(560 кб) - Волгоградский государственный медицинский
advertisement
На правах рукописи ЧУПРИНЕНКО ЛЮДМИЛА МИХАЙЛОВНА СТРУКТУРНО-ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИИ 14.00.15 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград – 2006 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Кубанский медицинский университет» Федерального здравоохранению и социальному развитию государственный агентства по Научный руководитель – доктор биологических наук профессор Славинский Александр Александрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Новочадов Валерий Валерьевич доктор медицинских наук профессор Богомолова Нина Викторовна Ведущая организация – Государственное некоммерческое учреждение – ″Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук″ Защита состоится «_____»______________2006 года в ______часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1. С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета. Автореферат разослан «_____»_______________________2006 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор С.И. Зайченко ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Железодефицитная анемия (ЖДА) – это широко распространенная патология эритрона. Основным этиологическим фактором заболевания часто становится хроническая кровопотеря, как правило, связанная либо с патологией желудочно-кишечного тракта, либо с обильными менструальными кровотечениями у женщин детородного возраста (Левина А.А. и соавт., 2001; Козинец Г.И. и соавт., 2003). Истощение общего количества железа в организме приводит к появлению анемического и сидеропенического синдромов (Воробьев П.А., 2001; Погорелов В.М. и соавт., 2004). ЖДА сопровождается снижением активности железосодержащих окислительно-восстановительных ферментов клеток различных тканей, что способствует развитию мышечной слабости, кардиомиопатии, вызывает дистрофические и атрофические изменения кожи и слизистых оболочек (Зюбина Л.Ю. и соавт., 2002; Малова Н.Е. и соав., 2002; Schaefer N. et al., 2004; Gupta K. et al., 2006). При дефиците железа нарушается миелинизация нервных волокон, возникают изменения в интеллектуальной сфере (Lozoff B. et al., 2000; Algarin C. et al., 2003). Рядом исследований установлено, что при ЖДА появляются изменения в гуморальном и клеточном звене иммунной системы (Сафуанова Г.Ш. и соавт. 2002, 2004; Eciz С. et al., 2005). Больные с ЖДА чаще страдают от инфекционно-воспалительных заболеваний, принимающих у них хроническое течение (Левина А.А. и соавт., 2001; Жданова Е.В. и соавт., 2002; Демихов В.Г., 2003). Патогенетические механизмы этого явления до сих пор остаются мало изученными. Учитывая, что нейтрофильные лейкоциты играют важную и порой определяющую роль в развитии воспалительных процессов, представляет интерес исследование функциональной активности этих клеток при ЖДА. Нейтрофильные лейкоциты первыми появляются в зоне повреждения ткани (Мазинг Ю.А., 1991; Пауков В.С. и соавт., 2005). Дегрануляция нейтрофилов с выбросом компонентов антибактериальных систем в фагоцитарные вакуоли или внеклеточное пространство способствует уничтожению микроорганизмов и очищению очага воспаления от некротизированных тканей (Саркисов Д.С., Пальцын А.А., 1992; Сапрыкин В.П., Галанкин В.Н., 1998; Faurschou M., Borregaard N., 2003; Brinkmann V. et al., 2004). Депрессия функциональной активности нейтрофилов приводит к 3 возникновению и прогрессированию гнойно-септических процессов (Галанкин В.Н., Токмаков А.М., 1991; Хаитов Р.М, Пинегин Б.В, 1995; Tralau T. et al., 2004). Исследование функционально-метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов крови с применением компьютерной морфометрии клеточного изображения представляется актуальным в связи с глобальной распространенностью железодефицитных состояний для более глубокого понимания деятельности защитных систем организма у больных ЖДА и в интересах дифференциальной диагностики патологии эритрона. Цель исследования. Выявить характерные для железодефицитной анемии структурно-цитохимические изменения в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови, связанные с нарушением функционально-метаболической активности внутриклеточных антибактериальных систем и ядерного хроматина. Задачи исследования: 1. Выявить обусловленные дефицитом железа изменения в зернистости нейтрофильных лейкоцитов на основе компьютерного мониторинга цитохимических маркеров гранул: миелопероксидазы, НАДФН-оксидазы, щелочной фосфатазы, нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы и неферментных катионных белков. 