Автореферат - Южно-Уральский государственный медицинский
реклама
На правах рукописи Униговская Марина Владимировна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ АНТИСПЕРМАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 14.01.01-акушерство и гинекология 14.03.09-клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2011 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на кафедре акушерства и гинекологии и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Медведев Борис Иванович доктор медицинских наук, профессор Телешева Лариса Фёдоровна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Кулавский Василий Агеевич доктор медицинских наук, профессор Бурмистрова Александра Леонидовна Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «20» октября 2011 года в________ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития» Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Автореферат разослан « »___________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Казачкова Элла Алексеевна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Одной из наиболее актуальных медико-социальных проблем современности является охрана репродуктивного здоровья населения, определяемого как состояние полного физического, умственного и социального благополучия, а не просто отсутствие болезней в сферах, касающихся репродуктивной системы [Мураков С.В. и др., 2009; Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010; Schmidt L., 2006]. В России проблема бесплодного брака приобретает особое медико-социальное значение в прогрессирующего снижения рождаемости, экономической контексте нестабильности и высокого уровня смертности населения [Зайнетдинова Л.Ф., 2010]. По данным, представленным Г.Т. Сухих, Т.А. Назаренко (2010), доля бесплодных браков на территории России колеблется от 8% до 17,5%, не имея тенденции к снижению. Если частота бесплодия в браке достигает 15% и выше, то проблема инфертильности приобретает масштаб государственного значения. При этом особо остро встает проблема физической и психической неполноценности пары, снижается социальная и профессиональная активность, увеличивается количество разводов [Узлова Т.В., 2000; Бахарева Ю.Ю., 2004; Кулаков В.И., 2005; Фролова О.Г., Токова З.З., 2005; Schmidt L., 2006]. Формирование инфертильности, как правило, зависит от ряда причин, выявляемых как у женщины, так и у мужчины. В 42,6 - 65,3% случаев бесплодие в браке обусловлено нарушениями репродуктивной функции женщины, а в 10-20% случаев причину отсутствия беременности установить не удается, что свидетельствует о несовершенстве методов диагностики [Узлова Т.В., 2000; Корнеева И.Е., Лопатина Т.В., 2005; Cухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010]. В последнее десятилетие отмечается прогресс в изучении влияния иммунологических факторов на развитие женского бесплодия. Одним из актуальных направлений является иммунология репродукции, в задачи которой входит изучение роли иммунологических механизмов в процесс репродукции. Последние годы интенсивно обсуждается вопрос о роли антиспермальных антител в нарушении фертильности у женщин [Рыбина И.В., 2004; Гурина О.П. и др., 2010; Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010; Chamley L.W., Clarke G.N., 2007]. Механизм формирования 4 данной формы иммунологического бесплодия обусловлен выработкой у женщин специфических антител, в ответ на чужеродные антигены спермы, и характеризуется высоким уровнем содержания антител в различных биологических жидкостях репродуктивного тракта (цервикальная слизь, фолликулярная жидкость, содержимое полости матки), а также в сыворотке крови [Черешнев В.А. и др., 2005; Николаева М.А., 2010; Eggert-Kruse W.,1995]. Частота выявления антител у пациенток с бесплодием варьирует в пределах 9 - 36% [Naz R. K., 2004]. Несмотря на проявляемый интерес к данной проблеме имеется дефицит работ по выяснению роли сывороточных антиспермальных антител в генезе женского бесплодия [Калашникова Е.А. и др., 2003; Мартенова А.А., Сотникова Н.Ю., 2003; Гурина О.П. и др., 2010; Shibachara H., 2003; Shibachara H. et al., 2009]. Цель исследования Оптимизация лечения бесплодия, ассоциированного с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, на основании изучения особенностей клинико-иммунологических показателей у пациенток с этой патологией. Задачи исследования 1. Определить клинико-анамнестические особенности и оценить частоту репродуктивных потерь у пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител. 2. Изучить особенности иммунологических показателей периферической крови у пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител. 3. Разработать комплексную поэтапную программу лечения пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, и оценить её эффективность. Научная новизна Впервые проведено сравнительное исследование клинических и иммунологических показателей у пациенток с бесплодием, имеющих высокий