Высвобождения окиси азота в сочетании с нестероидными противовоспалительными предотвращает патологию
реклама
Высвобождения окиси азота в сочетании с нестероидными противовоспалительными предотвращает патологию при мышечной дистрофии и улучшает лечение стволовыми клетками. Мышечные дистрофии являются клинически и молекулярно генетических гетерогенными заболеваниями, вызывающими истощение скелетных мышц, тяжелое местное воспаление, и по крайней мере, первоначально регенерацию мышц, для которых нет эффективной терапии. При наиболее тяжелых формах, таких как мышечная дистрофия Дюшенна, регенерация мышц постепенно уменьшается, что приводит пациента к полному параличу и смерти, как правило, от дыхательной и / или сердечной недостаточности. Терапевтические протоколы используемые в настоящее время на основе кортикостероидов с некоторым уменьшением прогрессирования заболевания, связаны с серьезными побочными эффектами. Альтернативные фармакологические стратегии до сих пор не дали благоприятных результатов в клинических испытаниях, и они не вошли в клиническую практику. Исследования на мышах изучили возможные терапевтические стратегии, начиная от ингибиторов деацитилаз, ингибирования миостатина, гиперэкспрессией инсулиноподобного фактора роста 1 для пропуска видоизмененного экзона и клеточной терапии с мезангиобластными стволовыми клетками. Хотя обнадеживает то, что эти подходы все еще не имеют разрешения на их использование у больных и нет точных данных о долгосрочной эффективности, безопасности и переносимости, кроме того, они дороги, и в некоторых случаях они предназначены только для подгруппы пациентов. Развитию терапии стволовыми клетками также препятствуют проблемы, связанные с изоляцией, ростом в пробирке, и эффективным приживлением клеток. Для решения этих вопросов, мы разработали лечение, комбинируя известные положительные эффекты оксида азота ( NO) в восстановлении и регенерации мышц с нестероидными противовоспалительными. В качестве препарата выбора, мы выбрали HCT 1026, производное флурбипрофена, одного из наиболее сильных нестероидных противовоспалительных средств, который высвобождает NO и не имеет серьезных побочных эффектов кортикостероидов. Важным значением для немедленного тестирования в клинике является то, что НСТ 1026 безопасен для желудочно-кишечного тракта, и он был одобрен для использования в организме человека, и эффективен при пероральном введении, и , таким образом, подходит для длительного лечения. В качестве второго важного шага в развитии эффективного терапевтического протокола для мышечной дистрофии, мы объединили это фармакологическое лечение с внутриартериальной доставкой мезоангиобластов. Эффект HCT 1026 был протестирован на двух моделях мышечной дистрофии: α - саркогликан (SG) -нулевых мышах и MDX , при долгосрочном ( 1 год ) лечении. HCT 1026 значительно замедляет развитие болезни, и поддерживает целостность мышц и функцию через механизмы, включающие ингибирование воспаления и сохранение количества спутниковых клеток и их активности. HCT 1026 был значительно более мощным, чем преднизолон, который был использован в качестве эталонного кортикостероида, и не вызывает побочных эффектов. Кроме того, медикаментозное лечение значительно улучшило терапевтический потенциал мезоангиобластов за счет увеличения их миграции к дистрофическим мышцам. Эти результаты открывают окно эффективного лечения мышечной дистрофии. Результаты Первую серию экспериментов проводили у α -SG- нулевых мышей, мышиной модели поясно- конечностной мышечной дистрофии с тяжелым фенотипом. Группы мышей (18 животных на группу ) обрабатывали в течение 12 месяцев HCT 1026 ( 30 мг / кг массы тела) или преднизолоном ( 2 мг / кг ). Контрольные группы, получающие ту же диету без любого