2. Оценить активационный потенциал ядер нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови у больных ЖДА по интенсивности анизотропного эффекта хроматина. 3. Определить изменение активности железосодержащих и не содержащих железо компонентов антибактериальных систем нейтрофилов в зависимости от степени тяжести ЖДА. 4. Установить характер взаимосвязи между цитохимическими признаками функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов крови и показателями состояния периферического звена эритрона у больных ЖДА. 5. Выявить различия структурно-цитохимических признаков функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов крови у больных с острой и хронической постгеморрагической (железодефицитной) анемией. Научная новизна работы: 1. Получены новые данные, характеризующие состояние железосодержащих (миелопероксидаза, НАДФН-оксидаза) и не содержащих железо (щелочная фосфатаза, нафтол-АS-D-хлорацетат 4 эстераза) компонентов антибактериальных систем нейтрофилов крови у больных с ЖДА. 2. Выявлены неизвестные ранее морфофункциональные особенности ядер нейтрофильных лейкоцитов у больных ЖДА, связанные с увеличением в них количества сегментов и доли гетерохроматина. 3. Представлены новые сведения о возрастании активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови у больных с острой постгеморрагической анемией, указывающие на повышение функциональной активности этих клеток. 4. Предложен новый способ для оценки состояния запасного фонда железа, основанный на определении количества сидероцитов в периферической крови. Научно-практическая значимость работы. Новые данные об угнетении функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов у больных с ЖДА расширяют современные представления о состоянии иммунной системы при этой патологии эритрона, поэтому могут применяться в научно-исследовательской работе, а также в учебном процессе со студентами медицинских и биологических специальностей. Выявленные различия в активности цитохимических маркеров антибактериальных систем нейтрофилов у больных с острой и хронической постгеморрагической анемиями могут быть использованы в дифференциальной диагностике патологии эритрона. Определение содержания сидероцитов в периферической крови может применяться в оценке запасного фонда железа при железодефицитных состояниях. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Нейтрофильные лейкоциты периферической крови больных с железодефицитной анемией характеризуются депрессией функциональнометаболической активности, которая проявляется структурноцитохимическими изменениями в цитоплазматической зернистости и обусловлена зависимым от концентрации гемоглобина в крови угнетением активности железосодержащих ферментов миелопероксидазы и НАДФНоксидазы. Не содержащие железо компоненты антибактериальных систем сохраняют свой функциональный потенциал в нейтрофилах больных, однако активность щелочной фосфатазы снижается при среднетяжелом течении заболевания. 2. В ядрах нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных с железодефицитной анемией возрастает анизотропный эффект, 5 что указывает на увеличение доли гетерохроматина и угнетение активационного потенциала ядер. Наряду с этим в крови повышается количество полисегментированных нейтрофилов. 3. Острая постгеморрагическая анемия характеризуется активацией нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови. В цитоплазме клеток возрастает активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы. Сохраняются показатели активности НАДФН-оксидазы и нафтол-АS-Dхлорацетат эстеразы, а также содержание неферментных катионных белков. Морфофункциональные параметры ядер нейтрофилов не изменяются. Внедрение результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 4 в центральной печати. Основные положения диссертации представлены на ХХХII научнопрактической конференции студентов и молодых ученых вузов ЮФО (Краснодар, 2005), научно-практической конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2005), IV всероссийской конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), IХ конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в 21 веке» (Киров, 2005), конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы медицинской науки и здравоохранения» (Краснодар, 2005), международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), ХХХIII конференции студентов и молодых ученых вузов ЮФО (Краснодар, 2006). Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Кубанского государственного медицинского университета. Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической анатомии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики. Практические рекомендации используются в работе отдела клинической и экспериментальной иммунологии ЦНИЛ Кубанского государственного медицинского университета. Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников кафедр патологической анатомии, патологической физиологии, гистологии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики Кубанского государственного медицинского университета 7 сентября 2006 года. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 6 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 21 рисунок (гистограммы, изображения эритроцитов и нейтрофильных лейкоцитов). Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, указателя использованной литературы. Библиография включает 253 источника, из них 83 на русском языке и 170 – на иностранных языках. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследована периферическая кровь 102 больных с ЖДА, развившейся в результате нарушения менструального цикла по типу менометроррагии на фоне лейомиомы матки в сочетании с аденомиозом. В соответствии с уровнем гемоглобина крови больные были разделены на две группы. Группа с легким течением ЖДА состояла из 72 женщин (уровень гемоглобина от 120 до 90 г/л). Группа со средней степенью тяжести ЖДА – из 30 больных (уровень гемоглобина от 90 до 70 г/л). Сравнение результатов исследования проводили с группой, состоящей из 29 больных лейомиомами матки и аденомиозом без клинико-лабораторных проявлений анемии (группа сравнения). В контрольную группу выбраны 60 практически здоровых женщин. Данные, полученные у больных с ЖДА, сопоставлены с результатами исследования 35 больных лейомиомами матки и аденомиозом, у которых основное заболевание осложнилось маточным кровотечением с развившейся на 1-2 сутки после него острой постгеморрагической анемией. Диагноз ЖДА подтвержден определением уровня сывороточного железа, ферритина, насыщения трансферрина железом. Исследование показателей периферического звена эритрона проведено при помощи проточного счетчика ''Cobas Micros 18 OT'' (АВХ, Франция). Основной диагноз поставлен на основании гистологического исследования операционного материала. В нейтрофильных лейкоцитах определяли активность ферментов, а также содержание цитоплазматических неферментных катионных белков. Исследовали уровень активации ядерного хроматина и сегментацию ядер. В эритроцитах определяли включения – ретикулофиламентозную субстанцию и сидеросомы. После всех цитохимических реакций проведена компьютерная морфометрия изображения нейтрофильных лейкоцитов (15000 клеток здоровых людей и 40250 клеток больных). Активность НАДФН-оксидазы в нейтрофилах определяли с помощью НСТ-теста (Нестерова И.В., 1980), миелопероксидазы – бензидиновым методом (Satо А., 1928). Активность нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы 7 осуществляли по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (2000), щелочной фосфатазы – по методу М.Г Шубича (1965). Определение содержания неферментных катионных белков проводили по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (1999). Исследование ядер нейтрофилов включало оценку степени сегментации и активационного потенциала. Для определения степени сегментации нами предложены два расчетных критерия: индекс сегментации ядер, представляющий собой среднее значение количества сегментов в расчете на одну клетку, и показатель полисегментации ядер, соответствующий проценту нейтрофилов в мазке крови, ядро которых состоит из 4 и более долей. Активационный потенциал ядер определяли поляризационнооптическим методом по анизотропным свойствам ядерного хроматина (Евглевский А.А., 2000). В периферическом звене эритрона оценивали структурные изменения эритроцитов. Определены эритроцитарные индексы и внутриклеточные включения. Включения негеминового железа выявляли реакцией на берлинскую лазурь, ретикулофиламентозную субстанцию – суправитальной окраской с метиленовым синим (Козинец Г.И. и соавт., 2004). Для оценки регенераторной способности костного мозга использовали расчетный критерий – ретикулоцитарный индекс (Погорелов В.