Карпеева Евгения Александровна 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ

На правах рукописи
Карпеева Евгения Александровна
ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА ЖИВОТНЫХ
ПРИ ИНВАЗИИ BALANTIDIUM COLI
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2011
1
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Ульяновский государственный
педагогический университет имени И.Н. Ульянова»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, доцент
Ильина Наталья Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Щербаков Анатолий Анисимович
доктор биологических наук, профессор
Романова Елена Михайловна
Ведущая организация:
ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный
аграрный университет»
Защита состоится «17» февраля 2011 года в 1400 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.061.04 при Федеральном государственном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО
«Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
Автореферат разослан «__» __________ 2011 года и размещен на сайте
университета www.sgau.ru.
Отзывы на реферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная
площадь, 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю
диссертационного совета.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор
Л.В. Карпунина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
2
Актуальность темы. В настоящее время хорошо известна важная роль
нормальной микробиоты пищеварительного тракта в целом, и кишечника в
частности, в создании резистентности макроорганизма к колонизации
патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, действию токсинов,
ферментов защиты и агрессии, формировании иммунного гомеостаза и
витаминного баланса, участии в метаболических и ферментативных процессах,
антимутагенной активности (Красноголовец, 1989; Куваева, Ладодо, 1991;
Воробьев, 1997; Акбаева, 1998; Шендеров, 1998; Ардатская, Дубинин,
Минушкин, 2001; Ильина, 2008). В свою очередь, микробиота кишечника
является индикатором состояния макроорганизма и целый ряд факторов
приводит к изменению ее качественного и количественного состава. При
снижении резистентности макроорганизма представители микробиоценоза
кишечника могут проявлять свою патогенность (Шендеров, 2000; ПотатуркинаНестерова с соавт., 2004; Ильина, 2006; Красноперова, 2009).
Среди
условно-патогенных
микроорганизмов,
способствующих
возникновению и поддержанию дисбиотического процесса в кишечнике
животных, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные
простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике
практически всех здоровых животных (Walker, 2005). Естественным
резервуаром возбудителей многих паразитарных инвазий, в том числе
балантидиаза, являются домашние животные – свиньи.
В последние годы в России особенно напряженной стала
эпидемиологическая обстановка по паразитарным болезням животных. В
стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных
различными паразитозами сельскохозяйственных животных, среди которых
отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Романенко, 2001).
Особый интерес вызывает балантидиаз, который очень широко распространен у
свиней. По данным ряда авторов зараженность свиней балантидиями
составляет от 21 % до 100 % , так в Великобритании – 36 %, в Египте – 70 %, в
Болгарии от 14 до 81 %, в Греции – 74,6 %, в Новой Гвинее – 100 %
(Жордания, 1971; Хамцов, 1972; Рочкене, 1977). Носителями балантидий могут
быть также крысы, мыши, дикие кабаны, обезьяны (Kobayashi et al., 1995;
Hussain et al., 1997; Кипайкин, Рубашкина, 2002).
В настоящее время достаточно хорошо изучены вопросы биологии
балантидий, пути и способы заражения ими животных, дана общая оценка
инвазированности разных хозяев (Рочкене, 1977; Лаптева, 1970; Лысенко,
1993). Однако, практически отсутствуют данные о состоянии микробиоценоза
кишечника животных при инвазии Balantidium coli, об особенностях
межмикробных
взаимодействий
при
формировании
паразитоценоза.
Малочисленность и фрагментарность работ, дающих представление о
стабильности адаптационных и функциональных возможностях кишечника, не
отражают характер изменения его микробного статуса при балантидиазе, а
также не направлены на изучение нарушений паразитоценоза в целом. В этой
связи сравнительное изучение состояния микробиоценоза кишечника свиней
3
при инвазии балантидиями и оценка характера взаимоотношений
микроорганизмов, определяющего тяжесть заболевания, представляют научный
и практический интерес.
Цель работы – изучить качественный и количественный состав
микробиоценоза кишечника свиней и оценить характер межмикробных
взаимодействий при инвазии Balantidium coli.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать структуру паразитоценоза кишечника свиней города
Ульяновска и Ульяновской области, оценить частоту встречаемости
B. coli.
2. Изучить биологические свойства выделенных балантидий в условиях
in vivo и in vitro.
3. Провести сравнительные исследования состава микробиоценоза
кишечника свиней в норме и при инвазии B. coli.
4. Выявить зависимость состояния облигатной и транзиторной микрофлоры
кишечника свиней от степени вирулентности балантидий.
5. Оценить характер межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней в
условиях инвазии B. coli.
Научная новизна работы. Установлен широкий спектр представителей
паразитоценоза кишечника свиней города Ульяновска и Ульяновской области,
включающий 11 видов кишечных паразитов, из которых 8 видов представлены
простейшими и 3 вида – гельминтами. Видовой спектр простейших включает
инфузории (Balantidium coli), саркодовые (Blastocystis sp., E. hartmanni, E. coli,
E. nana, Iodamoeba butschlii), жгутиковые (Lamblia intestinalis) и кокцидии
(Cryptosporidium parvum). Показано, что инвазивность свиней простейшими
составляет 81,7 %, из них балантидиями – 18,78 %.
Гельминты, представленные 1 видом трематод (Opisthorchis felineus),
1 видом цестод (Hymtnolepis nana) и 1 видом нематод (Ascaris iumbrieoides),
выявлены у 12,18 % обследованных свиней.