препарата или донор NO - динитрат изосорбида (ISDN ; 30 мг / кг ), анализировали параллельно. Флурбипрофен не использовался из-за его известной долгосрочной токсичности, тогда как используемая суточная доза HCT 1026 производит противовоспалительную активность без признаков токсичности. Введение лекарственного средства в рацион привело к обнаружению флурбипрофена в плазме (активный метаболит НСТ 1026 ) в диапазоне 16-20 мкм после 30 дней или 44 мкМ после 6 месяцев. Содержание в плазме находится в том же порядке, что у здоровых добровольцев после лечения в течение 7 дней HCT 1026 при 100 и 200 мг перорально. Доза преднизолона была аналогична использованной в других исследованиях у мышей. Мы начали лечение через 1 месяц после отъема , примерно в начале проявления симптомов болезни, имитируя лечение больных детей. Для оценки эффективности мы опирались на морфологические, гистохимические и функциональные параметры. После умерщвления животных были проведены гистологические анализы костей , печени, селезенки , головного мозга, почек, желудка , легких и сердце, чтобы проверить наличие основных признаков токсичности HCT 1026. Нет соответствующих гистологических различий в этих органах, обнаруженых между α -SG -нулевыми и дикого типа (WT) мышами, и никаких существенных гистологических изменений не наблюдалось в течение 12 -месячного лечения [ см. Рис. 5 ]. HCT 1026 уменьшает креатинкиназу в сыворотке крови α -SG- нулевых мышей. Креатинкиназа, фермент поврежденных или некротических волокон, обычно используется в качестве биомаркера тяжести мышечной дистрофии. Сывороточные уровни креатинкиназы у необработанных α -SG- нулевых мышей были выше, чем у животных WT уже в течение первых 2 месяцев жизни , и они постепенно увеличивалась до 6 месяцев, после чего наблюдалось снижение (рис. 1 ), в соответствии с резким сокращением мышечной ткани, что происходит на более поздних стадиях заболевания ( см. также рис. 2). В группе, получавшей HCT 1026, уровни креатинкиназы была значительно снижене по отношению к наблюдаемым у необработанных животных ( на 22,2 % , 44,9 % и 75,7% в 3, 4 и 6 мес соответственно, р <0,05, п = 9 ) . Снижение уровней креатинкиназы наблюдалась также у преднизолон обработанных животных ( на 41,0 % , 42,2 % и 53,6 % через 3 , 4 и 6 мес соответственно Р <0,05 ; п = 9 ) (рис. 1) , в то время как ISDN не оказывает значительного влияния (SI табл. 1). HCT 1026 улучшает в пробирке и живом организме функции мышц у α -SG- нулевых мышей . Мышечную функцию оценивали с помощью тестов на колесе и беговой дорожке, которые измеряют добровольную подвижность животных и выносливость мышц соответственно. Необработанные α -SG- нулевые мыши показали значительное снижение подвижности в тесте на колесе (рис. 1 В) и малому времени истощения в беговом тесте (Рис. 1 C ) по сравнению с WT мышами. Группы, получавшие HCT 1026,показали результаты значительно лучшие , чем необработанные дистрофические мыши в обоих тестах во всех временных точках. Через 6 месяцев в группе, получавшей преднизолон, тесты выполняяются значительно хуже, чем в группе, получавшей HCT 1026. Через 12 месяцев, преднизолон -обработанные животные также ухудшили показатели тестов на беговой дорожке , чем тех, кто получает HCT 1026. Преднизолон -обработанные мыши значительно лучше преодолели тредмил-тест, чем необработанные α -SG- нулевые мыши. Группа получавшая ISDN ведет себя аналогично необработанной α -SG- нулевых мышей (SI табл. 1). Мы определили ли пониженный уровень креатинкиназы в сыворотке крови, и увеличение производительности, индуцированной лечением, коррелирует с повышенной прочностью мышц. С этой целью 12 месяцев мы измерили силу камбаловидной и EDL мышцы. Мышцы от α -SG- нулевых мышей обладали меньшей силой тетанического