М. и соавт., 2004). Компьютерную морфометрию изображения нейтрофильных лейкоцитов проводили при помощи цветной телевизионной системы для микроскопических исследований ''MagiScop'', изготовленной в НИИ Телевидения (Санкт-Петербург). Применяли пакеты прикладных программ ''Magisoft'' и ''Видеотест''. Изображение, сформированное иммерсионной системой микроскопа, вводили через телекамеру в видеопамять компьютера. С помощью программной линейной аппроксимации увеличивали изображение клетки. Для равномерной очистки изображения от высокочастотных шумов делали медианную фильтрацию. В цветовом координатном пространстве LSH выполняли контрастирование изображения по гистограмме яркости. Производили бинаризацию изображения по цвету цитохимической реакции (рис.1). В автоматическом режиме измеряли параметры бинарных изображений. Определяли суммарные и средние значения площади и оптической плотности образовавшегося в клетке продукта цитохимической реакции. 8 Рис. 1. Компьютерное изображение нейтрофильного лейкоцита здорового человека после линейной аппроксимации, медианной фильтрации, контрастирования и увеличения резкости (слева). Бинарное изображение той же клетки (справа). Реакция на щелочную фосфатазу. Для оценки результатов компьютерной морфометрии использован вычисляемый критерий – интегральный цитохимический показатель (ИЦП), представляющий собой произведение суммарной площади продукта цитохимической реакции в клетке и его оптической плотности (Славинский А.А., 2000). Обработка результатов компьютерной морфометрии с помощью программы "Microsoft Excel" включала построение вариационных рядов и создание сводных электронных таблиц. Для оценки значимости различий между средними значениями двух выборок вычислен критерий Стьюдента (t). Для сравнения нескольких групп с одной определен критерий Даннета (q'). Количественную оценку взаимосвязи двух наборов данных проводили с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs) (Гланц С., 1999; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЕ ЗВЕНО ЭРИТРОНА У больных с легкой степенью ЖДА количество эритроцитов, содержащих включения негеминового железа (сидероцитов) в периферической крови составило 1,03±0,08‰, что в 1,6 раза меньше, чем у больных без анемии (р<0,01). При средней степени тяжести количество сидероцитов снижено в 2,7 раза (р<0,01), что может быть признаком истощения запасного фонда железа у этих больных. 9 Содержание ретикулоцитов не изменяется при легкой степени ЖДА, а при средней степени снижается до 2,84±0,07‰, что в 1,3 раза меньше (р<0,01) по сравнению с больными без анемии (рис.2). Ретикулоцитарный индекс снижен в 1,5 раза при легкой степени анемии, а при средней степени тяжести – в 2,4 раза (р<0,01). Это свидетельствует об угнетении эритропоэза и развитии гипорегенераторного состояния красного костного мозга у больных ЖДА. В отличие от ЖДА острая постгеморрагическая анемия не сопровождается изменением количества сидероцитов и ретикулоцитов в периферической крови больных. При этом виде анемии не изменяется ретикулоцитарный индекс, что свидетельствует о сохранении эритропоэтической функции костного мозга. Установлена прямая корреляционная связь средней силы (rs=0,51) между содержанием сидероцитов в периферической крови и уровнем гемоглобина. Падение уровня гемоглобина крови сопровождается уменьшением количества эритроцитов, в которых обнаруживаются гранулы негеминового железа. Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов при ЖДА также коррелирует со снижением количества сидероцитов в крови. ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ Цитохимические маркеры антибактериальных систем в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов имеют диффузную и гранулярную области распределения (Славинский А.А., 2000). В связи с этим в процессе компьютерной морфометрии клеточного изображения измерениям 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ЗЛ ББА Ретикулоциты (‰ ) ЖДА I ЖДА II ОПГА Ретикулоцитарный индекс (%) Рис. 2. Количество ретикулоцитов в периферической крови и значение ретикулоцитарного индекса. ЗЛ – здоровые люди, ББА – больные без анемии, ЖДА I – больные с железодефицитной анемией легкой степени, ЖДА II – больные с железодефицитной анемией средней степени, ОПГА – больные с острой постгеморрагической анемией. 10 подвергалась зона диффузно-гранулярного распределения цветного продукта цитохимических реакций (ДГ-зона). Реализация кислородзависимого механизма антибактериальной защиты происходит при участии НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы. Оба эти фермента в своем составе имеют железо, что позволило нам объединить их в группу железосодержащих компонентов антибактериальных систем нейтрофильных лейкоцитов. ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИЕ КОМПОНЕНТЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СИСТЕМ. Миелопероксидаза обнаружена в 59,2±9,7% нейтрофилов периферической крови у больных с легким течением ЖДА, что в 1,6 раза меньше, чем у больных без анемического синдрома (р<0,05). Активность фермента снижена в 1,9 раза (рис. 3А). Компьютерная морфометрия клеточного изображения показала, что снижение активности фермента при ЖДА обусловлено уменьшением площади ДГ-зоны в цитоплазме нейтрофилов. У больных со средней степенью ЖДА количество клеток, в которых выявлена активность миелопероксидазы, меньше в 2 раза (р<0,05). Активность фермента снижена в 2,3 раза, что связано с уменьшением в цитоплазме нейтрофилов площади ДГ-зоны фермента в 3,4 раза (р<0,01). При острой постгеморрагической анемии количество нейтрофилов с положительной реакцией на миелопероксидазу не имело статистически значимых различий при сравнении с больными без анемии (р>0,05). Однако активность фермента возросла в 1,5 раза (р<0,01). НАДФН-оксидаза при легкой степени ЖДА выявлена в 24,3±4,5% нейтрофилов периферической крови, что в 2,3 раза меньше, чем у больных без анемии (р<0,01). Активность фермента снижена в 1,4 раза (рис. 3.Б.). При компьютерной морфометрии клеточного изображения установлено, что в нейтрофильных лейкоцитах площадь ДГ-зоны продукта цитохимической реакции на НАДФН-оксидазу уменьшена в 1,4 раза (р<0,05). При средней степени ЖДА процент клеток, в цитоплазме которых обнаружена активность НАДФН-оксидазы, в 3 раза ниже, чем у больных без анемии (р<0,01). Активность фермента в нейтрофилах снижена до 5,03±0,3 отн.ед., что в 1,4 раза меньше по сравнению с больными без анемического синдрома (р<0,01). Площадь ДГ-зоны НАДФН-оксидазы уменьшена в 1,4 раза (р<0,05). Активность фермента, количество клеток, в которых обнаружена положительная реакция на НАДФН-оксидазу, оптические и 11 Рис. 3. Результаты компьютерной морфометрии компонентов антибактериальных систем нейтрофилов (ИЦП, отн.ед.): А – миелопероксидаза, Б – НАДФН-оксидаза, В – щелочная фосфатаза, Г - нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза. ЗЛ – здоровые люди, ББА – больные без анемии, ЖДА I – больные с железодефицитной анемией легкой степени, ЖДА II – больные с железодефицитной анемией средней степени, ОПГА – больные с острой постгеморрагической анемией. геометрические параметры продукта цитохимической реакции у больных с острой постгеморрагической анемией не имели статистических отличий от значений в группе больных без анемии (р>0,05). Статистический анализ выявил сильную прямую корреляционную связь между активностью миелопероксидазы в нейтрофилах крови и уровнем гемоглобина (rs=0,84). Связь между активностью НАДФН-оксидазы и уровнем гемоглобина крови имела среднюю силу. Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов у больных с ЖДА сопровождалось снижением активности миелопероксидазы и НАДФНоксидазы. 12 НЕ СОДЕРЖАЩИЕ ЖЕЛЕЗО КОМПОНЕНТЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СИСТЕМ. Щелочная фосфатаза обнаружена в 81,8±6,6% нейтрофилов периферической крови у больных с легкой степенью ЖДА, что достоверно не отличается от процента реагирующих клеток у больных без анемии (р>0,05). Активность фермента составляет 4,56±0,5 отн.ед., а площадь ДГ-зоны продукта реакции в цитоплазме клеток – 40,8±2,6 мкм2, что не имет статистически значимых отличий от показателей в группе больных без анемии (р>0,05). При средней степени ЖДА количество реагирующих клеток уменьшено в 1,6 раза – до 51,2±8,4% (р<0,05). Активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах снижена в 2,7 раза (р<0,01), что сопровождается уменьшением площади ДГ-зоны в цитоплазме клеток в 2,1 раза (р<0,01), а оптической плотности продукта реакции – в 1,6 раза (р<0,05). У больных с острой постгеморрагической анемией количество нейтрофильных лейкоцитов, в цитоплазме которых обнаружен продукт цитохимической реакции на щелочную фосфатазу, увеличено в 1,2 раза по сравнению с больными без анемии (р<0,05). Активность фермента выше в 1,4 раза (рис. 3В). Морфометрия изображения клеток показала увеличение площади ДГ-зоны щелочной фосфатазы в 1,4 раза (р<0,05). Нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза в нейтрофилах крови у больных с ЖДА легкой и средней степени тяжести обнаружена в 99,5±0,5 и 99,6±0,4% клеток, что статистически