Эпикриз применения гемопоэтических стволовых клеток
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научноисследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» на правах рукописи Кобзева Ирина Владимировна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Астрелина Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук Бубнова Людмила Николаевна - доктор медицинских наук, профессор Санкт-Петербург 2014г. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………4 ГЛАВА I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...12 1.1. Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток……………………………………..12 1.2. Создание банков пуповинной крови…………………………………………..16 1.3. Сбор и обработка пуповинной крови…………………………………………18 1.4. Тестирование концентратов пуповинной крови…………………………….22 1.5. Криоконсервирование и долгосрочное криохранение клеток пуповинной крови…………………………………………………….............26 1.5.1. Криопротекторы………………………………………………………………..28 1.5.2. Этапы замораживания и долгосрочное криохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови………………………………………………..31 1.6. Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови………………………………………………………………………………..….33 1.7. Клиническое применение криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови…………………………...35 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………..40 2.1. Материал исследования………………………………………………………..40 2.2. Методы исследования………………………………………………………….46 2.3. Статистическая обработка результатов……………………………………….49 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………51 3.1. Биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»……………………………………………………………….51 3.1.1. Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови ……………51 3 3.1.2. Влияние методов лейкоконцентрации на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» ………………………………………………………………55 3.1.3. Влияние величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»………………………………………………………………59 3.1.4 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»………………………………….….63 3.2. Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови……………...67 3.3. Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве…………………………………………………………………………71 3.3.1. Особенности общественного регистра доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови……………………………………………………...71 3.3.2. Анализ применения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови………………………………………………………83 3.4. Алгоритм работы общественного банка-регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови ……………………………………………………………89 ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…….…………………………………………………92 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………103 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………105 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………..106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...…108 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Эффективность первых аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) пуповинной крови (ПК) у пациентов с различными заболеваниями привела к широкомасштабному развитию клинических исследований в данной области (Gluckman Е., 2009; Kurtzberg J., 1994, 1996; Wagner J.E., 1996; Rubinstein Р., 2009; Broxmeyer, H.E., 2011). Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности их заготовки, на сегодняшний день ПК стала одним из наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во многих странах мира (Gluckman Е., 2011; Ballen K., 2013). Ежегодно в мире проводится более 3000 алло-ТГСК ПК пациентам с различными заболеваниями (Rocha V., Broxmeyer H.E., 2010). С целью обеспечения систематической заготовки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ПК для длительного криохранения и использования их в клинической практике было создано 160 успешно функционирующих банков ПК, в которых на криохранение находится более 600 000 тестированных образцов ПК (Rubinstein P. 2009; Welte K., 2010; Lauber S. et al, 2010; Wagner J.E., Gluckman E., 2010; URL:http://www.bmdw.org/). Современная система банков ПК позволяет в короткие сроки накопить большое количество тестированных образцов ПК, создать общественный регистр) и подобрать подходящего донора для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК (Navarrete C., 1998; Armitage S., 1999; Brown J., 2000; Davey S., 2004, Бубнова Л.Н., 2008). Успех алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества криоконсервированных ГСК ПК (Wagner J.E., 2002; Gluckman Е., 2005; Абдулкадыров К.М., 2006). Для оценки качества ГСК ПК в США, Италии и Японии были проведены исследования, которые продемонстрировали высокий процент сохранения ГСК во время криохранения (Вroxmeyer H.E. 2003, 2011; Zinno F., 2011). Рядом зарубежных авторов были показаны преимущества криохранения концентратов 5 пуповинной крови в автоматизированном системе «BioArchive» и «miniBioarchive» (Rubinstein P., 2004; Miura J., 2008). В России аналогичные исследования единичны. В 2012 году были представлены данные по оценке сохранности CD45+, CD45+/СD34+ клеток, колониеобразующей способности ГСК ПК и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание) и краткосрочного криохранения (Карпова Н.С, 2012). Также было проведено исследование по изучению влияния метода выделения ядросодержащих клеток (ЯСК) на ГСК ПК (сохранность и жизнеспособность CD45+, CD45+/СD34+ клеток) до и после криохранения в течение 7,0 ±0,42 месяцев (Хурцилава О.Г., 2012). Одним оптимального из наиболее перспективных комбинированного направлений криопротектора, является способного поиск сохранить качество ГСК ПК для дальнейшего клинического применения (Cilloni D., 1999; Galmes A., 1999; Halle P., 2001; Bakken A.M., 2003). В России было проведено только одно исследование по оценке влияния стандартного комбинированного криопротектора ДМСО в сочетании с декстраном 40 (Pall, Великобритания) на качество ГСК ПК (Смолянинов А.Б., 2009). Степень разработанности темы. Вышеизложенные данные не охватывают весь комплекс по оценке качества ГСК ПК, необходимый для более полной характеристики трансплантационного материала. Не завершены исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность ГСК ПК после криохранения. Востребовано постоянное получение новых данных о распределения частоты HLA - гаплотипов в регистре банков ПК для целенаправленного поиска доноров ПК, что особенно актуально для многонациональной России. Все это обуславливает актуальность настоящего исследования. 6 Цель исследования Оценить качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в автоматизированном системе «BioArchive®», для клинического применения. Задачи исследования 1. Изучить клеточный состав концентрата пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток (количество CD45+/СD34+ клеток, жизнеспособность СD45+ клеток, колониеобразующую активность) до и после длительного криохранения. 2. Определить влияние методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 3. Исследовать влияние отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, на качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 4. Проанализировать иммуногенетические характеристики общественного регистра и эффективность подбора гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве. 5. с Разработать алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток клиническими центрами, адаптированный здравоохранения в Российской Федерации и к условиям организации с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release). Научная новизна работы Впервые в России представлена комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 7 (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®». Изучение биологических клеточного состава характеристик концентрата гемопоэтических пуповинной стволовых крови клеток и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» показало, что общее количество ядросодержащих клеток незначительно снижается, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови сохраняется на достаточно высоком уровне. Это позволяет использовать клеточный концентрат пуповинной крови в качестве альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток. Выявлено, что на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» влияют метод выделения, величина гематокрита после лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA в концентрате пуповинной крови перед криохранением. Установлено, что отечественный комбинированный криопротектор ДМСО+реополиглюкин позволяет сохранять высокое качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения и может использоваться для длительного криохранения. Впервые проанализирован характер распределения HLA-гаплотипов в общественном регистре гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москвы и показано, что характер распределения в целом соответствует славянам центральной и восточной Европы, а частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3- генам HLA - системы (локусы А, В, DRB1) составляет 1:218. Впервые разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT. 8 Теоретическая и практическая значимость Криоконсервированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» являются качественным материалом и могут быть использованы в клинической практике. В результате проведенного исследования установлены факторы, влияющие на клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», которые необходимо учитывать при использовании клеточных концентратов пуповинной крови в клинической практике: метод выделения ядросодержащих клеток, величина гематокрита после процесса лейкоконцентрации и содержание гемоконсерванта CPDA до криохранения. Иммуногенетические особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Московского банка стволовых клеток позволяют проводить целенаправленный поиск совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для пациентов из различных регионов России. Предложенный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD -FACT позволит усовершенствовать работу в подобных учреждениях. Методология и методы исследования В работе были использованы общенаучные (анализ проспективный и ретроспективный, обобщение данных) и частные научные методы (лабораторные, клинические), а так же методы математической статистики. На первом этапе исследования были изучены клеточный состав концентрата пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых 9 клеток до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», было выявлено влияние методов обработки, содержания гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения. Далее была установлена целесообразность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, криохранения. Был при заготовке проведен пуповинной анализ крови для иммуногенетических длительного характеристик общественного регистра, включающий характер распределения HLA-гаплотипов и эффективность подбора совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москве. На заключительном этапе проведенной работы был разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT. Положения, выносимые на защиту 1. Предложенный комплекс по оценке биологических характеристик криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» всесторонне характеризует качество трансплантационного концентрация криохранением материала. гемоконсерванта оказывают Методы CPDA влияние и на обработки пуповинной крови, величина гематокрита перед биологические характеристики криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 2. Комбинированный отечественный криопротектор ДМСО+реополиглюкин, предложенный в Московском банке стволовых клеток, является эффективным криоконсервирующим раствором и может использоваться для длительного криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 3. Алгоритм взаимодействия клиническими центрами, Московского банка стволовых клеток адаптированный к условиям с организации 10 здравоохранения рекомендаций в Российской NETCORD-FACT, Федерации с учетом усовершенствует международных работу общественных регистров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в подобных учреждения. Степень достоверности и апробация результатов диссертации Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки. Апробация диссертации проведена 4 марта 2014 г. на расширенном заседании Проблемной комиссии №3 ФГБУ «Российский исследовательский институт гематологии и трансфузиологии научно- Федерального медико-биологического агентства». Материалы диссертации доложены на: XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011г.), международном симпозиуме «ACUTE LEUKEMIAS XIII Biology and Treatment Strategies» (Мюнхен, 2011г.), 37 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Париж, 2011г.), на международном V симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых памяти Раисы Горбачевой» (Санкт-Петербург, 2011г.), на V научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2011г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии» (Беларусь, 2011г.), на XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013г.), на VII Московском международном перспективы развития» конгрессе (Москва, «Биотехнология: 2013г.), 8th East-West состояние и «Immunogenetics conference» (Вена, 2014). Внедрение результатов в практику Результаты исследования были внедрены в практику работы Государственного Бюджетного Учреждения Здравоохранения «Банка стволовых 11 клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» и Научно-Исследовательского института детской Р.М.Горбачевой онкологии, гематологии Санкт-Петербургского и трансплантологии государственного им. медицинского университета им. акад. И. П. Павлова (ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова). Результаты диссертационной работы войдут в Методические рекомендации “Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORDFACT”. 12 ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток за последние 50 лет прочно вошла в практическую медицину как эффективный метод лечения заболеваний крови, иммунной системы, нарушений обмена веществ и онкологических заболеваний [46;69]. Во всем мире ежегодно количество проведенных трансплантаций увеличивается, а показания к данному виду терапии расширяются. Во многом эффективность алло-ТСГК зависит от наличия гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора. При этом, чем выше результаты индивидуальной совместимости пациента и донора по генам HLA-системы, тем меньше риск отторжения трансплантата в связи с преодолением биологической несовместимости тканей [14;17]. «Золотым» источником ГСК для алло-ТГСК является костный мозг (КМ) от гистосовместимого родственного донора, но вероятность найти внутри семьи HLA – идентичных сиблингов составляет лишь 25%, а найти подходящего неродственного донора, несмотря на наличие более 20 млн. зарегистрированных добровольных доноров костного мозга во всем мире [URL:http://www.bmdw.org/], удается не более чем в 30% случаев [15;21]. Для представителей некоторых групп эта возможность еще меньше, так как часть встречаемых HLA - аллелей и гаплотипов являются общими для этнических популяций; а другие преимущественно принадлежат какой-то одной популяционной группе [7]. Поэтому поиск неродственного HLA-совместимого донора – это весьма трудоемкий и длительный процесс, связанный с существенными временными и финансовыми трудностями. В среднем подбор донора может занимать около 3-4 месяцев, и зачастую пациент просто не доживает до трансплантации [1;51;59;63;80;118]. Другими серьезными проблемами являются тяжелые посттрансплантационные осложнения, которые существенно ограничивают успех алло-ТГСК костного мозга и вызваны несовместимостью иммунокомпетентных 13 клеток донора и реципиента. В первую очередь это отторжение трансплантата и развитие острой реакции «трансплантат против хозяина» (о. РТПХ). Зачастую они носят жизнеугрожающий характер, становясь основными причинами неудач и нежелательных отсроченных явлений. Перечисленные ограничения применения клеток костного мозга привели к поиску альтернативных источников ГСК, и одним из наиболее перспективных является пуповинная кровь (ПК). В течение последних 25 лет ПК активно используется во многих странах мира для лечения пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями [57]. Благодаря впервые успешно выполненной родственной алло-ТГСК предварительно криоконсервированной цельной ПК ребенку с анемией Фанкони от HLA-идентичного донора [64] удалось доказать, что одна единица ПК, ранее считавшаяся «биологическим отходом», содержит достаточное количество ГСК и ранних предшественников гемопоэза, способных восстановить кроветворение после миелоаблативной терапии. При этом было показано, что стволовые клетки ПК сохраняют свои биологические характеристики после криоконсервации [35;64]. На сегодняшний день в мире было выдано более 30 000 образцов ПК от родственных и неродственных доноров для проведения алло - ТГСК [21] пациентам с различными заболеваниями (Таблица 1) [27;45;49;50;52;73;77;83;87;89;107;128;135]. Таблица 1 Заболевания, при которых возможно применение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Злокачественные заболевания Острый лимфобластный лейкоз Острый миелобластный лейкоз Лимфома Ходжкина Хронический лимфолейкоз Ювенильный хронический миелолейоз Нейробластома Неходжинские лимфомы 14 Продолжение Таблицы 1 Множественная миелома Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз Синдром костно-мозговой недостаточности Анемия Фанкони Миелодиспластический синдром Гипопластическая анемия Даймонда-Блекфена Серповидно-клеточная анемия Апластическая анемия Иммунодефицитные состояния Первичный иммунодеффицит, тяжелая комбинированная иммунная недостаточность Первичный иммунодеффицит, Вискотт-Олдрич синдром Первичный иммунодеффицит, Омен синдром Гемаглобинопатии Талассемия Первичные нарушения метаболизма и обмена веществ Мукополисахаридоз Адренолейкодистрофия Метахроматическая лейкодистрофия 1.1. Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток Результаты трансплантаций ГСК ПК, которые были проведены за последние 20 лет, показали, что ПК обладает рядом неоспоримых преимуществ, перед другими источниками ГСК. Во-первых, клетки ПК с иммунофенотипом CD34+/CD38- обладают более высоким пролиферативным потенциалом и имеют более высокий ответ на действие ряда цитокинов (ИЛ-3, ИЛ-6 и КСФ). Они способны воспроизводить в 7 раз больше колоний в долгосрочных культурах, чем аналогичные клетки костного мозга [32;40;70;74;84;85;133]. Во-вторых, риск возникновения и частота развития острой и/или хронической «реакции трансплантат против хозяина» ниже, даже при использовании ГСК ПК от частично совместимых доноров по генам HLA – системы (со степенью совместимости 5/6-4/6), чем при трансплантации ГСК костного мозга от полностью совместимых доноров (со степенью совместимости 15 8/8) [49;58;81;82;134]. Это объясняется наличием в ПК менее зрелых и менее функционально активных имуннокомпетентных клеток и их более низкой концентрацией по сравнению с другими источниками ГСК. Так, большинство Тклеток ПК экспрессируют «наивный» иммунофенотип - CD45RA+/CD45RO-, CD62L, в отличие от аналогичных клеток костного мозга и периферической крови. Клетки с иммунофенотипом CD8+ в ПК либо вообще не определяются, либо содержатся в очень малом количестве. [40;130]. СD4+ клетки (Т-хелперы) ПК способны синтезировать интерлейкин- 10 и хемокиновый рецептор-5 (ССR5) в большем объеме, что объясняет противовоспалительные свойства ПК [16;92]. В-лимфоциты ПК в основном презентируют пустые молекулы HLA - антигенов второго класса, в то время как В-лимфоциты взрослых нагружены пептидами. Синтез противовоспалительного интерлейкина-12 мононуклеарными клетками (МНК), являющимся ключевым цитокином для усиления клеточно- опосредованного иммунного ответа и инициации, существенно снижен при сравнении с другими источниками ГСК [130]. В-третьих, заготовка ПК не требует проведения общей анестезии и стимуляции кроветворения гранулоцитарно - колониестимулирующими факторами (Г-КСФ) у донора. Риск для здоровья матери и новорожденного при сборе ПК отсутствует. В- четвертых, возможность длительного хранения большого количества полностью тестированных образцов ПК позволяет в максимально короткие сроки подобрать и доставить необходимые образцы ПК в клинические центры [101,127]. В-пятых, в связи с проведением тщательного вирусологического и бактериального контроля на всех этапах обработки ПК, риск передачи трансмиссивных инфекций при применении криоконсервированных ГСК ПК минимален. В-шестых, использование небольших объемов криопротектора ДМСО для заготовки ГСК ПК приводит к сокращению побочных реакций у реципиента на фоне введения криоконсервированной ПК [120]. 16 Однако в ходе проведенных клинических исследований по применению ГСК ПК [23;64;113] был выявлен и ряд недостатков, который в настоящее время сдерживает ее широкое использование. Прежде всего, это ограниченное количество ГСК в одном образце криоконсервированной ПК и отсутствие возможности повторного сбора клеток у донора. Это существенно ограничивает использование ПК у пациентов с массой тела более 20 кг. Во-вторых, было отмечено увеличение периода миелотоксического агранулоцитоза и тромбоцитопении после алло-ТГСК ПК по сравнению с другими источниками ГСК, что сопряжено с высоким риском развития оппортунистических инфекций [58;113;121]. И в-третьих, отсутствие возможности трансфузии донорских лейкоцитов. Безусловно, выявленные недостатки ограничивают широкое использование ПК в качестве альтернативного источника ГСК. Однако уникальные свойства ее клеток, усовершенствование методов обработки и криоконсервации, внедрение единых стандартов в работу банков ПК, улучшение подборов образцов ПК для клинического применения, возможность использования нескольких единиц ПК при недостаточном количестве ГСК, позволяют надеяться, что некоторые из этих проблем будут разрешены в ближайшем будущем. Во многих лабораториях мира продолжаются многочисленные исследования, направленные на изучение микроокружения и взаимодействия между собой стволовых клеток ПК, идет поиск путей увеличения количества ГСК в одном образце ПК, как за счет усовершенствования методов забора, так и за счет разработки методов их экспансии in vivo и/или ex vivо [39]. 