Fit-1 недостаточность улучшает мышечный фенотип ...

Fit-1 недостаточность улучшает мышечный фенотип дистрофии путем повышения ангиогенеза у MDX
мышей
ВВЕДЕНИЕ
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД ) является Х-хромосомным мышечным заболеванием, возникая у
одного из 3000 детей , когда ген , который кодирует белок дистрофин, мутирует (1) . Дистрофин
стабилизирует мембраны и является частью белкового дистрофин-ассоциированного комплекса который
защищает целостность мембраны в ответ на повреждения, вызванные сокращением(2). В дистрофических
мышцах, где эта связь нарушается, мышечные волокна развиваются нормально, но могут выйти из строя.
Поврежденные мышечные волокна вырождаются, и новые волокна развиваются из сателлитных клеток. Тем
не менее, регенерация является неэффективной, так последовательные раунды вырождения приводят к
постепенной замене мышцы соединительной тканью. Аномальный кровоток, как ожидается, вызвает
повреждение мышц как впервые показал Mendell др.(3). Эта группа показала, что ишемия микрососудов
миокарда производит группировку некротических волокон. Недавние исследования показывают, что
дистрофин также обнаружен в гладких мышцах сосудов мышей (4,5). Отсутствие дистрофина у MDX мышей
(6) , животной модели для МДД , приводит к сосудистым аномалиям, которые могут повлиять на приток
крови. Это зависит от системы оксида азота (NO), эндотелий-индуцированной дилатации , экспрессии
эндотелиальной NO -синтазы и нейронной NO -синтазы, а также пониженной плотности сосудов (7,8 ) . Кроме
того, также сообщалось, что атрофин, гомолог дистрофина, экспрессируется в эндотелии (9). Кроме того ,
нарушение функций комплекса саркогликана, который связан с дистрофином в гладких мышцах сосудов,
нарушает функцию сосудов. Это вызывает кардиомиопатию и обостряет мышечную дистрофию (10). Таким
образом, регулирование притока крови может быть нарушено при МДД , возможно увеличение повреждения
мышц. Последние работы элегантно демонстрирует важность экспрессии дистрофина в гладких мышцах
сосудов для функции мышц MDX мышей. Ито и др.(5) генерировали SMTG / MDX мышей, которые показали
восстановление NO -зависимой модуляции α -адренорецепторов и частично улучшенный фенотип мышц.
Взятые вместе, эти доклады свидетельствуют о том, что нарушение сосудистой функции, связанное с
мышечной патологией при МДД. Таким образом, МДД характеризуется повышенным повреждением мышц и
ненормальным кровотоком после сокращения мышц. Это называется состоянием функциональной ишемии.
Гипотеза предлагает патогенные дефекты в дистрофин-гликопротеиновом комплексе при мышечной
дистрофии (11) : первый удар заключается в снижении NO- опосредованной защиты от ишемии в
дистрофических мышцах, а второй удар заключается в увеличении клеточной восприимчивости к
метаболическому стрессу. Однако взаимосвязь развития между мышечной дистрофией и ангиогенезом до сих
пор не обнаружены. Окончательное лечение мышечной дистрофии, вероятно, потребует того, что белковый
комплекс дистрофина восстанавливается во всех пострадавших группах мышц, а также улучшает сосудистую
функцию мышц. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) регулирует ангиогенез путем поощрения роста
эндотелиальных клеток, их выживания и миграции. VEGF взаимодействует с его рецепторами VEGFR- 1 ( Flt1) и VEGFR- 2 ( FLK- 1 ), которые экспрессирюутся в гемангиобластах и эндотелиальных клеточных линий
во время стадии развития и регенерации тканей ( 13,14 ). FLT- 1 является типичным рецептором
тирозинкиназы, а также область FLT-1 обладает значительно более слабую активность , чем у Flk-1. В
дополнение к полнометражным рецепторам, растворимая форма FLT-1 производится с помощью
альтернативного сплайсинга. И полная и растворимая форма FLT- 1 обладают сильной аффинностью
связывания с VEGF (15). Мыши, лишенные Fit- 1 гена имеют раннюю эмбриональную летальность вследствие
чрезмерного роста эндотелиальных клеток и дезорганизации кровеносных сосудов(13-15). В
противоположность этому, гетерозиготные Fit- 1 мыши доживали до взрослого возраста и отображали
относительно нормальное развитие. Керни и др. . (16) показали, что гетерозиготные и гомозиготные Flt- 1
мыши отображают повышенную дифференцировку эндотелиальных клеток в культурах эмбриональных
стволовых клеток. Эти наблюдения предположили, что Flt- 1 является негативным регулятором роста и
дифференцировки эндотелия в процессе разработки. Несколько работ показывают, что администрация VEGF
способствует ангиогенезу в мышцах после ишемии (17). Кроме того, введение VEGF может способствовать
росту миогенных волокон, защитить миогенные клетки от апоптоза и в конечном итоге стимулировать
регенерацию мышц (18). У MDX мышей введение VEGF может улучшить гистологию и функции (19) мышц.
Тем не менее, остается неясным, влияет ли активируемый ангиогенез на мышечной фенотип дистрофии .Для
решения, можно ли компенсировать состояние функциональной ишемии в мышцах MDX мышей по уровню
развития увеличения плотности сосудов, мы скрестили MDX мышей с гетерозиготными Fit- 1 мышами ( Fit- 1
+ / -). Затем мы сравнили дистрофические фенотипы MDX: Fit- 1 + / - и контрольных MDX: Fit- 1 + / +
мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гетерозиготные мыши с отсутствием Flt- 1 показывают увеличение плотности сосудов.
Мыши, лишенные Flt- 1 гена путем вставки гена β -галактозидазы ( Flt -1- / -) в начале имеют высокую
эмбриональную летальность из-за чрезмерного роста эндотелиальных клеток и дезорганизации сосудов (13-15
). Текущая работа показала, что гетерозиготные Fit- 1 + / - мыши не доживали до взрослого возраста и не
проявляют очевидного фенотипа. Мы сравнили сосудистую плотность между диким типом ( Fit- 1 + / + ) и
гетерозиготными Fit- 1 + / - новорожденными и взрослыми мышами. Fit- 1 + / - новорожденные и взрослые
мыши ( 505,5 ± 24,5 и 273,7 ± 14,4 , соответственно) четко показали повышенную сосудистую плотность в
передней большеберцовой (ПБ) мышце по сравнению с диким типом ( Fit- 1 + / + ) ( 373,5 ± 23,5 и 172,6 ±
13,3 , соответственно), экспрессирюющих маркер CD31 эндотелиальных клеток в поперечном сечении (фиг.
