Боковой амиотрофический склероз (ALS)

Анализ гена ALS2CR3/GRIF1 человека, кодирующего
возможный раковый антиген MO-REN-46
Вихрева Полина
Студентка II курса факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. Ломоносова
Тьютор: Купраш Дмитрий Владимиривич
АННОТАЦИЯ
Целью настоящего исследования является дальнейшее развитие серологического подхода
к ранней диагностике рака. Ожидаемые результаты могут иметь новый характер и найти
прямое практическое применение в ранней диагностике рака и контроле лечения.
Поставлена задача выявления антигенов, вызывающих развитие гуморального иммунного
ответа у пациентов с онкологическими заболеваниями, объединение этих антигенов в
набор для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.
ВВЕДЕНИЕ
В действии канцерогенеза различают две стадии – трансформацию и прогрессию, т.е.
возникновение потенциально опухолевой клетки и ее развитие в опухоль. Начало опухоли
можно определить как трансформацию, которая ведет к автономности клеточного цикла,
высвобождению его из-под контроля организма, часто сопряженного с приобретением
клеткой бессмертия, т.е. уходу ее от апоптоза. Выход из-под контроля микроокружения,
создаваемого нормальной тканью, ведет к образованию биологически автономного клона,
обладающего неограниченным ростом , способностью к распространению за пределы
собственной территории (инвазии) и к росту на территориях гетерологичных тканей
(метастазированию).
Ранняя диагностика онкологических заболеваний остается острейшей проблемой
современной медицины. Известно, что при злокачественной трансформации клетки
возможна ре-экспрессия генов и их продуктов, "запрещенных" в норме для данного вида
клетки и ткани. Для некоторых видов рака, таких как рак простаты, выявлены и успешно
используются
маркеры,
которые
определяются
иммунологическими
методами
в
сыворотке крови пациентов, и поэтому легко совмещаются с обычным анализом крови. В
последние годы идентифицированы десятки антигенов, которые с относительно
небольшой частотой встречаются у онкологических больных, и экспрессия которых
повышена при конкретных видах рака. Интересно, что во многих случаях у пациентов
развивается иммунный ответ на такие "запрещенные" или сверхэкспрессируемые
антигены, причем механизмы нарушения иммунологической толерантности в этих
случаях до сих пор не установлены.
Для выявления антигенов, вызывающих развитие гуморального иммунного ответа у
пациентов с онкологическими заболеваниями, в середине 1990-х годов был разработан
метод серологического скрининга экспрессионных рекомбинантных клонотек кДНК,
полученных из опухолевого материала (SEREX) (Sahin et al., 1995). Клоны, на которые
есть иммунный ответ с высоким титром IgG, отбираются для дальнейшего анализа.
Разработан
эффективный
метод,
позволяющий
быстро
оценить
принадлежность
антигенов, выявляемых по методу SEREX к раковым антигенам - SMARTA (Serological
MiniArrays of Recombinant Tumor Antigens, Lagarkova et al., 2003). Метод позволяет
одновременно анализировать большой набор антигенов.
Анализ включает:
1) определение нуклеотидной последовательности антигена
2) поиск гомологичных последовательностей и известных белковых продуктов в
компьютерных базах данных
3) определение частоты встречаемости антител на данные антигены в сыворотках
раковых больных и здоровых доноров.
Целью настоящей работы являлся анализ структуры и экспрессии гена ALS2CR3/GRIF1, кодирующего возможный раковый антиген MO-REN-46, средствами биоинформатики.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Боковой амиотрофический склероз (ALS)
- это болезни двигательных нейронов
неясного происхождения, для которых характерна прогрессирующая дегенерация
кортикоспинальных трактов и/или клеток передних рогов, в возможном сочетании с
дегенерацией бульбарных двигательный ядер (Siddique et al., 1996).
Спорадические случаи заболевания ALS составляют 90%, а наследственная форма
заболевания (FALS) – 10%. Обе формы
заболевания, возможно, передаются как
аутосомная доминанта (DFALS) или как аутосомный рецессивный признак (RFALS) и,
являются клинически и генетически гетерогенными.
ALS2, также известен как аутосомный рецессивный 3-й тип ALS (RFALS type 3)
(Hamida et al., 1990). ALS2 картирован на 2q33-q34 хромосоме человека. Вызываемое
заболевание
характеризуется
нарушением
двигательных
нейронов,
ведущее
к
спастичности конечностей и лицевых мышц в сочетании с периферической амиотрофией
кистей и ступней (Hentati et al., 1994).