Впервые проведен комплексный сравнительный анализ состояния
микробиоценоза кишечника
свиней
при балантидиазной инвазии.
Охарактеризован видовой состав и выявлены качественные и количественные
изменения в составе микрофлоры кишечника животных, инвазированных
Balantidium coli.
Впервые установлено, что балантидии обладают различной степенью
вирулентности, показана зависимость дисбиотических изменений в составе
микробиоценоза кишечника от степени вирулентности балантидий.
Впервые определены особенности межмикробных взаимодействий в
кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli, которые сопровождаются
сменой абсолютных доминант Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp.,
4
Bacteroides spp. и появлением Escherihia coli с гемолитической активностью и
грибов рода Candida.
Практическая значимость работы. Подобранная оптимальная
питательная среда для культурального метода диагностики балантидиаза
позволяет дополнить имеющиеся сведения о влиянии B. coli на межмикробные
взаимодействия в кишечнике свиней, что обоснованно указывает на
необходимость широкого внедрения в ветеринарную практику методов
выделения и идентификации B. coli.
По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические
рекомендации по межмикробным взаимодействиям в кишечнике свиней при
инвазии Balantidium coli» для студентов старших курсов, аспирантов,
специалистов
микробиологических
лабораторий,
рекомендованные
редакционно-издательским советом и одобренные Ученым советом
естественно-географического факультета (протокол № 10 от 23 апреля 2010 г.),
монография «Экологические параметры микробиоты кишечника при
протозойных инвазиях» (в соавторстве с Н.А. Ильиной, Н.М. Касаткиной, Н.И.
Потатуркиной – Нестеровой,
Ю.Ю. Красноперовой, 2009). Результаты
диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций
по микробиологии, паразитологии и экологии микроорганизмов, проведении
лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в
Ульяновском государственном педагогическом университете имени И.Н.
Ульянова.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Паразитофауна кишечника свиней г. Ульяновска и Ульяновской области
представлена 11 видами кишечных паразитов, из которых 8 видов –
простейшие и 3 вида – гельминты. Инвазированность свиней
простейшими составляет 81,7 % , балантидиями – 18,78 %.
2. Выделенные из организма животных балантидии имеют типичную
морфологию, при культивировании на среде Суреша количество
инфузорий с максимальными размерами увеличивается, а с
минимальными – уменьшается. Уровень вирулентности балантидий
значительно варьирует и является показателем их неодинаковой
этиологической значимости в развитии инвазии.
3. Балантидиазная инвазия сопровождается значительными изменениями
количественных показателей основных эндосимбионтов толстого
кишечника животных и увеличением частоты встречаемости
представителей транзиторной микрофлоры.
4. Выраженные дисбиотические изменения микрофлоры кишечника свиней
регистрируются при инвазии высоковирулентными B. coli.
5. Межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней в условиях инвазии
балантидиями характеризуются изменениями, проявляющимися в
снижении доминирования и
значимости основных симбионтов и
5
увеличении частоты встречаемости транзиторной микрофлоры,
свидетельствующие о смене абсолютных доминант микробоценоза.
Работа выполнена на кафедре зоологии и на базе научноисследовательской лаборатории экологии микроорганизмов ГОУ «Ульяновский
государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова».
Апробация работы. Результаты работы были представлены на:
Международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии»
(Италия, о. Тенерифе, 2008), III Международной научно-практической
конференции «Образование и здоровье. Экономические, медицинские и
социальные проблемы» (Пенза, 2008), Международном Форуме по проблемам
науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2008),
Всероссийской заочной электронной научной конференции «Современные
проблемы науки и образования» (Москва, 2008), Международной научной
конференции «General practitioner» (Италия, 2009), Международном Форуме по
проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир
(Москва,
2009),
Международном
молодежном
научном
форуме
«Университетское образование: традиции и инновации» (Ульяновск, 2010), III
Всероссийской научно-практической конференции «Экология и здоровье:
проблемы и перспективы социально-экологической реабилитации территорий,
профилактики заболеваемости и устойчивого развития» (Вологда, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах,
рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и
собственных исследований, включающей объект, материалы и методы
исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения,
выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на
109 страницах, содержит 16 таблиц и 14 рисунков. Список использованных
литературных источников включает 166 наименований, в том числе 33
зарубежных.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект, материалы и методы исследований
При выполнении работы было обследовано 197 свиней г. Ульяновска и
Ульяновской области. Контрольную группу составили 56 свиней, у которых
отсутствовали паразитарные инвазии.
Лабораторную диагностику кишечных простейших проводили в
соответствии с регламентом (рис. 1). Для выявления кишечных простейших и
6
гельминтов использовали систему «Консервант Турдыева – формалин-эфирное
осаждение – центрифугирование (КТ-ФЭО-МЦН)» с последующим
микроскопированием. (Сергиев, Гордеева, Рагимов, 1994). Диагностику
кишечных протозоозов проводили путем микроскопии нативных и окрашенных
мазков и после формалин-эфирного осаждения по Ритчи в модификации
Аллена-Ридли. Размеры простейших определяли при помощи окуляр
микрометра (Сергиев, 1992).
Для выделения Balantidium coli использовали среды Павловой, Зиерта,
Суреша и Райса (Методические указания…, 1999).
