На правах рукописи 14.00.15 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ
advertisement
На правах рукописи Павлов Константин Анатольевич ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОДИСПЛАЗИЙ МЯГКИХ ТКАНЕЙ 14.00.15 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в ФГУ «Институт хирургии имени А.В. Вишневского Росмедтехнологий» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Щёголев Александр Иванович Научный консультант: доктор биологических наук Чекмарёва Ирина Александровна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Серов Роман Андреевич доктор медицинских наук, профессор Черняев Андрей Львович Ведущая организация: НИИ морфологии человека РАМН Защита состоится «21» декабря 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1. Автореферат разослан «10» ноября 2009 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета (117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1) Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 2 Щёголев А.И. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ангиодисплазии мальформации, врожденные пороки развития (сосудистые сосудов) являются результатом нарушения формирования сосудов в эмбриогенезе. Частота их колеблется от 0,3% до 5,4% (в среднем 2,6%) среди пациентов с заболеваниями периферических сосудов, госпитализированных в специализированные отделения [Garzon M.C., 2007а; Liapis C. D. et al., 2007; Дан В.Н., 2008]. При этом реальная заболеваемость сосудистыми мальформациями, видимо, несколько выше, так как в части наблюдений они ошибочно диагностируются как сосудистые опухоли, в частности, гемангиомы [Sangüeza O.P., 2003]. Ангиодисплазии представляют один из наиболее сложных видов сосудистой патологии, характеризующиеся большим разнообразием как морфологических, так и клинических проявлений, и нередко приводящие к развитию серьезных осложнений [Милованов А.П., 1978; Sangueza O.P. et al., 2003; Garzon M.C. et al., 2007б]. В последнее время среди специалистов, занимающихся вопросами диагностики и лечения ангиодисплазий, заметно возрос интерес к данной патологии, что обусловлено как большим желанием понять и объяснить патогенетические основы заболевания на более тонком уровне, так и желанием максимально использовать возможности современной медицины для разработки стратегии диагностики и лечебной тактики [Ферзаули А.Н., 2002; Tille J.C. et al., 2004; Дан В.Н., 2008; Limaye N. et al., 2009]. В настоящее время разработаны и используются различные классификации сосудистых мальформаций, прежде всего прикладные и узкоспециальные [Enjolras O. et al., 2007, Lee B.B. et al., 2007], критерии их лучевой диагностики [Ситников А.В., 2002; Галактионова Л.А., 2007], а также множество методов хирургического и консервативного лечения заболеваний данной группы [Куликов С.В., 2001; Дан В.Н., 2008; Garzon 3 M.C., 2007; Liapis C. D. et al., 2007]. При этом лечение больных с врожденными пороками развития сосудов до сих пор считается одним из самых сложных разделов сосудистой хирургии [Mattassi R. et al., 2009]. Важно отметить, что, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в изучении заболеваний этой группы, все еще отсутствует единое мнение специалистов по вопросам выбора тактики и рациональных сроков оперативного вмешательства при ангиодисплазиях, мало известно о причинах их возникновения и патогенезе, нет полного согласия специалистов в вопросах терминологии, не создана единая универсальная классификация данных образований, отсутствуют четкие и общепринятые критерии их дифференциальной диагностики, в том числе с новообразованиями [Дан В.Н., 2008; Мишнёв О.Д. и др., 2008; Mattassi R. et al., 2009]. Во многом сложившаяся ситуация обусловлена недостаточной изученностью морфологических особенностей сосудистых мальформаций разных типов, неполным знанием роли различных ангиогенных медиаторов и их взаимодействия в патогенезе ангиодисплазий, а также практически полным отсутствием четких и детальных описаний особенностей морфологической картины заболевания в целом и в зависимости от применяемых методов лечения. Цель исследования: провести сравнительное морфологическое изучение венозных и артериовенозных ангиодисплазий мягких тканей. Задачи исследования: 1. При помощи гистологических методов исследования провести сравнительное изучение артериовенозных и венозных форм ангиодисплазий. 2. Изучить ультраструктурные особенности строения артериовенозных и венозных ангиодисплазий. 3. При помощи иммуногистохимических методов исследования изучить особенности эндотелиальных клеток ангиодисплазий и гемангиом, а 4 также выявить возможные молекулярные нарушения в клетках этих образований. 4. Провести сопоставление морфологических данных с результатами иммуноферментного анализа гомогенатов ангиодисплазий. 