Hadano с коллегами (Hadano et al., 2001) клонировали и определили геномную
организацию трех новых неизвестных генов, обозначенных как ALS2CR1, ALS2CR2 и
ALS2CR3. Авторы считают, что одна из возможных генетических причин ALS2 может
быть вызвана некой мутацией в гене ALS2, приводящая к потере функциональной
активности ALS2. У ALS2 пациентов были выявлены небольшие делеции в структуре гена
ALS2. Для того, чтобы выявить совсем небольшие делеции или замены оснований в
экзонах или в интрон-экзонных границах Hadano с соавторами просеквенировали
(определили нуклеотидную последовательность) продуктов экзон-специфической ПЦР
(полимеразной цепной реакции).
В результате проведенных исследований авторы
полагают, что эти гены не являются каузативными ALS2 генами. Но все же, нельзя
полностью исключить то, что они являются кандидатами ALS2 гена, т.к не была
проанализирована экспрессия каждого гена в соответствующих тканях пациентов и не
был проведен поиск мутаций в 3`-НТО каждого транскрипта.
ALS2CR1 кодирует белок, функция которого еще не определена. ALS2CR2 кодирует
новую серин/треониновую киназу, и ALS2CR3 кодирует неизвестный белок, содержащий
"суперскрученные" (coiled-coil) домены. Белок, кодируемый ALS2CR3, похож на
гистидин-ассоциированный, HAP1 белок (Li et al., 1995). HAP1 связывает динактин
P150Glued , являющийся дополнительным белком для цитоплазматического динеина,
который участвует в ретрогадном транспорте в микроканальцах мембранных органел (Li
et al., 1998). Таким образом, можно предположить, что ALS2CR3 участвует в аксонном
транспорте, и мутации в ALS2CR3 генах вызывают нарушения транспорта, что и приводит
к смерти нейронов.
Недавно ALS2CR3 был независимо клонирован и охарактеризован как ген,
кодирующий новый GABAA рецептор-ассоциированный фактор, GRIF-1 (Beck et al.,
2002). GABAA рецептор – это быстро- действующий лиганд ионных канальцев, который
является основным ингибирующим медиатором рецепторов центральной нервной
системы позвоночных. GRIF-1 экспрессируется, в результате альтернативного сплайсинга,
в двух изоформах: GRIF-1a и, в усеченном виде с С-конца, GRIF-1b. Делеция в GRIF-1b
сооветствует экзону 15 ALS2CR3 гена.
ALS2CR3/GRIF-1 не имеет значительной гомологии с другими белками известной
природы. Однако, предсказанная аминокислотная последовательность показала сходство
между GRIF-1 и двумя генами человека с неизвестной функцией: KIAA0549 (~79%
идентичности) и
KIAA1042 (~45%). Было также показано сходство между GRIF-1 и
продуктами генов CG133777 (Drosophila melanogaster) и BAB41149 (Macaca fasciculariss).
Были идентифицированы консервативные области в предсказанных доменных структурах
всех этих белков. Таким образом, GRIF-1 является представителем нового семейства
генов вместе с еще двумя другими, упомянутыми выше генами. GRIF-1 (крыса),
KIAA0549 (ALS2CR3) (человек), и mCP20802/mCP20839 (мышь) являются группой
ортологичных белков.
Анализ вторичной структуры GRIF-1/ALS2CR3, выявил области, которые могут быть
вовлечены в белок-белковое взаимодействие.
GRIF-1
гомологичны
HAP-1A
и
Выявленные суперскрученные участки
HAP-1B,
которые
являются
белками
цитоплазматических нейронов. Субклеточная локализация указывает на возможную их
роль во внутриклеточном транспорте. Специфичность взаимодействия между GRIF-1 и
GABAA рецепторами (Beck et al., 2002) дает возможность предполагать схожесть их
функций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клон MO-REN-46 был получен при скрининге экспрессионной библиотеки, сделанной из
материала аденокарциномы почки ( REN- “renal”) и сывороткой того же пациента.
Последовательность
клона
была
предоставлена
лабораторией
молекулярной
иммунологии.
С помощью базы данных PubMed, по ключевому слову ALS2CR3 были найдены
опубликованные
статьи
и
составлен
краткий
обзор
литературы.
Нужная
последовательность (ALS2CR3) была найдена при помощи SRS (sequence retreival system)
установленной на сайте EBI ( www.srs.ebi.ac.uk ). Затем был проведен анализ гомологий
при помощи программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) по базе данных EST
(expressed sequence tags) человека (рис.1). BLAST - группа программ, разработанных для
выявления всех возможных сходных последовательностей из баз данных независимо от
того, белковые они или нуклеотидные. BLAST использует поисковый алгоритм, который
отслеживает локальные (а не глобальные) выравнивания, и тем самым распознает
сходство среди последовательностей, которые имеют только изолированные участки
гомологии (Altschl et al., 1990).