Определение вирулентности микроорганизмов проводили путем
внутрибрюшинного заражения мышей. Белым мышам массой 14-16 г. вводили
по 0,5 мл соответствующего разведения 101 - 109 взвеси культуры простейших,
выращенной на среде K. Suresh. Учет результатов производили через сутки и
определяли величину LD50, в соответствии с которой штаммы Balantidium coli
относили к высоковирулентным, умеренно вирулентным и слабовирулентным
(Костюкова, Андреева, Игнатов, 1996).
Фекалии
Свежевыделенные
Консервированные
нативный мазок с
физиологическим
раствором
мазок с
раствором
Люголя
мазок с
раствором
Люголя
концентрация
формалинэфирным
обогащением
окраска железным
гематоксилином
по Гейденгайну
окраска по
РомановскомуГимзе
мазок с
раствором
Люголя
окраска по
Романовскому
- Гимзе
Рис. 1. Регламент лабораторной диагностики кишечных простейших
Изучение микрофлоры кишечника у инвазированных и здоровых свиней
проводили согласно методическим рекомендациям «Бактериологическая
диагностика дисбактериоза», 1989.
Выделение и идентификацию микроорганизмов из состава микробиоценоза
кишечника проводили по общепринятым методикам. Содержимое толстого
кишечника и разведения фекалий высевали на дифференциальнодиагностические среды. Бактерии группы кишечной палочки выделяли на
средах Эндо, Плоскирева, Левина и висмут-сульфитном агаре; для выделения
стафилококков использовали солевой мясо-пептонный агар (МПА) и кровяной
МПА. Выделение анаэробных бифидобактерий проводили посевом больших
разведений фекалий в среду Блаурокка. Для выделения клостридий
использовали среды Китта-Тароцци, Вильсона-Блер, глюкозо-кровяной агар
7
Цейсслера. Лактобациллы определяли по росту на среде МРС. Proteus vulgaris
выделяли на среде Плоскирева и средах с добавлением желчи (МПА с 5 %
содержанием желчи). Микроскопические грибы родов Candida, Aspergilus,
Peniilium выделяли посевом исследуемого материала на среды Чапека и
Сабуро.
Оценивали биохимическую активность выделенных бактерий по
способности к разжижению желатина, коагуляции молока, утилизации маннита,
лактозы, сахарозы, аммиака, сероводорода на стандартных средах Гисса и с
использованием индикаторных полосок.
Рассчитывали качественное и количественное содержание бактерий и
грибов в исследуемых пробах, результаты переводили в десятичные логарифмы
и определяли относительное соотношение различных групп микроорганизмов в
микробиоценозе кишечника животных.
Характер межмикробных взаимодействий оценивали по значению
индекса контагиозности (Уиттекер, 1980), вычисляемого по формуле:
S
где UK – индекс контагиозности; S – выборочная дисперсия;
UK 
X,
Х – средняя арифметическая плотность, и позволяющего определить характер
пространственного распределения экологических групп в биотопе.
Для определения значимости экологических групп микробоценоза
пользовались индексом, предложенным М.П. Наткевичайте-Иванаускене (1985),
и вычисляли по формуле:
100  g
V
где V – индекс значимости; g – сумма встречаемости видов
n mz ,
данной группы; n – число описанных пробных площадок; m – среднее число
видов на пробной площадке; z – число видов в данной группе.
Видовое разнообразие сообщества микроорганизмов, населяющих
толстый отдел кишечника, рассчитывали по формуле Р. Уиттекера (1980):
S
где d – видовое разнообразие; S – количество видов;
d
N,
N – общая плотность бактерий.
Статистическая обработка результатов исследований выполнена на
персональном ЭВМ типа IBM «Pentium IV», графическая обработка материалов
выполнена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel-2003. При
математической обработке данных использовали пакет CSS3.1 «Компьютерная
биометрия» (Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование паразитоценоза кишечника свиней
Проведено обследование 197 свиней в г. Ульяновске и Ульяновской
области с применением диагностической системы КТ-ФЭО-МЦН. Выявлена
8
общая высокая зараженность кишечными паразитами у обследованных
животных. При этом инвазированность простейшими и гельминтами была не
одинакова. Так, простейшие были выявлены у 81,7 % свиней, тогда как
гельминты – у 12,2 % животных, 6,1 % из обследованных животных были не
инвазированы. Получены новые данные, отражающие богатое видовое
разнообразие паразитофауны кишечника обследованных животных (табл. 1).
Инфузории Balantidium coli также занимают значительное место в
паразитоценозе свиней, они были выявлены у 18,78 % обследованных
животных.
Таблица 1 – Встречаемость кишечных паразитов у обследованных свиней
Виды паразитов
Простейшие
1. Саркодовые
1.1. Blastocystis sp.
1.2. Entamoeba hartmanni
1.3. Entamoeba coli
1.4. Endolimax nana
1.5. Iodamoeba butschlii
2. Жгутиковые
2.1. Lamblia intestinalis
3. Инфузории
3.1. Balantidium coli
4. Кокцидии
4.1. Cryptosporidium parvum
Гельминты
1. Трематоды
1.1. Opisthorchis felineus
2. Цестоды
2.1. Hymtnolepis nana
3. Нематоды
3.1. Ascaris iumbrieoides
Встречаемость паразитов
абс.