5. Изучить возможности иммуногистохимических методов для дифференциальной диагностики ангиодисплазий и гемангиом. Научная новизна Впервые на большом объеме операционного материала изучены гистологические характеристики артериовенозных и венозных мальформаций мягких тканей. Впервые детально исследованы ультраструктурные особенности различных видов ангиодисплазий мягких тканей. Впервые изучена экспрессия основных ангиогенных факторов роста: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и его рецептора, и маркеров пролиферации (Ki-67, нестин) в эндотелиоцитах сосудистых мальформаций мягких тканей. Проведен сравнительный анализ гистологических и иммуногистохимических изменений ангиодисплазий и гемангиом. Практическая значимость Установленные морфологические иммуногистохимические, ультраструктурные) (гистологические, особенности строения ангиодисплазий подчеркивают значимость и необходимость комплексного изучения биопсийного и операционного материала больных. В результате исследования получены новые данные о патогенезе, морфогенезе, а также иммунофенотипе сосудистых мальформаций мягких тканей. Предложены новые дополнительные морфологические, в том числе иммуногистохимические, критерии для дифференциальной диагностики ангиодисплазий и гемангиом. 5 Результаты исследований могут быть использованы для разработки таргетной терапии сосудистых мальформаций мягких тканей. Внедрение результатов работы Результаты исследования используются в практической работе отдела патологической анатомии Института хирургии имени А.В. Вишневского Росмедтехнологий. Полученные данные о морфологических особенностях сосудистых мальформаций используются в материалах лекций и практических занятий со студентами и ординаторами на кафедре патологической анатомии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета. Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на XII ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2008); 20-ом Международном конгрессе по изучению тромбоза International Congress on Thrombosis (Афины, Греция, 2008); Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии ВМА им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2009); XIII ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2009); III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), 22-ом Европейском конгрессе патологов (Флоренция, Италия, 2009). Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Опубликованные работы содержат полный объем информации, касающийся темы диссертации. Объем и структура работы Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами, 9 диаграммами и 52 рисунками. Работа 6 состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 24 отечественных и 116 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа основана на морфологическом изучении операционного материала 109 пациентов, находившихся на лечении в Институте хирургии имени А.В. Вишневского в период с 2004 по 2008 год и оперированных по поводу ангиодисплазий мягких тканей периферической локализации. У 12 больных в предоперационном периоде проводилась рентгеноэндоваскулярная окклюзия гидрогелем (эмболами) в виде сфер (диаметр 0,4-0,6 мм) или цилиндров (диаметр 0,5-0,75 мм, длина 10-15 мм). Отбор и систематизацию клинического материала проводили на основе совместного с клиницистами (проф. В.Н. Дан, д.м.н. С.В. Сапёлкин) изучения данных историй болезни и результатов комплексного морфологического изучения операционного материала. Установление вида сосудистого поражения производилось на основании результатов морфологического исследования и данных клинико-инструментальных исследований, включающих УЗИ, компьютерную томографию, магнитнорезонансную томографии, ангиографию. Венозные мальформации были выявлены в 78 наблюдениях, артериовенозные – у 23 больных. У 8 пациентов были диагностированы гемангиомы. Среди пациентов с венозными мальформациями преобладали женщины (54 наблюдения) в возрасте от 15 до 56 лет (средний возраст – 28,7 г). Возраст мужчин с венозными мальформациями (24 наблюдения) варьировал от 14 до 46 лет (средний возраст – 29,1 г). Наиболее часто венозные мальформации поражали нижние конечности (41 больной), реже 7 – верхние конечности (20), туловище (9) и область головы и шеи (8). В 2 наблюдениях (2,5%) венозных мальформаций пациентам было проведено лечебное хирургическое вмешательство в виде рентгенэндоваскулярной окклюзии приносящих артерий образования. В 6 наблюдениях (7,7%) венозных ангиодисплазий имел место рецидив заболевания, развившийся в течение 3-5 лет после первичного хирургического вмешательства. Среди пациентов с артериовенозными мальформациями также преобладали женщины (17 наблюдений) в возрасте от 16 до 47 лет (средний возраст – 31,2 г). Возраст мужчин с артериовенозными мальформациями (6 наблюдений) варьировал от 14 до 38 лет (средний возраст – 27,6 г). Основной локализацией артериовенозных мальформациий были верхние конечности (14 пациентов), реже – нижние конечности (4), туловище Рентгенэндоваскулярная (3), область окклюзия головы приносящих и шеи (2). артерий и артериовенозных шунтов была выполнена у 10 больных (43,5%). В 3 наблюдениях (13,1%) артериовенозных мальфомаций был отмечен рецидив заболевания, развившийся в течение 1-3 лет с момента первичного хирургического вмешательства. Гемангиомы (в 5 наблюдениях капиллярные и в 3 кавернозные) мягких тканей диагностированы у 5 женщин