1A и B). Флуоресцентный анализ (FACS ) также подтвердил увеличенние CD31 + эндотелиальных клеток в
ПБ мышце Flt- 1 + / - мышей по сравнению с диким типом Flt- 1 + / + мышей (рис. 2а , б). Эти результаты
позволяют предположить, что Fit- 1 + / - мыши обнаруживают повышенный ангиогенез во время
послеродового развития мышц. Это наблюдение согласуется с опубликованной работой, что развитие сосудов
увеличивается в FLT- 1 + / - культурах эмбриональных стволовых клеток и что Flt- 1 негативно регулирует
ангиогенез в процессе развития (16).
MDX мыши постоянно отображают дегенерацию и регенерацию с последующими отложениями кальция и
фиброза в их мышцах (20,21). Важно, чтобы определить, влияет ли ангиогенез на мышечную патологию и
функции. Для этой цели мы создали двойных мутантных MDX мышей с гетерозиготным аллелем для Fit- 1 (
MDX: Fit- 1 + / -) и сравнили их с их однопометниками MDX мышей дикого типа с Fit- 1 аллелями ( MDX :
Fit- 1 + / + ). Контроль MDX : Fit- 1 + / + мыши имели в среднем 362 ± 12 и 562 ± 12 капилляров в поле зрения
для ПБ мышцы и диафрагмы, соответственно. MDX : Fit- 1 + / - мыши имели более высокие средние 438 ± 10
и 653 ± 17 для мышц ПБ и диафрагмы, соответственно (рис. 1C и D). Относительно частое появление
дистрофин-положительных ревертантных мышечных волокон наблюдаются у MDX мышей. У MDX- 5CV
мышей, используемых в этом исследовании, в ~ 10 раз меньше ревертантов, чем у оригинальных MDX мышей
(22). Вестерн-блот анализ и иммуноокрашивание экстрактов и секций ПБ мышцы проводились, чтобы
подтвердить, что экспрессия дистрофина и дистрофин-положительных ревертантных волокон не были
изменены у MDX: Fit- 1 + / + и MDX: Flt1 + / - мыши (рис. 3А- D) .
Известно, что в отсутствие дистрофина экспрессия атрофина усиливается для компенсации нестабильности
мембраны у MDX мышей (23). Экспрессия атрофина оценивали по вестерн-блоттингу экстракта ПБ мышцы.
Как и ожидалось, экспрессия атрофина была активирована в MDX: Flt- 1 + / + и MDX: Flt1 + / - мышах по
сравнению с диким типом ( рис. 3C и E) . Таким образом, MDX : Fit- 1 + / - мыши и контроль MDX : Fit- 1 + /
+ мышей были использованы для дальнейшего сравнения взаимосвязи между мышечной дистрофией и
ангиогенезом у MDX мышей.
Морфология и гистология мышц были улучшены у MDX: Fit- 1 + / - мышей.
Поглощение синего красителя Эванса (EBD) используется как мера проницаемости мембраны ( 24,25 ) . MDX
: Fit- 1 + / + мыши четко показали некоторые EBD- положительные дегенерирующие мышечные волокна в ПБ
мышцах ( 3.30 % ± 1,11 ) и в диафрагме ( 3.02 % ± 0,66 ) (рис. 4 , б). С другой стороны, MDX: Flt- 1 + / - мыши
показали более низкие EBD- положительные мышечные волокна в ПБ мышцах( 0,021 % ± 0,05 ) и в диафрагме
(1,25% ± 0,25 ). Эти данные убедительно свидетельствуют, что мышечные волокна в MDX: Fit- 1 + / - мыши
являются более стабильными и менее дегенеративнвми, чем в контрольной MDX: Fit- 1 + / + мышей.
Гистологические фенотипы, обычно связанные с МДД , включают чрезмерный фиброз и кальциноз. Фиброз
является заменой мышечных волокон, которая не только уменьшает количество генераторов силы, но и
препятствует силе, генерируемой другими мышцами из-за неупругих свойств ( 21,26 ). Диафрагма показала
уменьшение фиброза в MDX: Fit- 1 + / - мышей ( 524,8 ± 43,4 ) по сравнению с контрольными MDX: Fit- 1 + /
+ мышей ( 372,4 ± 34,7 ) ( рис. 4, и D). Кроме того, мембрана в контрольных MDX: Flt- 1 + / + мыши показали
большое накопление кальция, которое можно увидеть макроскопически, которое в основном отсутствует у
MDX: Flt- 1 + / - мышей ( фиг. 4E и F ). Красное окрашивание Ализарином подтвердило, что MDX: Flt- 1 + / имели гораздо меньше отложений кальция, которые также обычно меньше по размеру по сравнению с
контрольными MDX: Flt- 1 + / + мышами. В противоположность этому, как сообщалось ранее (21), фиброз и
кальциноз не так остро проявляются в ПБ мышцах MDX: Flt- 1 + / + мышей ( данные не показаны).
Расположеные в центре ядра (CLN ) в мышечных волокнах являются типичным фенотипическим признаком,
связаным со многими различными типами мышечных дистрофий (21). MDX : Flt1 + / - мыши отображают
50,00 % ± 1,05 волокон, как имеющие CLN по сравнению с контрольными MDX: + / + мышами Flt1 , которые
показали 66,16 % ± 2,06 волокон с CLN (рис. 5а и B). Это значение аналогично тому, что было обнаружено
другими в течение MDX мышей (27). Падение CLN у MDX: Flt1 + / - мышей, также рассматривалось в
диафрагме по сравнению с контрольными MDX: + / + мышами Flt1 ( 31,97 ± 0,77 против 38,01 ± 0,50 ) . Таким
образом, снижение CLN у MDX: Flt1 + / - мышей свидетельствует о понижении дегенерации волокон и
повышенной стабильностью мышечных волокон.
