции мононуклеаров периферической крови экспериментальных животных цитотоксических клеток, обладающих специфической активностью против клеток опухоли-графта. 2) Добавление фрагментов двуцепочечной ДНК человека в культуру экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток приводит к активации их профессиональных свойств. При этом происходит конечное созревание дендритных клеток, индуцируется продукция ими цитокинов Th1 пути, увеличивается аллостимуляторная активность дендритных клеток, приводящая к пролиферации Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов. Положения, выносимые на защиту. 1) Инъекции экзогенной двуцепочечной ДНК человека на фоне инъекций цитостатиков циклофосфана и доксорубицина приводят к достоверному усилению регрессирующего действия цитостатиков на рост экспериментальных опухолей мыши. 2) Вакцинация мышей зрелыми дендритными клетками, стимулированными к созреванию препаратом фрагментированной ДНК человека, приводит к достоверному торможению роста прививаемого опухолевого трансплантата. 4 3) Препарат фрагментированной геномной ДНК человека индуцирует усиление аллостимуляторной активности культуры дендритных клеток человека, что приводит к увеличению доли цитотоксических перфорин-содержащих Тлимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов. Практическая значимость. Результаты проведенных исследований явились базой для разработки стратегии лечения рака молочной железы и ее применения в исследованиях второй фазы клинических испытаний препарата на основе двуцепочечной ДНК человека («Панаген»), основанных на совместном применении программной полихимиотерапии по схемам FAC (циклофосфан+доксорубицин+фторурацил) и AC (циклофосфан+доксорубицин). Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск), международной конференции Annual Main Meeting of Society for experimental Biology (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания), международной конференции 7th European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13-17 сентября 2011 года, Дублин, Ирландия). Публикации. Всего - 24, по теме диссертации - 10, из них 5 статей в рецензируемых зарубежных журналах, 5 тезисов на российских и международных конференциях. Вклад автора. Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. Николина В.П. и к.б.н. Поповой Н.А. (ИЦиГ СО РАН). Работы с дендритными клетками человека проводились при участии д.м.н. Леплиной О.Ю. и к.м.н. Сахно Л.В. (НИИКИ СО РАМН), с дендритными клетками мыши – Ефремова Я.Р. (ИЦиГ СО РАН) и Решетниковой Е.С. (ИМКБ СО РАН). Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 31 рисунок и 8 таблиц. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение препарата ДНК: препарат ДНК человека получали из плацент здоровых рожениц безфенольным методом согласно промышленному регламенту производства препарата «Панаген» (регистрационное свидетельство ЛСР №004429/08 от 09.06.2008). Экспериментальные животные: в работе использовали мышей линии CBA/Lac. Опухоль прививалась животным в заднюю правую лапу внутримышечно. Животные контрольной группы вместо инъекций препаратов получали инъекции физ. раствора. Получение дендритных клеток мыши: дендритные клетки мыши получали из мононуклеарной фракции клеток костного мозга по стандартным протоколам (Lutz et al., 1999; Ахматова, 2007) с добавлением полилизата клеток опухоли, используя в качестве дозревающих стимулов препарат ДНК человека или ФНОα. Вакцинация мышей дендритными клетками: вакцинация животных проводилась трижды с интервалом в две недели по 500 тыс. клеток, подкожно в области спины. Опухоль прививалась животным за неделю до последней вакцинации. Генерация дендритных клеток человека: дендритные клетки человека генерировали по стандартным интерлейкиновому или интерфероновому протоколам из гепаринизированной венозной крови (Della Bella et al., 2004; Thurner et al., 1999), индуцируя к созреванию либо препаратом ДНК, либо ЛПС. Оценка функционального состояния дендритных клеток человека: аллостимуляторную активность дендритных клеток человека оценивали по реакции в СКЛ по включению 3H-тимидина, используя в качестве отвечающих клеток МНК здоровых доноров (Сахно и др., 2007; Сахно и др., 2008). Анализ продукции цитокинов дендритными клетками человека проводили с использованием стандартного планшета 17-plex согласно инструкциям, предложенным фирмой-производителем (Bio-Plex Pro™ Human Th17 Cytokine Assays, Bio-Rad, США). Анализ содержания CD8+/перфорин+ Т-клеток в периферической крови человека проводили с использованием меченых антител согласно протоколам, предложенным фирмой-производителем (BD Bioscience, США). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ противораковой активности препарата ДНК при его использовании в сочетании с цитостатиком ЦФ В современной мировой клинической практике и в многолетних научных исследованиях наиболее изученными и эффективными индукторами противораковой активности иммунной системы организма являются ЛПС и иммуногенная CpG-ДНК. ЛПС обладает активирующим действием на макрофаги, стимулируя их к синтезу и секреции ФНОα и ИФН-γ (Cowdery et al., 6 1996), CpG-содержащая ДНК обладает способностью активировать иммунокомпетентные Т-лимфоциты, натуральные киллеры, макрофаги и ДК. Это свойство CpG-ДНК активно исследуется с целью применения в терапии онкологических заболеваний (Олишевский и др., 2006; Ishii, Akira, 2006; Krieg, 2007; Medzhitov, 2007; Ракофф-Наум, Меджитов, 2008). В последние годы все больше внимания уделяется изучению эффекта активации антигенпрезентирующих клеток, в том числе и ДК, дцДНК (Takaoka, Taniguchi, 2008; Ishii et al., 2001; Kis-Toth et al., 2011; Vilaysane, Muruve, 2009). Имеются многочисленные экспериментальные данные, позволяющие полагать, что фрагментированная дцДНК способна взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками и оказывать влияние на процессы их дифференцировки и созревания (Decker et al., 2005; Yasuda et al., 2005; Ishii, Akira, 2006; Martin, Elkon, 2006; Rönnefarth et al., 2006; Ishii et al., 2001). Описано также синергичное противоопухолевое действие охарактеризованного активатора ДК CpG-ДНК и цитостатика ЦФ (Krieg et al., 1995; Weigel et al., 2003). В лаборатории молекулярной биологии клетки ФГБУН ИЦиГ СО РАН был обнаружен эффект противораковой активности препарата дцДНК человека, который также значительно усиливался при синергичном действии с цитостатиком циклофосфаном. Как показано в настоящем исследовании, описанный феномен связан с активацией ДК препаратом дцДНК с последующей индукцией противоракового иммунитета. На начальных этапах настоящей работы был охарактеризован используемый препарат ДНК. Он представляет собой геномную ДНК человека, полученную из плацент здоровых рожениц безфенольным методом фрагментированную до размеров 200-6000 п.о. Анализ препарата различными методами показал, что он не содержит полисахаридов и гистоновых белков. Также было показано, что гидролиз препарата ДНК человека ДНКазой приводит к потере его противораковой активности, что подтверждает факт того, что активную фракцию субстанции препарата ДНК составляют линейные фрагменты дцДНК (данные не приведены). Далее была проведена серия экспериментов по оптимизации условий совместного использования препарата ДНК и цитостатика ЦФ для воздейтсвия на мышиные опухоли. Было показано, что наиболее сильное действие, тормозящее развитие экспериментальных опухолей мыши, обнаруживалось при предварительных инъекциях цитостатика ЦФ и препарата ДНК до прививки опухоли (схема 1) (различные схемы инъекций препаратов и динамика роста опухолей у животных представлены на Рис. 1). 7 Рис. 1. Динамика роста опухоли Кребс-2 при различных схемах обработки мышей ЦФ и препаратом ДНК до или после прививки опухоли (отражена стандартная ошибка, n=10, p<0,001). Снизу приведены схемы соответствующих инъекций (ЦФ – циклофосфан; в/б – внутрибрюшинно; п/к – подкожно). Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора. Наши дальнейшие исследования показали, что противораковая активность препарата ДНК человека заметно усиливалась при его введении в сочетании с цитостатиком ЦФ с последующей иммунизацией экспериментальных животных гомогенатом клеток опухоли (Рис. 2). Эффект торможения роста опухоли при обработке ЦФ, ДНК и иммунизации составил в среднем 84% по сравнению с контрольной группой животных, которые получали инъекции физ. раствора (p<0,001). При иммунизации животных без предварительной обработки препаратом ДНК средняя эффективность торможения роста опухоли составила 67% относительно контроля. 