Заявка на КЭ Цитомеханариум

Заявка
на проведение на РС МКС космического эксперимента
1. Наименование КЭ:
«Поиск потенциальных механосенсоров клеток Drosophila melanogaster, экспонированных
условиям космического полёта»
(Шифр «ЦИТОМЕХАНАРИУМ»)
2. Полное наименование и реквизиты предприятия, заинтересованного в проведении КЭ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр
Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук
(ГНЦ РФ – ИМБП РАН)
Хорошевское шоссе, 76а, 123007, г. Москва
3. Наименование тематической секции КНТС, к которой заявитель относит свой КЭ
Секция № 1 «Космическая биология и физиология»
4. Данные о научном руководителе КЭ:
Огнева Ирина Владимировна, ГНЦ РФ – ИМБП РАН, старший научный сотрудник, д.ф-м.н.
5. Ответственный исполнитель (постановщик):
Огнева Ирина Владимировна, ГНЦ РФ – ИМБП РАН, старший научный сотрудник, д.ф-м.н.
6. Зарубежные соисполнители:
7. Участники КЭ:
8. Желательные и технически возможные сроки проведения КЭ: 2016 – 2025 гг.
9. Краткое описание КЭ, содержащее достаточный набор сведений, позволяющий
принять предварительное решение о включении его в программу:
Результаты большого числа исследований в условиях реальной и моделируемой
гравитационной разгрузки свидетельствуют о том, что в различных органах и тканях
формируются негативные изменения в результате действия микрогравитации. При этом
взаимодействие клетки и внешнего механического поля, в том числе гравитационного,
практически не изучено, хотя данная проблема является одной из ключевых в решении вопроса
о реализации длительных космических полетов.
Как и любая механическая система во внешнем поле клетка находится в напряженном (с
механической точки зрения) состоянии. Она формирует структуру и внутреннее механическое
напряжение в соответствии с вектором и амплитудой внешней силы. Изменение внешнего
воздействия (его вектора, амплитуды) закономерно приведет к изменению механического
1
напряжения в клетке и возникновению деформаций. Уровень значимости, последствия этих
деформаций для жизнедеятельности клетки будут зависеть от собственных механических
характеристик клетки и чувствительности ее механосенсоров.
Нами был получен целый ряд данных (Ogneva I.V. et al., 2010; Ogneva I.V., 2010, 2011;
Ogneva I.V. et al., 2014; Ogneva I.V. et al., 2015), позволяющих предположить роль актинсвязывающих белков подмембранного цитоскелета в первичной механорецепции клетками
скелетных мышц и миокарда. Однако в земных условиях исключить прямое действие на
организм силы тяжести не удается. Поэтому наиболее эффективным инструментом для
изучения влияния невесомости на живые организмы остается реальный космический полет.
Была разработана методика с использованием атомной силовой микроскопии,
позволяющая определять поперечную жесткость как сократительного аппарата, так и
мембраны с кортикальным цитоскелетом мышечных клеток (Ogneva I.V. et al., 2010). Было
показано, что у волокон камбаловидной мышцы поперечная жесткость различных участков
сократительного аппарата в расслабленном, активированном кальцием и ригор-состояниях
снижается в ходе гравитационной разгрузки, у волокон икроножной мышцы практически не
меняется, а передней большеберцовой – возрастает (Ogneva I.V. et al., 2009; Ogneva I.V., 2010).
При этом поперечная жесткость сарколеммы с кортикальным цитоскелетом в расслабленном
состоянии снижается во всех мышцах в динамике антиортостатического вывешивания, причем
уже в первые сутки вывешивания, что может быть связано с непосредственным изменением
вектора силы тяжести как внешнего механического фактора, меняющего напряжения на
мембране (Ogneva I.V., 2010). В то же время для кардиомиоцитов крысы, для которых в
условиях антиортостатического вывешивания, по-видимому, на ранних этапах вывешивания
имело место возрастание механического напряжения в результате гиповолемии, жесткость
мембраны с кортикальным цитоскелетом возрастала через 14 суток вывешивания (Ogneva I.V.,
Ushakov I.B., 2012; Ogneva I.V. et al., 2012). При восстановлении после антиортостатического
вывешивания жесткость волокон скелетных мышц увеличивалась (Ogneva I.V., 2011), а
кардиомиоцитов – уменьшалась (Ogneva I.V., Ushakov I.B., 2012; Ogneva I.V. et al., 2012),
возвращаясь к уровню контроля.