Изменения типа мышечных волокон и развитие гипертрофии были зарегистрированы в MDX мышцах в
качестве компенсации за счет потери
генерирующих силу мощностей существующих мышц. Для
определения окислительного профиля мышц срезы окрашивали НАДH - тетразолия редуктазой (TR) . MDX:
Flt1 + / - мыши ( окислительный : 9,8 ± 2,6 , окислительно- гликолитических : 56,9 ± 0,4 , гликолитических :
33,2 ± 2,5 ) показали увеличение количества окислительных и окислительно- гликолитических волокон и
уменьшение гликолитических волокон по сравнению с контролем MDX : Flt1 + / + мышей ( окислительный :
6,58 ± 0,5 , окислительно- гликолитических : 50,5 ± 1,3 , гликолитический : 42,8 ± 1,7 ) (рис. 5С и D) .
Иммуноокрашивание с использованием антител против изоформ тяжелой цепи миозина ( МНС ) ( 28,29 )
выявило увеличение окислительного типа мышечных волокон ( MDX : Flt1 + / -: 1,74 ± 0,4 , MDX : Flt1 + / + :
0,6 ± 0,2 ) (Дополнительный материал , рис. S1A и B). Мы также обнаружили, что среднее распределение
волокон по размерам диаметра MDX: Flt1 + / - мышей перекошено в сторону меньшего размера волокон (
Дополнительный материал , рис S1C и D ). Это уменьшение размера может быть связано с переключением
типа волокна от гликолитических на окислительный тип.
MDX : Flt1 + / - мыши обнаруживают повышенное кровоснабжение.
Чтобы оценить, насколько произошло увеличение плотности сосудов, увеличение перфузии в скелетных
мышцах , мы измерили поток лазерной доплерографией ( LDF ) в ПБ мышце. Среднее количество единиц
перфузии (ПУ) в соответствии с рекомендациями производителя (рис. 6а) . Flt- 1 + / - ( 54,8 ± 1,2 ) и MDX: Flt1 + / - ( 62,6 ± 4,7 ) показало увеличение потока эритроцитов (RBC) по сравнению с диким типом Flt- 1 + / + (
46,1 ± 1.1) и MDX: Flt- 1 + / + ( 48,1 ± 3,3 ), соответственно. Это согласуется с увеличением плотности
кровеносных сосудов в ПБ мышце и может компенсировать функциональный ишемический фенотип,
наблюдаемый у MDX мышей.
MDX : Fit- 1 + / - мыши обнаруживают улучшенную сократительную функцию мышц.
Чтобы изучить вопрос гистологического улучшения переведенного в функциональное улучшение, измерялась
производство
силы в задней конечности. Максимальный изометрический момент измеряли путем
количественного определения крутящего момента, когда малоберцовый нерв стимулировался для вызова
сокращения передней мышцы голени. Максимальная мощность была нормирована на массу тела мыши. Хотя
не было никакого существенного различия между Fit- 1 + / - ( 101,0 ± 7,2 ) и диким типом Fit- 1 + / + мышей (
100,3 ± 4,9 ), MDX : Fit- 1 + / - мыши (71,7 ± 4.3) генерируют больший крутящий момент по сравнению с
контрольными MDX: Flt- 1 + / + мышами (58,5 ± 4,7 ) (фиг.6В ). Чтобы оценить системное производство силы,
проводили анализ напряжения всего тела у дикого типа Flt- 1 + / +, Flt- 1 + / - , MDX: Flt- 1 + / + и MDX: Flt- 1
+ / - мышей . MDX : Fit- 1 + / - мыши показали улучшение максимальной силы тяги и среднего тягового
усилия (максимум : 73.49 ± 4,85 и среднего : 63.47 ± 4,00 ) по сравнению с контрольными MDX: Fit- 1 + / +
мышами ( максимальной : 62.83 ± 8.88 и средний: 52.52 ± 6.74 ) (рис. 6С и D) . Однако это улучшение было
только скромным по сравнению с силой , создаваемой диким типом Flt- 1 + / + мышей.
Оценка MDX: utrn - / - : Fit- 1 + / - тройных мутантных мышей.
Хотя MDX мыши, генетически схожи с МДД , но они не проявляют патологию с тяжестью МДД . Кроме того,
MDX мышей не показывают существенной разницы в их жизни по сравнению с мышами дикого типа . Одна
из причин относительно мягкого фенотипа MDX мышей является регуляция атрофина, который может
компенсировать недостающие функции дистрофина. MDX мыши, несущие мутации гена атрофина ( utrn - / -)
отображают более тяжелый фенотип, чем у MDX мышей ( 23,30 ) . Эти мыши обнаруживают заметный кифоз
и обычно умирают в течение 5 месяцев. Таким образом, они служат в качестве лучшей животной модели для
МДД. Так как мы не обнаружили различий в размере атрофина между MDX: Fit- 1 + / - и MDX : Fit- 1 + / +
мышей с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3C и Е ) , мы приступили к созданию тройного мутанта MDX: utrn
- / - : Fit- 1 + / - и контроля MDX : utrn - / - : Fit- 1 + / +. MDX: utrn - / -: Flt- 1 + / - мыши были
жизнеспособными, и потомство имело ожидаемое менделевское соотношение (данные не показаны ). Потеря
дистрофина и атрофина приводит к очень тяжелому мышечному фенотипу с очень высоким содержанием
соединительной ткани. Однако гистологические оценки ПБ мышцы показало уменьшение количества CLN у
MDX: utrn - / -: Flt- 1 + / - мышей ( 73,28 ± 1,94 ) по сравнению с контрольными MDX: utrn - / -: Flt- 1 + / + (
85.09 ± 1.99 )-животными (рис. 7 , б). MDX: utrn - / -: Flt- 1 + / - мыши также продемонстрировали
значительное увеличение массы тела по сравнению с контрольной MDX: utrn - / -: Flt- 1 + / + мышей ( фиг. 7С)
.
