Новый индуктор апоптоза - Препарат GA

НОВЫЙ ИНДУКТОР АПОПТОЗА В УКРАИНЕ
А.А.Литвиненко, В.Ф.Коноваленко
НИИ онкологии АМН Украины
Термин "апоптоз" (с греч. — опадание листьев) введен в научный
обиход в 1972 г. для обозначения формы гибели клеток, прототипом которой
является гибель тимоцитов под действием глюкокортикоидов. Эта форма
клеточной
смерти
была
отождествлена
с
ранее
описанной
программированной гибелью клеток: разница в обозначениях отражает
способы идентификации гибели — морфологический в первом и
биохимический во втором случае. Это отождествление, допускающее
использование двух терминов как равнозначных, сохраняется до настоящего
времени, хотя и вызывает критику. Во избежание неопределенности
сформулируем определения обоих понятий.
Программированная гибель — это активная форма гибели клетки,
являющаяся результатом реализации ее генетической программы или
ответом на внешние силы и требующая затрат энергии и синтеза
макромолекул de novo.
Апоптоз — это форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении
ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и
цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в
окружающую среду.
Несмотря на то, что обычно более принципиальным является аспект
программированности и активный характер гибели, чем сопутствующие ей
морфологические изменения, чаще используется термин "апоптоз", вероятно,
из-за его краткости.
Апоптоз обычно противопоставляется другой форме гибели клеток —
некрозу, который развивается при воздействии внешних по отношению к
клетке повреждающих агентов и неадекватных условий среды (гипоосмия,
крайние значения рН, гипертермия, механические воздействия, действие
агентов, повреждающих мембрану, формирование пор в мембране с участием
факторов комплемента) и проявляется набуханием клетки и разрывом
мембраны вследствие повышения ее проницаемости с выходом содержимого
клетки в среду.
Интерес к проблеме апоптоза (число посвященных ему публикаций в
последние годы увеличивается экспоненциально) после почти двух
десятилетий полузабвения связан с рядом обстоятельств. Прежде всего
появились методические возможности регистрации различных проявлений
апоптоза и анализа его молекулярных механизмов, которые оказались тесно
связанными с механизмами других "актуальных" феноменов (например,
активация клеток и связанная с ней биологическая сигнализация). Далее
изучение апоптоза оказалось очень продуктивным для понимания ряда
важнейших явлений и процессов, включая иммунный гомеостаз и онкогенез.
Наконец, в связи с апоптозом возникла необходимость пересмотра ряда
концептуальных основ физиологии и патологии: вместо прежних
представлений о гибели многоклеточного организма как отрицательном по
значимости и часто случайном явлении, идентифицируемом с некрозом,
сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в
пределах организма является закономерным и необходимым явлением, и
само существование многоклеточного организма подразумевает баланс
жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций.
В результате фагоцитоза, которому клетки подвергаются уже в
процессе развития апоптоза, их содержимое не выделяется в межклеточное
пространство, как это бывает при некрозе, когда вокруг гибнущих клеток
скапливаются их активные внутриклеточные компоненты, включая энзимы,
закисляется среда, что способствует гибели других клеток и развитию очага
воспаления. Апоптоз поражает индивидуальные клетки и практически не
отражается на их окружении.
Главным проявлением апоптоза является деградация хроматина. Ее
основой служит ферментативное расщепление ДНК. Оно происходит в
несколько этапов с формированием все более мелких фрагментов. Сначала
образуются фрагменты, включающие 700, 200-250, 50-70 тыс. пар оснований,
затем - фрагменты, содержащие 30-50 тыс. пар оснований. На этой стадии
происходит конденсация хроматина и инвагинации ядерной мембраны.
После реализации этого этапа процесс становится необратимым. Затем
наступает очередной этап деградации, который хорошо изучен и служит
наиболее широко принятым опознавательным признаком апоптоза — это
межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т. е. разрывы нитей ДНК,
находящихся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты,
кратные по величине 180-190 пар оснований, что соответствует
протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. Этот тип
деградации обычно завершается в течение суток. При всей типичности для
апоптоза этого типа расщепления ДНК известны примеры, когда процесс
ограничивается образованием более крупных фрагментов.[1].
Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом,
зависящим от температуры, источников энергии, синтеза РНК и белка de
novo. Различные этапы деградации ДНК катализируются разными формами
эндонуклеаз, отличающимися субстратной специфичностью и условиями
проявления активности (см. ниже).