и низкий уровень сывороточных антиспермальных антител. Установлено, что пациентки с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем антиспермальных встречаемости антител, характеризуются большей частотой экстрагенитальной патологии, инфекций, передающихся половым 5 путем (Clamydia trachomatis и Ureaplasma urealiticum), активностью хронического воспалительного процесса в полости матки (умеренно-активный эндометрит), повышенным содержанием гормона Т3 в сыворотке крови и отрицательным (сомнительным) результатом посткоитального теста (ПКТ). Выявлены особенности иммунологических показателей у пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител: увеличено содержание IgA, IgG, sFasL и NOx в сыворотке, повышено число лейкоцитов периферической крови, абсолютное и относительное число лимфоцитов с маркерами CD25+ и CD95+, повышено количество лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза при снижении содержания CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми женщинами. Определены отличия в показателях между пациентками с высоким уровнем антиспермальных антител и женщинами, имеющими низкий уровень антител, которые заключались в увеличении содержания всех классов сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG), специфического IgМ к ЦМВ, относительного и абсолютного содержания лимфоцитов, абсолютного числа CD4+ клеток, лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации (CD25+, HLA-DR), содержания растворимого sFas. Зарегистрировано снижение процентного содержания CD3+ и CD8+ лимфоцитов, а также уровня NOх в сыворотке крови у пациенток с высоким уровнем антиспермальных антител. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость работы заключается в расширении представлений о роли сывороточных антиспермальных антител в развитии бесплодия у женщин и об особенностях клинико-иммунологического статуса пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител. Разработана эффективная комплексная поэтапная программа лечения пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител. Положения диссертации, выносимые на защиту 6 1. У женщин с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, выявляется большая частота инфекционно- воспалительных заболеваний и высокая частота репродуктивных потерь. 2. У пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, отмечаются более выраженные изменения иммунологических показателей периферической крови по сравнению с пациентками, имеющими низкий уровень антиспермальных антител. 3. Лечение пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем антиспермальных антител, - комплексный поэтапный процесс, включающий мероприятия, направленные на снижение уровня антител с помощью этиотропной и иммуносупрессивной терапии на фоне длительной condom-терапии. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в работу 1 гинекологического отделения Клиники ГБОУ ВПО, используются в педагогическом процессе на кафедрах акушерства и гинекологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России. Апробация работы Основные положения диссертации доложены на VII-ой итоговой научнопрактической конференции молодых ученых ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава (Челябинск, 2009), на IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011). Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 в журналах, рекомндованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 30 таблиц и 2 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 223 источника, из них 148 отечественных и 75 зарубежных. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования 7 Было проведено открытое, краткосрочное исследование 131 женщины, 108 из которых имели диагноз бесплодие. Пациентки с бесплодием были разделены на группы в зависимости от уровня антиспермальных антител (АСАТ) в сыворотке. Критериями включения в основную группу являлись: 1) высокие уровни антиспермальных антител в сыворотке (> 65,00 Ед/мл); 2) репродуктивный возраст от 21 до 40 лет включительно (средний возраст 29,24±0,24); 3) бесплодие; 4) информированное согласие пациенток на участие в исследовании. Критерии включения в группу сравнения были: 1) низкие уровни антиспермальных антител в сыворотке (< 55,00 Ед/мл); 2) репродуктивный возраст от 21 до 40 лет включительно (средний возраст 29,79± 0,53); 3) бесплодие; 4) согласие пациенток на участие в исследовании. Критериями исключения были: 1) возраст 41 год и старше; 2) наличие промежуточных уровней антиспермальных антител (от 55,00 до 65,00 Ед/мл); 3) опухоли яичников, наличие тяжелой соматической патологии 4) аутоиммунные, аллергические и лимфопролиферативные заболевания; 5) трубно-перитонеальный фактор бесплодия (на основании данных гистеросальпингографии, лапароскопии); 6) мужской фактор бесплодия (на основании данных спермограммы). Контрольную группу составили 23 здоровые женщины в возрасте от 21 до 40 лет включительно с отсутствием патологии репродуктивной системы. Средний возраст обследуемых пациенток составил 28,78± 0,7 лет. Все пациентки с бесплодием были обследованы по стандартному плану диагностических тестов, который включал в себя: 1. Клинико-анамнестический метод (сбор анамнеза, бимануальное исследование, состояние менструальной, половой, репродуктивной функции, начало и характер половой жизни, данные о состоянии фертильности мужа). 