Важно отметить, что средняя продолжительность жизни MDX: utrn - / - : Fit- 1 + / - мышей была значительно
увеличена ( 177,88 дней ± 17,60 ) по сравнению с контрольными MDX: utrn - / - : Fit- 1 + / + мышами ( 91,76
дней ± 10,22 ) (рис. 7D и Е). Оба генотипа стабильны в течение всего 30-50 дней, после чего MDX : utrn -/ - :
Fit- 1 + / + мыши показывают резкое снижение жизнеспособности по сравнению с более постепенной
летальностью MDX: utrn - / - : FLT- 1 + / - мышей. Тестом на выживание Каплана-Мейера показал
значительную разницу между двумя генотипами ( рис. 7D). Эти данные убедительно свидетельствуют, что Fit1 + / - фон ослабляет фенотип мышечной дистрофии MDX: utrn - / - дважды мутантных мышей , чтобы
продлить их срок жизни, возможно, за счет увеличения плотности сосудов. Взятые вместе, эти данные
показывают, что сразвитие увеличения ангиогенеза и сосудистой плотности может частично улучшить
дистрофический фенотип вумодельных мышей с МДД.
Не было изменений в воспалительной реакции у MDX: Fit- 1 + / - мышей.
Воспаление, как известно, способствует мышечному заживлению и регенерации. Кроме того, сообщается, что
Flt- 1 также экспрессируется в макрофагах (31). Таким образом, мы сравнили степень воспаления в ПБ
мышце, выделенной из MDX: Fit- 1 + / - мыши и контрольных MDX : Fit- 1 + / + мышей. Иммуноокрашивание
для Mac -1 ( маркером моноцитов и макрофагов ) и GR-1 (маркера для моноцитов и гранулоцитов ) показало,
что не было никакого существенного различия в количестве клеток воспаления , которые наблюдались в ПБ
мышцах между MDX: Fit- 1 + / - мышами и контролем MDX: Fit- 1 + / + (Дополнительный материал , рис S2 .
). Спутниковые клетки являются негативными для VEGF рецепторов Flt- 1 и Flk- 1. Несколько сообщений
рассказывают, что распространение спутниковых клеток и миграцию клеток под влиянием VEGF , возможно,
через его рецепторы, Flk- 1 и Flt- 1 (15). Для выяснения того, что сателлитные клетки могут экспрессировать
FLT-1 и FLK- 1 и изучить любые потенциальные клеточные автономные эффекты, мы сначала характеризуем
экспрессию LacZ в мышцах Fit- 1 + / - ( Fit- 1- LacZ ) (14) , Flk -1- LacZ (32) и Myf5 + / nLacZ мышей (33,34) .
Эта экспрессия LacZ резюмирует эндогенную экспрессию FLT- 1 , Flk- 1 и Myf5. Очевидно, что LacZ позитивные клетки были обнаружены вокруг сосудов, расположеных за пределами ламинин-положительной
базальной пластинки мышечных волокон у Flt -1- LacZ и мышей Flk -1- LacZ ( Дополнительный материал ,
рис. S3A ) . В противоположность этому, LacZ -позитивные клетки-сателлиты были обнаружены в ламинин положительной базальной пластинке мышечных волокон у мышей Myf5 + / nLacZ , указывая, что покоящиеся
клетки-сателлиты и мышечные волокна не экспрессируют FLT-1 или Flk- 1 (Дополнительный материал , рис.
S3A ) . Далее, мы выделили мышечные волокна и от FLT-1 -LacZ и от Flk -1- LacZ мышей наряду с контролем
Myf5 + / nLacZ ( Дополнительный материал , рис. S3B ). Как и ожидалось, спутниковые клетки начали
пролиферировать на 2-й день и на 5 день ( 35 ). Тем не менее, ни одна из культур от FLT-1 -LacZ или мышей
Flk -1- LacZ не окрашивались позитивно на LacZ, указывая , что нет ни спутниковых клеток в покое, ни
клеток , экспрессирюющих FLT- 1 или FLK- 1. Кроме того, ни одна из мышечных трубок
дифференцированных из миобластов, выделенных из FLT-1 -LacZ и мышей Flk -1- LacZ не окрашивались
позитивно на LacZ. В противоположность этому, клетки-сателлиты и полученные спутниковые миобласты
имели явно положительный результат при окрашивании на LacZ в культурах мышей Myf5 + / nLacZ . Кроме
того, иммунное окрашивание ясно показало, что десмин -позитивные миобласты отрицательны для Flt -1 или
FLK- 1 , тогда как человеческие эндотелиальные клетки пупочной вены ( HUVECs ) положительны на наличие
обоих рецепторов ( дополнительный материал , рис. S3C ). Таким образом, эти результаты сильно указали, что
неклеточные автономные эффекты улучшили фенотип мышц у MDX: Fit- 1 + / - мышей.
Увеличение распространения миогенных клеток-предшественников в повышенной сосудистой нише.
Эксперименты с мышечными волокнами исключили возможность , что гетерозиготные Fit- 1 клетки
автономно влияют на происхождение пролиферации миогенных предшественников спутниковых клеток или
дифференциацию. Мышцы MDX мышей способны эффективно восстановиться на ранних стадиях в связи с
распространением сателлитных клеток в бассейне. Тем не менее, по мере старения мышц, количество
спутниковых клеток уменьшается, что приводит к нарушению регенерации мышц (28). Чтобы исследовать,
влияет ли количество спутниковых клеток и клеток-предшественников на MDX: Flt- 1 + / - мышей по
сравнению с контрольными MDX: Flt- 1 + / + мышами, мы провели анализ FACS диссоциированных клеток
из ПБ мышц ( рис. 8, а и б). Интересно, что хотя общее количество SM/C-2.6 + сателлитных клеток и
миогенных клеток -предшественников, выделенных из ПБ мышцы Flt- 1 + / - мышей, не показали
значительной разницы по сравнению диким типом Flt- 1 + / + мышей, эти клеточные популяции были заметно
увеличены у MDX: Flt- 1 + / - мышей по сравнению с контрольными MDX: Flt- 1 + / + мышами. Увеличение
числа Pax7 + сателлитных клеток , расположенных под базальной пластинкой ( ламинином +) у MDX: Fit- 1 +
/ - мышей были также обнаружены в мышечных секциях ПБ мышце ( рис. 8 и D). Таким образом, вполне
возможно, что повышение сосудистой ниши может способствовать пролиферации и / или выживанию
миогенных клеток предшественников.
