На правах рукописи АПОПТОЗ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ У
advertisement
На правах рукописи ВАСИЛЬЕВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА АПОПТОЗ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ У ЖЕНЩИН В КЛИМАКТЕРИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ 14.00.36 – Аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сотникова Наталья Юрьевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Защита состоится «19» октября 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «17» сентября 2009 года Ученый секретарь диссертационного cовета, кандидат медицинских наук, доцент Т.Е.Кузнецова 3 Актуальность исследования С возрастом изменяются многие функции организма, в том числе и иммунной системы [Семенков В.Ф., Карандашов В.И., Ковальчук Л.В. 2005]. Экспериментальные и клинические исследования в геронтологии показали, что иммунная защита организма является первой системной функцией, которая нарушается при старении [Хавинсон В. Х. и Анисимов В.Н. 2003]. Симптомы старости появляются уже в конце репродуктивного периода и становятся более интенсивными по мере дальнейшего старения [Хавинсон В.Х. и Анисимов В.Н., 2009]. Иммунная и эндокринная системы находятся в тесной взаимосвязи, направленной на поддержание постоянства внутренней среды организма [Ширшев С.В. 2002; Olsen N.J. and Kovacs W.J. 1996]. Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболеваний [Olsen N.J. and Kovacs W.J., 1996; Elmore S., 2007]. На современном этапе доказано, что изменение уровня половых стероидных гормонов отражается на функциональном состоянии иммунной системы [Bebo, B.F., e.a., 2001; Pfelscifter J., e.a., 2002]. Следующим периодом в жизни женщины после фертильного является климактерический период. Падение уровня циркулирующих эстрогенов и прогестерона в пременопаузальном периоде и крайне низкий их уровень в постменопаузальном периоде определяет возникновение симптомов эстрогендефицитного состояния [Minici F., e.a., 2007] и приводит к нарушению функции иммунной системы [Kamada M., Наступление климактерического e.a., 2000; Kumru S., e.a., 2004]. периода сочетается с возникновением аутоиммунных, опухолевых и инфекционно-воспалительных процессов, что подтверждает нарушение функции иммунной системы [Effros R.B., 2003]. Как известно, данные патологические процессы, могут быть связаны с изменением апоптоза клеток иммунной системы [Reed J.S., 2000; Hakim F.T., e.a., 2004; Schmitt E., e.a., 2007; Elmore S., 2007]. Утверждается, что различие между старыми и молодыми многоклеточными организмами состоит, прежде всего, в количестве функционирующих клеток в органе или ткани: с возрастом это количество в большинстве органов уменьшается из-за стимуляции митохондриального пути апоптоза [Северин Ф.Ф. и Скулачёв В.П., 2009]. 4 Поскольку уровень половых стероидных гормонов изменяется в зависимости от стадии климактерического периода, представляется целесообразным изучение параметров апоптоза как в пременопаузальном, так и в постменопаузальном периодах. Однако особенности апоптоза клеток иммунной системы у женщин как в пременопаузальном, так и постменопаузальном периодах остаются не изученными. В настоящее время широко используется заместительная гормональная терапия (ЗГТ) у женщин климактерического периода, однако механизмы действия препаратов ЗГТ остаются недостаточно изученными. Более того, имеются данные, свидетельствующие об онкогенном потенциале препаратов ЗГТ [Chlebowski R.T., e.a., 2003; Prelevic G.M., e.a., 2005], Современные препараты ЗГТ, содержащие в своем составе эстрогены и прогестины, обладают положительным клиническим эффектом, элиминируя симптомы эстрогендефицитного состояния [Сметник В.П., и Кулаков В.И., 2001]. Известно, что экзогенные половые стероидные гормоны: эстрогены и прогестерон способны модулировать функцию иммунной системы и процессы апоптоза [Riggs B.L., e.a., 2002]. В связи с этим изучение влияния препаратов ЗГТ на апоптоз клеток иммунной системы и параметры его регуляции становится особенно актуальным. Однако, сведения о влиянии заместительной гормональной терапии на апоптоз клеток иммунной системы малочисленны. Цель исследования Установить особенности регуляции Fas-зависимого апоптоза клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия женщин в пре- и постменопаузальном периоде и оценить влияние препаратов заместительной гормональной терапии на характеристики апоптоза. Задачи исследования 1. Установить особенности апоптоза клеток иммунной системы на системном и локальном уровне у женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах по сравнению с параметрами женщин репродуктивного возраста. 