в возрасте от 14 до 33 лет (средний возраст - 22,2 г) и 3 мужчин в возрасте от 14 до 48 лет (средний возраст 24,4). Гемангиомы локализовались в области верхних конечностей у 4-х пациентов, в области нижних конечностей – у 2-х, в области головы и шеи – у 2-х больных. Полученные кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили по общепринятым методикам на депарафинированных срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах, покрытых L-полилизином. Предварительную демаскировку антигена 8 проводили путем кипячения образцов в растворе цитратного буфера с pH 6.0. Блокирование эндогенной пероксидазы - путем обработки срезов 0,3% раствора перекиси водорода в течение 15 минут. В качестве фонового красителя использовали гематоксилин. Перечень использованных антител представлен в таблице 1. Таблица 1. Первичные антитела, использованные при иммуногистохимических исследованиях Антитело Клон Разведение Фирма-производитель Ki-67 MIB-1 1:150 Dako bFGF bFGF88 готовое BioGenex VEGF VG1 1:50 Diagnostic BioSystems TGF-β polyclonal 1:1000 Diagnostic BioSystems CD105 4G11 1:30 BioGenex Эластин BA-4 1:100 Novocastra S-100 polyclonal 1:200 BioGenex Нестин polyclonal 1:6000 Abcam Характер иммуногистохимических реакций оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток (таблица 2). Оценку числа Ki-67–позитивных клеток проводили при помощи телевизионного анализатора изображений «МЕКОС-Ц1». Для проведения электронно-микроскопического исследования из операционного материала вырезали кусочки объемом 1 мм3, которые фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырех- окиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50%, 70%, 96% и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена – эпонаралдитовая смола. После пропитки материал 9 помещали в капсулы и заливали эпонаралдитовой смолой, затем помещали в термостат при температуре 60 С на 2 суток, готовили срезы толщиной 1,5 – 2 мкм и окрашивали толуидиновым синим. После предварительного светомикроскопического изучения полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной 100-120 нм получали на ультратоме фирмы LKB (Швеция), ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа Philips CM10 (Нидерланды). Таблица 2. Критерии оценки иммуногистохимических реакций Тип реакции Интенсивность Обозначение Отрицательная реакция Слабая очаговая реакция + Отсутствие экспрессии Низкая экспрессия Средней интенсивности или интенсивная реакция с мембранной или апикальной внутриклеточной локализацией Интенсивная реакция с внутриклеточной локализацией и распространением по цитоплазме ++ Умеренная экспрессия +++ Высокая экспрессия Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста и его рецептора 2 типа (VEGF и VEGFR2) в гомогенатах ткани ангиодисплазий определяли с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа – «Quantikine® Human VEGF Immunoassay» и «Quantikine® Human VEGFR2 Immunoassay» (R&D systems, США) в соответствии с инструкциями производителя (исследование проведено совместно с членкорр. РАМН Н.Е.Кушлинским в отделении клинической биохимии НИИ 10 клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН). Концентрацию этих факторов в тканях выражали в пг/мг белка, определенного по методу Лоури. Статистическую оценку количественных данных проводили при помощи ЭВМ с использованием программного пакета Statistica. Результаты собственных исследований и их обсуждение При макроскопическом исследовании операционного материала венозные и артериовенозные ангиодисплазии выглядели как отграниченные от окружающей ткани образования неправильной формы серо-розового или красноватого цвета, эластической или потно- эластической консистенции. На разрезе образования представляли собой скопления полостей различного диаметра (от 0,01 мм до 13 мм) или хаотично расположенных сосудов малого и среднего диаметра с несколько утолщенной (до 2-3 мм) стенкой. В ряде наблюдений в просвете сосудов отмечалось наличие эмболов гидрогеля в виде «манной крупы» или беловатых цилиндром длиной 10-15 мм. При гистологическом изучении операционного материала артериовенозных ангиодисплазий нами были выявлены беспорядочные скопления сосудов артериального и венозного типа диаметром 5-15 мкм. Внутренняя эластическая мембрана этих сосудов характеризовалась неравномерным распределением эластических волокон с участками их «разволокнения». Кроме этого, наблюдались субинтимальные очаги гипертрофированных гладкомышечных клеток и очаговый склероз в стенке сосудов венозного типа. Все образования были окружены зоной плотной волокнистой соединительной ткани. Характерной особенностью артериовенозных ангиодисплазий явилось наличие артериовенозных свищей. Стенка афферентного отдела имела строение артерии с наличием наружной и внутренней эластичных мембран и гиперплазией гладкомышечных клеток, а эфферентного – вены с локальными расширениями и участками истончений. 