ОБСУЖДЕНИЕ
Хотя в настоящее время нет эффективных терапевтических возможностей для пациентов с МДД , есть много
перспективных активных областей исследований ( 37,38 ). Большинство из этих вариантов сосредоточены на
восстановлении механической стабильности
мышцы путем клеточной терапии , генной терапии или
сочетания того и другого. Недавно было показано, что смягчение проблем, связанных с сосудистым
снабжением у MDX мышей может существенно улучшить дистрофический фенотип ( 5,12,19 ) . Однако
взаимосвязь развития между ангиогенезом и мышечным фенотипом дистрофии предстоит выяснить. В этом
докладе мы стремились компенсировать функциональную ишемию в мышцах мышей с МДД при помощи
увеличения плотности уровня развития сосудов. Мы обнаружили, что Flt- 1 + / - мыши, а также MDX: Flt- 1
+ / - мыши показывают повышенную плотность кровеносных сосудов в мышцах по
сравнению с контролем Flt- 1 + / + или MDX: Flt- 1 + / + мышами. Увеличение плотности кровеносных
сосудов приводит к увеличению перфузии крови в мышцах и улучшения мышечного гистологического
фенотипа, как следствие улучшение сократительной функции мышц. Одновременно это также привело к
увеличению выживаемости и улучшению мышечной гистологии у MDX: utrn - / - : Fit- 1 + / - в сочетании с
тройными мутантными мышами по сравнению с контрольными MDX: utrn - / - : FLT- 1 + / + двойными
мутантными мышами. Насколько нам известно, это исследование является первым, показывающим, что с
развитием увеличения ангиогенеза и тем самым, увеличения сосудистой плотности, может частично
уменьшится дистрофический фенотип у мышей с МДД . Потенциальные механизмы включают (I) снижение
воспалительной реакции, (II) автономные эффекты клеток, (III) уменьшение ишемии путем увеличения
перфузии ткани или (IV) расширение взаимодействия сосудистой сети для
увеличения пролиферации
спутниковых клеток и / или защиты от повреждения мышц. Сообщалось также , что , чтобы освободить место
для новых мышечных волокон , повреждение мышц сопровождается приходом макрофагов , чтобы убрать
продукты распада клеток , оставленные поврежденной мышечной тканью ( 39-42 ) . Тем не менее, мы не
нашли никакого существенного различия в численности Mac-1 + - или GR-1 + - клеток проникающих в
мышцу MDX: Fit- 1 + / - по сравнению с контрольной MDX: Fit- 1 + / + мышей. Так как наша система
модулирует экспрессию FLT- 1 , важно исследовать воздействие на автономные мышечные волокна и
миогенные клетки-предшественники. Во-первых, срезы мышц показали, что Flt- 1 - или Flk -1экспрессирующие клетки расположены за пределами базальной пластинки мышечных волокон. Мы также
решили исследовать экспрессию и спутниковым клеток , и полученных миобластов, и культур мышечных
волокон, так как возможно получить чистые популяции спутниковых клеток с помощью этого метода. При
иммунологическом обнаружении LacZ у мышей , наши данные ясно показывают, что мышечные волокна ,
спутниковые клетки и полученные миобласты не экспрессируют FLT-1 и FLK- 1. Это означает, что нет
никаких автономных клеточных эффектов на мышечные волокна или миогенные клетки-предшественники
посредством этих рецепторов в нашей системе. Важно отметить, что увеличение плотности кровеносных
сосудов у Fit- 1 + / - и MDX : Fit- 1 + / - мышей также переведены на увеличение LDF в состоянии покоя. Во
время отдыха скелетным мышцам не хватает полной перфузии из-за отсутствия полного набора микрососудов
(44). Это набор микрососудов был рассмотрен во время физических упражнений , а также во время инфузии
инсулина. Во время мышечной деятельности NOS- опосредованная вазодилатация может увеличить градиент
пассивного давления в капиллярах, таким образом, увеличивая работу микроциркуляторного русла и
повышая тканевую перфузию ( 45,46 ). Ишемия, созданная в связи с отсутствием такого расширения сосудов
при сокращении, является прямой причиной повреждения мышечных волокон в естественных условиях у
MDX мышей (12). Таким образом, увеличение базального кровотока обнаруженного в наших моделях
мышечной дистрофии может предложить защитный механизм для сокращения повреждения (43). Увеличение
производства эндотелиальных клеток в мышцах может иметь множество различных благотворных эффектов
на дистрофические мышцы через паракринную стимуляцию, защищая поврежденные мышечные волокона и
активируя миогенные клетки-предшественники. Многочисленные отчеты показали, перекрестные помехи
между эндотелиальными клетками и клетками-сателлитами (19,47,48 ). Наши результаты, а также другие
показали, что эндотелиальные клетки и факторы, производимые в них могут выступить посредником ответа
на выживание спутниковых клеток и пролиферацию(18,47,48). Это в соответствии с нашими экспериментами
с культурами, которые показывают увеличение пролиферации клеток, полученных спутниковых миобластов,
когда их совместно культивировали с эндотелиальными клетками. Недавно Христов и др. . (47) показали, что
клетки-сателлиты преимущественно расположены рядом с капиллярами. Так как наша модель увеличивает
количество капилляров, находящихся в мышцах, что может эффективно увеличить количество сосудистых
ниш. В этом докладе мы показываем , что число сателлитных клеток и миогенных клеток-предшественников
заметно увеличивается у MDX: Fit- 1 + / - мышей по сравнению с контрольными MDX: Fit- 1 + / + мышами.
Это увеличение числа спутниковых клеток и миогенных клеток-предшественников могут быть ответственны
за фенотип MDX: Flt- 1 + / - мышей. Данное исследование показывает, что увеличение ангиогенеза может
быть новым подходом для улучшения некоторых дистрофинопатий и функциональных параметров,
связанных с МДД, которые можно использовать в конъюнктуре с другими стратегиями. Например,
внутримышечная инъекция VEGF, содержащие рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы ,
как было показано , чтобы функциональные и гистологическое улучшение в ишемических мышцах и
мышцах MDX (19,49,50). Это улучшение видно в сочетании с увеличением ангиогенеза в мышце. Ито и др. (5)
также показали важность отсутствия дистрофина в гладких мышцах сосудов. Они показали, что экспрессия
дистрофина в гладкомышечных клетках MDX мышей привело к частичному улучшению фенотипа мышц.