2. Специальные (гинекологические) методы исследования включали: осмотр наружных половых органов, пальпацию паховых лимфатических узлов, пальпаторное исследование молочных желез. Проводилась расширенная кольпоскопия и при наличии патологически измененного эпителия, была проведена прицельная биопсия с последующим гистологическим исследованием полученного пациенткам проводилась аспирационная биопсия материала. эндометрия с Всем помощью урогенитального зонда Тип С (ПАЙПЕЛЬ; «Jiangsu Suyun Medical Materials Co., Ltd», 8 КНР), с последующим морфологическим изучением материала [Кондриков Н.И., 1989; Lumsted М.А., Wallace Е.М., 1998]. Для объективного суждения о сущности, степени выраженности и активности воспалительного процесса использовался полуколичественный метод оценки лимфоцитарной инфильтрации, плазматизации и фибротизации стромы эндометрия, а также выраженности гранулоцитарной инфильтрации слизистой оболочки матки в биопсийном материале [Казачкова Э.А., 1984; Медведев Б.И. и др., 2001; Алимова О.А. и др., 2008]. Комплексное обследование функции яичников оценивали по содержанию гормонов в сыворотке крови. Комплекс инструментальных методов исследования, включающих ультразвуковое исследование половых органов, органов малого таза, молочных желёз, осуществлялся на ультразвуковом сканере Medison 8000 EX (Южная Корея). Информацию о состоянии маточных труб и полости матки получали путем использования метросальпингографии 76% водорастворимыми растворами урографина и тразографа в количестве 10-20 мл на аппарате «Тефаникс» (Франция). Морфологическое исследование включало цитологическое исследование мазковсоскобов, а также гистологическое исследование материала из полости матки. 3. Микробиологические методы заключались в проведении бактериологического исследования рекомендациям на наличие МЗ РФ гонококков и трихомонад согласно методическим «Стандартизация медицинской помощи больным гонококковой инфекцией» (Приказ №176 от 28.02.05), и положения МЗ РФ «О мерах по предупреждению распространения заболеваний, передающихся половым путём (Приказ № 291 от 30.07.01). Для количественной оценки содержания бактериальной микрофлоры в цервикальном канале производили подсчёт колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий в расчете на 1 мл. Для выявления возбудителей ИППП пациенткам осуществлялось молекулярно-биологическое исследование методом ПЦР, с использованием тест-систем производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (Москва). 4. Тест in vivo (посткоитальный тест) проводился в периовуляторный период и считался положительным, если в цервикальной слизи обнаруживалось любое число сперматозоидов с быстрым поступательным движением [Нерсеян Р.А., Курило Л.Ф., 2001]. 9 5. Иммунологические методы включали определение антиспермальных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием тест- системы Sperm-antibody-ELISA, Bioserv (Германия). При значениях антиспермальных антител в диапазоне 0-60 Ед/мл, согласно инструкции, результаты оценивались как низкие, более 65 Ед/мл - как повышенные. Показатели от 55-65 Ед/мл - оценивались как промежуточные, и являлись критериями исключения из исследования. Исследование уровней иммуноглобулинов А, М, G выполнено с использованием тест системы «Иммуноскрин - G, М, А-ИФА-БЕСТ». Определение специфических IgM, IgG к герпетической и цитомегаловирусной инфекции проводилось на полуавтоматическом иммунохемилюминесцентном анализаторе «Architect I 2000SR» (Abbot Laboratories, США). Также были определены уровни цитокинов IL-2, IL-4, IL10, IL-17 (ООО «Цитокин» (С-Пб); содержание конечных стабильных метаболитов оксида азота проводилось фотометрическим способом (Емченко Н.Л. и др., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г). Для оценки клеточного звена в периферической крови было определено абсолютное число лейкоцитов, абсолютное и относительное число лимфоцитов и их субпопуляций (НПО «Препарат», Н.Новгород). Морфологическая оценка апоптоза лимфоцитов периферической крови проводилась по методике Vermes I. et al., (2000) с использованием суправитального ядерного красителя Hoeсhst 33342 (США). Определение рецепторов sFas, sFasL в крови проводили иммуноферментным методом с помощью тест-систем Bender Medsystems (Австия). 6. Статистические методы. Результаты оценивали с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc. (США). Результаты исследования представлены в виде медианы (Ме) и квартилей - нижнего и верхнего (QL-QU). Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при р≤0,05, по непараметрическим критериям Mann-Whitney. При определении достоверности отличий уровня антиспермальных антител у пациенток первой группы до и после лечения использовали парный тест Вилкоксона. Сравнение групп по качественным бинарным признакам (симптом есть/нет) проводили путем вычисления двустороннего точного критерия Фишера [Гланц С., 2004]. Результаты исследования и их обсуждение 10 Сбор анамнестических данных пациенток основной и сравниваемых групп позволил выявить, что большинство пациенток в обследуемых группах относились к служащим (80%-90%), группы были сопоставимы по возрасту, уровню образования, социальному составу. Средний возраст менархе у пациенток всех исследуемых групп составлял в 13,00±0,07 лет, регулярный менструальный цикл сразу установился у 52 (70,3%) пациенток группы с ↑АСАТ, у 23 (67,6%) пациенток с ↓АСАТ, у 100% женщин контрольной группы. Возраст начала половой жизни у пациенток исследуемых групп был практически одинаковым. Проведенный анализ сопутствующих экстрагенитальных заболеваний у женщин с ↑АСАТ и ↓АСАТ показал, что у пациенток, с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ, в анамнезе достоверно чаще зарегистрирована экстрагенитальная патология (эндокринные заболевания, воспалительные заболевания верхних дыхательных путей, заболевания мочевыделительной, сердечнососудистой, нервной систем и желудочно-кишечного тракта), по сравнению с женщинами, страдающими бесплодием с ↓АСАТ (р=0,001), что согласуется с ранее проведёнными исследованиями Л.Ф. Зайнетдиновой [Зайнетдинова Л.Ф., 2010]. Анализ исходов беременностей выявил достоверно высокую частоту репродуктивных потерь у пациенток с ↑АСАТ по сравнению со здоровыми (р<0,0001) и с женщинами, имеющими ↓АСАТ (р=0,002), что совпадает с мнением авторов, изучающих данную проблему [Рыбина И.В., 2004; Lahteenmaki A., 1995; Kutteh W.H., 1999; Lombardo F., 2004], и позволяет предполагать взаимосвязь между наличием высокого уровня антиспермальных антител в крови и бесплодием у женщин с отягощенным акушерско-гинекологический анамнезом. Результаты наличия патогенной микрофлоры цервикального канала, выявленной методом ПЦР, представлены в таблице 1. Таблица 1 Возбудители инфекций, передающихся половым путем, у пациенток с бесплодием ↑АСАТ n = 74 Возбудитель Clamydia trachomatis Ureaplasma urealiticum ↓АСАТ n = 34 абс. % р (критерий Фишера) абс. % 17 23,00 - - 0,001 41 55,40 8 23,50 0,003 11 Анализ частоты встречаемости инфекций, передающихся половым путем (Clamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma genitalium, Gardnerella vaginalis, Herpes simplex virus, CMV, Trichomonas vaginalis, Candida albicans), показал их достоверное преобладание у пациенток с ↑АСАТ, (56 пациенток), по сравнению с пациентками с ↓АСАТ (13 пациенток): 75,70% против 38,20% (р=0,0002). Эти данные подтверждают мнения ряда авторов о способности генитальных инфекций стимулировать локальный антиспермальный иммунный ответ [Пшеничникова Т.Я., 1991; Кулаков В.И., 2005; Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010; Eggert-Kruse W., 1995]. Пациентки сравниваемых групп были обследованы на наличие хронического эндометрита в полости матки методом аспирационной биопсии эндометрия. Характер воспалительного процесса, по данным морфологической оценки, приведен в таблице 2. Таблица 2 Наличие и степень активности воспалительного процесса в полости матки у пациенток с бесплодием (по результатам аспирационной биопсии эндометрия) ↑АСАТ n = 74 Степень активности ↓АСАТ n = 34 р (критерий Фишера) абс. % абс. % Воспаление в полости матки не выявлено 10 13,5 2 5,9 >0,05 Неактивный эндометрит 30 40,5 28 82,4 0,001 Слабоактивный эндометрит 11 14,9 2 5,9 >0,05 Умеренно-активный эндометрит 16 21,6 1 2,9 0,011 Высокоактивный эндометрит 7 9,5 1 2,9 >0,05 Данные таблицы 2 показывают, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ, неактивный эндометрит зарегистрирован достоверно реже по сравнению с женщинами, имеющих ↓АСАТ (р =0,001). Превалирующей формой воспаления в полости матки был умеренно-активный эндометрит (р=0,011), что совпадает с данными литературы, свидетельствующими о влиянии активности 12 хронических воспалительных заболеваниях органов малого таза на повышенную выработку антиспермальных антител [Кулаков В.И., 2005; Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010; Хонина Н.