Несмотря на безусловно ключевую роль деградации ДНК в
осуществлении апоптоза. между этими процессами нельзя поставить знак
равенства. Во-первых, морфологические и биохимические изменения в
цитоплазме и мембранах, характерные для апоптоза (снижение
трансмембранного потенциала митохондрий, накопление реактивных форм
кислорода и т. д.), могут быть индуцированы в энуклеированных клетках, т.
е. в ситуации, когда деградация хроматина не происходит в связи с его
отсутствием. Во-вторых, не разрушение ДНК и прекращение работы генов
являются непосредственной причиной смерти клетки при апоптозе,
поскольку их последствия сказываются несколько позже того срока, когда
наступает апоптотическая гибель клетки. Предполагают, что гибель
наступает из-за энергетического голода, вызванного расходованием АТФ на
работу по репарации поврежденной ДНК.[2].
Методы выявления апоптоза разнообразны. Ориентировочная
идентификация апоптоза возможна на основании вышеназванных
морфологических признаков. Более доказательные подходы в большинстве
случаев основаны на выявлении формирующихся разрывов ДНК, ее
деградации и потери клеткой части генетического материала. Чаше всего
используют электрофоретическое разделение полидезоксирибонуклеотидных
фрагментов, экстрагируемых из клеток: фрагменты образуют характерную
"лесенку" (серию прерывистых полос), отражающую дискретный характер
межнуклеосомных разрывов. Другие методы основаны на катализируемом
терминальной
дезоксирибонуклеотидилтрансферазой
синтезе
олигонуклеотидов из меченых предшественников и их встраивании в ДНК
через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов.
Встраивание меченых олигонуклеотидов затем выявляется с помощью
цитофлюорометрических или морфологических методов — TUNEL (TdTmediated dUTR-biotin nick end-labeling) или ISEL (in situ end-labeling). В
настоящее время широко распространяется цитофлюорометрический метод
выявления апоптотических клеток, основанный на утрате ими части
хроматина. При этом клетки обрабатывают йодидом пропидия, который
проникает в апоптотические клетки и взаимодействует с ДНК, и подвергают
их проточной цитофлюорометрии, выявляя долю клеток с гиподиплоидным
содержанием ДНК. [3]. Иногда параллельно используют другие красители
для одновременного выявления некротизированных клеток. На регистрации
снижения трансмембранного потенциала митохондрий основан метод
регистрации апоптоза по изменению окрашивания липофильными
катионными флуорохромами (например, родамином или йодидом
дигексилоксикарбоцианина), тропными к внутренней поверхности
митохондриальной мембраны.[4].
На основании знаний о роли апоптоза в осуществлении
физиологических процессов можно предположить, что недостаточность
проявления апоптоза должна отразиться на процессах морфогенеза,
элиминации
клеток
с
генетическими
поломками,
становлении
аутотолерантности и проявляться в форме разного рода дефектов развития,
аутоиммунных процессах и злокачественных опухолях.
Большую группу заболеваний, к генезу которых имеет отношение
подавление апоптоза, образуют злокачественные опухоли, особенно
имеющие гематогенное происхождение. В этом случае ключевым событием,
способствующим развитию патологии, чаще всего служат соматические
мутации, затрагивающие ген р53 (обычно его экзоны 5-8). Выше
упоминалось, что фактор р53 трансформирует сигнал о нерепарированных
разрывах цепей ДНК в сигнал к развитию апоптоза. Благодаря этому
элиминируются клетки с повреждениями генетического аппарата,
спонтанными или индуцированными (например, облученными). В
нормальных клетках белок р53 не выявляется, а при опухолях его мутантную
форму экспрессирует до 70% трансформированных клеток. Однако большой
разброс частоты мутаций р53 при различных злокачественных опухолях не
позволяет сделать универсального заключения относительно его роли в
патогенезе злокачественных процессов. [5].
Аномалии фактора р53, а также других внутриклеточных факторов,
контролирующих апоптоз, в процессе развития опухоли имеют отношение к
ее прогрессированию. Лишившись такого контроля, клетки, утрачивающие
связи с межклеточным матриксом и другими факторами нормального
микроокружения, не гибнут, а благополучно развиваются в чужой для них
среде, что способствует метастазированию опухолей.
Общеизвестным является факт рекомбинации гена bcl-2, при
лимфоме Беркитта и некоторых формах фолликулярных лимфом, когда он
транслоцируется из хромосомы 18 в ген Igh хромосомы 14. При тех же типах
лимфом выявляется также аналогичное перемещение гена с-mус из
хромосомы 8 в тот же локус Igh. He вызывает сомнений связь патогенеза с
этими
транслокациями,
которая
реализуется
через
повышение
резистентности измененных клеток к индукции апоптоза.