1.2. Создание банков пуповинной крови Для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов ПК для клинического применения были созданы банки ПК. 17 История развития банков ПК началась с лаборатории микробиологии и иммунологии штата Индиана (США) под руководством профессора Broxmeyer H.J., который стал инициатором развития данной программы. В его лаборатории на хранение были заложены первые образцы ПК от родственных доноров. Были разработаны методы сбора и хранения цельной ПК, которые продемонстрировали возможность транспортировки образцов ПК между различными центрами, оценили биологические свойства ГСК и их пролиферативный потенциал [16;31]. В последующем, с ростом числа алло-ТГСК ПК, для расширения коллекции криоконсервированных образцов ПК и улучшения качества подборов пары донорреципиент, появилась необходимость развития программ по безвозмездному донорству и открытию государственных банков ПК [119]. Первые государственные банки ПК появились в начале 90-х годов Нью-Йорке, Милане и Дюссельдорфе [20], а в последующем и во многих странах мира. В Нью-Йоркском центре крови под руководством Р. Rubinstein, был разработан первый протокол по обработке, криоконсервированию, хранению и разморозке криоконсервированных образцов ПК [120], который до настоящего времени является основным документом при заготовке ПК во многих странах мира. Сегодня по данным Всемирной организации доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW) в различных странах мира насчитывается 158 государственных банков ПК где на криохранении находится более 600 000 полностью тестированных образцов ПК [URL:http://www.bmdw.org/; 87;102;124;136]. В связи с появлением большого числа банков ПК в 1998 году была учреждена группа NETCORD, призванная обеспечить соблюдение условий криохранения ПК, в соответствии со стандартами GMP (Good Medical Practice), создать международную сеть и облегчить поиск доноров ГСК ПК, улучшить качество трансплантационного материала и стандартизировать их в международном масштабе, и, что особенно важно, установить процедуры аккредитации банков ПК совместно с Международным Фондом Аккредитации Клеточной Терапии (FACT) [URL:http://www.netcord.org/]. 18 В 2000 году группой NETCORD-FACT впервые были разработаны международные стандарты для аккредитации банков ПК по сбору, обработке, тестированию, заготовке, подбору и выдачи образцов ПК для клинического применения – International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release [URL:http://www.factweb.org/]. В настоящее время в мире 18 банков ПК уже получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [URL:http://www.netcord.org/,109]. Таким образом, на сегодняшний день вся информация о доступных криоконсервированных образцах ПК, заготовленных в банках ПК, содержится в двух взаимосвязанных международных регистрах: в NETCORD - информация только о криоконсервированных образцах ПК, и во всемирной организации доноров костного мозга (BMDW), где содержится информация как о донорах костного мозга, так и о доступных единицах ПК [102]. Первостепенной задачей, которая стоит перед современными банками ПК является усовершенствование методов забора, выделения, криоконсервирования, хранения и разморозки ПК, с соблюдением контроля качества на каждом этапе согласно стандартам NETCORD, чтобы обеспечить трансплантационные центры высококачественным и безопасным материалом с максимальным количеством жизнеспособных стволовых клеток. Это приведет к дальнейшему прогрессу в области клеточной терапии и позволит улучшить клинические результаты [110]. 1.3. Сбор и обработка пуповинной крови Учитывая, что наиболее существенным ограничением широкого использования ПК является лимитированное количество ГСК в одном образце ПК, которое строго коррелирует с объемом заготовленного материала [1;12;140], основной задачей на данном этапе является сбор максимально возможного количества стволовых клеток для получения качественного трансплантационного материала [112;117]. Как правило, объем ПК, подлежащей обработке и дальнейшему криоконсервированию, устанавливается в каждом банке индивидуально в 19 соответствии с программами их работы и требованиями трансплантационных центров [102]. Однако, учитывая, что скорость восстановления гемопоэза после трансплантации ГСК ПК напрямую зависит от количества заготовленных ГСК [62;135], большинство банков ПК предпочитают оставлять на долгосрочное криохранение образцы с чистым весом более 40-70 г и количеством выделенных ядросодержащих клеток (ЯСК) не менее 3х107/кг [58;64;135]. Сбор ПК осуществляется после получения информированного согласия роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа в закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин) [URL:http://www.netcord.org/; 120]. На сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о влиянии гемоконсерванта CPDA на качество ГСК ПК. Единственное исследование, которое было проведено польскими исследователями, выявило умеренную токсичность CPDA на CD45+/CD34+ клетки при увеличении времени его взаимодействия с ПК [93]. Транспортировка ПК должна осуществляться при температуре от +4С до +22С; обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора, так как при увеличении сроков хранения жизнеспособность ГСК существенно снижается [URL:http://www.netcord.org/; 13;31;32;126] Первоначально, для обработки ПК и выделения ЯСК использовали протоколы, разработанные для выделения МНК КМ. При этом ПК подвергалась криоконсервированию без предварительной обработки сразу после добавления криоконсерванта ДМСО. Это позволяло сохранить до 100% ЯСК [31], однако привело к ряду существенных проблем [120]: 1. Большой объем заготавливаемого материала требовал большого криогенного хранилища и существенных финансовых затрат. 2. Криоконсервирование цельной ПК подразумевало введение больших объемов криопротектора ДМСО, что снижало его защитные функции на стволовые клетки и увеличивало риск развития побочных эффектов при трансплантации ГСК ПК. 20 3. Продукты лизиса эритроцитов и гранулоцитов, образующиеся во время процессов замораживания и размораживания, неблагоприятно влияли на жизнеспособность ГСК. 4. Увеличивался риск развития реакции несовместимости между донором и реципиентом по эритроцитарным антигенам. После проведения серий успешных трансплантаций ГСК ПК, получения доказательств ее эффективности и безопасности, во многих банках ПК начались разработки по модификации протоколов криоконсервирования. В 1995 году в качестве основного протокола обработки ПК для клинического применения, был предложен неавтоматический метод (ручной способ) сепарации ПК, основанный на увеличении скорости седиментации эритроцитов путем добавления к цельной ПК 6% гидроксиэтилкрахмала с последующим двойным центрифугированием на низких скоростях и сепарацией ЯСК [26;48;71;106;120]. Данный метод позволил сократить объем цельной ПК до 20 - 21 мл с сохранением до 90% ЯСК в жизнеспособном состоянии, существенно сократить объемы вводимого криоконсерванта, уменьшить финансовые затраты на криохранение [86;112;120]. На сегодняшний день ручной способ обработки пуповинной крови остается одним из наиболее распространенных во многих странах мира. Современным направлением при обработке ПК стало использование автоматических систем для выделения ЯСК, которые значительно сократили время процедуры, практически полностью исключили риск микробиологической контаминации и потери образца. В настоящее время наиболее распространены две технические системы – «Sepax» (Biosafe, Eysins, Switzerland) и «AutoЕхpres» (Termogenesis). Они представляют собой закрытые стерильные системы для обработки образца ПК любого объема. Принцип действия аппаратов основан на сепарации клеточных элементов путем центрифугирования на низких скоростях после добавления гидроксиэтилкрахмала («Sepax») или без него («AutoЕхpres»). Это позволяет разделять компоненты крови в соответствии с их плотностью и размерами. После центрифугирования эритроциты перемещаются в отдельный 21 стерильный мешок, плазма остается в обрабатываемом контейнере, а полученный лейкоконцентрат в объеме 21 мл помещается в специализированный контейнер для дальнейшего криоконсервирования. Автоматический метод с использованием «Sepax» позволяет сократить уровень исходного гематокрита до 36-45%, сохранить до 80-87% ЯСК и до 86% клеток с иммунофенотипом СD45+/CD34+ [URL:http://www.biosafe.ch/; 86;116]. Эти результаты были подтверждены и в работах отечественных авторов при сравнении эффективности автоматического и неавтоматического методов сепарации крови [7]. В проведенных на сегодняшний день исследованиях не достаточно представлены данные о влиянии величины гематокрита после лейкоконцентрации на качество криоконсеврированных ГСК ПК после размораживания. Существует единственная публикация о влиянии величины гематокрита в криоконсервированных образцах ПК на жизнеспособность и пролиферативную активность ГСК после разморозки. В своем исследовании группа ученых показала, что в криоконсервированных образцах ПК с величиной гематокрита 45% пролиферативная активность ГСК снижалась до 40% по сравнению с образцами ПК с величиной гематокрита 23% [108]. В 2012 году отечественными авторами было проведено исследование о влиянии методов двойного центрифугирования (55 образцов ПК) и автоматической сепарации (30 образцов ПК) на качество ГСК ПК после размораживания. Замораживание образцов ПК осуществлялось в программном замораживателе с последующим погружением в дьюар с жидким азотом. В результате исследования при сравнении обеих групп было показано преимущество использования автоматического метода выделения ЯСК. Процент сохранения СD45+ и СD45+/CD34+ клеток составил 91,7% и 91,34% против 82,1% и 85,27% соответственно; жизнеспособность ЯСК 89,3% против 82,7%) [12]. Таким образом, на данном этапе обработки ПК, независимо от применяемого метода лейкоконцентрации, первостепенной задачей является заготовка качественного трансплантационного материала с сохранением 22 максимального количества ГСК в биологически полноценном состоянии [112;117]. 1.4 Тестирование концентратов пуповинной крови Согласно стандартам NETCORD-FACT современные банки ПК должны обеспечить надлежащий контроль за качеством заготовленного материалом, который включает: Вирусологический и бактериальный контроль. Учитывая наличие глубокой иммуносупрессии у реципиентов ГСК, любая бактериальная и/или вирусная контаминация концентратов стволовых клеток может привести к неконтролируемым, зачастую фатальным инфекционным процессам. Поэтому на всех этапах обработки ПК требуется строгий бактериальный и вирусологический контроль (Таблица 2). Таблица 2 Маркеры инфекционных заболеваний для тестирования крови матери и пуповинной крови Материнская кровь HIV 1 и 2 типов (АТ+ПЦР) HCV (AT) HBV (HBsAg+anti-Hbcor+ПЦР) HTLVA 1и 2 типов (АТ) Сифилис (АТ) CMV IgG - Пуповинная кровь Анти-HIV 1 и 2 типов Анти –HCV HBsAg+anti-HbcAg CMV IgG+ПЦР Анти-HTLVA 1и 2 типов Сифилис (АТ+RPR) Бактериологический контроль Первоначально у роженицы тщательно исследуется соматический статус, анамнез. Ее кровь тестируется на наличие возбудителей инфекционных заболеваний, которые могут передаваться гематогенным путем: вирус иммунодефицита человека (HIV), вирусный гепатит В (HBV) и С (HCV), Тклеточный лимфотропный вирус человека, Treponema pallidum (возбудитель сифилиса), цитомегаловирус. В случае получения 23 положительных/неопределенных результатов исследований образцы ПК не допускаются до криохранения и клинического применения. Определение гемопоэтического потенциала клеток пуповинной крови Скорость восстановления гемопоэза у реципиентов ГСК строго коррелирует от количества и качества трансплантируемых стволовых клеток [58;64;65]. Учитывая, что первичное (раннее) восстановление кроветворения обеспечивается в основном за счет функции клеток-предшественников, а за долгосрочное восстановление гемопоэза и имунной системы ответственны уже ГСК, их количество и качество после криохранения являются наиболее важными характеристиками гемопоэтического потенциала трансплантата. 1. Общее количество ядросодержащих клеток Наиболее важным показателем качества трансплантационного материала является общее количество ЯСК в криоконсервированном образце пуповинной крови [24;61]. Ранее считалось, что для восстановления гемопоэза у реципиента ГСК минимальное количество ЯСК и клеток CD45+/CD34+ должно составлять 1,5х107/кг и/или 1,7х105/кг соответственно [14]. Согласно текущим мировым рекомендациям трансплантологов и всемирной организации доноров, при подборе образцов ПК для алло-ТГСК минимальная доза ЯСК может изменяться в зависимости от основного заболевания и степени HLA- совместимости пары донор и реципиент [110]. Минимальная клеточная доза при злокачественных заболеваниях составляет 2,5х107/кг ЯСК, при доброкачественных заболеваниях более 3,5х107/кг ЯСК [65]. С увеличением степени несоответствия по генам HLAсистемы между донором и реципиентом ГСК клеточную дозу следует увеличивать [22;110]. Однако необходимо отметить, что количество ЯСК может существенно изменяться в процессе криоконсервации и размораживании образцов ПК, а так же зависеть от технологических методов обработки пуповинной крови в каждом конкретном банке. Поэтому, количество ЯСК, рассчитанное до криоконсервации, 24 не может являться достоверным прогностическим фактором эффективности приживления трансплантата [22]. 2. Общее количество мононуклеарных клеток Для более точной характеристики трансплантационного материала в некоторых банках ПК используют показатель количества МНК. Прежде всего, от ЯСК они отличаются тем, что в их общей фракции отсутствуют полиморфонуклеарные клетки, такие как нейтрофилы. Количество МНК коррелирует с количеством CD45+/CD34+ клеток в образце ПК [97]. Поэтому количество МНК может быть использовано наряду с общим количеством ЯСК как показатель качества криоконсервирвоанного образца ПК. 3. Количество СD45+/CD34+ клеток Количество СD45+/CD34+ клеток в образце ПК строго коррелирует со cкоростью приживления трансплантата [88;135]. Стандартным методом определения ГСК ПК является наличие экспрессии мембранного маркера CD34 в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами. Однако его экспрессия не отражает истинный гемопоэтический потенциал трансплантата, так как концентрация ГСК в ней составляет не более 1% от общего числа ЯСК [3]. В ходе исследований по определению более точного иммунофенотипа ГСК, исследователям удалось выявить, что данные клетки можно обнаружить среди популяции клеток с иммунофенотипом CD34+/CD38-lineage-CD90+CD45RA- [94]. Но более полной характеристики иммунологического фенотипа ГСК человека на сегодняшний день не получено. Это связано с их способностью изменять свой иммунофенотип in vivo в зависимости от различных условий [39]. 4. Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток Оценка функциональной активности ГСК ПК, заключающаяся в определении колониеобразующей активности ГСК in vitro, является важным и надежным тестом качества заготовленной ПК [36]. В ряде зарубежных работ была выявлена взаимосвязь между скоростью приживления трансплантата у детей и количеством колониеобразующих единиц ГСК ПК [105;143]. 25 5. Оценка количества жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток Для определения жизнеспособности ГСК в большинстве банков ПК применяют методы с использованием красителей, способных проникать через цитоплазматические мембраны - трипановый синий [53;90;137], пропидия иодид [144] и 7-аминоактиномицин D (7-ADD) [110;142;143]. Известно, что в процессе замораживания и размораживания клеточная мембрана может обратимо изменять свои физические свойства и данные методы отражают лишь проницаемость мембран для этого красителя, но не истинное количество жизнеспособных клеток. Таким образом, для наиболее полной оценки трансплантационного материала необходимо учитывать: общее содержание ЯСК их жизнеспособность, количество CD45+/СD34+ клеток, и колониеобразующую активность ГСК до и после криоконсервации [43;99], что было подтверждено и во многих зарубежных клинических исследованиях [57;61;121;122;136]. HLA-генотипирование пуповинной крови Необходимым условием для проведения алло-ТГСК, является наличие гистосовместимого донора. По международным данным вероятность подбора совместимых доноров ГСК составляет 1:5000 [29;75], в РФ по данным Карельского регистра - 1:700 [5]. Частота и распределение HLA-гаплотипов в каждом национальном банке пуповинной крови значительно различается, что говорит об уникальном наборе гаплотипов в группах расовых и этнических популяций [9]. При анализе HLA-подборов ГСК ПК с учетом гаплотипов в 4 национальных банках пуповинной крови: Японии, Швеции, Бельгии и Финляндии было показано, что пациенты из этих стран могут подобрать в своем национальном банке донора ГСК ПК со степенью совместимости 5/6 по 3 генам HLA- системы в 80% случаях, тогда как при перекрестном подборе – не более чем 26% [30;68]. Учитывая уникальные иммунологические свойства ПК, подбор доноров возможно осуществлять всего по трем генам HLA- системы (A, В, DRB1) [39;115]. При этом проведение неродственной трансплантации ГСК ПК даже при 26 частичной совместимости пары донор-реципиент (степень совместимости 4/6-5/6) не приводит к увеличению частоты трансплантационной смертности и развитию острой РТПХ [60; 63;135]. Для успешного применения ГСК ПК в клинической практике необходимо создание регистров неродственных доноров в каждом государственном банке ПК и объединение их в более крупные регионарные. Поскольку шанс найти совместимого донора гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для аллогенной трансплантации ГСК напрямую зависит от популяционного состава потенциальных доноров и этнической принадлежности пациента, состав регистра государственного банка должен отражать состав населения страны. Информация о количестве, качестве и распределении частот HLA-аллелей и гаплотипов в банках пуповинной крови позволяют осуществлять целенаправленный поиск потенциальных доноров в конкретных мировых безвозмездных регистрах доноров ГСК ПК, что существенно сокращает время поиска необходимых образцов ПК [75]. Поэтому все образцы ПК, внесенные в общественный регистр доноров ГСК, должны быть типированы по трем генам HLA- системы (по локусам HLA-A, HLA-B на уровне базового разрешения и по локусу HLA-DRB1 на уровне высокого разрешения [URL:http://www. worldmarrow.org/]. 1.5. Криоконсервирование и долгосрочное криохранение клеток пуповинной крови Для длительного хранения заготовленных образцов ПК необходимо применение методов криоконсервации. Криоконсервация (воздействие низких температур) – это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при сверхнизких температурах, с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. 27 Этапы замораживания и размораживания клеточных концентратов являются наиболее ответственными моментами для сохранения ГСК в жизнеспособном состоянии. Как известно, даже простое охлаждении клетки до 0оС существенно ограничивает время ее жизни, что обусловлено изменениями фазового состояния липидов в клеточной мембране, изменением рH-среды, выключением «Na-насоса» и набуханием клеток. И только использование сверхнизких температур с соблюдением точных режимов охлаждения позволяет обратимо приостановить все биохимические процессы в клетке [67]. На сегодняшний день оптимальной температурой для длительного хранения ГСК принята температура жидкого азота от -80о до -196оС [104;120]. Поэтому, разработка и усовершенствование методов криоконсервации ГСК ПК являются наиболее актуальными задачами, которые стоят перед современными банками ПК [120;126]. В период криоконсервации факторами, ответственными за развитие различных криоповреждений [8;138], являются: 1. образование кристаллов льда и их размеры (фаза кристаллизации) 2. обезвоживание клетки 3. осмотический шок из-за увеличения концентрации электролитов в клетке. Под воздействием данных факторов в клетке возникают первичные криоповреждения, заключающиеся в изменении формы и размера клеток, нарушение целостности мембраны, изменение конформации макромолекул [47]. В процессе рекристаллизации и оттаивания первичные криоповреждения могут явиться причиной вторичных изменений, которые, в свою очередь, вызовут лизис клетки и приведут к несостоятельности трансплантата [111]. Однако, несмотря на существующие проблемы, в настоящее время удается успешно замораживать и размораживать ГСК, сохраняя при этом их биологические свойства. Это обеспечивается проведением ряда мероприятий по подготовке ПК перед криоконсервацией: 28 введение криопротекторов соблюдение методов замораживания и размораживания соблюдение строгих температурных режимов хранения криоконсервированных образцов ПК. 1.5.1 Криопротекторы Криопротекторы – это вещества с более низкой температурой замерзания, которые способны предупреждать развитие криоповреждений в клетке. Молекулы криопротекторов начинают взаимодействовать с мембранами ГСК ПК уже при комнатной температуре, приводя к изменению их физико-химических характеристик [56] и температуры главного фазового перехода [146]. Так же в присутствии криопротекторов отмечается понижение температуры, при которой регистрируется формирование внутриклеточного льда. Основные механизмы действия всех криопротекторов обусловлены следующими феноменами [78]: частичная осмотическая дегидратация клеток витрификация клеточной воды благодаря замедлению образования внутриклеточных кристаллов льда, что позволяет сохранить внутриклеточную воду при взаимодействии с макромолекулами, необходимую для их гидратации и стабилизации. Обязательные качества, которыми должны обладать криопротекторы при заготовке ПК, это: 1. безопасность по отношению к криоконсервированному материалу и биологическому объекту 2. высокая гидрофильность 3. снижение количества вымораживаемой воды и предотвращение кристаллизации воды в криозащитной смеси 4. поддержание белков и солей в растворенном состоянии вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние. 29 Все известные криопротекторы в зависимости от их молекулярной массы и способности проникать внутрь клетки разделены на экстра, эндоцеллюлярные и смешанные [96]. Выбор криопротектора зависит от его химического строения, типа криоконсервированных клеток и условий криоконсервации [95;125]. Общепринятым криопротектором для ГСК является эндоцеллюлярный криопротектор ДМСО, который способен легко проникать через мембрану клеток и образовать большое количество водородных связей с молекулами жидкой фазы клетки. Это приводит к снижению кристаллообразования внутри клетки, а также к снижению концентрации внутриклеточных солей при сверхнизких температурах, что уменьшает степень криоповреждения клетки [76;54]. Его рекомендуют добавлять в клеточную суспензию при постоянной скорости и перемешивании непосредственно перед этапом замораживания. Это обеспечивает равномерное распределение криопротектора во всем объеме концентрата клеток и максимально сокращает время его контакта со стволовыми клетками. Для нейтрализации выделяющегося тепла в результате экзотермической реакции при введении ДМСО, клеточные концентраты рекомендовано охлаждать до температуры от 0 до 40С [120]. Для реципиента ДМСО является относительно нетоксичным веществом. Однако, при увеличении его концентрации в конечном растворе возможно развитие токсических реакций у пациента. В литературе встречаются немногочисленные публикации, в которых описано развитие острых токсических реакций непосредственно на фоне инфузии или после введения размороженных ГСК. В основном нежелательные симптомы были кратковременными и проявлялись в виде тошноты, рвоты, болей в животе, головокружения [145]. В двух исследованиях были описаны случаи с развитием тяжелых неврологических осложнений (токсической комы) [25] и случай со смертельным исходом, непосредственно связанным с введением ДМСО [146]. В 2005 году были опубликованы результаты многоцентрового исследования трансплантаций ГСК из 97 трансплантационных центров EBMT, где сообщалось о 30 развитии побочных эффектов после введение криоконсервированных ГСК в конечной концентрации ДМСО от 5-10%. Развитие тяжелых токсических осложнений было отмечено в 1 случае, что составило 2,1 % от всех зарегистрированных случаев. В основном побочные эффекты наблюдались со стороны сердечно - cосудистой и дыхательной систем (27% и 17% соответственно), нейро- и нефротоксичность были зарегистрированы в 5% случаев [141]. Для снижения токсичности ДМСО на организм пациента рядом авторов были проведены исследования по удалению ДМСО из криоконсервированной ПК непосредственно после ее размораживания различными методами, при этом была отмечена существенная потеря ГСК - до 30% [12;116;120]. Для компенсации токсического действия и повышения его цитопротективных свойств необходим подбор оптимальной концентрации ДМСО, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на клетки. Наиболее безопасной и эффективной для криоконсервации ГСК ПК и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО в конечном растворе [1;28;44;76;132]. Рядом авторов были проведены исследования по сокращению конечной концентрации ДМСО. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% способно привести к существенным потерям ГСК (в ряде исследований наблюдалась фатальная гибель клеток) [18;44;55]. Вопрос об оптимальном составе криоконсервирующих растворов ДМСО для хранения ГСК ПК в жидком азоте остается открытым. На сегодняшний день наиболее перспективным направлением является модификация методик криоконсервации ГСК ПК, направленная на уменьшение токсичности ДМСО за счет его сочетания (человеческий с альбумин, полиглюкин и др.) [69]. различными непроникающими аутологичная сыворотка, криопротекторами гидроксиэтилкрахмал, 31 1.5.2 Этапы замораживания и долгосрочное криохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови После добавления криопротектора концентрат стволовых клеток ПК подвергается заморозке. Стандартная температура для длительного хранения ГСК составляет от -196о до -80оС. Оптимальной скоростью охлаждения суспензии клеток ПК принята скорость заморозки 1-20С в мин. Увеличение скорости до 5100С в мин существенно снижает процент жизнеспособных ГСК, что было подтверждено в ряде научных исследований [76;120]. При быстром охлаждении суспензии клеток вода не успевает покинуть клетку и образовавшиеся внутриклеточные кристаллы льда способны нарушить целостность мембран и цитоскелета. Происходит увеличение объема мембранных структур, что в свою очередь приводит к лизису клетки после размораживания. Напротив, при дегидратацией. медленном В этом охлаждении случае процесс разрушение клетки кристаллизации вызывается начинается во внеклеточной жидкости, что приводит к образованию гиперконцентрированных растворов солей, повышению осмолярности и сжатию клетки. Вода начинает покидать клетку через мембрану как посредством диффузии, так и через ее поры. Другим не менее опасным фактором, который приводит к гибели клетки, является ее перегрев в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Для нейтрализации данного феномена необходимо использовать кратковременное охлаждение клеточных суспензий с высокой скоростью, что позволит избежать негативного воздействия выделившегося тепла [11]. Поэтому, использование неконтролируемой скорости замораживания может приводить к морфофункциональным повреждениям в клетке, и, следовательно, к несостоятельности трансплантационного материала В настоящее время во всех банках ПК применяют два основных метода замораживания: 1. Неконтролируемое или ручное замораживание. На первом этапе происходит охлаждение клеточного концентрата до -40С, на втором – концентрат помещают в морозильную камеру (-80°С) или в пары жидкого азота (-130°С). При 32 данном методе существует вероятность повреждения ГСК высвобождающейся теплотой плавления в момент перехода жидкости в лед (в фазу кристаллизации). 2. Контролируемое или программное, замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с определенной скоростью при помощи специальных приборов - программных замораживателей. В данном случае клеточный концентрат охлаждается со скоростью 1-20С в мин до температуры -400С, далее процесс замораживания осуществляется со скоростью 3-50С в мин до достижения необходимой температуры. Выбор метода замораживания в каждом банке ПК определяется индивидуально в зависимости от технического и материального оснащения. Возможность применения ручного метода замораживания обсуждается в литературе, и в ряде работ сообщается, что данный метод является безопасным для криоконсервации ГСК и по результатам сопоставим с программным [44;69]. На сегодняшний день, контролируемый метод замораживания является стандартом для криоконсервирования ГСК ПК [19;79]. После процедуры замораживания каждый образец ПК помещается в жидкий азот для долгосрочного хранения. Существует два вида систем для долгосрочного криохранения образцов ПК. Во многих банках ПК используется специализированный контейнер (дьюар), представляющий собой изолированный контейнер, заполненный жидким азотом. В ряде случаев данные системы могут быть оборудованы приборами для измерения температуры и контроля уровня жидкого азота в ней. Другой системой для долгосрочного хранения, наиболее востребованной в настоящее время, является автоматизированный криокоплекс «BioArchive®» (Termogenesis, RanchoCordova, CA, USA). Он способен выполнять программное замораживание и длительное индивидуальное хранение до 3626 образцов ПК одновременно. При этом главным его преимуществом считается закрытость процесса замораживания и изъятия образцов, что исключает поступление внешнего тепла. 33 В 2004 году было проведено ретроспективное исследование по оценке жизнеспособности ГСК в 1032 криоконсервированных образцах ПК после размораживания. Все образцы ПК были разделены на три группы: в первую группу вошли образцы ПК, которые не подвергались сепарации и были заморожены механическим способом, вторую группу составили образцы, подвергшиеся редукции объема и замороженные механическим способом, третью группа - это образцы, подвергшиеся сепарации и замороженные с помощью программного замораживателя Во «BioArchive®». всех группах жизнеспособность ЯСК была высокая, но при использовании программного замораживателя клеточные потери были минимальными (84,5%, 81,8% и 88% соответственно) [124]. В аналогичном исследовании, проведенном в 2008 году в Японии, так же был показан высокий процент сохранения CD45+, CD45+/СD34+ клеток и отдельных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГМ и КОЕ-(ГМ+Г+М)) на небольшом количестве материала (20 образцов пуповинной крови) после криохранения в автоматизированной системе «mini-Bioarchive» (AirWaterInc., Osaka, Japan) [100]. В России подобных исследований не проводилось. Таким образом, сочетание программного метода замораживания и автоматизированного криокомплекса «BioArchive®» является наиболее оптимальным для криоконсервирования ГСК ПК. 1.6 Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови Оценка качества криоконсервированных ГСК ПК и возможность их применения в клинической практике – это задача, которая стоит перед банками ПК всего мира. Для этого ГСК ПК должны быть разморожены. В 1995 году Р. Rubinstein разработал методику по размораживанию ГСК ПК, которая является общепринятой и до настоящего времени [120]. Первоначально, криоконсервированном возможность состоянии длительного и их хранения последующее образцов в использование в клинической практике подвергалась сомнениям. Но, в ходе проведенных 34 исследований, было установлено, что стандартные протоколы криоконсервирования ГСК ПК при температуре жидкого азота с использованием криопротектора ДМСО в конечной концентрации 10% и методов программного замораживания позволяют в течение десятилетий сохранять более 80% ЯСК в жизнеспособном состоянии и более 90% предшественников гемопоэза [101] . Данные выводы были подтверждены и в научных работах H.E Вroxmeyer, где он со своими коллегами продемонстрировал высокий процент сохранения ЯСК ПК и клеток предшественников гемопоэза после 10-ти, 15-ти и 24-х лет хранения в жидком азоте [32-34;40] (Таблица 3) Таблица 3 Влияние криохранения на сохранение ядросодержащих клеток пуповинной крови и колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток Длительность криохранения Процент сохранения ЯСК (M±SD) Процент сохранения КОЕ-mix ( M±SD) Процент сохранения КОЕ-ГМ (M±SD) 10 лет (n=8) 88±20 74±25 92±11 15 лет (n=9) 83±12 85±25 95±15 21-24 года (n=23) 84 82 Группой итальянских ученых [147] в претрансплантационном периоде было проведено исследование по оценке качества 40 криоконсервированных образцов ПК из 40 различных банков, которые были отобраны для реципиентов ГСК. Средний срок криохранения в исследовании составил 43,3±26,2 месяца, процент сохранения ЯСК - 78,9±15,41%, из них жизнеспособных 85,5±10,59%, СD45+/CD34+ клеток – 96,83±71,96%. Похожее исследование по оценке качества было выполнено в институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. Они показали высокий уровень сохранения ЯСК и CD45+/СD34+ клеток в жизнеспособном состоянии до 98% и 94-98%. При оценке колониеобразующей активности клеток ПК их пролиферативный потенциал так же оставался достаточно высоким (общее количество колоний составило 247,6±36,8) [2]. Однако в данном исследовании 35 отсутствовала информация о количестве размороженных образцов ПК, их количестве и сроках криохранения. В России было проведено только одно подобное исследование на 231 образце ГСК ПК по оценке сохранности CD45+, CD45+/СD34+ клеток, колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток и длины теломер в зависимости (программное и от различных неконтролируемое способов замораживание). криоконсервирования Было показано, что криоконсервирование ПК необходимо проводить в программном замораживателе, а длительное криохранение должно осуществляться в диапазоне температур от – 130°С до – 196°С. Количество ГСК ПК с иммунофенотипом CD34+/CD45+ в образце ПК прямо пропорционально зависит от исходного количества ЯСК [6]. Таким образом, представленные данные не охватывают весь комплекс ПО оценке качества криоконсервированных ГСК ПК. 1.7 Клиническое применение криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Благодаря безопасности уникальным ее заготовки, свойствам ПК, развитию относительной глобальной сети простоте банков и ПК, усовершенствованию методов заготовки и улучшению качества подборов, на сегодняшний день ПК является одним их наиболее востребованных альтернативных источников ГСК для алло-ТГСК во многих странах мира [123]. Это существенно расширило возможность применения трансплантации ГСК, особенно в терапии тех пациентов, которым ранее данный вид терапии был недоступен (представители расовых и этнических меньшинств) или они нуждались в срочном проведении алло-ТГСК. В настоящее время в мире ежегодно проводится 2000-3000 новых трансплантаций ГСК ПК пациентам с различными заболеваниями, а в 2009 году впервые число проведенных аллоТГСК ПК превысило количество трансплантаций ГСК КМ [36]. Согласно данным Международного регистра трансплантаций костного мозга (International Bone Marrow Transplant registry - IBMTR) сегодня около 20% от всех алло-ТГСК, 36 которые были проведены молодым пациентам в возрасте менее 20 лет, выполнены с использованием ПК. В Японии этот показатель приближается к 50%. Эффективность первых трансплантаций ГСК ПК у пациентов с различными заболеваниями, вызвала огромный интерес со стороны многих ученых и привела к дальнейшему развитию клинических исследований в данной области [58;81;82;121;134]. Результаты этих и последующих трансплантаций ГСК ПК продемонстрировали, что ПК во многом отличается от традиционных источников ГСК (костного мозга и периферической крови). Было отмечено, что трансплантация ПК ассоциирована с задержкой восстановления нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с другими источниками ГСК [58;113;121]. Однако, в ходе дальнейших исследований, стало ясно, что скорость восстановления гемопоэза и эффективность трансплантации ПК существенно зависит от качества подборов пары донор-реципиент, а так же от количества и качества трансплантируемых ГСК [61;89;115;136]. Благодаря сравнительному анализу между различными источниками ГСК было показано, что проведение трансплантации ГСК ПК возможно с менее строгими критериями отбора пары донор-реципиент по генам HLA-системы по сравнению с донорами КМ или периферической кровью. Несоответствие по 1-2 аллелям HLA-антигенов не приводило к увеличению риска развития острой/хронической РТПХ и снижению общей выживаемости [113]. Это стало особенно важным для тех пациентов, которые длительное время ожидали подходящего донора, а так же для больных с быстро прогрессирующими заболеваниями. До 1993 года алло-ТГСК ПК в основном проводились от родственных доноров. Открытие общественных банков ПК в Европе и расширение коллекции криоконсервирванных образцов ПК привело к первым неродственным трансплантациям клеток ПК [81;134]. С тех пор стало ясно, что ПК является безопасным и эффективным источником ГСК для трансплантаций, который способен обеспечить длительное восстановление гемопоэза у пациентов после миелоаблативной терапии. 37 В 1995 году в связи с ростом числа проводимых трансплантаций клеток ПК рабочая группа EBMT (European Blood and Marrow Transplantation) с поддержкой Европейского союза организовали международный регистр Eurocord [URL:http://www.eurocord.org/], для систематизированного сбора и обработки всех клинических случае применения ПК. Он включал в себя более 180 трансплантационных центров в 35 странах мира как европейские, так и неевропейские, которые проводят трансплантации ПК. Международный регистр Eurocord работает в тесном сотрудничестве с EBMT и NETCORD от имени рабочей группы EBMT [58] Международный исследовательский центр трансплантации крови и костного мозга CIBMTR (Center for International Blood and Marrow Transplant Research) совместно с Eurocord проводят аналитическую оценку проведенных трансплантаций ПК в Европе и за ее пределами, изучают их эффективность и безопасность. В 2000 году группа CIBMTR впервые опубликовали результаты сравнительного анализа алло-ТГСК от HLA-идентичных доноров костного мозга (2052 пациента) и ПК (113 пациентов). Впервые было продемонстрировано, что трансплантация ПК ассоциирована с задержкой скорости восстановления кроветворения (гранулоцитопоэза и тромбоцитов) и со сниженной частотой развития острой и хронической болезни РТПХ по сравнению с костным мозгом. Данные результаты стали основанием для использования ПК от доноров с частичной совместимостью по HLA-системе и показали необходимость дальнейшего развития системы банков для расширения коллекции образцов ПК. Проведенные клинические исследования [42;77;83;91;98;114] показали, что алло-ТГСК ПК может эффективно применяться при терапии пациентов с различными заболеваниями, она способна обеспечить долгосрочное восстановление гемопоэза, в большинстве случаев ассоциирована с низким риском развития о. РТПХ, и не связана со снижением безрецидивной выживаемости [49;114]. При сравнительном анализе общей выживаемости пациентов после аллоТГСК костного мозга по сравнению с алло-ТГСК ПК различий выявлено не было; 38 хотя в одном выживаемости исследовании пациентов было после показано трансплантаций достоверное ПК по увеличение сравнению с трансплантациями КМ [89;115;131]. W.Y. Hwang и его коллеги, проанализировав данные 1789 алло-ТГСК ПК, показали, что при использовании ГСК ПК снижается вероятность развития хронической РТПХ, при этом острая РТПХ развивается с той же частотой, что и при алло-ТГСК КМ; восстановление кроветворения у пациентов после алло-ТГСК ПК происходит медленнее, но не менее эффективно, чем при трансплантациях ГСК костного мозга [77]. Безусловно, у каждого источника ГСК есть свои преимущества и ограничения. Поэтому решать вопрос о выборе донора ГСК необходимо индивидуально в каждом конкретном случае. Возраст пациента и его соматическое состояние, статус основного заболевания, наличие подходящего донора костного мозга являются основополагающими моментами в выборе источника ГСК. Однако, в тех случаях, когда у больного нет возможности длительно ожидать гистосовместимого донора костного мозга, ПК становится весьма перспективным источником ГСК. Таким образом, данные по оценке качества ГСК ПК, находящихся на длительном криохранении для дальнейшего клинического применения, является важной задачей, которая стоит перед любым современным банком ПК. Несмотря на проведенные исследования, данные о качестве ГСК ПК после длительного криохранения представлены не в полном объеме и не дают подробной информации о качестве криоконсервированных ГСК ПК. Не завершен поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточную морфологическую и функциональную сохранность ГСК ПК. Востребовано постоянное получение новых данных для целенаправленного поиска количества, качества и распределения частот HLA-аллелей и гаплотипов в регистре банков ПК для пациентов, нуждающихся в трансплантации. Все выше изложенные 39 литературные данные определяют актуальность проведенного настоящего исследования и направлены на решение поставленных задач. 40 ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал исследования В исследование были включены: 1. 600 криконсервированных клеточных концентратов ПК, изъятых из автоматизированной системы «BioArchive®» (Thermogenesis, США) для оценки клеточного состава и биологических характеристик ГСК (Таблица 4). Таблица 4 Характеристика криоконсервированных образцов пуповинной крови (n=600) Показатель M±SD 2,90±1,30 20,06±0,08 30,31±0,27 40,60±17,00 10,00±0,28 Срок хранения (год) Объем образца ПК (мл) % CPDA % Гематокрит %ДМСО Средний срок криохранения составил 2,9±1,3 лет (от 1 года до 6 лет), объем криоконсервированной ПК - 20,06±0,08 мл. Процент гемоконсерванта CPDA в ПК составил 30,31±0,27%, величина гематокрита – 40,60±17,00%. Концентрация ДМСО в криоконсервированном образце ПК была 10,0±0,28 (%). Ежегодно с 2006 по 2011 года проводилось плановое контрольное изъятие и размораживание криоконсервированных образцов ПК, что составляло 6% от всего заложенного клеточного материала. 2. 4800 криоконсервированных клеточных концентратов ПК, находящихся на криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®», прошедших HLA-типирование, тестирование на вирусную и микробную контаминацию и внесенных в общественный регистр ГСК ПК г. Москвы за период с 2004 по октябрь 2013 гг. Для изучения частоты встречаемости гаплотипов методом независимой последовательной рандомизацией было 41 отобрано 200 образцов ПК с образцами периферической крови родителей (n=400). 3. 100 криконсервированных клеточных концентратов ПК, заготовленных и изъятых для оценки влияния отечественного комбинированного криопротектора – 50% раствор ДМСО + реополиглюкин (10% декстрана ср. мол. масса 30000-40000 в изотоническом растворе), производитель «ПанЭко», Россия. В качестве контрольной группы использовали комбинированный криопротектор – 55% раствор ДМСО + декстран - 40 (5% раствор декстрана ср. мол. масса 3500045000 в изотоническом растворе), производитель «PallGmbh», Германия (n=100). 4. 56 криоконсервированных клеточных концентратов ПК, переданных в клинические центры для проведения аллогенной трансплантации ГСК пациентам с различными заболеваниями. 