сокращения по сравнению с WT мышами ( рис. 1 D). Лечение НСТ 1026 уменьшило эту разницу значительно. Преднизолон был значительно менее эффективен в предотвращении потери мышечной силы в камбаловидной мышце, и он не показал никакого эффекта в EDL. В конце эксперимента целостность сарколеммы исследовали путем оценки поглощение синего красителя Эванса, который окрашивает серьезно поврежденные и умирающие волокна. EDL и камбаловидная мышца от α -SG- нулевых мышей, необработанные или обработанные преднизолоном, показали аналогичное повышение поглощения красителя по сравнению с EDL от мышей WT (рис. 2 C). Никаких существенных различий между этими группами не было обнаружено. В отличие от этого, мышцы α -SG -нулевых мышей, получавших HCT 1026, отображают значительно меньшее поглощение красителя (рис. 2 C и данные не показаны). HCT 1026 усиливает регенерацию и защищает скелетных мышц у α -SGнулевых мышей от повреждения. Оценку H & E- окрашенных срезов проводили на передней большеберцовой мышцы и диафрагме. Мышцы получены у необработанных α -SG- нулевых мышей показали прогрессирующую дегенерацию с появлением некротических и кальцинированных волокон, которая сопровождалась увеличением центральных ядер, что отображает регенерацию волокон на ранней стадии, а затем снижение , скорее всего, из-за истощения клетоксателлитов (рис. 2 а и В) . Лечения преднизолоном лишь слегка улучшило этих параметры , тогда как ISDN не дало никаких существенных эффектов (SI табл. 1). С другой стороны, мышечная архитектура была почти нормальной в группах, получавших HCT 1026, со значительно меньшим количеством некротических волокон, даже на 12-месячный момент времени. Интересно, что количество волокон с центральными ядрами была выше у HCT 1026 -обработанных животных , и не снижалась с течением времени , что указывает на отсутствие истощения спутниковых клеток, в соответствии с уровнями креатинкиназы сыворотки, и наблюдаемым снижением мышечной массы. Дополнительное подтверждение благоприятного воздействия на скелетные мышцы HCT 1026 получено из анализа частоты гистограмм площади поперечного сечения (CSA) у отдельных волокон. У необработанных α -SG- нулевых мышей CSA волокон была очень гетерогенная по сравнению с CSA волокон мышей дикого типа, значения распределены между 250 и 3000 мкм2 , крупнейший диаметр считается знаком дегенерации ( патологическая гипертрофия) (рис. 2 D). В отличие от этого, частота гистограммы HCT 1026 обработанных животных показали значительно более однородным распределением CSA значений, которые существенно не отличались от тех, которые наблюдались у мышей дикого типа. Однородность в значениях CSA наблюдалась также у преднизолон-обработанных животных, но только до 6 месяцев, а после 12 месяцев распределение CSA значений было гетерогенным, как у необработанных α -SG- нулевых мышей. HCT 1026 увеличивает дифференцировку спутниковых клеток и резистентность к апоптозу , и сохраняет их количество в живом организме . Результаты, полученные до сих пор предполагают, что механизм действия HCT 1026 включает в себя конкретное благотворное влияние на клетки-сателлиты. Поэтому мы оценили действие препарата на дифференцировку спутниковых клеток, пролиферацию и устойчивость к апоптогенным сигналам в цитотоксической среде дистрофических мышц. Результаты, полученные в пробирке и в естественных условиях ясно показывают, что лечение НСТ 1026 значительно увеличило дифференцировку спутниковых клеток и выживания клеток , что приводит к увеличению популяции спутниковых клеток ( С. И. и С. И. Результаты рис. 6). Эффективность HCT 1026 этих параметров по-прежнему значима после 12 месяцев лечения. HCT 1026 и преднизолон оказывают противовоспалительное действие на скелетные мышцы α -SG- нулевых мышей. Воспаление