Травматическая болезнь спинного мозга. Классификация

Лечение травматической болезни спинного мозга
с использованием клеточных технологий
Отчет о научной работе.
Москва 2005 г.
ЗАО "Клиника восстановительной и интервенционной неврологии и терапии "НейроВита".
Российский онкологический научный центр РАМН им. Н.Н.Блохина
Список исполнителей:
Брюховецкий А.С. - доктор медициских наук, профессор (научный руководитель)
Менткевич Г.Л. - доктор медицинских наук, профессор
Зайцев А.Ю. - кандидат медицинских наук (ответственный исполнитель)
Лаврентьев А.В. - старший научный сотрудник, доктор медицинских наук
Долгополов И.С. - доктор медицинских наук
Тупицын Н.Н. - профессор, доктор медицинских наук
Андреева Н.Ю. - старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук
Красавин И.В. - врач-невролог
Фадеев А.И. - врач невролог
Тюленев И.В. - врач-нейрохирург
Евсеев Н.Г. - доктор медицинских наук, профессор
Мхеидзе Д.М - кандидат медициских наук
Лымарь К.Г. - врач- терапевт
ОГЛАВЛЕНИЕ
Аннотация ...................................................................................................................................... 2
Введение ......................................................................................................................................... 3
Травматическая болезнь спинного мозга. Классификация, некоторые аспекты
патофизиологии, патоморфологии, диагностики и лечения ..................................................... 3
I. Классификация ТПСМ .............................................................................................................. 4
II. Патоморфология и патофизиология травматической болезни спинного мозга (СМ) ....... 4
III. Методы диагностики повреждения СМ ................................................................................ 7
III. Методы лечения ТПСМ ........................................................................................................ 10
IV. Клеточные методы восстановления поврежденного спинного мозга ............................. 13
Клиническая характеристика пациентов, методы исследования и лечения ........................ 17
Нейрофизиологические методы исследования ........................................................................ 21
I. Двигательные изменения у больных после применения МСК .......................................... 26
II. Изменения функций органов малого таза на фоне применения МСК .............................. 29
III. Чувствительные изменения .................................................................................................. 31
Оценка клинических результатов трансфузии аутологичных обкладочных
глиообанятельных клеток (ОГК) у пациентов с травматической болезнью СМ .................. 32
Изменения электронейромиографических показателей при клеточной реконструкции МСК
нейрональной ткани .................................................................................................................... 37
Оценка восстановления мочевыводящих путей с помощью уродинамических проб .......... 39
Возможные механизмы действия МСК .................................................................................... 41
Заключение .................................................................................................................................. 49
Предварительные выводы .......................................................................................................... 51
Список литературы ..................................................................................................................... 52
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
2
Аннотация
В рамках межотраслевой программы "Новые клеточные технологии-медицине" было
включено 78 больных, которые проходили обследование и лечение по поводу травматической болезни спинного мозга (СМ). 48 пациентов в настоящее время находятся в процессе
обработки полученных данных, так имеют только одно введение МСК и, в настоящее
время, у них незавершено динамическое наблюдение.
В группе с инфузией МСК было обследовано 18 человек, 12 мужчин и 6 женщин, средний возраст 32 года. У 3 человек от момента травмы до госпитализации прошло менее 1
года, у 6 человек - от года до 5 лет и у 9 человек между травмой и госпитализацией прошло более 5 лет. У всех обследуемых больных за 2 месяца до госпитализации отсутствовали неврологические изменения. 11 пациентов характеризовались полным функциональным перерывом спинного мозга на различных уровнях, и 7 человек имели неполный перерыв спинного мозга. Все 18 человек прошли первичный курс трансфузии мобилизованными стволовыми клетками (МСК), который включал в себя 2 интратекальных введения.
В среднем временной интервал между курсами введения клеток составлял 2 месяца. Число
вводимых МСК при каждом введении в среднем составлял 5,3 10 в 6 степени.
Оценка эффективности терапии проводилось по данным клинико-неврологического
обследования, ЭНМГ исследования, уродинамических проб.
На фоне проводимой терапии отмечалась положительная динамика в двигательной и
чувствительной сфере, нормализовывались функции тазовых органов.
У 5 пациентов проводилась терапия интратекальными трансфузиями глиообонятельных обкладочных клеток (ГОК). Оценка эффективности терапии так же проводилось по
данным клинико-неврологического обследования, ЭНМГ исследования, уродинамических
проб. Ни у одного больного не отмечено регрессии неврологической симптоматики. У одного пациента отмечался отек головного мозга, который потребовал проведения интенсивной терапии. В связи с отсутствием положительного клинического эффекта от проведения терапии ГОК и развития тяжелого осложнения исследования в данной группе прекращены.
В группе трансплантации "Сферогеля" было обследовано 7 пациентов. 1 больному
произведена трансплантация только "Сферогеля"; 3 больным - трансплантация "Сферогеля" с МСК; 3 больным - трансплантация "Сферогеля" с ГОК (1 пациент исключен из анализа, так как после трансплантации прошло менее 1 года). У 2 пациентов с трансплантацией "Сферогеля" с МСК и у 2 пациентов с трансплантацией "Сферогеля" с ГОК было отмечено улучшение неврологической симптоматики в двигательной, чувствительной сфере, а так же нормализации функции тазовых органов.
Возможные механизмы действия МСК были изучены на 12 образцах крови больных c
тяжелой травмой СМ, у которых отмечался положительный клинический эффект. Непосредственно исследовалась экспрессия рецептора gp130/80. Показана эффективность мобилизации стволовых (CD34+) периферических клеток у больных с травматической болезнью спинного мозга при назначении нейпогена. В целом примерно у 60% больных в
популяции МСК (CD34+) присутствовало более 20% CD45-негативных клеток. Нередкую
ситуацию представляли случаи, когда этих клеток было более 80 - 90%% среди CD34позитивных, что может указывать на негемопоэтическую направленность дифференцировки этих клеток. Для более детального изучения этого вопроса проведен анализ экспрессии CD38 и HLA-DR на мобилизованных CD34+ клетках крови больных с тяжелой
травмой СМ. Доказано существование CD45-CD38-HLA-DR- фракции среди мобилизованных стволовых CD34+ клеток крови у больных с травмой СМ, что указывает на присутствие клеток, способных дифференцироваться по мезенхимной линии.
Кроме того, изучена экспрессия рецепторного комплекса gp130/80 на мобилизованных
периферических стволовых клетках крови. Экспрессия рецептора gp130 (от слабой до
умеренно положительной) имела место во всех изученных случаях. Изучение 3 эпитопов
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
3
рецептора gp130 (A1, C2, D1) показало, что в отличие от перевиваемых клеточных линий
интенсивность реакции одних и тех же клеток с различными МКА к gp130 могла варьировать, что могло указывать на эндогенную активацию и димеризацию рецептора. Изменение уровней экспрессии молекулы gp130 на стволовых клетках под действием ИЛ-6 не
исключило димеризации gp130 на части из них.
Полученные данные убедительно доказывают экспрессию gp130 на мобилизованных
стволовых клетках крови больных с травматической болезнью спинного мозга.
Ключевые слова: гемапоэтические стволовые клетки периферической крови, мобилизованные стволовые клетки, глиообонятельные обкладочные клетки, сферогель, трансплантация, травматическая болезнь спинного мозга, трансфузия, gp130.
Введение
Частота травм спинного мозга варьирует от 29,4 до 50 случаев на один миллион жителей, при этом более чем в половине случаев пострадавшими являются наиболее работоспособное население. Отсутствие в настоящее время адекватных методов лечения последствий тяжелых повреждений СМ приводит к тяжелой инвалидизации пациентов, неспособности данной категории больных адаптироваться в обществе, что несет за собой
огромные социальные и экономические потери. Различные реабилитационные мероприятия в некоторых случаях существенно улучшают исходы травмы и повышают качество
жизни пострадавших, но не могут устранить тяжелого неврологического дефицита. Хирургические методы лечения в основном показывают свою эффективность в острый период травмы, но в большинстве случаев не приводят к улучшению неврологического статуса
больных при травме СМ более 12 ч. Причина неэффективности существующих подходов
к лечению данной патологии достаточно ясна. Ни реабилитационные мероприятия, ни
оперативные вмешательства не приводят к устранению основной причины заболевания повреждения невральных структур СМ.
Одной из попыток решения данной проблемы является применение биомолекулярных
технологий на основе применения аутологичных модифицированных стволовых клеток
(МСК), глиообонятельных обкладочных клетки. К сожалению, на сегодняшний день клинический опыт применения клеточных технологий в неврологической практике минимален, что связано с недостаточной научно - теоретической базой, с трудностью забора,
определения и консервации стволовых клеток, а так же с неотработанными методологическими подходами применения. Разработанная программа трансфузии и трансплантации
клеток, была оценена у 30 пациентов с позвоночно - спинальной травмой, включенных в
межотраслевую программу "Новые клеточные технологии-медицине".
Травматическая болезнь спинного мозга.
Классификация, некоторые аспекты патофизиологии,
патоморфологии, диагностики и лечения
Сведения о количестве больных с травматической болезнью спинного мозга (ТПСМ)
противоречивы, что обусловлено стремительным ростом травматизма и удельного веса
спинальной травмы. М. О. Фридланд (1940) утверждает, что переломы позвоночника составляют всего 0,44% от всех травм. О. Г. Коган (1975) констатирует 30-кратный рост
ПСМТ (100-150 на 10 млн. жителей ежегодно). А. В. Лившиц (1990) считает, что ПСМТ
составляют от 0,7% до 4% всех травм; М. М. Косичкин с соавт. (1999) указывает, что в 80е годы частота осложненных травм позвоночника составляла 6-7%. Е. Н. Кондаков с соавт. (1989) утверждает, что ежегодно в Санкт-Петербурге 300-320 человек получают
осложненные ТПСМ, что соответствует уровню 600-640 человек на 10 млн. населения и
превышает показатели 1975 года в 4-6,4 раза. По сведениям М. М. Косичкина (1999), еже-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
4
годно становятся инвалидами более 8 000 больных с ТПСМ, что составляет 547 на 10 млн.
населения. Естественно, число травмированных больных намного больше, чем количество
получивших инвалидность. Так как только госпитальная смертность в раннем периоде
травмы составляет порядка 16,3% (М. Г. Дралюк с соавт., 1993). В 1999 году ТПСМ получили не менее 654 человек на 10 млн. населения, что выше данных О. Г. Когана (1975) в
4,4-6,5 раз.
Таким образом, наблюдается рост спинального травматизма более чем в 200 раз за 70летний период. Анализ ситуации позволяет прогнозировать уровень 800 и более травмированных на 10 млн. населения в ближайшем будущем.
Остается высокой летальность среди больных с осложненной травмой позвоночника,
которая составляет 34,4% (Austin G. M., 1990), а инвалидизация вследствие перенесенной
позвоночно-спинномозговой травмы колеблеться от 60 до 100% по данным различных авторов.
Таким образом, неуклонный рост частоты, тяжёлых последствия данного вида патологии, крайне высокая частота инвалидизации и несершенство существующих общепризнанных методик лечения требует разработки новых методов и способов лечения данной
патологии.
I. Классификация ТПСМ
Под ТПСМ понимают "комплекс обратимых или необратимых патологических изменений, которые наступают после острого повреждения вещества спинного мозга и (или) его
питающих сосудов, оболочек и корешков. Данные изменения сопровождаются реологическими и ликвородинамическими расстройствами, что приводит к частичному или полному
нарушению проводимости по спинному мозгу и его корешкам, топически обусловленному
уровнем и характером травмы".
Различают следующие четыре периода ТПСМ спинного мозга (по И.Я.Раздольскому):
1) острый период - охватывает первые 2-3 суток и характеризуется сходной клинической картиной при повреждениях спинного мозга различной степени, что обусловлено
развитием спинального шока;
2) ранний период - продолжается последующие 2-3 недели. Неврологически проявляется чаще синдромом полного нарушения проводимости спинного мозга вследствие грубого
его повреждения. Обратимые изменения в спинном мозге к концу этого периода обычно
исчезают;
3) промежуточный период - длится до 2-3 мес. В его начале обычно исчезают явления
спинального шока и выявляется истинный характер повреждения спинного мозга;
4) поздний период - начинается с 3-4 мес и продолжается неопределенно долгое время.
Неврологически он характеризуется дальнейшим, очень медленным восстановлением
функций спинного мозга или автоматизма его отдела, котрый расположен книзу от уровня
полного перерыва. Сроки этих периодов могут значительно удлиняться при грубых повреждениях спинного мозга, которые сопровождаются дополнительным раздражением его
костными отломками, металлическими инородными телами, арахноидальными кистами и
др.
II. Патоморфология и патофизиология травматической
болезни спинного мозга (СМ)
1. Действие непосредственно механического фактора
С некрозом связывают первичное непосредственное повреждение мозговой ткани в
момент приложения травматической силы - контузия паренхимы мозга, ее сдавление, а
также дисциркуляторные расстройства вследствие поражения сосудов. Основным морфо-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
5
логическим проявлением первичного повреждения является некротический очаг, который
включает в себя обломки разрушенных клеток и клетки, которые участвуют в развитии
воспаления. Некротический очаг впоследствии эволюционирует в глиальносоединительно-тканный рубец, вблизи которого в дистальном и проксимальном отделах
спинного мозга образуется область кавитации. Мелкие полости могут сливаться с образованием посттравматических кист различного размера.
Таким образом, некроз характеризуется гибелью клеток в результате внешнего чрезмерного повреждающего воздействия, что приводит к нарушению их энергообеспечения,
разрушению клеточных мембран, набуханию и распаду клетки.
Наряду с первичным повреждением спинного мозга запускаются и развиваются механизмы вторичного повреждения клеток, к которым можно отнести: воспалительную реакцию, апоптоз, глиальную реакцию, ишемические нарушения.
2. Воспалительная реакция
Воспаление является главным механизмом в санации очага повреждения. В то же время, избыточный воспалительный ответ может привести к вторичному повреждению путем
черезмерного выделения медиаторов воспаления и развития гиперергических клеточных
реакций. В свою очередь это вызывает и усиливает такие процессы, как ишемия и
апоптоз.
Уже через 24 ч наблюдается максимальная инфильтрация области травмы полиморфноядерными лейкоцитами; через 24- 48 ч - происходит пик миграции макрофагов, через 48
ч - натуральных киллеров, хелперов и супрессоров. Последние, участвуют в иммунной
модуляции воспаления и наблюдаются до 16 сут. [Mofohashi 0.]. Лейкоциты, которые появляются в очаге травмы, выделяют множество прямых цитотоксичных факторов и медиаторов, что позволяет процессу воспаления самоподдерживаться и расширяться вне очага
поражения. In vitro установлено вторичное повреждение путем выделения миелопероксидазы полиморфноядерными лейкоцитами [Casha S.], в то время как наличие клодроната,
подавляющего макрофаги, увеличивает сохраняемость миелинизированных трактов [PlataSalaman C. R.]. Блокирование выработки мононуклеарными фагоцитами токсичной квинолиновой кислоты (продукт обмена триптофана) уменьшает неврологический дефицит in
vivo [McTigue D.]. Макрофаги, микроглия участвуют в прогрессирующем некрозе путем
освобождения свободных радикалов и воспалительных цитокинов - интерлейкина-1, интерлейкина-6, туморнекротизирующего фактора, факторов адгезии тромбоцитов (IL-1, IL1b, TNFа, PAF, соответственно) [Carlson S. L, Mofohashi 0.]. Медиаторы воспаления имеют
множество мишеней, и как результат - развитие многоуровневого воспалительного иммунного ответа.
3. Глиальная реакция
Глия создает особое окружение нейронов и играет важную роль в процессе санации
очага травмы, обеспечивая возможность нейронального выживания и восстановления.
Уже через 24 ч в зоне травмы с участием системы комплемента активируются микроглиоциты, которые превращаются в макрофаги, активно поглощающие детрит. В дальнейшем
комплементнезависимым путем микроглия активируется вдоль проводящих пучков на отдалении от места травмы и участвует в процессе вторичной дегенерации волокон [Wang
Ch. X.]. Микроглиальные клетки производят отростки, которые контактируют с олигодендроцитами и путем прямого фагоцитоза или выделения цитокинов (TNF) уничтожают
миелин в проксимальном и дистальном отрезках мозга (по отношению к месту травмы)
[Schumacher P. A.]. Прежде всего, апоптозу подвергаются клетки, которые тесно контактируют с аксоном. Апоптоз олигодендроцитов приводит к быстрому набуханию миелина
и заключению оставшихся олигодендроцитов в изоляты, ловушки. Возможно, смерть этих
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
6
интерфасцикулярных клеток является необходимой подготовкой для регенерации [Abe
Y.]. На наиболее ранних стадиях глиального ответа - 1-3 дня после травмы - реагируют
астроциты как компонент гематоспинномозгового барьера. При этом клетки перестраиваются на ранние стадии онтогенетического функционирования, что подтверждается продукцией виментина, глиального фибриллярного кислого протеина - белков быстроразвивающихся астроцитов [Bfinik N.].
Тот факт, что травматическое повреждение не просто разрушает клеточные структуры
путем травматического, ишемического некроза, но глобально изменяет всю жизнедеятельность сохранившихся клеток, подтверждается развитием отсроченной программированной гибели клеток - апоптозом.
4. Апоптоз
Гибель клетки путем апоптоза - есть включение травматическим агентом механизмов
естественной клеточной смерти. Причиной развития апоптоза может быть прямое воздействие на геном клетки (вирусы) или непрямое влияние через нейромедиаторы (глутамат),
медиаторы воспаления, ишемию и пр. Такая полиэтиологичность апоптоза связывает его
со многими патологическими состояниями - травмой, ишемией, инфекцией. Современные
методы позволяют выявить самые ранние стадии апоптоза в клетках травмированного
СМ. При этом механизм травмы - сдавление мозга в эксперименте (drop-weight model) или
его пересечение - не имеет значения. Такие методики как TUNEL, ISEL позволяют выявить изменения ДНК на самых ранних стадиях апоптоза, до того как появятся тельца
апоптоза - фрагментированная ДНК в виде глыбок хроматина в ядре или в цитоплазменных каплях вне клетки [Rosenberg L. J.]. Процессы, которые связанны с апоптозом,
наблюдаются уже спустя 6 ч после травмы. Первый пик гибели клеток происходит примерно через 3 дня - апоптозу подвергаются как нейроны, микроглия, так и в меньшей степени олигодендроглия; второй пик - это максимальная гибель олигодендроцитов к концу
2-й недели. Предполагают, что глиальный апоптоз может быть причиной аксональной дегенерации [CassamA. K., Yong C.].
Таким образом, апоптоз нейронов приводит к прогрессирующей потере числа активных клеток, а апоптоз глии препятствует выживанию и прорастанию оставшихся волокон,
что выражается в отсутствии полноценной регенерации в СМ.
5. Ишемические нарушения
Ишемия СМ является непременным компонентом его травматического повреждения.
Простое сдавление сосудов СМ без травматического повреждения клеток приводит к
ишемическому некрозу, развитию воспалительной реакции, запускает апоптоз. Уже через
180 мин компрессии сосудов мозга наступают полностью необратимые изменения нейронов [Carlson G. D.]. Обсуждается роль Nа+/Са2+-, Nа+/Н+-насосов, возбуждающих аминокислот (глутамат, аспартат), ионов Са2+ в патогенезе ишемических процессов, связанных
с травмой СМ [Smaivimi T., Lombard V., Rosenberg L. J.]. Ишемия приводит к повреждению гематоспинномозгового барьера - снижается содержание специальных молекул барьера - глюкозо-1-транспортер (GLUT-1) и эндотелиально связанного антигена [Jakeman L.
B.].
Таким образом, описанные клеточные реакции на субклеточном уровне реализуются
путем активации биологически активных веществ, которые изменяют как функционирование клеток, так и внутриклеточную структуру. В свою очередь первичные структурные
повреждения вызывают освобождение ранее неактивных веществ, которые приводят к
вторичному повреждению структуры клеток. Такая связь между структурой и функцией
лежит в основе формирования пространственной и временной цепи взаимосвязанных первичных и вторичных патологических реакций.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
7
6. Роль ионов Са2+, К+, Nа+
Cтало бесспорным, что изменения в Са2+-обмене играют роль в патофизиологическом
каскаде клеточных изменений, которые ведут к нейрональной смерти и дегенерации после
травмы ЦНС. Изменения в гомеостазе ионов Са2+ лежат в основе клеточной смерти при
ишемии СМ. Отмеченные изменения в концентрации ионов Са2+ в зоне травмы линейно
коррелируют с размером нанесенной травмы СМ в эксперименте [Mofohashi 0.]. Са2+ является одним из вторичных месенджеров между мембраной и клеточными ферментными
системами, между мембраной и генным аппаратом. Отмечена экспрессия некоторых генов
при достижении концентрации Са2+ определенного уровня. Повышение внутриклеточного Са2+ приводит к абсорбции его митохондриальными мембранами и последующим блокированием дыхательной цепи электронов. Повышенное внутриклеточное содержание
Са2+ активирует нелизосомальную цистеиновую протеазу кальпейн, приводя к лизису цитоскелета, деградации энзимов (киназ, фосфолипаз), мембрано-ассоциированных белков
(ионных каналов, переносчиков, рецепторов, молекул адгезии). Расположенный и в
нейронах, и в глии, кальпейн оказывается вовлеченным в постишемическую и посттравматическую цитотоксическую реакцию, связанную с повышением внутриклеточного
Са2+. Несмотря на большое число публикаций, вопрос о роли Са2+ при травме СМ остается открытым [Agrawal S. K.-1998; Carlson G. D. - 1997; Smaivimi T., Rosenberg L. J.]. Отмечено, что хотя снижение внеклеточного Са2+ важно для выживания клеток, это может
быть препятствием к новому росту аксонов[Chii G. K. T.].
7. Влияние нейромедиаторов
Особую роль в механизмах первичного и вторичного повреждения клеток уделяют возбуждающим медиаторным аминокислотам - глутамату и аспартату. На моделях животных
доказана токсичность этих аминокислот в отношении нейронов. Избыточное содержание
данных медиаторов при травме, ишемии может привести как к некрозу, так и к апоптозу
клеток. Установлены некоторые механизмы их влияния на клетку: путём трансмембранного перемещения Са2+ в клетку либо через лизис фосфатидилинозитола фосфолипазой С
с освобождением Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматической сети, митохондрий). Данные о влиянии возбуждающих аминокислот in vitro и in vivo имеют некоторые
противоречия, и механизмы их действия спорны. Но какой бы механизм не был, доказательства на моделях животных их цитотоксичности указывают на возможную ответственность за посттравматические эффекты, которые можно блокировать антагонистам рецепторов возбуждающих аминокислот [Faden A., Mofohashi 0., Obrenovitch T. P., Yoon K. W.].
Таким образом, в развитии повреждения спинного мозга принимает участие достаточно большое количество различных механизмов, находящихся в тесной взаимосвязи.
III. Методы диагностики повреждения СМ
В настоящее время для оценки уровня и тяжести ТПСМ наиболее часто используются
следующие диагностические методы:
 Неврологический осмотр с оценкой по шкале ASIA;
 рентгенограммы (спондилограммы) в двух (передне-задней и боковой) проекциях;
 спондилограммы в специальных укладках;
 рентгеновская компьютерная томография (КТ);
 миелография восходящая или нисходящая;
 КТ-миелография;
 магнитно-резонансная томография (МРТ).( В. В. Лебедев В. В. 2001г.)
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
8
Одним из основных способов оценки функций спинного мозга остается неврологический осмотр. Однако при исследовании неврологического статуса используется много
субъективных критериев. Это мешает сравнивать данные осмотра, контролировать изменения в статусе, анализировать результаты лечения и давать прогноз.
С целью максимальной стандартизации результатов неврологического осмотра и была
предложена единая классификация неврологических проявлений травмы позвоночника и
спинного мозга.
Первое издание классификации было опубликовано в 1982 г. Американской ассоциацией повреждений спинного мозга - American Spinal Cord Injury Association, сокращенно
ASIA [Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injured Patients. American
Spinal Cord Injury Association. - Chicago, 1982.].
В 1992 г. после очередной редакции международным обществом параплегии данная
классификация была принята и получила признание в качестве международных стандартов неврологической и функциональной классификации повреждений спинного мозга ISCSCI-92 (International Standards for Neurological and Functional Classification of Spinal
Cord Injury) [Ditunno J. F. 1994.]. Последняя редакция состоялась в 1996 г.
В качестве критериев состояния спинного мозга использованы мышечная сила, тактильная и болевая чувствительность. Особое внимание уделено проверке двигательных и
чувствительных функций нижних крестцовых сегментов.
К сожалению, функции тазовых органов, живость рефлексов, мышечно-суставное чувство вынесены за рамки стандартного осмотра как не всегда объективно определяемые.
Для определения мышечной силы общепринята Шкала Комитета медицинских исследований (Medical Research Council Scale, R. Van der Ploeg и соавт, 1984). Возможно, более
точное определение мышечной силы возможно в рамках теста Л. Д. Потехина, который
предусматривает, пятиуровневую оценку движущих сил.