А., 2010]. В обязательную схему обследования пациенток, страдающих бесплодием, было включено определение их гормонального статуса по фазам менструального цикла, учитывая взаимосвязь важнейших функциональных адаптационных систем: репродуктивной, иммунной и эндокринной. Кроме того, изучено содержание гормонов, характеризующих работу щитовидной железы. Выявлено достоверное увеличение гормона Т3 у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ, по сравнению с показателями пациенток, имеющих ↓АСАТ (р=0,006). По остальным показателям гормонального статуса достоверных отличий не установлено. В ходе комплексного посткоитальный тест обследования (рисунок 1), всем пациенткам был проведён позволяющий оценить взаимодействие сперматозоидов с цервикальной слизью. Известно, что АСАТ, взаимодействуя с чужеродными антигенами сперматозоидов, в биологических жидкостях репродуктивного тракта женщин, могут вызывать нарушение их подвижности, блокируя, в ряде случаев, мембранные молекулы, необходимые для взаимодействия с яйцеклеткой [Чепель Э. и др., 2008; Naz R.K., Menge A.C., 1994; Mazumdar S., Levine A.S.,1998; Bronson R.A., 1999]. 60 50 40 * 30 20 10 0 Положительный посткоитальный тест ↑АСАТ ↓АСАТ Рис. 1. Результаты посткоитального теста. *- достоверность между сравниваемыми группами Повышенное содержание АСАТ в сыворотке крови, выявленное в процессе 13 исследования, позволяет предположить наличие изучаемых антител в слизи цервикального канала, что подтверждается результатами посткоитального теста. Анализ результатов выявил, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ в сыворотке, достоверно чаще регистрировался отрицательный (сомнительный) результат посткоитального теста (р<0,001), то есть, чаще встречались сперматозоиды с признаками иммобилизации. Напротив, в группе регистрировался положительный результат ПКТ с ↓АСАТ чаще (р<0,001),что может свидетельствовать об отсутствии влияния низкого уровня АСАТ на подвижность сперматозоидов в цервикальном секрете. Поскольку репродуктивная функция женщины напрямую связана с работой иммунной системы, то изменения иммунного гомеостаза, возможно, влияют на нормальный репродуктивный процесс, приводя к развитию бесплодия. Для оценки гуморальных факторов иммунитета проводилось определение уровней Ig А, М, G в сыворотке крови. Результаты приведены в таблице 3. Таблица3 Концентрация иммуноглобулинов A, M, G (г/л) в сыворотке крови у пациенток с бесплодием Ig IgA IgM IgG 1 ↑АСАТ n = 74 2 ↓АСАТ n = 34 3 Здоровые Me Me Me QL-QU QL-QU QL-QU 2,80 1,70 1,50 2,10-3,80 1,50-2,80 1,25-2,08 2,12 1,32 1,75 1,40-3,37 0,98-2,36 1,31-2,40 12,95 9,53 9,20 10,20-17,80 6,40-13,10 8,10-10,05 р (тест Манна-Уитни) n=23 Пациентки с высоким уровнем АСАТ 1-3 2-3 1-2 0,001 0,071 0,001 0,088 0,421 0,008 0,001 0,479 0,001 характеризовались статистически значимым увеличением IgA и IgG в сыворотке крови по сравнению со здоровыми женщинами и достоверным увеличением содержания всех анализируемых классов 14 сывороточных иммуноглобулинов (Ig А, Ig М, Ig G), по сравнению с пациентками, имеющими низкий уровень АСАТ. Для определения характера специфического иммунного ответа у пациенток с бесплодием c ↑АСАТ и ↓АСАТ, проводили определение Ig классов М и G к герпетической и цитомегаловирусной инфекции, и только концентрация IgМ к ЦМВ была достоверно повышена в группе пациенток с ↑АСАТ (р=0,05). Таблица 4 Частота обнаружения специфических IgM к ЦМВ у пациенток с бесплодием ↑АСАТ n = 74 ↑АСАТ n = 74 IgM ЦМВ (-) 58 32 IgM ЦМВ (+) 16 2 Показатели р (критерий Фишера) 0,05 В процессе исследования нами не было выявлено отличий по содержанию цитокинов IL-2, IL-10, IL-17 в сыворотке крови у пациенток всех обследуемых групп. При сравнении показателей пациенток с бесплодием, имеющих ↓АСАТ, с группой здоровых женщин выявлено достоверное снижение содержания IL-4 у пациенток, страдающих бесплодием. Уровни цитокинов в крови обследованных пациенток представлены в таблице 5. Таблица 5 Уровни цитокинов в сыворотке крови пациенток с бесплодием Показатели IL-2, пг/мл IL-4, пг/мл IL-10, пг/мл 1 2 3 ↑АСАТ n = 74 ↓АСАТ n = 34 Здоровые Me Me Me QL-QU QL-QU QL-QU 0,001 0,001 0,001 0,000-0,001 0,000-2,165 0,001-0,001 46,940 41,460 54,610 30,500-74,410 36,600-45,340 52,600-57,870 4,526 4,827 4,371 3,488-5,710 3,915-5,563 3,017-5,180 р тест Манна-Уитни n=23 1-3 2-3 1-2 0,303 1,000 0,290 0,484 0,009 0,283 0,535 0,372 0,686 15 IL-17, пг/мл 5,588 0,001 13,910 0,001-21,730 0,001-103,300 0,001-19,500 0,704 0,813 0,898 Поскольку оксид азота (NO) является важным фактором неспецифической защиты организма [Ванин А.Ф., 1998; Маеда Х., Акаики Т., 1998; Сомова Л.М., Плехова Н.Г., 2006], было изучено содержание его конечных стабильных метаболитов в сыворотке крови, результаты представлены в таблице 6. Таблица 6 Уровни конечных стабильных метаболитов оксида азота у пациенток с бесплодием 1 2 3 ↑АСАТ n = 74 ↓АСАТ n = 34 Здоровые Me Me Me QL-QU QL-QU QL-QU NOх 21,90 24,00 19,10 мкМоль/л 18,40-26,00 21,10-28,00 12,30-22,40 NO2 3,55 4,75 2,50 мкМоль/л 2,25-6,40 2,70-7,20 2,00-4,60 NO3 17,65 17,60 15,50 мкМоль/л 15,40-19,90 16,80-20,00 7,94-19,90 Показатели р (тест Манна-Уитни) n=23 1-3 2-3 1-2 0,026 0,001 0,009 0,208 0,047 0,217 0,141 0,083 0,360 Анализ данных таблицы 6 показал статистически значимое увеличение NOх у пациенток с бесплодием, имеющих ↑АСАТ, по сравнению с группой здоровых женщин. Также было отмечено достоверное повышение показателей NOх и NO2 у пациенток с бесплодием, имеющих ↓АСАТ, при сравнении со здоровыми женщинами, что совпадает с результатами, полученными ранее Л.