играет важную роль в патогенезе мышечной дистрофии, потому что богатый воспалительный инфильтрат, диспергированный в основном в соединительной ткани дистрофических мышц, которая постепенно заменяют мышечные волокна, что приводит к снижению мышечной силы и ухудшению заболевания. Окрашивание выявило частые очаги фиброза в мышцах необработанных α -SG- нулевых мышей (фиг. 3 А и Б), инфильтрат состоит в основном из CD11 + макрофагов между волокнами, которые были выявлены путем окрашивания ламинина (фиг. 3 D ). Мы исследовали также экспрессию нескольких провоспалительных цитокинов , и было установлено, что в дистрофических мышцах TGF- β , макрофагального воспалительного белка - 1α ( MIP1α ) и хемоаттрактант моноцитов белок -1 ( МСР-1 ) увеличиваются (рис. 3 C ) . Мы обнаружили, что лечение HCT 1026 значительно сократило количество воспалительных инфильтратов, количество фиброзной ткани, и концентрации TGF- β , MIP- 1α , и МСР-1 , что указывает на ингибирование воспаления, что играет важную роль в действии HCT 1026 ( рис. 3). Преднизолон уменьшил воспалительные инфильтраты и экспрессию цитокинов, однако он не снижает образование фиброзной ткани. Эти эффекты, а также ограниченное влияние на долгосрочное восстановление мышц и защиты от повреждений (рис. 2), могут внести объяснение того, почему преднизолон не приводит к существенному улучшению функции мышц . HCT 1026 улучшает дистрофический фенотип мыши MDX . MDX мышей ( девять животных на группу ) обрабатывали HCT 1026 (30 мг / кг), или они получили простую диету (контроль) . Креатинкиназа сыворотки , подвижность на колесе и беговой дорожке и мышечная морфология оценивались через 6 месяцев. Результаты ясно показывают, что длительное лечение НСТ 1026 оказывает благотворное влияние у этих животных. Данные, представленные в таблице 2 С. И. и С. и рис. 7 показывают, что НСТ 1026 значительно снижало уровни креатинкиназы, улучшенные тесты подвижности, снижение повреждений мышц и увеличение волокон с центральными ядрами. Кроме того, у мышей MDX мы не обнаружили никаких признаков токсичности HCT 1026 в различных тканях и органов (данные не показаны). HCT 1026 усиливает терапевтическую эффективность мезоангиобластов, увеличивая их способность мигрировать и приживаться в дистрофических мышцах. Лечение с помощью НСТ 1026 не исправит генетический дефект основной мышечной дистрофии. Для решения этого вопроса мы объединили фармакологическое лечение с доставкой мезоангиобластов. Мезоангиобласты были трансдуцированны лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP, чтобы проследить их в различных тканях, и они были использованы либо необработанным , либо после12 -часового воздействия стромальных клеток, полученного фактора 1 ( SDF-1 , 50 нг / мл) ,лечение, которое увеличивает их сродство к мышцам ( 24). В противоречии с предыдущим отчетом, в котором клетки вводили α -SG- нулевым мышам три раза, здесь мы провели одну инъекцию, чтобы оценить лучшие изменения терапевтической эффективности индуцированной лекарственным лечением. Миграцию мезоангиобластов оценивали путем введения их в дозе 5 × 105 клеток на животное у α -SG- нулевых мышей необработанные или обработанные в течение 3 месяцев HCT 1026. Икроножная мышца и ткани других органов ( селезенке, печени , легких и почках, где мезоангиобласты, могут быть обнаружены ) были исследованы через 6 ч после инъекции, а процент клеток, которые мигрировали, оценивали путем ПЦР в реальном времени со специфическими праймерами для GFP. Миграция мезангиобластов в икроножных мышцах на стороне инъекции (правая сторона) была значительно повышена у HCT 1026 -обработанных животных (рис. 4) . Синергический эффект HCT 1026 с предварительной обработкой мезоангиобластов SDF-1 перед инъекцией также