не отличается от процента реагирующих клеток у больных без анемии (р>0,05). Средние значения активности фермента, площади ДГ-зоны и оптической плотности продукта цитохимической реакции в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов при легкой и средней степени ЖДА не имеют статистически значимых отличий от показателей в группе больных без анемии (рис. 3Г). При острой постгеморрагической анемии изменения в количестве реагирующих нейтрофилов, активности фермента, оптических и геометрических параметрах продукта цитохимической реакции в цитоплазме клеток статистически недостоверны (р>0,05). НЕФЕРМЕНТНЫЕ КАТИОННЫЕ БЕЛКИ. Количество клеток, содержащих катионные белки, у больных с легкой степенью ЖДА равно 99,8±0,2%. Содержание катионных белков в цитоплазме нейтрофилов составляет 5,12±0,3 отн. ед., а занимаемая площадь – 34,8±2,4 мкм2, что не отличается от показателей у больных без анемии (р>0,05). При средней степени ЖДА количество нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови, содержащих катионные белки, средние значения 13 активности фермента и площади ДГ-зоны не имеют статистических отличий от показателей в группе больных без анемии (р>0,05). В периферической крови больных с острой постгеморрагической анемией количество нейтрофилов, содержащих неферментные катионные белки, составило 99,2±0,8%. Содержание в цитоплазме клеток катионных белков – 5,26±0,6 отн.ед., что не имело статистически значимых отличий от показателей у больных без анемии (р>0,05). Компьютерная морфометрия изображения нейтрофильных лейкоцитов показала, что средняя площадь ДГ-зоны катионных белков и оптическая плотность продукта реакции статистически не отличаются от показателей в группе больных без анемического синдрома (р>0,05). МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕР НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ Установлено, что нейтрофильные лейкоциты в периферической крови у больных с ЖДА содержат от 2 до 6 долей в ядре. Процент нейтрофилов с полисегментированными ядрами при легкой степени ЖДА выше в 2,1 раза, чем у больных без анемии (рис. 4). Индекс сегментации ядер нейтрофильных лейкоцитов равен 3,07±0,2 отн. ед., что статистически значимо отличается от показателя в группе больных без анемии (р<0,05). При средней степени ЖДА количество нейтрофилов с полисегментированными ядрами в периферической крови выше в 2,3 раза (р<0,01). Индекс сегментации составляет 3,10±0,1 отн. ед., что Рис. 4. Сегментация ядер нейтрофильных лейкоцитов крови: А количество клеток с полисегментированными ядрами (%), Б – индекс сегментации ядер (отн.ед.). ЗЛ – здоровые люди, ББА – больные без анемии, ЖДА I – больные с железодефицитной анемией легкой степени, ЖДА II – больные с железодефицитной анемией средней степени, ОПГА – больные с острой постгеморрагической анемией. 14 статистически достоверно отличается от показателей в группе больных без анемии (р<0,05). У больных с ЖДА между показателем полисегментации ядер нейтрофилов, индексом сегментации и гематологическими параметрами корреляционная связь отсутствует. У больных с острой постгеморрагической анемией изменения в количестве полисегментированных нейтрофилов и среднем числе сегментов ядра статистически недостоверны (р>0,05). Для оценки активационного потенциала ядер нейтрофильных лейкоцитов использовали показатель активности хроматина. Величина анизотропного эффекта отражает структурную упорядоченность ядерного хроматина, и снижение уровня анизотропии можно рассматривать как показатель, свидетельствующий о его деспирализации и диссоциации комплекса ДНК-гистон в ядрах нейтрофилов. Подобные явления указывают на возможное повышение матричной активности ДНК, а значит и на увеличение биосинтетической активности клеток (Евглевский А.А., 2000). У больных с легкой степенью ЖДА количество нейтрофилов с анизотропным эффектом в ядре больше, чем у больных без анемии в 2 раза (р<0,01). Показатель активности ядерного хроматина составляет 1,79±0,3 отн.ед., что в 1,8 раза ниже по сравнению с больными без анемического синдрома (рис. 5 А, Б). При средней степени ЖДА количество клеток с анизотропным эффектом в ядре выше в 2,1 раза (р<0,01). Показатель активности хроматина нейтрофилов снижен до 1,91±0,1 отн.