8 Рис. 2. Динамика роста опухоли Кребс-2 при обработке групп мышей ЦФ и препаратом ДНК с последующей иммунизацией гомогенатом опухоли графта (отражена стандартная ошибка, n=6). Снизу приведена схема инъекций: мыши группы «иммунизация» были иммунизированы только гомогенатом клеток опухоли; «ЦФ+иммунизация» – иммунизированы после инъекции ЦФ; «ЦФ+ДНКчеловека+иммунизация» – иммунизированы после инъекций ЦФ и препарата ДНК, согласно схеме (ЦФ – циклофосфан; в/б – внутрибрюшинно; п/к – подкожно; инакт. кл. – гомогенат клеток опухоли Кребс-2). Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора. По совокупности результатов, полученных при анализе противораковой активности препарата ДНК была регламентирована следующая схема введения ЦФ и препарата ДНК, принятая как оптимальная для подавления роста опухоли: инъекции препарата ДНК в дозе 200 мкг/мышь через 30 мин, 48, 72 и 96 часов после введения цитостатика ЦФ в дозе 200 мг/кг. Активация дендритных клеток мыши in vitro препаратом фрагментированной экзогенной ДНК Было сделано предположение, что, аналогично действию CpG-ДНК (Heckelsmiller et al., 2002; Zwaveling et al., 2002), противораковая активность препарата ДНК с большой долей вероятности связана с активацией ДК. ДК, пульсированные раковыми антигенами, в свою очередь, индуцируют 9 противораковый иммунитет, а именно стимулируют пролиферацию CD8+ Тцитотоксических лимфоцитов. Для проверки сделанного предположения была проведена оценка влияния препарата ДНК на культуру экстракорпорально сгенерированных ДК мыши. Предшественниками культуры ДК служила мононуклеарная фракция клеток костного мозга мыши. На шестой день генерации в культуру ДК добавляли препарат ДНК (25 мкг/мл) в качестве индуктора созревания ДК. Группой сравнения служила культура ДК, индуцированная к созреванию стандартным индуктором созревания ФНОα (20 нг/мл) (Lutz et al., 1999; Ахматова, 2007). Одновременно с этим клетки нагружали гомогенатом клеток опухоли (100 мкл/млн. ДК). Контрольными группами служили ДК, созревшие без добавления индуктора созревания и опухолевого лизата («ДК (0)»), и ДК, получившие только лизат клеток опухоли («ДК (Лиз)»). Полученные зрелые ДК были использованы для вакцинации животных. Вакцинация проводилась трижды с интервалом в две недели по 500 тыс. клеток, подкожно, в области спины. Рис. 3. Динамика появления опухоли Эрлиха в группах мышей, вакцинированных дендритными клетками, созревшими в присутствии препарата ДНК человека или ФНОα («ДК+ДНК», «ДК+ФНО») или без дозревающих стимулов («ДК(0)» и «ДКлизат»); мыши контрольной группы получали инъекции физ. раствора (n=6). Результаты вакцинации мышей с последующей прививкой опухоли Эрлиха продемонстрировали значительное торможение прогрессии опухоли в группах мышей, вакцинированных ДК, получавшими в качестве дозревающего стимула препарат ДНК или ФНОα (Рис. 3). Это означает, что препарат 10 фрагментированной дцДНК человека может быть использован в качестве дозревающего стимула при активации профессиональных свойств ДК с эффективностью, не уступающей стандартному дозревающему стимулу (например, ФНОα). Исходя из полученных результатов было сделано предположение о том, что эффект торможения роста перевиваемых опухолей обусловлен участием иммунокомпетентных ДК, презентирующих опухолевый антиген. Характеристика влияния препарата дцДНК человека на активацию антигенпрезентирующих свойств экстракорпорально сгенерированных ДК человека Для оценки эффективности воздействия препарата экзогенной ДНК человека на активацию профессиональных свойств ДК человека были проведены комплексные исследования с использованием в качестве отвечающей культуры экстракорпорально сгенерированных ДК человека. Была проведена оценка влияния препарата геномной ДНК человека на функциональную аллостимуляторную активность ДК, которую оценивали на ДК здоровых доноров, индивидуально для каждого донора, поскольку в каждом отдельном случае ДК, генерированные по интерфероновому протоколу, могли различаться по соотношению незрелых/полузрелых и зрелых клеток в общей популяции (Рис. 4). Конечное созревание ДК стимулировали либо ЛПС (10 мкг/мл), либо ДНК в различных дозах (1, 5, 25 и 50 мкг/мл). Эффективность действия дозревающих стимулов оценивали по индексу влияния (ИВ), который представлял собой отношение ответа в СКЛ при стимуляции ДК, генерированными с дозревающим стимулом, к ответу в СКЛ при стимуляции ДК, генерированными без дозревающего стимула. Линией 1,2 отмечена принятая пороговая величина ИВ, свидетельствующая о позитивном эффекте ДК в СКЛ (ИВ=1,2 расч.