Исследования в области клеточных технологий и тканевой

УДК 579.083.13
ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРЕДПРИЯТИЯ
«АНТИГЕН»
Кауламбаева М.З., Ахметсадыков Н.Н., Стабаева Г.С.
ТОО НПП «Антиген»
Исследования в области клеточных технологий и тканевой инженерии научно-производственного предприятия «антиген»
Кауламбаева М.З., Ахметсадыков Н.Н., Стабаева Г.С.
Клеточные технологии, тканевая инженерия, фибробласты, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, коллаген, костный
мозг
Основные направления исследований лаборатории «Клеточной биотехнологии» НПП «Антиген»:
- приготовление жидких питательных сред, вспомогательных растворов и сыворотки крови КРС;
- пополнение и поддержание банка клеточных линий;
- создание и пополнение банка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека;
- применение клеточных технологий для лечения многих заболеваний;
- разработка технологии приготовления тканоинженерных конструкций с использованием ММСК для лечения ожогов и костных дефектов.
Research in the field of cell technology and tissue engineering research and production enterprise "antigen"
Kaulambaeva M.Z., Ahmetsadykov N.N., Stabaeva G.S.
Cell technologies, tissue engineering, fibroblasts, multipotent mesenchymal stromal cells, collagen, bone marrow
The Main trends of the studies of the laboratory "Celluar technology" RPI "Antigen":
- a preparation of the fluid media, auxiliary solution and bovine serum;
- Updating and maintaining a bank of cell lines;
- Creation and maintenance of the bank of multipotent mesenchymal stromal cells of human;
- The use of cellular technologies for the treatment of many diseases;
- Development of preparation technology TIS using MMSCs for the treatment of burns and bone defects.
Культивирование клеток человека и животных in vitro явилось крупнейшим достижением современной биологии. Клеточные технологии
в конце 20 века получили бурное развитие. Это не только производство вакцин и диагностикумов, но и разработка, усовершенствование и
внедрение в практику новых технологий производства иммунобиологических и лекарственных средств с использованием культур клеток,
разработка новых лекарственных форм и способов доставки в живой организм, а также проведение исследований по получению и
культивированию стволовых клеток человека.
В 2004 году в ТОО НПП «Антиген» была организована лаборатория «Клеточных технологий». На первых этапах работы нами были
отработаны технологии приготовления жидких питательных сред, вспомогательных растворов и нормальной сыворотки крови КРС,
используемых для культивирования
и криоконсервации культур клеток. В настоящее время нами разработаны стандарты организации
9 наименований жидких питательных сред вспомогательных растворов и сыворотки крови КРС для культур клеток. Лаборатория
«Клеточных технологий» НПП «Антиген» может полностью удовлетворить потребность других лабораторий в жидких питательных средах и
вспомогательных растворах на условиях свободной продажи.
Следующим этапом работы было создание банка перевиваемых, диплоидных и первичных культур клеток. Это связано с тем, что в
процессе длительного и крупномаштабного культивирования клеток животных и человека клетки способны изменять свои свойства с
увеличением числа пассажей. При культивировании in vitro на фоне клеток, соответствующих паспортным характеристикам культуры,
появляются различные полиморфные клетки, гигантские многоядерные или одноядерные клетки, с крупным или очень маленьким
ядром. Изменение морфологических свойств, как правило, ведет за собой изменение кариологических характеристик. В процессе
длительного пассирования изменяется модальный класс культуры и наблюдается редукция числа хромосом. Все эти изменения приводят,
в конечном счете, к изменению чувствительности культуры клеток к различным видам вирусов. Поэтому невозможно бесконечно долго
пассировать культуру клеток и при этом сохранять ее свойства. Для решения данной проблемы необходимо создавать производственные
и музейные банки клеточных культур, в которые закладываются очищенные от микоплазм и клоны клеточных линий, соответствующие
паспортным характеристикам.
Деконтаминация от микоплазм и клонирование с целью сохранения свойств культуры клеток представляет собой сложный и длительный
многоступенчатый процесс. После выделения клона в течение нескольких пассажей наращивали клеточную массу, затем проводили
цитологический, кариологический и бактериологический контроль полученного клона клеток. На длительное хранение закладывали те
клоны культуры клеток, которые наиболее соответствовали паспортным характеристикам и были свободные от микоплазм. В настоящее
время банк клеточных культур ТОО НПП «Антиген» насчитывает 15 клеточных линий (МДВК, СПЭВ, VERO, A4xL и др.), диплоидный штамм
эмбриональных фибробластов человека ЭФЧ 01/05, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга и культуры
клеток кожи человека. Для дальнейшего расширения коллекции клеточных культур НПП «Антиген» имет договореннсти о поставки
культур клеток из научных центров Москвы и Санкт-Петербурга. В случае дополнительного финансирования на базе лаборатории
«Клеточных технологий» можно создать коллекцию клеточных культур, соответствующую всем международным стандартам.
В процессе исследований нами получен диполоидный штам эмбриональных фибробластов человека, который обладает всеми
культурально-морфологическими свойствами, характерными для данного типа ткани и свободный от посторонних контаминантов.
Диплоидный штамм фибробластов человека ЭФЧ 01/05 за депонирован в Республикансткой коллекции микроорганизмов и
паспортизирован. Получение новых штаммов диплоидных культур является перспективным направлением в биотехнологии. Диплоидные
клетки используются для получение вакцин, диагностикумов и различных лекарственных средств.
Мы исследовали данный штамм фибробластов на определения условий культивирования , криоконсервации, сохранности и
ростстимулирующие свойства.