наблюдалось. Для проверки того, что рост миграции приведет также к увеличению коррекции фенотипа дистрофии, мышей, обработанных с или без HCT 1026, которые были убиты через 2 месяца после инъекции мезангиобластов. Эффективность лечения оценивали путем измерения α -SG экспрессии мРНК методом ОТ-ПЦР и α -SG белка методом вестерн-блоттинга и иммунофлюоресценции. Мезоангиобласты прижились и восстановили мышечные волокна в четырехглавой мышце, икроножной и камбаловидной мышцы на стороне инъекции (рис. 4 B- D). Этот эффект был в два раза выше у HCT 1026 обработанных животных. Сочетание этих двух методов лечения увеличило в 4 раза процент волокон , экспрессирующих -SG белок. Важно, что оба препарата увеличили прививку в контралатеральной мышце тоже. Способность HCT 1026 увеличить мезангиобласт -опосредованное восстановление волокна сопровождается усилением напряженности (рис. 4 E) , снижением повреждений мышц ( судят по снижению уровня креатинкиназы ; . Рис 4 F ), а также повышению производительности на беговой дорожке (рис. 4 G ), которые были значительными по сравнению с наблюдаемым у животных, получавших мезоангиобласты в отсутствие HCT 1026 лечения, и они дополнительно увеличились при SDF-1 предварительной обработке мезоангиобластов. Таким образом, HCT 1026 значительно увеличивает приживление мезангиобластов , и оно может иметь синергизм с другими способами лечения, что приводит к значительно более эффективной клеточной терапии. Обсуждение. Спустя два десятилетия после идентификации молекулярных дефектов ответственных за мышечную дистрофию Дюшенна, до сих пор нет эффективных методов лечения этого заболевания. Неудачи всех предыдущих фармакологических подходов оставили кортикостероиды в качестве единственного доступного медикаментозного лечения. Терапия кортикостероидами, несмотря на нынешние попытки улучшить протоколы управления, попрежнему имеет ограниченные клинические преимущества, и это сопровождается серьезными побочными эффектами. Лечение, которое мы здесь испытывали имеет несколько критериев для эффективной терапии , в том числе возможность блокировать или по крайней мере значительно задержать развитие болезни, практически без побочной токсичности, экономически эффективное, и , в конце концов , разрешить основной генетический дефект. В частности, лечение HCT 1026 было достаточным само по себе значительно задержать прогрессирование мышечной дистрофии в двух различных моделях, имеющих отношение к мышечной дистрофии у людей. Препарат оказался эффективным в исправлении биохимических и морфологических изменениях и в ограничении воспаления. Самое главное, препарат повышал мышечную силу и значительно увеличило способность животных выполнять различные тесты на моторику. Это функциональное улучшение было стойким после 12 месяцев лечения, когда болезнь у необработанных животных была тяжелой , наглядно демонстрирует эффективность лечения в замедлении прогрессирования заболевания. Долгосрочные положительные эффекты не наблюдались ни для одного из экспериментального лечения мышечной дистрофии. Благотворное влияние NO на функции мышц хорошо известно, и механизмы его действия вполне понятны. Действительно, улучшение фенотипа дистрофии наблюдалось у нейронной NO- синтазы трансгенных мышей. Эти исследования стимулировали исследования о терапевтическом потенциале процедуры, основанной на введении Lаргинина, метаболического предшественника оксида азота, или молсидомином ,NO донором. Хотя некоторые улучшения мышечной морфологии наблюдается, в одном исследовании уровни креатинкиназы были снижены, эти процедуры не дали восстановления функции мышц, и они не улучшили тестов подвижности. Более того, эти эксперименты были краткосрочными исследованиями. Мы не нашли никаких улучшений морфофункциональных параметров α -SG- нулевых мышей после 6 -месячного лечения с ISDN .