2. Выявить особенности сывороточного содержания регулирующих апоптоз факторов у женщин в пре- и постменопаузальном периодах. 5 3. Оценить экспрессию мРНК регулирующих апоптоз факторов в ткани эндометрия у женщин в пре- и постменопаузальном периодах. 4. Установить характер влияния препаратов заместительной гормональной терапии на апоптоз клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия у женщин постменопаузального периода. Научная новизна исследования Впервые установлено, что у женщин в климактерическом периоде в отличие от женщин фертильного возраста снижается апоптоз лимфоцитов и моноцитов периферической крови преимущественно за счет снижения содержания клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза, что сочетается со снижением уровня моноцитов, способных индуцировать апоптоз. Установлены закономерности апоптоза лимфоцитов и макрофагов эндометрия в пременопаузальном и постменопаузальном периодах, проявляющиеся в пременопаузе снижением уровня лимфоцитов на ранних этапах апоптоза и повышением количества апоптирующих макрофагов, а в постменопаузальном периоде - снижением апоптоза лимфоцитов и макрофагов. Установлены особенности сывороточного содержания факторов, регулирующих апоптоз, в климактерическом периоде, характеризующиеся в пре- и постменопаузе снижением содержания sFasL и p53, дополнительно в пременопаузе – снижением уровня sFas по сравнению с параметрами женщин фертильного возраста. У женщин в пременопаузальном периоде выявлено снижение экспрессии клетками эндометрия мРНК XIAP, а в постменопаузе - повышение экспрессии мРНК XIAP и р53 в ткани эндометрия. Впервые установлены закономерности изменения содержания FasL+ моноцитов, снижение которого ассоциируется с наличием хронического эндометрита у женщин в климактерическом периоде. Впервые установлено, что препараты заместительной гормональной терапии у женщин в постменопаузальном периоде оказывают влияние на апоптоз клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия и регулирующие его факторы, усиливая апоптоз лимфоцитов периферической 6 крови, снижая сывороточное содержание sFas и р53, а также уровень экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия. Выявлены различия в действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия: препарат «Климодиен» в большей степени усиливает апоптоз-индуцирующую способность моноцитов, а препарат «Анжелик» периферических усиливает лимфоцитов и апоптоз лимфоцитов эндометрия. Практическая значимость работы Разработаны нормативы параметров апоптоза периферических эндометриальных клеток иммунной системы у женщин и климактерического периода. Разработан и предложен способ диагностики хронического эндометрита у женщин в постменопаузальном периоде (приоритетная справка № 2009115014 от 20.04.2009). Выявлены особенности влияния препаратов заместительной гормональной терапии на параметры Fas-зависимого апоптоза у женщин климактерического периода, что может использоваться в обосновании выбора терапии. Внедрение результатов исследования Результаты диссертационной работы внедрены в практическую деятельность центра планирования семьи и репродукции ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий», консультативно-диагностической поликлиники ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и хирургического отделения НУЗ «Отделенческая больница на станции Иваново ОАО «Российские железные дороги». Положения, выносимые на защиту У женщин с наступлением менопаузы в отличие от женщин фертильного возраста на системном и локальном уровне нарушается Fas-зависимый апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция, что проявляется угнетением апоптоза периферических и эндометриальных лимфоцитов, апоптоз- индуцирующей способности моноцитов, готовности к апоптозу макрофагов 7 эндометрия и снижением сывороточного уровня sFasL и p53. Параметры апоптоза клеток иммунной системы зависят от стадии климактерического периода и в большей степени проявляются в постменопаузальном возрасте. Препараты заместительной гормональной терапии восстанавливают апоптоз лимфоцитов, но снижают