Чувствительность проверяется в 28 сегментах с двух сторон. Для определения чувствительности во всем сегменте достаточно проверить ее в одной контрольной точке, привязанной к четкому анатомическому ориентиру. Точки на туловище располагаются вдоль
среднеключичной линии. Для оценки чувствительности используется следующая шкала:
 0 баллов - отсутствие чувствительности,
 1 балл - нарушенная чувствительность,
 2 балла - нормальная чувствительность
В качестве необязательных, но рекомендуемых пунктов при оценке чувствительности
предполагается определение положения конечностей и ощущения глубокого давления и
боли, которые оцениваются как отсутствующие, нарушенные и нормальные. Также для
оценки мышечно-суставного чувства предлагается тестировать пассивные движения в
указательных пальцах кистей и больших пальцах стоп.
На основании тестирования двигательной и чувствительной функций, в соответствии с
международным стандартом, определяется:
Неврологический уровень - наиболее каудальный уровень с нормальными двигательными и чувствительными функциями (уровень с неизмененной чувствительностью и силой мышц не менее 3 баллов).
Двигательный уровень - наиболее каудальный сегмент спинного мозга с нормальной
двигательной функцией. Однако большинство мышц иннервируется более чем одним
нервным корешком, обычно корешками двух сегментов. Поэтому отношение одной мышцы или одной мышечной группы к единственному сегменту является упрощением. При
этом необходимо учитывать, что для каждой мышцы наличие иннервации одним и отсутствие иннервации другим сегментом приведут к слабости. По соглашению, если мышечная сила равна по меньшей мере 3, то считается, что верхний сегмент, иннервирующий
указанную мышцу, интактен. Например, если никакой активности не выявляется в мышцах С7-сегмента, а мышцы С6 имеют силу 3, то двигательный уровень на тестируемой
стороне соответствует С6 (при условии, что С5 мышцы имеют силу 5 баллов), т. е. двига-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
9
тельный уровень определяется как наиболее низкий сегмент с силой мышц по меньшей
мере 3 балла при условии, что мышцы вышерасположенного сегмента имеют нормальную
силу - 5 баллов.
Чувствительный уровень - наиболее каудальный сегмент спинного мозга с нормальной чувствительной функцией.
Зона частичного поражения - дерматомы и миотомы каудальнее неврологического
уровня, имеющие частичную иннервацию. Если ниже сегментов с нормальной функцией
имеются сегменты с нарушенной двигательной или чувствительной функцией, точное
число таких сегментов должно быть указано с двух сторон как зона частичного поражения. Термин относится только к полным поражениям. Здесь следует указать, что под дерматомом понимается область кожи, иннервируемая чувствительными аксонами одного
нервного корешка, а под миотомом - мышечные волокна, иннервируемые двигательными
аксонами одного корешка.
По степени повреждения спинного мозга больные классифицируются на 5 групп:
 А - полное повреждение: ни двигательных, ни чувствительных функций не выявляется в S4-5-сегментах, нет никаких признаков анальной чувствительности;
 В - неполное: двигательные функции отсутствуют ниже уровня повреждения, но
сохранены элементы чувствительности в сегментах S4-5;
 С - неполное: двигательные функции сохранены ниже уровня повреждения и в
большинстве контрольных групп сила менее 3 баллов;
 D - неполное: двигательные функции сохранены ниже уровня повреждения и в
большинстве контрольных групп сила более или равна 3 баллам;
 Е - норма: двигательные и чувствительные функции не нарушены
Кроме того, при неполном повреждении спинного мозга выделяют следующие клинические синдромы:
 синдром поражения центральной части спинного мозга - повреждение встречается
почти исключительно в шейном отделе, вызывает сохранение чувствительности в
крестцовых сегментах и большую слабость в верхних, чем в нижних, конечностях;
 синдром поражения передних отделов спинного мозга - нарушение двигательных
функций и болевой, и температурной чувствительности при сохранении проприоцептивной чувствительности;
 синдром Броун-Секара - нарушение двигательных функций и проприоцептивной
чувствительности на стороне поражения и потеря болевой и температурной чувствительности с другой стороны;
 синдром поражения конуса и конского хвоста - повреждение конуса и поясничных
корешков внутри позвоночного канала, вызывающее арефлекторный мочевой пузырь, вялый паралич ног.
Классификация использует следующие определения:
Тетраплегия - нарушение или потеря функций рук, туловища, ног, тазовых функций,
возникшие в результате повреждения нервных структур в позвоночном канале на уровне
шейных сегментов спинного мозга. Повреждения плечевого сплетения или периферических нервов не включаются.
Параплегия - нарушение или потеря функций туловища, ног, тазовых функций, возникшие в результате повреждения нервных структур в позвоночном канале на уровне
грудных, поясничных и крестцовых сегментов спинного мозга. Термин относится к повреждению конуса и конского хвоста. Поражения пояснично-крестцового сплетения или
периферических нервов не включаются.
Несмотря на достаточно объемную характеристику неврологических нарушений, данная классификация имеет и серьезные недостатки. Главным из которых, является наличие
так называемого феномена "потолка". Кроме того, остаётся проблема диагностики синдрома полного перерыва спинного мозга, особенно в раннем периоде. А. А. Луцик (1994),
указывает, что в раннем периоде заболевания различные формы повреждения спинного
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
10
мозга идентичны. И. И. Дерябин и О. С. Насонкин (1987) отмечают, что в остром периоде
трудно определить характер повреждения вещества спинного мозга, но "... достоверными
и ранними симптомами полного перерыва спинного мозга являются приапизм, плотные
(индуративные) отеки, раннее развитие пролежней".
По Р. А. Гэлли с соавт. (1995), для обратимых изменений в спинном мозге характер-на
положительная динамика в остром периоде ТПСМ. С другой стороны, К. Г. Ниренбург
(1966) сообщает, что из 74 пациентов с синдромом полного поперечного поражения спинного мозга в остром периоде травмы, в сроки от 3 до 25 лет после травмы картина полного
анатомического перерыва подтвердилась только у 27 (36,5%); у остальных 47 (63,5%)
наблюдалось различной степени восстановление ранее нарушенных функций.
Наиболее точным методом диагностики степени повреждения спинного мозга на сегодняшний день является ЯМРТ, всё же имеет место гипердиагностика полного анатомического поражения спинного мозга, даже после проведения данного обследования.
Таким образом, использование для оценки неврологического статуса разработанных
международных шкал, в том числе и ASIA, нельзя считать решенным. Это касается как
той или иной степени субъективности, так и невозможности определения медленной незначительной динамики неврологической симтматики, особенно в поздний период ТПСМ.
Поэтому необходим дальнейший поиск возможной оценки неврологического дефицита у
больных с травмой СМ с обязательной объективизацией различными нейрофизиологическми методами исследования. К сожалению, использование для этих целей объективных нейрофизиологических методов зачастую невозможно и требует больших капиталовложений. Применение различных рентгенологических методов исследования, в том числе и ЯМРТ, безусловно, являются наиболее точными методами диагностики характера и
уровня ТПСМ, но имеют свои ограничения и должны использоваться в комплексной оцеке больного.
III. Методы лечения ТПСМ
Несмотря на значительный прогресс в диагностике и лечении ТПСМ смертность и инвалидизация пациентов остается на высоком уровне. Прежде всего, это связано с дезинтеграцией функции ЦНС, что в свою очередь отражается на гомеостатических и адапционных механизмах организма больного.
Все методы лечения ТПСМ можно разделить на 4 группы: хирургические, медикаментозные, реабилитация, а также различные виды клеточной терапии. Безусловно, для лечения больных с ТПСМ применяется комплекс лечебных мероприятий, так как каждый в
отдельности не может привести к положительным результатам.
1. Хирургическое лечение
По мнению А.Г. Аганесова и соавт. хирургическая тактика при осложненной травме
шейного и травме грудного и поясничного отделов позвоночника в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга предусматривает скорейшую декомпрессия
спинного мозга. Большинство специалистов [Мюллер М., 1996, Мусалатов Х.А.,1999,
Byrd J.A., 1996, Howard S., -1998, Letts M., 2002, McLain R.F,1999] указывают на малую
эффективность оперативного лечения пострадавших с осложненной травмой позвоночника, выполняемого позднее 72 ч после травмы. При осложненной травме в грудном и верхнепоясничном отделах позвоночника (т.е. на уровне спинного мозга) декомпрессия должна обязательно дополняться ревизией спинного мозга под оптическим увеличением. Это
необходимо для выявления внутримозговых гематом и подоболочечных кровоизлияний,
которые следует удалять, так как они приводят к образованию кист и рубцов. Спайки
между оболочками, корешками и веществом спинного мозга образуются очень быстро, и
поэтому уже в раннем периоде может потребоваться выполнение менингомиелорадикуло-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
11
лиза, обязательно с использованием оптического увеличения и микроинструментов. В поясничном отделе позвоночника при травме корешков конского хвоста производятся аналогичные манипуляции, которые в случае разрыва корешков должны дополняться их микрохирургическим швом. Существуют различные мнения относительно способа декомпрессии спинного мозга, необходимости его ревизии. Одни авторы не считают обязательным выполнение ревизии спинного мозга у таких пациентов, если нет признаков медуллярного конфликта внутри дурального мешка по данным компьютерной и магниторезонансной томографии (Лавруков А. М., Томилов А. Б., 2000). Другие полагают, что ревизию спинного мозга необходимо осуществлять во всех случаях проведения декомпрессии,
чтобы избежать оставленной ликворной кисты, рубцов и спаек, препятствующих нормальной ликвороциркуляции (Луцик А. А., Тюлькин О. Н., 1998). Третьи к этому вопросу
подходят дифференцированно, при этом критерием для осуществления ревизии спинного
мозга считают отсутствие пульсации дурального мешка после костного этапа декомпрессии, что может указывать на нарушение ликвороциркуляции (Хвисюк Н. И., Чикунова А.
С., 1989).
Главным критерием, определяющим показания к операции, является наличие повреждения спинного мозга и нестабильности позвоночника.
Противопоказания к оперативному вмешательству в остром периоде позвоночноспинномозговой травмы (в частности к декомпрессии) являются:
1) травматический шок;
2) сопутствующее повреждение внутренних органов;
3) ранние септические осложнения ТПСМ;
4) острая дыхательная недостаточность, сочетающаяся с другой бульбарной симптоматикой.
Относительно сроков оперативного вмешательства так же не существует единого мнения. Ряд авторов считают, что оперативное вмешательство в ранние сроки не способствует большему восстановлению неврологических функций, а даже, наоборот, может приводить к ухудшению состояния. Другие приводят данные о положительном эффекте от ранних операций. J. Wilberger [75] сообщил, что, если оперативное вмешательство производилось в течение первых 24 ч, частота пневмоний уменьшалась с 21 до 10%, а пролежней с 16 до 10%. Нет определенного мнения, что считать операцией в ранние сроки. Т.
Аsazuma и соавт. [25] считают ранними сроками первые 4 нед после травмы, J. Farmer и
соавт. [40] - первые 5 дней, А. Vaccaro и соавт. [70] и S. Mirsa и соавт. [54] - первые 3 дня
(72 ч), F. Wagner и В. Chehrazi [72] - первые 8 ч. S. Papadopoulos и соавт. [57] проанализировали результаты хирургического лечения 91 пациента с острой шейной травмой. Они
считают, что немедленная декомпрессия и стабилизация позвоночника, основанные на
МРТ-исследовании, могут значительно улучшить неврологический результат. S. Mirza и
соавт. [54] исследовали результаты хирургического лечения травмы шейного отдела позвоночника, сравнивая изменения в неврологическом статусе, длительность госпитализации и частоту осложнений оперативного вмешательства при операциях, выполненных в
течение 3 дней после травмы и позже 3 дней после нее. Авторы считают, что декомпрессия и стабилизация, выполненные в течение 72 ч, не приводят к увеличению числа осложнений, могут улучшать восстановление неврологических функций и сокращать время пребывания пациентов в стационаре.
Современные подходы к хирургическому лечению спинальной травмы в позднем периоде, как правило, заключаются в ликвидации компрессии спинного мозга, стабилизации
позвоночника и восстановлении ликвородинамики [6,12,14,42]. Это создает более благоприятные условия для восстановления функций спинного мозга и препятствует возникновению вторичных ишемий [8, 13, 17]. Так, И. Н. Шевелев и соавт. [18] проанализировали
результаты хирургического лечения больных в позднем периоде травмы. Они делают вывод, что наличие сдавления спинного мозга может рассматриваться как показание к хирургическому лечению, однако в случаях полного спинального поражения целью опера-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
12
ции является улучшение сегментарных функций. М. Zhang Shaocheng [78] считают, что в
отдаленном периоде спинальной травмы, который характеризуется развитием рубцоводегенеративных изменений вещества спинного мозга и спаечного процесса окружающих
тканей, декомпрессия спинного мозга путем удаления костных фрагментов является ключевым фактором хирургического лечения. Н. Bohlman и Р. Anderson представили результаты анализа 58 операций в позднем периоде травмы у пациентов, оперированных ими в
сроки от 1 мес до 9 лет после травмы (в среднем через 13 мес после травмы). 29 пациентов
после операции начали ходить. 6 пациентов, которые ходили до операции, стали передвигаться значительно лучше. Только у 9 из них не было неврологического улучшения. Однако авторы не указывают, в какие сроки после операции проявилось улучшение, и сами
делают оговорку, что, возможно, оно бы возникло и без вмешательства [27].
Также у больных с травматической болезнью спинного мозга применяются реконструктивные микрохирургические операции по реваскуляризации и реиннервации спинного мозга с помощью сальника [3, 4, 7]. Свободная аутопластика сальником с микроанастомозированием его сосудов с артериальным и венозным сосудистым бассейном соответственно уровню поражения дает возможность производить оментомиелопексию при
любом уровне поражения спинного мозга. Свободную оментомиелопексию необходимо
дополнять менингорадикулолизом для достижения максимального эффекта хирургического
лечения.
Таким образом, хирургичсекое лечение может реально снизить неврологический дефицит у пациентов с ТПСМ. Несмотря на успехи хирургии при ТПСМ большое количество
больных подвергается тяжелой инвалидизации.
2. Медикаментозная терапия
Медикаментозная терапия при травме спинного мозга значительно усовершенствовалась за последние семь лет. В 1999 г. Geisler и соавт. сообщили, что моносиаловый ганглиозид (GM1), вводившийся не позднее 48 часов после травмы, и терапия метилпреднизолоном ускоряют неврологическое восстановление, но не приводят к значимому улучшению в сроки 6-12 месяцев после повреждения.
Появилось несколько новых методов лечения нейропатической боли. В некоторых
клиниках используется введение лекарств, в том числе морфина, под оболочки спинного
мозга. Некоторые антиэпилептические лекарства оказывают выраженный эффект в купировании нейропатической боли, особенно большие дозы неуронтина (габапентина) и карбемапазин. Также помогают блокаторы глютаматных рецепторов и каннабиноиды. Новый
метод лечения спастичного мочевого пузыря - внутрипузырное введение препаратов.
Например, дитропан при введении в мочевой пузырь уменьшает его спастичность при
меньших побочных эффектах. Капсаицин (сapsaicin) - экстракт перца, вводимый внутрипузырно, поглощается нервными волокнами и приводит к истощению субстанции P в
спинном мозге, стойко (на 2-3 месяца) уменьшая спастичность пузыря. Тизанидин - блокатор альфа-адренорецепторов недавно был апробирован для купирования спастичности.
Наконец, 4-аминопиридин (4-AP), может уменьшить боль и спастичность, а также улучшить чувствительность и двигательную функцию у больных с демиелизированными аксонами при хроническом повреждении спинного мозга. Третья фаза клинических испытаний
этого препарата близится к завершению. Если результат будет положительным, 4-AP станет первым лекарством, уменьшающим спастичность, не ухудшая двигательную функцию.
Таким образом, несмотря на появление новых препаратов для лечения при травме СМ,
их клиничесакая эффективность не доказана. Необходимо проведение мультицентровых
исследований для решения вопроса о эффективности той или иной группы препаратов в
схему лечения ПТСМ.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
13
3. Реабилитация
Появилось много новых методов реабилитации. Функциональная электрическая стимуляция (FES) обычно применяется, чтобы активизировать парализованные мышцы.
Имплантация крестцовых электростимуляторов используется для активизации мочеиспускания и предотвращения недержания мочи. Применяются наружный (Ness) и внутренний (Freehand) стимуляторы руки. Многие аппараты для электростимуляции соединяют с
устройствами для тренировки такими, как велотренажер, чтобы предотвратить мышечную
атрофию. Но, возможно, наиболее важным достижением в реабилитации было осознание
роли феномена "learned non-use" ("разучился использовать"). Этот термин имеет отношение к нервным цепям (даже анатомически сохранным), выключающимся после длительных периодов бездеятельности. Подобно мышцам, которые атрофируются, если не используются, нервные цепи также могут подвергнуться атрофии. Поскольку люди после
травмы спинного мозга восстанавливаются медленно и на долгий срок остаются неактивными, возникающий феномен "learned non-use" может препятствовать функциональному
восстановлению. Несколько последних исследований показали, что "learned non-use"
можно обратить интенсивными упражнениями даже после десятилетий паралича. Taub и
соавт. обнаружили, что больные с гемиплегией после инсульта могут восстановить функцию, если будут принуждены пользоваться парализованными руками. Терапия с использованием обратной биологической связи также может значительно улучшить двигательную функцию. Но, возможно, наиболее впечатляющие достижения наблюдаются в восстановлении ходьбы. Wernig и другие исследователи сообщили, что интенсивная тренировка ходьбы на тредмилле (бегущей дорожке) может восстановить способность к ходьбе
у большинства людей с неполным повреждением спинного мозга, даже если они никогда
не ходили после травмы. Для облегчения такой тренировки разработаны различные
устройства и тренажеры.
IV. Клеточные методы восстановления поврежденного
спинного мозга
Трансплантация нейрональных стволовых клеток и других
нейрональных линий клеток
В последние годы стали интенсивно изучаться свойства различных типов стволовых
клеток и возможность их применения в медицине, в частности при болезнях ЦНС [45, 81,
98, 109]. На моделях травмы спинного мозга (ТСМ) было показано, что нейрональные региональные стволовые клетки могут выживать, интегрироваться с мозгом хозяина, а также
дифференцироваться в нейроны и глию [70, 71]. Развитие и дифференцировка трансплантированных нейрональных стволовых клеток (выделенных из эпендимиальных оболочек)
совпадала с восстановлением функции экспериментальных животных с ТСМ [70]. Было
высказано предположение, что плюрипотентные свойства нейрональных стволовых клеток позволяют использовать их в качестве источника донорских клеток для трансплантации при травме спинного мозга.
Vacanti C.A. использовал региональные нейрональные стволовые клетки, выделенные
из спинного мозга крысы. Клетки пересаживались в геле из плюроника P-200, при этом
трансплантат во время операции закрыл диастаз перерезанного спинного мозга длинной 4
мм. В группе животных с трансплантацией нейрональных стволовых клеток наступило
восстановление функции задних конечностей, тогда как в контрольной группе существенных изменений не произошло [105].
Из линии клеток, человеческой тератокарциномы (hNT клетки от Layton Bioscience Inc)
после воздействия ретиноевой кислотой была получена гомогенная популяция нейрональ-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
14
ных клеток предшественников NT2N [14]. Это клетки (NT2N) характеризовались стабильностью нейрохимических, физиологических и морфологических свойств в культуре [10,
15, 16, 67, 79, 83, 84, 114]. NT2N клетки были успешно пересажены в мозг иммунодефицитных мышей, хорошо прижились, не образовывали опухоли, не отторгались, не некротизировались и не подверглись апоптозу в течение одного года [55, 66, 76, 77]. Более того,
было показано, что пересаженные NT2N клетки, интегрировали с окружающей нейрональной тканью хозяина, посредством дендритных и аксональных отростков [103]. Эти
клетки были использованы на животных моделях, имитирующих следующие неврологические состояния: инсульт [28, 29, 90], болезнь Гентингтона [60], болезнь Паркинсона [17]
и нейротравма [82]. Недавно, показано, что трансплантированные NT2N клетки интегрируют с клетками хозяина в спинном мозге мыши и дают спрутинг аксонов на протяжении
более чем 2 см [54]. Использование в клинике NT2N клеток сдерживается потенциальной
возможностью малигнизации этих клеток.
Другая нейрональная линия стволовых клеток RN33B была получена из ядер шва эмбрионального мозга крысы. Эти клетки были трансфецированы ретровирусным вектором,
несущим ген, кодирующим температурно чувствительный мутантный протеин SV40
большого T-антигена [109]. На модели ушиба спинного мозга крысы было продемонстрировано, что пересаженные после трансфекции клетки развиваются и дифференцируются в
биполярные нейроны [80], а также интегрируют с окружающей тканью спинного мозга
хозяина [80, 109]. К сожалению подобных попыток применения этих клеток в клинике не
было из-за развития хромосомных аберраций в эксперименте [109].
McDonald и соавторы использовали линию эмбриональных стволовых клеток D3, обработанных ретиноевой кислотой, для трансплантации в область повреждения спинного
мозга крыс [71]. Перед трансплантацией клетки были трансфецированы LacZ, экспрессирующим галактозидазу. Спустя две недели, методом двойного окрашивания были обнаружены пересаженные клетки. При этом было показано, что трансплантированные клетки
окрашиваются также специфическими маркерами на нейроны (NeuN - нейронспецифический ядерный протеин), астроциты (GFAP- глиально-фибрилярный кислый
протеин), олигоденроциты (APC CC-1 - аденоматозный полипозный генетический продукт палочек). В группе животных с трансплантацией клеток было выявлено некоторое
улучшение функции паретичных конечностей по сравнению с контролем. Таким образом
бала доказана теоретическая и экспериментально подтверждена возможность замены патологических клеточных элементов ткани органа на региональные и стволовые клетки при
их прямой трансваскулярной цитотрансфузии, а также модуляции функционального состояния органа при трансплантации донорских клеток культуры ткани.
Трансплантация эмбриональных клеток головного
и спинного мозга
В течение последнего десятилетия был накоплен значительный опыт по пересадке эмбриональных клеток для восстановления функции спинного мозга [7]. Были установлены
оптимальные сроки для забора эмбрионального мозга (7-9 неделя) и трансплантации эмбриональных клеток [96]. Так было показано, что при трансплантации эмбриональных
клеток коры и спинного мозга крысам (взрослым и новорожденным) с повреждениями
спинного мозга в период до семи дней от момента травмы, имеет место сохранение пересаженных нейронов. Если клетки пересаживали после 7 дней, то выживаемость их уменьшилась.
Показано, что крысиная зародышевая неокортикальная ткань способна развиваться и
дифференцироваться в нормальные нейроны в поврежденном спинном мозге крысы [38].
Было установлено [24], что уже спустя 7 дней в зоне трансплантации выявляются дифференцированные нейроны и нейроглия. Имеются данные по клеточной миграции донорских
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
15
клеток: трансплантированные астроциты были идентифицированы дистальнее места пересадки до 3,5 см [50].
Вследствие того, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) спинного мозга при травме
нарушается [85], трансплантат, пересаженный в место повреждения спинного мозга, постепенно вовлекается в реакцию иммунного ответа. Несмотря на это, трансплантированные клетки интегрируют с тканью хозяина и пролиферируют, заполняя область повреждения [101]. Использование иммунносупрессии позволяет уменьшить иммунную реакцию
на трансплантат [23]. Исследованиями Homer и соавторов было показано, что использование - аминоизобутириковой кислоты при пересадке эмбриональных клеток не вызывает
значительного повреждения ГЭБ, но при этом в области трансплантата происходит значительное уменьшение проницаемости ГЭБ [56]. Приведенные результаты указывают на
возможность использования кратковременной иммунносупрессии после трансплантации,
поскольку вместе с развитием трансплантата, восстанавливается и целостность гематоэнцефалического барьера.
Несмотря на наличие доказательств о выживании трансплантата и о функциональном
восстановлении после трансплантации фетальной ткани [4, 31, 33, 46, 65, 89], ряду авторов
не удалось обнаружить спрутинг аксонов хозяина сквозь трансплантат больше чем на 1-2
мм в каудальную часть спинного мозга [18, 32, 61, 78]. Напротив, результаты пересадки
эмбриональных клеток новорожденным щенкам при травме спинного мозга показывают,
что нисходящие аксоны проникают через трансплантат и протягиваются дистальнее от
места трансплантации более чем на 4 мм [25, 40, 75]. Имеется также доказательство, что
трансплантация эмбриональных клеток на модели полной перерезки спинного мозга у новорожденной крысы улучшила функциональное восстановление по сравнению с контролем [100]. Эти данные свидетельствуют о том, что окружающая среда развивающегося
спинного мозга также способствует не только выживанию трансплантированных клеток,
но и восстановлению их контактов со спинным мозгом реципиента.