2.2. Методы исследования Сбор пуповинной крови Получение ПК осуществляли при наличии развернутого информированного согласия роженицы, отсутствии стандартных общемировых абсолютных противопоказаний (Таблица 5), на 37-41 неделе гестации при самопроизвольных или оперативных родах только после рождения ребенка. Таблица 5 Стандартные абсолютные противопоказания для сбора пуповинной крови Отказ матери Наличие носительства и установленных инфекционных заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекция, гепатиты, сифилис и заболевания, передающиеся половым и гемотрансмиссивным путем Генетические заболевания Наследственные и врожденные патологии, в том числе патологии кроветворной и иммунной систем Психические заболевания Онкологические заболевания, в том числе в стадии ремиссии Применение цитостатических и тератогенных средств во время беременности Наркомания и токсикомания 42 Продолжение Таблицы 5 Переливание крови и ее компонентов в течение последних 12-и месяцев Лечение иглоукалыванием, выполнение пирсинга и татуировок в последние 12 месяцев перед родами Постоянное отстранение от донорства ПК собирали по принятой в роддоме методике в асептических условиях в закрытую систему для сбора крови (Green Cross, Корея), которая содержала стандартное количество гемоконсерванта CPDA. Эксфузию ПК осуществляли в среднем в течение 5 мин. Степень разведения образцов ПК гемоконсервантом CPDA зависела от объема собранной ПК. Процентное содержание гемоконсерванта CPDA рассчитывали по формуле: Количество CPDA (г) в мешке для сбора ПК ×100% (Вес мешка для сбора ПК с цельной ПК – Вес чистого мешка (г) для сбора ПК без CPDA) Процедура первичной оценки образцов пуповинной крови После забора из родильных домов ПК в течение 18-ти часов после родов доставлялась в регистратуру Московского банка ПК в специализированных термоконтейнерах. Длительность транспортировки не превышала 2 часов. Краткосрочное хранение ПК осуществляли вне зоны доступа прямых солнечных лучей при температуре от 20о до 24оС. Во время транспортировки была обеспечена защита упаковки, сохранение идентификации образца. Вся поступившая ПК регистрировалась в базе данных. Проводилась первичная оценка качества материала ПК. Образцы ПК с «чистым» весом меньше 60 грамм, нарушением герметичности мешка, неправильным заполнением документации, наличием тромбов и гемолиза, нарушением температурного режима в процессе хранения и транспортировки отбраковывались (первичная отбраковка). Образцы ПК с весом более 120 г делились на 2 части и обрабатывались как отдельные образцы. Обработку образцов ПК проводили не позднее чем через 24 часа после 43 процедуры сбора ПК. Выделение ядросодержащих клеток пуповинной крови В асептических условиях, в «чистом» помещении класса D осуществляли выделение ГСК ПК двумя методами: методом двойного центрифугирования (МДЦ) и методом автоматического выделения клеток (МАВК). При обработке образца ПК методом МДЦ использовались: комплект мешков для обработки и замораживания ПК - “Transfer/Freesing Bag Set”(ThermoGenesis, USA); центрифуга “Cryofuge 5500i”(Heraeus, Germany); автоматический плазмоэкстрактор “Auto Volume Expressor”(ThermoGenesis, USA). Исходный рабочий протокол МДЦ был разработан Нью-Йоркским банком ПК [126]. После первого центрифугирования ПК разделялась на три фракции - плазма, с частью клеток, лейкоцитарный слой и «остаточные» эритроциты - с последующей экстракцией первых двух фракций и частично эритроцитов; после второго – получали плазму и клеточный концентрат, содержащий гемопоэтические стволовые клетки. Введение криоконсервирующего раствора осуществлялось с помощью шприцевого дозатора TE-331, Terumo Terufusion, Belgium. Обработку ПК МАВК проводили с использованием аппарата “Sepax S100” (Biosafe, Switzerland) с применением комплектов для автоматической обработки ПК “Sepax CS-530”(Biosafe, Switzerland). Во время первого центрифугирования ПК разделялась на клеточную плазму, первую порцию лейкоцитарного концентрата и эритроциты; во время второго - на бесклеточную плазму, вторую порцию лейкоцитарного Криоконсервирующий концентрата раствор вводился и при остаточные помощи эритроциты. аппарата для перемешивания и охлаждения концентрата ПК “Coolmix AS-210”(Biosafe, Switzerland). Криоконсервирование и криохранение концентратов пуповинной крови После выделения ЯСК все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированной системе «BioArchive®» 44 (ThermoGenesis, USA.). Непосредственно перед процессом криоконсервации в каждый концентрат ПК вводили криоконсервирующий раствор ДМСО в сочетании с декстраном-40 (или ДМСО в сочетании с реополиглюкином) в стандартном количестве 5 мл до конечной концентрации 10%. Далее концентрат ПК помещался в тефлоновый пакет и металлическую канистру, затем погружался в пары азота в автоматизированной системе «BioArchive®» для предварительного охлаждения и его предзаморозки по определенному температурному графику до температуры -50ºС. Процесс криоконсервации начинался с охлаждения до -1°С. Затем клеточный материал ПК охлаждался до температуры -11°С со скоростью 10°С/мин. Конечным этапом была криоконсервация со скоростью 2°С/мин до температуры -50°С (рисунок 2). В дальнейшем образец ПК погружался криокомплексом в жидкий азот с температурой -196ºС в заранее автоматически выбранную пустую ячейку для бессрочного хранения. Каждая ячейка имела свой индивидуальный адрес хранения. Рисунок 2. Пример профиля замораживания гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» 45 Размораживание концентратов пуповинной крови Ежегодно с 2006 по 2011 гг. проводилось плановое контрольное изъятие и размораживание криоконсервированных образцов ПК, что составляло 6% от всего заложенного материала. Все клеточные концентраты ПК были заготовлены, обработаны и криоконсервированы по ранее описанным методикам. После изъятия концентратов ПК из криохранилища проводили размораживание их размораживание: канистры с криоконсервированными образцами ПК выдерживались в течение 15 мин в парах азота и затем при комнатной температуре в течение 5 минут, для того чтобы пластик приобрел эластичность; далее производилось непосредственное размораживание образцов ПК на водяной бане при температуре +37 0С в течение 2- 3 минут. 2.3. Методы исследования Тестирование клеточных концентратов пуповинной крови 1. В процессе обработки ПК определяли групповую принадлежность и проводили инфекционный контроль – вторичная отбраковка (бактериальное и вирусологическое исследование). 2. Оценивали клеточный состав концентрата ПК до и после криохранения: количество ЯСК (гранулоциты, нормобласты, лимфоциты, моноциты) и МНК (лимфоциты, моноциты) определяли при помощи: автоматического гематологического анализатора ABX Pentra 60C Plus (HORIBA ABX Diagnostics Inc., FRANCE) в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров. Они включали расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов по объему, двумерную диаграмму, отражающую плотность популяции лейкоцитов и ее состав, а так же дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам – лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, выявление атипичных лимфоцитов, больших незрелых клеток и нормобластов. морфологической оценки мазков, окрашенных по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая- 46 Грюнвальда и краской Романовского). Дифференциальный подсчет лейкоцитов (лейкоцитарная формула) проводился при использовании иммерсионных объективов (х40 и х100). При подсчете лейкоцитарной формулы анализировали не менее 200 клеток. Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100лейкоцитов). Коррекция результатов автоматического анализа пуповинной крови Учитывая, что степень разведения образцов ПК антикоагулянтом зависела от объема собранной крови (объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл), для каждого показателя производили пересчет результатов автоматического анализа ПК с учетом степени разведения каждого образца. Изучали биологические характеристики ГСК ПК 3. а) Количество ГСК ПК оценивали по экспрессии мембранных маркеров в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD34 и CD45 при помощи проточной цитометрии FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Оценивали процентное соотношение от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+ клеток в 1 мл ПК каждого образца. б) Колониеобразующую активность клеток ГСК ПК определяли при помощи культивирования клеточной суспензии ПК в метилцеллюлозе в течении 14 суток при температуре 37°С в СО2- инкубаторе. В дальнейшем производили подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 х 10 5 эксплантированных клеток: КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Эр. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины КОЕ умножали на число МНК в 1 мл ПК. в) помощью Жизнеспособность красителя ядросодержащих 7-ADD, поникающего клеток через ПК оценивали с цитоплазматическую мембрану клетки и связывающегося с ДНК, определением количества CD45+ негативных 7-ADD клеток на проточном цитофлуометре FACSCalibur. 4. HLA-генотипирование образцов ПК 47 Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов крови методом сепарации на магнитных частицах. Выделение ДНК проводили с использованием сертифицированных коммерческих наборов BioSprint 15 DNA Blood kit фирмы «Qiagen» (США). Для выделения ДНК использовали автоматизированную систему «King Fisher». Метод позволяет исключить перемещение жидкостей в процессе обработки образцов, перекрестную контаминацию и перенос реагентов, что обеспечило стандартизацию всего процесса. Концентрацию и степень чистоты выделенной ДНК измеряли с помощью спектрофотометра на приборе SmartSpec фирмы «Biorad» (США). Концентрацию ДНК измеряли в сравнении с чистым элюирующим раствором по оптической плотности OD260. Степень чистоты выделенной ДНК определяли с помощью многоволнового режима А260/280. Образцы для исследования соответствовали предъявляемым к ним требованиям – концентрация ДНК > 50 нг/мкл и отношение А260/280 составляло 1,7-1,9. Полученные образцы ДНК сразу использовали для генотипирования или замораживали при температуре -20 °С. Молекулярные методы типирования Для HLA генотипирования применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Весь Закрепление процесс на ПЦР твердой проходил поверхности в термоциклере (амплификаторе). олигонуклеотидных зондов для гибридизируемой ДНК (или ампликоана) называется обратным дот-блотингом, а метод – SSO (Sequence Specific Oligonucleotides). Процедуру проведения анализа включала следующие стадии: амплификация исследуемого фрагмента ДНК, гибридизация на стрипах с нанесенными олигонуклеотидами, промывание не связавшихся продуктов, детекция. Типирование с использованием технологии SSO проводилось на автоматическом процессоре Dynal AutoRELI™ 48 Mk с реагентами RELI™ SSO (Invitrogen). Проводили типирование определенных локусов HLA: A, B, C, DRB1 и DQB1. Полученные результаты считывались сканированием стрипа с помощью сканера AutoCam. Интерпретацию результатов проводили в автоматическом 48 режиме с использованием программы Dynal PMP. Методом SSO выявляли генотип HLA по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Образцы, у которых были получены двойные интерпретации результатов, дополнительно были протипированы методом ПЦР с помощью аллельспецифических праймеров (SSP - Sequence Specific Primer). В основе данного метода также лежит принцип комплементарности нуклеотидов. Исследования проводили на коммерческих сертифицированных наборах ALLSet™GOLD SSP фирмы «Invitrogen» для низкого и для высокого уровня разрешения. Метод состоял из нескольких этапов: 1. Амплификация. 2. Электрофорез в 2% агарозном геле. 3. Интерпретация результатов. Регистрацию сигналов полученной электрофореграммы, фотографирование изображения и документирование результатов в электронном виде осуществляли с помощью гель документирующей системы «ДиДжиДок» (США) и компьютерной программы «UPV». По наличию или отсутствию специфических продуктов амплификации в лунках определенной последовательности и с помощью специальных таблиц, прилагаемых к каждому набору специфических праймеров, определяли генотип исследуемого образца. Анализ применения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Качество клеточных концентратов ПК, выданных клиническим центрам для проведения алло-ТГСК, оценивали после их применения в клинических центрах согласно «эпикризам применения ГСК ПК» с 2006 по октябрь 2013 гг. (ФГУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева г. Москвы, ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова, ФГБУ «РДКБ» Минздравсоцразвития России и ГБУЗ НО «Нижегородский ОЦК»). Была получена информация о: номере истории болезни, 49 возрасте, половой принадлежности, весе пациента, диагнозе, проведенном лечение до трансплантации, режиме кондицинирования, осложнениях во время введения криоконсервированных концентратов ПК, сроках восстановления нейтрофилов, тромбоцитов, наличия отторжения или недостаточности работы трансплантата, развитии острой и хронической РТПХ, исходе трансплантации, трансфузии донорских тромбоцитов, повторной трансплантации, состоянии пациента (жив, умер - дата смерти, причина), дате последнего контакта с пациентом (Рисунок 3). 2.4. Статистическая обработка результатов Проводилась для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия КрускаллаУоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Zтест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики в программах Microsoft Excel, Microsoft Access, Statisticav 6.0, «Biostat» с двупольной таблицы при помощи программы «OpenEpi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Частоты встречаемости гаплотипов определяли прямым подсчетом. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р< 0,05. Работа была выполнена в государственном бюджетном учреждении здравоохранения города Москвы «Банке стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» (директор д.м.н. М.В. Яковлева), в ФГБУЗ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России» (директор – профессор д.м.н. А.В. Чечеткин). 50 ГБУЗ «Банк стволовых клеток ДЗМ» Эпикриз применения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Заполняемая форма 115516 Москва, ул. Бакинская, 31. Тел./Факс. (495) 327-18-53 e-mail: [email protected] Трансплантационный центр: Идентификационный номер: образца: Дата выдачи криоконсервированных ГСК ПК: Дата трансплантации ГСК ПК: Вид трансплантации: РОДСТВЕННАЯ / НЕРОДСТВЕННАЯ Ф.И.О. пациента: Возраст:_____________Вес пациента___________Номер истории болезни________ Диагноз основной: Диагноз сопутствующий: Проведенное лечение до алло-ТГСК: Режим кондицинирования: Количество трансплантируемых TNC х10 8/кг: х10 6 /кг и CD34+ х10 6/кг: Осложнения во время трансфузии ПК: Сроки восстановления нейтрофилов ≥0,5х109/л: тромбоцитов ≥50 тыс: Зависимость от донорских тромбоцитов (кол-во доз): Было ли отторжение или недостаточнось работы трансплантата: Острая РТПХ (степень, форма), лечение: Хроническая РТПХ (степень, форма): Инфекционные осложнения: Исход трансплантации: Вводились ли донорские лимфоциты: Рецидив заболевания (дата): Повторная трансплантация (число): Текущее состояние пациента (жив, умер-дата смерти, причина): Дата последнего контакта с пациентом: Ф.И.О. зав. отделения подпись печать Рисунок 3. Эпикриз применения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 51 ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» С целью изучения клеточного состава концентратов ПК и биологических характеристик ГСК до и после криохранения, определения влияния методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», нами было изучено 600 ранее криоконсервированных образцов ПК. 3.1.1. Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови В результате нашего исследования были получены следующие данные (Таблица 6). Таблица 6 Клеточный состав концентратов пуповинной крови до и после криохранения (n=600) Показатель ЯСКx107/мл M±SD р МНКх107/мл До После % сох-я До 3,67 ±0,97 3,13 ±0,80 87,01 ±13,30 1,72 1,79 ±0,56 ±0,60 0,02 После 0,08 Нейтрофилы х107/мл % сох-я До После 100,4 ±9,20 1,94 1,46 ±0,62 ±0,51 % сох-я 78,60 ±12,20 0,03 Количество ЯСК в концентрате ПК после криохранения достоверно снижалось: с 3,67±0,97x107/мл до 3,13±0,80x107/мл (р=0,02). Процент сохранения общей фракции ЯСК составил 87,01±13,30%. 52 При анализе субпопуляционного состава ЯСК было выявлено перераспределение соотношения между лимфоцитами и гранулоцитами до и после криохранения (Рисунок 4). p=0,04 p=0,03 p=0,01 Рисунок 4. Субпопуляционный p=0,03 состав p=0,023 ядросодержащих клеток пуповинной крови до и после криохранения Абсолютное количество МНК после криохранения концентратов ПК достоверно не изменялось: 1,72±0,56x107/мл и 1,79±0,60x107/мл соответственно. Процент сохранения МНК составил 100,4±9,20%. Абсолютное количество нейтрофилов после криохранения концентратов ПК статистически значимо снижалось с 1,94±0,62x107/мл до 1,46±0,51x107/мл (р=0,03). Процент сохранения составил 78,60±12,2%. Достоверного автоматизированной влияния криохранения клеточных системе «BioArchive®» на концентратов жизнеспособность в ЯСК (CD45+7AAD-) выявлено не было (Таблица 7). Таблица 7 Жизнеспособность ядросодержащих клеток до и после криохранения (n=600) Показатель M±SD р CD45+7AAD-(%) До 99,30±1,27 После 97,90±1,42 0,10 53 Абсолютное количество СD45+/CD34+ клеток после криохранения клеточного концентрата ПК достоверно снижалось с 0,13±0,08х106/мл до 0,089±0,05х106/мл (р=0,035). Процент сохранения СD45+/CD34+ клеток составил 93,70±5,3% (Таблица 8). Таблица 8 Количество CD45+/CD34+ клеток в концентрате пуповинной крови до и после криохранения (n=600) Показатель CD45+/СD34+ х106/мл После % сох -ия До M±SD 0,13±0,08 р 0,089±0,05 93,70±5,30 0,035 При оценке колониеобразующей активности ГСК ПК было показано, что количество колоний КОЕ-mix, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-ГМ и КОЕ-Эр после криохранения ПК достоверно 99,30±3,38%, 85,03±5,56%, снижалось, процент сохранения 81,30±3,28%, 82,34±9,80% и составил: 69,40±5,7% соответственно (Таблица 9). При проведении регрессионного анализа были обнаружены значимые положительные корреляционные зависимости между количеством ЯСК и МНК до криохранения и количеством СD45+/СD34+ клеток после криохранения концентратов ПК (Таблица 10). Таблица 10 Взаимосвязь между количеством ядросодержащих и мононуклеарных клеток пуповинной крови до криохранения и количеством CD45+/СD34+ клеток после криохранения CD34+х106/мл после криохранения CD34+ MNCх106/мл до криохранения r p 0,54 0,001 TNC х106/мл до криохранения r p 0,61 0,01 Таблица 9 Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после криохранения (n=600) Показатель КОЕ-mix х105 МНК 54 До % После сох-ия До 26,91 25,90 (M±SD) ± ± 4,06 8,37 р КОЕ-Г х105 МНК 0,049 99,30 ± 3,38 КОЕ-М х105 МНК % После сох-ия До 19,05 17,03 ± ± 3,23 4,41 0,038 85,03 ± 5,56 КОЕ-ГМ х105 МНК % После сох-ия До 13,71 12,40 ± ± 3,26 3,60 0,040 81,30 ± 3,28 КОЕ-Эр х105 МНК % После сох-ия До 19,50 17,29 ± ± 2,4 4,92 82,34 ± 9,80 0,036 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия - процент сохранения % После сох-ия 21,62 13,64 ± ± 7,69 3,17 0,001 69,40 ± 5,70 55 При проведении регрессионного анализа были обнаружены значимые положительные корреляционные зависимости между количеством ЯСК, МНК и СD45+/CD34+ клеток до криохранения концентратов ПК и колонинеобразующей активностью ГСК после криохранения клеточных концентратов ПК (Таблица 11). Таблица 11 Взаимосвязь между количеством ядросодержащих, мононуклеарных и СD45+/CD34+ клеток пуповинной крови до криохранения и колониеобразующей активностью гемопоэтических стволовых клеток после криохранения концентратов пуповинной крови КОЕх10 МНК после криохранения КОЕ-mix КОЕ-ГМ КОЕ-Г КОЕ-М КОЕ-Эр 5 Таким криохранения образом, в СD45+/CD34+ до криохранения r p 0,55 0,0001 0,26 0,06 0,54 0,0001 0,3 0,04 0,01 0,03 проведенное автоматизированной МНК до криохранения r p 0,35 0,01 0,28 0,05 0,35 0,01 0,22 0,05 -0,32 0,02 исследование системе ЯСК до криохранения r p 0,04 0,3 0,11 0,008 0,13 0,002 0,06 0,16 -0,62 0,05 показало, «BioArchive®» что после отмечается достоверное снижение количества ЯСК, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, уменьшение количества СD45+/CD34+ клеток и всех КОЕ. 3.1.2. Влияние методов лейкоконцентрации на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» Мы изучили влияние различных методов обработки ПК на клеточный состав концентратов ПК и биологические характеристики ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®». Все криоконсервированные концентраты ПК были разделены на две группы в зависимости от метода лейкоконцентрации: 56 Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МАВК - 256 концентрата Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МДЦ - 344 концентрата При анализе показателей клеточного состава концентрата ПК в зависимости от метода лейкоконцентрации нами были получены следующие данные (Таблица 12). Таблица 12 Клеточный состав концентрата пуповинной крови до и после криохранения в зависимости от метода лейкоконцентрации Метод ЯСКx107/мл (M±SD) До МАВК (n=256) МНКх107/мл (M±SD) После % сох-я До Нейтрофилы х107/мл (M±SD) После % сох-я До После % сох-я 3,54 3,00 ±0,94 ±0,80 87,32 ±4,21 1,84 1,58 ±0,72 ±0,54 94,32 ±2,92 1,87 1,47 ±0,67 ±0,49 85,31 ±3,80 МДЦ (n=344) 3,76 3,20 ±0,99 ±0,79 88,27 ±3,45 1,63 1,47 ±0,47 ±0,61 96,36 ±3,10 1,98 1,45 ±0,57 ±0,52 80,21 ±2,10 0,3 0,5 0,9 0,02 0,0006 р 0,08 0,03 0,05 0,6 Процент сохранения общей фракции ЯСК, МНК после криохранения при сравнении двух методов лейкоконцентрации достоверно не различался. Процент сохранения нейтрофилов в концентратах ПК после криохранения был достоверно ниже в группе образцов, обработанных МДЦ 80,21±2,10% по сравнению с группой образцов, обработанных МАВК 85,31±3,80% , р=0,0006. При сравнении жизнеспособности ЯСК (CD45+7AAD-) в обеих группах криоконсервированных образцов ПК значимых различий до и после выявлено не было (Таблица 13). 