Культура фибробластов способна выделять ростовые факторы в культуральную среду и обладать регенирирующими свойствами. Поэтому
штамм ЭФЧ 01/05 можно использовать:
- в качестве фидерного слоя для культивирования стволовых клеток;
- в качестве субстрата для выделения ростовых факторов;
- для лечения переломов, костных деффектов и пародантита;
- для приживления имплантантов;
- лечения ожогов;
- в косметологии;
- в производстве биопрепаратов.
Нами были проведены исследования по применению штамма ЭФЧ 01/05 в сочетании с коллагеновым матриксом для костной регенерации,
лечения ожогов,хирургических ран, трофических язв и пародонтита. В результате проведенных исследований получены следующие
данные:
- регенерация костной ткани усиливается в 2-3 раза по сравнению с контролем;
- заживление ожогов, хирургических ран и трофических язв при применение суспензии фибробластов ускоряется в 1,5-2 раза по
сравнению с контролем.
Таким образом существует большая перспектива использования штамма фибробластов ЭФЧ 01/05 для лечения ожогов, костных
деффектов, переломов, в стоматологии и в косметологии. Это связано с тем, что введение клеток штамма ЭФЧ 01/05 усиливает
регенерирующие процессы в тканях.
Другим направлением исследований лаборатории «Клеточных технологий» является разработка технологии производства коллагена и
гиалуроновой кислоты из различных тканей. В результате проведенных исследований разработаны технологии приготовления коллагена
из костной ткани и сухожилий телят.Разработан и утвержден стандарт организации «Масса колагеновая» и получены два иновационных
патента по способам получения коллагена.Разработана технология получения гиалуроновой кислоты из гребешков. Данное направление
является очень перспективным, так как в Казахстане препараты на основе коллагена и гиалуроновой кислоты не производятся. Коллаген и
гиалуроновая кислота может применятся в медицине, ветеринарии и косметологии. Ислледования по применению коллагена и
гиалуроновой кислоты показали, что заживление ран и ожогов при использовании коллагеновых покрытий ускоряется в 2-3 раза. При
наличие дополнительного финансирования мы можем на базе «Антигена» создать линии по производству различных видов коллагена и
гиалуроновой кислоты.
Следующим направлением исследований лаборатории было разработка технологии выделения, культивирования и криоконсервации
стволовых клеток для коррекции утраченных функций органов и тканей. По этой теме в 2006-2008 годах нами от НЦБ РК получен грант на
исследования. В результате выполнения проекта нами разработан лабораторный регламент по выделению, культивированию и
криоконсервации стволовых клеток из фетального костного мозга и пуповинной крови. Получены два иновационных патента по
выделению и культивированию гемопоэтических
стволовых клеток пуповинной крови. Получены культуры мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) фетального костного мозга с последующей остеогенной дифференциацией. Нами
проведены иследования по применению ММСК коллагенового матрикса для костной пластике и лечения пародонтита. Результаты
проведенных исследований покаазали большую перспективность применения ММСК в травматологии и стоматологии.
В 2010-2012 годах ТОО Научно-производственное предприятие «Антиген» становится соисполнителем НТП «Инновационные технологии в
развитии клеточных трансплантаций и восстановлении функциональной активности органов и тканей» АО Национального научного
медицинского центра Министерства здравоохранения Республики Казахстан. Нами проведены следующие исследования:
1. Определение фенотипического состава и анеуплоидии культивируемых клеток фетального костного мозга человека в процессе
пассирования;
2. Применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных швов в эксперименте;
3. Определение пирогенности и общей токсичности коллагенового матрикса;
4. Экспериментальное обоснование применения клеточных технологий для лечения ран и трофических язв при локальной ишемии
нижних конечностей;
5. Применение клеточных технологий для лечения острого инфаркта миокарда в эксперименте;
6. Применение клеточных технологий для лечения диабетической ретинопатии в эксперименте;
7. Применение культуры клеток фибробластов человека ЭФЧ 01/05 в сочетании коллагеновым матриксом для лечения кондуктивной
тугоухости.
Для определения безопасности применения культивируемых клеток в медицине нами было проведено кариотипирование,
фенотипирование и мониторинг уровня анеуплоидии культур костного мозга человека в течении пяти пассажей. Кариологический анализ
показал, что в процессе пассирования модальный класс культуры не меняется и соответствует 46 хромосомам. Фенотипирование с
применением маркеров гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток показало, что в процессе пассирования в культуре клеток
происходит увеличение доли мезенхимальных и уменьшение доли гемопоэтических стволовых клеток. Уровень анеуплоидии в культуре
клеток костного мозга в течении пяти пассажей находился в пределах нормы. Таким образом, можно утверждать, что применение
культивируемых клеток костного мозга до пятого пассажа является безопасным методом лечения, так как не были выявлены признаки
малигнизации культуры клеток.
Исследования по определению пирогенности и общей токсичности показали, что коллагеновый матрикс, производимый в ТОО НПП
«Антиген», не является пирогенным и токсичным.
Применение культур фибробластов ЭФЧ 01/05, мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и ММСК для профилактики
несостоятельности легочных швов, для лечения ран и трофических язв при локальной ишемии нижних конечностей, диабетической
ретинопатии, кондуктивной тугоухости в эксперименте показало высокую эффективность и безопасность данного метода.
В настоящее время ТОО НПП «Антиген» занимается исследованиями в области применения клеточных технологий для лечения сахарного
диабета, постинфарктного кардиосклероза, воспалительно-деструктивных заболеваний суставов и
создания ткано-инженерных
конструкций на основе коллагенового матрикса, гиалуроновой кислоты и ММСК для лечения ожогов и костных дефектов.