Возможности ксенотрансплантации, с помощью эмбриональных клеток спинного мозга
человека также изучали на модели травмы спинного мозга крысы [13, 47, 48]. После
трансплантации на модели ушиба, человеческие эмбриональные клетки спинного мозга
были идентифицированы иммуногистохимически спустя 2-3 месяца [73]. В качестве
трансплантата использовались тканевые (твердые или солидные) трансплантаты и суспензия эмбриональных клеток. При этом было показано, что тканевые трансплантаты, помещенные в область повреждения, в острой фазе имели выживаемость 83%, тогда как при
трансплантации в позднем периоде после повреждения спинного мозга (14-40 дней после
травмы) выживаемость составила 92% [48]. При использовании суспензии клеток в позднем периоде травмы выживание составило 85%. Эти исследования указывают на тот факт,
что выживаемость человеческих эмбриональных клеток при трансплантации, а также
дифференцировка и интеграция этих клеток зависят от выбора времени трансплантации и
типа трансплантата (тканевой трансплантат или суспензия клеток).
Трансплантация модифицированных стволовых клеток
костного мозга
Наряду с вышеперечисленными типами клеток для нейротрансплантации, мобилизованные стволовые клетки костного мозга так же рассматриваются, как потенциальный источник клеток для пересадки в поврежденный спинной мозг [62].
Стромальные клетки костного мозга способны дифференцироваться в адипогенном,
хондрогенном, миогенном, остеогенном и кардиомиогенном направлении, а также в другие ткани, которые имеют общее мезодермальное происхождение [62]. В исследовании
Jun Kohyama [62], было показано, что нейрональную дифференцировку, можно получить
из клеток стромы костного мозга при культивировании в среде со специфическими индукторами, на подложке из фибронектина и орнитина. Нейроны и глия, полученные из кост-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
16
но-мозговой стромы, формировали аксоны, экспрессировали нейронспецифические маркеры (MAP-2, NF, Nestin, GFAP) и отвечали на деполяризующие стимулы, как функционирующие зрелые нейроны. Трансдифференцировка клеток стромы костного мозга в этом
эксперименте была вызвана Noggin-агентом. Идея использования Noggin-агента для трансдифференцировки стромальных клеток костного мозга аналогична идее обработки клеток 5-азацитидином - препаратом, способствующим изменению экспрессии генов путем
диметилирования ДНК.
Трансплантация Шванновских клеток
Известно, что Шванновские клетки продуцируют миелин, а также составляя основу
оболочки аксонов, выделяют различные нейротрофические факторы: фактор роста нервов
(NGF) [20], нейротрофический фактор, синтезируемый в головном мозге (BDNF) [11] и
реснитчатый нейротрофический фактор (СNTF) [44]. Эти факторы, также как внеклеточные матричные молекулы [34], могут играть значительную роль в аксональной регенерации. Значение нейротрофических факторов, выделяемых Шванновскими клетками, было
изучено в эксперименте. Так культура Шванновских клеток, выделенных из седалищных
нервов крысы, была пересажена в зону повреждения, созданную путем моделирования
неполной перерезки спинного мозга в грудном отделе позвоночника [112]. При гистологическом исследовании были обнаружены признаки регенерации аксонов только в области трансплантации. При этом не имелось никаких доказательств аксональной регенерации ростральнее и каудальнее места трансплантации [112]. Между тем исследование Chen
[111], выполненное на той же модели, демонстрирует не только обширную регенерацию
спиномозговых аксонов ростральнее и каудальнее зоны повреждения, но также и ограниченный спрутинг аксонов в каудальный конец трансплантата. Эти наблюдения были подтверждены в других исследованиях [69], которые показали выживание и интеграцию
трансплантированных Шванновских клеток с окружающими тканями спинного мозга хозяина. Несмотря на положительные гистологические результаты, по мнению Martin [72]
не существует пока убедительных доказательств наличия спрутинга аксонов хозяина
сквозь трансплантат [72], т.к. никем не показано восстановление функции спинного мозга
у экспериментальных животных.
Дополнительное введение нейротрофических факторов через мини-насос в область
трансплантации Шванновских клеток увеличивало число миелинизируемых волокон в
зоне трансплантации. Чтобы увеличить свойственную Шванновским клеткам способность
выделять нейротрофические факторы, в эксперименте стали использовать генетически
модифицированные Шванновские клетки [74, 104, 93, 106]. Было показано, что генмодифицированные трансплантаты Шванновских клеток спонтанно образуют скопления в пределах спинного мозга и вызывают увеличение роста аксонов, а также ремиелинизацию, по
сравнению с немодифицированными клетками [106]. На модели полного пересечения
спинного мозга крысы было продемонстрировано, что трансплантация человеческих
Шванновских клеток также ведет к ускорению аксональной регенерации. При этом
наблюдалось некоторое восстановление функции паретичных конечностей [54].
Пересадка обкладочных клеток обонятельной зоны коры
головного мозга
Другая группа миелин-формирующих клеток - обкладочные клетки обонятельной зоны
коры головного мозга - также используются в нейротрансплантации. В отличие от Шванновских клеток, обкладочные клетки обонятельной зоны коры локализуются в ЦНС и
поддерживают рост аксонов от обонятельной луковицы [42]. Обкладочные клетки обонятельной зоны коры миелинизируют аксоны в культуре [39]. Li и соавторы [68] пересадили
суспензию культивированных обкладочных клеток обонятельной зоны коры в спинной
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
17
мозг взрослой крысы в область неполного рассечения его на уровне шейного отдела позвоночника. Было установлено, что клетки трансплантата миелинизировали часть аксонов,
функция пораженных конечностей улучшилась у животных с трансплантацией, тогда как
в группе контроля улучшения не наблюдалось. Восстановление функции, при трансплантации обкладочных клеток обонятельной зоны коры было подтверждено и в других исследованиях [87, 88]. Возможность значительной ремиелинизации демиелинизированного
спинного мозга крыс после трансплантации в него человеческих обкладочных клеток была показана также в работе Kato [64]. Все эти исследования вселяют надежду на возможность и целесообразность применения обкладочных клеток обонятельной зоны коры с лечебной целью.
Использование биополимеров
В работах братьев Ваканти с соавт.(1999) была доказана в эксперименте на крысах возможность полного восстановления функции движения при реконструкции полного перерыва спинного мозга путём имплантации твёрдого полимерного матрикса (фирма Albani
Corparation (USA)) со стволовыми нервными клетками. В работах S.Woerly(1999) был использован биополимер NeuroGel. Биополимер не содержал стволовых клеток и факторов
роста - т.е. в область полного перерыва спинного мозга имплантировался чистый биосовместимый гидрогель. Полученные результаты показали, что без применения NeuroGel'я в
зоне повреждённого спинного мозга образовывались рубцы, спайки и кисты, а применение биополимерного моста ведёт к восстановлению структуры мозга без морфологического дефекта. Джефри Райзман (J. Raisman et al., 1999 - 2000) из Национального института
медицинских исследований в Люндоне в своих работах использовал биополимерную коллагеновую биодеградирующую матрицу с добавлением собственных стволовых клеток
обонятельного эпителия. Это также позволило добиться восстановления двигательной активности у крыс после полного пересечения спинного мозга по прошествию 2-х месяцев, в
то время как животные контрольной группы остались парализованными.
Таким образом, несмотря на разнообразие применения различных клеточных технологий единой концепции их применения на сегодня не существует. Причиной этого в певую
очередь является недосточное понимание механизмов действия различных клеток и отсутствие правильных методичиеских и методологиеских подходов к оценке неврологического статуса у пациентов с ТПСМ. Кроме того, значительную часть клетоных технологий
невозможно применить из-за этических, моральных и религиозных проблем (например,
эмбриональные стволовые клетки). Возможно, решением данной проблемы является использование для лечения травматической болезни СМ аутологичных стволовых клеток.
Клиническая характеристика пациентов, методы
исследования и лечения
Пациенты, поступившие в клинику, с травматической болезнью спинного мозга проходили обследование (Таблица 1), после чего решался вопрос о включение их в межотраслевую программу РАМН "Новые клеточные технологии - медицине".
Таблица 1. Программа обследования пациента.
- Клинический анализ крови, ликвора, мочи
- Рентгенография органов грудной клетки
- Магнитно-резонансная томография (МРТ)
- RW, HCV, HBS, ВИЧ
- Группа крови и резус-фактор
- Коагулограмма
- Биохимия крови
- ЭКГ, ЭНМГ, Эхо-КГ, ЭЭГ с картированием
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
18
- Иммунологический статус
- ПЦР- диагностика крови и ликвора на инфекции
- Комплексные уродинамические пробы
- Комплексное УЗИ
- Анализ нейроспецифических антигенов и антител в ликворе и сыворотке крови
- Консультации невролога, нейрохирурга, психолога, терапевта, уролога, гематолога
Абсолютными противопоказаниями для трансфузии и трансплантации клеток считали:
1) Острые инфекционные заболевания.
2) Тяжелые гематологические заболевания.
3) Острые состояния с декомпенсацией нарушенных витальных функций организма
(агональное состояние, кровотечения, интоксикация, психотические состояния).
4) Полиорганная недостаточность и кахексия.
5) Гнойно-септические осложнения (пролежни, сепсис и т.д.).
Было обследовано 78 пациентов, однако данные по 48 из них не были включены в исследование. Это было связано с тем, что у некоторых больных имелись противопоказания
к введению аутологичных клеток. Часть пациентов госпитализировалась однократно, в
связи с чем не было возможности оценить эффективность терапии. У одного пациента
был имплантирован электростимулятор для уменьшения болевого синдрома.
Таким образом, в нашей работе мы анализировали результаты 30 пациентов, из которых было сформировано несколько групп:
1. С введение мобилизованных стволовых клеток (МСК) - 18 пациентов (Табл. 2);
2. С введением глиообонятельных нейрональных клеток (ГОК)- 5;
3. С введением "Сферогеля"- 1;
4. С введении "Сферогеля" и МСК- 3;
5. С введением "Сферогеля" и ГОК- 3.
Характеристика пациентов.
Возраст
От 19 до 51 года
Пол
Мужчин - 12, женщин - 6
Давность травмы
Меньше 1 года - 3
От 1 года до 5 - 6
Больше 5 лет - 9
Уровень травмы СМ
Шейный отдел - 7
Грудной отдел - 7
Поясничный отдел - 4
Наличие функционального перерыва СМ
Полный - 11
Неполный - 7
Количество введений
За 2 госпитализации - 4 введения
Среднее количество вводимых клеток
5,3 млн.
Характеристика группы с трансфузией аутологичных МСК.
Было обследовано 5 пациентов травматической болезнью СМ.
Клинико-неврологические методы обследования.
Для клинической оценки полученных результатов лечения применялись шкалы FIM
(Functional Independence Measure) и ASIA (American Spinal Injury Assosiation Impairment
Scale), которые входят в протокол мультицентровых исследований для больных со спинальной травмой.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
19
Шкала FIM позволяет характеризовать самообслуживание, перемещение, подвижность
больного и его способность контролировать функции тазовых органов (всего 13 пунктов,
из которых каждый оценивается по 7-ми балльной шкале).
Шкала ASIA выявляет наиболее каудальный уровень, на котором чувствительные и
двигательные функции еще сохранены с обеих сторон. Для этого с каждой стороны исследуется 10 миотомов и 28 дерматомов.
Шкала комитета медицинских исследований (по R. Van der Ploeg and al, 1984)
Объем пассивных движений
движения отсутствуют - 5 баллов
минимальные движения в конечностях - 4 балла
1/4 амплитуды движения в конечностях - 3 балла
1/2 амплитуды движения в конечностях - 2 балла
3/4 амплитуды движения в конечностях - 1 балл
полный объем движений - 0 баллов
движения отсутствуют - 5 баллов минимальные движения в конечностях - 4 балла 1/4 амплитуды движения в конечностях - 3 балла
Объем активных
1/2 амплитуды движения в конечностях - 2 балла 3/4 амплитуды
движений
движения в конечностях - 1 балл полный объем движений - 0 баллов
полный паралич - 5 баллов
пальпируемые или видимые сокращения - 4 балла
Сила мышц туактивные движения в облегченном положении - 3 балла
ловища и конечактивные движения в обычном положении - 2 балла
ностей
движения с преодолением некоторого сопротивления - 1 балл
движения против полного сопротивления - 0 баллов
Оценка неврологического статуса включало в себя тестирование двигательных, чувствительны систем, функции тазовых органов, определение выраженности функционального перерыва и уровня травмы.
I. Для оценки двигательной активности использовалась шкала комитета медицинских
исследований (Табл. 3), благодаря которой можно оценить (от 0 до 5 баллов в зависимости
от степени выраженности изменений) объем активных, пассивных движений, а также силу
мышц туловища и конечностей.
Оценка рефлексов, тонуса мышц и степени выраженности гипотрофии проводилась по
специально разработанным шкалам, представленным в таблицах 4, 5.
Для облегчения статистической обработки данных, а также, учитывая тот факт, что нам
пришлось использовать различные шкалы для оценки двигательной активности, был введен как общий балл нарушения двигательной функции. Для двигательных нарушений общий балл находился в диапазоне от 0 до 90.
II. Оценку чувствительных нарушений проводили с помощью шкалы ISCSCI-92 (отсутствие чувствительности - 2 балла, снижение чувствительности - 1 балл, нормальная чувствительность - 0 баллов). Для чувствительных нарушений общий балл находился в диапазоне от 0 до 16.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
20
Балльная оценка рефлекторной активности.
Сухожильные и периостальные рефлексы (сгибательно-локтевой;
разгибательно-локтевой; карпорадиальный; коленные рефлексы;
ахилловы рефлексы; подошвенные рефлексы)
повышен или
утрачен- 2
понижен - 1
норма - 0
Брюшные, подошвенные:
отсутствуют - 1
сохранены - 0
Патологические рефлексы на коненчостях
есть - 1
нет - 0
Балльная оценка уровня мышечного тонуса.
Тонус мышц верхних и нижних конечностей
резко повышен с формированием контрактур - 2
понижен или повышен по спастическому
типу - 1
норма - 0
Гипотрофия мышц верхних и нижних конечностей
есть - 1
нет - 0
III. Для оценки нарушений функции тазовых органов общий балл находился в диапазоне от 0 до 5. При этом нарушение функции тазовых органов оценивался так же по разработанной нами шкале
Балльная оценка нарушений функций тазовых органов
Мочеиспускание
не нарушено - 0
периодическое недержание мочи - 1
императивные позывы на мочеиспускание - 2
истинное недержание мочи - 3
задержка мочи - 4
Дефекация
не нарушена - 1
запоры - 0
IV. Оценка функционального перерыва спинного мозга проводилась по данным неврологического статуса (нижняя параплегия, анестезия по проводниковому типу, задержка
мочи). Наличие минимальных движений или гипестезии ниже зоны повреждения оценивались как неполный функциональный перерыв спинного мозга (нет - 0, неполный функциональный перерыв спинного мозга - 1, полный функциональный перерыв спинного мозга - 2).
V. Также для оценки уровня травмы использовались данные МРТ. В основе балльной
оценки тяжести травмы использовались позвонки, соответствующие шейному и пояснично-крестцовому утолщению (Табл. 7).
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
21
Балльная оценка в зависимости от уровня травмы.
Уровень травмы
Балльная оценка
С1-С3 позвонки
5 баллов
С4-Th2 (шейное утолщение)
4 балла
Th3-Th8
3 балла
Th9-L1(пояснично-крестцовое утолщение)
2 балла
L2 и ниже
1 балл
Нейрофизиологические методы исследования
Комплексные уродинамические пробы.
Исследование проводилось на уродинамической установке Дует Мульти-Р (Medtronic,
Дания). Используемая терминология и методика проведения уродинамического исследования соответствует стандартам, рекомендованным ICS (International Continence Society международное общество по проблеме удержания мочи). Внутрипузырное давление измерялось c помощью двухпросветного катетера 6 или 8 Fr. Измерение абдоминального давления производилось с помощью ректального баллонного катетера. Электромиография
выполнялась наложением поверхностных ЭМГ электродов, расположенных на 3 и 9 часах
соответственно около анального отверстия пациента, согласно рекомендациям ICS.
Обязательным условием проведения уродинамических проб являлось нахождение пациента в горизонтальном положении. Скорость наполнения при выполнении цистометрии
составила от 20 до 25 мл/мин.
При выполнении уродинамический тестов оценивались следующие параметры:
1. Активность детрузора в фазу наполнения и опорожнения мочевого пузыря;
2. Чувствительность детрузора:
А. первое ощущение наполнения мочевого пузыря
Б. нормальный позыв к мочеиспусканию
В. сильный позыв к мочеиспусканию;
3. Комплайнс (адаптационная способность детрузора):
А. комплайнс 1 (начало наполнения)
Б. комплайнс 2 (при максимальной цистометрической емкости);
4. Максимальная цистометрическая емкость;
5. Электромиографическая активность мышц промежности.
Повторное уродинамическое исследование выполнялось в сроки от 2 до 3 месяцев.
Электронейромиография.
Электронейромиография (ЭНМГ) метод диагностики, основанный на регистрации и
анализе биоэлектрической активности мышечных и периферических нервных волокон,
как спонтанной, отражающей состояние их в покое и при мышечном напряжении, так и
вызванной, т. е. обусловленной электрической стимуляцией нерва или мышцы различной
интенсивности и частоты. ЭНМГ позволяет получать объективные характеристики функций нервно-мышечного аппарата с учетом возраста пациента, патогенеза и патоморфологии заболевания.
Показателями, которые анализируются в ходе исследования, являются амплитуда, латентный период М-ответа, а также скорость проведения возбуждения (СПВ) по двигательным волокнам.
Известно, что у пациентов со спинальной травмой развивается дегенерация нейронов,
заканчивающаяся их гибелью, нами было решено включить данное исследование в про-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
22
грамму с целью оценки функционального состояния двигательных волокон периферических нервов нижних и верхних конечностей до и после введение МСК.
При этом считали, что увеличение латентного периода М-ответа и уменьшение СПВ
свидетельствует о демиелинизирующем процессе, то есть о разрушении шванновских клеток. В свою очередь снижение амплитуды М-ответа о дегенерации осевого цилиндра.
Таким образом, данные ЭНМГ позволяют оценить изменения в двигательных волокнах
периферических нервов после введения МСК и косвенно является отражением процессов
реиннервации.
Сбор, консервирование и введение МСК.
Метод складывается из выполнения ряда последовательных стадий технологического
процесса: I стадия (стадия обследования), II стадия (забора и подготовки биоматериала),
III стадия ( трансфузия аутологичных МСК).
I стадия (обследование): включает в себя обязательные клинические и параклинические исследования.
II стадия (забора и подготовки биоматериала):
А. Получения стволовых клеток.
1. Мобилизация стволовых клеток в периферическую кровь.
С целью увеличения количества стволовых клеток в периферической крови пациент,
(он же донор) получал 8 инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
(Г-КСФ) подкожно, с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. Впервые три дня доза
препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается
2. Сбор стволовых клеток.
Осуществлялся на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови СОВЕ спектра с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов.
Длительность процедуры составляла 3-4 часа в зависимость от скорости процедуры, веса
донора и параметров анализа крови. Процедура проводилась путем забора крови из одной
вены, обработки ее внутри сепаратора, забора определенного объема стволовых клеток и
возврата остальных компонентов крови донору через другую вену. Средний объем собранного материала 300-400 мл.
Б. Определение периферических стволовых клеток.
Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводилось цитофлуориметрически, с применением метода тройной метки. Счет стволовых клеток происходило
на проточном цитофлюориметре.
В. Криоконсервирование стволовых клеток крови.
Криоконсервирование МСК заключалось в добавлении диметилсульфоксида к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и замораживании на 1 градус в минуту до 80 С или -120 С с использованием электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или парах жидкого азота.
III стадия ( трансфузия аутологичных МСК):
А. Подготовка препарата к трансфузии и его применение. Размораживание стволовых клеток.
Размораживание производилось непосредственно перед трансплантацией у постели
больного в водяной бане при температуре 37 - 40 С до момента перехода замороженного
материала в жидкую фазу. В дальнейшем путем центрифугирования при 1500 об/мин.
МСК осаждали на дно центрифужной пробирки, отсасывали надосадочную жидкость и
заливали 1 мл 0,9% физиологическим раствором NaCl. Процедуру повторяли дважды.
Препарат аутологичных стволовых клеток в размороженном состоянии может применяться в течение 6 часов после приготовления.
Б. Интратекальное введение препарата аутологичных МСК.
Интратекальное введение препарата гемопоэтических МСК проводили в условиях
нейрореанимационного отделения. Трансфузию аутологичных МСК осуществляли через
люмбальный прокол, выполненный в L2-L3 промежутке, под местной анестезией 1% рас-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
23
твора лидокаина. Затем забирали 3 мл ликвора и смешивали со 100 мкл клеточного препарата (максимальный объем до 1 мл). Ресуспензировали клеточный препарат в ликворе и
медленно вводли в субарахноидальное пространство. При необходимости повторяли интратекальную трансфузию МСК через 2-3 месяца.
В клинике пациентам с последствиями спинальной травмы помимо клеточной терапии
проводились мероприятия, направленные на коррекцию соматической патологии.
Изучение механизма действия МСК
Экспрессия рецептора gp130/80 изучена нами на 12 образцах мобилизованных стволовых клеток крови больных c тяжелой вертеброспинальной травмой. Клетки окрашивали
стандартными МКА к CD34 (HPCA-2, Becton Dickinson, США), напрямую меченными
флуорохромами (флуоресцеином, FITC; фикоэритрином, РЕ, перидининхлорофиллом,
PerCP). Экспрессию молекул gp130 и gp80 изучали путем обработки клеток МКА А1, С2,
D1 и М91, меченными биотином, с последующей визуализацией связанного с клеткой
биотина комплексом стрептавидинфикоэритрин. В качестве отрицательного контроля использовали биотинилированные МКА к T-клеточному рецепторному комплексу / , который, как известно, отсутствует на мембране стволовых гемопоэтических клеток. Накапливали клетки позитивные по CD34. Анализ осуществляли в гейте CD34+ клеток с низкими
(близкими к таковым для лимфоидных клеток) характеристиками светорассеяния лазерного луча (Low SSC).
Способ приготовления "Сферогеля"
Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс представляет собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, один из которых является
тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса.
Матрикс состоит из двух фаз: твердой - в виде микросфер из коллагена ткани млекопитающих, и жидкой - образованной из денатурированного коллагена ткани птиц. Матрикс
дополнительно содержит компоненты физиологических культуральных сред, добавки,
способствующие росту и дифференциации клеток и тканей, антибактериальные и/или антивирусные компоненты и антиагрегационные препараты.
Для приготовления раствора коллагена млекопитающего (РКМ) и денатурированного
раствора коллагена птиц (РКП) использовали 0,3М уксусной кислоты, в конечной концентрации для РКМ 0,5-1,5%, для РКП - 3,0-5,0%. Затем РКМ обрабатывали Y-излучением в
дозе 1,0 Мрад и гомонизировали до получения микросфер, после чего РКМ и РКП обрабатывали дистиллированной водой до рН не менее 6,0, промывали фосфатным буферным
раствором и смешивали отмытый коллаген млекопитающих и коллаген птиц в соотношении 1:1 с полученным матриксом. В полученный матрикс дополнительно вносили антибактериальные и/или антивирусные компоненты, а также стимуляторы регенерации тканей и антиагрегационные препараты. Полученный матрикс стерилизовали Y-излучением в
дозе 0,5 Мрад на 1 мл.
Конечными продуктами биодеградации является СО2 и Н2О.
Изделие упаковано в шприцы различной емкости, простерилизовано Y-излучением.
Вводят матрикс непосредственно в зону дефекта.
Также каждому больному была составлена индивидуальная программа по ребиалитации, в которую входили:
Комплекс лечебной физкультуры
1. Пассивно-активная гимнастика выполняется с методистом.
2. Дыхательная гимнастика выполняется с методистом.
3. Суставная гимнастика выполняется с методистом.
4. Силовые упражнения на тренажёре "КРОССОВЕР" выполняется с методистом.
5. Вертикализация пациента на специальном оборудовании, затем в коленном упоре с
последующими приседаниями.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
24
6. Силовая гимнастика выполняется с методистом.
7. Гимнастика с отягощениями выполняется с методистом.
8. Гимнастика с отягощениями выполняется с методистом.
9. Занятие на велоэргометре "МОТОМЕД" в различных режимах.
10. Комплексные упражнения на тренажёре "Райдер-Варио" выполняется с методистом.
Курс ЛФК составляет 15-20 процедур.
Массаж
1. Общий массаж.
2. Точечный массаж.
3. Меридианный массаж.
4. Линейный массаж.
5. Рефлекторный массаж.
6. Тонизирующий массаж.
7. Расслабляющий массаж.
8. Криомассаж (кубиками льда на основе растворов лекарственных трав).
9. Тракционный массаж.
Различные виды массажа в количестве 15-20 сеансов.
Физиотерапевтические процедуры
1. Электромиостимуляция.
2. Магнитотерапия (ПМП).
3. Электрофорез.
4. Фонофорез (ультразвук).
5. Ингаляции.