содержание факторов, регулирующих апоптоз, как на системном, так и на локальном уровне. В действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза существуют различия, которые могут быть обусловлены особенностями содержания синтетических эстрогенов и прогестинов. Снижение содержания в крови FasL-позитивных моноцитов может служить диагностическим критерием хронического эндометрита у женщин постменопаузального периода. Апробация Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции «Молодая наука – развитию Ивановской области» (Иваново, 2006), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области» (Иваново, 2007), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2008» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области» (Иваново, 2008), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной дню памяти основателя института В.Н. Городкова (Иваново, 2009), на научных чтениях, посвященных памяти академика В.И. Кулакова (Москва, 2009), на 13 Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009). Публикации По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Объём и структура работы Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав собственных исследований, главы «Обсуждение полученных результатов», выводов, практических рекомендации и 8 библиографического указателя включающего 221 источник отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 11 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий» (директор – засл. деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева Л.В.). Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии – заведующая лабораторией – засл. врач РФ, д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю. и в центре планирования семьи и репродукции - заведующая центром, д.м.н., профессор Богатова И.К. Всего было обследовано: 25 здоровых женщин фертильного возраста, 10 женщин в пременопаузальном периоде, 25 женщин в постменопаузальном периоде, 10 женщин в постменопаузальном периоде после лечения препаратом «Анжелик» и 10 женщин в постменопаузальном периоде после лечения препаратом «Климодиен». Материалом для непосредственного исследования служили: периферическая венозная кровь и биоптаты эндометрия из полости матки. Для проведения иммунологических исследований получали популяцию мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови и из ткани эндометрия. Выделение МНК из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколлурографина (d=1,078). Для выделения обогащенной популяции МНК из эндометриальной ткани использовали стандартный безферментативный механический метод (Chernyshov V.P., 1993). Выделение обогащенной популяции МНК эндометрия осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078) (Чичахов Д.А., Пулин А.М., 2008). Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве 9 флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). В исследовании использовали следующие мАТ: коньюгированные с PE (фикоэритрин) анти CD95 антитела (CALTAG Laboratories, USA), коньюгированные с FITC (флюоресцеин изотиоцианат) анти CD95L антитела (CALTAG Laboratories, USA), коньюгированный с FITC recombinant AnnexinV (CALTAG Laboratories, USA) и Propidium Iodid (CALTAG Laboratories, USA). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток аннекином V (Annexin V) и пропидиумом иодидом (Pi). Анализ результатов проводили в программе "LYSYS II". Содержание sFas, sFasL, Bсl-2 и P-53 в сыворотке крови оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия). В таблице 1 представлена характеристика использовавшихся в работе тест систем для проведения ИФА. Таблица 1. Панель моноклональных антител, использованных в исследовании № Показатель Фирма-производитель Предел чувствительности п/п системы 1. sFas/APO-1 Bender MedSystems,Австрия > 13,2 pg/ml 2. sFasL Bender MedSystems,Австрия > 0,07 ng/ml 3. Bсl-2 Bender MedSystems,Австрия > 0,5 ng/ml 4. p-53 Bender MedSystems,Австрия > 0,33 U/ml Анализ и интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-разработчика. Для определения уровня экспрессии специфической мРНК клетками эндометриальной ткани реальном времени. использовали полуколичественный метод RT-PCR в 10 Процедуру выделения тотальной РНК из эндометрия проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом (Velden van V.H.J, 2003) с использованием набора реагентов «Онкоскрин» (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Далее