11 При анализе рецидивов артериовенозных мальформаций по сравнению с первичными поражениями отмечался бóльший объем плотной волокнистой соединительной ткани, окружающей образование, с обилием незрелых коллагеновых волокон и фибробластов, а также расположенных преимущественно в периферических участках образования капилляров, венул и артериол. На препаратах артериовенозных ангиодисплазий, подвергнутых предварительной рентгеноэндоваскулярной окклюзии, нами была выявлена облитерация просвета множества артерий, как за счет разрастания волокнистой соединительной ткани, так и за счет гидрогелевых эмболов. В просвете некоторых сосудов отмечались явления реканализации и васкуляризации. В периферических отделах образования нами были выявлены многочисленные капилляры, артериолы и венулы, выстланные крупными округлыми эндотелиоцитами. При микроскопическом исследовании венозных ангиодисплазий мягких тканей нами были выделены два основных гистологических типа поражений. Первый тип (28 наблюдений) представлял собой скопления диспластичных вен малого и среднего диаметра, второй (50 наблюдений) скопления сосудистых полостей (каверн) различного размеров и формы с небольшим числом диспластичных вен преимущественно малого диаметра. При этом отмечалась неравномерность толщины стенок каверн: в участках истончения определялось уменьшение числа миоцитов, в участках утолщения число мышечных клеток было увеличенным. Вокруг образования отмечались участки плотной волокнистой соединительной ткани и очаги кровоизлияний различного размера. В результате сравнительного изучения рецидивных и первичных венозных ангиодисплазий у одних и тех же пациентов нами было отмечено увеличение объема плотной волокнистой соединительной ткани вокруг образования и ее высокая клеточность (преимущественно за счет фибробластов), снижение числа вен и каверн, а также преобладание среди 12 диспластичных сосудов вен и каверн малого и очень малого диаметра особенно в периферических отделах образования. Венозные мальформации, подвергнутые рентгеноэндоваскулярной окклюзии, отличались облитерацией просвета части сосудов (артерий, вен, каверн) часто с явлениями реканализации, и бóльшим числом капилляров, венул и вен малого диаметра на периферии образования. При электронно-микроскопическом изучении периферических венозных ангиодисплазий установлено, что вены и каверны среднего и малого диаметра были выстланы округлыми функционально активными эндотелиоцитами. Последние имели ядра неправильной формы и большое количество средней длины и длинных отростков. Крупные каверны были выстланы преимущественно уплощенными эндотелиоцитами с низкой функциональной активностью, имеющими овальные ядра и малое число коротких отростков. Признаки функциональной активности (большое число вакуолей в цитоплазме, множество выростов цитоплазматической мембраны, мелкодисперсный хроматин, множество рибосом) были более выражены в эндотелиоцитах, выстилающих сосуды малого диаметра, стенка которых была представлена одним слоем эндотелиальных клеток и единичными перицитами. Базальная мембрана в крупных кавернах местами имела прерывистый характер и локальные утолщения. Плотные контакты между эндотелиоцитами были единичными, однако их количество было несколько выше в кавернах крупного диаметра. При этом в одном наблюдении встречались крупные каверны с нарушенной эндотелиальной выстилкой и явлениями экстравазации эритроцитов. Стенка таких каверн была представлена волокнами зрелого коллагена и расположенными между ними фибробластами. На всех препаратах в сосудистой стенке выявлялись единичные перициты. Стенка сосудов была значительно утолщена в больших кавернах преимущественно за счет волокон зрелого коллагена и фибробластов, 13 имевших чаще овальную и веретеновидную форму, реже – неправильную. Часть фибробластов находилась в функционально активном состоянии. При электронно-микроскопическом исследовании артериовенозных форм ангиодисплазий нами было установлено, что артерии и вены малого диаметра были выстланы функционально активными эндотелиоцитами с множеством средней длины и длинных отростков. Ядра таких клеток имели овальную форму и изрезанную ядерную мембрану. Артерии и вены крупного диаметра были выстланы преимущественно уплощенными эндотелиальными клетками с овальными ядрами, малым числом коротких отростков и признаками низкой функциональной активности. В мелких сосудах стенка состояла из одного слоя эндотелиоцитов с признаками повышенной функциональной активности и единичных перицитов. Количество плотных контатков между эндотелиоцитами в сосудах различного калибра было минимальным. Сосудистая стенка была значительно утолщена в крупных венах и умеренно утолщена в артериях и венах среднего диаметра. В участках утолщения наблюдались волокна зрелого коллагена и фибробласты овальной и веретеновидной формы. Базальная мембрана стенок крупных артерий местами имела прерывистый или многослойный вид с участками утолщений. Кроме этого, отмечалось уменьшение числа перицитов и наличие участков разволокнения пучков коллагена в стенке крупных артерий. Часть фибробластов находилась в функционально активном состоянии. По данным литературы [Suri C., 1996] любые нарушения ангиогенеза сопровождаются нарушением межэндотелиальных контактов. Так, уменьшение