Ф. Зайнетдиновой (2010). Сравнительный анализ показателей суммарного содержания нитратов и нитритов в сыворотке крови у пациенток с бесплодием с ↑АСАТ и с ↓АСАТ выявил достоверное снижение NOх у женщин с ↑АСАТ. Выявленный факт позволяет предположить, что бесплодие у женщин с ↑АСАТ, возможно, связано с гиперпродукцией антиспермальных антител, а не с высоким содержанием NOх. Характеристика популяционного состава лимфоцитов у обследованных пациенток приведена в таблице 7. Таблица 7 Характеристика популяционного состава лимфоцитов у пациенток с бесплодием 16 1 2 3 ↑АСАТ n = 74 ↓АСАТ n = 34 Здоровые Me Me Me QL-QU QL-QU QL-QU 1 2 3 4 Лейкоциты, 109/л 5,45 5,00 4,80 4,50-6,40 4,20-5,80 3,80-5,80 28,00 26,00 32,00 26,00-35,00 25,00-28,00 24,00-35,00 Лимфоциты, 1,55 1,41 1,54 х109/л 1,17-2,08 1,05-1,56 0,91-2,18 CD3, % 62,00 65,50 68,00 55,00-67,00 60,00-68,00 62,00-69,00 35,00 36,00 36,00 32,00-38,00 35,00-38,00 36,00-38,00 0,65 0,53 0,55 0,49-0,85 0,39-0,65 0,35-0,84 22,00 24,00 24,00 20,00-24,00 22,00-24,00 22,00-24,00 12,00 12,00 12,00 12,00-17,00 10,00-15,00 10,00-12,00 0,18 0,16 0,15 0,15-0,28 0,13-0,22 0,09-0,24 0,33 0,25 0,29 0,21-0,49 0,21-0,34 0,19-0,43 Показатели Лимфоциты, % CD4, % CD4, х109/л CD8, % CD25, % CD25, х109/л HLA-DR, х109/л р тест Манна-Уитни n=23 1-3 2-3 1-2 5 6 7 0,028 0,361 0,086 0,973 0,137 0,035 0,406 0,402 0,037 0,002 0,204 0,034 0,016 0,532 0,056 0,235 0,641 0,046 0,013 0,721 0,024 0,002 0,054 0,273 0,027 0,478 0,015 0,275 0,406 0,028 У пациенток с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ, по сравнению со здоровыми женщинами, наблюдается достоверное повышение числа лейкоцитов периферической крови, относительного и абсолютного содержания CD25 лимфоцитов при снижении процентного содержания CD3+, CD4+, CD8+. Сравнительный анализ субпопуляционного периферической крови, проведённый между имеющих ↑АСАТ и состава лимфоцитов группами пациенток с бесплодием, ↓АСАТ, показал повышение относительного и абсолютного 17 содержания лимфоцитов, абсолютного числа клеток, несущих рецепторы CD4+, а также лимфоцитов с маркёрами ранней и поздней активации - CD25+, HLA-DR+, при снижении процентного содержания CD3+ и CD8+ лимфоцитов. Для характеристики процессов апоптоза в периферической крови (таблица 8), было определено число лимфоцитов с маркером готовности к Fas-зависимому апоптозу (Fas/Apo-1/CD95), количество лимфоцитов с морфологической фрагментацией ядра, а также уровень растворимого Fas (sFas) и растворимого Fasлиганда (sFasL). Таблица 8 Показатели, характеризующие процессы апоптоза у пациенток с бесплодием 1 2 3 ↑АСАТ n = 74 ↓АСАТ n = 34 Здоровые Me Me Me QL-QU QL-QU QL-QU 10,00 12,00 8,00 8,00-12,00 10,00-12,00 8,00-10,00 0,16 0,14 0,12 0,12-0,21 0,12-0,18 0,07-0,17 8,00 7,50 5,00 5,00-10,00 6,00-12,00 3,00-9,00 Апоптоз, 0,10 0,10 0,07 х109/л 0,07-0,15 0,05-0,12 0,04-0,12 sFas, пг/м 74,51 54,37 79,03 66,01-79,10 32,56-72,75 77,24-84,21 0,50 0,42 0,17 0,42-0,54 0,34-0,55 0,14-0,35 Показатели CD95, % CD95, х109/л Апоптоз, % sFasL, нг/мл р тест Манна-Уитни n=23 1-3 2-3 1-2 0,007 <0,001 0,076 0,003 0,028 0,436 0,017 0,01 0,491 0,016 0,215 0,158 0,197 0,042 0,041 0,003 0,062 0,580 Наиболее выраженные изменения программированной гибели лимфоцитов, выявленные у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ↑АСАТ, заключались в достоверно повышенном содержании клеток, несущих рецепторы СD95, повышенным числом лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза и более 18 высоким уровнем растворимого sFasL в сыворотке по сравнению со здоровыми. Показатели апоптоза у пациенток с бесплодием, имеющих ↓АСАТ, отличались от значений женщин группы контроля достоверно повышенным содержанием клеток с готовностью к апоптозу (CD95+), лимфоцитов с апоптотической более высоким процентным содержанием фрагментацией ядра, пониженным уровнем растворимого sFas в сыворотке. Сравнительный анализ показателей, характеризующих процессы апоптоза у пациенток с бесплодием, имеющих высокий и низкий уровень АСАТ, выявил повышенное содержание sFas в сыворотке в группе с ↑АСАТ, при отсутствии достоверных отличий по другим показателям апоптоза. С учётом выявленных клинико-иммунологических особенностей пациенток с бесплодием, ассоциированных с ↑АСАТ, и в соответствии с поставленной целью, была разработана комплексная лечебная программа, направленная на снижение уровня антиспермальных антител в сыворотке крови. Комплекс лечебных мероприятий состоял из 4 последовательных этапов (рис. 2). Обязательным условием на всех этапах лечения данного вида бесплодия, было использование длительной condom-терапии с целью избежания контакта с чужеродными антигенами спермы полового партнера. I этап: Комплексное обследование пациенток Распределение по группам Группа ↑АСАТ II этап: Группа ↓АСАТ Этиотропная терапия Контроль