выделенную мРНК переводили в комплементарную кДНК, используя коммерческий набор реагентов Онкоскрин RT (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Для проведения полуколичественной RT-PCR в реальном времени использовались следующие наборы праймеров, зондов и реагентов для проведения ПЦР в реальном времени производства OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, (Москва, Россия): ОНКОСКРИН 12-Q для определения интенсивности экспрессии гена -2-микроглобулина человека (ген домашнего хозяйства), ОНКОСКРИН 13-Q для определения интенсивности экспрессии гена XIAP. Кроме того, в работе использовались коммерческие праймеры и зонды для определения мРНК Bcl-2, p53 производства BIOSOURCE INTERNATIONAL (USA). ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA) по протоколу, рекомендованному разработчиком праймеров. Для количественно определения уровня экспрессии мРНК Bcl-2, P-53 и XIAP использовали стандартный сравнительный Ct метод (Van der Velden, 2003). Общее количество проведенных исследований составило 2217. Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000. Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента. Автор выражает благодарность и глубокую признательность за научное сотрудничество, помощь в организации и проведении клинических исследований заведующей центром планирования семьи и репродукции д.м.н., профессору Богатовой И.К. и всему коллективу врачей. 11 Результаты работы и их обсуждение Проведенные нами исследования выявили ряд отличий параметров апоптоза клеток иммунной системы у женщин в климактерическом периоде от таковых у женщин репродуктивного возраста, причем ряд этих изменений отмечался на всем протяжении климактерического периода, а некоторые особенности иммунного апоптоза зависели от стадии климактерического периода. В периферической крови у женщин пременопаузального и постменопаузального периодов, по сравнению с женщинами фертильного возраста, снижалось содержание лимфоцитов с фенотипом AnnexinV+ (20,00±1,02% у женщин фертильного возраста, 15,21±0,83% в пременопаузальном периоде и 15,13±1,02% в постменопаузальном периоде, р<0,001 и p<0,02 соответственно) и Annexin V+Pi- (18,31±0,99% в фертильном периоде, 13,46±0,7% в пременопаузе и 13,54±0,95% в постменопаузе, р<0,001 в обоих случаях). Аналогичные изменения апоптоза были выявлены и в эндометрии, так, у женщин климактерического периода снижалось количество эндометриальных лимфоцитов, имеющих фенотип AnnexinV+ (26,89±1,51% у женщин фертильного возраста, 21,53±1,75% в пременопаузальном периоде и 18,02±1,51% в постменопаузальном периоде, р<0,05 и p<0,01 соответственно) и Annexin V+Pi- (19,76±1,11% у женщин фертильного возраста, 15,64±0,97% в пременопаузальном периоде и 14,55±1,42% в постменопаузальном периоде, р<0,02 в обоих случаях). Та же самая закономерность прослеживалась нами и в отношении моноцитов периферической крови. У женщин пременопаузального и постменопаузального периодов, по сравнению с женщинами фертильного возраста, снижалось содержание моноцитов с фенотипом AnnexinV+ (44,10±2,63% в фертильном периоде, 31,73±2,43% в пременопаузе и 34,99±2,44% в постменопаузе, р<0,001 и p<0,02 соответственно) и Annexin V+Pi- (37,05±2,42% в фертильном периоде, 25,80±1,76% в пременопаузе и 29,63±2,37% в постменопаузе, р<0,001 и p<0,05, соответственно). Как известно, иммунный апоптоз развивается в активированных клетках и необходим для завершения иммунного ответа (Ярилин А.А., 1999; Ковальчук Л.В., и др., 1998; Ковальчук Л.В., 1999). Снижение апоптоза лимфоцитов и 12 моноцитов у женщин в пре- и постменопаузе может приводить к пролонгации жизни лимфоцитов и накоплению активированных клонов клеток, способствуя развитию аутоиммунных реакций у женщин в данные возрастные периоды их жизни. Это предположение согласуется с литературными данными, указывающими на то, что в климактерическом периоде повышается частота развития аутоиммунных болезней (Nalbandian G., 2005). При изучении особенностей экспрессии Fas молекул на поверхности периферических и эндометриальных клеток иммунной системы было установлено, что характер экспрессии этой молекулы был различен на системном и локальном уровне у женщин пре- и постменопаузального возраста и зависел от типа МНК. В периферической крови у женщин пременопаузального и постменопаузального периодов по сравнению с аналогичными показателями женщин фертильного возраста было значительно повышено содержание (17,33±1,01% у лимфоцитов, женщин экспрессирующих фертильного возраста, Fas молекулы 32,07±3,27% в пременопаузальном периоде и 28,85±1,01% в постменопаузальном периоде, р<0,02 и p<0,001 соответственно), тогда как в ткани эндометрия снижался уровень Fas-позитивных макрофагов (40,37±2,52% у женщин фертильного возраста, 25,53±2,89% в пременопаузальном периоде и 28,66±2,11% в постменопаузальном периоде, p<0,01 в обоих случаях). Пусковым фактором для реализации Fas-зависимого апоптоза является связывание Fas-рецептора с Fas-лигандом (Барышников А.