ед.). 11 Рис. 4. Аллостимуляторная активность дендритных клеток здоровых доноров (№1-11) в СКЛ. Данные представлены в виде индексов влияния (ИВ), которые представляли собой отношение ответа в СКЛ при стимуляции ДК, генерированными с дозревающим стимулом (препарат ДНК или ЛПС), к ответу в СКЛ при стимуляции ДК, генерированными без дозревающего стимула. Линией ИВ=1,2 отмечена пороговая величина ИВ, свидетельствующая о позитивном эффекте ДК в СКЛ. (А) – сравнение различных доз препарата ДНК (доноры №1-8), (Б) – сравнение различных доз препарата ДНК с действием стандартного индуктора ЛПС (доноры №9-11). СКЛ – смешанная культура лимфоцитов (мононуклеарные клетки здорового донора) в качестве отвечающей культуры. Как следует из результатов проведенных экспериментов, препарат ДНК человека приводит к индукции аллостимуляторной активности ДК человека, что проявляется в индукции пролиферативной активности в СКЛ. Эффект усиления аллостимуляторной активности ДК у разных доноров достигается при использовании разных доз препарата ДНК, максимальная эффективность у здоровых доноров достигается при использовании доз 5 и 25 мкг/мл. 12 Далее с использованием стандартного планшета 17-plex была проведена оценка продукции цитокинов ДК человека при воздействии фрагментированной дцДНК человека в сравнении с ЛПС. Для анализа были использованы ДК, сгенерированные по протоколу с использованием ИЛ-4 (ИЛ-ДК) (n=12). Оказалось, что ДК, активированные ДНК, достоверно стимулируют продукцию провоспалительного цитокина ИФН-γ и хемокина MIP-1β дендритными клетками человека (Рис. 5). При общем анализе полученных результатов можно заключить, что интерлейкиновые ДК при индукции как ДНК, так и ЛПС в значительной степени продуцируют практически один и тот же набор цитокинов – ИФН-γ, ФНОα, MIP-1β, ИЛ-8, MCP-1. Рис. 5. Продукция цитокинов экстракорпорально сгенерированными по интерлейкиновому протоколу дендритными клетками человека («ИЛ-ДК») в сравнении с ЛПС по совокупности результатов всех доноров (n=12). * – указаны достоверные различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, p<0,05. «0» – ДК, не стимулированные к созреванию, «ЛПС» и «ДНК» – ДК, стимулированные к созреванию ЛПС и ДНК человека, соответственно. 13 Проведенный анализ предполагает, что дцДНК человека индуцирует продукцию ДК человека цитокинов, направляющих развитие Th1-клеточного иммунного ответа. Для прямой оценки способности интактных и ДНК-обработанных ДК стимулировать генерацию цитотоксических CD8+/перфорин+ Т-клеток, ДК, сгенерированные в присутствии либо препарата фрагментированной ДНК человека (5 мкг/мл), либо ЛПС (10 мкг/мл), либо в отсутствии дозревающего стимула (0), культивировали с фракцией свежевыделенных аллогенных МНК здорового донора, т.е. использовали в качестве стимуляторов в СКЛ (Рис. 6). Рис. 6. Процентное содержание CD8+/перфорин+ Т-клеток в интактных МНК (Контроль) и после инкубации с ДК, созревшими в присутствии ЛПС (ДК (ЛПС)), ДНК (ДК (ДНК)) или в отсутствии дозревающего стимула (ДК (0)). * – достоверность различий показателей по сравнению с контролем (pu<0,05, u – критерий ВилкоксонаМанна-Уитни); # – достоверность различий по отношению к ДКИНТ (pw<0,05, w – критерий Вилкоксона для парных выборок, n=11). МНК – мононуклеарные клетки. Установлено, что использование препарата ДНК человека в качестве дозревающего стимула при созревании ИФН-ДК человека приводит к увеличению доли цитотоксических лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточно перфорин, в популяции СКЛ по сравнению с ДК, созревавшими или без дозревающего стимула, или и в присутствии стандартного дозревающего стимула ЛПС. Проведенные исследования свидетельствовали о высоком уровне стимулирующего действия, оказываемого препаратом дцДНК на ДК человека, сгенерированные ex vivo, приводящего к проявлению ими аллостимуляторной активности в СКЛ, индукции продукции