6. УВЧ терапия.
7. Ультротон терапия.
8. Лазеротерапия.
В процессе восстановительной терапии активно используются реабилитационные приспособления лечебной целью, так и целью профилактики возможных осложнений:
1. Корсеты и бандажи различной степени жёсткости на отделы позвоночника.
2. Противопролежневые системы.
3. Лангеты и тутора на верхние и нижние конечности.
4. Лечебные укладки для положения тела и конечностей.
5. Компрессионные изделия.
6. Средства для облегчения самостоятельного передвижения.
Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы "SPSS 9,0".
Оценка клинических результатов трансфузии аутологичных мобилизованных стволовых клеток у пациентов с травматической болезнью спинного мозга.
Применение трансфузии МСК в субарахноидальное пространство СМ, была оценено у
18 пациентов с позвоночно - спинальной травмой, включенных в межотраслевую программу "Новые клеточные технологии-медицине".
89% исследуемых пациентов имели давность травмы более 5 лет. 96% больных до госпитализации в течение нескольких лет не имели никакой положительной неврологической
динамики.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
25
Рис. 1. Эффективность терапии у пациентов, получивших трансфузию МСК.
Из всех обследованных больных у 61,1% имели положительный эффект от лечения
МСК (рис.1).
Через 2 - 3 месяца после первого курса трансфузии МСК отмечалась достоверная положительная динамика в виде восстановления функций тазовых органов и двигательной
активности. Однако изменений по шкалам FIM и ASIA отмечено не было, что указывает
на отсутствие влияния улучшения неврологического статуса на инвалидизацию пациентов
и связано, вероятнее всего, с грубой шкалой оценки результатов лечения. В связи с этим
оценку неврологической симптоматики в дальнейшем проводили с помощью шкалы комитета медицинских исследований, шкалы ISCSCI-92 и другими специально разработанными шкал.
Анализ полученных результатов показал, что восстановление больных со спинальной
травмой в зависимости от уровня поражения и выраженности травмы и степени функционального перерыва не одинаково.
Рис.2. Эффективность терапии у пациентов с различным уровнем травмы.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
26
Рис. 3. Эффективность терапии МСК у пациентов
с неполным и полным функциональным перерывом СМ.
Динамика восстановление утраченных функций была хуже у больных, с уровнем травмы C4-Th2 позвонков (улучшение неврологической симптоматики отмечено у 40% больных). Ввиду малого количества больных с другим уровнем локализации травмы сравнительный анализ этих групп было провести не возможно. Вероятнее всего, сдавление спинного мозга на уровне шейного утолщения в результате травмы приводит не только к повреждению проводящих путей, но и является непосредственной причиной гибели нейронов (чувствительных, двигательных, вегетативных, вставочных и т.д.), которые участвуют
в иннервации верхних конечностей. Кроме того, длительный срок, проходящий от момента травмы до ортопедической коррекции и от травмы до лечения МСК являются дополнительными неблагоприятными факторами, которые оказывают влияние на гибель нейронов.
Больные с полным функциональным перерывом спинного мозга характеризовались
лучшим восстановлением двигательной активности и функции органов малого таза (81,8
%), чем больные с неполным функциональным перерывом (28,6 %) (Рис. 3).
I. Двигательные изменения у больных после
применения МСК
Рис. 4. Oбщая характеристика динамики двигательных нарушений после трансфузии МСК.
После первой трансфузии МСК была выявлена положительная динамика в виде
уменьшения двигательных нарушений. В течение 3 месяцев после второй трансфузии
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
27
МСК достоверных изменений нарушений двигательных функций не выявлено, что связано с небольшим количеством наблюдений (рис.4).
Изменения двигательной активности у больных после первой трансфузии МСК были
неодинаковые.
Рис. 5. Динамика двигательных нарушений после первой трансфузии МСК..
Изменения двигательной активности у больных после первой трансфузии МСК были
неодинаковые. У 7 пациентов достоверных изменений получено не было. 11 имели достоверную положительную динамику в виде нарастание силы мышц конечностей, увеличения объема активных движений, что нашло свое отражение в балльной оценке двигательных изменений (исходные показатели - 40,1 балла, по сравнению с 36,7 баллами после 1
трансфузии; p<0,05, соответственно) (рис.5).
Полученные данные показали неоднозначные результаты, полученные после лечения
МСК у больных с полным и неполным функциональным перерывом спинного мозга.
Больные с полным функциональным перерывом спинного мозга характеризовались положительными изменениями в виде увеличения силы мышц конечностей и объема активных движений. У пациентов с неполным функциональным перерывом спинного мозга
этого не отмечено (Рис. 6). Возможно, это связано с отсутствием в настоящее время шкал
специально разработанных для оценки неврологических изменений у больных после тяжелых травм спинного мозга, которые должны учитывать постепенное медленное восстановление двигательной активности. К примеру, для оценки уровня мышечной силы использовалась общепринятая 5-ти бальная система. У больных с полным функциональным
перерывом спинного мозга, имевших плегию до лечения (5 баллов) появление минимальных самостоятельных движений расценивался как парез (4 балла), а у больных с неполным функциональным перерывом спинного мозга, изначально имевших парез (4 балла)
незначительное увеличение мышечной силы на общий балл влияния не оказывала.
У пациентов с неполным функциональным перерывом спинного мозга этого не отмечено (Рис. 6). Возможно, это связано с отсутствием в настоящее время шкал специально
разработанных для оценки неврологических изменений у больных после тяжелых травм
спинного мозга, которые должны учитывать постепенное медленное восстановление двигательной активности. К примеру, для оценки уровня мышечной силы использовалась
общепринятая 5-ти бальная система. У больных с полным функциональным перерывом
спинного мозга, имевших плегию до лечения (5 баллов) появление минимальных самостоятельных движений расценивался как парез (4 балла), а у больных с неполным функциональным перерывом спинного мозга, изначально имевших парез (4 балла) незначительное
увеличение мышечной силы на общий балл влияния не оказывала.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
28
Рис. 6. Динамика двигательных изменений у пациентов с частичным и полным
функциональным перерывом спинного мозга после трансфузии МСК.
В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:
Больная Й. 29 лет и/б № 04/00187, находилась клинике "НейроВита" с диагнозом: последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы, перелома Т9 позвонка. Нижняя
вялая параплегия, нарушение функции тазовых органов. Состояние после реконструктивных операций на позвоночнике - ляминэктомии на уровне 8,9,10 гр. позвонков.
При поступлении предъявляет жалобы на отсутствие движений в нижних конечностях.
Неврологический статус: Сознание ясное, правильно ориентирована в пространстве,
времени, собственной личности. Со стороны ЧМН без патологических изменений не выявлено. Мышечная сила рук - 5 баллов во всех группах. Атрофий, фасцикуляций нет. Рефлексы на руках живые, симметричные. Поверхностная и глубокая чувствительность на
руках сохранена, не изменена. Нижняя спастическая параплегия. На ногах оживление сухожильных рефлексов с расширением рефлексогенных зон. Повышение тонуса мышц ног
по спастическому типу. Симптом Бабинского, Россолимо с двух сторон. Клонусы коленных стоп и чашечек. Истинное недержание мочи. Анестензия с уровня Th9. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно.
Дважды 07.09.2004. и 13.09.04 с информированного согласия больной, была проведена
трансфузия МСК в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось 2,6 106 CD
34+ клеток. Все манипуляции больная перенесла удовлетворительно.
Катамнез через 1 год. Отмечается в сравнении с предыдущей госпитализацией наличие
движения нижних конечностях, до 1 балла в правой нижней конечности, проксимальных
отделах и 2 баллов в проксимальных отделах левой нижней конечности, снижение выраженности спастики в нижних конечностях.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
29
II. Изменения функций органов малого таза на фоне
применения МСК
Рис. 7.Общая характеристика динамики изменений функций
органов малого таза после трансфузии МСК.
Рис. 8.Пациенты без динамики функций органов малого таза
и с положительной динамикой после трансфузии МСК.
После первой трансфузии МСК отмечалось восстановление тазовых расстройств в виде
появления ощущения наполненности мочевого пузыря (рис.7). Эти положительные изменения достигали достоверности не только по сравнению с исходной группой, но и с пациентами, которые после первого введения МСК динамики не отмечали (рис.8). После второй трансфузии МСК достоверных изменений получено не было, что, вероятно, также
связано с малой группой исследуемых больных (рис.4).
Для больных с нарушением функций тазовых органов оценка результатов лечения также была также зависила от выраженности функционального перерыва спинного мозга.
Больные с полным функциональным перерывом спинного мозга после первой трансфузии
МСК характеризовались достоверными положительными изменениями со стороны функции органов малого таза, и с группой с неполным функциональным перерывом спинного
мозга (Рис. 9). Больные с неполным функциональным перерывом, спинного мозга достоверной положительной динамики от лечения МСК не отмечали. Однако, как и в случае с
двигательными нарушениями, такая динамика неврологической симптоматики вероятнее
всего связана с погрешностями в градации полученных изменений. Больные, которые не в
состоянии оценивать наполнение мочевого пузыря расцениваются как больные с истин-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
30
ным недержанием мочи, и при появлении ощущения наполненности мочевого пузыря переходят в разряд больных с императивными позывами на мочеиспускание. Пациенты, изначально относившиеся к группе с императивными позывами на мочеиспускание, в виде
положительной динамики отмечают урежение количества мочеиспусканий, ощущение
прохождение мочи по мочевыделительному тракту, попрежнему оцениваются как больные с императивными позывами на мочеиспускание. У части больных с улучшением
функции мочеиспускания на фоне лечения МСК происходит незначительная нормализация стула, что, возможно, связано, с усилением функции мышц тазового дна или является
результатом восстановления чувствительности малого таза.
Рис. 9. Динамика изменений функций органов малого таза у пациентов
с неполным и полным функциональным перерывом спинного мозга после трансфузии МСК.
В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:
Больной Б., 28 лет, и/б 04/00202 находился в клинике "НейроВита" с клиническим диагнозом: Последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы, компрессионнооскольчатый перелом С-7 позвонка.
При поступлении предъявлял жалобы на отсутствие движений и чувствительно-сти в
нижних конечностях, слабость мышц рук, недержание мочи, запоры.
Неврологический статус при поступлении: сознание ясное. ЧМН без патологии. Чувствительных нарушений в верхних конечностях нет. Плегия мышц плечевых суставов и
мышц разгибателей локтевых суставов. Снижение тонуса этих мышц. Парез мышцсгибателей локтевых составов до 3 баллов. Сила дистальных мышц рук - 5 баллов. Рефлексы на
руках: периостальные не изменены, сухожильные с мышц бицепса и трицепса - угнетены,
S=D. Патологических рефлексов на руках нет. Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя спастическая параплегия. Гипотрофия мышц ног. Рефлексы на ногах оживлены,
больше справа, с расширением рефлексогенных зон. Клонусы коленных чашечек и стоп.
Рефлексы Бабинского, Гордона и Шеффера вызываются с обеих сторон. Отсутствие всех
видов чувствительности с уровня Т1. Истинное недержание мочи.
Единожды 15.09.2004. с информированного согласия больного, была проведена трансфузия МСК в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось 3,5 106 CD 34+
клеток. Все манипуляции больной перенёс удовлетворительно.
Катамнез через 6 месяцев. У больного появилось ощущение наполненности мочевого
пузыря, стал контролировать мочеиспускание, однако ввиду периодических недержаний
мочи пользуется памперсами.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
31
III. Чувствительные изменения
Достоверных изменений для болевой, температурной, тактильной и глубокой чувствительности получено не было. Отсутствие достоверной динамики в чувствительной сфере у
исследуемых больных может быть связано:
1. С отсутствием общепринятых шкал адекватной оценки и объективных методов
оценки изменений, в т.ч. сенсорной сфере, что приводит к неадекватной оценке полученных результатов.
2. С отсроченными изменениями в чувствительной сфере.
3. С плохим восстановлением чувствительности после введения МСК.
Однако у ряда пациентов на фоне клеточной терапии отмечается незначительная положительная динамика в виде появление чувствительности по мозаичному типу (см. клинический пример).
В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:
Больная Л. 17 лет, повторно находилась в клинике "НейроВита" с диагнозом: тяжелая
позвоночно-спиномозговая травма. Компресионный перелом тела D5 и компрессионнооскольчатый перелом тела D 7-8 с компрессией спинного мозга на этом уровне и полным
функциональным перерывом спинного мозга, нижняя параплегия, нарушение функции
тазовых органов. Состояние после операции: ляминэктомия D5-8 позвонков. Передняя декомпрессия с удалением клина Урбана D7-8 и на уровне D-5 позвонков. Задний транспедикулярный спондилодез D4-D6-D9-D10.
При поступлении жалобы слабость мышц ног, недержание мочи, отсутствие чувствительности ниже уровня Th-5, императивные позывы на мочеиспускание.
Неврологический статус: Сознание ясное. ЧМН - без патологии. Мышечная сила рук 5 баллов во всех группах. Атрофий, фасцикуляций нет. Рефлексы на руках живые, симметричные. Поверхностная и глубокая чувствительность на руках сохранена, не изменена.
Нижняя спастическая параплегия. На ногах оживление сухожильных рефлексов с расширением рефлексогенных зон. Повышение тонуса мышц ног по спастическому типу. Симптом Бабинского, Россолимо с двух сторон. Клонусы коленных стоп и чашечек. Истинное
недержание мочи. Анестензия с уровня Th5. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно.
Дважды 04.08.04 и 18.08.04 с информированного согласия больной была проведена
трансфузия МСК в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось 2,28 106 CD
34+ клеток. Все манипуляции больная перенесла удовлетворительно.
Катамнез через 1 год. Больная отметила увеличение промежутков времени между мочеиспусканиями, увеличилась сила мышц спины, в результате чего был убран карсет,
уменьшилась спастика мышц ног, восстановилась чувствительность в области правой лопатки, увеличилось время в течении которого больная могла самостоятельно при помощи
рук, удерживаясь за опору, стоять на ногах, появились парестезии в ногах в виде покалывания, ползания мурашек, стала ощущать усталость ног после физической нагрузки, появилась ощущение болезненности пальцев ног, появилась мозаичная болевая чувствительность в ногах.
Таким образом, данные наших исследований предварительно показали, что на фоне терапии МСК положительная динамика отмечается более чем у половины пациентов в виде
улучшения двигательных функций и функций тазовых органов. В настоящее время в мире
не разработаны методы, позволяющие объективно оценить динамику неврологических
изменений у пациентов со спинальной травмой. Используемые шкалы, в частности FIM и
ASIA не отражают в полной мере изменения клинической картины на фоне лечения МСК.
В связи с этим в нашей клинике планируется разработка программы, которая позволит более адекватно оценить динамику неврологического статуса.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
32
В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:
Больной Г., 22 лет, повторно находился в клинике "НейроВита" с 08.03.04.г. по 15.04.04
г. с клиническим диагнозом: Последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы,
перелом Th-12 позвонка. Нарушение функции тазовых органов.
При поступлении предъявлял жалобы на отсутствие движений и чувствительности в
нижних конечностях, недержание мочи, запоры.
Неврологический статус при поступлении: сознание ясное. ЧМН без патологии. Двигательных и чувствительных нарушений в верхних конечностях нет. Тонус мышц рук не
изменен. Рефлексы на руках не изменены. Патологических рефлексов на руках нет.
Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя спастическая параплегия. Гипотрофия
мышц ног. Рефлексы на ногах оживлены, больше справа, с расширением рефлексогенных
зон. Клонусы коленных чашечек и стоп. Отсутствие всех видов чувствительности с уровня Th-12 слева и L-1 справа. Рефлексы Бабинского, Гордона и Шеффера вызываются с
обеих сторон. Недержание мочи.
Трижды 22.03.04., 25.03.04. и 05.04.04 г.г. с информированного согласия больного, была проведена трансфузия МСК в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось
6,3 106 CD 34+ клеток. Все манипуляции больной перенёс удовлетворительно. Катамнез
через 1 год. У больного увеличилась мышечная масса ног практически до нормального
состояния, самостоятельно ходит с опорой на "ходунки", восстановилась половая функция, полностью стал контролировать дефекацию, появилось ощущение наполненности
мочевого пузыря, но мочеиспускание осуществляет с использованием катетеризации, появилась мозаичная болевая чувствительность в ногах.
Оценка клинических результатов трансфузии
аутологичных обкладочных глиообанятельных клеток
(ОГК) у пациентов с травматической болезнью СМ
Трансфузия ОГК в субарахноидальное пространство СМ, была проанализирована у 5
пациентов с позвоночно - спинальной травмой. Анализ клинических эффектов проводился
различными шкалами оценки неврологического статуса и инвалидизации пациентов.
Двигательная активность, чувствительность и функция тазовых органов ни у одного
больного не изменились в течение 1 года после введения ОГК. Кроме того, у одного пациента развился тяжелый отек головного мозга, который потребовал проведения всего комплекса интенсивной терапии, направленного на поддержание жизненно важных функций.
Неудовлетворительные клинические результаты привели к прекращению проведения клинических испытаний трансфузии ОГК.
Скорее всего, отсутствие клинических улучшений неврологического статуса было связано с неспособностью ОГК "перемещаться" к области повреждения спинного мозга.
Таким образом, трансфузия ОГК бесперспективна для лечения больных с поражением
спинного мозга и не может быть рекомендована для внедрения в широкую клиническую
практику.
Моделирование поврежденной ткани спинного мозга
биодеградируемым полимером "СФЕРОГЕЛЬ"
Моделирование поврежденной ткани спинного мозга биодеградируемым полимером
"Сферогель" является одним из методов доставки и мобилизации МСК или ГОК в зону
поражения спинного мозга.
Биодеградируемый полимер "Сферогель" по результатам предварительного анализа
осуществляет роль нейроматрицы, а также питательной среды для клеток в течение до 6
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
33
месяцев.
Показания к применению "Сферогеля":
1.Полный анатомический перерыв спинного мозга;
2.Отсутствие эффекта от традиционной терапии.
Противопоказания: 1.Острые инфекционные заболевания.
2.Тяжелые гематологические заболевания.
3.Острые состояния с декомпенсацией нарушенных витальных функций организма
(агональное состояние, кровотечения, интоксикация, психотические состояния).
4.Полиорганная недостаточность и кахексия.
5.Гнойносептические осложнения (пролежни, сепсис и т.д.).
В клинике было прооперировано 7 пациентов. В данном отчете учитываются результаты лишь шестерых пациентов, так как один больной был прооперирован менее одного месяца назад и оценить динамику процесса не представляется возможным (Табл. 1).
Табл. 1 Результаты трансплантации "Сферогеля" с аутологичными клетками.
Введение "Сферогеля" и
МСК
Введение "Сферогеля" и
ГОК
Всего пациентов
3
3
Положительная динамика
1
2
Без динамики
2
1
Производимые хирургические манипуляции требуют определенной осторожности во
избежание дополнительной травмы спинного мозга. До операции необходимо уточнить
состояние костных структур и топографию поврежденного участка спинного мозга в месте повреждения. Наиболее информативными в этом отношении является комплекс обследования, включающий в себя- рентгенографию позвоночника в 2-х проекциях, МРТ,
КТ-миелографию, спиральную 3D КТ.
Осуществляется линейный кожный разрез с иссечением послеоперационного рубца.
Жировая клетчатка рассекается до остистых отростков. Далее скелетируют остистые отростки. Важно, что технические особенности скелитирования остистых отростков и дужек
позвонков определяются необходимостью оперировать в патологически измененных топографо-анатомических условиях, где образовался мощный костнорубцовый конгломерат,
или же нарушена целостность позвоночного столба. Топографо-анатомическими ориентирами, позволяющим судить о средней линии, глубине позвоночного канала являются
остистые отростки неповрежденных позвонков. Важность топографо-анатомических ориентиров при иссечении рубцовой ткани особенно велика в области пояснично-крестцового
отдела, где глубина раны может быть более 10см.
В ряде случаев для осуществления доступа к месту повреждения необходимо удаление
металлоконструкции. В этих случаях после удаления металлоконструкции необходимо
интраоперационно убедиться в отсутствии нестабильности в поврежденном сегменте позвоночного столба.
После вскрытия эпидурального пространства иссекают рубцово-измененную эпидуральную клетчатку.
Под контролем микроскопа осторожно рассекается рубцово-измененная твердая мозговая оболочка (т.м.о.), к которой могут быть припаяны как корешки, так и спинной мозг.
Выраженные рубцово-измененные ткани вызывают сдавление спинного мозга с формированием ликворного блока. Интраоперационно это проявляется отсутствием пульсации дурального мешка в зоне операции.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
34
Хирургическое вмешательство предполагает обязательное использование микрохирургической техники и эндоскопического контроля дистального и проксимального концов
поврежденного участка.
После разреза т.м.о. обнаруживается поврежденный спинной мозг, который может
быть истончен, рубцово изменен и выглядит как "тяж". При анатомическом перерыве диастаз между центральным и периферическим концом заполнен рыхлой рубцовой тканью, а
концы прерванного спинного мозга окружены более плотными соединительнотканными
разрастаниями. Но даже под микроскопом иногда крайне сложно дифференцировать
остатки рубцово-измененного спинного мозга, в связи с чем все манипуляции должны
осуществляться крайне деликатно.
Далее выполняется менингомиелорадикулолиз, в процессе которого осуществляется
деликатное разделение анатомо-морфологических структур зоны поврежденного спинного мозга и удаление рубцово-спаечных образований.
Техническая сложность зависит от наличия выраженных, хорошо кровоснабжаемых
рубцовых сращений спинного мозга, его корешков с т.м.о., при этом дифференцировать
анатомические структуры крайне сложно. Принципиально важно сохранить мелкие кровеносные сосуды, кровоснабжающие вещество мозга. По возможности избегать кровотечения и затекания крови, что может привести к повторному образованию рубцовоспаечного процесса. В процессе миеломенигорадикулолиза могут вскрываться арахноидальные кисты.
Менингомиелорадикулолиз предполагает обязательное восстановление ликвородинамики.
При наличии интрамедуллярной ликворной кисты, она вскрывается и дренируется. Они
формируются в результате взаимодействия ряда факторов: наличие очага гематомиелии
или ишемии приводит к формированию полости, в которой собирается спинномозговая
жидкость. Наличие рубцовых сращений способствует увеличению размеров кисты при
повышении абдоминального и внутригрудного давления, передающегося и на ликворное
давление. При наличии нарушения ликвородинамики в зоне повреждения ликвор стремится вверх и над суженным участком субарахноидального пространства давление повышается по сравнению с нижележащим. Перепад давления создает условия для смещения
границ кисты вниз, что способствует ее увеличению.
Под контролем микроскопа киста вскрывается микроскальпелем в месте наибольшего
выбухания для ее дренирования.
Параллельно ex tempera проводится подготовка биодеградируемого полимера "Сферогель" для имплантации. В стерильных условиях производится добавления в сертифицированный концентрат "Сферогеля" физиологического раствора (до 50% объема) до операционно подготовленной суспензии ГОК и МСК. Полученный субстрат центрифугируют в
течение 3-5 минут до образования гомогенной массы с равномерным распределением в
ней имплантируемых клеток. Далее также в стерильных условиях, которая передается
оперирующей бригаде для имплантации в зону повреждения спинного мозга. Объем имплантируемого материала определяется с учетом 40-60% заполнения дефекта органического поражения спинного мозга. Это связано с высокой гидрофильностью "Сферогеля" и
дальнейшим послеоперационным увеличением его объема.
Твердая мозговая оболочка тщательно и герметично ушивается. Проводится послойное
ушивание операционной раны с обязательным ее дренированием.
В качестве иллюстраций приводим следующие наблюдения.
Больная Лва, 17 лет. И/б №04/00116. Диагноз: Последствия тяжелой позвоночноспинальной травмы, компрессионного перелома Th8-9 позвонков, вывиха Th8 позвонка.
Нижняя параплегия. Нарушение тазовых функций. Состояние после многократных оперативных вмешательств.
Из анамнеза известно, что травма получена в 1998 году. Через 5 часов после травмы
выполнена ламинэктомия Th8-9 с ревизией позвоночного канала. Через 2 месяца после
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
35
травмы повторная операция - выправление клина Урбана, иссечение посттравматической
кисты и установка нйростимулятора. Курс стимуляции продолжался 1 месяц. В октябре
1998 года? Установлена винтовая стабилизирующая система. Через 8 месяцев система
удалена из-за угрозы инфицирования. После этого у больной сформировался грубый кифосколиоз. Неврологические нарушения оставались без динамики на фоне проводимого
лечения. В 1999 году произведена транплантация фетальных клеток в субарахноидальное
пространство. Состояние больной оставалось стабильно тяжелым, без динамики в неврологическом статусе.
В неврологическом статусе: сознание ясное. Зрачки равные, средней величины, равные.
Фотореакция живая, D=S. Лицо симметричное. ЧМН без патологии. Мышечный тонус в
верхних конечностях физиологический. Отмечается повышение сухожильных рефлексов с
рук с умеренной S=D. Двигательных и чувствительных нарушений в верхних конечностях
нет. Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя параплегия с низким мышечным тонусом. Рефлексы с ног повышены, рефлекторные зоны расширены, клонус левой стопы.