Ю., и др., 2002). У женщин как в пре-, так и в постменопаузальном периоде по сравнению с показателями женщин фертильного возраста в периферической крови был снижен уровень FasL-позитивных моноцитов (36,33±2,38% у женщин фертильного возраста, 30,08±2,53% в пременопаузальном периоде и 26,52±2,16% в постменопаузальном периоде, р<0,05 и p<0,01 соответственно), что позволяет говорить об угнетении апоптоз-индуцирующей способности моноцитов в период климактерия. Известно, что транслокация FasL на поверхность клетки происходит после воздействия активационного сигнала (Kiener P.A., e.a., 1997). Можно предположить, что в пре- и постменопаузальном периодах нарушается процесс 13 активации моноцитов. С другой стороны, фагоцитам отводится основная роль в индукции апоптоза различных клеток-мишеней, таких как опухолевые, генетически поврежденные, дисфункциональные клетки, и клетки иммунной системы, экспрессирующие Fas-рецептор (Kiener P.A., e.a., 1997). В связи с этим нарушение в пре- и постменопаузе апоптоз-индуцирующей функции моноцитов может приводить к описанному выше снижению апоптоза периферических лимфоцитов и моноцитов, а также, вероятно, проявляться недостаточной элиминацией дефектных и аутоагрессивных клеток у данного контингента пациенток. Поскольку в период менопаузы увеличивается частота аутоиммунной патологии (Nalbandian G., e.a., 2005), можно предположить, что выявленное снижение апоптоз-индуцирующей функции фагоцитов является одним из важных механизмов их развития. Это предположение согласуется с имеющимися литературными данными. Показано, что аутоиммунные болезни ассоциируются с нарушением функции фагоцитарных клеток и процесса их активации (Engelich G.G. e.a., 2001), а также со снижением FasL-зависимого пути индукции апоптоза аутореактивных клонов лимфоцитов (Rathmell J.C., e.a., 2002, Kühtreiber W.M., e.a., 2003). Проведенные нами исследования позволили установить, что показатель относительного содержания FasL+ моноцитов может быть использован для диагностики хронического эндометрита у женщин в постменопаузальном периоде. При ретроспективном анализе данных нами было установлено, что при значении показателя FasL+ моноцитов равного 22,0% или менее у женщины диагностируется хронический эндометрит с точностью 82,6%, чувствительностью – 75,00% и специфичностью – 86,67% (приоритетная справка № 2009115014 от 20.04.2009). Учитывая, что популяция моноцитов, экспрессирующих молекулы CD95L, обладает цитотоксическим действием и способна осуществлять элиминацию инфицированных клеток-мишеней (Фильченков А.А., 2002), можно предположить, что уменьшение содержания в периферической крови FasL - позитивных моноцитов приводит к ухудшению реализации цитотоксических реакций, направленных на своевременное удаление инфицированных клеток – мишеней. Все это может определять снижение противоинфекционной защиты. 14 Таким образом, в обеих обследованных группах женщин климактерического периода отмечалось усиление готовности к вступлению в апоптоз периферических лимфоцитов, и снижалась готовность к вступлению в апоптоз эндометриальных макрофагов. Кроме того, у женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах снижалась апоптозиндуцирующая способность моноцитов. Интенсивность процессов апоптоза регулируется целым рядом факторов, которые оказывают либо про-, либо антиапоптотическое действие. Известно, что факторы sFas и Bcl-2 являются блокаторами апоптоза, тогда как sFasL и р53 относятся к факторам стимулирующим апоптоз. По нашим данным у женщин в пременопаузальном и в постменопаузальном периодах в сыворотке крови было достоверно снижено по сравнению с показателями женщин фертильного возраста содержание индукторов апоптоза sFasL (62,00±07,00 пг/мл у женщин фертильного