Изменения в значениях поперечной жесткости как волокон скелетных мышц, так и
кардиомиоцитов в условиях антиортостатического вывешивания и последующего
восстановления коррелировали с содержанием в мембранной фракции немышечных изоформ
актина, формирующих кортикальный цитоскелет, а также были связаны с разнонаправленным
изменением содержания немышечных изоформ альфа-актинина (1 и 4) в мембранной и
цитоплазматической фракциях (Ogneva I.V., 2011; Ogneva I.V. et al., 2012).
Мы предполагаем, что любое изменение внешних условий для клетки находит свое
отражение в деформации её кортикального цитоскелета. Однако эти деформации
принципиально различны при увеличении и уменьшении нагрузки. Самым первым
результатом становится диссоциация от кортикального цитоскелета различных актинсвязывающих белков: при уменьшении нагрузки – альфа-актинина-4, при увеличении – альфаактинина-1 (Ogneva I.V., 2013; Ogneva I.V., Biryukov N.S., 2013). При дальнейшем развитии
процесса, деформация приводит к разрушению структуры и, на последующих ранних этапах
воздействия, к первоначальному снижению жесткости (Ogneva I.V. et al., 2014). Поэтому мы
2
проанализировали содержание немышечных изоформ актина и альфа-актинина в мембранной
и цитоплазматической фракциях белков, а также уровень экспрессии соответствующих генов.
Основная гипотеза, лежащая в основе предлагаемого космического эксперимента, связана
с тем, что именно деформации кортикального цитоскелета (причём разнонаправленные в
условиях уменьшения и увеличения внешней механической нагрузки), могут играть ключевую
роль в запуске механотрансдукции.
Полученные нами в результате 30-суточного космического полета биоспутника «БИОНМ» №1 (Россия, 2013) данные о состоянии кортикального цитоскелета (Ogneva I.V. et al., 2014)
дают возможность предположить, что изменения его структуры могут играть роль в первичной
механорецепции.
Однако, учитывая, что подобный механизм может быть универсальным для любого типа
клеток, интерес представляет, в том числе, и скрининговый анализ (полный протеом и
транскриптом), который возможен, например, на плодовых мушках Drosophila melanogaster. В
настоящий момент после 44,5-суточного космического полёта космического аппарата
«ФОТОН-М» №4 (Россия, 2014) получен уникальный биологический материал в виде живых
имаго (2-ое поколение) и личинок разных стадий развития (3-е поколение) плодовой мушки
Drosophila melanogaster. Кроме того, повторное экспонирование Drosophila melanogaster
условиям космического полета (экспедиция МКС 40/41) позволило получить пятое поколение
личинок 3 стадии развития.
Представленные в доступной нам литературе результаты исследования различных
аспектов жизнедеятельности плодовой мушки дрозофилы в условиях реальной и
моделируемой микрогравитации позволяют говорить о том, что данный объект является
весьма интересным и перспективным для последующего изучения молекулярно-генетических
механизмов, лежащих в основе адаптационного ответа на экстремальные условия внешней
среды.
Короткий жизненный цикл, нетребовательность к техническому устройству систем
жизнеобеспечения экспериментов на борту спутников или МКС, а также полностью
секвенированный геном дают возможность проведения широкого спектра скрининговых
исследований.
Методики полногеномного секвенирования транскриптома, а также полного протеомного
анализа на основе масс-спектрометрии позволяют в будущем рассчитывать на выявление
механизмов регуляции развития и формирования адаптационного паттерна как на уровне
клеточных структур, включающих регуляцию на уровне транскрипции и трансляции, так и на
уровне целого организма.