Важно понять, как васкуляризация взаимодействовует с мышечными волокнами и мышечными стволовыми
клетками, чтобы обеспечить необходимый кислород и питание, защищать от гибели клетки и обеспечивают
сосудистую нишу. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить точный механизм и
долгосрочные последствия увеличения васкуляризации. С терапевтической точки зрения, неоваскуляризация
может быть индуцирована в дистрофических мышцах с использованием введения ангиогенных факторов,
таких как VEGF белок.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Ссылки
↵ Dalkilic I., Kunkel L.M. Muscular dystrophies: genes to pathogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 2003;13:231238. doi:10.1016/S0959-437X(03)00048-0. CrossRef Medline Web of Science
↵ Davies K.E., Nowak K.J. Molecular mechanisms of muscular dystrophies: old and new players. Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 2006;7:762-773. doi:10.1038/nrm2024. CrossRef Medline Web of Science
↵ Mendell J.R., Engel W.K., Derrer E.C. Duchenne muscular dystrophy: functional ischemia reproduces its
characteristic lesions. Science 1971;172:1143-1145. doi:10.1126/science.172.3988.1143. Abstract/FREE Full
Text
↵ Miyatake M., Miike T., Zhao J., Yoshioka K., Uchino M., Usuku G. Possible systemic smooth muscle layer
dysfunction due to a deficiency of dystrophin in duchenne muscular dystrophy. J. Neurol. Sci. 1989;93:11-17.
doi:10.1016/0022-510X(89)90157-3. CrossRef Medline Web of Science
↵ Ito K., Kimura S., Ozasa S., Matsukura M., Ikezawa M., Yoshioka K., Ueno H., Suzuki M., Araki K., Yamamura
K., et al. Smooth muscle-specific dystrophin expression improves aberrant vasoregulation in mdx mice. Hum.
Mol. Genet. 2006;15:2266-2275. doi:10.1093/hmg/ddl151. Abstract/FREE Full Text
↵ Cullen M.J., Jaros E. Ultrastructure of the skeletal muscle in the X chromosome-linked dystrophic (mdx)
mouse: comparison with duchenne muscular dystrophy. Acta Neuropathol. 1988;77:69-81.
doi:10.1007/BF00688245. CrossRef Medline
↵ Loufrani L., Levy B.I., Henrion D. Defect in microvascular adaptation to chronic changes in blood flow in
mice
lacking
the
gene
encoding
for
dystrophin.
Circ.
Res.
2002;91:1183-1189.
doi:10.1161/01.RES.0000047505.11002.81. Abstract/FREE Full Text
↵ Loufrani L., Matrougui K., Gorny D., Duriez M., Blanc I., Levy B.I., Henrion D. Flow (shear stress)-induced
endothelium-dependent dilation is altered in mice lacking the gene encoding for dystrophin. Circulation
2001;103:864-870. Abstract/FREE Full Text
↵ Weir A.P., Burton E.A., Harrod G., Davies K.E. A- and B-utrophin have different expression patterns and are
differentially
up-regulated
in
mdx
muscle.
J.
Biol.
Chem.
2002;277:45285-45290.
doi:10.1074/jbc.M205177200. Abstract/FREE Full Text
↵ Coral-Vazquez R., Cohn R.D., Moore S.A., Hill J.A., Weiss R.M., Davisson R.L., Straub V., Barresi R., Bansal D.,
Hrstka R.F., et al. Disruption of the sarcoglycan–sarcospan complex in vascular smooth muscle: a novel
mechanism for cardiomyopathy and muscular dystrophy. Cell 1999;98:465-474. doi:10.1016/S00928674(00)81975-3. CrossRef Medline Web of Science
↵ Rando T.A. Role of nitric oxide in the pathogenesis of muscular dystrophies: a ‘two hit’ hypothesis of the
cause of muscle necrosis. Microsc. Res. Tech. 2001;55:223-235. doi:10.1002/jemt.1172. CrossRef Medline
Web of Science
↵ Asai A., Sahani N., Kaneki M., Ouchi Y., Martyn J.A., Yasuhara S.E. Primary role of functional ischemia,
quantitative evidence for the two-hit mechanism, and phosphodiesterase-5 inhibitor therapy in mouse
muscular dystrophy. PLoS ONE 2007;2:e806. doi:10.1371/journal.pone.0000806. CrossRef Medline
↵ Fong G.H., Rossant J., Gertsenstein M., Breitman M.L. Role of the flt-1 receptor tyrosine kinase in
regulating the assembly of vascular endothelium. Nature 1995;376:66-70. doi:10.1038/376066a0. CrossRef
Medline
↵ Fong G.H., Zhang L., Bryce D.M., Peng J. Increased hemangioblast commitment, not vascular
disorganization, is the primary defect in flt-1 knock-out mice. Development 1999;126:3015-3025. Abstract
↵ Ferrara N., Gerber H.P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat. Med. 2003;9:669-676.
doi:10.1038/nm0603-669. CrossRef Medline Web of Science
↵ Kearney J.B., Ambler C.A., Monaco K.A., Johnson N., Rapoport R.G., Bautch V.L. Vascular endothelial
growth factor receptor flt-1 negatively regulates developmental blood vessel formation by modulating
endothelial cell division. Blood 2002;99:2397-2407. doi:10.1182/blood.V99.7.2397. Abstract/FREE Full Text
↵ Springer M.L., Ozawa C.R., Banfi A., Kraft P.E., Ip T.K., Brazelton T.R., Blau H.M. Localized arteriole
formation directly adjacent to the site of VEGF-induced angiogenesis in muscle. Mol. Ther. 2003;7:441-449.
doi:10.1016/S1525-0016(03)00010-8. CrossRef Medline Web of Science
↵ Arsic N., Zacchigna S., Zentilin L., Ramirez-Correa G., Pattarini L., Salvi A., Sinagra G., Giacca M. Vascular
endothelial growth factor stimulates skeletal muscle regeneration in vivo. Mol. Ther. 2004;10:844-854.
doi:10.1016/j.ymthe.2004.08.007. CrossRef Medline Web of Science
↵ Messina S., Mazzeo A., Bitto A., Aguennouz M., Migliorato A., De Pasquale M.G., Minutoli L., Altavilla D.,
Zentilin L., Giacca M., et al. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal
muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 2007;21:3737-3746.
doi:10.1096/fj.07-8459com. Abstract/FREE Full Text
20. ↵ Coulton G.R., Curtin N.A., Morgan J.E., Partridge T.A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy. II.