Обнаруживаются и стойкое восстановление функции мышц в нашем исследовании, скорее всего, потому, что НСТ 1026 объединяет в себе все положительные эффекты NO описанные выше с мощным противовоспалительным действием флурбипрофена, уступая препаратам наделеным новыми свойствами. Мы обнаружили, что важные механизмы совпадают для определения превосходного терапевтического потенциала HCT 1026. Препарат значительно ингибирует воспаление в дистрофических мышцах за счет снижения генерации провоспалительных цитокинов и уменьшения инфильтрации провоспалительных клеток. Кроме того, HCT 1026 имел определенное действие в сохранении числа и функции спутниковых клеток, защищая их от проапоптотической среды дистрофических мышц и увеличивая их способность дифференцироваться. Это действие объясняет, почему у HCT 1026 -обработанных животных , возможность повышение регенерации мышц, что оценено как увеличение числа центральных ядер, уменьшенное количество некротических волокон и нормальная CSA была сохранена . Благоприятный эффект лечения мы сравнивали с преднизолоном, одним из широко используемых кортикостероидов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Мы обнаружили, что HCT 1026 был более эффективной, чем стероид в улучшении морфологических, биохимических и функциональных параметров и что эти действия имеют место в отсутствие токсичных побочных эффектов. В частности, мы не наблюдали повреждение желудка, которое сводится к минимуму благодаря NO -донорному фрагменту (16). Кроме того, ограниченные положительные эффекты стероидов уменьшаются со временем, становится незначительным на более поздних стадиях заболевания. Предыдущие исследования у MDX мышей показали, что кортикостероиды либо самостоятельно, либо в сочетании с другими методами лечения оказывают благоприятные эффекты, терапия разработана только как краткосрочные протоколы лечения (2-3 месяцев в среднем ). В организме человека, однако, лечение должно быть доставлено долгосрочным, ситуация, в которой побочные эффекты кортикостероидов еще представляют собой серьезную проблему (21). В отличие от кортикостероидов НСТ 1026 имеет профиль безопасности, который перспективен для его использования в будущем у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Из-за отсутствия кортикостероидной токсичности, HCT 1026 является более перспективной терапией, чем сочетание L -аргинина и дефлазакорта недавно предложеное (25). Вторым важным преимуществом лечения НСТ 1026 является то, что существенно повысило прививки к мышце внутриартериально доставленых мезоангиобластов ,тип стволовых клеток, которые показали свою эффективность при коррекции генетического дефекта мышц (8). Это усовершенствование привело к значительному увеличению их терапевтической эффективности, как показали морфологические и биохимические показатели и в естественных условиях подвижности на беговой дорожке. Этот эффект был более усилен в пробирке воздействием донорских клеток на SDF-1, молекула увеличивает самонаведение мезоангиобластов (24), это означает, что HCT 1026 может быть использовано в комбинированной терапевтической стратегии, чтобы получить синергический положительный эффект. Важно, что увеличение приживления мезоангиобластов к мышце сопровождается сопутствующим сокращением их числа в соответствующих фильтрах органов. Это число является большим, и это может привести к повреждению этих органов (9). Повышение эффективности доставки стволовых клеток снизит либо количество клеток, необходимых для одной инъекции или количество инъекций , что приводит к оптимизации клеточной терапии. По сравнению с текущей экспериментальной терапией, лечение, которое мы предлагаем, имеет явные преимущества. Несмотря