57 Таблица 13 Влияние методов лейкоконцентрации на жизнеспособность ядросодержащих клеток Метод % CD45+7AAD- (M±SD) До криохранения После криохранения МАВК (n=256) 99,99±0,21 90,11±4,83 МДЦ (n=344) 97,33±0,44 89,9±6,26 0,59 0,70 Процент сохранения СD45+/СD34+ клеток после криохранения концентратов ПК был достоверно выше в группе образцов, обработанных МАВК 95,61±0,06% по сравнению с группой образцов, обработанных МДЦ 84,52±0,07%, р=0,042 (Таблица 14). Таблица 14 Влияние методов лейкоконцентрации на количество CD45+/CD34+ клеток Метод CD45+/СD34+ х106/мл (M±SD) После % До криохранения криохранения сохранения МАВК (n=256) 0,10±0,06 0,08±0,05 95,61±4,70 МДЦ (n=344) 0,17±0,1 0,10±0,05 84,52±5,10 р 0,001 0,008 0,04 При оценке колониеобразующей активности ГСК после криохранения концентратов ПК в обеих группах достоверных различий выявлено не было (Таблица 15). Таким образом, криоконсервированные концентраты ПК, полученные методом автоматического выделения клеток, после долгосрочного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержат достоверно больше нейтрофилов и CD45+/CD34+клеток, по сравнению с концентратами ПК, полученными методом двойного центрифугирирования. Таблица 15 Влияние методов лейкоконцентрации на колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Метод КОЕ-mix х105МНК (M±SD) КОЕ-М х105МНК (M±SD) КОЕ-ГМ х105МНК (M±SD) КОЕ-Эр х105МНК (M±SD) После % До сох-ия После % До сох-ия После % До сох- ия После % До сох-ия После % сох-ия МАВК 30,62 (n=256) ± 2,83 28,18 ± 8,22 99,40 ± 3,88 19,81 ± 6,73 18,34 ± 7,52 78,90 ± 4,12 14,92 ± 3,14 13,48 ± 1,31 97,40 ± 3,32 23,15 ± 4,31 22,22 ± 1,29 95,52 ± 7,10 27,27 ± 1,91 13,29 68,2 ± ± 8,21 0,91 29,12 МДЦ (n=344) ± 5,25 28,05 ± 8,48 97,5 ± 2,98 21,02 ± 3,83 18,73 ± 7,79 87,7 ± 5,61 13,89 ± 5,07 13,31 ± 7,64 99,1 ± 1,38 19,38 ± 1,16 18,45 ± 3,08 96,7 ± 1,47 27,5 ± 7,72 17,26 70,0 ± ± 1,36 1,11 58 До КОЕ-Г х105МНК (M±SD) р 0,54 0,65 0,26 0,08 0,1 0,32 0,13 0,56 0,77 0,06 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия - процент сохранения 0,06 0,53 0,34 0,06 0,07 59 3.1.3. Влияние величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» Все размороженные образцы ПК были разделены на две группы в зависимости от величины гематокрита после лейкоконцентрации: Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 12% до 39% - 286 концентратов ПК Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 40% до 69% - 314 концентратов Влияние величины гематокрита на клеточный состав концентратов ПК после криохранения представлен в таблице 16. Процент сохранения общей фракции ЯСК после криохранения был достоверно выше в группе с гематокритом от 40% до 69% -89,51±4,54%, чем в группе концентратов ПК с более низкой величиной гематокрита- 84,83±4,98% (р=0,01). Таблица 16 Влияние величины гематокрита на клеточный состав концентрата пуповинной крови Гема- ЯСКx107/мл токрит МНКх107/мл (M±SD) (%) Нейтрофилы х107/мл (M±SD) (M±SD) До После % сох-я До После % сох-я До 3,71 3,06 1,63 После % сох-я 12-39% 84,83 1,74 ±1,01 ±0,79 ±4,98 40-69% 3,64 (n=314) (n=286) р 96,27 1,91 ±0,54 ±0,59 ±2,41 ±0,61 ±0,47 ±8,02 89,51 1,70 96,79 1,96 ±0,94 ±0,80 ±4,54 ±0,58 ±0,60 ±3,25 ±0,62 ±0,54 ±2,64 0,7 0,01 0,09 0,08 0,08 3,19 0,7 1,64 0,09 1,45 1,46 0,8 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия -процент сохранения 79,64 79,22 0,37 60 При анализе количества МНК и нейтрофилов в концентрате ПК после криохранения в зависимости от величины гематокрита достоверно значимых различий получено не было. При оценке содержания жизнеспособных ЯСК в концентратах ПК после криохранения (CD45+7AAD-) в обеих группах значимых различий получено не было (Таблица 17). Таблица 17 Влияние величины гематокрита на жизнеспособность ядросодержащих клеток в концентратах пуповинной крови Гематокрит (%) %СD45+7ADD- (M±SD) До криохранения После криохранения 12-39% (n=286) 98,8±8,59 91,15±5,43 40-69% (n=314) 96,82±6,21 91,50±3,17 р 0,27 0,37 Абсолютное количество CD45+/СD34+ клеток ПК после криохранения концентратов ПК в обеих группах образцов статистически значимо не различалось (Таблица 18). Процент сохранения CD45+/СD34+ клеток после криохранения в концентрате ПК с величиной гематокрита от 12% до 39% был достоверно выше, чем в группе с более высокой величиной гематокрита - 96,32±3,46% и 90,06±5,83% соответственно, р=0,006. Таблица 18 Влияние величины гематокрита на количество CD45+/СD34+ клеток в концентрате пуповинной крови Гематокрит (%) CD45+/СD34+ х106/мл (M±SD) До криохранения После криохранения % сохранения 12-39% (n=286) 0,13±0,09 0,09±0,05 96,32±3,46 40-69% (n=314) 0,14±0,07 0,09±0,04 90,06±5,83 р 0,44 0,049 0,006 61 Колониеобразующая активности ГСК ПК после криохранения не изменялась в зависимости от величины гематокрита ПК (Таблица 19). В ходе проведенного исследования было выявлено, что ПК, криоконсервированная с величиной гематокрита от 12% до 39% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержит достоверно больше CD45+/CD34+ клеток и меньше ЯСК, по сравнению с криоконсервированной ПК с большей величиной гематокрита: процент сохранения 96,32±3,46% против 90,06±5,83% и 84,83±4,98% против 89,51±4,54%, р=0,01 и соответственно. Таблица19 Влияние величины гематокрита на колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Гематокрит (%) КОЕ-mixх105МНК M±SD До После КОЕ-Гх105МНК M±SD % До сох-я После КОЕ-Мх105МНК M±SD КОЕ-ГМх105МНК M±SD % До сох-я После % До сох-я После КОЕ-Эрх105МНК M±SD % До сох-я После % сох-я 29,50 26,72 ±4,67 ±8,72 94,20 ±5,41 23,88 21,25 ±15,41 ±4,61 91,54 ±1,55 15,32 ±3,19 14,20 ±4,95 91,46 ±1,02 23,40 18,31 ±2,93 ±8,97 89,33 ±0,99 28,22 ±5,03 14,84 ±3,29 79,29 ±1,28 40-69% (n=314) 26,92 24,42 ±4,09 ±7,99 93,04 ±2,84 19,59 ±1,65 93,85 ±1,63 13,49 ±8,87 12,71 ±7,04 91,88 ±1,60 18,87 15,51 ±7,34 ±8,54 91,85 ±1,75 26,55 ±6,75 16,24 ±8,88 78,02 ±0,76 62 12-39% (n=286) р 0,20 0,21 0,18 0,18 18,33 ±3,22 0,23 0,06 0,54 0,21 0,44 0,21 0,11 0,78 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия -процент сохранения 0,15 0,10 0,26 63 3.1.4. Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» Учитывая, что процентное содержание гемоконсерванта CPDA в каждом образце ПК индивидуальное, все размороженные образцы были разделены на две группы: Криоконсервированные концентраты ПК с величиной CPDA от 15 % до 29% - 236 концентрата ПК Криоконсервированные концентраты ПК с величиной CPDA от 30% до 60% -364 концентрата При оценке влияния содержания гемоконсерванта CPDA на клеточный состав концентратов ПК нами были получены следующие данные (Таблица 20). Таблица 20 Влияние гемоконсерванта CPDA на клеточный состав концентрата пуповинной крови ЯСКx107/мл (M±SD) % CPDA 15-29% (n=236) 30-69% (n=364) р МНКх107/мл (M±SD) Нейтрофилы х107/мл (M±SD) До После % сох-я До После % сох-я До После % сох-я 4,21 ±1,21 3,36 ±0,73 3,62 ±1,04 3,85 ±0,59 88,42 ±3,51 86,79 ±2,61 1,95 ±0,59 1,59 ±0,49 1,96 ±0,74 1,57 ±0,45 99,73 ±1,88 96,01 ±5,70 2,21 ±0,77 1,79 ±0,49 0,1 0,1 0,4 0,1 0,1 0,03 0,001 0,01 1,63 ±0,66 1,36 ±0,41 79,73 ±3,60 79,23 ±8,79 0,9 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия -процент сохранения Статистически значимых различий в проценте сохранения общей фракции ЯСК и нейтрофилов после криохранения концентратов ПК в двух группах образцов получено не было. Процент сохранения МНК после криохранения концентратов ПК в группе с величиной гемоконсерванта CPDA от 15 % до 29% достоверно был выше по 64 сравнению с группой концентратов ПК с более высокой величиной CPDA: 99,73±1,88% и 96,01±5,70% соответственно (р=0,03). Статистически значимых различий при сравнении содержания жизнеспособных ЯСК после криохранения концентратов ПК в двух группах получено не было (Таблица 21). Таблица 21 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA жизнеспособность ядросодержащих клеток в концентратах пуповинной крови Величина гемоконсерванта CPDA % CD45+7AAD- (M±SD) До криохранения После криохранения 15-29% (n=236) 98,8±0,83 91,17±0,17 30-60% (n=364) 99,28±0,67 91,48±0,32 р 0,8 0,9 Процент сохранения CD45+/СD34+ клеток в концентратов ПК с величиной гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% было достоверно выше, по сравнению с группой с более низким содержанием CPDA: 96,3±0,28% и 88,52±0,58% соответственно, р=0,012 (Таблица 22). Таблица22 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на количество CD45+/СD34+ клеток в концентратах пуповинной крови % CPDA 15-29% (n=236) 30-60% (n=364) CD45+/СD34+ х106/мл (M±SD) До После % криохранения криохранения сохранения 0,18±0,12 0,10±0,05 88,52±0,58 0,11±0,06 0,08±0,04 98,96±0,28 0,007 0,007 0,012 р Колониеобразующая активность ГСК ПК (КОЕ-mix, КОЕ-М, КОЕ-ГМ, КОЕЭр) в обеих группах образцов до и после криохранения достоверно не изменялась (Таблица 23). 65 Таким образом, показано, что клеточный концентрат ПК с концентрацией гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% после криохраненияв автоматизированной системе «BioArchive®» содержит больше CD45+/CD34+ клеток и меньше МНК, по сравнению с концентратом ПК с более низким содержанием CPDA. Таблица 23 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 66 % CPDA КОЕ-mix х105МНК M±SD 15-29% (n=236) 30-60% (n=364) р КОЕ-Г х105МНК M±SD КОЕ-М х105МНК M±SD КОЕ-ГМ х105МНК M±SD КОЕ-Эр х105 МНК M±SD До После % До сох-я После % До сох-я После % До сох-я После % До сох-я После % сох-я 33,07 ±3,96 29,00 ±2,52 96,33 19,28 ±1,26 ±1,82 17,41 ±2,12 91,43 14,27 ±8,24 ±3,70 13,08 ±2,02 91,76 21,40 ±8,95 ±3,00 18,95 ±5,34 88,92 25,23 ±6,61 ±6,36 16,18 ±4,70 79,24 ±9,77 25,55 ±6,43 21,66 ±4,27 92,18 21,11 ±2,68 ±3,75 12,46 ±6,17 89,25 14,47 ±3,55 ±8,60 12,94 ±7,28 88,67 20,87 ±2,55 ±1,66 16,68 ±4,95 86,49 28,48 ±5,09 ±1,83 15,31 ±3,42 76,34 ±1,06 0,3 0,37 0,03 0,05 0,13 0,056 0,09 0,2 0,1 0,8 0,13 0,56 0,67 0,88 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия -процент сохранения 0,05 67 3.2. Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы по использованию ДМСО в качестве криопротектора, поэтому большинство банков ПК разрабатывают свои собственные протоколы для криоконсервации ГСК ПК. Для оценки влияния отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реоплогиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, было изъято из автоматизированной системы «BioArchive®» 100 ранее криоконсервированных концентратов ПК с применением данного криоконсервирующего раствора. В качестве контрольной группы было изъято 100 образцов ранее криоконсервированных с использованием общепринятого криопротектора ДМСО+декстран 40. ДМСО + реополиглюкин -100 образцов ПК ДМСО + декстран 40 – 100 образцов ПК Характеристика криоконсервированных концентратов ПК представлена в таблице 24. Таблица 24 Характеристика криоконсервированных образцов пуповинной крови Показатель/криопротектор n Срок криохранения (год) Медиана (25-й и 75-й процентиль) МАВК МДЦ % ДМСО в конечном растворе Медиана (25-й и 75-й процентиль) ДМСО + реополиглюкин 100 ДМСО + декстран 40 100 2 (1-3) 2 (1-3) 64 36 54 46 10,1 (9,8-10,2) 10,0 (9,7-10,1) Как видно из представленной таблицы, медиана криохранения в обеих группах концентратов ПК составила 2 года (1-3). Методом автоматического выделения клеток в группе ДМСО + реополиглюкин было обработано 64 образца 68 и 54 образца в группе ДМСО + декстран 40. 36 образцов ПК из группы ДМСО + реополиглюкин и 46 из группы ДМСО + декстран 40 были обработаны методом двойного центрифугирования. Концентрация ДМСО в первой группе концентратов ПК составила 10,1%(9,8-10,2), во второй группе - 10% (9,7- 10,1). При анализе абсолютного количества до и после криохранения, а так же процента сохранения клеток в концентрате ПК после криохранения в зависимости от вида используемого комбинированного криопротектора достоверных различий получено не было (Таблица 25). Таблица 25 Клеточный состав концентрата пуповинной крови в зависимости от вида криопротектора Криопротектор ДМСО + декстран 40 (n=100) До ЯСКx107/мл M±SD После % сох-я До 3,40 ±0,12 2,93 ±0,09 1,70 1,40 ±0,17 ±0,06 88,60 ±3,00 МНКх107/мл M±SD После % сох-я 92,20 ±2,00 Нейтрофилы х107/мл M±SD До После % сох-я 1,92 1,44 ±0,01 ±0,05 78,32 ±2,10 ДМСО 4,60 3,60 89,20 2,10 1,70 96,00 2,40 1,76 77,36 + ±2,00 ±0,12 ±0,09 ±0,96 ±0,13 ±0,09 ±0,75 реополиглюкин ±0,23 ±0,02 (n=100) 0,08 0,8 0,7 1,00 0,99 0,86 0,58 0,99 0,51 р Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия-процент сохранения При сравнении содержания жизнеспособных ЯСК до и после криохранения концентратов ПК в двух группах образцов значимых различий получено не было (Таблица 26). Таблица 26 Жизнеспособность ядросодержащих клеток в концентрате пуповинной крови в зависимости от вида криопротектора Криопротектор ДМСО + декстран 40 (n=100) ДМСО+ реополиглюкин (n=100) р % CD45+7ADD- (M±SD) До После криохранения криохранения 98,90±0,49 91,12±0,21 98,50±0,86 89,93±0,69 0,5 0,67 69 При оценке абсолютного количества CD45+/СD34+ до и после криохранения, а так же процента их сохранения после криохранения концентратов ПК в обеих группах криоконсервированных образцов статистически значимых различий получено не было (Таблица 27). Таблица 27 Количество CD45+/СD34+ клеток в концентрате пуповинной крови до и после криохранения в зависимости от вида криопротектора Вид криопротектора CD45+/СD34+х106/ мл M±SD До После %сох-ия ДМСО+ декстран 40 (n=100) 0,18 ±0,02 0,15±0,05 86,26±0,70 ДМСО+ реополиглюкин (n=100) 0,19±0,03 0,16±0,20 87,20±0,40 р 0,66 0,53 0,36 Колониеобразующая активность ГСК ПК до и после криохранения в зависимости вида используемого комбинированного криопротектора не изменялась (Таблица 28). Таким образом, в проведенном исследовании достоверных различий в клеточном составе концентратов ПК, количестве СD45+/CD34+, жизнеспособности ЯСК и колониеобразующей активности ГСК ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» при использовании двух видов криопротекторов выявлено не было. . Таблица 28. Колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в зависимости от вида комбинированного криопротектора Криопротектор 70 ДМСО + декстран 40 (n=100) КОЕ-miх x105 МНК КОЕ-Г x105 МНК КОЕ-М x105 МНК КОЕ-ГМ x105 МНК КОЕ-Эр x105 МНК M±SD M±SD M±SD M±SD M±SD До Пос- % До Пос- % До После % До Пос- % До Пос- % ле сох-ия ле сох-ия сох- ия ле сох-ия ле сох-ия 34,36 ±6,08 30,90 91,20 ±1,90 ±1,90 22,30 19,80 83,26 ±1,90 ±1,20 ±0,96 15,42 14,52 ±1,60 ±1,80 87,90 ±1,80 22,70 18,22 83,20 ±5,50 ±1,90 ±2,00 27,70 12,30 75,6 ±2,60 ±1,90 ±2,10 ДМСО 52,60 41,30 89,50 + реополиглюкин ±2, 60 ±2,10 ±0,60 (n=100) 23,20 20,30 84,70 ±1,32 ±1,60 ±0,60 15,81 15,54 ±2,80 ±8,30 88,56 ±0,60 22,11 19,20 85,21 ±1,20 ±1,80 ±0,90 27,93 12,82 73,72 ±2,50 ±1,70 ±2,30 р 0,09 0,87 0,54 0,09 0,54 0,70 0,61 0,36 0,12 0,90 0,61 0,25 0,21 Примечание: До-до криохранения, После- после криохранения, % сох-ия-процент сохранения 0,12 0,45 71 3.3. Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве 3.3.1. Особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москвы За период с 2004 г. по октябрь 2013 г. в Московский банк стволовых клеток поступило 11565 образцов ПК. В процессе тестирования (первичная и вторичная отбраковка) 5733 (49,57%) образцов ПК были отбракованы, из них 441 образца (7,69%) в связи с наличием инфекционных маркеров (116 образцов (2,0%) – наличие серологических маркеров острой HBV и HСV-инфекции и/или выявления ДНК вирусов в цельной крови при ПЦР - диагностике; 38 (0,66%) – в связи с обнаружением маркеров сифилиса (антитела к Treponema pallidum); 287 (5,0%) образцов в связи с бактериальной контаминацией). 5832 концентратов ПК (50,43%) были заложены на криохранение в кол-во криоконсервированных образцов ПК автоматизированную систему «BioArchive®» (Рисунок 5). 1200 1118 1000 800 802 610 519 565 761 642 600 355 361 400 200 0 год закладки Рисунок 5. Количество криоконсервированных пуповинной крови в Московском банке стволовых клеток концентратов 72 В регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК было передано 4800 (41,50%) криоконсервированных концентратов ПК, прошедших инфекционный контроль и типированных по пяти генам HLA-системы на уровне базового разрешения: HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1. На каждый концентрат ПК, переданный в безвозмездный регистр ГСК ПК, был оформлен паспорт образца для неперсонифицированного хранения с указанием клеточного состава и биологических характеристик ГСК ПК (Рисунок 6). ГБУЗ «Банк стволовых клеток ДЗМ» Паспорт гемопоэтических стволовых клеток ПК Заполняемая форма 115516 Москва, ул. Бакинская, 31Тел./Факс. (495) 327-18-53 e-mail: [email protected] № образца Штрих-код Дата обработки: Родильный дом: Объем конечного продукта мл Количество WBC х 10 6/unit Количество MNC х 10 6/unit Группа крови и резус-принадлежность Количество CD 34+ клеток в концентрате х 10 5/мл + Количество CD45 7-ADD клеток % Количество клеток предшественников в 1 мл концентрата КОЕ-mix КОЕ (ГМ +Г + М) Пробы для определения HLA – фенотипа переданы Тестирование на стерильность Заполнил Должность Ф.И.О. Подпись: Дата: пробы не контаминированы Проверил Должность Ф.И.О. Подпись: Дата: . . Рисунок 6. Паспорт криоконсервированного концентрата пуповинной крови для неперсонифицированного хранения 73 Средний объем концентрата ПК, внесенного в общественный регистр ГСК ПК, составил 20,2±1,2. мл. Клеточный состав, жизнеспособность и количество СD45+/CD34+ представлены в таблице 29. Таблица 29 Характеристика криоконсервированных концентратов пуповинной крови общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=4800) Показатель M±SD ЯСКx106/в образце 1666,6 ±738,90 МНКx106/в образце 500,14±221,70 %CD45+7AAD-/в образце 98,03 ±5,51 CD45+/СD34+x106/ в образце 7,24 ±8,86 При анализе количественного распределения ЯСК в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в общественный регистр ГСК ПК, были получены следующие данные: 720 (15%) образцов ПК содержали от 363,05 до 999,9х106 ЯСК, что позволяет их использовать для трансплантации у пациентов с весом до 30 кг; 2880 (60%) образцов ПК содержало от 1000,0 до 1999,9 х106 ЯСК, что дает возможность их использовать для пациентов с весом более 30 кг; 1200 (25%) образцов содержали от 2000,0 до 4628,0х106 ЯСК, что позволяет их использовать для пациентов с весом более 60 кг (Таблица 30). Таблица 30 Количественное распределение ядросодержащих клеток в криоконсервированных концентратах пуповинной крови (n=4800) ЯСКx106/ в образце Абс. количество образцов Отн. 363,05-999,9 720 15 1000,0-1999,9 2880 60 2000,0-4628,0 1200 25 74 Колониеобразующая активность ГСК ПК, внесенных в общественный регистр ГСК ПК, представлена в таблице 31. Таблица 31 Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=4800) Показатель M±SD КОЕ- mix х 105МНК 31,20±7,52 КОЕ-Г x 105МНК 22,61±1,12 КОЕ-М x 105МНК 16,91±3,65 КОЕ-ГМ x 105МНК 27,52 ±2,43 КОЕ-Эр x 105МНК 31,73±6,14 Ключевым моментом проведения алло-ТГСК является наличие гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора. На сегодняшний день регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК Московского банка стволовых клеток включает в себя доноров многих национальностей (Таблица 32). Таблица 32 Национальный состав общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в Московском банке стволовых клеток. Национальность Американцы Асириец Афганцы Абхазцы Аварцы Азербайджанцы Армяне Афганцы Балкарцы Башкиры Белорусы Болгары Абс. 1 11 1 8 24 105 153 2 3 5 15 4 Отн.(%) 0,02% 0,06% 0,02% 0,17% 0,50% 2,19% 3,19% 0,04% 0,06% 0,10% 0,31% 0,08% Национальность Коми Корцы Кумык Лаки Лезгины Мадьяр Марийцы Мордвины Немцы Ногайцы Осетины Поляки Абс. 3 35 10 5 16 1 2 1 3 7 25 5 Отн.(%) 0,06% 0,73% 0,21% 0,10% 0,33% 0,02% 0,04% 0,02% 0,06% 0,15% 0,52% 0,10% 75 Буряты Гагаусы Греки Грузины Дагестанцы Дориане Евреи Езиты Ингуши Индусы Иранцы Кабардинцы Казахи Калмыки Карачаевцы Киргизы 9 2 6 28 12 20 24 7 14 1 1 7 3 4 3 24 0,19% 0,04% 0,13% 0,58% 0,25% 0,42% 0,50% 0,15% 0,29% 0,02% 0,02% 0,15% 0,06% 0,08% 0,06% 0,50% Русские Сербы Таджики Татары Тувинцы Турки Туркмены Удмурты Узбек Украинцы Цахуры Черкесы Чеченцы Чуваши Якуты - Продолжение Таблицы 32 3776 78,67% 2 0,04% 9 0,19% 179 3,73% 1 0,02% 1 0,02% 1 0,02% 1 0,02% 12 0,25% 113 2,35% 1 0,02% 1 0,02% 47 0,98% 14 0,29% 6 0,13% - Известно, что частота встречаемости аллелей/групп аллелей, а также их неравновесное сцепление в гаплотипах различаются в различных этнических популяциях. Для быстрого и эффективного поиска совместимого донорского образца ГСК в различных региональных банках ПК необходимо учитывать и частоту распределения их HLA-гаплотипов [4]. В данном исследовании была проанализирована частота встречаемости 2-х локусных (B/C и DRB1/DQB1), 4-х локусных (B/C/DRB1/DQB1) и 5-ти локусных (A/B/C/DRB1/DQB1) гаплотипов. Наиболее часто встречаемыми вариантами гаплотипов B/C были – В*35/С*04 (8,9%), В*08/С*07 (8,4%), В*13/С*06 (8,4%), В*07/С*07 (7,9%), В*44/С*05 (5,6%) и В*18/С*12 (5,1%). По гаплотипам DRB1/DQB1 - DRB1*11/DQB1*03 (14,4%), DRB1*04/DQB1*03 (13,0%), DRB1*07/DQB1*02 (13,0%), DRB1*01/DQB1*05 (11,1%), DRB1*15/DQB1*06 (11,1%), DRB1*13/DQB1*06 (10,2%) и DRB1*03/DQB1*04 (8,9%). Среди 4-х локусных гаплотипов B/C/DRB1/DQB1 с наибольше частой встречаемости были B*13/C*06/DRB1*07/DQB1*02 (8,45%), 76 B*08/C*07/DRB1*03/DQB1*02 (7,46%), B*18/C*07/DRB1*11/DQB1*03 (3,48%),B*07/C*07/DRB1*15/DQB1*01(3,48%), B*15/C*03/DRB1*04/DQB1*03 (3,01%). По 5-ти локусным гаплотипам A/B/C/DRB1/DQB1 были выявлены различные варианты их различных сочетаний, из которых с наибольшей частотой встречаемости были: A*01/B*08/C*07/DRB1*03/DQB1*02 - 3,92%, A*24/B*13/C*06/DRB1*07/DQB1*02 - 2,29%, A*25/B*18/C*12/DRB1*15/DQB1*06 - 1,96%, A*24/B*18/C*07/DRB1*11/DQB1*03 - 1,63%, A*30/B*13/C*06/DRB1*07/DQB1*02 - 1,63%. Технология поиска совместимого донорского образца ГСК ПК в общественном регистре Московского банка стволовых клеток основана на индивидуальном подборе пар донор-реципиент, совместимых по 3 генам HLAсистемы (А, В и DRB1) и состоит из ряда последовательных этапов, необходимых для получения положительного результата. Этапы подбора доноров ГСК ПК 1. Начальным моментом для поиска совместимого донорского образца ГСК ПК являлся запрос от клинического центра - «Первичный запрос на поиск» (Рисунок 7). 2. После получения запроса на поиск совместимого донорского образца ГСК ПК в информационной базе общественного регистра осуществлялся подбор всех совместимых и частично совместимых образцов ПК по 3 генам HLAсистемы - A, B и DRB1 на уровне базового разрешения. 3. Полученные результаты поиска высылались в клинические центры/запрашивающие организации. В случае обнаружения образцов ГСК ПК со степенью информацию образцов. совместимостью о биологических 4/6-6/6 поисковый характеристиках центр запрашивал заинтересовавших его 77 4. В дальнейшем, клинический центр/запрашивающие организации высылали запрос на выполнение HLA-типирования с «высоким разрешением» по локусу HLA-DRB1 у отобранных образцов ПК. Целью данного HLA-типирования, являлось определение совместимости пары донор-реципиент на уровне аллеля. ГБУЗ «Банк стволовых клеток ДЗМ» Название документа Запрос на поиск образцов ПК 115516 Москва, ул. Бакинская, 31.Тел./Факс. (495) 327-18-53 e-mail: [email protected] Запрос на первичный (повторный) поиск образцов ПК Ф.И.О. Дата рождения: Диагноз Дата постановки диагноза: Результаты типирования пациента А*_____В*_____С*_______DRB1*________DRB______DQB1*______ А*_____В*_____С*_______DRB1*________DRB______DQB1*______ Поиск срочный: ДА, НЕТ (нужное подчеркнуть) Запрашивающая организация: Телефон Факс e-mail Трансплантационный центр: Дополнительные Координатор: Врач комментарии______________________________________ Передал Должность Ф.И.О. Подпись: Дата: Получил Должность Ф.И.О. Подпись: Дата: Отправил Должность: Ф.И.О. Подпись: Дата: Рисунок 7. Запрос на индивидуальный подбор неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 5. В случае, если результаты HLA-типирования интересующих образцов ГСК ПК оказывались совместимыми с реципиентом на уровне аллеля, клинический центр высылал заявку на резервирование или изъятие данных образцов для последующего клинического использования. 78 6. Перед проведением алло-ТГСК ПК согласно международным стандартам в обязательном порядке проводилось верифицирующее HLA-типирование резервированных образцов ПК. За период с 2006 по октябрь 2013 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 516 первичных запросов из разных клинических и поисковых центров (Таблица 33-34). Таблица 33 Количество запросов на подбор донорских образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=516) Год 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Всего Запросы 9 36 66 176 85 82 47 15 516 Таблица 34 Запрашивающие организации (n=516) Клинические центры Российская детская клиническая больница, г. Москва Запросы 153 Морозовская детская городская клиническая больница, г. Москва 97 Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева", г. Москва Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой, г. Санкт-Петербург Краснодарская детская краевая клиническая больница, г. Краснодар 86 Областная детская клиническая больница, г. Екатеринбург 23 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения нижегородской области «Нижегородская областная детская клиническая больница", г. Нижний Новгород Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, г. Москва 31 Московский областной онкологический диспансер, г. Балашиха 15 Городская клиническая больница имени С.