возраста, 41,00±04,00 пг/мл в пременопаузальном периоде и 44,82±03,25 пг/мл в постменопаузальном периоде, р<0,05 в обоих случаях) и р53 (4,86±0,66 U/ml у женщин фертильного возраста, 2,18±0,45 U/ml в пременопаузальном периоде и 2,38±0,20 U/ml в постменопаузальном периоде, р<0,02 и p<0,01 соответственно). Эти данные хорошо согласуются с выявленным нами снижением апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. По-видимому, снижение системной продукции sFasL и р53 лежит в основе механизмов регуляции апоптоза в целом и апоптоза клеток иммунной системы в частности у женщин в климактерическом периоде. В то же время четкой закономерности в изменении системной продукции блокаторов апоптоза у женщин климактерического периода нами выявлено не было. В пре- и постменопаузальном периоде уровень Bcl-2 в сыворотке крови по нашим данным был ниже пределов чувствительности тест-системы. При этом у женщин фертильного возраста содержание в сыворотке Bcl-2 было в пределах детектируемых значений и составило 1,340,68 нг/мл. Однако достоверных различий между группами фертильных женщин и женщин в климактерическом периоде по этому показателю мы не выявили. Изменения сывороточного содержания sFas у женщин климактерического периода по нашим данным зависят от стадии климактерия и различаются у 15 женщин в пре- и постменопаузе. В группе женщин в пременопаузальном периоде нами было выявлено значительное снижение сывороточного содержания sFas по сравнению с показателями фертильных женщин (269,90±44,80 пг/мл у женщин фертильного возраста и 105,09±38,06 пг/мл в пременопаузальном периоде, р<0,05). То есть в данный период происходит снижение содержания на системном уровне не только факторов, индуцирующих апоптоз, но и его ингибиторов. Хотелось бы отметить, что у женщин в пременопаузе нами был отмечен ряд особенностей апоптоза клеток иммунной системы, которые не были характерны для женщин в постменопаузальном возрасте. Так, только для женщин в пременопаузальном периоде было характерно усиление апоптоза эндометриальных макрофагов, о чем свидетельствовало повышение по сравнению с аналогичными данными у женщин фертильного периода содержания AnnexinV+ клеток (49,53±2,76% у женщин фертильного возраста и 57,93±2,37% в пременопаузальном периоде, р<0,05). По-видимому, эти изменения могут быть связаны с тем, что в данный период жизни женщины гормональные нарушения носят нестабильный характер (Сметник В.П., Кулаков В.И. 2001). Поэтому, у женщин в пременопаузе угнетение апоптоза как на системном, так и на локальном уровне, проявляется в несколько меньшей степени, чем в постменопаузе. Вероятно, выявленное нами низкое сывороточное содержание ингибитора апоптоза sFas может определять меньшую выраженность угнетения апоптоза у женщин в пременопаузе по сравнению с таковой у женщин в постменопаузе. У женщин в постменопаузальном периоде нами отмечалось повышенное по сравнению с группой женщин в пременопаузальном периоде сывороточное содержание sFas (105,09±38,06пг/мл в пременопаузальном периоде и 209,73±25,82 пг/мл в постменопаузальном периоде, р<0,05), которое при этом не отличалось от такового у женщин фертильного возраста (269,90±44,80пг/мл у женщин фертильного возраста и 209,73±25,82 пг/мл в постменопаузальном периоде, р>0,05). Следует отметить, что только у этих женщин происходило резко выраженное угнетение апоптоза эндометриальных макрофагов, о чем 16 свидетельствовало сниженное содержание эндометриальных макрофагов с фенотипом AnnexinV+ (57,93±2,37% в пременопаузе и 42,86±3,35% в постменопаузе, p<0,05). В целом в эндометрии женщин в постменопаузе угнетение апоптоза как лимфоцитов, так и макрофагов было выражено больше, чем у женщин в пременопаузе. Складывается впечатление, что максимальная степень угнетения апоптоза клеток иммунной системы у женщин в постменопаузе может определяться изменением общего баланса регуляции апоптоза, который сдвигается в пользу доминирования антиапоптотических сигналов за счет резкого подавления выработки индукторов апоптоза в данный возрастной период. Тогда как в пременопаузе сниженная продукция ингибиторов апоптоза ассоциирована с угнетением и выработки ряда факторов, блокирующих апоптоз, что может определять меньшую степень выраженности угнетения апоптоза клеток иммунной системы в данный возрастной период. Для уточнения локальных механизмов регуляции апоптоза в ткани эндометрия