%
161
81,73
145
73,60
91
46,19
15
7,61
74
37,56
46
23,35
23
11,68
49
24,87
73
37,06
37
18,78
37
18,78
6
3,05
6
3,05
24
12,18
6
3,05
6
3,05
3
1,52
3
1,52
17
8,63
12
6,09
Паразитоценоз кишечника свиней характеризовался наличием в ряде
случаев ассоциаций разных видов паразитов. Были выявлены двухчленные
ассоциации: Blastocystis sp. (46,19 %) – Lamblia intestinalis (37,06 %),
Balantidium coli (18,78 %) – Blastocystis sp. (46,19 %), Balantidium coli (18,78 %)
– Candida spp. (7,39 %); трехчленные ассоциации: Lamblia intestinalis (37,06 %)
– Balantidium coli – Candida spp. (7,39 %), протозойно-гельминто-грибковые
(7,81 %).
9
Характеристика выделенных штаммов Balantidium coli
Морфология балантидий
Изучение морфологических особенностей балантидий, обнаруженных в
нативном материале и в культуре, выращенной на искусственных питательных
средах, выявило отличия в размере инфузорий (табл. 2).
Таблица 2 − Размеры балантидий выделенных из исследуемого материала
и после культивирования на питательной среде
Размеры инфузорий из исследуемого материала (мкм) и их
количество в %
40,6±19,7×51,3±12,3
16,7 %
11,3 %
67,4±10,6×81,2±14,6
из нативного материала
71,8 %
после культивирования
62,4 %
99,6±23,3×114,2±17,5
11,5 %
26,3 %
Среди выделенных из нативного материала балантидий преобладали
клетки размером 67,4±10,6×81,2±14,6 мкм. После их культивирования на
питательной среде количество клеток с минимальными размерами
уменьшилось до 11,3 %, а с максимальными – увеличилось до 26,3 %. В мазках
с питательной среды выявлены делящиеся формы балантидий, в то время как
микроскопия нативного материала редко выявляла клетки в процессе деления.
Культуральные свойства инфузорий Balantidium coli
Для изучения культуральных свойств инфузорий B. coli проводили
исследования фекалий свиней, используя культуральный метод (Генис, 1979).
Для получения культур простейших использовали двухфазную
питательную среду Зиерта, среду Павловой, среду Райса, среду Джонса, среду
Суреша: ЕМ, СЕМ, ТЕМ. Учитывая большое количество имеющихся
питательных сред, провели исследования с целью выявления оптимальной
питательной среды для культивирования B. coli. Для этого произвели посевы
фекалий на все указанные питательные среды, наличие роста балантидий
отмечали на 1, 2, 3, 4, 5, и 6 сутки (табл. 3).
Анализ полученных данных показал, что рост в виде помутнения среды
появлялся на средах Павловой и Суреша (ЕМ) – на 5 сутки после посева, на
средах Райса и Суреша (ТЕМ) – на 4 сутки, на средах Зиерта и Джонса – на 3
сутки и на среде Суреша (СЕМ) – на 2 сутки.
Жизнеспособность выросших балантидий сохранялась во всех случаях
дальнейших пересевов полученных культур B. coli.
10
Таблица 3 – Результаты посевов фекалий на питательные среды
Питательные среды
Количество посевов
Среда Зиерта
Среда Райса
Среда Павловой
Среда Джонса
Среда Суреша ЕМ
Среда Суреша ТЕМ
Среда Суреша СЕМ
30
30
30
30
30
30
30
Наличие роста (сутки)
1
-
2
+
3
+
+
+
4
+
+
+
+
+
5
+
+
+
+
+
+
+
6
+
+
+
+
+
+
+
Примечание: «+» - наличие роста в виде помутнения среды, «−» - отсутствие роста.
Вирулентность изолятов Balantidium coli
Впервые было установлено, что балантидии, выделенные у свиней,
обладают вирулентностью, однако часть изолятов были авирулентны. Лишь
60,4 % выделенных простейших вызывали гибель мышей, причем уровень
показателей вирулентности был неодинаков.
Проведенные исследования показали, что 119 из 197 изолятов балантидий
вызывали гибель мышей при внутрибрюшинном заражении, что составило
60,4% (рис. 2). Показатель LD50 для вирулентных культур B. coli варьировал от
2,6±0,7 до 6,7±0,4 мк/мл; в зависимости от его величины были выделены
3 группы балантидий. 1 группу составили 20 культур со слабой вирулентностью
(LD50/lg 2,6±0,7-3,9±0,4 мк/мл), 2 группу – 46 культур со средней
вирулентностью (LD50/lg 4,0±0,6-5,5±0,7 мк/мл); 3 группу – 53 культуры с
высокой вирулентностью (LD50/lg 5,6±0,9-6,7±0,5 мк/мл).
39,6%
60,4%
Вирулентные
Авирулентные
Рис. 2. Количество вирулентных изолятов балантидий
11
Характеристика качественного и количественного состава
микробиоценоза кишечника свиней
Кишечный микробоценоз свиней без инвазии B. coli
Анализ качественного и количественного состава микробоценоза
кишечника свиней, не инвазированных балантидиями, позволил отнести 368
штаммов идентифицированных микроорганизмов к 10 родам (табл. 4).
Таблица 4 – Частота встречаемости (%) и плотность колонизации (lg КОЕ/г)
микроорганизмами кишечника свиней без паразитарных инвазий
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Микроорганизмы
Lactobacillus spp.
Bifidobacterium spp.
Escherichia spp.
Bacteroides spp.
Proteus spp.