П. Боткина, г. Москва 4 Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии,г. Минск Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, г. Санкт-Петербург 1 57 28 20 1 79 Срок подбора совместимого донорского образца ГСК ПК с момента обращения клинического центра в Московский банк стволовых клеток составлял не более 2 суток, включая типирование локусу HLA-DRB1 на уровне высокого разрешения по у отобранных образцов. В таблице 35 представлены данные о реципиентах ГСК. Медиана возраста пациентов на момент запроса составила 8 лет (от 3 месяцев до 62 лет). В 260 случаев (50,39%) запросы на поиск образцов ПК поступили для пациентов мужского пола, в 256 случае (49,61%) – для женского. Таблица 35 Характеристика реципиентов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=516) 8 (3 мес. - 62 года) Возраст, полных лет, медиана 260/256 Мужчины/женщины Абс. % Нозологическая структура больных Злокачественные заболевания 266 51,55 Острый лимфобластный лейкоз 110 41,35 Острый миелобластный лейкоз 76 28,57 Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз 27 10,15 Хронический миелоидный лейкоз 14 5,26 Острый бифинотипический лейкоз 7 2,63 Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз 6 2,26 Неходжинские лимфомы 6 2,26 Лимфома Ходжкина 4 1,50 Нейробластома 3 1,13 Острый нелимфобластный лейкоз 1 0,38 Множественная миелома 1 0,38 Саркома Юинга 1 0,38 Острый недефференцированный лейкоз 1 0,38 Синдром костно-мозговой недостаточности 85 16,47 Миелодиспластический синдром 31 36,47 Апластическая анемия 27 31,76 Анемия Фанкони 19 22,35 Гипопластическая анемия Даймонда-Блекфена 4 4,71 Синдром Костмана 2 2,35 Вторичная нейтропения 1 1,18 Амегакариоцитоз 1 1,18 Иммунодефицитные состояния 45 8,72 Первичный иммунодеффицит, тяжелая комбинированная иммунная 30 66,67 недостаточность Первичный иммунодеффицит,Вискотт-Олдрич синдром 14 31,11 80 Продолжение Таблицы 35 Первичный иммунодеффицит,Омен синдром 1 2,22 Первичные нарушения метаболизма и наследственные 19 3,68 нарушения обмена веществ Мукополисахаридоз Лейкодистрофия Болезнь Нимана Пика Синдром Пирсона Талассемия 13 4 1 1 5 5 68,42 21,05 5,26 5,26 1,0 100 Другое Лимфопролиферативный синдром Болезнь Альберс-Шенберга (остеопетроз) Нейродистрофия центральной нервной системы Синдром Стерджа—Вебера—Краббе Нет данных 3 3 2 1 87 0,58 0,58 0,39 0,19 16,86 Гемаглобинопатии В 266 случаях (51,55%) пациенты страдали злокачественными заболеваниями. Из них в большинстве случаев были диагностированы острый лимфобластный и миелобластный лейкоз – 110 (41,35%) и 76 (28,57%) случаев соответственно. В 27 случаях (10,15%) - ювенильный мономиелоцитарный лейкоз, в 14-ти (5,26%) - хронический миелоидный лейкоз. Острый бинофинотипический лейкоз был верифицирован у 7 пациентов (2,63%), гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз у 6-ти (2,26,%). Неходжкинские лимфомы были диагностированы в 6-ти случаях (2,26%), лимфома Ходжкина в 4-х случаях (1,50%), нейробластома в 3-х случаях (1,13%). По 1- му случаю запросы поступили для пациентов, у которых были выявлены острый нелимфобластный лейкоз, множественная миелома, саркома Юинга и острый недифференцированный лейкоз (по 0,38% соответственно). В 82-х случаях (16,47%) запросы на поиск необходимых образцов ПК поступили из клиник для пациентов, у которых был верифицирован синдром костно-мозговой недостаточности. Из них миелодиспластический синдром был диагностирован в 31-ом случаяе (36,47%), апластическая анемия в 27-ми (31,76%), анемия Фанкони в 19-ти (22,35%), гипопластическая анемия Даймонда-Блекфена в 4-х случаях (4,71%), синдром Костмана (детский генетически детерминированный агранулоцитоз) в 2-х случаях (2,35%). По 81 одному случаю были диагностированы амегакариоцитоз и вторичная нейтропения (по 1,18% соответственно). В 45-ти запросах (8,72%) на подбор совместимых образцов ПК был указан диагноз первичный иммунодеффицит, из них в 30-ти случаях (66,67%) пациенты страдали тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью, в 14-ти (31,11%) - синдром Вискотта - Олдрича и в 1-ом случае (2,22%) синдром Омена. В 19-ти случаях (3,68%) у пациентов, нуждающихся в трансплантации ГСК, были обнаружены первичные нарушения метаболизма и наследственные нарушения обмена веществ. Из них диагноз мукополисахаридоза был указан в 13-ти запросах (68,42%), лейкодисторофия в 4-х (21,05%), синдром НиманаПика и синдром Пирсона в 2-х запросах (по 5,26%). В 5- ти случаях (1,0%) в бланках запросов был указан диагноз талассемии. Лимфоролиферативный синдром и болезнь Альберс-Шенберга были указаны в 6-ти запросах (по 0,58 % соответсвенно). Нейродистрофия центральной нервной системы в 2-х запросах (0,39%), синдром Стерджа — Вебера—Краббе был указан в 1-ом запросе (0,19%). В 87 запросах (16,86%) диагноз у реципиента ГСК указан не был. В 448 случаях (86,82%) по запросам были выявлены совместимые и частично совместимые доноры ГСК ПК по 3 генам HLA-системы - A, B и DRB1 на уровне базового разрешения. В 68-ми случаях (13,18%) не удалось обнаружить подходящие образцы пуповинной крови (Таблица 36). Таблица 36 Структура запросов на подбор донорских образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=516) Структура первичных запросов Запросы, по которым были выявлены совместимые образцы ГСК ПК Запросы, по которым не были выявлены совместимые образцы ГСК ПК Количество запросов Абс. % 448 86,82% 68 13,18% 82 В 268 случаях (59,82%) по первичному запросу в базе общественного регистра ГСК ПК были выявлены частично совместимые образцы пуповинной крови с 2 несоответствиями по генам HLA- А или В (4/6), в 134-х случаях (29,91%) – с 1 или 2- несоответствиями по генам HLA- А или В (5/6 и 4/6). В 22-ти случаях (4,91%) были обнаружены частично совместимые образцы пуповинной крови с 1 несоответствиями по HLA-A или В (5/6). Предварительно совместимые образцы ПК по трем генам HLA – системы были выявлены в 24-х случаях (5,36%), из них в 4-х случаях дополнительно были обнаружены образцы ПК со степенью совместимости 4/6, в 8- ми со степенью совместимости 5/6 и 4/6, в 7-ми – 5/6 (Таблицы 37-38). Таблица 37 Результаты подбора донорских образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=448) Результаты подборов Образцы ПК со степенью совместимости 6/6 Образцы ПК со степенью совместимости 6/6 и 5/6 Образцы ПК со степенью совместимости 6/6, 5/6 и 4/6 Образцы ПК со степенью совместимости 6/6 и 4/6 Образцы ПК со степенью совместимости 5/6 Образцы ПК со степенью совместимости 5/6 и 4/6 Образцы ПК со степенью совместимости 4/6 Количество подборов Абс. % 2 0,45 9 2,01 9 2,01 4 0,89 22 4,91 134 29,91 268 59,82 Таблица 38 Вероятность подборов донорских образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови с различной степенью совместимости Степень совместимости Вероятность подбора 6/6 5/6 4/6 1:218 1:28 1:12 83 По вторичным запросам клинических центров у совместимых образцов ПК с реципиентом ГСК было выполнено HLA-типирование по локусу HLA-DRB1 на уровне высокого разрешения. Таким образом, в результате проведенного исследования все криоконсервированные образцы ПК, переданные в общественный регистр ГСК ПК Московского банка стволовых клеток, были охарактеризованы с позиции биологических характеристик на 1 криоконсервирваонный образец ПК. Получены иммуногенетические характеристики - характер распределения генных частот HLA класса I и II. По данным работы регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК Московского банка стволовых клеток частота полной совместимости донора и реципиента ГСК (6/6) составила - 1:218. 3.3.2. Анализ применения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови В настоящей работе проведена оценка качества ГСК ПК, выданных клиническим центрам для проведения алло-ТГСК. По запросу четырех клинических центров (ФГУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева г. Москвы и ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова, ФГБУ «РДКБ» Минздравсоцразвития России, ГБУЗ НО «Нижегородский ОЦК») за период с 2006 по октябрь 2013 гг. было выдано 56 криоконсервированных концентратов ПК от 47 доноров (9 образцов ПК были разделены в процессе заготовки клеточного материала) (Таблица 39-40). Из них трансплантировано – 52 концентрата (в связи с ухудшением соматического состояния в предтрансплантационном периоде 4 были утилизированы). Срок криохранения ГСК ПК, выданных для проведения трансплантации, составил 48,15±2,34 месяца. Средний объем образцов ПК-21,02±0,99 мл. Абсолютное количество 1161,89±410,16х106/ в ЯСК образце, в выданных МНК – концентратах ПК 549,89±209,77х106/в CD45+/СD34+ клеток -9,46±6,65х106/в образце (таблица 41). было образце, 84 Таблица 39 Количество выданных для трансплантации и трансплантированных криоконсервированных концентратов пуповинной крови. Характеристика Количество образцов ПК, переданных в ТЦ Количество доноров Количество деленных образцов ПК Количество трансплантированных образцов ПК n 56 47 9 52 Таблица 40 Количество выполненных аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=29) Кол-во Трансплантационный центр алло-ТГСК ПК ФГУ ФНКЦ им. Дмитрия Рогачева г. Москва 17 ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова 10 ФГБУ «РДКБ» Минздравсоцразвития России 1 ГБУЗ НО «Нижегородский ОЦК» 1 Таблица 41 Характеристика выданных криоконсервированных образцов ПК (n=56) Показатель ЯСКx106/в образце МНКx106/в образце CD45+/СD34+x106/ в образце M±SD 1161,89±47,68 549,89±54,67 9,46±1,67 При оценке колониеобразующей активности выданных ГСК ПК количество КОЕ-mix составило 29,70±19,02х105 МНК, КОЕ-Г - 20,76±9,94x105 МНК, КОЕМ было 30,04±4,66x105 МНК, КОЕ-ГМ - 27,50±13,69x105 МНК, КОЕ-Эр составило 36,44±20,22x105 МНК (Таблица 42). 85 Таблица 42 Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, выданных для клинического применения (n=56) Показатель КОЕ- mix х 105МНК КОЕ-Г x 105МНК КОЕ-М x 105МНК КОЕ-ГМ x 105МНК КОЕ-Эр x 105МНК M±SD 29,70 ±4,39 20,76 ±2,82 30,04 ±16,52 27,50 ±3,11 36,44 ±4,73 За период с 2008 по октябрь 2013 гг. было выполнено 29 алло-ТГСК ПК 28 пациентам (одному пациенту была проведена повторная алло-ТГСК ПК в связи с первичным неприживлением трансплантата). Медиана возраста пациентов на день трансплантации составила 3 года (от 3 месяцев до 45 лет). До 1 года было 6 больных, от 2 до 5 лет- 14, от 10 до 20 лет – 8, старше 20-ти лет -1. Пациентов мужского пола -18, женского – 10 (Таблица 43). Таблица 43 Распределение реципиентов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по полу и возрасту (n=28) Показатель Возраст, полных лет, медиана (25-75 персентили) n 3 (1-6,3) до 1 года 6 от 2 -5 лет от 10-20 лет 14 8 Старше 20-ти 1 Мужской пол 18 Женский пол 10 В 20-ти случаях (66,7%) алло-ТГСК ПК были выполнены по поводу гематологических заболеваний: рецидивы и рефрактерные формы острого 86 лимфобластного лейкоза – 5 случев (17,86%), острый миелобластный лейкоз – 6 случаев (21,43%), ювенильный миеломоноцитарный лейкоз -4 случая (14,29%), приобретенная апластическая анемия, тяжелое течение - 2 случая (7,14%), миелодиспластический синдром – 2 случая (7,14%), в 1-ом случае по поводу врожденной нейтропении Костмана (3,57%). В 4-х случаях (14,29%) алло-ТГСК ГСК ПК выполнена по поводу мукополисахаридоза I типа, в 1-ом - остеопетрозиса (3,57%), и в 3-х случаях по поводу тяжелого первичного иммунодефицита (10,71%) (Таблица 44). Таблица 44 Распределение реципиентов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по нозологиям (n=28) Нозология Острый лимфобластный лейкоз n 5 % 17,86 Острый миелобластный лейкоз Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз 6 4 21,43 14,29 Миелодиспластический синдром Приобретенная апластическая анемия 2 2 7,14 7,14 Мукополисахаридоз Остеопетроз 4 1 14,29 3,57 Первичный иммунодефицит 3 10,71 Врожденная нейтропения Костмана 1 3,57 Выбор донорских образцов ГСК ПК производился клиническим центром в пользу наиболее совместимого образца по системе HLA с учетом возрастных и весовых показателей реципиента. В 5 случаях алло-ТГСК ПК были проведены от HLA-идентичных сиблингов, из них в 3 случаях донорами ГСК были только родные братья/сестры, а в 2 случаях дополнительно использовался образец ПК со степенью HLA - совместимости 5/6. В 24-х случаях алло-ТГСК проведены от неродственных доноров ГСК ПК с различной степенью HLA- совместимости: в 1-ом случае - 6/6, в 4-х - 6/6 и 5/6, в 15-ти – 5/6, в 4-х – 4/6 (Таблица 45). 87 Таблица 45 Характеристика доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (n=29) Тип донора HLA- идентичный сибс (6/6) HLA- идентичный сибс (6/6) и неродственный донор со степенью совместимости 5/6 HLA- идентичный неродственный донор (6/6) HLA-идентичный неродственный донор (6/6) и донор со степенью совместимости 5/6 Неродственный донор со степенью совместимости 5/6 Неродственный донор со степенью совместимости 4/6 n 3 2 1 4 15 4 Данные о результатах применения ГСК ПК были представлены в 27 случаях, в 2 случаях медицинская документация не представлена. В 16-ти случаях в качестве источника ГСК использовался 1 концентрат ПК, в 9-ти случаях 2 концентрата ПК от разных доноров, в 2-х случаях – 3 концентрата ПК от разных доноров (Таблица 46). Таблица 46 Источник гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации (n=27) Источник ГСК n 16 9 2 1хПК 2xПК 3xПК По данным полученных эпикризов применения ГСК ПК (n=27) все пациенты получили кондиционирования миелоаблативные согласно химиотерапевтические установленному диагнозу. режимы Объем трансплантированной ПК составил 35,72±14,87 мл, объем ДМСО составил 0,74±0,46 мл/кг. Количество трансплантированных ЯСК - 15,07±9,05x107/кг, МНК - 7,31±4,82x107/кг, CD45+/СD34+ клеток– 2,58±3,18x107/кг (Таблица 47). Таблица 47 88 Характеристика трансплантата пуповинной крови (n=27) Показатель Объем концентрата ПК (мл) ДМСО (мл/кг) ЯСКх107/кг МНКх107/кг CD45+/СD34+ х106/кг M±SD 35,72±14,87 0,74±0,46 15,07±9,05 7,31±4,82 2,58±3,18 Тяжелых нежелательных реакций на инфузию ГСК ПК отмечено не было. В 5-ти случаях (18,5%) были зарегистрированы транзиторные реакции: 2-х случаях - тошнота и рвота, в1-ом - гипертензия и тошнота на момент трансфузии донорских клеток, и в 2-х случаях - макрогематурия и гипертензия (Таблица 48). Таблица 48 Нежелательные реакции на трансфузию криоконсервированной пуповинной крови (n=27) Характеристика Тошнота и рвота Тошнота и транзиторная гипертензия Макрогематурия и гипертензия n 2 1 2 По данным представленных эпикризов применения ГСК ПК приживление донорских ГСК к 100 дню посттрансплантационного периода было зарегистрировано в 15 случаях (55,6%), неприживление в 12 (44,4%). Медина восстановления гранулоцитопоэза (гранулоциты периферической крови ≥ 0,5х109/л в течение трех последовательных дней) у пациентов составила 24 дня (20-31). Восстановление тромбоцитопоэза (тромбоциты ≥ 50 109/л в течение трех последовательных дней без трансфузий донорских тромбоцитов) к 100 дню было достигнуто у 10-типациентов (37,3%) в среднем на 28 день. О. РТПХ развилась в 7 случаях (25,9%), при этом во всех случаях I-II степени. В настоящее время, согласно представленным данным из 89 трансплантационных центров, 16 пациентов (59,2%), перенесших алло-ТГСК живы. Таким образом, клеточные концентраты ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» является полноценным источником ГСК, и могут быть использованы в клинической практике. 3.4 Алгоритм работы общественного банка-регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови В результате проведенных исследований был разработан алгоритм работы банка-регистра безвозмездных неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (Рисунок 7): Эпикриз клинического применения к л и н и ч е с к и й ц е н т р Передача концентратов ПК в клинические центры Верифицирующее HLAтипирование на уровне базового разрешения Резервирование совместимых образцов ПК HLA- типирование по локусу DRB1 на уровне высокого разрешения у совместимых образцов ГСК ПК Подбор всех первичносовместимых образцов ГСК ПК на уровне базового разрешения Первичный запрос на подбор донорских ГСК ПК из клинических центров Рисунок 7. Алгоритм Отбор потенциальных доноров ПК Получение информированного согласия Сбор ПК Регистрация образцов ПК Первичная отбраковка концентратов ПК Обработка образцов ПК МАВК МДЦ Криоконсервация концентратов ПК Тестирование образцов ПК Типирование концентратов ПК по 5-ти генам HLAсистемы (А,В,С, DRB1 и DQB1) Вторичная отбраковка концентратов ПК Паспортизация концентратов ПК Внесениеконцентратов ПК в общественный регистр доноров ГСК ПК работы общественного гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови банка-регистра 90 После отбора потенциальных доноров ПК, получения информированного согласия роженицы в дородовом периоде, осуществляли сбор ПК без вмешательства в процесс родов только после рождения ребенка и доставляли ее в регистратуру Московского банка стволовых клеток. Далее осуществлялась регистрация поступившей ПК в базе данных. Проводилась первичная отбраковка образцов ПК («чистый» вес меньше 60 грамм, нарушение герметичности мешка, неправильное заполнение документации, наличие тромбов и гемолиза, нарушение температурного режима в процессе хранения и транспортировки). В дальнейшем проводили обработку ПК двумя методами с учетом установленных показаний МДЦ и МАВК. После выделения ЯСК все концентраты ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном системе «BioArchive®». Все криоконсервированные концентраты ПК подвергались тестированию с определением групповой принадлежности, клеточного состава, биологических характеристик ГСК, проводили инфекционныйконтроль, HLA-генотипирование по 5-ти генам (локусы А,В,С, DRB1 и DQB1). В последующем осуществлялась вторичная отбраковка образцов ПК по итогам инфекционного контроля. После паспортизации ПК данные о криоконсервированном концентрате пуповинной крови вносились в общественный регистр ГСК ПК. При получении из клинических центров запроса на поиск совместимого донорского образца ГСК ПК в информационной базе Московского банка стволовых клеток осуществлялся подбор всех совместимых и частично совместимых образцов пуповинной крови по трем генам HLA-системы- A, B и DRB1 на уровне базового разрешения. В случае полной или частичной совместимости образца ГСК ПК с реципиентом по генам HLA - системы, по запросу клинических центров выполнялось HLA-типирование по локусу HLADRB1на уровне высокого разрешения у отобранных образцов ГСК ПК. При полной/частичной совместимости отобранных образцов ГСК ПК с реципиентом 91 осуществлялось их резервирование в базе данных регистра; перед проведением алло-ТГСК ПК проводилось верифицирующее HLA-типирование резервированных донорских образцов ПК и передача их в клинический центр. После проведения трансплантации ГСК ПК из клинических центров получали эпикризы применения ГСК ПК для оценки качества выданных концентратов ПК. Таким образом, на заключительном этапе проведенной работы был разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release). 92 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности ее заготовки, развитию банков ПК и совершенствованию методов ее заготовки, улучшению качества индивидуальных подборов пар доноррципиент, за последние 20 лет в мире было выдано более 20 000 полностью тестированных образцов ПК для проведения аллогенных трансплантаций ГСК ПК более 14000 пациентам с различными заболеваниями [21;64]. Использование ПК в качестве альтернативного источника ГСК показало, что она является полноценным и жизнеспособным источником ГСК, способным обеспечить долгосрочное восстановление гемопоэза. Это позволило существенно расширить возможность ее применения особенно в терапии тех пациентов, которым ранее данный вид лечения был недоступен (представители расовых и этнических меньшинств). Абсолютным условием для проведения алло-ТГСК является наличие HLA - совместимого донора [27;65;135]. Поиск неродственного HLAсовместимого донора – это весьма трудоемкий и длительный процесс, связанный с существенными временными и финансовыми трудностями. В среднем подбор донора занимает около 3-4 месяца, и зачастую пациент не доживает до трансплантации [1;51;59;80;103]. Современная система общественных банков ПК способна накопить большое количество тестированных и HLA- типированных образцов ПК, что позволяет в короткие сроки создать регистр ГСК ПК и подобрать подходящие донорских образцы ГСК ПК для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК. Успех и эффективность алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества заготовленного клеточного материала [62;120;136]. Для восстановления биологических свойств ГСК и возможности их применения в клинической практике криоконсервированная ПК должна быть разморожена. Однако в 93 процессе замораживания и размораживания в клетках могут возникнуть различные морфофункциональные несостоятельности повреждений повреждения, трансплантационного напрямую зависит от приводящие материала, и глубина технологии замораживания к этих и размораживания клеточного материала [14;47]. Поэтому оценка качества криоконсервированной ПК является одной из первостепенных задач, которая стоит перед современными банками ПК. В настоящем исследовании проведена комплексная оценка качества криоконсервированных ГСК ПК (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®». Было показано, что общее количество ЯСК снижается, но преимущественно за счет фракции гранулоцитов (процент сохранения общего количества ЯСК составил 87,01±13,3%, нейтрофилов 78,6±21,2); уменьшается количество CD34+/CD45+ клеток - процент сохранения составил 93,7±5,3%. Отмечается уменьшение всех КОЕ, но колониеобразующая активность ГСК ПК сохраняется на достаточно высоком уровне - процент сохранения КОЕ-mix99,3±3,38%, КОЕ-Г - 85,03±5,56%, КОЕ-М - 81,3±3,28%, КОЕ-ГМ - 82,34±9,8% и КОЕ-Эр - 69,4±5,7%. Жизнеспособность CD45+/CD34+ клеток во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» достоверно не изменяется (Рисунок 8-11). Таким образом, криохранение концентратов ПК в автоматизированной системе «BioArchive®» позволяет сохранить высокое качество ГСК ПК. Полученные результаты исследования не уступают данным мировых исследований [34;40;41;86]. 