Проводниковая анестезия всех видов чувствительности с дерматома Th12 с обеих сторон.
Двухсторонние патологические знаки. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу.
02.06.04 произведена операция - транспедикулярная фиксация L3-L4, фиксация крючками Th10-11. Реконструкция дефекта спинного мозга с использованием сферогеля под
контролем эндоскопа.
После кожного разреза, скелитированы остистые отростки Th9-L4. Под контролем
ЭОП произведена установка транспедикулярной системы на уровне L3-4. На уровне Th1011 в область междужковых пространств заведены до заклинивания 4 крючка. Конструкция
сформирована из 2-х продольных и 2-х поперечных балок. Выше уровня Th12 произведена гемиламинэктомия, обнажена неизмененная т.м.о, которая вскрыта. Осуществлен менингомиелорадикулолиз до появления свободного тока ликвора. Убедительно интраоперационно при использовании эндоскопа структуры спинного мозга на протяжении Th9-L2
не обнаружены (диастаз до 6см). В образовавшийся дефект имплантирован сферогель(3мл) в композиции с аутологичными стволовыми клетками.
Твердая мозговая оболочка ушита.
Послеоперационный период протекал без осложнений. Рана зажила первичным натяжением.
При МРТ исследовании:
При КТ-миелографии:
При контрольном осмотре через 5 месяцев. У больной отмечалась отчетливая положительная динамика в виде снижения уровня чувствительных расстройств на 20 см вниз,
также появилась способность двигать пальцами правой стопы. Отмечаются элементы дви-
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
36
гательной активности в глубоких мышцах бедер с 2-х сторон до 2 баллов. По шкале ASIA
- A переход в D. По шкале FIM (с 93- 102).
Больная Вна, 20 лет. И/б №02/0004. Диагноз: Последствия тяжелой позвоночноспинальной травмы. Компрессионный перелом тела L1 позвонка со сдавлением спинного
мозга от 0.6.2000г. Нижняя параплегия. Нарушение тазовых функций. Состояние после
многократных хирургических операций.
Из анамнеза известно, что 6 апреля 2000 года упала с высоты 5 этажа. При поступлении
в Ставропольскую краевую больницу был диагностирован компрессионный перелом L1
позвонка с компрессией позвоночного канала и множественные переломы ног. Сразу проявился нижний вялый парапарез до плегии с уровня L1, нарушение функции тазовых органов и нарушение чувствительности: в правой ноге с уровня L3, слева - только на стопе.
Там же была оперирована: выполнили заднюю декомпрессия спинного мозга на уровне
перелома L1 позвонка. Затем в ЦКГ ВМФ РФ выполнена стабилизирующая операция:
устранение клина Урбана и фиксация ниже и вышележащих сегментов с помощью системы Horizon фирмы Sofamor Danek. Со слов больной, после этой операции наступило
ухудшение в виде исчезновения болевой чувствительности в ногах, исчезло суставномышечное чувство в правой ноге. Затем с целью электростимуляции спинного мозга был
имплантирован электростимулятор, работа которого вызывала сильный болевой синдром.
17.09.02. в клинике "Нейровита" электростимулятор был удалён. При неоднократных
люмбальных пункциях ликвор получить не удалось из-за полного блока субарахноидального пространства. 16.10.02. была выполнена операция - ревизия стабилизирующей конструкции SOFAMOR DANEC и спинного мозга, удалены остатки электростимулятора и
правого нижнего ламинарного крючка, выполнен менингомиелорадикулолиз. При интраоперационной стимуляции корешков конского хвоста установлено, что моторное проведение сохранено. На фоне проведённых операций и консервативной терапии у больной
исчезли болевые ощущения, связанные с электростимулятором, и дискомфорт от прикосновения спины к постели или спинке кресла. Изменился уровень чувствительности, но,
вместе с тем, появилась непостоянная боль в правой ноге и ягодицах, которые к настоящему поступлению прошли.
В неврологическом статусе: сознание ясное. ЧМН без патологии. В верхних конечностях без двигательных, чувствительных и рефлекторных нарушений. Движения в ногах
отсутствуют. Сухожильные рефлексы с нижних конечностей не вызываются. Патологических стопных знаков нет.
Анестезия с уровня Th12 в правой половине тела, в левой - с уровня L1. При прикосновении к ногам могут возникать перекрёстные парестезии на симметричной области в виде
жжения, мурашек. Суставно-мышечное чувство отсутствует.
Больной, после проведения предоперационной подготовки, 28.07.2004 года произведена операция - удаление транспедикулярной фиксации на нижнегрудном- поясничном
уровне с одномоментной операцией- реконструкция спинного мозга с помощью биодеградирующего геля "Сферогель" с использованием аутологичных стволовых клеток в рамках
отраслевой программы "клеточные технологии-медицине".
При контрольном осмотре через 8 месяцев положительной динамики выявлено не было.
Заключение: недостаточное количество пациентов не позволяет достоверно оценить
эффективность нейрохирургического метода применения клеточной нейротрансплантации.
В 50% случаев у больных с отсутствием эффекта от традиционной методики лечения
спинальной травмы было отмечено объективное улучшение состояния после введения
"Сферогеля".
Другим аспектом анализа представленных случаев является необходимость применения нейротрансплантации в комплексе с классическими нейроортопедическими принципами.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
37
Таким образом, в дальнейшем является перспективным использование данного метода
с целью получения достоверного и доказательного материала.
При КТ-исследовании:
При МРТ-миелографии:
На спондилограммах:
Изменения электронейромиографических показателей
при клеточной реконструкции МСК нейрональной ткани
По данным литературы у пациентов, с поврежденным спинным мозгом, через несколько месяцев после травмы в периферических нервах начинает развиваться дегенеративный
процесс (вторичная дегенерация нейронов), который в конечном итоге заканчивается их
гибелью. Этот процесс можно объективизировать с помощью электронейромиографического исследования. На начальной стадии отмечается снижение амплитуды Мответа, снижение скорости проведения и удлинения латентного периода М-ответа. На
поздней стадии зарегистрировать М-ответ не удается. Считается, что развитие вторичной
дегенерации связано с тем, что в результате травмы спинного мозга происходит разобщение надсегментарных и сегментарных структур, следствием чего является нарушении
трофики периферических нервов. Это приводит в дальнейшем к их гибели.
Анализируя данные ЭНМГ пациентов до и после введения МСК, нами не было отмечено изменений нейрофизиологических показателей, что вероятно связано с начинающим
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
38
восстановлением проводящих путей спинного мозга и как следствие уменьшению трофических нарушений в периферических нейронах.
Рис. 1.Зависимость амплитуды М-ответа (мВ) от возраста.
Анализ проводился методом ANOVA.
Рис. 2.Зависимость латентного периода М-ответа (мс) от возраста.
Анализ проводился методом ANOVA.
В тоже время, несмотря на то, что клиническая картина пациентов со спинальной травмой не различается в зависимости от возраста, полученные электронейромиографические
показатели свидетельствуют о том, что в разных возрастных группах имеются отличия в
показателях амплитуды и латентного периода М-ответа (рисунок 1,2).
Амплитуда М-ответа у пациентов моложе 29 лет (3,8 мВ) выше, чем у пациентов старше 29 лет (2,4 мВ). Латентный период длиннее у молодых (5,35 мс), чем у пациентов
старше 29 лет (4,6 мс).
Возможно это связано с тем, что у пациентов до 29 лет первично в процессе дегенерации лежит демиелинизирующий процесс, что вполне может быть связано с развитием
аутоиммунных процессов в периферической нервной системы. Тогда как у пациентов
старше 29 лет первично начинается дегенерация собственно аксона и только в дальнейшем вторично развивается демиелинизация. Однако для этого требуется проведение дополнительных исследований.
Используя дисперсионный метод анализа (рисунок 3), мы получили данные, что возможно до 1 года - амплитуда у пациентов снижается, от 1 года до 5- повышается, после 5
лет вновь отмечается снижение амплитуды (2,3; 3,8 и 1,7 мВ, р<О,О5 соответственно).
По нашему мнению это связано с тем, что до 1 года, на фоне остро развившейся деиннервации периферических нервов, дегенеративные процессы преобладают над репаративными. После 1 года включаются, пока нам неизвестные, восстановительные процессы,
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
39
следствием чего является повышение амплитуды М-ответа. При длительности процесса
свыше 5 лет наступает истощение данных механизмов и амплитуда вновь снижается. Использование дисперсионного метода анализа позволило предположить, что возможно
группа пациентов с давностью травмы от 1 года до 5 является наиболее прогностически
благоприятной для лечения МСК. Однако это можно подтвердить только на большей
группе пациентов.
Рис. 3.Дисперсионный анализ данных по амплитуде М-ответа (мВ) ЭНМГ
нижних конечностей и давности травмы.
Таким образом, несмотря на небольшое количество больных, нам удалось сделать
предположение, что отсутствует отрицательная динамика электронейромиографических
показателей после цитотрансфузии МСК. Возможно, это связано с тем, что стволовые
клетки способствуют активации репаративных процессов не только в центральной нервной системе, но и периферической, тем самым, уменьшая, а может быть, и прекращая развитие дегенеративных изменений.
Оценка восстановления мочевыводящих путей с помощью уродинамических проб
Мочеиспускание является сложным рефлекторным актом, в регуляции которого принимают участие чувствительная, соматическая и вегетативные отделы нервной системы, а
также корковые структуры и подкорковые ядра центральной нервной системы.
При полном функциональном перерыве спинного мозга контроль со стороны головного
мозга на активность мочевыделительной системы отсутствует, что приводит к нарушению
акта мочеиспускания.
100% исследуемых нами больных имели нарушения функций мочевыделительной системы. Из них 61% имели истинное недержание мочи, 39 - императивные позывы на мочеиспускание.
Рис.1 Динамика изменений комплайнс 1 и первого ощущения наполнения мочевого пузыря.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
40
По данным уродинамических проб у больных с нарушениями функций тазовых органов улучшилось чувствительность детрузора по параметру первого ощущения наполнения
мочевого пузыря и адаптационные способности детрузора по данным комплайнс 1.
Полный или частичный функциональный перерыв спинного мозга характеризуется
снижением афферентации и эфферентной составляющий рефлекторной дуги, замыкающейся на уровне головного. Достоверное улучшение чувствительности детрузора свидетельствует о восстановлении глубокой чувствительности от рецепторов мочевого пузыря.
Увеличение адаптационных возможностей детрузора свидетельствует о формировании
контроля над парасимпатическим отделом вегетативной нервной системы со стороны
корковых и подкорковых структур головного мозга, что свидетельствует о восстановлении эфферентной части рефлекторной дуги, участвующий в контроле акта мочеиспускания. Таким образом, полученные достоверные изменения уродинамических показателей с
одной стороны являются подтверждением тех субъективных изменений, которые отмечают больные после применения МСК. С другой стороны, является инструментальным методом, позволяющим объективно оценить результаты репаративных изменений со стороны проводящих путей спинного мозга на фоне применения МСК.
В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:
Больной Л., 17 лет поступил в клинику 29.04.04. с диагнозом: последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы, перелома С6 позвонка. Нижняя вялая параплегия, недержание мочи. После двукратного введения МСК по данным уродинамических проб:
исследуемые параметры
уродинамическое исследование№ 1 (19.05.04)
уродинамическое исследование№ 2 (31.03.05)
первое ощущение наполнения мочевого пузыря
цистометрический объем 56 мл; P det. - 9 см.водн.ст
цистометрический объем 16 мл; P det. - 1 см.водн.ст
нормальный позыв к мочеиспусканию
цистометрический объем 85 мл; P det. - 11 см.водн.ст
цистометрический объем 199 мл; P det. - 43
см.водн.ст
сильный позыв к мочеиспусканию
цистометрический объем 93 мл; P det. - 68 см.водн.ст
-
комплайнс 1 цистометрический объем - 80 мл
8,0 (мл/см.водн.ст)
20,0 (мл/см.водн.ст)
комплайнс 2 (максимальная
цистометрическая емкость)
1,24 (мл/см.водн.ст)
2,67 (мл/см.водн.ст)
максимальная цистометрическая емкость
93 мл
199 мл
ЭМГ
наличие эпизодов непроизвольного сокращения детрузора
появление эпизодов ЭМГ
появление эпизодов ЭМГ
активности при мочеиспус- активности при мочеиспускании
кании
непроизвольное сокращение детрузора до 77 см
водн.ст.
непроизвольное сокращение детрузора до 67 см
водн.ст.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
41
Цитометрия
Как видно из таблицы, у пациента отмечается:
- улучшение чувствительности детрузора
- увеличение функциональной емкости мочевого пузыря
- снижение детрузорного давления в фазу наполнения мочевого пузыря
- улучшение адаптационной способности детрузора (увеличение комплайнс)
- снижение амплитуды непроизвольных сокращений детрузора
Возможные механизмы действия МСК
Эффективность мобилизации стволовых (CD34+) периферических клеток у больных с
травматической болезнью спинного мозга.
Хорошо известно, что в условиях спокойного, неповрежденного гемопоэза в периферической крови человека циркулируют стволовые гемопоэтические клетки, однако, их
концентрация столь ничтожна (менее 0,01%), что их детальное изучение или, тем более,
использование для целей трансплантации практически невозможны. Выход стволовых гемопоэтических клеток из центральных органов гемопоэза (костный мозг) наблюдается после травмирования гемопоэза (чаще всего, как результат химиотерапии), а также под действием колониестимулирующих факторов (КСФ). В клинике наибольшее распространение
получили Г-КСФ (гранулоцитарный) и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный). Под
действием этих факторов концентрация стволовых гемопоэтических клеток крови возрастает в 100-1000 раз, что позволяет собрать эти клетки и использовать для трансплантации.
В ГУ РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН накоплен большой опыт трансплантации аутологичных и аллогеннных ПСК (сотни онкологических больных). Сбор стволовых клеток в
этих случаях осуществлялся для последующего восстановления гемопоэза после высокодозной химиотерапии. Как следствие предшествовавшей химиотерапии, костный мозг пациентов является к моменту проведения мобилизации в определенном смысле "истощенным", и эффективные мобилизации стволовых клеток (более 20 клеток в мкл крови) достигались не во всех случаях. Как правило, набрать необходимое для трансплантации количество клеток (2 х 106 /кг) удавалось за 2-3 сеанса лейкофереза.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
42
Следует отметить, что мобилизация стволовых клеток в периферическое кровеносное
русло у больных с травматической болезнью спинного мозга была эффективной в большинстве случаев - как абсолютное, так и процентное содержание CD34+ клеток в лейкоконцентратах, получаемых за 1 сеанс лейкафереза, соответствовало таковому, необходимому для трансплантации (> 2 х 106 /кг).
1. Экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 на мобилизованных
стволовых клетках крови больных с травматической болезнью спинного
мозга.
CD45 является интегральным показателем гемопоэтической природы клеток. Антиген
экспрессирован на всех этапах дифференцировки клеток крови от незрелых предшественников до лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и т.д. Единственным исключением являются эритроциты. По мере созревания клеток крови экспрессия CD45 на них возрастает.
Стволовые гемопоэтические клетки характеризуются различными уровнями экспрессии
CD45 - от незначительной до выраженной. Наличие CD45 на стволовых гемопоэтических
клетках крови и костного мозга положено в основу одного из наиболее известных протоколов определения этих клеток - ISHAGE.
Рисунок 2. Пример высокой пропорции CD45-негативных клеток (94%) в пределах CD34+ фракции мобилизованных стволовых клеток крови. А - характеристики светорассеяния клеток цитаферезного продукта. Б - стволовые клетки (CD34+) составляют 0,4% от всей клеточной популяции. В - пороговый уровень экспрессии
CD45 определен по нижней границе позитивности гранулоцитов. Г - в пределах гейта R1 (стволовые, CD34+
клетки) лишь 6% клеток экспрессируют CD45, остальные клетки CD45-негативны. В пределах CD45- фракции
видны клетки, полностью отрицательные по CD45, и клетки, которые приближаются к CD45слабопозитивности. На точечных графиках А и В представлено 2000 событий, на графике Б - 50 000, на графике Г - 200 (0,4% от 50 000, гейт R1).
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
43
Нами изучена экспрессия CD45 на мобилизованных стволовых клетках 15 больных с
травмами спинного мозга. У большинства больных в пуле CD34+ клеток выявлялась отчетливая популяция CD45-негативных клеток, пропорция которой варьировала от 1% до
98% (в большинстве случаев - более 20%). Оценку процентного содержания CD45негативных стволовых (СD34+) мобилизованных клеток крови осуществляли следующим
образом. При анализе цитометрических данных в режиме Dot-plot выделяли гейт стволовых клеток CD34+ SSC-low, далее переходили в формат CD45-SSC для определения порогового уровня экспрессии CD45 на гранулоцитах (ниже этого уровня клетки считали отрицательными по CD45), далее в гейте CD34-позитивных клеток оценивали процент клеток отрицательных по CD45. Пример оценки CD45 на мобилизованных CD34+ клетках
представлен на рисунке 2.
В целом по анализируемой группе процент CD45-негативных клеток примерно у 60%
больных в популяции мобилизованных стволовых клеток (CD34+) присутствовало более
20% CD45-негативных клеток, нередкую ситуацию представляли случаи, когда этих клеток было более 80-90% среди CD34-позитивных, как это показано на рисунке 2.
Возникает вопрос, можно ли расценивать CD45-негативные стволовые (CD34+) клетки,
как потенциально коммитированные по негемопоэтической линии. Ответ на этот вопрос
неоднозначен. Разумеется, отсутствие или крайне слабая экспрессия CD45 еще не является 100%-ным доказательством негемопоэтической природы клеток. на самых ранних
предшественниках гемопооэза экспрессия CD45 чрезвычайно слабая, и эти клетки часто
становятся мишенями злокачественной трансформации при острых лейкозах. Вместе с
тем, полностью исключить негемопоэтическую направленность дифференцировки этих
клеток также не представляется возможным. Хорошо известно, что в пуле мобилизованных CD34+ присутствуют негемопоэтические предшественники - эндотелиальные клетки,
мезенхимные клетки. В пределах фракции CD38- HLA-DR-, которая составляет небольшую пропорцию CD34+ клеток, присутствуют клетки, способные дифференцироваться по
мезенхимной линии. Для более детального изучения этого вопроса нами проведен анализ
экспрессии CD38 и HLA-DR на мобилизованных CD34+ клетках крови больных с тяжелой
травмой СМ.
2. Субпопуляции мобилизованных стволовых CD34+ клеток: экспрессия
CD38 и HLA-DR
Экспрессия молекул HLA-DR и CD38 изучена на мобилизованных стволовых клетках
(CD34+) 12 больных травматической болезнью СМ.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
44
Рисунок 3. Коэкспрессия молекул HLA-DR и CD38 на мобилизованных стволовых (CD34+) клетках крови. А гейт стволовых CD34+ клеток, стволовые клетки составляют 0,44% от общего числа клеток. Б -контрольный
образец окрашивания FL1 vs FL2 в гейте CD34+ клеток. В - 95% CD34+ клеток коэкспрессируют на мембране
молекулы CD38 и HLA-DR, отмечается лишь незначительная пропорция клеток HLA-DR- CD38+ (2,3%). Г контурный график, практически один кластер клеток CD38+ HLA-DR+, единичные события CD38+ HLA-DR-. В
данном случае процент CD45-негативных стволовых клеток (CD34+) составил 65%.
Пропорция этих клеток в большинстве случаев была незначительной (менее 9% у 10
больных) и лишь у 2 больных составила 16% и 23%. Как правило, отмечалась доминирующая фракция CD34+ клеток с гомогенной коэкспрессией CD38 и HLA-DR (рисунок 3).
В 2 случаях отмечалась выраженная пропорция CD38- HLA-DR- клеток в пуле CD34+
мобилизованных стволовых клеток крови. Пример на рисунке 4.
Рисунок 4. Выраженная пропорция CD38-HLA-DR- клеток в популяции мобилизованных стволовых (CD34+)
клеток крови больного с тяжелой черепно-мозговой травмой. А - гейт стволовых клеток, Б - контрольное
окрашивание, В - 23% CD34+ клеток являются негативными по экспрессии HLA-DR и CD38 (HLA-DR-CD38-). Г
- контурный график, отчетливо видны 2 популяции CD34+ клеток - HLA-DR-CD38- и HLA-DR+CD38+. В данном
случае 98% стволовых (CD34+) клеток не имели на мембране CD45.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
45
В обоих случаях с выраженной пропорцией HLA-DR-CD38- стволовых (CD34+) клеток
большинство CD34+ клеток не имело на мембране CD45. В приведенном примере CD45негативная фракция составила 98%. Это отчетливо указывает на существование CD45CD38-HLA-DR- фракции среди мобилизованных стволовых CD34+ клеток крови у больных с травмой СМ.
Во втором случае процент HLA-DR-CD38- клеток во фракции стволовых (CD34+) клеток составил 16%, при этом 56% CD34+ клеток были CD45-негативными. У этого пациента однозначно высказаться о наличии фракции CD34+HLA-DR-CD38-CD45- не представляется возможным.
Мы провели дополнительные исследования по оценке коэкспрессии молекул CD38 и
CD45, а также HLA-DR и CD45 на стволовых (CD34+) клетках.
Рисунок 5. Экспрессия HLA-DR и CD38 на CD45-негативных стволовых CD34+ клетках.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
46
Рисунок 6. Пример присутствия фракции (51%) CD45- CD38- в пределах CD34+ клеток.
3. Экспрессия рецепторного комплекса gp130/80 на мобилизованных периферических стволовых клетках крови.
Известно, что при культивировании стволовых (CD34+) клеток пуповинной крови в
полужидких средах в присутствии СФ и комплекса ИЛ-6/sИЛ-6Р резко увеличивается количество колониеобразующих единиц, и изменяется их качественный состав: появляются
многочисленные колонии крупного размера, более 60% которых относится к смешанным
(ГЭММ) и бластным колониям, возрастает число мегакариоцитарных колоний и БОЕ-Э.
МКА к gp130 и ИЛ-6Р эффективно блокируют колониеобразование, индуцированное комплексом ИЛ-6/sИЛ-6Р, оказывая наибольшее влияние на смешанные колонии [15].
При выращивании стволовых клеток/клеток-предшественников (CD34+) человека в
бессывороточных суспензионных культурах в присутствии ИЛ-6 и СФ добавление sИЛ-6Р
дозозависимо увеличивало генерацию мегакариоцитов (IIb/IIIa+ клеток) [16]. Мегакариоцитопоэз зависел от передачи сигнала через gp130 и не зависел от тромбопоэтина, т.к.
полностью блокировался анти-gp130 МКА.
Японскими учеными установлено, что стимуляция gp130 с помощью комплекса ИЛ6/sИЛ-6Р способна поддерживать пролиферацию, дифференцировку и конечное созревание эритроидных клеток из очищенных CD34+ клеток человека в присутствии СФ. Это
действие отменяется антителами к gp130 [17].
CNTF (цилиарный нейротрофный фактор) также передает сигнал через gp130. Действие комплекса CNTF+растворимый рецептор во много сходно с действием комплекса
ИЛ-6/ИЛ-6Р. Данный цитокин (ЦНТФ) поддерживает выживание отростчатых нейронов и
двигательных нейронов, индуцирует дифференцировку олигодендроцитов в астроциты 2го типа. ЦНТФ и его рецептор экспрессированы, главным образом, в нервной системе. Мы
изучили показатели экспрессии и активации gp130 на мобилизованных стволовых клетках
10 больных с тяжелой травмой СМ. В качестве группы сравнения использованы данные,
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
47
полученные на мобилизованных стволовых гемопоэтических клетках онкологических
больных.
Экспрессия рецептора gp130 (от слабой до умеренно положительной) имела место во
всех изученных случаях. В то же время экспрессия-цепей (gp80) рецептора ИЛ-6 варьировала в широких пределах (от 1 до 60%), рисунок 3.
Рис.3 Экспрессия эпитопов рецептора gp130/80 на мобилизованных стволовых клетках человека. А. Гейт
(R1) стволовых клеток (CD34-FITC+/SSC-low), в котором проводилось изучение экспрессии рецептора. Б - Г.
Окрашивание стволовых клеток меченными биотином МКА, затем - стрептавидином-РЕ. Б. Контрольное
окрашивание МКА к Т-клеточному рецептору / (1,6% неспецифического связывания). В. Окрашивание МКА
М91 к -цепям рецептора ИЛ-6 (50,8% положительных клеток). Г. Окрашивание МКА С2 к рецептору gp130 (мономорфная положительная реакция). По оси ординат - интенсивность бокового светорассеяния (SSC). По оси
абсцисс - на рис. 3А интенсивность FL1, на рис. 3Б - 3Г интенсивность FL2.