цитокинов Th1 пути (ИФН-γ, ФНОα) и хемокинов (MIP-1β, ИЛ-8, MCP-1) и пролиферации перфорин-содержащих Т- 14 цитотоксических лимфоцитов. Все обнаруженные свойства являются показателями того, что препарат ДНК человека эффективно индуцирует ДК человека к проявлению ими специфических антигенпрезентирующих свойств in vitro. Активация специфических свойств антигенпрезентирующих клеток препаратом ДНК может приводить к индукции адаптивного иммунного ответа, в том числе противоракового. Следовательно, препарат ДНК человека можно использовать в качестве индуктора иммунного ответа, в частности при онкологических заболеваниях. Подбор условий эффективного лечения экспериментальных опухолей мыши с использованием сочетания препаратов ЦФ, ДР и фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК Известно, что обработка опытного животного с перевитой опухолью цитостатиком доксорубицином (ДР) приводит к образованию иммунногенного дебриса раковых клеток (Obeid et al., 2007a; Obeid et al., 2007b). Также известно синергичное противораковое действие ЦФ и препарата ДНК на основе CpGолигонуклеотидов (Weigel et al., 2003), при котором раковая клетка также разрушается. Мы предположили, что сочетание действия ДР и ЦФ и одновременная стимуляция созревания ДК препаратом ДНК позволит в значительной степени усилить противораковое действие каждого из указанных компонентов. В первую очередь предложенная терапия была применена к недавно перевитой и стабилизированной опухоли (к моменту терапии опухоль имела непальпируемый размер) (Рис. 7). На 17 сутки только у двух из 10 мышей в группе «ЦФ+ДР+ДНК» можно было пальпировать небольшие узелки в месте прививки графта. В группе «ЦФ+ДР» также наблюдалась значительная задержка в развитии опухолевого трансплантата. Однако в день последнего измерения у всех мышей в группе «ЦФ+ДР» опухолевый трансплантат имел измеряемый размер. Дополнительно в МТТ-тесте (с использованием бромида 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия) против клеток опухоли Кребс-2 была оценена цитотоксическая активность мононуклеарной фракции клеток крови экспериментальных животных, динамика роста опухоли которых приведена на рисунке 7. Цитотоксический индекс (ЦИ) рассчитывали как процент погибших клеток опухоли в опытных группах относительно эффекта, проявляемого клетками интактной мыши. Для схемы «ДР+ЦФ+ДНК» ЦИ составил 86,5%, что согласуется с динамикой роста опухоли (Рис. 7). Для схемы «ДР+ЦФ» ЦИ был практически равен нулю, однако при этом наблюдалось значительное подавление роста опухоли. Это можно объяснить физическим разрушением 15 опухолевых клеток цитостатиками без стимуляции созревания ДК препаратом ДНК и индукции развития адаптивного иммунного ответа. Рис. 7. Динамика роста опухоли Кребс-2 после различных схем обработки животных циклофосфаном (ЦФ), доксорубицином (ДР) и препаратом ДНК (отражена стандартная ошибка, n=9). Снизу приведена схема соответствующих инъекций. Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора. Аналогичный эксперимент был проведен в применении к опухоли, достигшей определенного измеряемого размера (1 см3, или ~5% веса тела) (Рис. 8). Схема инъекций препаратов была аналогична схеме, представленной на рисунке 7. 16 Рис. 8. Динамика роста опухоли Кребс-2 после проведенной химиотерапии (отражена стандартная ошибка; «контроль», n=6; «ЦФ», n=6; «ЦФ+ДР+ДНК», n=7; «ЦФ+ДР», n=7; «ДР», n=2). Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора. Полученные результаты позволяют утверждать, что инъекции мышам с привитыми опухолями препарата ДНК на фоне инъекций цитостатиков ЦФ и ДР приводят к значительному подавлению роста экспериментальных опухолей. Такой эффект, по-видимому, обусловлен развитием у животных противоракового иммунитета, который связан с появлением в периферической крови пула цитотоксических клеток и популяции CD8+/перфорин+ Т-клеток в иммунокомпетентных органах животных с привитыми опухолями. Таким образом, была подобрана стратегия наиболее эффективной в экспериментальных условиях противоопухолевой терапии с использованием клинических цитостатических препаратов, которая состоит в следующем: животные с привитыми опухолями последовательно получают инъекции ДР внутривенно в дозе 3-6 мг/кг веса животного, затем