женщин в климактерическом периоде нами был проведен анализ уровня экспрессии мРНК таких факторов, регулирующих апоптоз, как р53, Bcl2 и XIAP. Экспрессия мРНК р53 (RQ - 1,12±0,28) и Bcl-2 (RQ - 0,73±0,42) в эндометрии женщин в пременопаузальном периоде практически не отличалась от таковой в эндометриальной ткани здоровых женщин фертильного возраста. Уровень экспрессии мРНК XIAP в пременопаузе был снижен относительно его уровня у фертильных женщин (0,56±0,21). В эндометрии женщин постменопаузального периода уровень экспрессии мРНК р53 более чем в 6 раз превосходил уровень экспрессии мРНК р53 в эндометрии здоровых женщин фертильного возраста (RQ - 6,54±2,85). Экспрессия мРНК Bcl-2 и XIAP также была повышена в эндометрии женщин в постменопаузальном периоде относительно таковой у женщин фертильного возраста. RQ для Bcl-2 в эндометрии женщин в постменопаузе составил 1,77±0,97, а для XIAP - 1,91±0,27. У женщин в постменопаузе отмечалась более высокая, чем у женщин пременопаузального возраста, экспрессия мРНК XIAP (p<0,001). Следует также 17 отметить, что уровень экспрессии мРНК р53 в эндометрии женщин в постменопаузе был значительно выше, чем у женщин в пременопаузальном периоде (p>0,05). У женщин постменопаузального периода в эндометрии отмечалось максимальное снижение активности иммунного апоптоза, вероятно, за счет повышения активности XIАP и Bcl-2. Одновременно у женщин данной группы усиливался и синтез в эндометриальной ткани проапоптотического фактора 53, который может играть роль в морфологической перестройке эндометрия у женщин в постменопаузе (Marusyk, A., e.a., 2007). Выявленные изменения в экспрессии мРНК р53, Bcl-2 и XIAP в эндометрии женщин в различные периоды непосредственно климактерического связаны с периода, особенностями по-видимому, гормонального фона и функционального состояния эндометрия в пре- и постменопаузе. С целью коррекции симптомов, обусловленных эстроген-дефицитным состоянием, гормональная в климактерическом терапия (ЗГТ). периоде Ранее в назначается работах с заместительная использованием экспериментальных моделей было показано, что эстрогены способны влиять на апоптоз клеток иммунной системы (Kovats S 2008). Для нашего исследования были выбраны два препарата ЗГТ, наиболее часто используемые в клинической практике у женщин в постменопаузе – «Анжелик» и «Климодиен», различающиеся по составу эстрогенов и прогестинов. Действующими веществами препарата «Анжелик» - являются: 1 мг эстрадиола и 2 мг дроспиренона, в состав «Климодиена» входят 2 мг эстрадиола валерата и 2 мг диеногеста. По нашим данным, у женщин постменопаузального периода после приема как препарата «Анжелик», так и препарата «Климодиен» усиливался по сравнению с исходным уровнем апоптоз лимфоцитов периферической крови до уровня, характерного для женщин фертильного возраста. После приема препарата «Анжелик» повышалось содержание периферических лимфоцитов с фенотипом AnnexinV+ (14,34±1,21% до лечения и 20,19±1,7 % после лечения, р<0,02) и AnnexinV+Pi- (13,05±1,28% до лечения и 18,84±1,15% после лечения, р<0,02) до уровня, характерного для женщин фертильного возраста; после приема препарата «Климодиен» также значительно повышалось содержание 18 периферических AnnexinV+ (14,92±1,51% до лечения и 19,59±0,9% после лечения, р<0,02) и AnnexinV+Pi- лимфоцитов (13,12±1,31% до лечения и 17,45±1,04 % после лечения, р<0,02). Кроме того, оба препарата повышали в эндометрии содержание CD95+ макрофагов («Анжелик» - 28,67±4,14% до лечения и 41,12±2,85 % после лечения, р<0,05; «Климодиен» - 28,66±2,19% до лечения и 41,96±2,96% после лечения, р<0,02). Таким образом, можно говорить о нормализирующем действии препаратов ЗГТ на уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови и готовность к апоптозу эндометриальных макрофагов. В то же время в действии изученных препаратов были и различия. После курса приема препарата «Анжелик» повышалось содержание в эндометрии лимфоцитов с фенотипом CD95+ (20,74±2,84% до лечения и 27,44±1,32% после лечения, р<0,05), AnnexinV+ (18,24±2,17% до лечения и 29,44±1,41 % после лечения, р<0,01), AnnexinV+Pi- (15,13±2,07% до лечения и 21,47±0,98% после лечения, р<0,02) и AnnexinV+Pi+ (2,86±0,57% до лечения и 7,98±1,42 % после лечения, р<0,02). Препарат «Климодиен» подобного действия на уровне эндометрия не оказывал. Только у женщин, принимавших «Климодиен», в периферической