Рис.1 Результат поиска гомологии гена ALS2CR3 (Standard nucleotide-nucleoide BLAST [blastn] по базе esthuman).
Также был проведен анализ кластера последовательностей Unigene ( Cluster HS. 154248
Homo
sapiens
),
соответствующего
гену
ALS2CR3.
UniGene
–
база
данных,
сформированная путем автоматического разделения EST последовательностей на
кластеры, состоящие из гомологичных последовательностей. Каждый кластер в UniGene
содержит последовательности, которые представляют как уникальный ген, так и
связанную с ним информацию, такую как тип ткани, в которой был обнаружен данный
транскрипт, и его расположение в геноме. Кластеры, соответствующие генам с высоким
уровнем экспрессии, содержат множество EST
последовательностей, тем самым эта
коллекция может служить для оценки уровня экспрессии в разных тканях. Современная
представленность клонов из раковых библиотек и нормальных тканей в базе данных
GenBank такова, что, в первом приближении, нормализацией по общему количеству
идентифицироанных транскриптов можно пренебречь.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ
Реализация алгоритма BLAST на сайте NCBI, который использовался в данном
исследовании, имеет ограниченные возможности: программа выдает не более 100
гомологичных последовательностей. На самом деле гомологичных последовательностей
может
быть
больше.
Соответствующий
кластер
UniGene
содержит
342
EST
последовательностей. Интересно, что многие EST последовательности, обнаруженные при
помощи BLAST в базе данных est-human, более короткие и с меньшей степенью
гомологии. В кластеры UniGene попадают не все EST последовательности: так, туда не
попадают
последовательности
с
низким
процентом
гомологии.
Следовательно,
большинство последовательностей, не попавших в UniGene, дают слишком маленькие
участки гомологии, которые, за редким исключением, не являются биологически
значимыми. Исключение могут составлять альтернативные транскрипты или продукты
хромосомных транслокаций, которые имеют протяженные участки гомологии, но не
удовлетворяют условиям формирования кластера; такие последовательности, в данном
случае, обнаружены не были. Данные были занесены в
электронную таблицу и
классифицированы по происхождению транскриптов. Происхождение транскриптов
определялось вручную, путем анализа заголовка файла, содержащего последовательность
EST. Результаты анализа представлены на рис.2 и рис.3. Частоты встречаемости антигена
ALS2CR3 в раковых тканях и нормальных, по результатам поиска BLAST и по составу
кластера UniGene, оказались практически идентичными. Таким образом, можно сделать
вывод, что на уровне анализа базы данных, указаний на альтернативный сплайсинг нет.
Результаты поиска по BLAST
cell lines
6%
pooled
9%
Tumor tissue
39%
normal
46%
Tumor tissue
normal
cell lines
pooled
Рис2. Результаты поиска гомологий гена ALS2CR3 из базы данных EST-human по программе BLAST
Результаты поиска по UniGene
cell lines
6%
pooled
12%
Tumor tissue
33%
normal
49%
Tumor tissue
normal
cell lines
pooled
Рис.3 Результаты поиска гомологий гена ALS2CR3 по программе UniGene
Биологические ткани были грубо классифицированы на четыре типа: раковые ткани,
нормальные ткани, клеточные линии, pooled (смешаные образцы, обогащенные редко
встречающимися РНК). Данные о тканевой принадлежности были получены из описания
последовательностей в записях базы данных GenBank. Поскольку встречаемость данного
транскрипта в библиотеках составленных из нормальных и раковых тканей оказались
сравнимыми, можно сделать вывод, что на уровне информации, имеющейся в базе данных
GenBank, экспрессии, специфичной для раковых тканей, не наблюдается. Тем самым,
повышенная экспрессия гена ALS2CR3/GRIF1 не является характерной для раковых
опухолей.
Для проверки возможности того, что гуморальный ответ возникает на продукт
альтернативного сплайсинга гена, более детально было исследовано соответствие
последовательности клона MO-REN-46 и предсказанной экзон-интронной структуры гена
ALS2CR3/GRIF1.Графическое представление результатов работы программы BLAST и
предсказанной структуры гена было использовано в том виде, в котором это реализовано
на сервере NCBI. Как видно из рис.4, все предсказанные экзоны гена присутствуют в
транскрипте MO-REN-46. В то же время, среди последовательностей EST имеется один
возможный кандидат на продукт альтернативного сплайсинга (рис. 5). Вследствие
гетерогенности опухоли вполне возможна ситуация, когда гуморальный ответ возникает
на белковый продукт альтернативного сплайсинга, тем более, что из библиотеки был
проклонирован
полноразмерный
транскрипт.