В связи с вышеизложенным, целью предстоящих исследований является поиск других
кандидатов (помимо изоформ альфа-актинина) на роль белков-мишеней, связанных с
кортикальным цитоскелетом и являющихся потенциальными механосенсорами. Для
достижения этой цели будет проведен анализ полного протеома (с использованием массспектрометрии) и полного транскриптома (с использованием полногеномного секвенирования
транскриптома) полученных после космического полета имаго и личинок Drosophila
melanogaster. Полученные после такого скрининга данные будут верифицированы с
использованием вестерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции.
3
1. Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Ponomareva E.V., Shenkman B.S. Effect of shorttime gravitational unloading on rat and Mongolian gerbil muscles // Journal of Muscle research and
cell motility. 2009. Vol. 30. P. 261 – 265.
2. Ogneva I.V., Lebedev D.V., Shenkman B.S. Transversal stiffness and Young’s modulus of single
fibers from rat soleus muscle probed by atomic force microscopy // Biophysical Journal. 2010. Vol.
98. Issue 3. P. 418 – 424.
3. Ogneva I.V. The transversal stiffness of fibers and the desmin content in the leg muscles of rats
under gravitational unloading of various duration // Journal of Applied Physiology. 2010. Vol. 109.
Issue 6. P. 1702 – 1709.
4. Ogneva I.V., Ponomareva E.V., Kartashkina N.L., Altaeva E.G., Fokina N.M., Kurushin V.A.,
Kozlovskaya I.B., Shenkman B.S. Decrease of contractile properties and transversal stiffness of
single fibers in human soleus after 7-day “dry” immersion // Acta Astranautica. 2011. Vol. 68. P.
1478 – 1485.
5. Ogneva I.V. Transversal stiffness and beta-actin and alpha-actinin-4 content of the m. soleus
fibers in the conditions of a 3-day reloading after 14-day gravitational unloading // Journal of
Biomedicine and Biotechnology. 2011. Vol. 2011, Article ID 393405, 7 pages.
6. Ogneva I.V., Ushakov I.B. The transversal stiffness of skeletal muscle fibers and cardiomyocytes
in control and after simulated microgravity // Book «Atomic Force Microscopy Investigations into
Biology – From Cell to Protein» (Edited by Dr. Christopher L. Frewin, University of South Florida,
USA), InTech, Chroatia, 2012, 354 pp. ISBN 978-953-51-0114-7. Chapter № 15, P. 325 – 354.
7. Ogneva I.V., Mirzoev T.M., Biryukov N.S., Veselova O.M., Larina I.M. Structure and functional
characteristics of rat’s left ventricle cardiomyocytes under antiorthostatic suspension of various
duration and subsequent reloading // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012. Vol. 2012,
Article ID 659869, 11 pages.
8. Ogneva I.V., Biryukov N.S. Mathematical modeling cardiomyocyte’s and skeletal muscle fiber’s
membrane: interaction with external mechanical field // Applied mathematics. 2013. Vol. 4. № 8A.
P. 1 – 6.
9. Ogneva I.V. Cell mechanosensitivity: mechanical properties and interaction with gravitational
field // BioMed Research International. 2013. Vol. 2013, Article ID 598461, 17 pages.
10. Ogneva I.V., Buravkov S.V., Shubenkov A.N., Buravkova L.B. Mechanical characteristics of
mesenchymal stem cells under impact of silica-based nanoparticles // Nanoscale Research Letters.
2014, 9:284.
11. Ogneva I.V., Maximova M.V., Larina I.M. Structure of cortical cytoskeleton in fibers of mouse
muscle cells after being exposed to a 30-day space flight on board the BION-M1 biosatellite //
Journal of Applied Physiology. 2014. Vol. 116. Issue 10. P. 1315 – 1323.
12. Ogneva I.V., Biryukov N.S., Leinsoo T.A., Larina I.M. Possible role of non-muscle alpha-
4
actinins in muscle cell mechanosensitivity // PLoS ONE. 2014. Vol. 9. Issue 4:e96395
13. Ogneva I.V., Gnyubkin V., Laroche N., Maximova M.V., Larina I.M., Vico L. Structure of the
cortical cytoskeleton in fibers of postural muscles and cardiomyocytes of mice after 30-day 2gcentrifugation // Journal of Applied Physiology. 2015. Vol. 118. Issue 5. P. 613 – 623.
5