Изменения р53, гиперэкспрессия Вс1-1 и Вс1-xl, активация каспаз
являются основой формирования устойчивости к лечебным воздействиям,
основанным на индукции апоптоза опухолевых клеток - рентгено- и
радиотерапии, химиопрепаратам. Наиболее полной формой таковой
резистентности является множественная лекарственная устойчивость
опухолевых клеток. [6]. В основе достаточно большого числа
патологических процессов лежат нарушения процесса апоптоза. У взрослых
могут регистрироваться лишь дефекты с ограниченными фенотипическими
проявлениями, поскольку организмы с обширными дефектами такого рода
гибнут на ранних этапах онтогенеза. Наиболее характерным проявлением
недостаточности апоптоза служит развитие аутоиммунных процессов и
злокачественных новообразований, проявлениями усиленного апоптоза аплазии и дегенеративные процессы, а также некоторые уродства с
дефектами тканей. [7].
Сосредоточение значительных усилий исследователей на изучении
апоптоза позволило и относительно короткий срок (с начала 90-х годов)
осуществить прорыв в анализе его молекулярных механизмов. Особенно
существенные
успехи
достигнуты
в
понимании структуры
и
функционирования Fas-рецептора и связанных с ним молекул, факторов,
контролирующих апоптоз (Вс1-2, Вах и т. д.), сериновых протеаз (каспаз).[8].
В то же время с полной определенностью не установлена природа
эндонуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК при апоптозе, и не
выяснено, каким образом протеолиз, осуществляемый каспазами, приводит к
активации этих эндонуклеаз. [9]. Параллельно накапливаются сведения о
месте апоптоза в развитии организма и деятельности его функциональных
систем, в особенности иммунной. Наконец, в последние годы началось
широкомасштабное изучение места апоптоза и его нарушений в развитии
патологических процессов. Показана его реальная роль в патогенезе нервных
заболеваний, аутоиммунных, опухолевых процессов и другой патологии.
Особую важность приобрела проблема устойчивости опухолевых клеток к
лекарственным средствам, обусловленной нарушением апоптоза. Эти
направления исследований смыкаются с разработкой подходов к генотерапии
заболеваний человека.
Индуктор апоптоза полипептидный комплекс Га-40 был разработан в
начале 90-х годов в медико-биологическом научно-исследовательском и
производственном центре Alexis (Тбилиси, Грузия). Сырьевым источником
получения препарата в виде пептидного лиофилизированного порошка
служит горное растение Купена горная (Polgonatum varticillatum). После
проведения биохимических исследований на предмет количественного и
качественного состава было выявлено, что препарат содержит несколько
сотен малых пептидов с молекулярной массой 10-50 кД. Для определения
состава
использовался
метод
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии (HPLC) с последующей тандемной масс-спектрометрией масс
с использованием LTQ FT ICR спектрометра масс (Hybrid-2D-Linear
Quadrupole Ion Trap, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass
Spectrometer) (Thermo Electron Corp). [10].
Следует отметить, что большинство присутствующих в организме
человека эндогенных пептидов, обладающих биологической активностью
(цитокины, гормоны, антитела, дефенсины, алармины), имеют как раз
количественный аминокислотный состав от 10 до 50 и соответственно
низкую молекулярную массу. Данный факт объясняется тем, что малые
молекулы легче транспортируются в тканях организма, а также имеют
большую тропность к лигандному взаимодействию с мембранными
рецепторами. Также следует отметить, что эти малые активные пептиды
действуют в очень малых нано- и пико- концентрациях.
Таким образом, пептидный состав препарата ГА-40 представляет
собой несколько сотен потенциально биологически активных молекул.
Вопрос соотнесения каждого из малых пептидов с его биологической
активностью является предметом дальнейших научных исследований.
Однако препарат ГА-40 прошел серию экспериментов in vitro и in
vivo, которые достоверно продемонстрировали ряд терапевтических
эффектов его пептидного состава в комплексе, а именно:
1)
Полипептиды препарата ГA-40 взаимодействуют с
мембранными структурами атипичных клеток и инициируют механизм
апоптоза; [11]
2) А. ГA-40 взаимодействует с мембранными структурами
мононуклеарних клеток, в результате чего активируются Са-зависимые и Санезависимые тирозиновые протеинкиназы. Протеинкиназы активируют
транскрипционный нуклеарный фактор (NFkB) и транслоцируют его в ядро
мононуклеарной клетки. NFkB стимулирует синтез фактора некроза
опухолей α (TNF α).
В.