Klebsiella spp.
Enterococcus spp.
Staphylococcus spp.
Candida spp.
Частота встречаемости
(%)
100,0
100,0
100,0
68,1
9,8
9,6
21,5
16,4
22,5
lg КОЕ/г, Мm
8,21,8
8,92,1
7,92,6
10,63,7
3,80,7
2,90,9
5,31,9
4,61,3
3,91,3
Анализ состава микробиоценоза кишечника свиней выявил 100 %
присутствие лактобактерий (их плотность колонизации составляла 8,21,8 lg
КОЕ/г), бифидобактерий (8,92,1 lg КОЕ/г) и эшерихий (7,92,6 lg КОЕ/г).
Среднее содержание Bacteroides spp. в кишечнике неинвазированных животных
составляло 10,63,7 lg КОЕ/г; эти бактерии были обнаружены у 68,1 %
обследуемых животных.
Из фекалий свиней достаточно часто высевались и другие энтеробактерии
(26,3 %). Выявлено высокое содержание Proteus spp. (3,80,7 lg КОЕ/г), в
меньшем количестве обнаруживали Klebsiella spp.(2,90,9 lg КОЕ/г).
Достаточно часто в фекалиях обнаруживались представители рода
Staphylococcus spp., которые были выделены у 16,4 % животных; при этом в
65 % случаев это был S. epidermidis и значительно реже – S. aureus (13,7 %), на
долю остальных видов стафилококков приходилось 21,3 %, Enterococcus
spp.(5,31,9 lg КОЕ/г). У каждого четвертого обследованного животного
выявлены грибы рода Candida (22,5 %). Их присутствие было весьма
незначительным, средняя арифметическая величина составила 3,91,3 lg КОЕ/г.
Полученные
нами
результаты
свидетельствуют
о
широкой
распространенности в микробиоценозе кишечника обследованных животных
при отсутствии паразитарных инвазий анаэробных микроорганизмов.
12
Микробоценоз кишечника свиней при инвазии B. coli
Наличие балантидиазной инвазии у свиней во всех случаях
сопровождалось различной степенью выраженности дисбиотических
изменений в составе микрофлоры кишечника. Было выделено и
идентифицировано 396 штаммов микроорганизмов, анализ которых позволил
отнести их к 9 родам (табл. 5).
Таблица 5 – Состав микробиоценоза кишечника свиней в условиях
инвазии В. coli
№
Частота встречаемости
Микроорганизмы
lg КОЕ/г, Мm
п/п
(%)
1
Lactobacillus spp.
82,0
4,91,1
2
Bifidobacterium spp.
79,9
6,20,7
3
Escherichia spp.
92,4
8,61,2
4
Bacteroides spp.
62,1
6,80,8
5
Enterococcus spp.
49,5
6,90,8
6
Proteus spp.
24,3
5,80,8
7
Klebsiella spp.
14,7
6,41,2
8
Staphylococcus spp.
27,2
4,71,1
9
Candida spp.
49,8
6,70,9
Установлено, что дисбиотические изменения проявлялись прежде всего в
уменьшении основных представителей микробиоценоза кишечника –
Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. Представители резидентной
микробиоты кишечника – Escherichia spp. – были обнаружены в 92,4 % проб в
повышенном количестве (lg 8,61,2 lg КОЕ/г). Наряду с E. coli с нормальной
ферментативной активностью встречались и штаммы с гемолитической
активностью (56,8 %). Bacteroides spp. были обнаружены в 62,1 % проб,
микробное число которых равнялось 6,80,8 lg КОЕ/г.
Анализируя состав микрофлоры кишечника свиней при балантидиазе,
следует отметить резкое возрастание как количества высеваемых
микроорганизмов, так и частоты их обнаружения. Установлено, что
доминировали энтеробактерии (62,7 % случаев выделения), со средним
микробным числом 6,40,4 lg КОЕ/г. Содержание Proteus spp. составило 5,80,8
lg КОЕ/г, Klebsiella spp. – 6,41,2 lg КОЕ/г. Грибы рода Candida выявлялись в
49,8 % проб, обсемененность ими кишечника свиней была высокой и
составляла 6,70,9 lg КОЕ/г. Довольно часто выявлялись Enterococcus spp.
(49,5 %), при этом средняя арифметическая величина обсемененности была
весьма значительной (6,90,8 lg КОЕ/г). Staphylococcus spp. обнаруживались в
27,2 % проб в количестве 4,71,1 lg КОЕ/г.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях инвазии
балантидиями происходит значительная колонизация кишечника свиней
13
транзиторными микроорганизмами на
представителей облигатной микрофлоры.
фоне
снижения
содержания
Оценка изменений состава микробиоценоза кишечника животных
в зависимости от степени вирулентности балантидий
Выявленные дисбиотические изменения в составе микробиоценоза
кишечника свиней, инвазированных балантидиями, представляли значительный
интерес для определения зависимости выраженного дисбиоза от степени
вирулентности данных простейших.
Нарушения содержания облигатной микрофлоры были выявлены у всех
опытных животных 3 групп зараженных балантидиями с разной степенью
вирулентности. Однако, показатели плотности колонизации кишечника
животных отдельными представителями микробиоценоза были различными.