числа плотных контактов, по мнению A. Peters [1991], может свидетельствовать как о неполноценности гематоэнцефалического барьера при сосудистых мальформациях центральной нервной системы, так и о склонности ангиодисплазий к развитию рецидивов. При этом щелевидные межэндотелиальные контакты в диспластичных сосудах значительно шире по сравнению с нормальными сосудами головного мозга [Tu J., 2006]. В 14 изученных нами наблюдениях артериовенозных и венозных ангиодисплазий выявлено лишь небольшое число плотных контактов между эндотелиоцитами. Следует также отметить, что при артериовенозных формах количество плотных контактов было несколько меньшим, что, возможно, объясняет более активный рост и бóльшую склонность данных образований к развитию рецидивов. Другим проявлением различных по своей природе нарушений процессов васкулогенеза называемых и ангиогенеза вспомогательных является компонентов дисбаланс сосудистой так стенки, выражающийся в уменьшении числа или полном отсутствии в ее структуре перицитов [Folkman J., 1996]. Дефицит этих клеток, выполняющих функции стабилизации структуры сосудистой стенки и, возможно, фагоцитоза, играет важную роль в патогенезе некоторых типов ангиодисплазий [Tille J.C., 2004]. При электронно-микроскопическом изучении операционного материала нами были выявлены единичные перициты в сосудистой стенке как артериовенозных, так и венозных ангиодисплазий, а в некоторых сосудах артериовенозных мальформаций даже полное их отсутствие. Подобные изменения согласуются с данными R.E. Clatterbuck с соавт. [2001], установившими отсутствие перицитов в структуре стенок кавернозных мальформаций центральной нервной системы. Характерными ультраструктурными признаками сосудистых мальформаций головного мозга считаются нарушения строения базальной мембраны стенки сосудов [Wong J.H., 2000, Clatterbuck R.E., 2001]. Они заключаются в ее многослойности, неравномерности толщины и отложении гранул гемосидерина. Описано также частичное или полное отсутствие базальной мембраны в структуре сосудистой стенки артериовенозных и кавернозных ангиодисплазий головного мозга [Tu J., 2005, 2006]. 15 Нами при ультраструктурном изучении периферических ангиодисплазий также был выявлен прерывистый характер и локальные утолщения базальной мембраны в крупных кавернах и артериях, в некоторых кавернах венозных мальформаций она практически полностью отсутствовала. Базальная мембрана сосудов малого и среднего диаметра имела обычный вид. Нами также установлено, что вены и каверны малого и среднего диаметра венозных ангиодисплазий, вены и артерии малого и среднего диаметра артериовенозных форм были выстланы эндотелиоцитами округлой и неправильной формы с множеством цитоплазматических отростков средней и большой длины. Большинство эндотелиоцитов, выстилающих сосуды малого диаметра и часть клеток, выстилающих сосуды среднего диаметра, находились в функционально активном состоянии. Ядра таких эндотелиоцитов имели овальную форму и изрезанную ядерную мембрану. Эндотелиальные клетки, выстилающие каверны, крупные вены и артерии, имели обычную уплощенную форму, небольшое число коротких выростов цитоплазмы и преимущественно находились в функционально неактивном состоянии. В целом стенка сосудов среднего и крупного диаметра при артериовенозных волокнами и зрелого венозных коллагена ангиодисплазиях с была расположенными представлена между ними фибробластами и была значительно утолщена в кавернах крупного диаметра, преимущественно за счет волокон зрелого коллагена и фибробластов, имевших чаще овальную и веретеновидную, реже – неправильную форму. Таким образом, выявленные нами ультраструктурные особенности строения периферических ангиодисплазий отражают различия в их морфогенезе и могут быть использованы диагностики различных их форм. 16 для дифференциальной Важную роль в процессах эмбрионального развития и постнатального роста тканей, в том числе кровеносных сосудов, играют многочисленные факторы роста. Установлено, что рост эндотелиоцитов артериовенозных мальформаций не изменяется при введении в их культуру трансформирующего фактора роста (TGF-β), тогда как темпы роста эндотелиоцитов нормальных тканей замедляются и клетки подвергаются апоптозу [Дан В.Н. и соавт., 2008]. В результате исследования проведенного выявлена умеренно нами иммуногистохимическом повышенная экспрессия TGF-β эндотелиоцитами артериовенозных и венозных ангиодисплазий (таблица 3). При этом уровень экспрессии TGF-β была выше в эндотелии артериовенозных мальформаций, что подтверждает данные литературы о влиянии TGF-β на развитие и прогрессирование указанного типа сосудистой аномалии. Нами также отмечена умеренно повышенная экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в эндотелии венозных и артериовенозных ангиодисплазий. Однако экспрессия VEGF также была несколько выше в эндотелиоцитах артериовенозных форм. Таблица 3. Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов при артериовенозных и венозных ангиодисплазиях Интенсивность экспрессии фактора Тип ангиодисплазии VEGF b-FGF TGFb Ki67 Артериовенозная 2,0 1,1 2,1 0,57 Венозная 1,7 1,7 1,8 1,83 Семейство сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) представлено несколькими секреторными гликопротеинами, в частности, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Все представители семейства VEGF могут связываться 17 с VEGF тирозинкиназными рецепторами 1, 2 и 3 типа (VEGFRs). VEGF-A является одним из наиболее важных регуляторов процесса ангиогенеза in vivo, особенно на ранних его этапах [Karkkainen M.J., 2003]. Специфическая инактивация гена VEGFR-1 ведет к активации и дифференцировке гемангиобластов, что в свою очередь вызывает усиленный рост эндотелиоцитоподобных клеток и дезорганизацию кровеносных сосудов [Hiratsuka S., 2001]. Инактивация гена рецептора VEGFR-2 ведет к нарушению формирования кровяных островков и эмбриональных кровеносных сосудов, вызывая гибель эмбриона. Активация рецептора VEGFR-2 усиливает пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов, а также повышает проницаемость кровеносных сосудов [Tille J.C., 2004]. Выявленные нами особенности иммуногистохимической экспрессии VEGF подтверждают его участие в патогенезе артериовенозных мальформаций периферических локализаций, однако для выяснения роли конкретного типа VEGF в развитии рецидивов ангиодисплазий этого типа необходимо проведение дальнейших исследований. Семейство фактора роста фибробластов (FGF) представлено 22 сходными по структуре полипептидными соединениями, играющими важную роль в процессах эмбрионального развития, ангиогенеза, васкулогенеза и заживления ран [Poole T.J., 2001]. Все представители семейства FGF воздействуют на клетку путем активации специфических трансмембранных тирозинкиназных рецепторов (FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4). Установлено [Murakami M., 2008], что система FGF-FGFR2 играет роль в регуляции миграции эндотелиоцитов в процессе образования новых сосудов. Нами выявлена низкая или незначительно повышенная экспрессия b-FGF эндотелиоцитами изученных ангиодисплазий, при этом она была несколько выше в эндотелии венозных мальформаций. Согласно исследованиям W. Tirakotai с соавт. [2004] в эндотелиоцитах артериовенозных мальформаций твердой мозговой оболочки наблюдается умеренная экспрессия PCNA и отсутствие экспрессии Ki-67, что 18 объясняется тем, что PCNA имеет более длительный период полужизни (около 20 часов) и в отличие от Ki-67 экспрессируется клетками, находящимися в G0 фазе клеточного цикла. В эндотелии артериовенозных мальформаций головного мозга показана умеренная, а в некоторых случаях высокая экспрессия Ki-67, коррелирующая со склонностью данных образований к развитию рецидивов [Sure U., 2001]. На основании исследований эндотелиоцитов проведенных установлена нами низкая периферических иммуногистохимических пролиферативная венозных и активность артериовенозных ангиодисплазий (0,1% - наблюдались лишь единичные экспрессирующие Ki-67 клетки). Однако пролиферативная активность эндотелиальных клеток сосудов мелкого диаметра, расположенных в периферических отделах образований, была умеренно повышена (2-4%). Кроме того, в отдельных наблюдениях нами выявлена умеренно повышенная пролиферативная активность эндотелия большинства диспластичных сосудов. У таких пациентов, на наш взгляд, значительно повышен риск развития рецидивов заболевания после хирургического лечения. Примечательно, что результаты иммуногистохимических исследований проведенных нами согласуются с полученными данными о концентрации VEGF и VEGFR2 в гомогенатах ткани ангиодисплазий. Нами установлено, что концентрация VEGF в ткани венозных ангиодисплазий в 2,1 раза выше по сравнению с артериовенозными. В случае рецидива заболевания отмечается повышение уровня VEGF на 20% при венозной и в 4,5 раза при артериовенозной форме. Концентрация рецептора VEGF 2 типа также больше при венозных мальформациях (на 47,4%). Развитие рецидива характеризуется повышением его уровня, особенно при артериовенозной форме (в 8,8 раз). Таким образом, выявленные нами особенности экспрессии факторов роста в эндотелии венозных и артериовенозных ангиодисплазий отражают различия в патогенезе данных образований. Повышенная пролиферативная 19 активность эндотелия в отдельных наблюдениях ангиодисплазий обоих типов может лежать в основе развития рецидива заболевания. Одной из актуальных задач современной ангиологии и патологической анатомии является разработка критериев (в том числе и морфологических) дифференциальной диагностики сосудистых ангиодисплазий и гемангиом. Действительно, в результате проведенного нами комплексного морфологического изучения операционного материала у 8 больных с предварительным диагнозом ангиодисплазии были установлены гемангиомы (в 5 наблюдениях капиллярные и в 3 кавернозные). Согласно данным литературы [Herbreteau D. et al., 1997; Chang J. et al., 1999; Boon L.M. et al., 2004; Frischer J.S. et al., 2004] и результатам ранее проведенных собственных исследований [Мишнёв О.