уровня АСАТ III этап: Уровень АСАТ в динамике после этиотропной терапии. Снижение АСАТ Без динамики 19 Планирование беременности Применение ГКСтерапии IV этап: Применение терапии глюкокортикоидами (метипред 4мг) у пациенток с высоким уровнем антиспермальных антител в сыворотке крови Рис. 2. Программа ведения пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных АСАТ Первый этап включал проведение комплексного обследования пациенток с бесплодием (сбор анамнестических данных, оценку воспалительных и инфекционных процессов органов малого таза, определение уровня гормонов, антиспермальных антител, изучение иммунного статуса, обследование полового партнера) и распределение их по группам в зависимости от уровня антиспермальных антител в сыворотке. На втором этапе всем пациенткам с бесплодием был проведен комплекс лечебных мероприятий, направленный на устранение инфекционно-воспалительных заболеваний органов малого таза. В схему терапии были включены антибактериальные, иммуномодулирующие, нестероидные противовоспалительные препараты, местное лечение. После чего всем пациенткам проводился контроль излеченности: исследование сыворотки крови для определения уровня АСАТ в динамике, исследование мазков-соскобов на инфекции, передающиеся половым путем, аспирационная биопсия эндометрия, бактериологическое исследование отделяемого из цервикального канала. При отсутствии эффекта от проведенной терапии был назначен повторный курс лечебных мероприятий. При получении положительной динамики (снижение АСАТ) пациентки переводились на следующий этап. Третий этап включал распределение женщин с изначально высоким уровнем АСАТ на 2 подгруппы, в зависимости от содержания антиспермальных антител после проведенной на втором этапе терапии. 1 подгруппу составили 27 (36,50%) пациенток с зарегистрированной положительной динамикой после проведенного лечения (АСАТ 20 менее 55,00 Ед/мл), 2 подгруппу составили 47 (63,50%) пациенток, у которых уровень АСАТ остался высоким (более 65,00 Ед/мл). После чего пациентки, включённые в исследование, переводились на четвертый этап. Четвертый этап - имел два варианта тактики ведения пациенток в зависимости от уровня АСАТ в сыворотке. 1 вариант. Пациенткам с АСАТ < 55,00 Ед/мл рекомендовалось планировать беременность на фоне condom-терапии и отменять ее только в периовуляторный период. 2 вариант. Пациенткам с АСАТ > 65,00 Ед/мл на фоне condom-терапии проводили специфическое лечение глюкокортикоидными препаратами (ГКС). При отсутствии овуляторных циклов, пациенткам проводилась контролируемая индукция овуляции. 11 пациенток с уровнем АСАТ >65,00 Ед/мл отказались от терапии и были исключены из дальнейшего исследования. Эффективность лечения бесплодия пациенток с разными уровнями антиспермальных антител приведена в таблице 9. Таблица 9 Эффективность лечения бесплодия у пациенток с высоким и низким уровнем антиспермальных антител Женщины с высокими уровнями АСАТ n=74 Показатели Этиотропная терапию+condomтерапия n=27 ↓АСАТ Этиотропная +condomтерапия +специфическая терапия глюкокортикоидами n=36 ↑АСАТ Этиотропная терапия n=11 ↑АСАТ Женщины с ↓АСАТ n=34 Количество наступивших беременностей 15 19 2 19 55,60 52,80 18,20 55,90 % наступивших беременностей На фоне проводимого лечения, из 27 пациенток со сниженным уровнем АСАТ после этиотропной терапии у 15 лечения наступила беременность, т.е. эффективность составила 55,60%. Пациенткам, с отсутствием положительной динамики (АСАТ>65,00Ед/мл) после проведенного на втором этапе лечения (36 пациенток), 21 назначалась терапия глюкокортикоидами, на фоне применения которой, проводился контроль уровня АСАТ. Положительная динамика (снижение АСАТ < 55,00 Ед/мл), зарегистрирована у 23 пациенток, т.е. использование ГКС-терапии приводит снижению уровня антиспермальных антител в принимавших глюкокортикоиды, у 19 (63,9%). наступила к Из 36 пациенток, беременность, то есть эффективность лечения составила 52,80%. Из 11 пациенток (АСАТ > 65,00 Ед/мл), не давших своего согласия на проведение лечения, только у 2 (18,2%) наступила беременность. Эффективность лечения бесплодия с изначально низким уровнем сывороточных АСАТ составила 55,9%. Пациенткам, с отсутствием эффекта от проводимой терапии (АСАТ>65,00 Ед/мл), и пациенткам, у которых, несмотря на снижение уровня АСАТ беременность не наступила в течение всего периода наблюдения, было рекомендовано дальнейшее лечение бесплодия с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий. Снижение уровня сывороточных антиспермальных антител с использованием этиотропной и иммуносупрессивной терапии, на фоне длительной condom-терапии, является критерием повышения эффективности лечения, данной формы бесплодия. ВЫВОДЫ 1. У пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, наблюдается большая частота экстрагенитальной патологии, хронических репродуктивного тракта, инфекций, воспалительных передающихся процессов половым путем, и репродуктивных потерь. 