При инвазии простейшими со слабо выраженной вирулентностью (1 группа
животных) изменения в составе микробиоценоза кишечника были наименее
выражены. Отмечено незначительное снижение количественных показателей
содержания Bifidobacterium spp. до 8,71,5 lg KOE/г по сравнению с
контрольными показателями (8,92,1 lg KOE/г; р>0,05), Lactobacillus spp. до
8,11,3 lg KOE/г (контроль 8,21,8 lg KOE/г; р>0,05), Bacteroides spp. до
10,10,9 lg КОЕ/г (контроль 10,63,7 lg KOE/г; р>0,05) и E. coli с нормальной
ферментативной активностью до 7,70,5 lg KOE/г (контроль 7,92,6 lg KOE/г;
р>0,05). Отмечено также незначительное повышение количественного
показателя содержания Enterococcus spp. (3,90,6 lg KOE/г; в контроле 3,61,2
lg KOE/г; р>0,05).
В кишечнике животных 2 группы происходило снижение содержания
представителей нормобиоты на фоне повышения содержания транзиторных
условно-патогенных микроорганизмов. Показатель колонизации Bifidobacterium
spp. составил 8,30,1 lg КОЕ/г, что было ниже контрольного значения (8,92,1 lg
КОЕ/г, р<0,05). Отмечено также уменьшение содержания Lactobacillus spp. до
7,20,03 lg КОЕ/г (в контроле – 8,21,8 lg КОЕ/г; р<0,05), E. coli до 7,00,3 lg
КОЕ/г (7,92,6 lg КОЕ/г; р<0,05) и Bacteroides spp. до 8,20,9 lg КОЕ/г (10,63,7
lg КОЕ/г; р<0,05). На фоне количественного дисбаланса микрофлоры
выявлялись и значительные изменения ее качественного состава. Помимо
снижения содержания кишечной палочки с нормальной ферментативной
активностью отмечено появление эшерихий с гемолитической способностью,
показатель их колонизационной активности составил 3,21,9 lg КОЕ/г. Уровень
содержания Proteus spp. составил 5,50,7 lg KOE/г (р<0,05), Klebsiella spp. –
4,20,8 lg KOE/г (р<0,05), Enterococcus spp. – 4,71,0 lg KOE/г (р<0,05),
Staphylococcus spp. – 6,00,4 lg KOE/г (р<0,05) и Сandida spp. – 3,30,1 lg KOE/г
(р<0,05). Следовательно, при заражении животных балантидиями со средней
степенью вирулентности, дисбиотические изменения микробиоты кишечника
были более выражены и сопровождались не только снижением содержания
14
представителей нормобиоты, но и повышением плотности колонизации
условно-патогенной микрофлоры.
У животных 3 группы выраженность дисбиотических изменений в
кишечнике нарастала, что проявлялось в еще большем снижении содержания
бактерий из состава нормальной микрофлоры и повышении массивности
обсеменения условно-патогенными микроорганизмами. Отмечено уменьшение
Bifidobacterium spp. до 7,40,4 lg КОЕ/г (р<0,05), Lactobacillus spp.– до 5,61,1
lg КОЕ/г (р<0,05), E. coli.– до 6,42,0 lg КОЕ/г (р<0,05) и Bacteroides spp. – до
7,51,6 lg КОЕ/г. На этом фоне происходило повышение колонизационной
активности условно-патогенных микроорганизмов. Так, уровень содержания
гемолитических эшерихий увеличивался до 5,7  1,8 lg КОЕ/г, Proteus spp. – до
6,80,9 lg КОЕ/г (р<0,05), Klebsiella spp. – до 6,32,1 lg КОЕ/г (р<0,05),
Enterococcus spp. – до 5,21,7 lg КОЕ/г (р<0,05) Staphylococcus spp. – до 6,91,8
lg КОЕ/г (р<0,05) и Candida spp. – до 6,22,4 lg КОЕ/г (р<0,05).
Анализ полученных результатов показал, что дисбиотические сдвиги в
составе микробиоценоза кишечника животных находятся в зависимости от
степени вирулентности выделенных балантидий и затрагивают как аэробный,
так и анаэробный его компоненты. Характерным для выявленного дисбиоза
является снижение колонизационной активности представителей нормобиоты и
увеличение количества условно-патогенных микроорганизмов, очень часто
ассоциаций нескольких видов. Полученные результаты указывают на тесную
взаимосвязь вирулентности балантидий при их инвазии, с одной стороны, и
состояния кишечного микробоценоза – с другой.
Межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней при инвазии
Balantidium coli
Показатели постоянства представителей микробоценоза
кишечника свиней
Особенности межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней
характеризовали используя показатели индекса постоянства, индекса
контагиозности и индекса значимости.
Значения индекса постоянства микроорганизмов в кишечнике свиней без
паразитарной инвазии свидетельствовали об абсолютном доминировании
Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. и Escherichia spp. (С=100 % для всех
видов бактерий). К этой же группе микроорганизмов были отнесены и
Bacteroides spp. (С=65,0 %).
Добавочную группу составили Candida spp. со значением С=21,8 %. В
транзиторную группу представителей микробоценоза кишечника вошли
представители семейства Enterobacteriaceae и Staphylococcus spp. (С=19,6 % и
14,8 % соответственно).
Доминирующими видами в составе микробиоценоза кишечника свиней,
инвазированных балантидиями, являются Escherichia spp., Bifidobacterium spp.
и Lactobacillus spp. (С=90,5 %; 87,2 % и 79,8 % соответственно), а также
Bacteroides spp. (С=63,5 %) (табл. 6).