В опытах in vivo установлено, что введение препарата «GA-
40» мышам в дозах 2, 20 и 200 мкг/кг вызывает достоверное увеличение
количества антителообразующих клеток в 1,5, 2,4 и 2 раза соответственно,
по сравнению с животными, не получавшими препарат.
C. В опытах in vitro установлено, что совместная культивация
препарата «GA-40» в концентрации 100 мкг/мл с мононуклеарными клетками
периферической крови здоровых доноров вызывает достоверное повышение
продукции интерферона-гамма.
D.
Га-40 предотвращает пост-ишемические изменения
интенсивности флуоресценции катехоламинов в лимбико-гипоталамических
структурах мозга крыс. Коррекция постишемических прооксидантноантиоксидантных изменений происходит в основном благодаря усилению
действия антиоксидантних ферментов препаратом ГА-40. Другими словами
препарат ГА-40 обладает выраженным антиоксидантным и антистрессовым
действием. Препарат ГA-40 не вызывает аллергических реакций немедленного типа и псевдоаллергических реакций.[12].
Учитывая
вышесказанное,
а
также
отмечая
общую
тенденцию
современной медицины к расширению использования протеин-протеиновых
взаимодействий, следует отметить, что препарат Га-40 можно рассматривать
как
перспективное
лекарственное
средство,
предназначенное
для
присоединения к схемам комплексной терапии онкологической патологии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Imyanitov E.N. Kuligina E.Sh., Belogubova E.V., Togo A.V., Hanson K.P. Mechanisms of
lung cancer. Drug Discov. Today: Dis. Mech., 2005a, 2, 213–223.
2. Imyanitov E., Hanson K., Zhivotovsky B. Polymorphic variations in apoptotic genes and
cancer predisposition. Cell Death Differ., 2005, 12, 1004–1107.
3. Kobayashi S., Ji H., Yuza Y., Meyerson M., Wong K.K., Tenen D.G., Halmos B. An
alternative inhibitor overcomes resistance caused by a mutation of the epidermal growth factor
receptor. Cancer Res., 2005, 65, 7096–7101.
4. Li J., Karlsson M.O., Brahmer J., Spitz A., Zhao M., Hidalgo M., Baker S.D. CYP3A
phenotyping approach to predict systemic exposure to EGFR tyrosine kinase inhibitors. J. Natl.
Cancer Inst., 2006, 98, 1714–1723.
5. Asahina H., Yamazaki K., Kinoshita I., Sukoh N., Harada M., Yokouchi H., Ishida T., Ogura
S., Kojima T., Okamoto Y., Fujita Y., Dosaka–Akita H., Isobe H., Nishimura M. A phase II trial
of gefitinib as first–line therapy for advanced non–small cell lung cancer with epidermal growth
factor receptor mutations. Br. J. Cancer, 2006, 95, 998–1004.
6. Dy G.K., Miller A.A., Mandrekar S.J., Aubry M.C., Langdon R.M. Jr., Morton R.F., Schild
S.E., Jett J.R., Adjei A.A. A phase II trial of imatinib (ST1571) in patients with c–kit expressing
relapsed small–cell lung cancer: a CALGB and NCCTG study. Ann. Oncol., 2005, 16, 1811–
1816.
7. Erlichman C., Hidalgo M., Boni J.P., Martins P., Quinn S.E., Zacharchuk C., Amorusi P.,
Adjei A.A., Rowinsky E.K. Phase I study of EKB–569, an irreversible inhibitor of the epidermal
growth factor receptor, in patients with advanced solid tumors. J. Clin. Oncol., 2006, 24, 2252–
2260.
8. Goodin S. Erlotinib: optimizing therapy with predictors of response? Clin. Cancer Res., 2006,
12, 2961–2963.
9. Govindan R., Crowley J., Schwartzberg L., Kennedy P., Williams C., Ekstrand B., Sandler A.,
Jaunakais D., Bolejack V., Ghalie R. Phase II trial of bexarotene capsules in patients with
advanced non–small–cell lung cancer after failure of two or more previous therapies. J. Clin.
Oncol., 2006, 24, 4848–4854.
10. Великий Н.Н., «Отчет об определении количественного и качественного состава
препарата ГА-40», Институт биохимии им. Палладина НАН Украины, Киев, 2007.
11. Loeb Lawrence A.,«Investigation of molecular mechanisms of the anti-carcinogenic action
of the GA-40 preparation» University of Washington, School of Medicine, Department of
Pathology; WDC, 2005.
12. Ю.М.Лопухин, А.К.Мартынов, «Исследование иммунотропной активности препарата
ГA-40», «Исследование клеточных и молекулярных механизмов действия препарата ГA40», ГУ НИИ ФХМ, Москва, 2006.