Эта
экспериментальной проверки при помощи количественной ПЦР.
гипотеза
заслуживает
В последнем номере журнала «Proceedings of the National Academy of Sciences» (USA)
была опубликована статья международного консорциума авторов (Brentani et al., 2003),
разработавших систему электронной оценки уровня раково-специфической экспрессии
генов человека «Cancer Genome Anatomy Project». Приуроченное к выходу статьи
обновление,
доступных
для
использования
инструментов
на
сайте
проекта
(http://cgap.nci.nih.gov ), выводит технические возможности для решения этой задачи на
качественно новый уровень. Вместе с тем, очевидно, что накопление достаточного
количества первичных данных, необходимых для получения достоверных выводов о
специфичности экспреccии того или иного транскрипта, еще далеко от завершения.
Рис.4 Сравнение последовательности клона MO-REN-46 с геномным локусом полученным с помощью
программы GenomeBLAST
Анализируемая
послеlовательность
gi 13918935
gb BG687538
кандидат на продукт
альтернативного
сплайсинга
Рис.5 Последовательности из базы данных EST-human гомологичные клону MO-REN-46
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Beck M, Brickley K, Wilkinson HL, Sharma S, Smith M, Chazot PL, Pollard S,
Stephenson FA. (2002) Identification, molecular cloning, and characterization of a novel
GABAA receptor-associated protein, GRIF-1. J Biol Chem Aug 16;277(33):30079-90
2. Hadano S, Yanagisawa Y, Skaug J, Fichter K, Nasir J, Martindale D, Koop BF, Scherer
SW, Nicholson DW, Rouleau GA, Ikeda J, Hayden MR. (2001) Cloning and
characterization of three novel genes, ALS2CR1, ALS2CR2, and ALS2CR3, in the
juvenile amyotrophic lateral sclerosis (ALS2) critical region at chromosome 2q33-q34:
candidate genes for ALS2. Genomics Jan 15;71(2):200-13
3. Hentati, A., Bejaoui, k., Pericak-Vance, M. A., Hentati. F., Speer, M. C., Hung, W.-Y.,
Figlewicz, D. A., Haines, J., Rimmler, J., Hamida, C. B., Hamida, M. B., Broun, R. H.,
Jr., and Siddique, T. (1994). Linkage of recessive familial amyotrophic lateral sclerosis to
chromosome 2q33-q35.Nat. Genet. &: 425-428 [Abstract]
4. Li, S. H., Gutekunst, C.-A., Hersh, S. M., and
Li, X.-J. (1998). Interacting of of
huntingtin- associated protein with dynactin P150Glued . J Neurosci. 18: 1261-1269.
5.
Li, X. J., Li, S. H., Sharp, A. H., Nucifora, F C., Jr., Schilling, G., Lanahan, A., Worley,
P., Snyder, S. H., and Ross, C. A. (1995). A huntingtin-associated protein enriched in
brian with implications for pathology. Nature 378: 398-402.
6. Sahin, U., Tureci, O., Schmitt, H., Cochlovius, B., Johannes, T., et al. Human neoplasms
elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci
USA, 1995, 92, 11810-11813.
7. Siddique, T., Nijhawan, D., and Hentati, A. (1996). Molecular genetic basis of familiar
ALS. Neurology 47: S27-S35.
8. Russian Journal of Immunology, volume 7, number 3,2002. Серологическая
идентификация антигенов, ассоциированных с раком почки. Е. П. Королева, М. А.
Лагарькова, А. А. Мещеряков, М. Сканлан, Л. Олд, С. А. Недоспасов, Д. В. Купраш
9. Основы иммунологии. А. Ройт, Мир, 1991
10. Руководство по медицине.
Диагностика и терапия в 2-х т. Под редакцией Р.
Беркоу; Мир, 1997
11. Lagarkova MA, Koroleva EP, Kuprash DV, Boitchenko VE, Kashkarova UA,
Nedospasov SA, Shebzukhov YV. Evaluation of humoral response to tumor antigens
using recombinant expression-based serological mini-arrays (SMARTA). Immunol Lett.
2003 Jan 2;85(1):71-4.
12. Brentani H et al., The generation and utilization of a cancer-oriented representation of the
human transcriptome by using expressed sequence tags. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003
Nov 11; 100(23):13418–13423