15
К этой же группе относятся Enterococcus spp. (С= 57,6 %) и Candida spp.
(С=55,5 %), которые не входили в эту группу микроорганизмов кишечника
неинвазированных животных.
Таблица 6 – Структура и состав микробиоценоза кишечника свиней
неинвазированных балантидиями
№
п/п
1
2
3
4
1
1
2
Структура микробиоценоза
Доминирующие группы
микроорганизмов
Bifidobacterium spp.
Lactobacillus spp.
Escherichia spp.
Bacteroides spp.
Добавочные группы
Candida spp.
Транзиторные группы
Enterobacter spp.
Staphylococcus spp.
Показатель постоянства (С, %)
Неинвазированные животные
100,0
100,0
100,0
65,0
21,8
19,6
14,8
Было показано, что ценотип кишечника у свиней, инвазированных
балантидиями,
формируют
представители
нормальной
микрофлоры:
Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Escherichia spp. и Bacteroides spp., а
также Enterococcus spp. и Candida spp.(табл. 7)
Таблица 7 – Структура и состав микробиоценоза кишечника свиней
инвазированных балантидиями
№
п/п
1
2
3
4
5
6
1
2
1
Структура микробиоценоза
Доминирующие группы
микроорганизмов
Bifidobacterium spp.
Lactobacillus spp.
Escherichia spp.
Bacteroides spp.
Enterococcus spp.
Candida spp.
Добавочные группы
Staphylococcus spp.
Proteus spp.
Транзиторные группы
Klebsiella spp.
Показатель постоянства (С, %)
Инвазированные животные
87,2
79,8
90,5
63,5
57,6
55,5
48,9
30,0
20,4
16
Появление в группе резидентных видов Enterococcus spp. и Сandida spp. в
ассоциации с представителями нормальной микробиоты (Bifidobacterium spp.,
Lactobacillus spp., Escherichia spp. и Bacteroides spp.) свидетельствует о
развитии дисбиоза кишечника. Анализ ценотипа инвазированных животных
показал, что его изменения имеют последовательный характер и проявляются
на уровне экосистемы.
Уровень контагиозности таксонов микробиоты кишечника свиней
Распределение видов микроорганизмов в структуре микробиоценоза
кишечника животных оценивали с помощью индекса контагиозности (Уиттекер,
1980), который характеризуется коэффициентом вариации (табл. 8).
Уменьшение значений контагиозности для условно-патогенных
представителей в микробиоценозе кишечника животных при инвазии
балантидиями по сравнению с группой неинвазированных свиней приводит к
освобождению экологических ниш успешно занимаемых представителями
транзиторной микрофлоры, в результате чего индекс контагиозности ее
представителей уменьшается. Данное соотношение выявляет диспропорцию
участия в горизонтальной структуре экосистемы кишечника при инвазии
балантидиями основных симбионтов и представителей транзиторной
микрофлоры.
Таблица 8 – Степень контагиозности основных представителей микробиоценоза
кишечника обследованных групп животных
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Микроорганизмы
Bifidobacterium spp.
Lactobacillus spp.
Escherichia spp.
Bacteroides spp.
Enterococcus spp.
Candida spp.
Staphylococcus spp.
Proteus spp.
Klebsiella spp.
Обследуемые животные
Неинвазированные
Инвазированные
животные
животные
0,60,4
2,90,4
0,80,3
2,50,5
0,70,3
1,80,6
0,30,3
1,60,5
0,90,3
0,50,3
1,60,4
0,60,2
0,90,3
0,30,2
0,80,2
0,30,1
0,60,3
0,20,2
Оценка значимости участников микробоценоза кишечника свиней
Оценку значимости представителей нормальной микрофлоры и условнопатогенных микроорганизмов у инвазированных и неинвазированных свиней
проводили с помощью индекса значимости, предложенного М.П. Наткевичайте
– Иванаускене (1985) (табл. 9).
17
Таблица 9 – Индекс значимости микроорганизмов в кишечном
микробиоценозе животных
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Микроорганизмы
Bifidobacterium spp.
Lactobacillus spp.
Escherichia spp.
Bacteroides spp.
Enterococcus spp.
Proteus spp.
Klebsiella spp.
Candida spp.
Staphylococcus spp.
Индекс значимости микробиоценоза
животных (%)
Неинвазированных
Инвазированных
животных
животных
28,4
11,6
27,9
12,6
24,6
15,3
22,6
16,3
12,5
24,6
7,7
16,8
5,7
17,1
8,7
18,2
0,4
7,8
Показано, что наиболее значимыми в составе микробиоценоза кишечника
неинвазированных животных были представители облигатной микробиоты:
Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Escherichia spp. и Bacteroides spp., тогда
как в кишечнике животных с балантидиазом индекс значимости Bifidobacterium
spp. уменьшился до 11,6 %, Lactobacillus spp. – до 12,6 %, Escherichia spp. – до
15,3 % и Bacteroides spp. – до 16,3 %. Уменьшение значимости этими
бактериями своего доминирующего положения привело к увеличению
значимости условно-патогенных микроорганизмов. Наибольшие значения
индекса значимости были у Enterococcus spp. (24,6 %), Candida spp. (18,2 %) и
Klebsiella spp. (17,1 %).