Д. и др., 2008] основными дифференциально-диагностическими признаками ангиодисплазий являются наличие артерий и вен различной формы и размеров, тесно связанных артериовенозных соустей, (ассоциированных) тромбов и друг с кальцинатов, другом, а также неравномерность распределения эластических волокон во внутренней и наружной оболочках сосудов, очаговые утолщения интимы и гипертрофия мышечного слоя. Кроме того, на основании проведенного нами сравнительного изучения различных типов ангиодисплазий мы считаем, что в качестве дополнительных критериев могут быть использованы следующие признаки: выявление в структуре образования пучков нервных волокон, экспрессия эластина в стенке и нестина в эндотелии сосудов, а также оценка пролиферативной активности эндотелия (по Ki-67). Наличие в структуре образования нервных стволов, которые могут быть выявлены гематоксилином даже и при эозином, изучении является, препаратов, на наш окрашенных взгляд, важным дифференциально-диагностическим критерием ангиодисплазий. Нервные 20 стволы как компонент ангиодисплазий подтверждают дисморфогенетическую природу этих образований, являющихся, таким образом, аномально организованными нормально присутствующими в организме тканями [Rydh M., 1991; Qiu S., 2002; Adegboyega P.A., 2005]. Следует добавить, что во всех изученных нами наблюдениях артериовенозных ангиодисплазий и в 10 наблюдениях венозных форм при иммуногистохимическом исследовании была выявлена экспрессия белка S-100 в нервных стволах и одиночных нервных волокнах, расположенных в структуре ангиодисплазии. При этом во всех изученных наблюдениях капиллярных и кавернозных гемангиом экспрессия белка S-100 отмечалась только в единичных нервных волокнах, расположенных в структуре опухоли. Другим дифференциально-диагностическим признаком является положительная реакция на эластин в стенке сосудов при ангиодисплазиях. При иммуногистохимическом артериовенозных мальформаций исследовании нами была во всех препаратов выявлена выраженная экспрессия эластина в области внутренней и наружной эластической мембран, которые имели неравномерный прерывистый вид с локальными утолщениями и истончениями. В наблюдениях венозных ангиодисплазий также отмечалась экспрессия эластина в стенке вен и каверн. В случае гемангиом реакция на эластин практически не определялась, что согласуется с данными литературы [Adegboyega P.A. et al., 2005]. В качестве дополнительных маркеров гемангиом, по нашему мнению, следует использовать иммуногистохимическое выявление нестина и Ki-67. Нестин, представитель семейства промежуточных филаментов IV класса, содержится преимущественно в нейроэпителиальных стволовых клетках и клетках предшественниках [Lendahl U., 1990, Johansson C.B., 2002]. В делящихся клетках нестин индуцирует разъединение пучков промежуточных филаментов и регулирует распределение виментина между дочерними клетками в ходе 21 деления клетки-предшественника [Chou Y-H, По 2003]. данным литературы [Sugawara K., 2002] нестин является информативным маркером пролиферирующих сосудов. Высокая экспрессия нестина выявлена в эндотелиоцитах многих развивающихся тканей, включая плаценту, а также новообразованных сосудов в ткани опухолей [Aihara M., 2004]. Согласно проведенным нами исследованиям во всех наблюдениях венозных и артериовенозных ангиодисплазий отсутствовала экспрессия нестина в эндотелии сосудов и сосудистых полостей. Умеренная его экспрессия была отмечена только в эндотелии мелких сосудов периферических областей образования. В то же время на препаратах гемангиом наблюдалась умеренно-высокая экспрессия нестина в эндотелиоцитах опухолевых сосудов. Помимо этого эндотелиальные клетки гемангиом характеризуются более высоким индексом пролиферации (индекс Ki-67 составляет 4-5%) по сравнению с таковыми в ангиодисплазиях (единичные экспрессирующие Ki-67 клетки). Таким образом, ангиодисплазии (сосудистые мальформации) представляют собой особую группу заболеваний, лечение конкретных форм которых сопряжено со значительными трудностями. Важную роль в их диагностике и дифференциальной диагностике играет комплексное морфологическое (гистологическое и иммуногистохимическое) изучение биопсийного и операционного материала. ВЫВОДЫ 1. Венозные ангиодисплазии локализуются преимущественно (в 52,5% наблюдений) в области мягких тканей нижних конечностей и представляют собой скопление вен и каверн причудливой формы, стенка которых умеренно неравномерно утолщена или имеет локальные утолщения. 22 Артериовенозные расположены в ангиодисплазии области верхних чаще (60,8% конечностей и наблюдений) представлены скоплением артерий причудливой формы и сосудов венозного типа (вен и каверн). При этом стенка большинства диспластичных артерий неравномерно утолщена. Характерным признаком является наличие артериовенозных шунтов. 2. При морфологическом исследовании операционного материала выделено два типа венозных мальформаций: с преобладанием вен и с преобладанием сосудистых полостей – каверн. Второй тип является преобладающим и составляет 67%. 