в течение часа ЦФ внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг веса животного, и четырехкратные инъекции препарата ДНК на 1, 2, 3 и 5 сутки после инъекций цитостатиков. Совокупность полученных экспериментальных данных, а также проведенных доклинических испытаний и клинических испытаний первой фазы явились основой для проведения клинических испытаний второй фазы препарата на основе фрагментированной геномной ДНК человека, зарегистрированного под названием «Панаген» (регистрационное свидетельство ЛСР №004429/08 от 09.06.2008) в качестве лейкостимулирующего средства при проведении программной полихимиотерапии в схемах лечения рака молочной 17 железы II-IV степени с дополнительным эффектом стимуляции развития адаптивного противоракового иммунитета. ВЫВОДЫ 1. Совместное применение препарата фрагментированной геномной ДНК человека и кросслинкирующего цитостатика циклофосфана приводит к усилению торможения роста экспериментальных опухолей мыши. Иммунизация экспериментальных животных гомогенатом клеток опухоли усиливает описанный противораковый эффект. 2. Обработка препаратом ДНК человека экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток мыши приводит к их созреванию на уровне, сравнимом со стандартным индуктором созревания ФНОα. Вакцинация мышей зрелыми дендритными клетками, пульсированными антигенами опухоли-графта, приводит к торможению роста опухолевого трансплантата. 3. Присутствие аллогенной двуцепочечной ДНК в культуре дендритных клеток человека индуцирует их созревание и усиление аллостимуляторной активности и приводит к увеличению доли цитотоксических перфоринсодержащих Т-лимфоцитов в популяции смешанной культуры лимфоцитов с эффективностью, сравнимой с действием стандартного дозревающего стимула ЛПС стенки бактерий. 4. Обработка животных с экспериментальными опухолями цитостатиками доксорубицином и циклофосфаном в сочетании с препаратом ДНК человека обеспечивает выраженный противоопухолевый эффект как в случае небольшого количества раковых клеток (не пальпируемый размер), так и в случае опухоли, достигшей размеров более 5% массы тела животного. Развивающийся противораковый эффект сопровождается появлением во фракции мононуклеаров периферической крови популяции цитотоксических клеток, обладающих специфической активностью против опухоли-графта. 18 СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva TE, Nikolin VP, Popova NA, Orishchenko KE, Strunkin DN, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Combined therapy with cyclophosphamide and DNA preparation inhibits the tumor growth in mice. Genet Vaccines Ther. 2009 Aug 14; 7(1):12. http://www.gvt-journal.com/content/7/1/12. 2. Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva TE, Nikolin VP, Popova NA, Kiseleva EV, Orishchenko KE, Sakhno LV, Gel'fgat EL, Ostanin AA, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous allogenic fragmented double-stranded DNA is internalized into human dendritic cells and enhances their allostimulatory activity. Cellular Immunology, 2010; V. 262: P. 120-126. 3. Alyamkina EA, Leplina OY, Sakhno LV, Chernykh ER, Ostanin AA, Efremov YR, Shilov AG, Proskurina AS, Orishchenko KE, Dolgova EV, Rogachev VA, Nikolin VP, Popova NA, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Effect of double-stranded DNA on maturation of dendritic cells in vitro. Cellular Immunology, 2010; V. 266: P. 46-51. 4. Alyamkina EA, Nikolin VP, Popova NA, Dolgova EV, Proskurina AS, Orishchenko KE, Efremov YR, Chernykh ER, Ostanin AA, Sidorov SV, Ponomarenko DM, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. A strategy of tumor treatment in mice with doxorubicin-cyclophosphamide combination based on dendritic cell activation by human double-stranded DNA preparation. Genetic Vaccines and Therapy. 2010, Nov 1; 8(1):7. http://www.gvt-journal.com/content/8/1/7. 5. Alyamkina EA, Leplina OY, Ostanin AA, Chernykh ER, Nikolin VP, Popova NA, Proskurina AS, Gvozdeva TS, Dolgova EV, Orishchenko KE, Rogachev VA, Sidorov SV, Varaksin NA, Ryabicheva TG, Bogachev SS, Shurdov MA. Effects of human exogenous DNA on production of perforin-containing CD8+ cytotoxic lymphocytes in laboratory setting and clinical practice. Cell Immunol. 2012, 276, P. 59-66. 19