Изучение 3 эпитопов рецептора gp130 (A1, C2, D1) указывало на то, что в отличие от
перевиваемых клеточных линий интенсивность реакции одних и тех же клеток с различными МКА к gp130 могла варьировать. Так, нами отмечено, что в 3 из 15 изученных случаев плотность эпитопа А1 была значительно ниже, чем плотность эпитопа С2, что могло
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
48
указывать на эндогенную активацию и димеризацию рецептора. В одном из этих трех образцов рецептор gp80 присутствовал на мембране стволовых клеток (60%), в двух других отсутствовал (менее 12%). Следовательно, возможность активации gp130 без участия
мембранной формы -цепей рецептора ИЛ-6 нельзя исключить. Пример активации gp130
представлен на рисунке:
Рисунок. Активированное состояние рецептора gp130: эпитоп С7 присутствует на всех клетках, эпитоп А1 - на
части клеток.
Оценка активации рецептора gp130 при добавлении к мобилизованным стволовым
клеткам ИЛ-6 проведена в 12 образцах цитоконцентрата (Рисунок). Сложность подобного
исследования обусловлена, с одной стороны, тем, что уровни CD34+ клеток в анализируемых образцах являются низкими (1-5%), а с другой - выраженной гетерогенностью уровней экспрессии -цепей рецептора ИЛ-6 на стволовых клетках (1 - 60%). Даже теоретически ожидать димеризацию gp130 под влиянием ИЛ-6 можно лишь на клетках, экспрессирующих рецептор для ИЛ-6. В случаях с низким содержанием gp80-позитивных стволовых клеток влияние ИЛ-6 на уровни экспрессии эпитопа А1 (снижение которых свидетельствует о димеризации gp130) может быть незначительным. С нашей точки зрения
проведение подобных экспериментов представляется наиболее корректным в популяции
очищенных CD34+CD126+(gp80) клеток.
Изучили изменение уровней экспрессии молекулы gp130 (процент антигенположительных клеток в реакциях с МКА А1, D1, C2) на стволовых клетках под действием ИЛ-6. Достоверных колебаний среднего числа gp130-позитивных стволовых клеток, выявляемых с
помощью МКА D1 и С2 не установлено (р > 0,05). Вместе с тем, средний процент А1позитивных стволовых клеток после инкубации с ИЛ-6 достоверно снижался (t = 2,7; p =
0,02; n = 12). Этот результат не исключает димеризации gp130 на части стволовых гемопоэтических клеток под действием ИЛ-6. В настоящее время углубленный анализ этого
вопроса нами проводится с учетом субпопуляционного состава стволовых клеток и экспрессии на них молекулы gp80.
Анализ качественного состава мобилизованных стволовых клеток позволил установить
высокую пропорцию клеток, негативных по экспрессии СD45, а также наличие выраженной фракции CD34+ HLA-DR- CD38-. Подобные иммунофенотипические характеристики
характерны для наиболее ранних гемопоэтических клеток и мобилизованных клеток негемопоэтической природы.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
49
Рис. 3. Изменение уровней экспрессии эпитопов молекулы gp130 на мембране клеток линии под действием ИЛ-6. В обычных условиях культивирования все эпитопы молекулы gp130 (А1 в сайте димерзации, В1 в
сайте присоединения -цепей рецептора ИЛ-6 и С7 в сайте молекулы gp130, не участвующем в функциональных взаимодействиях в ходе ИЛ-6-сигналинга) в равной мере экспрессированы на мембране клеток (сплошная линия). В качестве контроля использованы МКА к антигену CD7, отсутствующему на мембране клеток
(заштрихованный пик). После добавления к клеткам ИЛ-6 (8 нг/мл; 30 мин, 4 С) исчезает реакция на А1 и В1
(пунктирная линия, практически не отличима от контроля) в то время как экспрессия эпитопа С7 остается
неизменной (сплошная линия). Реакция непрямой иммунофлюоресценции. По оси абсцисс - интенсивность
флуоресцентного сигнала. По оси ординат - количество клеток.
Полученные данные убедительно доказывают экспрессию gp130 на мобилизованных
стволовых клетках крови больных с травматической болезнью спинного мозга. Обнаружение активации рецептора является основанием для продолжения экспериментов по
уточнению взаимодействий рецепторлиганд с целью совершенствования методов получения нейронально-коммитированных мобилизованных стволовых клеток.
Заключение
В настоящее время патофизиологически обоснованные методы лечения травматической болезни спинного мозга не разработаны. Существующие методы направлены на
устранение анатомических дефектов спинного мозга в ранний период травмы путем оперативного вмешательства и различного рода реабилитационных программ, которые у некоторых категорий больных позволяет снизить уровень инвалидизации. В то же время ни
один из этих методов лечения не приводит к устранению главной причины заболевания нарушению целостности спинного мозга. Возможно, применение клеточных технологий
может явиться кардинальным решением данной проблемы. Экспериментально доказанная
способность стволовых клеток к трансформации в нейрональную ткань позволяет предположить возможность частичного восстановления функций поврежденного спинного мозга.
В связи с этим применение клеточных технологий у этих больных является перспективным направлением для лечения травматической болезни спинного мозга.
Проведенное исследование в рамках межотраслевой программы РГМУ "Новые клеточные технологии-медицине" предварительно показала высокую эффективность терапии
аутологичными клетками у пациентов с последствиями повреждения спинного мозга. Из
78 пациентов, включенных в данную программу, проанализировано 30 больных, которые
были распределены на 5 групп в зависимости от вида применяемых клеток и способа их
введения:
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
50
1. С введение мобилизованных стволовых клеток (МСК)
2. С введением глиообонятельных нейрональных клеток (ГОК)
3. С введением "Сферогеля"
4. С введении "Сферогеля" и МСК
5. С введением "Сферогеля" и ГОК
Остальные пациенты в настоящее время попали под критерии исключения из исследования.
Трансфузии аутологичных МСК привели к уменьшению неврологического дефицита в
61,1% случаев. В основном клинические изменения были получены в двигательной сфере
и мочевыделительной системе.
После первичного курса трансфузии МСК отмечалось нарастание мышечной силы в
паретичных конечностях, что проявлялось появлением активности от минимальных движений в некоторых отделах конечностей до возможности самостоятельного передвижения
с помощью вспомогательных средств. Полученные данные подтверждаются результатами
ЭНМГ исследованиями. Было установлено отсутствие динамики ЭНМГ показателей после
трансфузии МСК, что наряду с клинической картиной может указывать на прекращение
дегенеративных процессов периферических нервов ниже уровня травмы. В свою очередь
это может указывать на восстановление проводящих систем СМ и как следствие активации репаративных процессов.
Подобная клиническая картина прослеживается для функции органов малого таза. В
течение 2-3 месяцев после первичного курса терапии МСК отмечалась положительная динамика в виде появления императивных позывов на мочеиспускание у больных с истинным недержанием мочи. Эти клинические наблюдения доказываются данными уродинамических проб. Улучшение чувствительности и адаптационных возможностей детрузора
не только свидетельствуют о восстановлении функции мочевого пузыря, но и косвенно
отражают восстановление проводящих систем спинного мозга.
Важно отметить, что достоверных данных восстановления чувствительных нарушений
получено не было. Возможно это связано:
1. С отсроченными изменениями в чувствительной сфере.
2. С плохим восстановлением чувствительности после введения МСК.
3. С отсутствием общепринятых шкал адекватной оценки и объективных методов
оценки изменений, в т.ч. сенсорной сфере, что приводит к неадекватной оценке полученных результатов.
В то же время у ряда пациентов отмечалось мозаичное восстановление чувствительности в зонах анестезии.
Важно отметить, что на первый взгляд у больных с полным функциональным перерывом спинного мозга (СМ) процесс уменьшения неврологического дефицита более выражено. Возможно, это связано с более благоприятными анатомо-функциональными условиями для приложения действия МСК у больных с полным функциональным перерывом
СМ. В то же время более детальный анализ полученных результатов не может подтвердить данную гипотезу т.к. разработанные в настоящее время шкалы не позволяют объективно оценить минимальные изменения неврологического статуса у данной категории
больных.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности терапии
МСК у больных с травматической болезнью СМ. Минимальная инвазивность, отсутствие
реакции отторжения трансплантата, а также религиозных и этических проблем позволяет
рекомендовать данную методику к широкому применению.
В то же время отсутствие положительных клинических эффектов у ряда больных привело к поиску новых подходов к лечению травматической болезни СМ. Альтернативным
вариантом лечения больных с данной патологией могла бы явиться трансфузия ГОК. Однако ни у одного из пяти исследованных больных положительных результатов получено
не было, что вероятно связано с невозможностью дислокации ГОК к месту повреждения.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
51
Кроме того, у одного пациента возникло осложнения в виде отека головного мозга. В связи с клинической неэффективностью и возможной опасностью ГОК дальнейшее исследование в этом направлении были закрыты.
Другим перспективным направлением является моделирование поврежденной ткани
спинного мозга биодеградируемым полимером "Сферогель" с трансплантацией аутологичных клеток. Несмотря на небольшое количество проведенных оперативных вмешательств, у ряда пациентов (50%) отмечалась положительная динамика в виде уменьшения
двигательного и чувствительного дефицита и восстановления функции тазовых органов.
Эти клинические изменения подтверждается данными ЭНМГ и уродинамических проб.
Однако на данный момент для решения вопроса о предпочтении между выбором разных
типов аутологичных клеток остается неясным ввиду малого количества наблюдений.
Таким образом, трансплантация аутологичных клеток при моделировании поврежденной ткани спинного мозга биодеградируемым полимером "Сферогель" нуждается в дальнейшем изучении. Первично полученные результаты позволяют надеяться на высокую
эффективность данной технологии у больных с травматической болезнью СМ.
В заключении необходимо отметить, что существующие методические и методологические подходы для оценки неврологических изменений у данной категории пациентов
являются не адекватными. В связи с этим, для дальнейших проведений исследований по
оценке эффективности клеточной терапии необходимо включение в программу дополнительных методов исследования, позволяющих объективизировать изменения неврологического статуса. В нашей клинике для этих целей начато использование соматосенсорных
вызванных потенциалов, транскраниальной магнитной стимуляции, кожногальванической
реакции и компрессионно-спектрального анализа ЭЭГ. Однако накопленные на сегодняшний день данные не позволяют провести анализ полученных результатов.
Изучение механизмов действия МСК показало негемопоэтическую направленность
дифференцировки некоторых из этих клеток, что косвенно указывает на потенциально
возможное образование нейрональной ткани при трансплантации в область повреждения
СМ. Полученые убедительные доказательства экспрессии gp130 на мобилизованных стволовых клетках крови, что в последствие открывает новый подход в клеточной терапии содания нейронально-коммитированных МСК.
Предварительные выводы
1. Выявлена клиническая эффективность терапии аутологичными МСК у больных с
травматической болезнью спинного мозга.
2. На фоне введения МСК отмечается уменьшение двигательного и чувствительного
дефекта, улучшение функций тазовых органов.
3. Выявлена клиническая неэффективность трансфузии ГОК.
4. Трансплантация аутологичных клеток при моделировании поврежденной ткани
спинного мозга биодеградируемым полимером "Сферогель" возможно является высоко
эффективным методом лечения больных с травматической болезнью спинного мозга.
5. Данные ЭНМГ исследования и уродинамических проб подтверждают клиническую
эффективность терапии стволовых клеток.
6. Анализ качественного состава МСК позволил установить высокую пропорцию клеток, негативных по экспрессии СD45, а также наличие выраженной фракции CD34+ HLADR- CD38-. Подобные иммунофенотипические характеристики характерны для наиболее
ранних гемопоэтических клеток и мобилизованных клеток негемопоэтической природы.
7. Полученные данные убедительно доказывают экспрессию gp130 на мобилизованных
стволовых клетках крови больных с травматической болезнью спинного мозга. Обнаружение активации рецептора является основанием для продолжения экспериментов по
уточнению взаимодействий рецепторлиганд с целью совершенствования методов получения нейронально-коммитированных мобилизованных стволовых клеток.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
52
Список литературы
1.Аганесов А. Г. // Заболевания и повреждения позвоночника и спинного мозга. - М.,
1985. - С. 54-56.
2.Аганесов, К.Т. Месхи, А.П. Николаев, Е.П. Костив. // Хирургическое лечение осложненной травмы позвоночника в остром периоде/ Вестник травматологии и ортопедии им.
Н.Н. Приорова, №3, 2003.
3.Алиев М. А., Крючков В. В. // Материалы 3-го съезда нейрохирургов РФ. - СПб. 2002.
- С. 183.
4.Бехтерева Н.П., Гилерович Е.Г., Гурчин Ф.А. и др. О трансплантации эмбриональных
нервных тканей в лечении паркинсонизма. Журн. невропатол. и психиатр., 1990, т. 90., 11,
с. 10-13.
5.Брехов А. И. Морфологическое и биохимическое состояние поврежденного сегмента
спинного мозга в условиях его стабилизации: Автореф.дис. ... канд. мед. наук. - Симферополь, 1986.
6.Брюховецкий А.С. Трансплантация нервных клеток и тканевая инженерия мозга при
нервных болезнях - М.: ЗАО "Клиника восстановительной интервенционной неврологии и
терапии "НейроВита", 2003. - С 168 - 170.
7.Бублик Л. А., Карих Р. И., Мироненко И. В. // Материалы 3-го съезда нейрохирургов
РФ. - СПб, 2002. - С. 189.
8.Бурдей Г. Д. Спинной мозг. - Саратов, 1984.
9.Валеева К. Г., Сафин Ш. М. // Тезисы доклада 1-го съезда нейрохирургов РФ. - Екатеринбург, 1995. - С. 131.
10.Викторов И. В. // Возбудимые клетки в культуре ткани. - Пущино, 1984. - С. 4-18.
11.Виноградова О.С. Проблема трансплантации в центральную нервную систему млекопитающих. Журн. высш. нервн. деят., 1995, т. 35, ? 1, с. 132-138.
12.Георгиева С. А., Бабиченко И. Е., Пучиньян Д. М. Гомеостаз, травматическая болезнь головного и спинного мозга. - Саратов, 1993.
13.Головных Л. Л. // Вопросы организации и лечения травмы нервной системы в
РСФСР. - Л., 1977. - С. 143-144.
14.Деркач В. И., Каминский А. А., Резниченко В. И. // Тезисы доклада 1-го съезда
нейрохирургов РФ. - Екатеринбург, 1995. - С. 140-141.
15.Жестовскнй В. К. // Заболевания и повреждения позвоночника и спинного мозга. М., 1985. - С. 43-46.
16.Зяблов В. И. Проблемные вопросы регенерации нервной системы. - Симферополь,
1986.
17.Карлсон Б. М. Регенерация. - М., 1986. 18.Катунян П.И., Клюшник Т.П., Ермакова
С.А., МеренковД.И., Пейкер А.Н., Козлов В.Л, Николаев Н.Н., Мусалатов Х.Р. Исследование содержания антимиелиновых антател при оперативном лечении острого травматического повреждения спинного мозга с использованием перфторана. Перфторорганические соединения в биологии и медицине. Пущино 2001г, с. 164-166.
19.Катунян П.И., Круглов Н.А., Дзукаев Д.Н., Шумилина В.И. Нейротрансплантация
при оперативном лечении травматического повреждения спинного мозга. Сборник: "Актуальные вопросы вертебрологии, реконструктивной хирургии позвоночника и спинного
мозга". Москва 1992 с 19-22.
20.Кнорре А.Г. Эмбриональный гистогенез. Л.: Медицина, 1971. 429 с.
21.Колпачков В. А. // Нейрохирургическая патология спинного мозга. - М., 1986. - С.
61-67.
22.Коновалов А. Н., Лихтерман Л. Б., Лившиц А. В., Ярцев В. В. // Вопр. нейрохир. 1986. - № 3. - С. 3-8.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
53
23.Коновалов А. Н., Лихтерман Л. Б., Потапов А. А. Нейротравматология. - М., 1994. С. 300.
24.Корж А. А., Зяблов В. И., Филиппенко В. А. // Ортопед. травматол. - 1987. - № 2. - С.
65-70.
25.Котляр Б. И. // Научные доклады высшей школы: Биол. науки. - 1986. - № 2. - С, 2334.
26.Лебедев В. И., Быковников Л. Д. // Руководство по неотложной нейрохирургии. - М.,
1987. - С, 159-193.
27.Леонтьев М.А. Лечение и реабилитация пациентов с травматической болезнью
спинного мозга / М.А. Леонтьев // Реабилитация инвалидов с нарушением функций опоры
и движения / Под ред. Л.В. Сытина, Г.К. Золоева, Е.М. Васильченко. - Новосибирск, 2003.
- С. 299-335.
28.Лившиц А. В. Хирургия спинного мозга- - М., 1990.
29.Лившиц А.В. Хирургия спинного мозга. Москва: Медицина. 1990.
30.Лившиц А.В. Электростимуляция спинного мозга. Вопросы нейрохирургии. 1977, 5,
С 7-13.
31.Луцик А. А. // Вопросы организации и лечения травмы нервной системы в РСФСР. Л., 1977. - С. 142-143.
32.Луцик А. А. // Позвоночно-спинномозговая травма (диагностика, лечение, реабилитация): Сборник трудов, кафедры нейрохирургии. - Новокузнецк, 1988. - С. 84-96.
33.Луцик А. А. // Травма шейного отдела позвоночника и спинного мозга. - Л., 1981. С. 33-36.
34.Михайлов А.Ю. Возможности реваскуляризации спинного мозга с использованием
микрохирургической техники: Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 2002.
35.Мусалатов Х.А., Аганесов А.Г., Чепский А.Д. и др. // Современные технологии в
травматологии и ортопедии: Сб. науч. работ. - М., 1999.
36.Мюллер М., Альговер М., Шнайдер Р., Виллинеггер X. Руководство по внутреннему
остеосинтезу. - М., 1996. - С. 627-682.
37.Оленев С.Н. Развивающийся мозг. Л.: Наука, 1978. 220с.
38.Отелин В.А. Нейробиологические проблемы структурномедиаторной организации
цнс и нейротрансплантологии. СПб. Изд. РАМН, ИЭМ, 1992.
39.Полежаев Л. В., Александрова М. А. Трансплантация ткани мозга в норме и при патологии. - М., 1986.
40.Резников К.Ю., Назаревская Г.Д. Пролиферация и цитогенез в развивающемся гиппокампе. Ред. В.Я.Бродский; АН СССР. Московское общество испытателей природы.
Москва: Наука, 1989.-125с.
41.Ромаданов А. П., Рудяк К. Э. // Вопр. нейрохир. - 1998. - № 1. - С. 56-62.
42.С.П. Миронов, ТА. Степанов, И.Г. Гришин, В.Г. Голубев, З.Г. Нацвлишвили, С. В.
Русских, И.Н. Карпов, Г. И. Хохриков, М.В. Капырина, Н.А. Еськин. // Первый опыт реконструктивных микрохирургических операций у больных с травматической болезнью
спинного мозга. // Вестник травматологии и ортопедии - 2003 №2.
43.Сабуренко Ю. Ф., Перфильев С. В., Карцев М. X; Эсчанов Б. // Сборник науч. работ
симпозиума, посвящ. 70-летию Новокузнецкого ГИДУВа. - Новосибирск, 1997. - С. 115118.
44.Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М., Медицина, 1979 с. 284.
45.Современные методы лечения осложненной травмы шейного отдела позвоночника:
Материалы городского семинара. - М., 2001. - Т. 150.
46.Степанов Г.А., Шапошников Ю.Г., Гришин И.Г., Мицкевич В.А., Каменев Ю.Ф.,
Колесников С.А. // Вести. травматол. ортопед. - 1998. - N 4. - С. 12-16.
47.Фаин Алан. // В мире науки. - 1986. - № 10. - С. 30-40.
48.Хвисюк Н. И., Чикунов А. С. // Ортопед, травматол, - 1990.-№ I. - С. 28-32.
49.Цивьян Я. Л. Лечение застарелых повреждений средне- и нижнешейного отделов
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
54
позвоночника: Метод, рекомендации. - Новосибирск, 1982.
50.Шапошников Ю.Г., Степанов Г.А., Гришин И.Г., Мицкевич В.А., Каменев Ю.Ф.,
Колесников С.А. / / Вести. травматол. ортопед. - 1998. - N 2. - С. 23-27.
51.Шевелев И. Н., Яриков Д. Е., Басков А. В. // Вопр. нейрохир. - 1997. - № 4. - С. 1922.
52.Шеперд Г. Нейробиология: Пер. с англ. - М., 1987. - Т.2. - С. 260-265.
53.Юмашев Г.С., Аганесов А.Г. // Всерос. съезд травматологов-ортопедов, 5-й: Тезисы
докладов. - Ярославль, 1990. - Ч. 1. - С. 189-195.
54.Abraham I., Sampson K.E., Powers E.A., et al. Increased PKA and PKC activities accompany neuronal differentiation of NT2/D1 cells. J Neurosci Res 1991; 28: 29-39.
55.Abumi K., Shong X, Kotami Y., Kaneda K. // J. Neurosurg. - 2000. - Vol. 92. - P. 30-37.
56.Acaroli G. C., Parisini P., Laguardia A. M. et al. // Minerva An-estesiol. - 1989. - Vol. 55.
- P. 99-102.
57.Acheson A., Barker P.A., Alderson R.F., Miller F.D., Murphy R.A. Detection of brainderived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron 1991; 7: 265-275
58.Agrawal S, K., Fellings M. G. // Ibid. - N 2. - P. 81-88.
59.Agrawal S. K., Felling M. G. // Ibid, - 1998. - Vol. 15, N I. - P. 39.
60.Agrawal S. K., Fellings M. G. // fbici. - 1997. - Vol. 14, N 10. - P. 776.
61.Aguayo A., David S., Richardson P., Bray G. Axonal elongation in periferal and cen-tral
nervous system transplants. In Fedoroff, Herz, Advances in cellular neurobiology, 1982, voll 3,
pp. 215-234.
62.Akesson E., Kjaeldgaar A., Seiger A. Human embryonic spinal cord grafts in adult rat spinal cord cavities: survival, growth and interactions with the host. Exp Neurol 1998; 149: 262276.
63.Alday R., Lobato R. D., Gomel P. // Neurosurgery 96, Manual of Neurosurgery / Ed. J. D.
Palmer. - Edinburgh, 1996. - P. 723-730.
64.Alien B. L. Jr., Perot P. L., Gudeman S. K. // J. Neurosurg. - 1985. - Vol. 63. - P. 510-520.
65.Altman J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats
// Anat. Rec. 1963. V. 145. P. 573-591.
66.Altman J., Das G.D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats // J. Сотр. Neurol. 1965. V. 124. P. 319-335.
67.Andrews P.W. Human teratocarcinoma stem cells: glycolipid antigen expression and
modulation during differentiation. J Cell Biochem 1987; 35: 321-332.
68.Andrews P.W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Dev Biol 1984; 103: 285-293.
69.Andrews P.W., Damjanov I., Simon D., et al. Pluripotent embryonal carcinoma clones derived from the human teratocarcinoma cell line Tera-2. Differentiation in vivo and in vitro. Lab
Invest 1984; 50: 147-162.
70.Apple D. F., McDonaldA. R., Smith R. A. // Paraplegia. - 1987. - Vol. 25. - P. 78-85.
71.Asawma T., Satomi K., Su^uki N, et al. // Spinal Cord. - 1996.- Vol. 34, N 10. - P. 620625.
72.Azizi S.A., Stokes D., Augelli B.J. Engraftment and migration of human bone mar-row
cells implanted in the brains of albino rats - similarities to astrocyte grafts // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1998. V. 95. P. 3908-3913.
73.Baker K.A., Hong M., Sadi D., Mendez I. Intrastriatal and intranigral grafting of hNT neurons in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Exp Neurol 2000; 162: 350-360.
74.Baldwin S. A.. Blades D. B., Scheff S. W. // Ibid. - 1996. -Vol. 13, N 10. - P. 603.
75.Bamber N.I., Li H., Aebischer P., Xu X.M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords.
Neural Plas 1999; 6: 103-121.
76.Bandtlow C., Zachleder T., Schwab M.E. Oligodenrocytes arrest neurite growth by contact
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
55
inhibition. J Neurosci. 1990 10 (12): 3837-48.
77.Bandtlow C.E., Heumann R., Schwab M.E., Thoenen H. Cellular localization of nerve
growth factor synthesis by in situ hybridization. EMBO J 1987; 6: 891-899
78.Bandtlow C.E., Schwab M.E. NI-35/250nogo-a: a neurite growth inhibitor restricting
structural plasticity and regeneration of nerve fibers in the adult vertebrate CNS. Glia. 2000 29
(2): 175-81
79.Barnard J.W., Carpenter W. Lack of regeneration in the spinal cord of the rat. J Neurophysiol 1950; 13: 223-228
80.Beagles K. E., Knapp P. E., Springer J. E. // Ibid. - 1998. -Vol. 15, N 10. - P. 857.
81.Bemhardt M., White A. A., Punjabi M. M., McGowan D. P. // The Spine / Eds R. H.
Rothman, F. A. Simeone. - 3-rd Ed.- Philadelphia, 1992. - P. 1167-1195.