ед. (р<0,01). У больных с острой постгеморрагической анемией анизотропный эффект обнаружен в ядрах 63,2±7,6% нейтрофилов, что статистически не отличалось от значений в группе больных без анемии (р>0,05). Изменение показателя активности хроматина в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови при этом виде анемии также статистически недостоверно (рис. 4 А,Б). Между количеством нейтрофилов с анизотропным эффектом в ядре и уровнем гемоглобина крови существует обратная корреляционная связь средней силы (rs=0,59). Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов у больных с ЖДА сопровождается снижением количества клеток с анизотропными ядрами. Показатель активности ядерного хроматина нейтрофилов снижается при падении уровня гемоглобина в крови. Показатели микроцитоза и гипохромии прямо 15 Рис. 5. Анизотропный эффект в ядрах нейтрофильных лейкоцитов периферической крови: А количество клеток с анизотропным эффектом в ядре (%), Б – показатель активности хроматина ядер (отн.ед.). ЗЛ – здоровые люди, ББА – больные без анемии, ЖДА I – больные с железодефицитной анемией легкой степени, ЖДА II – больные с железодефицитной анемией средней степени, ОПГА – больные с острой постгеморрагической анемией. коррелируют с показателем активности ядерного хроматина нейтрофилов. Увеличение интенсивности анизотропного эффекта в ядрах нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных с ЖДА может свидетельствовать о выраженной конденсации ядерного хроматина и снижении его транскрипционной активности. Результаты проведенного исследования показали, что нейтрофильные лейкоциты периферической крови у больных с ЖДА характеризуются структурно-цитохимическими изменениями в цитоплазматической зернистости и ядре. Изменение активности миелопероксидазы и НАДФНоксидазы в нейтрофилах можно объяснить наличием железа в составе этих ферментов. Миелопероксидаза – гемопротеидный фермент азурофильной зернистости нейтрофильных лейкоцитов, механизм действия которого связан с каталитическими реакциями, протекающими при участии железа в составе гемового центра фермента (Abu-Soud H.M., Hazen S.L., 2000; Арнхольд Ю, 2004). НАДФН-оксидаза нейтрофильных лейкоцитов – мультиферментный комплекс. Её активность направлена на генерацию радикалов кислорода и связана с железосодержащим компонентом цитохромом b558 (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999; Ambruso D.R. et al., 2004). Таким образом, развивающаяся у больных с ЖДА сидеропения способствует снижению активности этих железосодержащих ферментов. Сохранение активности нафтол-АS-D-хлорацетат эстеразы и щелочной фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах больных с ЖДА свидетельствует 16 об отсутствии влияния дефицита железа на их активность. Однако резкое снижение при среднетяжелом течении анемии активности щелочной фосфатазы указывает на выраженное угнетение функционального потенциала этих клеток у больных. В отличие от миелопероксидазы и НАДФН-оксидазы, щелочная фосфатаза нейтрофильных лейкоцитов не имеет в своем составе железа. Определение ее активности используют для индикации в организме очагов воспаления при различных патологических состояниях (Дягилева О.А. и соавт., 2001; Wessely-Szponder J. et al., 2004). Щелочная фосфатаза является маркером мембран секреторных пузырьков нейтрофильных лейкоцитов (Borregaard N., 1996). Активация нейтрофилов приводит к быстрой реорганизации, слиянию и экзоцитозу этих гранул (Kobayashi T. et al., 1998, 2000). Уменьшение активности щелочной фосфатазы, НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы можно рассматривать как признак депрессии функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов крови у больных с ЖДА. Снижение функционального потенциала нейтрофилов, представляющих собой одно из звеньев врожденного иммунитета и являющихся неотъемлемым компонентом воспалительной реакции, может иметь неблагоприятное прогностическое значение для развития инфекционно-воспалительных заболеваний у пациентов с сидеропеническим синдромом. ВЫВОДЫ 1. Нейтрофильные лейкоциты периферической крови больных с железодефицитной анемией характеризуются депрессией функциональнометаболической активности, которая проявляется структурноцитохимическими изменениями в цитоплазматической зернистости и снижением активности ядерного хроматина. 2. Структурно-цитохимические изменения в цитоплазматической зернистости нейтрофилов при железодефицитной анемии обусловлены угнетением железосодержащих компонентов антибактериальных систем. Активность миелопероксидазы снижена в 1,9 раза при легкой степени анемии и в 2,3 раза – при средней степени тяжести заболевания. Активность НАДФН-оксидазы снижена в 1,4 раза как при легком, так и при среднетяжелом течении анемии. Активность железосодержащих ферментов находится в прямой корреляционной связи с уровнем гемоглобина крови. 