3. При иммуногистохимическом исследовании венозные ангиодисплазии характеризуются преимущественно умеренной экспрессией b-FGF (в 66,7% наблюдений) и TGF-β (78,2%), низкой экспрессией VEGF (65,4%) и CD105 Артериовенозные (55,1%). мальформации характеризуются преимущественно умеренной экспрессией b-FGF (в 82,6% наблюдений) и TGF-β (43,4%) а также высокой экспрессией VEGF (73,9%), CD105 (69,5%) и эластина (100%) в стенке артерий. 4. Результаты иммуногистохимических исследований согласуются с данными иммуноферментого анализа содержания ангиогенных факторов VEGF и VEGFR2 в гомогенатах ткани ангиодисплазий. Установлено резкое повышение концентрации VEGFR2 при развитии рецидива заболевания, особенно артериовенозной формы (в 8,8 раз). 5. При электронно-микроскопическом популяции эндотелиоцитов исследовании ангиодисплазий: выявлено крупные две округлые функционально активные клетки и уплощенные функционально неактивные клетки, при этом вторая популяция является преобладающей. Как артериовенозные, так и венозные мальформации характеризуются снижением числа плотных контактов между выстилающими их сосуды эндотелиоцитами, а также единичными 23 перицитами в стенке сосудов. Базальная мембрана имеет многослойную структуру с локальными утолщениями и прерывистый характер. 6. Дифференциально-диагностическими критериями сосудистых мальформаций и гемангиом мягких тканей являются наличие в структуре ангиодисплазий артериовенозных шунтов, пучков нервных волокон, экспрессирующих S-100 белок, низкий пролиферативный индекс и отсутствие экспрессии нестина эндотелиоцитами, выраженная экспрессия эластина в стенке сосудов артериовенозных форм. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Выявленные в процессе исследования особенности строения венозных и артериовенозных ангиодисплазий необходимо использовать в практике патологоанатомических отделений лечебных и научно- исследовательских учреждений для определения вида ангиодисплазии и их дифференциальной диагностики с гемангиомами. Результаты педагогическом исследования процессе в рекомендуется соответствующих использовать разделах в курсов патологической анатомии и сердечно-сосудистой хирургии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и хирургов. При проведении иммуногистохимического исследования установлен более высокий уровень экспрессии маркеров пролиферации (Ki-67, нестина) и основных ангиогенных факторов (VEGF, TGF-β, bFGF) в наблюдениях рецидивных артериовенозных ангиодисплазий, что позволяет рекомендовать их исследование в качестве факторов прогноза развития рецидива образования. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Дан В.Н., Павлов К.А., Сапелкин С.В., Щеголев А.И. Клиникоморфологическая характеристика артериовенозных мальформаций // 24 Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. 2008. Т. 9. № 3. Приложение. С. 187. 2. Pavlov K., Mishnev O., Shchegolev A., Dan V., Sapelkin S. Clinical and morphological comparisons at peripheric vascular malformations // Pathophysiology of Haemastasis and Thrombosis. 2007-2008. V. 36. (Suppl. 1). P. A55. 3. Павлов К.А., Дубова Е.А., Щеголев А.И., Мишнёв О.Д. Экспрессия факторов роста в эндотелиоцитах при сосудистых мальформациях // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. № 3. С. 341-345. 4. Дубова Е.А., Павлов К.А. Патоморфологическая характеристика периферических венозных мальформаций // Вестник РГМУ. 2009. № 3. С. 24-25. 5. Павлов К.А., Дубова Е.А. Использование иммуногистохимических маркеров пролиферации при морфологической диагностике и оценке риска развития рецидивов сосудистых мальформаций периферической локализации // Вестник РГМУ. 2009. № 3. С. 59. 6. Павлов К.А., Щеголев А.И., Дан В.Н., Сапелкин С.В., Мишнёв О.Д. Ангиодисплазии: роль медиаторов и факторов роста // Ангиология и сосудистая хирургия. 2009. Т. 15. № 1. С. 51-154. 7. Павлов К.А., Чекмарева И.А.., Щеголев А.И., Мишнёв О.Д. Ультраструктурная характеристика периферических артериовенозных и венозных ангиодисплазий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. № 4. С. 463-468. 8. Павлов К.А. эндотелиоцитов Использование нестина в нового оценке маркера риска пролиферации развития рецидива сосудистых мальформаций мягких тканей и их дифференциальной диагностике с гемангиомами // Материалы Всерос. научн. конф., посвящ. 150-летию кафедры пат. анатомии ВМА им. С.М.Кирова. СПб., 2009. С. 153-154. 25 9. Павлов К.А., Дубова Е.А., Щеголев А.И., Мишнёв О.Д. Иммуногистохимические особенности периферических сосудистых мальформаций // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. Самара, 2009. С. 388-389. 10. Мишнёв О.Д., Павлов К.А., Дубова Е.А., Щёголев А.И. Выявление одиночных нервных волокон и их пучков – новый критерий дифференциальной диагностики ангиодисплазий и гемангиом // Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН. 2009. Т. 10. № 3. Приложение. С. 85. 11. Павлов К.А., Щеголев А.И., Дан В.Н., Сапелкин С.В., Мишнёв О.Д. Медиаторные взаимодействия при васкулогенезе и ангиогенезе // Ангиология и сосудистая хирургия. 2009. Т. 15. № 2. С. 31-35. 12. Pavlov K.A., Shchegolev A.I., Dubova E.A., Mishnev O.D. Expressing of some angiogenic mediators at peripheric arteriovenous and venous malformations // Virchows Archiv. 2009. V. 455 (Suppl 1). P. S246. 26