Contractile properties. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1988;14:299-314. doi:10.1111/j.13652990.1988.tb00890.x. Medline Web of Science
21. ↵ Coulton G.R., Morgan J.E., Partridge T.A., Sloper J.C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy. I. A
histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1988;14:53-70.
doi:10.1111/j.1365-2990.1988.tb00866.x. Medline Web of Science
22. ↵ Danko I., Chapman V., Wolff J.A. The frequency of revertants in mdx mouse genetic models for Duchenne
muscular dystrophy. Pediatr. Res. 1992;32:128-131. Medline Web of Science Search Google Scholar
23. ↵ Deconinck A.E., Rafael J.A., Skinner J.A., Brown S.C., Potter A.C., Metzinger L., Watt D.J., Dickson J.G.,
Tinsley J.M., Davies K.E. Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy.
Cell 1997;90:717-727. doi:10.1016/S0092-8674(00)80532-2. CrossRef Medline Web of Science
24. ↵ Matsuda R., Nishikawa A., Tanaka H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital
staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J. Biochem. (Tokyo)
1995;118:959-964. Abstract/FREE Full Text
25. ↵ Hamer P.W., McGeachie J.M., Davies M.J., Grounds M.D. Evans blue dye as an in vivo marker of myofibre
damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J. Anat. 2002;200:6979. doi:10.1046/j.0021-8782.2001.00008.x. CrossRef Medline Web of Science
26. ↵ Suelves M., Vidal B., Serrano A.L., Tjwa M., Roma J., Lopez-Alemany R., Luttun A., de Lagran M.M., DiazRamos A., Jardi M., et al. uPA deficiency exacerbates muscular dystrophy in MDX mice. J. Cell Biol.
2007;178:1039-1051. doi:10.1083/jcb.200705127. Abstract/FREE Full Text
27. ↵ Pastoret C., Sebille A. Mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age. J. Neurol.
Sci. 1995;129:97-105. doi:10.1016/0022-510X(94)00276-T. CrossRef Medline Web of Science
28. ↵ Brack A.S., Bildsoe H., Hughes S.M. Evidence that satellite cell decrement contributes to preferential
decline in nuclear number from large fibres during murine age-related muscle atrophy. J. Cell. Sci.
2005;118:4813-4821. doi:10.1242/jcs.02602. Abstract/FREE Full Text
29. ↵ Maggs A.M., Taylor-Harris P., Peckham M., Hughes S.M. Evidence for differential post-translational
modifications of slow myosin heavy chain during murine skeletal muscle development. J. Muscle Res. Cell.
Motil. 2000;21:101-113. doi:10.1023/A:1005639229497. CrossRef Medline Web of Science
30. ↵ Grady R.M., Teng H., Nichol M.C., Cunningham J.C., Wilkinson R.S., Sanes J.R. Skeletal and cardiac
myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell
1997;90:729-738. doi:10.1016/S0092-8674(00)80533-4. CrossRef Medline Web of Science
31. ↵ Sawano A., Iwai S., Sakurai Y., Ito M., Shitara K., Nakahata T., Shibuya M. Flt-1, vascular endothelial growth
factor receptor 1, is a novel cell surface marker for the lineage of monocyte-macrophages in humans. Blood
2001;97:785-791. doi:10.1182/blood.V97.3.785. Abstract/FREE Full Text
32. ↵ Ema M., Takahashi S., Rossant J. Deletion of the selection cassette, but not cis-acting elements, in targeted
Flk1-lacZ allele reveals Flk1 expression in multipotent mesodermal progenitors. Blood 2006;107:111-117.
doi:10.1182/blood-2005-05-1970. Abstract/FREE Full Text
33. ↵ Tajbakhsh S., Rocancourt D., Buckingham M. Muscle progenitor cells failing to respond to positional cues
adopt non-myogenic fates in myf-5 null mice. Nature 1996;384:266-270. doi:10.1038/384266a0. CrossRef
Medline Web of Science
34. ↵ Beauchamp J.R., Heslop L., Yu D.S., Tajbakhsh S., Kelly R.G., Wernig A., Buckingham M.E., Partridge T.A.,
Zammit P.S. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite
cells. J. Cell Biol. 2000;151:1221-1234. doi:10.1083/jcb.151.6.1221. Abstract/FREE Full Text
35. ↵ Shefer G., Yablonka-Reuveni Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze
satellite cells. Methods Mol. Biol. 2005;290:281-304. Medline Search Google Scholar
36. ↵ Fukada S., Higuchi S., Segawa M., Koda K., Yamamoto Y., Tsujikawa K., Kohama Y., Uezumi A., Imamura M.,
Miyagoe-Suzuki Y., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from
murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 2004;296:245-255.
doi:10.1016/j.yexcr.2004.02.018. CrossRef Medline Web of Science
37. ↵ Cossu G., Sampaolesi M. New therapies for Duchenne muscular dystrophy: challenges, prospects and
clinical trials. Trends Mol. Med. 2007;13:520-526. doi:10.1016/j.molmed.2007.10.003. CrossRef Medline
Web of Science
38. ↵ O'Brien K.F., Kunkel L.M. Dystrophin and muscular dystrophy: past, present, and future. Mol. Genet.
Metab. 2001;74:75-88. doi:10.1006/mgme.2001.3220. CrossRef Medline Web of Science
39. ↵ Sato K., Yokota T., Ichioka S., Shibata M., Takeda S. Vasodilation of intramuscular arterioles under shear
stress in dystrophin-deficient skeletal muscle is impaired through decreased nNOS expression. Acta Myol.