82.Bengzon J., Kokaia Z., Elmer E. et al. Apoptosis and proliferation of dentate gyrus neurons after single and intermittent limbic seizures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.
10432-10437.
83.Bernstein J.J., Hoovler D.W., Turtil S. Initial growth of transplanted E11 fetal cortex and
spinal cord in adult rat spinal cord. Brain Res 1985; 343: 336-345.
84.Bernstein J.J., Underberger D., Hoovler D.W. Fetal CNS transplants into adult spinal cord:
techniques, initial effects and caveats. Cent Nerv Syst Trauma 1984; 1: 39-46.
85.Bernstein-Goral H., Bregman B.S. Spinal cord transplants support the regeneration of axotomized neurons after spinal cord lesions at birth: a quantitative double labeling study. Exp
Neurol 1993; 123: 118-132.
86.Bfinik N., Maeie M., WUford G., Hogan E. // Ibid. - P. 600.
87.Bjorklund A. and Stenevi U. Intracerebral neural transplants neuronal replacement and reconstruction of damages circuitries. Ann. Rev. Neurosci, 1984, v. 7, p. 279-308.
88.BjorklundA., Lindvall 0. Cell replacement therapies for central nervous system disor-ders
// Nat. Neuroscience. 2000. V. 3. P. 537-544.
89.Bjornson C.R.R., Rietze R.L., Reynolds B.A. Turning brain into blood: a hematopo-etic
fate adopted by adult neural stem cells in vivo II Science. 1999. V. 283. P. 534-537.
90.blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.
91.Blight A. R., Leroy C. Jr., Heyes M. P. // Ibid. - 1997. -Vol. 14, N 2. ~ P. 89-98.
92.Blumer C.E., Quine S. Prevalence of spinal cord injury: an international comparision.
Neuroepidemiology. 1995, 14(5):258-268).
93.Bohlman H. H. // J. Bone Jt Surg. - 1979. - Vol. 61 (A). -P. 1119-1142.
94.Bohlman H. H., Anderson P. A. // J. Bone Jt Surg. - 1992. -Vol. 74, N 5. - P. 671-682.
95.Borlongan C.V., Saporta S, Poulos SG, Othberg A, Sanberg PR. Viability and sur-vival of
hNT neurons determine degree of functional recovery in grafted ischemic rats. Neuro Rep 1998;
9: 2837-2842.
96.Borlongan C.V., Tajima Y., Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y., Sanberg P.R. Transplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons (NT2N cells) promotes
functional recovery in ischemic rats. Exp Neurol 1998; 149: 310-321.
97.Boulis N. M., Bhatia V., Bridle T. I. et al. // J. Neurosurg. -1999. - Vol. 90, N 1. - P, 99108.
98.Bouvier M.M., Mytilineou C. Basic fibroblast growth factor increases division and delayed differentiation of dopam-ine precursors in vitro II J. Neurosci. 1995. V. 15. P. 7141-7149.
Brustle O. Building brain: neuronal chimeras in the study of nervous system development and
repair // Brain Pathol. 1999. V. 9. P. 527-545.
99.Bracken M. B., Shepard M. J., Holford T. R. et al. // J. Neurosurg. - 1998. - Vol. 89, N 5. P. 699-706.
100.Bracken M.B., Shepard M.J., Collins W.F., et al. A randomized controlled trial of
methylpredmsolone or naloxone in the treatment of acute spinal-cord injury Results of the Second National Acute Spinal Cord Injury Study N Engl J Med 1990, 322 1405-1411
101.Bregman B.S. Recovery of function after spinal cord injury: transplantation strate-gies.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
56
In: Dunnett SB, Bjorkland A, eds. Functional Neural Transplantation. New York: Raven Press
Ltd, 1994: 489-529.
102.Bregman B.S., Diener P.S., McAtee M., Dai H.N., James C. Intervention strategies to
enhance anatomical plasticity and recovery of function after spinal cord injury. Adv Neurol
1997; 72: 257-275.
103.Bregman B.S., Kunkel-Bagden E, Reier P.J., et al. Extension of the critical period for developmental plasticity of the corticospinal pathway. J Comp Neurol 1989; 282: 355-370.
104.Brewer G.J. Regeneration and proliferation of embryonic and adult rat hippocampal neurons in culture // Exp. Neurol. 1999. V. 159. P. 237-247.
105.Brodke D. S., Anderson P. A., Newell D. et al. // 23-rd Annual Meeting of the Cervi-cal
Spine Research Society. - New Mexico, 1995.
106.Bucholt R. W. II Clin. Orthop. - 1981. - N 154. - P. 119-124.
107.Bunge R.P., Bunge M.B., Eldridge C.F. Linkage between axonal ensheathment and basal
lamina production by Schwann cells. Ann Rev Neurosci 1986; 9: 305-328
108.Byrd J.A., Puno R.M. // Current techniques in spinal stabilization /Eds. KG. Fessler,
R.W. Uaid. - New York. 1996.-P. 409-419.
109.Cameron H.A., Gould E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in den-tate
gurus // Neuroscience. 1994. V. 61. P. 203-209.
110.Cameron H.A., Hazel T.G., McKay R.D. Regulation of neurogenesis by growth fac-tors
and neurotransmitters // J. Neurobiol. 1998a. V. 36. P. 287-306.
111.Cameron H.A., McEwen B.S., Gould E. Regulation of adult neurogenesis by excita-tory
input and NMDA receptor activation in the dentate gyrus // J. Neurosci. 1995. V. 15. P. 46874692.
112.Cameron H.A., McKay R.D. Restoring production of hippocampal neurons in old age //
Nat. Neurosci. 1999. V. 2. P. 894-897.
113.Cameron H.A., Tanapat P., Gould E. Adrenal steroids and N-methyl-D-aspartate receptor activation regulate neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats through a common
pathway // Neuroscience. 1998b. V. 82. P. 349-354.
114.Campbell's operative orthopedics. - 1992. - Vol. 5. - P. 2961-3870.
115.Carlson G. D., Minato Y., Okava A. etal. //J. Neurotrauma. -1997. - Vol. 14, N 12. - P.
951-962.
116.Carlson S. L, Vacant M. E. // Ibid. - 1998. - Vol. 15, N 10.- P.861.
117.Carol M., Ducker T. B., Bymes D. // Neurosurgery. - 1980. - Vol. 7. - P. 219-224.
118.Caroni P., Schwab M.E. Codistribution of neurite growth inhibitors and oligodendrocytes in rat CNS: appearance follows nerve fiber growth and precedes myelination. Dev Biol.
1989 136 (2): 287-95.
119.Carpenter M.K., Cui X., Ни Z.Y. et al. In vitro expansion of a multipotent population of
human neural progenitor cells // Exp. Neurol. 1999. V. 158. P. 265-278. Chalmers-Redman
R.M., Priestley Т., Kemp J.A. et al. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotent progenitor cells from human fetal brain // Neuroscience. 1997. V. 76. P. 1121-1128.
120.Casha S., Fehlings M. G. // Ibid. - P. 861.
121.CassamA. K., Krassionkov A. V., Weaver L. C. // Ibid. - 1995.- Vol. 12, N 1. - P. 111.
122.Chen M.S, Huber A.B., van der Haar M.E., Frank M., Schnell L., Spilmann A.A, Christ
F., Schwab M.E. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an anti-gen for
monoclonal antibody IN-1. Nature. 2000 403 (6768): 434-9.
123.Chen T. Y., Dickman C. A., Eleraky M., Sonntag V. K. // Spine. - 1998. - Vol. 23, N 22.
- P. 2398-2403.
124.Cheng H., Yihai C., Olson L. Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function. Science 1996; 273: 510-513
125.Chenn A., McConnel S.K. Cleavage orientation and the asymmetric inheritance of Notch
1 immunoreactivity in mammalian neurogenesis // Cell. 1995. V. 82. P. 631-641.
126.Chiasson B.J., Tropepe V., Morshead C.M. et al. Adult mammalian forebrain ependymal
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
57
and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have
neural stem cell characteristic // J. Neuro-sci. 1999. V. 19. P. 4462-4471.
127.Chii G. K. T., Tator C. M. // [bid. - 1998. - Vol. 15, N 10. - P. 863.
128.Christensen M. D., Supowit S. C., DiPetter D. J., Halsebosch C. E. It Ibid. - P. 602.
129.Cooper P. R., Cohen W. // J. Neurosurg. - 1984. - Vol. 61.- P. 281-289.
130.Das G.D. Neural transplantation in the spinal cord of adult rats. Conditions, survival, cytology and connectivity of the transplants. J Neurol Sci 1983; 62: 191-210.
131.Davis A.A., Temple S. A self-renewing multipotential stem cells in embryonic rat cerebral cortex // Nature. 1994. V. 17. P. 263-266.
132.Davis D., Bohlman H., Walker A. E. et al. // J. Neurosurg. - 1971. - Vol. 34, N 5. - P.
603-613.
133.de Castro R. Jr., Gelman Z., McAdoo D. J. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 603.
134.de Castro R. Jr.. Alcock N., McAdoo D. J. // Ibid. - 1995. -Vol. 12, N 5. - P. 994.
135.Del Bigio M.R. The ependyma: a protective barrier between brain and cerebrospinal fluid
// Glia. 1965. V. 14. P. 1-13.
136.Denis F. // Spine. - 1983. - Vol. 8. - P. 817-831. 137.Devon R., Doucette R. Olfactory
ensheathing cells myelinate dorsal root ganglion neurites. Brain Res 1992; 589: 175-179
138.Dick W., Lindsey R.W. // Spine. - 1991. - Vol. 16, SuppL-P. 140-145.
139.Diener P.S., Bregman B.S. Fetal spinal cord transplants support the development of target
reaching and coordinated postural adjustments after neonatal cervical spinal cord injury. J Neurosci 1998; 18: 763-776.
140.Diener P.S., Bregman B.S. Neurotrophic factors prevent the death of CNS neurons af-ter
spinal cord lesions in newborn rats. Neuroreport 1994 Oct 3;5(15):1913-7
141.Ditunno J. F., Young W., Donovan W. H., Creasy G. // Paraplegia. - 1994. - Vol. 32. - P.
70-80.
142.Doetsch F., Caille I., Lim D.A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the
adult mammalian brain // Cell. 1999. V. 96. P. 703-716.
143.Doetsch F., Garcia-Verduno J.M., Alvarez-Buylla A. Cellular composition and threedimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain // J.
Neurosci. 1997. V. 17. P. 5046-5961.
144.Donovan W. H., Brown D. J., Ditunno J. F. et al. // Spinal Cord, - 1997. - Vol. 35, N 5. P. 275-281.
145.Doucette R. Olfactory ensheathing cells: potential for glial cell transplantation into areas
of CNS injury. Histol Histopathol 1995; 10: 503-507.
146.Ducker T. B., Zeidman S. M. // Spine. - 1994. - Vol. 19, N20. -P. 2281-2287.
147.Eglitis M.A., Mezey E. Hematopoetic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brain of adult mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 4080148.Eisch A.J.,Barrot M., Schad С. A. et al. //Opiates inhibit neurogenesis in the adult rat
hippocampus // Proc. Natl. Ac-ad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 7579-7584.
149.Eismont F. /., Arena M. /., Green B. A. // J. Bone Jt Surg. - 1991. - Vol. 73A. - P. 15551560.
150.Eriksson P.S., Perfilieva E., Bjork-Eriksson T. et al. Neurogenesis in the adult human
hippocampus // Nat. Medicine. 1998. V. 11. P. 1313-1318.
151.Evans M.J. The isolation and properties of a clonal tissue culture strain of pluripotent
mouse teratoma cells // J. Em-bryol. Exp. Morphol. 1972. V. 28. P. 163-176.
152.Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluri-potential cells from mouse
embryos // Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.
153.Faden A. /., Ivanovo S. A., Mukfiin A. G. // Ibid. - 1997. - Vol. 14, N 12. - P. 885-895.
154.Farmer J., Vaccaro A., Albert T. J. et al.// J. Spinal Disord. - 1998. - Vol. 11, N 3. - P.
192-196.
155.Farooug M., Olsson Y.. Hillered L. // Ibid. ~ N 7. - P. 469-476.
156.Fehlings M. G. // Ibid. - 1998. - Vol. 15, N 1. - P. 10.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
58
157.Fehlings M. G., Sekhton L. H., Tator C. // Spine. - 2001. -Vol. 26. N 24. - Suppl. - P.
S101-S110.
158.Feigin I., Hecht Geller E., Wolf A. Absence of regeneration in the spinal cord of the
young rat. J Neuropathol Exp Neurol 1951; 10: 420-425
159.Floyd C. L. Rzigalincki B. A. // Ibid. - N 10. - P. 869.
160.Frankel H. L., Hancock D. 0., Hyslop G. et al. // Paraplegia. - 1969. - Vol. 7, N 3. - P.
179-192.
161.Fricker R.A., Carpenter M.K., Winkler C. et al. II Sitespecific migration of human neural
progenitor cells after transplantation in the adult rat brain // J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 59906005.
162.Friedman B., Scherer S.S. Rudge J.S., et al. Regulation of ciliary neurotrophic factor expression in myelin-related Schwann cells in vivo. Neuron 1992; 9: 295-305
163.Gage F.H. Mammalian neural stem cells. Science 2000; 287: 1433-1438.
164.Gage F.H. Stem cells of the central nervous system // Curr. Opin. Neurbiol. 1998. V. 8. P.
671-676. Gage F.H. Mammalian neural stem cells // Science. 2000. V. 287. P. 1433-1438.
165.Gage F.H., Kempermann G., Palmer Т.О. et al. Multipotent progenitor cells in the adult
dentate gyrus //J. Neurobiol. 1988. V. 36. P. 249-266.
166.Gage F.H., Ray J., Fisher L.J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the
CNS / Eds Cowan W.M. et al. Anen. Rev. of Neurosci. 1995. P. 159-192.
167.Garcia-Verdugo J.M., Doetsch F., Wichterle H. et al. Architecture and cell type of adult
subventricular zone: a search of the stem cells // J. Neurobiol. 1998. V. 36. P. 234-248.
168.Gimenez y Ribotta M., Orsal D., Feraboli-Lohnherr D., Privat A. Recovery of locomotion following transplantation of monoaminergic neurons in the spinal cord of paraplegic rats.
Ann N Y Acad Sci 1998; 860: 393-411.
169.Giovanini M.A., Reier P.J., Eskin T.A., Anderson D.K. MAP2 expression in the developing human fetal spinal cord following xenotransplantation. Cell Transplant 1997; 6: 339346.
170.Giovanini M.A., Reier P.J., Eskin T.A., Wirth E., Anderson D.K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesions and grafting conditions. Exp Neurol 1997; 148: 523-543.
171.Goldberg J.L., Barres B.A. Nogo in nerve regeneration. Nature. 2000 403 (6768): 36970.
172.Goldberg W.J., Bernstein J.J. Transplant-derived astrocytes migrate into host lumbar and
cervical spinal cord after implantation of E14 fetal cerebral cortex into adult thoracic spinal cord.
J Neurosci Res 1987; 17: 391-403.
173.Goldsmith H. S. // Neurol. Res. - 1994. - Vol. 16.
174.Goodman J.H., et all. Platobt aggregation in experimental spinal cord injury. Arch Neurol. 1979. 36(4):197-201.
175.Gould E. Serotonin and hippocampal neurogenesis // Neuropsychopharmacology. 1999.
V. 21. Suppl. 2. P. 46S-51S.
176.Gould E., Beylin A., Tanapat P. et al. Learning enhances neurogenesis in the hippocampal formation // Nat. Neurosci. 1999a. V. 2. P. 260-265.
177.Gould E., Reeves A J., Fallach M. et al. Hippocampal neurogenesis in adult Old World
primates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999b. V. 96. P. 5263-5267.
178.Gould E., Reeves A.J., Graziano M.S. et al. Neurogenesis in the neocortex of adult primates // Science. 1999c. V. 286. P. 548-552.
179.Gould E., Tanapat P., Rydel T. et al. Regulation of hippocampal neurogenesis in adulthood // Biol. Psychiatry. 2000. V. 48. P. 715-720.
180.Grandpre T., Nakamura F., Vartanian T., Strittmatter S.M. Identification of the Nogo inhibitor of axon rgeneration as a Reticulon protein. Nature. 2000 403 (6768): 439-44.
181.Grant G. A., Mirza S. K., Chapman J. R. et al. // Neurosurgery. - 1999. - Vol. 90. N 1. Suppl. - P. 13-18.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
59
182.Graziadei P.P.C., Monti Graziadei G.A. Continuous nerve cell renewal in the olfac-tory
system. Handbook of Sensory Physiology. Development of Sensory System. New York: Springer Verlag, 1978. V. XI. P. 52-85.
183.Green J.B., Sora E., Bialy Y., Ricamato A., Thatcher R.W. Cortical motor reorganization after paraplegia - an EEG study. Neurology 1999; 53(4):736-743.
184.Grill R. J.. Miller f. J., Tiswinski M. H. // Ibid. - 1996. -Vol. 13, N 10. - P. 628.
185.Gritti A., Parati E.A., Cova L. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor // J. Neurosci. 1996. V. 16, P.
1091-1100.
186.Guest J.D., Rao A., Olson L., Bunge M.B., Bunge R.P. The ability of human Schwann
cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord. Exp Neurol 1997; 148:
502-522
187.Harringfon J. -F., Likavec M. /., Smith A. S. // J. Neurosurg. - 1991. - Vol. 29. - P. 374379.
188.Hartley R.S., Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y. Differential effects of spinal cord gray and
white matter on process outgrowth from grafted human NTERA2 neurons (NT2N, hNT). J
Comp Neurol 1999; 415: 404-418.
189.Hastings N.B., Gould E. Rapid extension of axons into the С A3 region by adultgenerated granule cells //J. Сотр. Neurol. 1999. V. 413. P. 146-154.
190.Homer P.J., Power A.E., Kempermann G. Proliferation and differentiation of progeni-tor
cells throughout the intact adult rat spinal cord // J. Neurosci. 2000. V. 20. P. 2218-2228.
191.Horner P. J.. McTigue D. M., Rridet J. L. et al. // Ibid. -P. 628.
192.Horner P.J., Popovich P.G., Mullin B.B., Stokes B.T. A quantitative spatial analysis of
the blood-spinal cord barrier. II. Permeability after intraspinal fetal transplantation. Exp Neu-rol
1996; 142: 226-243.
193.Howard S., An M.D. // Ibid. - 1998, - Vol. 23. - P. 2713-2729.
194.Hsu C.Y., et all. Jncreased thromboxane level in experimentally spinal cord injury. J
Neurolog Sci. 1986. 74(2-3): 289-296.
195.Huang D.W., McKerracher L, Braun PE, David S. A therapeutic vaccine approach to
stimulate axon regeneration in the adult mammalian spinal cord. Neuron. 1999 24 (3): 639-47.
196.Huang J.L., Lee W.Y., Chen L.C., Kuo M.L., Hsieh K.H. Changes of serum levels of interleukin-2, intercellular adhesion molecule-1, endothelial leukocyte adhesion molecule-1 and Th
1 and Th 2 cells in severe atopic dermatitis after intravenous immunoflobulin therapy. Ann Allergy Asthma Immunol. 2000 84 (3): 345-52.
197.Hurlbert M.S., Gianani R.I., Hutt C., Freed C.R., Kaddis F.G. Neural transplantation of
hNT neurons for Huntington's disease. Cell Transplant 1999; 8: 143-151.
198.Issaksson J., Farooque M., Holt^. A., Olsson J. // Ibid. - 1999. -Vol. 16, N 2. - P. 165173.
199.Jacobson M. Developmental Neurobiology. New York: Plenum Press, 1978. 562 p.
200.Jakeman L. B., Stokes B. T. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10.- P. 601.
201.Jakeman L.B., Reier P.J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the
adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol 1991;
307: 311-334.
202.Jeanneret B., Mageri F., Ward F. H., Ward J. C. H. // Spine.- 1991. - Vol. 16, N 3. Suppl. - P. S56-S63.
203.Johansson C.B., Momma S., Clarke D.L. et al. Identification of a neural stem cells in the
adult mammalian central nervous system // Cell. 1999a. V. 96. P. 25-34.
204.Johansson C.B., Swensson M. Wallstedt L. et al. Neural stem sells in the adult human
brain // Exp. Cell. Res. 1999b. V. 253. P. 733-736.
205.Jun Kohyama, Hitoshi Abe, Takuya Shimazaki, Amane Koizumi, Kinichi Naka-shima,
Satoshi Gojo, Tetsuya Taga, Hideyuki Okano, Jun-ichi Hata, Akihiro Umezawa. Brain from
bone: Efficient ''meta-differentiation'' of marrow stromaderived mature osteoblasts to neu-rons
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
60
with Noggin or a demethylating agent. Differentiation (2001) 68:235-244
206.Kao C.C. Comparison of healing process in transected spinal cords grafted with autogenous brain tissue, sciatic nerve and nodose ganglion. Exp Neurol 1974; 44: 424-439.
207.Kato T., Honmou O., Uede T., Hashi K. Transplantation of human olfactory en-sheathing
cells elicits remyelination of demyelinated rat spinal cord. Glia 2000; 30: 209-218
208.Katunian P.I., Dzucaev D.N., Musalatov C.A. Valoracion de la aceptacion de neurotransolantes en la lesion medular traumatica. Barcelona Quirurgica. 1999 42 (1): 27-30.
209.Kempermann G., Brandon E.P., Gage F. Environmental stimulation of 129/SvL mice
causes increased cell proliferation and neurogenesis in the adult dentate gyrus // Curr. Biol.
1998a. V. 13. P. 939-942.
210.Kempermann G., Gage F. Experience-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis: effects of longterm stimulation and stimulus withdrawal // Hippocampus. 1999. V. 9. P.
321-332.
211.Kempermann G., Kuhn H.G., Gage F. Experience-induced neurogenesis in the senes-cent
dentate gyrus // J. Neurosci. 1998b. V. 18. P. 3206-3212.
212.Kempermann G., Kuhn H.G., Gage F. Genetic influence on neurogenesis in the den-tate
gyrus of adult mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997a. V. 94. P. 10409-10414.
213.Kempermann G., Kuhn H.G., Gage F. More hippocampal neurons in adult mice liv-ing in
an enriched environment // Nature. 1997b. V. 386. P. 493-495.
214.Kirschenbaum B.M., Nedergaard A., Preuss K. et al. In vitro neuronal production and
differentiation by precursor cells derived from the adult human forebrain // Cereb. Cortex. 1994.
V. 6. P. 576-589.
215.Kleppner S.R., Robinson K.A., Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y. Transplanted human neurons derived from a teratocarcinoma cell line (NTera-2) mature, integrate and survive for over 1
year in the nude mouse brain. J Comp Neurol 1995; 357: 618-632.
216.Koivikko M. P., Myllynen P., Karjalainen M. et al. // Arch. Orthop. Traumat. Surg. 2000. - Vol. 120, N 7-8. - P. 448- 451.
217.Kopcsynski S. Derenda M., Kowalina I., Siwiecki T. // Neurol. Neurochir. Pol. - 2002. Vol. 36, N 4. - P. 669-682.
218.Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney F.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse
brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
219.Kreui N. R., Meakin S. 0., Weaver L. C. // Ibid. - 1997. -Vol. 14. N 10. - P. 803.
220.Kreuz M R; Korkola M. L., Weaver L C. // Ibid. - 1995. -Vol. 15, N I- - P. 127.
221.Kukekov V.G., Laywell E.D., Suslov 0. Multipotent stem/progenitor cells with simi-lar
properties arise from two neurogenic regions of adult human brain // Exp. Neurol. 1999. V. 156,
P. 333-344.
222.Laporte C., Saillant G. // Maitrise Orthop. - 1997. - N 68. - P. 1-9.
223.Laus M., Zappoli F. A., Alfonso C. et al. // Chir. Organi Mov.- 1997. - Vol. 82, N 2. - P.
97-104.
224.Lavirov-Spigler 0., Solomon A. S.. Ben Zeev-Brann A. et al. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N
10. - P. 617.
225.LaywellE.D., Kukekov V.D., SteindlerDA. Multipotent neurospheres can be derived
from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals // Exp. Neurol. 1999. V. 156. P. 428- 421.
226.Lazarov-Spigler 0., Rapalino D. // Ibid. - 1998. - Vol. 15,N 10. - P. 879.
227.Lee S.H., Lumelsky N., Studer L. et al. Efficient generation of midbrain and hind-brain
neurons from mouse embryonic stem cells // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 675-679.
228.Lee V.M.-Y., Andrews P.W. Differentiation of NTERA-2 clonal human embryonal carcinoma cells into neurons involved the induction of all three neurofilament proteins. J Neuro-sci
1986; 6: 514-521.
229.Letts M., Davidson D., Healey D. // Ibid. - 2002. - Vol. 27. - P. 446-450.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
61
230.Li Y., Field P.M., Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science 1997; 277: 2000-2002
231.Li Y., Raisman G. Integration of transplanted cultured Schwann cells into the long myelinated fibre tracts of the adult spinal cord. Exp Neurol 1997; 145: 397-411
232.Linsenmeyer T. A., Stone /. M. // Rehabilitation Medicine:Principles and Practice / Ed. J.