94 100.4 120 87.01 78.6 процент,% 100 80 60 40 20 0 ЯСК МНК Нейтрофилы % сохранения клеток после криохранения (n=600) Рисунок 8. Клеточный состав концентрата пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» Сохранение CD45+/CD34+ клеток после криохранения - 97,3% 0.14 0.12 0.13 х106/мл 0.1 0.08 p=0,035 0.06 0.089 0.04 0.02 0 до криохранения после криохранения Рисунок 9. Количество CD45+/CD34+ клеток в концентрате пуповинной крови до и «BioArchive®» после криохранения в автоматизированной системе 95 99.5 процент,% 99 99,3 % 98.5 98 97,9% 97.5 97 до криохранения после криохранения до криохранения после криохранения Рисунок 10. Жизнеспособность ядросодержащих клеток до и после криохранения концентратов пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» 100 90 80 99,3 % процент,% 70 85,03 % 60 82,34 % 81,3 % 69,4 % 50 40 30 20 10 0 КОЕ-mix КОЕ-Г КОЕ-ГМ КОЕ-М КОЕ-Эр % сохранения КОЕ после криохранения Рисунок 11. Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» на колониеобразующую стволовых клеток пуповинной крови активность гемопоэтических 96 При проведении регрессионного анализа были выявлены статистически значимые положительные корреляционные зависимости между общим количеством ЯСК, МНК и CD45+/СD34+ клеток до криоконсервирования ПК и количеством почти всех КОЕ после криохранения концентратов ПК. Так же были обнаружены положительные корреляции количества CD45+/СD34+ клеток после криохранения с количеством ЯСК и МНК до криоконсервирования. В проведенном исследовании было охарактеризовано влияние методов лейкоконцентрации ПК, величины гематокрита и гемоконсерванта CPDA на качество ПК после криохранения автоматизированной системе «BioArchive®». В результате было выявлено, что криоконсервированная ПК, полученная методом автоматического выделения клеток, после долгосрочного криохранения содержит достоверно больше нейтрофилов и CD45+/CD34+клеток, по сравнению с криоконсервированной ПК, полученной методом двойного центрифугирирования: 85,31±3,80% против 80,21±2,10%, и 95,61±4,7% против 84,52±5,1% соответственно. В настоящее время в различных банках ПК, как в России, так и за рубежом, для обработки ПК успешно применяются оба метода лейкоконцентрации. Согласно проведенным исследованиям они позволяют получать высокий выход общей фракции ЯСК и CD45+/CD34+ клеток (87-90%), [URL:http://www.biosafe.ch/; 86;112;116;120;129]. Поэтому, полученные данные являются важным аспектом при планировании использования и оценке криоконсервированных ГСК ПК для клинического применения (Рисунок 12,13). 97 процент,% 99 96.36 94.32 119 88.27 87.32 85.31 80.21 79 59 р=0,0006 39 19 -1 ЯСК МНК МАВК (n=256) Нейтрофилы МДЦ (n=344) Рисунок 12. Влияние методов выделения ядросодержащих клеток на клеточный состав концентрата пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» р=0,04 2 100 процент,% 95 95,6% 90 85 84,5 % 80 75 МАВК (n=256) МДЦ (n=344) Рисунок 13. Влияние методов лейкоконцентрации на сохранение CD45+/CD34+ клеток в концентрате пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» При оценке влияния величины гематокрита на качество ГСК ПК, было выявлено, что концентрат ПК с величиной гематокрита от 12% до 39% после криохранения содержит достоверно больше CD45+/CD34+ клеток и меньше ЯСК, по сравнению с концентратом ПК с большей величиной гематокрита: 98 процент сохранения - 96,32±3,46% против 90,06±5,83% и 84,83±4,98% против 89,51±4,54%, р=0,01 и соответственно (Рисунок 14-15). 100 84,8 96,3 89.51 96.79 79,6 79.22 процент,% 80 60 40 p=0,01 20 0 ЯСК МНК гематокрит 12-39% (n=286) Нейтрофилы гематокрит 40-69% (n=314) Рисунок 14. Влияние гематокрита на клеточный состав концентрата пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» 96.32 98 процент,% 96 гематокрит 12-39% (n=286) 94 90.06 гематокрит 40-69% (n=314) 92 90 88 р=0,0056 86 Рисунок 15.Влияние гематокрита на сохранение CD45+/СD34+ клеток в концентратах пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» В проведенном подобном исследовании в Испании было выявлено, что колониеобразующая способность ГСК ПК с гематокритом 45% снижалась до 40% по сравнению с ПК с гематокритом 23% - 64% [115]. В настоящем 99 исследовании достоверного влияния на колониеобразующую активность ГСК ПК выявлено не было. При исследовании влияния гемоконсерванта CPDA на качество криоконсервированной ПК было показано, что криоконсервированная ПК с величиной гемоконсерванта от 30% до 60% после криохранения содержит больше CD34+/CD45+ клеток и меньше МНК, по сравнению с заготовленной ПК с более низкой величиной гемоконсерванта CPDA: 98,96±0,28% против 88,52±0,58%; 99,73±8,88% и 96,01±7,7% соответственно (Рисунок 16-17). 99.7 100.0 88.0 96.0 87.0 80.0 79.0 Процент, % 80.0 р=0,03 60.0 40.0 20.0 0.0 ЯСК CPDA 15-29% (n=236) МНК Нейтрофилы CPDA 30-60% (n=364) Рисунок 16. Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на клеточный состав концентратов пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» 100 процент,% 98.9 р=0,012 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 88.5 CPDA 15-29% (n=236) CPDA 30-60% (n=364) Рисунок 17. Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на сохранение клеток CD45+/CD34+ после криохранения концентрата пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» При исследовании влияния отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, достоверных различий в клеточном составе концентратов ПК, количестве и проценте сохранения CD45+/CD34+ клеток, жизнеспособности ЯСК, колониеобразующей активности ГСК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» при сравнении со стандартным криопротектором ДМСО+декстран 40 получено не было. Таким образом, предложенный криоконсервирующий раствор сохранял высокое качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения и может быть использован при заготовке ПК для длительного хранения. В проведенной работе были выявлены иммуногенетические особенности общественного регистра ГСК ПК Московского банка стволовых клеток. Было показано, что небольшое количество неродственных доноров ГСК ПК в базе данных регистра позволяет подобрать совместимый образец ГСК ПК на уровне базового разрешения (6/6) с частотой вероятности 1:218. Более частое 101 совпадение результатов HLA типирования донора и пациента по сравнению с данными других регистров криоконсервированная ПК ГСК здорового можно объяснить населения тем, Московского что региона объединяет единую популяцию жителей Центрального региона РФ и соответствует центрально-восточно-европейским народам, в то время как международные регистры осуществляют свою деятельность на все мировое сообщество. Выявленные особенности общественного регистра ГСК ПК свидетельствует об объективной трудности подбора совместимого образца ГСК, обусловленной высоким генетическим разнообразием человеческой популяции, а также рядом других параметров донора, влияющих в конечном итоге на его отбор для реципиента. Полученные особенности регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови Московского банка стволовых клеток рекомендуется учитывать при подборе совместимой пары донор-реципиент. В ходе проведенного исследования был выполнен анализ применения криоконсервированных ГСК ПК в клинической практике. В результате было показано, что криоконсервированная автоматизированной системе ПК «BioArchive®» после криохранения является в полноценным альтернативным источником ГСК, который способен восстановить гемопоэз у пациентов после миелоаблативных режимов кондиционирования, и может быть использован в клинической практике. Итогом проведенной работы стал разработанный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NetCordFACT, который рекомендуется использовать для работы в подобных учреждениях. Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что оценка качества криоконсервированных ГСК ПК, предназначенных для клинического 102 применения, является ключевым моментом в работе каждого современного банка ПК. Целесообразно проведение полного комплекса по оценке качества заготовленного материала всесторонне характеризующего трансплантационный материал и включающего: исследование клеточного состава концентратов ПК, биологических и иммуногенетических характеристик ГСК ПК после криохранения. При планировании использования криоконсервированной ПК в качестве трансплантационного материала необходимо учитывать, что после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» биологические характеристики ГСК ПК изменяются, однако ее качество сохраняется на высоком уровне. При выборе криоконсервированных образцов ПК в различных банках ПК следует учитывать методы лейкоконцентрации, величину гематокрита и концентрацию гемаконсерванта CPDA, которые оказывают влияние на биологические характеристики криоконсервированных ГСК ПК. При поиске донора ГСК следует обращать внимание, что частота встречаемости отдельных как антигенов, так и гаплотипов в различных регистрах ГСК отличается, поэтому вероятность нахождения донора в собственном регистре значительно увеличивается. 103 ВЫВОДЫ 1. После клеточный криохранения состав гемопоэтических в автоматизированной пуповинной стволовых крови клеток и системе «BioArchive®» биологические характеристики пуповинной крови незначительно изменяются. Отмечается снижение общего количества ядросодержащих клеток и нейтрофилов (процент сохранения - 87,01% и 78,6% соответственно); CD45+/CD34+ клеток (процент сохранения 93,7%); колониеобразующей активности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (процент сохранения КОЕ-mix-99,3%, КОЕ-Г - 85,03%, КОЕ-М - 81,3%, КОЕ-ГМ - 82,34% и КОЕ-Эр - 69,4%). 2. Клеточный концентрат пуповинной крови, полученный методом автоматического выделения клеток, после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержит больше нейтрофилов и CD45+/CD34+клеток, по сравнению с лейкоконцентратом, полученным методом двойного центрифугирирования (85,31% против 80,21% и 95,61% против 84,52, соответственно). 3. Клеточный концентрат пуповинной крови с величиной гематокрита от 12% до 39% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержит больше СD45+/CD34+клеток и меньше ядросодержащих клеток, по сравнению с более высокой величиной гематокрита (процент сохранения - 96,32 % против 89,06%, и 84,8% против 89,51%, соответственно). 4. Клеточный концентрат пуповинной крови с концентрацией гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», содержит больше CD45+/CD34+клеток и меньше мононуклеарных клеток, по сравнению концентратами пуповинной крови с более низкой концентрацией гемоконсерванта CPDA (98,96% против 88,52% и 99,73% и 96,01%, соответственно). 104 5. Отечественный комбинированный криопротектор - ДМСО+реополиглюкин сохраняет качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения. 6. Частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3 генам HLA системы (локусы А, В, DRB1) по данным общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в Московском банке стволовых клеток составляет 1:218, а характер распределения гаплотипов в целом соответствуют таковому у славян центральной и восточной Европы. 7. Разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими здравоохранения центрами, в адаптированный Российской рекомендаций NETCORD -FACT. Федерации к условиям с учетом организации международных 105 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Перед использованием криоконсервированных ГСК ПК в клинической практике необходимо учитывать, что после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» снижается процент сохранения ЯСК и CD45+/CD34+ клеток и составляет 87% и 93% соответственно. 2. до Метод выделения, величину гематокрита и гемоконсерванта CPDA криоконсервирования ПК рекомендуется учитывать при оценке трансплантационного материала. 3. Отечественный комбинированный криопротектор - ДМСО+реополиглюкин целесообразно использовать при заготовке клеточных концентратов ПК для длительного криохранения. 4. Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими здравоохранения центрами, адаптированный в Российской Федерации к условиям организации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT рекомендуется использовать при создании, работе и усовершенствовании подобных учреждений. 106 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Алло-ТГСК – аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток ГСК – гемопоэтические стволовые клетки ПК - пуповинная кровь ЯСК - ядросодержащие клетки МНК – мононуклеарные клетки КМ- костный мозг о.РТПХ - острая реакция «трансплантат против хозяина» хр. РТПХ – хроническая реакция «трансплантат против хозяина» CD – (clasters of differentiations) кластер дифференцировки АТ - антителла CPDA – гемоконсервант (цитрат + фосфат натрия + декстроза + аденин) HLA – (Human leukocyte antigen) человеческие лейкоцитарные антигены ПЦР - полимеразная цепная реакция RPR – (Rapid Plasma Reagin) – антикардиолипиновый тест HTLVA - Т-лимфотропный вирус человека Анти-HTLVA - Антитела (IgG) к Т-лимфотропному вирусу человека HIV – вирус иммунодефицита человека Анти-HIV - антитела к 1 и 2 типу вируса иммунодефицита человека HCV – вирус гепатита С Анти –HCV – суммарные антитела (классов IgG и IgM) к антигенам вируса гепатита C HBV- вирус гепатита В anti-HbcAg - Антитела к поверхностному антигену гепатита В CMV - цитомегаловирус anti-Hbcor - Антитела к ядерному антигену HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота 107 ДМСО - Диметилсульфоксид 7-ADD - проникающий краситель 7-аминоактиномицин D МАВК - метод автоматического выделения клеток МДЦ – метод двойногоцентрифугирования КОЕ-mix – колониеобразующая единица смешанная КОЕ-Г – колониеобразующая единица гранулоцитарная КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная КОЕ-М – колониеобразующая единица макрофагальная КОЕ-Э – колониеобразующая единица эритроцитарная % сох-ия – процент сохранения 108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н., Сельцер А.В. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови// Вопросы онкологии. -2000.-№ 46.С.513-520 2. Бабийчук Л.А., Грищенко В.И., Зубов П.М., Зубова О.Л., Рязанцев В.В., Бабийчук Л.В., Кудокоцева О.В., Любчич С.А. Структурно-функциональное состояние и жизнеспособность ядросодержащих клеток пуповинной крови после криоконсервирования//Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2010.-№3.-C. 77-81 3. Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Плясунова С.А., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Майорова O.A., Румянцев С.А. Состав пула стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных. Вопросы современной педиатрии.- 2006.-Том5, №1.-С. 79. 4. Бубнова Л.Н., Зайцева Г.А., Ерохина Л.В., Беркос А.С., Реутова Н.В.,Беляева Е.В., Петровская М.Н., Игнатова Н.К., Кудинова Э.Е., Минина В.М. Сравнение частоты распределения антигенов и гаплотипов локусов у доноров гемопоэтических стволовых клеток россиийских регионов и Германии// Клеточная терапия и трансплантация.-2008.-Том 1, №1.-С. 34 5. Иоффе Ю. Анализ первичных запросов на поиски доноров в Карельском Регистре неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток//Клиническая онкогематология.-2010.-Том.3, №1-С.43-46 6. Карпова Н.С., Абдулкадыров К.М., Селиванов Е.А., Балашова В.А. Изучение длины теломер и колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при криоконсервировании//Клеточная трансплантология - 2011 г. - Том IV. №4 - С. 1 – 6 7. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Стратегия HLA-типирования в Московском банке стволовых клеток. III 109 научно- практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, Москва, Научное издание - тезисы докладов, с. 19-20. 8. Подколзина Э.А., Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Карпова Е.Э., Яковлева М.В., Майорова О.А. Сравнение эффективности процедуры выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови ручным и аппаратным методом//Российский иммунологический журнал.-2006.-Т.9 (3).С.136. 9. Селиванов Е. А., Бубнова Л. Н. Служба иммунологического типирования и регистр доноров гемопоэтических стволовых клеток в России// Вестник гематологии. - 2009. - Том 5, N 3. - С. 54-56. 10. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлажденния. М.: И.Л., 1963. – С.505 11. Усс А.Л., Мицкевич П.Б., Завгородняя И.Л. Криоконсервирование клеток человека//Медицинская панорама.-2003.-№2(27).-С. 38 12. Хурцилава О.Г., Иволгин Д.А., Коровина К.В., Хрупина А.С., Смолянинов А.Б., Селиванов Е.А. выделение и подготовка стволовых клеток пуповинной крови к трансплантации.//Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова.-2012.-Том 14.-N.2.-С.7-15 13. Юрасов С.В., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови человека для трансплантации// Гематология и трансфузиология.-1997.-№ 42.-С.10-15 14. Allan D., Petraszko T., Elmoazzen H., Smith S. A Review of Factors Influencing the Banking of Collected Umbilical Cord Blood Units// Stem Cells International.-2013.-Vol. 2013.- P. 1-7 15. Appelbaum F.R. Pursuing the goal of a donor for everyone in need//N Engl J Med.- 2012.-Vol.367-P.1555-155 110 16. Armitage S., Warwick R., Fehily, D., NavarreteC., Contreras M. Cord blood banking in London: the first 1000 collections//Bone Marrow Transplantation. -1999.Vol.24.-P.139–145 17. Bacchetta R., Bigler M., Touraine J.L. et al. High levels of interleukin 10 production in vivo are associated with tolerance in SCID patients transplanted with HLA mismatched hematopoietic stem cells// Journal of experimental and clinical medicine.- 1994.-Vol.179.-P.493-502 18. Bakken A.M., Bruserud O., Abrahamsen J.F. No differences in colonyformation of peripheral blood stem cells frozen with 5% or 10% dimethyl sulfoxide// J. Hematother Stem Cell Res.- 2003.-Vol.12.-P.351–358 19. Balint B., Ivanovic Z., Petakov M. et al. The cryopreservation analysis//Lancet.- 2010.-Vol.11.-P.653–660 20. Ballen K. New trends in umbilical cord blood transplantation//Blood.-2005.- Vol.105.- P.3786-3792 21. Ballen K., Gluckman E., Broxmeyer H.E. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond//Blood. -2013.-Vol.122.-P.491-498 22. Barker J.N., Davies S.M., DeFor T., Ramsay N.K., Weisdorf D.J., Wagner J.E. Survival after transplantation of unrelated donor umbilical cord blood is comparable to that of human leukocyte antigen-matched unrelated donor bone marrow: results of a matched-pair analysis//Blood.- 2001.-Vol. 97.-Pt.10.-P.2957-2961 23. Barker J.N., Scaradavou A., Stevens C. E. Combined effect of total nucleated cell dose and HLA match on transplantation outcome in 1061 cord blood recipients with hematologic malignancies// Blood.-2010.- Vol. 115.- N. 9.-P. 1843–1849 24. Barker J. N., Byam C., Scaradavou A. How i treat: the selection and acquisition of unrelated cord blood grafts.//Blood.-2011.-Vol. 117/-N. 8.-P. 2332– 2339 25. Bauwens D., Hantson P., Laterre P.F., Michaux L., Latinne D., Tourtchaninoff M., Cosnard G., Hernalsteen D. Recurrent seizure and sustained encephalopathy 111 associated with dimethylsulfoxide-preserved stem cell infusion// Leuk. Lymphoma.2005.-Vol.46.-P.1671-1674 26. Bertolini F., Battaglia M., De Iulio C., Sirchia G., Rosti L. Placental blood collection: effects on newborns//Blood.- 1995.-Vol.85.-Pt.11.-P.3361-3362 27. Bizzetto R., Bonfim C., Rocha V., Socié G., Locatelli F., Chan K., Ramirez O., Stein J., Nabhan S., Miranda E., Passweg J., Souza C.A., Gluckman E. Outcomes after related and unrelated umbilical cord blood transplantation for hereditary bone marrow failure syndromes other than Fanconi anemia// Haematologica. -2011.Vol.96.-Pt.1.-P.134-141 28. Branch D.R., Calderwood S., Cecutti M.A., Herst R., Solh H. Hematopoietic progenitor cells are resistant to dimethyl sulfoxide toxicity//Transfusion.- 1994.Vol.34.-P.887–890 29. Bray R.A., Hurley C.K., Kamani N.R., Woolfrey A., Müller C., Spellman S., Setterholm M., Confer D.L. National marrow donor program HLA matching guidelines for unrelated adult donor hematopoietic cell transplants// Biol Blood Marrow Transplant. -2008.-Vol.14.-P.45-53 30. Brown J., Poles A., Brown C.J., Contreras M., Navarrete C. HLA-A, -B and - DR antigen frequencies of the London Cord Blood Bank units differ from those found in established bone marrow donor registries//Bone Marrow Transplantation.2000.-Vol. 25. – P.475–481 31. Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangoc G., Cooper S., Bard J., English D., Arny M., Thomas L., Boyse E.A. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1989.-Vol.-86.-Pt.10.-P.3828-3832 32. Broxmeyer H.E., Hangoc G., Cooper S. et al. Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential for transplantation in adults// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1992.-Vol.89.-P. 4109-4113 112 33. Broxmeyer H.E., Cooper S. High efficiency recovery of immature hematopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity from human cord blood cryopreserved for ten years// Clin. Exp. Immunol.-1997.-Vol.107.-P.45-53 34. Broxmeyer H.E., Srour E.F., Hangoc G., Cooper S., Anderson S.A., Bodine D.M. High efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years// Proc. Natl. Acad. Sci.-2003.Vol.100.-P.645-650 35. Broxmeyer H. E., Smith F.O. Cord blood hematopoietic cell transplantation// Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation 4th edition, Appelbaum F.R., Forman S.J., Negrin R.S., Blume K.G. - UnitedKingdom.- 2009.- P.559–576 36. Broxmeyer H.E. Cord Blood Transplantation: A Mini Review Celebrating the 20th Anniversary of the First Cord Blood Transplant// The Hematologist.-2009.Vol.6.-P.7 37. Broxmeyer H.E., Srour E., Orschell C., Ingram D.A., Cooper S., Plett P.A .et al. Cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. In: Klimanskaya I., Lanza, R (eds). Essential Stem Cell Methods/ Academic Press, Elsevier Science: San Diego, CA.- 2009, Chapter 17 38. Broxmeyer H.E., Cooper S., Hass D.M., Hathaway J.K., Stehman F.B., Hangoc G. Experimental basis of cord blood transplantation// Bone Marrow Transplant. 2009.- Vol.44.-Pt. 10.-P.627-633 39. Broxmeyer H.E. Umbilical Cord Transplantation: Epilogue//Seminars in Hematology. -2010.-Vol. 47.-Pt.1.-P.97–103. 40. Broxmeyer H.E. Cord blood hematopoietic stem cell transplantation//Stem book. – 2010.