на недавние обнадеживающие результаты, терапия стволовыми клетками сама по себе не может изменить уже существующие патологические изменения, и все еще страдает от неэффективности приживления (9). Этот недостаток может исходить из ограниченного самонаведения этих клеток на мышцы и пониженную способность к сопротивлению цитотоксической среды, существующие в поврежденных мышцах (23, 29). Эти проблемы уменьшены путем сочетания мезоангиобластов с HCT 1026. В текущем сценарии доклинических и ранних клинических исследованиях HCT 1026 показывает явные преимущества, которые является экономически доступными, неиммуногенные, подходит для всех мутаций (в отличие от олигонуклеотидов для пропуска экзонов ), и с проверенным профилем безопасности. Мы пришли к выводу, что терапевтические стратегии, представленные в этой работе представляют собой значительный шаг вперед и создает условия для немедленного испытания на пациентах. Материалы и методы Лечение животных. Мышей обрабатывали HCT 1026 и преднизолона с пищей с одобрения Институционального комитета по этике. Мезангиобласты D16 -GFP , предварительно обработанные с или без SDF-1 , были доставлены путем внутриартериальной инъекции через правую бедренную артерию (8). Определение креатинкиназы сыворотки. Сывороточные концентрации креатинкиназы были измерены в образцах крови мышей при помощи косвенного колориметрического анализа (Roche Diagnostics , Basel , Швейцария), в соответствии со стандартными процедурами. Функциональные тесты. Тетаническую силу нормализовали по оценкам CSA предполагая цилиндрическую форму мышц и плотности 1,06 мг/мм3. Нормализованная тетаническая сила выражается как кН/м2. Абсолютные (Р о) и удельное усилие (Р о / CSA) из одного мышечного волокна были измерены (31). Гистология и иммуногистохимия. Морфометрия. Мышцы иссекают и замораживают в изопентане, охлажденным жидком азоте. Повреждение мембраны волокон оценивали с помощью окрашивания синеим красителем Эванса. Серийные срезы мышц окрашивали Н & Е, с помощью Азаном- Малори техники , или иммуноокрашиванию как описано в ссылке. Морфометрические анализы для оценки распределения волокна CSA были проведены на 300 волокон в мышце, на H & E окрашенных участках передней большеберцовой мышце, используя 1,63 программное обеспечение ( Scion Corporation, Frederick , MD). Анализ цитокинов. TGF- β и MIP- 1α концентрации были определены на равные количества белковых лизатов из передней большеберцовой мышцы , используя Quantikine набор ELISA (R & D Systems , Minneapolis, MN ) . MCP-1 концентрации оценивали с помощью проточной цитометрии (BD Bioscience , San Jose , CA). Измерения РНК и белка. В режиме реального времени количественный ПЦР-анализ проводили на ДНК из образцов ткани с помощью Mx3000P ПЦР в реальном времени системы обнаружения (Stratagene , La Jolla, CA). Каждый образец кДНК амплифицировали в дубликате с использованием SYBR Green Supermix (Bio-Rad , Hercules, CA) для GFP ( GFP праймеров : вперед , AAGTTCATCTGCACCACCG , наоборот, TCCTTGAAGAAGATGGTGCG ) . Образцы белка от гомогенизированных тканей анализировали Вестерн-блоттингом с помощью моноклональных антител анти- α SG ( Novocastra , Ньюкасл -апон-Тайн , Великобритания) и GAPDH ( Biogenesis , Kingston , NH) (8). Статистический анализ . Величины выражены как среднее ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, последующего Student- Newman - Keul теста. Вероятность <5% (P < 0,05) рассматривалось как статистически значимое. Ссылки. ↵ Emery AE (2002) Lancet 359:687–695. CrossRef Medline Web of Science ↵ Manzur AY , Kuntzer T , Pike M , Swan A (2004) Cochrane Database Syst Rev, CD003725. Search Google Scholar ↵ Skuk D , Vilquin JT , Tremblay JP (2002) Curr Opin Neurol 15:563–569. CrossRef Medline Web of