3. Не содержащие железо компоненты антибактериальных систем 17 нейтрофилов сохраняют свой функциональный потенциал при железодефицитной анемии. Активность нафтол-АS-D-хлорацетат эстеразы и содержание неферментных катионных белков не изменяются и не имеют корреляционной связи с уровнем гемоглобина крови. Активность щелочной фосфатазы сохраняется при легкой степени анемии, однако при среднетяжелом течении заболевания снижается в 2,7 раза, что указывает на выраженное угнетение функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов в крови этих больных. 4. Показатель активности хроматина в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови при железодефицитной анемии снижается в 1,8 раза, что указывает на увеличение доли гетерохроматина и угнетении транскрипционной активности клеток. Наряду с этим количество полисегментированных нейтрофилов увеличивается при легкой степени анемии в 2,1 раза, а при средней степени в 2,3 раза. 5. В отличие от железодефицитной, при острой постгеморрагической анемии активность миелопероксидазы в нейтрофильных лейкоцитах повышается в 1,5 раза, а щелочной фосфатазы – в 1,4 раза. Показатели активности НАДФН-оксидазы и нафтол-АS-D-хлорацетат эстеразы, а также содержание неферментных катионных белков в цитоплазме клеток сохраняются. Показатели сегментации ядер и активности ядерного хроматина не изменяются. 6. В периферическом звене эритрона у больных с железодефицитной анемией количество эритроцитов, содержащих негеминовое железо, уменьшается в 1,6 раза при легкой и 2,7 раза при средней степени тяжести заболевания, что указывает на истощение запасного фонда железа и может использоваться в качестве дополнительного критерия в диагностике анемий. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Чуприненко Л.М. Активность НАДФН-оксидазы в нейтрофилах периферической крови у больных железодефицитной анемией. // Материалы VI всероссийской конф. молодых ученых и студентов по медицине. Тула, 2005. С. 171172. 2. Чуприненко Л.М. Компьютерный анализ клеточного изображения в оценке функционального состояния нейтрофилов крови у больных железодефицитной анемией. // Материалы IХ конф. студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в 21 веке». Киров, 2005. №1. С. 54. 3. Чуприненко Л.М. Состояние кислородзависимой антибактериальной системы нейтрофильных лейкоцитов при железодефицитной анемии. // Материалы XXХII конф. 18 студентов и молодых ученых вузов ЮФО. Краснодар, 2005. С. 57-58. 4. Чуприненко Л.М. Компьютерная морфометрия активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови при железодефицитной анемии. // Материалы XXХIII конф. студентов и молодых ученых вузов ЮФО. Краснодар, 2006. С. 109-110. 5. Чуприненко Л.М., Мингалева Н.В., Славинский А.А. Миелопероксидаза в нейтрофилах крови при железодефицитной анемии: компьютерный анализ клеточного изображения. // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. № 9. С. 44-45. 6. Чуприненко Л.М., Мингалева Н.В., Славинский А.А. Активность миелопероксидазы в нейтрофилах крови у больных железодефицитной анемией. // Материалы конф. КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН. Курск, 2005. Т. 1. С. 149-150. 7. Чуприненко Л.М., Славинский А.А. Активность хроматина нейтрофилов крови при железодефицитной анемии. // Журнал Ассоциации детских аллергологов и иммунологов России. 2005. №6. Прил.1. С.146. 8. Чуприненко Л.М., Славинский А.А. Метаболическая активность нейтрофилов периферической крови при железодефицитной анемии. // Материалы конф. молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы медицинской науки и здравоохранения». Краснодар, 2005. С. 41-42. 9. Чуприненко Л.М., Славинский А.А. Миелопероксидазная система нейтрофильных лейкоцитов крови при гипохромной микроцитарной анемии. // Материалы конф. молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы медицинской науки и здравоохранения». Краснодар, 2005. С. 42-44. 10. Чуприненко Л.М., Славинский А.А. Оценка кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови у больных железодефицитной анемией. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. № 9. С. 50. 11. Чуприненко Л.М., Славинский А.А. Железозависимые компоненты антибактериальных систем нейтрофильных лейкоцитов у больных железодефицитной анемией. // Успехи современного естествознания. 2005. №10. Прил.1. С.278-281. 19