2008;27:30-36. Medline Search Google Scholar
40. Wehling M., Spencer M.J., Tidball J.G. A nitric oxide synthase transgene ameliorates muscular dystrophy in
mdx mice. J. Cell Biol. 2001;155:123-131. doi:10.1083/jcb.200105110. Abstract/FREE Full Text
41. Wehling-Henricks M., Lee J.J., Tidball J.G. Prednisolone decreases cellular adhesion molecules required for
inflammatory cell infiltration in dystrophin-deficient skeletal muscle. Neuromuscul. Disord. 2004;14:483-490.
CrossRef Medline Web of Science Search Google Scholar
42. ↵ Barleon B., Sozzani S., Zhou D., Weich H.A., Mantovani A., Marme D. Migration of human monocytes in
response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood
1996;87:3336-3343. Abstract/FREE Full Text
43. ↵ Deasy B.M., Feduska J.M., Payne T.R., Li Y., Ambrosio F., Huard J. Effect of VEGF on the regenerative
capacity of muscle stem cells in dystrophic skeletal muscle. Mol. Ther. 2009;17:1788-1798.
doi:10.1038/mt.2009.136. CrossRef Medline Web of Science
44. ↵ Dawson D., Vincent M.A., Barrett E.J., Kaul S., Clark A., Leong-Poi H., Lindner J.R. Vascular recruitment in
skeletal muscle during exercise and hyperinsulinemia assessed by contrast ultrasound. Am. J. Physiol.
Endocrinol. Metab. 2002;282:E714-E720. Abstract/FREE Full Text
45. ↵ Lindbom L. Microvascular blood flow distribution in skeletal muscle. An intravital microscopic study in the
rabbit. Acta Physiol. Scand. Suppl. 1983;525:1-40. Medline Search Google Scholar
46. ↵ Crosbie R.H. NO vascular control in Duchenne muscular dystrophy. Nat. Med. 2001;7:27-29.
doi:10.1038/83309. CrossRef Medline Web of Science
47. ↵ Christov C., Chretien F., Abou-Khalil R., Bassez G., Vallet G., Authier F.J., Bassaglia Y., Shinin V., Tajbakhsh
S., Chazaud B., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Mol.
Biol. Cell 2007;18:1397-1409. doi:10.1091/mbc.E06-08-0693. Abstract/FREE Full Text
48. ↵ Germani A., Di Carlo A., Mangoni A., Straino S., Giacinti C., Turrini P., Biglioli P., Capogrossi M.C. Vascular
endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function. Am. J. Pathol. 2003;163:1417-1428.
Medline Web of Science Search Google Scholar
49. ↵ Yan H., Guo Y., Zhang P., Zu L., Dong X., Chen L., Tian J., Fan X., Wang N., Wu X., et al. Superior
neovascularization and muscle regeneration in ischemic skeletal muscles following VEGF gene transfer by
rAAV1
pseudotyped
vectors.
Biochem.
Biophys.
Res.
Commun.
2005;336:287-298.
doi:10.1016/j.bbrc.2005.08.066. CrossRef Medline Web of Science
50. ↵ Borselli C., Storrie H., Benesch-Lee F., Shvartsman D., Cezar C., Lichtman J.W., Vandenburgh H.H., Mooney
D.J. Functional muscle regeneration with combined delivery of angiogenesis and myogenesis factors. Proc.
Natl Acad. Sci. USA 2005;107:3287-3292. doi:10.1073/pnas.0903875106. CrossRef
51. ↵ Asakura A., Lyons G.E., Tapscott S.J. The regulation of MyoD gene expression: conserved elements mediate
expression in embryonic axial muscle. Dev. Biol. 1995;171:386-398. doi:10.1006/dbio.1995.1290. CrossRef
Medline Web of Science
52. ↵ Abramoff M.D., Magelhaes P.J., Ram S.J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 2004;11:36-42.
Search Google Scholar
53. ↵ Baltgalvis K.A., Call J.A., Nikas J.B., Lowe D.A. Effects of prednisolone on skeletal muscle contractility in mdx
mice. Muscle Nerve 2009;40:443-454. doi:10.1002/mus.21327. CrossRef Medline Web of Science
54. ↵ Sonnemann K.J., Fitzsimons D.P., Patel J.R., Liu Y., Schneider M.F., Moss R.L., Ervasti J.M. Cytoplasmic
gamma-actin is not required for skeletal muscle development but its absence leads to a progressive
myopathy. Dev. Cell. 2006;11:387-397. doi:10.1016/j.devcel.2006.07.001. CrossRef Medline Web of Science
55. ↵ Clark A.D., Youd J.M., Rattigan S., Barrett E.J., Clark M.G. Heterogeneity of laser Doppler flowmetry in
perfused muscle indicative of nutritive and nonnutritive flow. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.
2001;280:H1324-H1333. Abstract/FREE Full Text
56. ↵ Asakura A., Komaki M., Rudnicki M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit
myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation 2001;68:245-253. doi:10.1046/j.14320436.2001.680412.x. CrossRef Medline Web of Science
57. ↵ Asakura A., Rudnicki M.A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro
hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 2002;30:1339-1345. doi:10.1016/S0301-472X(02)00954-2.
CrossRef Medline Web of Science
58. ↵ Asakura A., Hirai H., Kablar B., Morita S., Ishibashi J., Piras B.A., Christ A.J., Verma M., Vineretsky K.A.,
Rudnicki M.A. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into
regenerating
skeletal
muscle.
Proc.
Natl
Acad.
Sci.
USA
2007;104:16552-16557.
doi:10.1073/pnas.0708145104. Abstract/FREE Full Text
59. ↵ Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A., Seale P., Asakura A., Rudnicki M.A. Reduced differentiation potential of
primary MyoD−/− myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 1999;144:631-643.
doi:10.1083/jcb.144.4.631. Abstract/FREE Full Text
60. ↵ Thompson L.V., Durand D., Fugere N.A., Ferrington D.A. Myosin and actin expression and oxidation in aging
muscle. J. Appl. Physiol. 2006;101:1581-1587. doi:10.1152/japplphysiol.00426.2006. Abstract/FREE Full Tex
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
Оригинал статьи: http://hmg.oxfordjournals.org/content/19