2. У пациенток с антиспермальных бесплодием, антител в ассоциированным сыворотке, с встречаются высоким уровнем неблагоприятные (отрицательные или сомнительные) результаты посткоитального теста в 77%. 3. У пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, увеличено содержание IgA, IgG, sFasL и NOx в сыворотке, повышено число лейкоцитов периферической крови, абсолютное и относительное число лимфоцитов с маркерами CD25+ и CD95+, число лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, 22 зарегистрирован низкий процент CD3+, CD4+ и CD8+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми женщинами. 4. У пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем антиспермальных антител, по сравнению с пациентками, имеющими низкий уровень антител увеличено содержание IgA, IgM, IgG и sFas в сыворотке, зарегистрировано повышенное содержание специфического IgM к ЦМВ, повышено относительное и абсолютное содержание лимфоцитов, абсолютное число CD4+клеток, а также лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации – CD25+ и HLA-DR+, снижено относительное содержание CD3+, CD8+, а также уровень сывороточного NOx. 5. Применение терапии глюкокортикоидами в комплексной поэтапной программе лечения пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, позволило снизить уровень антител в 63,9% случаев и привело к наступлению беременности в 52,8% случаев. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. На первом этапе пациенткам с бесплодием следует проводить комплексное обследование, включающее определение антиспермальных антител в сыворотке методом иммуноферментного анализа. 2. На втором этапе пациенткам с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем сывороточных антиспермальных антител, необходимо проводить лечение органов сопутствующих малого антибактериальные, таза, инфекционно-воспалительных включающее нестероидные заболеваний иммуномодулирующие, противовоспалительные местное лечение. Лечение должно проводиться препараты, на фоне длительной condom-терапии. 3. На третьем этапе проводится контроль уровня сывороточных антиспермальных антител в динамике. 4. На четвертом этапе, пациенткам с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем антиспермальных антител, при отсутствии эффекта от проводимой терапии (отсутствие снижения уровня антиспермальных антител), рекомендуется использование глюкокортикоидных препаратов (метипред 4 мг). 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Униговская, М.В. Диагностическое и прогностическое значение определения количества антиспермальных антител у женщин с бесплодием / М.В. Униговская // Новые технологии в здравоохранении: сборник научных трудов. – Выпуск VII. – Челябинск, 2008. С. 226-227. 2. Униговская, М.В. Характеристика гуморального звена иммунной системы, процессов активации и апоптоза лимфоцитов у женщин с иммуноопосредованным бесплодием / М.В. Униговская, С.Н. Теплова, Б.И. Медведев // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. №2/1 (24), 2009. С. 172-174. 3. Униговская, М.В. Маркеры активации и апоптоз лимфоцитов при бесплодии у женщин с высоким и низким уровнем антиспермальных антител в сыворотке крови / М.В. Униговская, Е.А. Иванов // Материалы VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской Государственной Медицинской Академии. – Челябинск, 2009. – С. 147-149. 4. Униговская, М.В. Характеристика показателей клеточного и гуморального иммунитета у женщин с бесплодием, ассоциированным с высокими уровнями антиспермальных антител / М.В. Униговская, Б.И. Медведев, С.Н. Теплова // Материалы III регионального научного форума «Мать и дитя». – Саратов, 2009. – С. 285-286. 5. Униговская, М.В. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток с бесплодием с разными уровнями антиспермальных антител / М.В. Униговская, Б.И. Медведев, С.Н. Теплова // Вестник Южно-Уральского государственного университета. - №6, Челябинск, 2010. – С. 116-118. 6. Униговская, М.В. Характеристика гуморального и клеточного звена иммунной системы, показателей апоптоза лимфоцитов пациенток с бесплодием, имеющих высокие уровни сывороточных антиспермальных антител / М.В. Униговская, С.Н. Теплова, Б.И. 24 Медведев, Е.А. Иванов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. – Выпуск 23. - №19 (195). – Челябинск, 2010. – С.101-104. 7. Униговская, М.В. Субпопуляционный состав лимфоцитов и показатели гуморального иммунитета у пациенток с бесплодием, ассоциированным с высоким уровнем антиспермальных антител / М.В. Униговская, Л.Ф. Телешева, Б.И. Медведев // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. – 2/1. – Челябинск, 2011. – 209-210. 25 На правах рукописи Униговская Марина Владимировна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ АНТИСПЕРМАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 14.01.01-акушерство и гинекология 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Челябинск, 2011