Science ↵ Minetti GC , Colussi C , Adami R , Serra C , Mozzetta C , Parente V , Fortuni S , Straino S , Sampaolesi M , Di Padova M , et al. (2006) Nat Med 12:1147–1150. CrossRef Medline Web of Science ↵ Bogdanovich S , Krag TO , Barton ER , Morris LD , Whittemore LA , Ahima RS , Khurana TS (2002) Nature 420:418–421. CrossRef Medline ↵ Barton ER , Morris L , Musaro A , Rosenthal N , Sweeney HL (2002) J Cell Biol 157:137–148. Abstract/FREE Full Text ↵ Lu QL , Mann CJ , Lou F , Bou-Gharios G , Morris GE , Xue SA , Fletcher S , Partridge TA , Wilton SD (2003) Nat Med 9:1009–1014. CrossRef Medline Web of Science ↵ Sampaolesi M , Torrente Y , Innocenzi A , Tonlorenzi R , D'Antona G , Pellegrino MA , Barresi R , Bresolin N , De Angelis MG , Campbell KP , et al. (2003) Science 301:487–492. Abstract/FREE Full Text ↵ Cossu G , Sampaolesi M (2004) Trends Mol Med 10:516–520. CrossRef Medline Web of Science ↵ Kaliman P , Canicio J , Testar X , Palacin M , Zorzano A (1999) J Biol Chem 274:17437–17444. Abstract/FREE Full Text ↵ Pisconti A , Brunelli S , Di Padova M , De Palma C , Deponti D , Baesso S , Sartorelli V , Cossu G , Clementi E (2006) J Cell Biol 172:233–244. Abstract/FREE Full Text ↵ Tatsumi R , Hattori A , Ikeuchi Y , Anderson JE , Allen RE (2002) Mol Biol Cell 13:2909–2918. Abstract/FREE Full Text ↵ Stamler JS , Meissner G (2001) Physiol Rev 81:209–237. Abstract/FREE Full Text ↵ Nisoli E , Falcone S , Tonello C , Cozzi V , Palomba L , Fiorani M , Pisconti A , Brunelli S , Cardile A , Francolini M , et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:16507–16512. Abstract/FREE Full Text ↵ Wehling M , Spencer MJ , Tidball JG (2001) J Cell Biol 155:123–131. Abstract/FREE Full Text ↵ Wallace JL , Reuter B , Cicala C , McKnight W , Grisham MB , Cirino G (1994) Gastroenterology 107:173–179. Medline Web of Science ↵ Scatena R (2004) Curr Opin Investig Drugs 5:551–556. Medline ↵ Duclos F , Straub V , Moore SA , Venzke DP , Hrstka RF , Crosbie RH , Durbeej M , Lebakken CS , Ettinger AJ , van der Meulen J , et al. (1998) J Cell Biol 142:1461–1471. Abstract/FREE Full Text ↵ van Groen T , Kadish I (2005) Brain Res Brain Res Rev 48:370–378. CrossRef Medline ↵ Zacharowski P , Zacharowski K , Donnellan C , Johnston A , Vojnovic I , Forte P , Del Soldato P , Benjamin N , O'Byrne S (2004) Clin Pharmacol Ther 76:350–358. CrossRef Medline Web of Science ↵ Dubowitz V (2005) Lancet Neurol 4:264. CrossRef Medline Web of Science ↵ Jejurikar SS , Kuzon WM, Jr (2003) Apoptosis 8:573–578. CrossRef Medline Web of Science ↵ Engvall E , Wewer UM (2003) FASEB J 17:1579–1584. Abstract/FREE Full Text ↵ Galvez BG , Sampaolesi M , Brunelli S , Covarello D , Gavina M , Rossi B , Costantin G , Torrente Y , Cossu G (2006) J Cell Biol 174:231–243. Abstract/FREE Full Text ↵ Archer JD , Vargas CC , Anderson JE (2006) FASEB J 20:738–740. Abstract/FREE Full Text ↵ Voisin V , Sebrie C , Matecki S , Yu H , Gillet B , Ramonatxo M , Israel M , De la Porte S (2005) Neurobiol Dis 20:123–130. CrossRef Medline Web of Science ↵ Barton ER , Morris L , Kawana M , Bish LT , Toursel T (2005) Muscle Nerve 32:751–760. CrossRef Medline Web of Science ↵ Chakkalakal JV , Thompson J , Parks RJ , Jasmin BJ (2005) FASEB J 19:880–891. Abstract/FREE Full Text ↵ Tews DS , Goebel HH (1996) J Neuropathol Exp Neurol 55:342–347. Medline Web of Science ↵ Rossi R , Bottinelli R , Sorrentino V , Reggiani C (2001) Am J Physiol 281:C585–C594. Search Google Scholar ↵ D'Antona G , Pellegrino MA , Adami R , Rossi R , Carlizzi CN , Canepari M , Saltin B , Bottinelli R (2003) J Physiol (London) 552:499–511. Abstract/FREE Full Text Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org Оригинал статьи: http://www.pnas.org/content/104/1/264.long