-P.1-14 41. Broxmeyer H.E., Lee M.R., Hangoc G., Cooper S., Prasain N., Kim Y.J., Mallett C., Ye Z., Witting S., Cornetta K., Cheng L., Yoder M.C. Hematopoietic stem/progenitor cells, generation of induced pluripotent stem cells, and isolation of endothelial progenitors from 21- to 23.5-year cryopreserved cord blood//Blood.2011.-Vol.117.-Pt.18.-P.4773-4777 113 42. Cairo M.S., Wagner J.E. Placental and/or umbilical cord blood an alternative source of haemopoietic stem cells for transplantation//Blood.-1997.- Vol.90.- P.4665–4678 43. Cicuttini FM, Welch K, Boyd AW. Characterization of CD34+HLA-DR- CD38+ and CD34+HLA-DR-CD38-progenitor cells from human umbilical cord blood// Growth Factors.-1994.-Vol.10.-P.127–134 44. Cilloni D., Garau D., Regazzi E., Sammarelli G., et al. Primitive hematopoietic progenitors within mobilized blood are spared by uncontrolled rate freezing//Bone Marrow Transplant.-1999.-Vol.23.-P.497– 503 45. Cohen Y.C., Scaradavou A., Stevens C.E. Factors affecting mortality following myeloablative cord blood transplantation in adults: a pooled analysis of three international registries//Bone Marrow Transplant.- 2011.-Vol.46.-P.70–76 46. Copeland E.A. Hematopoietic stem cell transplantation// The New England journal of medicine.- 2007.-Vol.354.-P.1813–1826 47. Davies P. L., Baardsnes J. , Kuiper M. J. , Walker V. K.Structure and function of antifreeze proteins// Phil. Trans. R. Soc. Lond.- 2002.-Vol. 357.-P. 927– 935 48. Denning-Kendall P., Donaldson C., Nicol A, Bradley B., Hows J. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking// Experimental hematology.-1996.-Vol.24.-Pt.12.-P.1394-1401 49. Eapen M., Rubinstein P., Zhang M.J., Stevens C., Kurtzberg J., Scaradavou A. et al. Outcomes of transplantation of unrelated donor umbilical cord blood and bone marrow in children with acute leukaemia: a comparison study//Lancet.- 2007.Vol.369.-P.1947–1954 50. Eapen M., Rocha R., Sanz G., Scaradavou A., Zhang M., Arcese W., et al. Effect of graft source on unrelated donor haemopoietic stemcell transplantation in adults with acute leukaemia: a retrospective//Lancet Oncol.-2010.Vol.11.-P.653–660 51. Forte K.J. Alternative donor sources in pediatric bone marrow transplantation// J Pediatr Oncol Nurs.-1997.-Vol. 14.-Pt.4.-P.213-224 114 52. Frangoul H., Wang L., Harrell F.E., Manes B., Calder C., Domm J. Unrelated umbilical cord blood transplantation in children with immune deficiency: results of a multicenter study// Bone Marrow Transplant.- 2010.-Vol.45.-P.283–288 53. Fraser J.K., Cairo M.S., Wagner E.L., McCurdy P.R., Baxter-Lowe L.A., Carter S.L., Kernan N.A., Lill M.C., Slone V., Wagner J.E., Wallas C.H., Kurtzberg J. Cord Blood Transplantation Study (COBLT): cord blood bank standard operating procedures. Journal of hematotherapy.- 1998.-Vol.-7.-P.521–561 54. Fuller B., Lane N., Benson E. Life in the frozen state// CRC Press.- 2004.– Р.72 55. Galmes A., Besalduch J., Bargay J. et al. Long-term storage at -80 degrees of hematopoietic progenitor cells with 5% dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant// Transfusion. -1999.-Vol.39.-P.70–73 56. Giraud M.N., Motta C., Boucher D., Grizard G. Membrane fluidity predicts the outcome of cryopreservation of human spermatozoa. Hum Reprod.-2000.-Vol.15.P.2160–2164 57. Gluckman E., Broxmeyer H.A., Auerbach A.D., Friedman H.S., Douglas G.W., Devergie A., Esperou H., Thierry D., Socie G., Lehn P. et al// Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.- The New England journal of medicine.-1989.Vol.321.-Pt.17.-P.1174-1178 58. Gluckman E., Rocha V., Boyer-Chammard A., Locatelli F., Arcese W., Pasquini R., Ortega J., Souillet G., Ferreira E., Laporte J.P., Fernandez M., Chastang C. Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group//New England Journal of Medicine.-1997.-Vol.337.-P.373–381 59. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation// Experimental hematology.- 2000.-Vol.28.-Pt.11.-P.1197-1205 115 60. Gluckman E., Rocha V. Cord blood transplantation for children with acute leukaemia: a Eurocord registry analysis// Blood cells, molecules, and diseases.-2004.Vol.33.-Pt.3.-P.271-273 61. Gluckman E., Rocha V., Arcese W., Michel G., Sanz G., Chan K.W., Takahashi T.A., Ortega J., Filipovich A., Locatelli F. et. al. Factors associated with outcomes of unrelated cord blood transplant: guidelines for donor choice// Experimental Hematology.- 2004.-Vol. 32.- P.397–407 62. Gluckman E. Cord blood transplantation// Biol. Blood Marrow Transplant.- 2006.-Vol.12.-Pt.-8.-P.808-812 63. Gluckman E., Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood transplants// Current opinion in immunology.-2006.-Vol.18.-Pt.5.-P.565-570 64. Gluckman E. History of cord blood transplantation// Bone marrow transplantation.- 2009.-Vol.44.-Pt.-10.-P.621-626 65. Gluckman E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside// British journal of haematology.-2009.- Vol. 147.-Pt. 2.-P.192-199 66. Gluckman E. Milestones in umbilical cord blood transplantation// Blood reviews.-2011.-Vol. 25.-Pt.6.-P.255-259 67. Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A., Lutsenko E.D, Goltsev K.A. Cryopreservation: An Optimizing Factor for Therapeutic Potential of Fetoplacental Complex Products// Biopreservation and Biobanking.- 2009.-Vol. 7.-Pt.1.-P. 29-38 68. Haimila K., Penttilä A., Arvola A., et al. Analysis of the adequate size of a cord blood bank and comparison of HLA haplotype distributions between four populations// Hum. Immunol.- 2013.-Vol.74.-Pt.2.- P.189-195 . 69. Halle P., Tournilhac O., Knopinska-Posluszny W., et al. Uncontrolled rate freezing and storage at -80 degrees, with only 3.5% DMSO in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations// Transfusion. 2001.-Vol.41.-P. 667–673 116 70. Hao Q.L., Shah A.J., Thiemann F.T., Smogorzewska E.M., Crooks G.M. A functional comparison of CD34+ CD38- cells in cord blood and bone marrow//Blood.- 1995.-Vol.86.-P.3745-3753 71. Harris D.T., Schumacher M.J., Rychlik S., Booth A., Acevedo A., Rubinstein P., Bard J., Boyse E.A. Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation//Bone Marrow Transplant.-1994.-Vol.13.-Pt.2.P.135-143 72. Haspel R.L., Miller K.B. Hematopoietic stem cells: source matters// Current stem cell research and therapy.-2008.- Vol.3.- Pt.4 - P.229-236 73. Hayani A., Lampeter E., Viswanatha D., Morgan D., Salvi S.N. First report of autologous cord blood transplantation in the treatment of a child with leukemia// Pediatrics. -2007.- Vol.119.-Pt.1.-P.e296-300 74. Hogan C.J., Shpall E.J., McNulty O. et al. Engraftment and development of human CD34(+)-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/LtSz-scid/scid mice//Blood.-1997.-Vol.90.-P. 85-96 75. Howe C.W., Radde-Stepaniak T. Hematopoietic cell donor registries. In Thomas E., Blume K.G., Forman S.J., eds. Hematopoietic Cell transplantation, 2nd. Malden, MA Blackwell Science.- 1999.-Р. 503—514 76. Hunt C. J., Armitageb S.E.,.Pegg D. E. Cryopreservation of umbilical cord blood: 1. Osmotically inactive volume, hydraulic conductivity and permeability of CD34+ cells to dimethyl sulphoxide.2.Tolerance of CD34(+) cells to multimolar dimethyl sulphoxide and the effect of cooling rate on recovery after freezing and thawing//Cryobiology.-2003.-Vol.46.-Pt.1.-P.76-78 77. Hwang W.Y., Samuel M., Tan D., Koh L.P., Lim W., Linn Y.C. A Meta- Analysis of Unrelated Donor Umbilical Cord Blood Transplantation versus Unrelated Donor Bone Marrow Transplantation in Adult and Pediatric Patients// Biol Blood Marrow Transplant.-2007.-Vol.13.P.444–453 78. Karow A.M. Biophysical and chemical considerations cryopreservation//Organ preservation for transplantation.-1981.-P. 113 in 117 79. Ketheesan N., Whiteman C., Malczewski A.B., Hirst R.G., Brooy J.T. Effect of cryopreservation on the immunogenicity of umbilical cord blood cells// Transfus Apher Sci.-2004.-Vol.30.-P.47–54 80. Kollman C., Abella E, Baitty R. Assessment of optimal size and composition of US National Registry of Hematopoietic Stem Cell Donors//Transplantation.-2004,Vol.78.-P.89-95. 81. Kurtzberg J., Graham M., Casey J., Olson J., Stevens C.E., Rubinstein P. The use of umbilical cord blood in mismatched related and unrelated hemopoietic stem cell transplantation//Blood cells.-1994.-Vol. 20.-P.275-283 82. Kurtzberg J., Laughlin M., Graham M.L., Smith C., Olson J.F., Halperin E.C., Ciocci G., Carrier C., Stevens C.E., Rubinstein P. Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients// The New England journal of medicine.-1996.- Vol. 335.-Pt.3.-P.157-166 83. Kurtzberg J., Prasad V.K., Carter S.L., Wagner J.E., Baxter-Lowe L.A., Wall D., Kapoor N., Guinan E.C., Feig S.A., Wagner E.L., Kernan N.A. Results of the Cord Blood Transplantation Study (COBLT): clinical outcomes of unrelated donor umbilical cord blood transplantation in pediatric patients with hematologic malignancies// Blood.- 2008.- Vol.112.-Pt.10.-P.4318-4327 84. Lansdorp P.M., Dragowska W., Mayani H. Ontogeny-related changes in proliferative potential of human hematopoietic cells// J Exp Med.-1993.-Vol. 178.-P. 787-789 85. Lapidot T., Pflumio F., Doedens M. et al. Cytokine stimulation of multilineage hematopoiesis from immature human cells engrafted in SCID mice.// Science.-1992.Vol.255.-P.1137-1141 86. Lapierre V., Pelligrini N., Bardey I., Malugani C., Saas P., Garnache F. et al. Cord blood volume reduction using an automated system (Sepax) vsa semiautomated system (Optipress II) and a manual method (hydroxyethyl starch sedimentation) for routine cord blood banking: a comparative study// Cytotherapy.2007.-Vol.9.-P.165-169 118 87. Lauber S., Latta M., Klüter H., Müller-Steinhardt M. The Mannheim Cord Blood Bank: Experiences and Perspectives for the Future// Transfus Med Hemother.2010.- Vol.37.-Pt. 2.-P.90-97 88. Laughlin M. J., Barker J., Bambach B. et al. Hematopoietic engraftment and survival in adult recipients of umbilical-cord blood from unrelated donors// The New England Journal of Medicine.-2001.- Vol. 344.-N. 24.-P 1815–1822 89. Laughlin M.J., Eapen M., Rubinstein P., Wagner J.E., Zhang M.J., Champlin R.E. et al. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia// New England journal of medicine. -2004.Vol.351.-P.2265–2275 90. Liu K., Gao Z., Jiang Y., Dong W., et al. Collection, processing and cryopreservation of placental cord blood hematopoietic stem cells// Beijing Da Xue Bao.-2003.-Vol.35.-P.119–122 91. Locatelli F., Rocha V., Chastang C., Arcese W., Michel G., Abecasis M. et al. Factors associated with outcome after cord blood transplantation in children with acute leukemia//Blood.-1999.-Vol. 93.-P.3662–3667 92. Loetscher P., Uguccioni M., Bordoli L. et al. CCR5 is characteristic of Th1 lymphocytes// Nature. -1998.-Vol.391.-P.344-345 93. Machaliński B., Ratajczak M.Z. The effect of selected anticoagulants on the clonogenicity of h hematopoietic progenitors. Transplantation implications//Pol Arch Med Wewnet.- 1997.-Vol.97(6).-P.509-517 94. Majeti R., Park C.Y., Weissman I.L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood//Cell Stem Cell.- 2007.Vol.1.-P.635– 645 95. Mazur P. Fundamental cryobiology and the preservation of organs by freezing. Organ Preservation for Transplantation. -1981.-P.143-175 96. Meryman H.T. Crioprotectiveagents//Criobiology.-1971.-Vol.3.-P 173-183 119 97. Meyer- Monard S., Tichelli A., Troeger C. et al. Initial cord blood unit volume affects mononuclear cell and CD34+cell-processing afficiency in a non-linear fashion//Cytotherapy.-2012.-Vol.14.-N. 2.-P.215-222 98. Michel G., Rocha V., Chevret S., Arcese W., Chan K.W., Filipovich A. et al. Unrelated cord blood transplantation for childhood acute myeloid leukemia: a Eurocord group analysis//Blood.-2003.-Vol.102.-P.4290–4297 99. Migliaccio A.R., Adamson J.W., Stevens C.E., Dobrila N.L., Carrier C.M., Rubinstein P. Cell dose and speed of engraftment in placental/umbilical cord blood transplantation: graft progenitor cell content is a better predictor than nucleated cell quantity// Blood.-2000.-Vol.96.-P.2717–2722 100. Miura J., Minegishi M., Itoh T., Kitaura T., Fukawa N., Takahashi H., Suzuki A., Kudo Y., Narita A. et al. Quality evaluation of umbilical cord blood progenitor cells cryopreserved with a small-scale automated liquid nitrogen system//Cryobiology.-2008.-Vol.57.-Pt.2.-P.178-81 101. Mugishima H., Harada K., Chin M. et al. Effects of long-term cryopreservation on hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood//Bone Marrow Transplant.1999.-23.-P.395-396 102. Navarrete C., Contreras M. Cord blood banking: a historical perspective// British Journal of Haematology.- 2009.-Vol.147.-Pt.2.-P. 236–245 103. Oudshoom M., Foeken L., Wiegand T. Editors. Stem cell donor registries annual report 2007, 11th edition. WMDA: Netherlands, 2008. 104. Özkavukcu S., Erdemli E. Cryopreservation: Basic knowledge and biophysical effects// J Ankara Med School. -2002.-Vol.24.-P.187-96 105. Page K. M., Zhang L., Mendizabal A.et al. Total colony-forming units are a strong, independent predictor of neutrophil and platelet engraftment after unrelated umbilical cord blood transplantation: a single-center analysis of 435 cord blood transplants//Biology of Blood and Marrow Transplantation.-2011.-Vol. 17.-N.9.P.1362–1374 120 106. Pahwa R.N., Fleischer A., Than S., Good R.A. Successful hematopoietic reconstitution with transplantation of erythrocyte-depleted allogeneic human umbilical cord blood cells in a child with leukemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A.1994.-Vol.91.-Pt.10.-P.4485-4488 107. Prasad V.K., Mendizabal A., Parikh S.H., Szabolcs P., Driscoll T.A., Page K., et al. Unrelated donor umbilical cord blood transplantation for inherited metabolic disorders in 159 pediatric patients from a single center: influence of cellular composition of the graft on transplantation outcomes//Blood.- 2008.-Vol.112.-P. 2979–2989 108. Querol S., Azqueta C., Garsia J. Effect of red blood cell content on progenitor function after Cryopreservation of cord blood buffy-coat products // Abstracts of EBMT Conference, Montreux.-2002.-P.740-S202 109. Querol S., Mufti G. J., Marsh S. G. E. et al. Cord blood stem cells for hematopoietic stem cell transplantation in the UK: how big should the bank be?//Haematologica.-2009.- Vol. 94.-N. 4.-P. 536–541 110. Querol S., Gomez S.G., Pagliuca A., Torrabadella M., Madrigal J.A. Quality rather than quantity: the cord blood bank dilemma// Bone Marrow Transplant.- 2010.Vol.45.-Pt.-6.-P.970-978 111. Raabe D. Atexture-component Avrami model for predicting recrystallization textures, kinetic sand grain size// Modell. Simul. Mater. Sci. Eng. -2007.-Vol.15.Pt.2.-P. 39 112. Regidor C., Posada M., Monteadudo D., Garaulet C., Somolinos N., Forés R., Briz M., Fernández M.N. Umbilical cord blood banking for unrelated transplantation: evaluation of cell separation and storage methods// Experimental hematology.- 1999.-Vol.27.-Pt.2.-P.380-385 113. Rocha V., Wagner J.E., Sobocinski K.A., Klein J.P., Zhang M.J., Horowitz M.M., Gluckman E. Graft-versus-host disease in children who have received a cordblood or bone marrow transplant from an HLA-identical sibling// New England Journal of Medicine. -2000.-Vol.342.-Pt.25.-P.1846-1854 121 114. Rocha V., Cornish J., Sievers E., Filipovich A., Locatelli F., Peters C. et al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia//Blood.-2001.-Vol.97.-P.2962–2971 115. Rocha V., Broxmeyer H.E. New approaches for improving engraftment after cord blood transplantation// Biol. Blood Marrow Transplant.- 2010.- Vol.16.-P. S126132 116. Rodriguez L., Azgueta C., Azzalin S., Garcia J., Qerol S. Washing of cord blood grafts after trawing: high cell recovery using in automated and closed system// Vox sanguinis.-2004.-Vol.87.-P.165-172 117. Rogers I., Sutherland D.R., Holt D., Macpate F., Lains A., Hollowell S., Cruickshank B., Caspter R.F. Human UC-blood banking: impact of blood volume, cell separation and cryopreservation on leukocyte and CD34+ cell recovery//Cytotherapy.-2001.-Vol. 3.-P. 269–276 118. Rood J.J., Oudshoorn M. Eleven million donors in Bone Marrow Donors Worldwide! Time for reassessment?// Bone Marrow Transplant.- 2008.- Vol.41.Pt.1.-P.1-9 119. Rubinstein P., Taylor P.E., Scaradavou A., Adamson J.W., Migliaccio G., Emanuel D., Berkowitz R.L., Alvarez E., Stevens C.E. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution: organization of the placental blood program// Blood Cells.- 1994.-Vol.20.-P.587-596 120. Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E., Adamson J.W., Migliaccio G., Migliaccio A.R., Taylor P.E., Stevens C.E. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1995.- Vol.92.-Pt.22.-P. 10119-10122 121. Rubinstein P., Carrier C., Scaradavou A., Kurtzberg J., Adamson J., Migliaccio A.R., Berkowitz R.L., Cabbad M., Dobrila N.L., Taylor P.E., Rosenfield R.E. , Stevens C.E.Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors// New England Journal of Medicine.-1998.-Vol.339.-P.1565–1577 122 122. Rubinstein P., Stevens C.E. Placental blood for bone marrow replacement: the New York Blood Center's program and clinical results. // Clinical Haematology.2000.-Vol.3.-P.565–584 123. Rubinstein P. Why cord blood// Human immunology.-2006.- Vol. 67.-Pt.6.P.398-404 124. Rubinstein P. Cord blood banking for clinical transplantation//Bone Marrow Transplant. -2009.- Vol.44.-Pt. 10.-P.635-642 125. Shlafer M. Pharmacological considerations in cryopreservation. Organ Preservation for transplantation. 2ndEd.- 1981.-P.143-175 126. Shlebak A.A., Marley S.B., Roberts I.A. et al. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord haematopoietic stem cells for clinical transplantation// Bone Marrow Transplant.-1999.-Vol. 23.-Pt.2.-P. 131-136 127. Smith A.R., Wagner J.E. Alternative haematopoietic stem cell sources for transplantation: place of umbilical cord blood// British journal of haematology.2009.-Vol.147.-Pt.2.-P.246-261 128. Smythe J., Armitage S., Mc Donald D., Pamphilon D., Guttridge M., Brown J, et al. Directed sibling cord blood banking for transplantation: the 10-year experience in the national blood service in England//Stem Cells. 2007.-Vol.25.-P.2087–2093 129. Solves P., Planelles D., Mirabet V., Blanquer A., Uberos F. Qualitative and quantitative cell recovery in umbilical cord blood processed by two automated devices in routine cord blood banking: a comparative study// Blood Transfus. -2013.Vol. 11(3).-P. 405–411 130. Szabolcs P., Park K.D., Reese M., Marti L., Broad-water G., Kurtzberg J. Coexistent naive phenotype and higher cycling rate of cord blood T cells as compared to adult peripheral blood//Experimental hematology.-2003.-Vol.31.-P.708-714 131. Takahashi S. et al. Analysis of cord blood transplantation from unrelated donors with bone marrow or peripheral blood stem-cell transplants from related donors in adult patients with hematologic malignancies after myeloablative conditioning regimen//Blood.- 2007.-Vol.109.-P.1322-1330. 123 132. Valeri C.R., Pivacek L.E. Effects of the temperature, the duration of frozen storage, and the freezing container on in vitro measurements in human peripheral blood mononuclear cells//Transfusion.- 1996.-Vol.-36.-P.303–308 133. Vormoor J., Lapidot T., Pflumio F. et al. Immature human cord blood progenitors engraft and proliferate to high levels in severe combined immunodeficient mice//Blood.-1994.-Vol.83.-P.2489-2492 134. Wagner J.E., Rosenthal J., Sweetman R., Shu X.O., Davies S.M., Ramsay N.K., McGlave P.B., Sender L., Cairo M.S. Successful transplantation of HLAmatched and HLA-mismatched umbilical cord blood from unrelated donors: analysis of engraftment and acute graft-versus-host disease// Blood.- 1996.- Vol.88.-Pt.3.P.795-802 135. Wagner J.E., Barker J.N., DeFor T.E., Baker K.S., Blazar B.R., Eide C.et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival//Blood.- 2002.-Vol.100.P.1611–1618 136. Wagner J.E., Gluckman E. Umbilical Cord Blood Transplantation: the first 20 years. Seminars in Hematology.- 2010.-Vol.47.-Pt.1.-P. 3–12 137. Ware C.B., Nelson A.M., Blau C.A. Controlled-rate freezing of human ES cells// Biotechniques.-2005.-Vol.38.-P.879 -883 138. Webster D.F., Pond G.B., Dyson M., Harvey W. Role of cavitation in the "in vitro" stimulation of protein synthesis in human fibroblasts//Ultrasound in Med. Biol.-1978. Vol.4.-Pt.4.-P343-351 139. Welte K., Foeken L., Gluckman E., Navarrete C.; Cord Blood Working Group of the World Marrow Donor Association.International exchange of cord blood units: the registry aspects// Bone Marrow Transplant. -2010.- Vol.45.-Pt. 5.-P.825-83 140. Wen S.H., Zhao W.l., Lin P.Y., Yang K.L. Associations among birth weight, placental weight, gestational period and product quality indicators of umbilical cord blood units//Transfusion and Apheresis Science.-2012.- Vol. 46.- P. 39–45 124 141. Windrum P., Morris T.C., Drake M.B., Niederwieser D., Ruutu T. Variation in dimenthylsulfoxide use in stem cell transplantation: Asurvey of EBMT centres//Bone Marrow Transplant.-2005.-Vol.36.-P.601–603 142. Yin A.H., Miraglia S., Zanjani E.D., et al. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells// Blood.-1997.-Vol.90.-P.5002–5012 143. Yoo K. H, Lee S. H., Kim H. J. et al. The impact of post-thaw colony-forming units-granulocyte/macrophage on engraftment following unrelated cord blood transplantation in pediatric recipients// Bone Marrow Transplantation.-2007.-Vol. 39.-N. 9.-P.515– 521 144. Yu Z.W., Quinn P.J. Dimethyl-sulfoxide a review of its applications in cell biology//Bioscience Reports.-1994.-Vol.14.-P. 259-281 145. Zambelli A., Poggi G., Da Prada G., et al. Clinical toxicity of cryopreserved circulating progenitor cells infusion//Anticancer Res.- 1998.-Vol.18.-Pt.6B.-P.4705– 4708 146. Zenhausern R., Tobler A., Leoncini L., Hess O.M., Ferrari P. Fatal cardia carrhythmia after infusion of dimethylsulfoxide cryopreserved hematopoietic stem cells in a patient with severe primary cardiacamyloidosis and end-stagerenal failure// Ann Hematol.- 2000.-Vol.79.-P.523–526 147. Zinno F., Landi F., Aureli V., Caniglia M., Pinto R.M., Rana I., Balduino G., Miele M.J., Picardi A., Arcese W., Isacchi G. Pre-transplant manipulation processing of umbilical cord blood units: Efficacy of Rubinstein's thawing technique used in 40 transplantation procedures// Transfus. Apher. Sci.-2010.-Vol.43.-Pt.2.-P.173-178