Изучение межмикробных взаимодействий в составе микробиоценоза
кишечника свиней с балантидиазом показало, что при инвазии балантидиями
происходят компенсированные качественные и количественные сдвиги
кишечного микробоценоза.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что в
широком спектре представителей паразитоценоза кишечника свиней города
Ульяновска и Ульяновской области, балантидии составляют 18,78 % от общей
инвазивности свиней простейшими, что обуславливает
необходимость
широкого внедрения в практику ветеринарных лабораторных методов
исследований выделения и идентификации Balantidium coli. Проведенный
комплексный анализ состояния микробиоценоза кишечника свиней при
балантидиазной инвазии позволил выявить качественные и количественные
изменения, отражающие формирование дисбиоза, его тяжесть и зависимость от
степени вирулентности балантидий.
Полученные данные расширяют и
углубляют представления о влиянии простейших на межмикробные
взаимодействия в кишечнике животных.
18
ВЫВОДЫ
1. Выявлено 11 видов кишечных паразитов свиней в г. Ульяновске и
Ульяновской области, из которых 8 видов представлены простейшими и 3 вида
– гельминтами. Видовой спектр простейших включает инфузории (Balantidium
coli), саркодовые (Blastocystis sp., E. hartmanni, E. coli, Endolimax nana,
Iodamoeba butschlii), жгутиковые (Lamblia intestinalis)
и кокцидии
(Cryptosporidium parvum). Инвазированность свиней простейшими составляет
81,7 % , балантидиями – 18,78 %.
2. Установлена типичная морфология in vivo выделенных Вalantidium
coli; при культивировании на среде Суреша отмечено увеличение количества
инфузорий с максимальными размерами с 11,5 до 26,3 % и уменьшение – с
минимальными до 11,3%. Определена разная степень вирулентности у 60,4%
идентифицированных балантидий.
3. Обнаружено, что при балантидиазе свиней происходит значительное
снижение содержания облигатной микробиоты толстой кишки на фоне
увеличения микробного числа транзиторных видов, что свидетельствует о
глубоких дисбиотических изменениях данного биотопа.
4. Выявленный дисбиоз кишечника имел более выраженный характер при
инвазии балантидиями с высокими показателями вирулентности LD50/lg
(5,6±0,9-6,7±0,8 мк/мл), выделение авирулентных простейших сопровождалось
незначительными изменениями микробоценоза.
5. Балантидиаз у свиней сопровождался полным доминированием
Escherichia spp. (С=90,5 %), широким диапазоном анаэробных бактерий
(Bifidobacterium spp. (С=87,2 %), Lactobacillus spp. (С=79,8 %) и Bacteroides
spp. (С=63,5 %). К этой же группе относились Candida spp. (С=55,5 %) и
Enterococcus spp. (С=57,6 %), которые у животных без инвазии не входили в
группу доминирующих микроорганизмов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Карпеева, Е.А. Кишечный амебиаз: клиника и диагностика / Е.А. Карпеева,
Н.А. Ильина, И.Т. Гусева, Д.В. Шабанов // Образование и здоровье.
Экономические, медицинские и социальные проблемы: материалы III
Международной научно-практической конференции, декабрь 2008. – Пенза:
Приволжский дом знаний, 2008. – С. 29-30.
2. Карпеева, Е.А. Бактериальная флора кишечника в зависимости от вида
заболевания желудочно-кишечного тракта / Е.А. Карпеева, Н.М. Касаткина,
Н.А. Ильина // III тысячелетие-новый мир: Труды Международного Форума
по проблемам науки, техники и образования, 2-5 декабря 2008. – М.:
Академия наук о Земле, 2008. − Т.3. − С. 131-133.
3. Карпеева, Е.А. Балантидиаз свиней / Е.А. Карпеева, Д.В. Шабанов //
Фундаментальные исследования. − 2008. − № 11. − С. 70-72.
4. Карпеева, Е.А. Общие и специфические свойства бактерий семейства
Enterobacteriaceae / Е.А. Карпеева, Н.А. Ильина, Д.В. Шабанов, И.Т. Гусева
19
5.
6.
7.
8.
// Современный мир, природа и человек: межвузовский сборник научных
трудов. − Томск. − 2009. − Т. 1, № 1. − С. 67-68.
Карпеева, Е.А. Экспериментальная модель заражения лямблиями крыс / Е.А.
Карпеева, Н.А. Ильина, Г.В. Криушинская // Естественные и технические
науки. − 2009. − № 4(42). − С. 70-71.
Карпеева, Е.А. Экологические параметры микробиоты кишечника при
протозойных инвазиях / Н.А. Ильина, Н.М. Касаткина, Н.И. ПотатуркинаНестерова, Ю.Ю. Красноперова. Е.А. Карпеева. − Ульяновск: Корпорация
технологий продвижения, 2009. − 80 с.
Карпеева, Е.А. Экологические параметры микробиоты кишечника при
протозойных инвазиях / Н.А. Ильина, Н.М. Касаткина, Н.И. ПотатуркинаНестерова, Ю.Ю. Красноперова, Е.А.Карпеева // III тысячелетие-новый
мир: Труды Международного Форума по проблемам науки, техники и
образования, 1-4 декабря 2009. − М.: Академия наук о Земле. − 2009. − Т. 2.
− С.108-109.
Карпеева, Е.А. Вирулентность изолятов Balantidium coli / Е.А. Карпеева,
И.Д. Ефремова,
Д.В. Шабанов, Н.А. Ильина // Фундаментальные
исследования. − 2010. − № 2. − С. 45-47.