A. De Lisa. - 2-nd Ed. - Philadelphia, 1993. - P. 733-762.
233.Liu D., Qian H., Leski L. // Ibid. - 1998. - Vol. 15, N 10. - P.880.
234.Liu D., Sybert T. E., Leski M. L. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 602.
235.Liu Y., Himes B.T., Solowska J., et al. Intraspinal delivery of neurotrophin-3 using neural stem cells genetically modified by recombinant retrovirus. Exp Neurol 1999; 158: 9-26
236.Lois C., Alvarez-Buylla A. Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.
90. P. 2074-2077.
237.Lombard V., Vaiko L., Stole S., Vaiko M. // Ibid. - 1995. -Vol. 12, N 1. - P. 130.
238.Luskin M.B. Restricted proliferation and migration of postna-taly generated neurons derived from the forebrain sub-ventricular zone // Neuron. 1993. V. 11. P. 173-189.
239.MacDonald J.W., Liu X.Z., Qu Y., et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord. Nat Med 1999; 5: 1410-1412
240.Magavi S.S., Leavitt B.R., Macklis J.D. Induction of neurogenesis in the neocortex of
adult mice // Nature. 2000. V. 405. P. 951-955.
241.Mahale Y. J., Silver J. R., Henderson N. J. // J. Bone Jt Surg. - 1993. - Vol. 75. - P. 403409.
242.Martin D., Robe P., Franzen R., et al. Effects of Schwann cell transplantation in a contusion model of rat spinal cord injury. J Neurosci Res 1996; 45: 588-597
243.Martin G.R. Isolation of pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned to tera-tocarcinoma stem sells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 198l. V. 78. P.
7634-7638.
244.Martin G.R., Evans M.J. The morphology and growth of pluripotent teratocarcinoma cell
line and its derivates in tissue culture // Cell. 1974. V. 2. P. 163-172. McBurney M.W., Reuhl
K.R., Ally A.I. Differentiation and maturation of embryonal carcinoma-derived neurons in cell
culture // J. Neurosci. 1988. V. 8. P. 1063-1073. McKay R. Stem cells in the central nervous system // Science. 1997. V. 276. P. 66-71.
245.MautesA., Cuenther K., Panfer S. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 604.
246.Maxwell W. L, Kosanlavit R.. Graham D. f. // Ibid. - P. 788.
247.Maynard F. M., Bracken M. B., Creasy G. et al. // Spinal Cord. - 1997. - Vol. 35, N 5. P. 266-274.
248.McAfee P. C., Zeidman S. M., Ducker T. B., Bohlman H. H. // Annual Meeting of the
Cervical Spine Research Society. - Palm Desert, California, 1992.
249.McLain R.F, et al. // Ibid. - 1999. - Vol. 24. - P. 1646
250.Mclntosh T. K., Juhler M., Wieloch T. // Ibid. - 1998. -Vol. 15, N 10. - P. 731.
251.McTigue D. M., Horner P. J., Gage F. H., Stokes B. T. // Ibid.- 1997. - Vol. 14, N 10, - P.
775.
252.Mehler M.F., Маbie Р.С., Zhu G. et al. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to bone morphogenetic proteins differentially modulate progressive CNS lineage
fate // Dev. Neurosci. 2000. V. 22. P. 74-85.
253.Mendez I., Sadi D., Hong M. Reconstruction of the nigrostriatal pathway by simultaneous intrastriatal and intranigral dopaminergic transplants. J Neurosci 1996; 16: 7216-7227.
254.Menei P., Montero-Menei C., Whittemore S.R., Bunge R.P., Bunge M.B. Schwann cells
genetically modified to secrete human BDNF promote enhanced axonal regrowth across transected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci 1998; 10: 607-621
255.Menezes A. H., Sonntag V. K. H. Principles of Spinal Surgery. - New York 1996. - Vol.
1-2.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
62
256.Mezey E., Chandros K.J. Bone marrow: a possible alternative source of cells in the adult
nervous system // Eur. J. Pharmacol. 2000. V. 405. P. 297-302.
257.Mirza S. K., Krengel W. F., Chapman J. R. et al. // Clin. Orthop. - 1999. - N 359. - P.
104-114.
258.Miya D., Giszter S., Mori F., et al. Fetal transplants alter the development of function after spinal cord transection in newborn rats. J Neurosci 1997; 17: 4856-4872
259.Miyazono M., Lee V.M.-Y., Trojanowski J.Q. Proliferation, cell death and neuronal differentiation in transplanted human embryonal carcinoma (NTera-2) cells depend on the graft site
in nude and severe combined immunodeficient mice. Lab Invest 1995; 73: 273-283.
260.Miyazono M., Nowell P.C., Finan J.L., Lee V.M.-Y., Trojanowski J.Q. Long-term integration and neuronal differentiation of human embryonal carcinoma cells (NTera-2) transplanted into the caudoputamen of nude mice. J Comp Neurol 1996; 376: 603-613.
261.Mofohashi 0., Suyiki M., Shida M., Umewva K. // Ibid. -1997. - Vol. 14, N 10. - P. 747754.
262.Mori F., Himes B.T., Kowada M., Murray M., Tessler A. Fetal spinal cord transplants
rescue some axotomized rubrospinal neurons from retrograde cell death in adult rats. Exp Neurol
1997; 143: 45-60.
263.Morshead C.M., Craig C.G., van der Kooy D. In vivo clonal analyses reveal the properties of endogenous neural stem cell proliferation in the adult mammalian forebrain // Development. 1998. V. 125. P. 2251-2261.
264.Morshead C.M., Shah N.M., Craig C.G. et al. Neural stem cells in the adult mammal-ian
forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells // Neuron. 1994. V. 13. P.
1071-1082.
265.Morshead C.M., van der Kooy D. A new "spin" of neural stem cells? // Curr. Opin. Neurobiology. 2001. V. 11. P. 59-65.
266.Morshead C.M., van der Kooy D. Postmitotic death is the fate of constitutively proliferating cells in the subependymal layer of the adult brain // J. Neurosci. 1992. V. 12. P. 49256.
267.Mukhin A. C., Ivanovo S. A., Knoblach S. M., Faden I. I. // Ibid. - P. 651-663.
268.Munir M, Lu L., Wang Y.H., et al. Pharmacological and immunological characteriza-tion
of N-methyl-D-aspartate receptors in human NT2-N neurons. J Pharmacol Exp Ther 1996; 276:
819-828.
269.Nakauchi K., Ikata T., Katon S. et at. // Ibid. - 1996. -Vol. 13,N 10. - P.573-582,
270.Nashimi R., Miitsaers L., Acherley C. A. et al. // Ibid. - 1997. - Vol. 14, N 10. - P. 776.
271.Nilsson M., Perfillieva E., Johansson U. et al. Enriched environment increases neurogenesis in the adult rat dentate gyrus and improves spatial memory // J. Neurobiol. 1999. V. 39.
P. 569-578.
272.Noekels R., Young W. // J. Neurotrauma. - 1992. - Vol. 9. - Suppl. l.-P. S211-S217.
273.Obrenovitch T. P., Urenjak J. U. // Ibid. - P. 667-698.
274.Onifer S.M., Cannon A.B., Whittemore S.R. Altered differentiation of CNS neural progenitor cells after transplantation into the injured adult rat spinal cord. Cell Transplant 1997; 6:
327-338.
275.Ono K., Takii Т., Onozaki K. Migration of exogenous immature hematopoietic cells into
adult mouse brain parenchyma under GFP-expressing bone morrow chimera // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 262. P. 610-614.
276.OrdoneT. B. J., Benyl F. C., Naderi S., Welter S. J. //J. Neuro-surg. - 2000. - Vol. 92, N
1. - Suppl. - P. 18-23.
277.Ourednik V., Ourednik J., Park K.I., Snyder E.Y. Neural stem cells; a versatile tool for
cell replacement and gene therapy in the central nervous system. Clin Genet 1999; 56: 267-278.
278.Pagano S.F., Impagnatielo F., Girelli M. et al. Isolation and characterization of neural
stem cells from the adult human olfactory bulb // Stem Cells. 2000. V. 18. P. 295-300.
279.Palmer Т.D., Takahashi J., Gage F.H. The adult rat hippocampus contains primordial
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
63
neural stem sells // Mol. Cell. Neurosci. 1997. V. 8. P. 389-404.
280.Palmer Т.О., Markakis E.A., Willhoite A.R. et al. Fibroblast growth factor-2 activates a
latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS //J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 8487-8497. 281.Palmer Т.О., Ray J., Gage F.H. FGF-2-responsible neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain // Mol.
Cell Neurosci. 1995. V. 6. P. 474-486.
282.Papadopoulos S. M., Selden N. R., Quint D. J. et al. // J. Trauma. - 2002. - Vol. 52, N 2. P. 323-332.
283.Peretto P., Merighi A., Fasolo A., Bonfanti L. The subventricular layer in rodents: a site
of structural plasticity and cell migration in the adult mammalian brain // Brain Res. Bull. 1999.
V. 49. P. 221-243. 284.Philips M.F., Muir J.K., Saatman K.E., et al. Survival and integration of
transplanted postmitotic human neurons following experimental brain injury in immunocompetent rats. J Neurosurg 1991; 90: 116-124.
285.Pincus D.W., Keyoung H.M., Harrison-Restelli C. et al. Fibroblast growth factor-2/braindrived neurotrophic-assotiated maturation of new neurons generated from adult human subependymal zone // Ann. Neurol. 1998. V. 43. P. 576-585.
286.Plata-Salaman C. R., Kelly G., Agrestra C., Salomon S. K. // Ibid. - 1995. - Vol. 12, N 1.
- P. 135.
287.Pleasure S.J., Lee V.M.-Y. NTera 2 cells: a human cell line which displays characteristics expected of a human committed neuronal progenitor cell. J Neurosci Res 1993; 15: 585602.
288.Pleasure S.J., Page C., Lee V.M.-Y. Pure, postmitotic, human neurons derived from
NTera 2 cells provide a system for expressing exogenous proteins in terminally differentiated
neurons. J Neurosci 1992; 12: 1802-1815.
289.Popovich P. G., Huitinga f., van Rooljen N., Stokos B. T. // Ibid. - 1997. - Vol. 14, N 10.
- P. 790.
290.Popovich P.G., Horner P.J., Mullin B.B., Stokes B.T. A quantitative spatial analysis of
the blood-spinal cord barrier. I. Permeability changes after experimental spinal contusion in-jury.
Exp Neurol 1996; 142: 257-274.
291.Pratt E. S., Green D. A., Spongier D. M. // Spine. - 1990. - Vol. 15, N 7. - P. 662-666.
292.Prinjha R., Moore S.E., Vinson M., Blake S., Morrow R., Christie G., Michalovich D.,
Simmons D.L., Walsh F.S. Inhibitor of neurite outgrowth in humans. Nature. 2000 403 (6768):
383-4.
293.Qian H., Liu D. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 602.
294.Raflin G., Jenneret B., Mageri F. // Annual Meeting of the Cervical Spine Research Society. European Section. - St Gallon, Switzerland, 1989.
295.Ramon-Cueto A., Cordero M.I., Santos-Benito F.F., Avila J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron 2000; 25: 425-435
296.Ramon-Cueto A., Plant G.W., Avila J., Bunge M.B. Long-distance axonal regenera-tion
in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants. J
Neurosci 1998; 18: 3803-3815
297.Raynor R. B. // Spine. - 1977. - Vol. 2. N 1. - P. 39-43.
298.Reference Manual for the International Standards for Neurological and Functional Classification of Spinal Cord Injury. American Spinal Injury Association/International Medical Society
of Paraplegia. - Chicago, 1994.
299.Reier P.J., Houle J.D. The glial scar. Its bearing on axonal elongation and transplanta-tion
approaches to CNS repair. In: Waxman SG ed. Advances in Neurology: Functional Recov-ery in
Neurological Disease. New York: Raven Press. 1988; 47: 87-137.
300.Reshik D. K., Grahan Ss.ff., Dixon C. 1., Marion D. W. // Ibid. - 1998. - Vol. 15, N 12. P. 1005-1011.
301.Rizzolo S. /., Piaw M. R., CotlerJ. M. et al. // Spine. - 1991.-Vol. 16, N6.-P. 187-189.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
64
302.Rjsenblum W. I, // Ibid. - 1997. - Vol. 14, N 5. - P. 313-326.
303.RoafR. // J. Bone Jt Surg. - 1960. - Vol. 42. - P. 810-823.
304.Robertson P. A., Ryan M. D. // 3. Bone Jt Surg. - 1992. - Vol. 74. - P. 224-227.
305.Rosenberg L. J., WrathalJ. R. // Ibid. - N 11. - P. 823-838.
306.Rosenblutch J. R., SchiffR.. Liang W. L. et al. // Ibid. - 1995. -Vol. 12, N 5. - P. 972.
307.Rosser A.E., Tyers P., Dunnet S.B. The morphological development of neurons de-rived
from EGF- and FGF-2-driv-en human CNS precursors depends on their site of integration in the
neonatal brain // Eur. J. Neurosci. 2000. V. 12. P. 2405-2413.
308.Roy N.S., Wang S., Jiang L. et al. In vitro neurogenesis by progenitor cells isolated from
the adult human hippocampus // Nat. Medicine. 2000. V. 6. P. 271-278.
309.Ryan M. D., Henderson J. J. // Injury. - 1992. - Vol. 23. N 1.- P. 38-40.
310.Salto N., Wanatabe T.. Abe Y., Yamamoto T. Y. // Ibid. - 1998.- Vol. 15, N 1. - P. 74.
311.Saporta S., Sanberg P.R. Neural transplantation of human neuroteratocarcinoma (hNT)
neurons into ischemic rats. A quantitative dose-response analysis of cell survival and be-havioral
recovery. Neurosci 1999; 91: 519-525.
312.Savaskan N.E., Plaschke M., Ninnemann O., Spillmann A.A., Schwab ME, Nitsch R,
Skutella T. Myelin does not influence the choice bechaviour of entorhinal axons but strongly inhibits their outgrowth length in vitro. Eur J Neurosci. 1999 11 (1): 316-326
313.Savio T., Schwab M.E. Rat CNS white matter, but not gray matter, is nonpermissive for
neuronal cell adhesion and fiber outgrowth. J Neurosci. 1989 9 (4): 1126-33.
314.Sayers S.T., Khan N., Ahmed Y., Shahid R., Khan T. Preparation of brain-derived neurotrophic factor- and neurotrophin-3-secreting Schwann cells by infection with a retroviral vector. J Mol Neurosci 1998; 10: 143-160
315.Scharff C. Chasing fate and function of new neurons in adult brain // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. V. 10. P. 774-789.
316.Schultz K. D., McLaughlin M. R., Haid R. W. et al. // J. Neurosurg. - 2000. - Vol. 93. - P.
214-221.
317.Schumacher P. A.. EubanksJ. H., Fellings N. Ci'.//Ibid.- 1996. -Vol. 13, N 10.- P. 606.
318.Schwab M.E. Regenerative nerve fiber growth in the adult central nervous system. News
Physiol. Sci. 1998 13 (12): 294-298.
319.Schwab M.E. Structural plasticity of the adult CNS. Negative control by neurite growth
inhibitory signals. Int J Dev Neurosci. 1996 14 (4): 379-85.
320.Shankle W.R., Landing B.H., Rafii S. et al. Evidence for a postnatal doubling of neu-ron
number in the developing human cerebral cortex between 15 months and 6 years // J. Theo-ret.
Biol. 1998. V. 12. P. 293-300.
321.Shetty A.K., Turner D.A. In vitro survival and differentiation of neurons derived from
epidermal growth factor-responsible postnatal hippocampal stem cells: inducing effect of brainderived neurotrophic factor // J. Neurobiol. 1998. V. 35. P. 395-425.
322.Shibayama M., Matsui N., Himes B.T., Murray M., Tessler A. Critical interval for rescue
of axotomized neurons by transplants. Neuroreport 1998; 9: 11-14.
323.Short D. /., Mostly W. S. E. L, Jones P. W. // Spinal Cord. -2000. - Vol. 38. - P. 273-286.
324.Shuman S. L., Bresnahan J. C., Beatie M. S. // Ibid. - 1997.- Vol. 14, N 10. - P. 774.
325.Simpson M. J., Sutton D., Rizzolo S. J., Cotler J. // Surgery of the Cervical Spine / Eds
H. S. An, M. J. Simpson. - Baltimore, 1994. - P. 267-291.
326.Smaivimi T., Kossis J. D., Waxman S. G. // Ibid. - 1997. - Vol. 14, N 5. - P. 299-311.
327.Spinal Cord Injury: Medical Management and Rehabilitation / Ed. G. M. Yarkony. Gaithersburg, 1994.
328.Springer R., Azbill D. A., Mark R. J. et al. // Ibid. - P. 773.
329.Staas W. E., Formal C. S. et al. Rehabilitation of the spkial cord-injured patient / Ed. J.
A. De Lisa. - Philadelphia, 1993. - P. 886-915.
330.Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injured Patients. American Spinal Cord Injury Association, - Chicago, 1992.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
65
331.Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injured Patients. American Spinal Cord Injury Association. - Chicago, 1982.
332.Sugar O., Gerard R.W. Spinal cord regeneration in the rat. J Neurophysiol 1940; 3: 1-19
333.Sun X., Maxwell W. L. // Ibid. - P. 788.
334.Sutterlin C. E. Ill, McAfee P. C, Warden K. E. et al. // Spine. - 1988. - Vol. 13. - P. 795802.
335.Svendsen C.N., Caldwell M.A. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation. Brain Pathol 1999; 9: 499-513.
336.Svendsen C.N., Caldwell M.A., Ostenfeld T. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation // Brain Pathol. 1999. V. 9. P. 499-513.
337.Svendsen C.N., Smith A.G. // New prospects for human stem-cell therapy in the nervous
system // Trends Neurosci. 1999. V. 22. P. 357-364.
338.Takahaschi J., Palmer Т.D., Gage F.H. Retinoic acid and neurotrophins collaborate to
regulate neurogenesis in adult-derived neural stem cells cultures // J. Neurobiol. 1999. V. 38. P.
65-81.
339.Tanapat P., Hastings N.B., Reeves A.J. et al. Estrogen stimulates a transient increase in
the numbers of new neurons in the dentate gyrus of the adult female rat // J. Neurosci. 1999. V.
19. P. 5792-5801.
340.Tello F. La influencia del neurotropismo en la regenevaciуn de los centros nerviosos.
Trab Inst Cajal Invest Biol t. 9, 1911
341.Temple S., Alvarez-Buylla A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system
// Curr. Opin. Neurobiol. 1999. V. 9. P. 135-141.
342.Teng Y. D., Wralhall J. R. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 605.
343.Terman T. R., Wang X. M.. Martin G. F. // Ibid. - P. 628.
344.Tessler A., Fischer I., Giszter S., et al. Embryonic spinal cord transplants enhance locomotor performance in spinalized newborn rats. Adv Neurol 1997; 72: 291-303.
345.Theele DP., Schrimsher G.W., Reier P.J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol 1996; 142: 128-143.
346.Thompson I.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines de-rived
from human
347.Tissier-Lavigne M., Goodman C.S. Perspectives: neurobiology. Regeneration in the
Nogo zone. Science. 2000 287 (5454): 813-814.
348.Trojanowski J.Q., Mantione J.R., Lee J.H., et al. Neurons derived from a human teratocarcinoma cell line establish molecular and structural polarity following transplantation into
the rodent brain. Exp Neurol 1993; 122: 283-294.
349.Tuszynski M.H., Weidner N., McCormack M., et al. Grafts of genetically modified
Schwann cells to the spinal cord: survival, axon growth and myelination. Cell Transplant 1998;
7: 187-196
350.Uchida N., Buck D.W., He D. Direct isolation of human central nervous system stem
cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 14720-14725.
351.Vacanti C.A. Tissue-engineered spinal cord. Transplant Proc 2001 Feb-Mar; 33(1-2):
592-8.
352.Vaccaro A. R., Falatyn S. P., Flanders A. E. et al. // Spine. - 1999. - Vol. 24, N 12. - P.
1210-1217.
353.Van der Kooy d., Weiss 5. Why stem cells? // Science. 2000. V. 287. P. 1439-1441.
354.Van Praag H., Christie B.R., Sejnowski T.J. Running enhances neurogenesis, learn-ing,
and long-term potentiation in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 13427-13431.
355.Vescovi A.L., Parati E.A., Gritti A. Isolation and cloning of multipotential stem cells
from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell line
by epigenetic stimulation // Ex. Neurol. 1999a. V. 156. P. 71-83.
356.Vescovi A.L., Snyder E.Y. Establishment and properties of neural stem cells clones: plasticity in vitro and in vivo // Brain Pathol. 1999b. V. 9. P. 569-598.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
66
357.Vicario-Abejon C., Collin C., Tsoulfas P., McKay R.D. Hip-pocampal stem cells differentiate into excitatory and inhibitory neurons // Eur. J. Neurosci. 2000. V. 12, P. 677-688.
358.Wagner F. C. Jr., Chehrati B, // J. Neurosurg. - 1982. - Vol. 56. - P. 699-705.
359.Wallis R. A.', Pani^on K. L., Adams L A., Shin D. // Ibid. -1997. - Vol. 14, N 10. - P.
799.
360.Walters R. N., Adkins R. H., Nelson R., Garland D. // Contemp. Orthop. - 1987. - Vol.
14. - P. 35-45.
361.Wang Ch. X., Olschowks J. A., Wralhall J. R. // Ibid. - 1996. - Vol. 13, N 10. - P. 605.
362.Watanabe T., Yamamoto T., Abe J. et al. // Ibid. - 1999. - Vol. 16, N 3. - P. 255-265.
363.Watt F.M., Hogan B.L.M. Out of Eden: stem cells and their niches // Science. 2000. V.
287. P. 1427-1430.
364.Weider N., Blesch A., Grill R.J., Tuszynski M.H. Nerve growth factor-hypersecreting
Schwann cell grafts augment and guide spinal cord axonal growth and remyelinate central nervous system axons in a phenotypically appropriate manner that correlates with expression of L1. J
Comp Neurol 1999; 413: 495-506
365.Weigert C. Apoptosis, oncosis and necrosis an overview of cell death. Amer. J. Pathol.
1995. 146: 3-5.
366.Weiss C., Dunne C., Hewson J. et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult
mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 7599-7609.
367.White A. A., Southwick W. 0., Panjabi M. M. // Spine. - 1976. -Vol. l.-P. 15-27.
368.Whittemore S.R. Neuronal replacement strategies for spinal cord injury. J Neuro-trauma
1999; 16: 667-673.
369.Whittemore S.R., White L.A. Target regulation of neuronal differentiation in a temperature-sensitive cell line derived from medullary raphe. Brain Res 1993; 615: 27-40.
370.Wickelgren I. Stem cells. Rat spinal cord function partially restored. Science 1999; 286:
1826-1827.
371.WilbergerJ. //J. Neurotrauma. - 1991. - Suppl. 1. - P. S21- S28.
372.Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent
stem cell line derived from mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 212-219.
373.Xu X.M., Chen A., Guenard V., Kleitman N., Bunge M.B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult
rat spinal cord. J Neurocytol 1997; 26: 1-16
374.Xu X.M., Guenard V., Kleitman N., Bunge M.B. Axonal regeneration into Schwann cellseeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol 1995; 351:
145-160
375.Yam P. S.. Dewar D., McCulloch J. // Ibid. - 1997. - Vol. 14. N 10. - P. 788.
376.Yong C., Arnold P. M., Zoubine M. N. et al. // Ibid. - 1998. -Vol. 15, N 7. - P. 459-472.
377.Yoon K. W., Fuse T., Shan P. T. et al. // Ibid. - N 2. -P. 141-147.
378.Young J. S., Dexter W. R. // Paraplegia. - 1978. - Vol. 16. -P. 39-49.
379.Young W. Acute, restorative, and regenerative therapy of spinal cord injury. Piep-meier
JM, ed. The outcome following traumatic spinal cord injury. Mount Kisco, NY: Futura, 1992. p.
174-197.
380.Younkin D.P., Tang C.M., Hardy M., et al. Inducible expression of neuronal gluta-mate
receptor channels in the NT2 human cell line. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 2174-2178.
381.Zhang Shaocheng M. D. // Workshop Held at the Ministry for Foreign Affairs in Iceland. - Reykjavik, Abe Y., Sugiyama J., Kayama H. et al. // J. Neurolrauma. -1998. -Vol. 15, N
1. - P. 55.
382.Zompa E. A., Piw D. P., Pere-Polol R., Halsebosch C. E. // Ibid. - 1995. - Vol. 12, N 5. P. 973.
383.Zompa E. F., Cain L. D., Eleverhart A. W. et al. // Ibid. - 1997.- Vol. 14, N 8. - P. 479506.
Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий
384.Zompa E. F., Moyer M. P.. Cain L. et al. // Ibid. - 1996
67