крови было повышенно содержание CD95L+ лимфоцитов (5,72±0,38% до лечения и 8,86±0,84 % после лечения, р<0,05) и CD95L+ моноцитов (24,55±3,83% до лечения и 33,82±1,64% после лечения, р<0,05). Следовательно «Анжелик» в большей степени способствовал изменению апоптоза клеток иммунной системы на уровне эндометрия, что проявлялось резко выраженным повышением готовности к вступлению в апоптоз эндометриальных лимфоцитов и усилением их апоптоза, а для «Климодиена» было характерно более выраженное действие на системном уровне, направленное на усиление апоптоз-индуцирующей способности моноцитов. Оба препарата одинаково влияли на уровень в крови факторов, регулирующих апоптоз. В сыворотке периферической венозной крови снижалось содержание sFas («Анжелик» - 248,82±45,13 пг/мл до лечения и 128,09±28,79 пг/мл после лечения, р<0,05; «Климодиен» - 185,58±33,17 пг/мл до лечения и 84,55±24,50 пг/мл после лечения, р<0,05;) и р53 («Анжелик» 2,81±0,16 U/ml до лечения и 2,10±0,23 U/ml после лечения, р<0,05; 19 «Климодиен» 2,16±0,27U/ml до лечения и 1,45±0,21U/ml после лечения, р<0,05). Применение обоих препаратов ассоциировалось также со снижением уровня экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия («Анжелик» - RQ – 0,15±0,13; «Климодиен» - RQ – 0,10±0,05). Таким образом, нами не наблюдалось нормализации сывороточного содержания и локальной продукции факторов, регулирующих апоптоз, под действием обоих изучаемых препаратов ЗГТ. Дополнительное снижение системной продукции р53, ассоциированное с уменьшением сывороточного содержания sFas, вызванное препаратами ЗГТ, позволяет говорить о том, что заместительная гормональная терапия может оказывать и негативное воздействие на регуляцию апоптоза клеток иммунной системы. Нарушение активности как про-, так и антиапоптотических факторов на системном уровне может проявляться не только в изменении апоптоза клеток иммунной системы, но и отразиться на балансе пролиферации и гибели любых других типов соматических клеток, что усиливает возможность риска развития опухолевых заболеваний. Таким образом, у женщин в пременопаузальном и в постменопаузальном периодах в отличие от женщин фертильного возраста как на системном, так и на локальном уровне нарушается Fas-зависимый апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция. Это проявляется угнетением периферических и эндометриальных лимфоцитов, снижением апоптоза апоптоз- индуцирующей способности моноцитов и готовности макрофагов эндометрия к апоптозу. Параллельно у женщин в климактерическом периоде нарушается системная и локальная продукция факторов, регулирующих апоптоз, у них снижается сывороточное содержание sFasL и p53. Параметры апоптоза клеток иммунной системы и его регуляции зависят от стадии климактерического периода, и в большей степени проявляются в постменопаузе. Препараты заместительной гормональной терапии восстанавливают апоптоз лимфоцитов, но снижают содержание факторов, регулирующих апоптоз, как на системном, так и на локальном уровне. В действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза существуют различия, которые 20 могут быть обусловлены особенностями содержания синтетических эстрогенов и прогестинов. Снижение содержания в крови FasL-позитивных моноцитов может служить диагностическим критерием хронического эндометрита у женщин постменопаузального периода. Выводы 1. У женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах нарушается процесс апоптоза лимфоцитов и моноцитов/макрофагов периферической крови и эндометрия, что ассоциируется с угнетением апоптоз- индуцирующей функции моноцитов, и изменением синтеза и продукции факторов, регулирующих апоптоз, на системном и локальном уровне. 2. В периферической крови женщин в пре- и постменопаузальном периоде отмечается снижение по сравнению с показателями женщин фертильного возраста количества лимфоцитов и моноцитов, вступивших в апоптоз, при одновременном повышении содержания CD95+ лимфоцитов и снижении уровня CD95L+ моноцитов. 3. В эндометрии женщин в пре- и постменопаузальном периоде снижено количество апоптирующих лимфоцитов и содержание CD95+ макрофагов. Отличительной чертой эндометрия женщин пременопаузального возраста является повышенное содержание макрофагов, вступивших в апоптоз, тогда как в эндометрии женщин в постменопаузе количество апоптирующих макрофагов, напротив, снижено. 4. Сывороточный уровень sFasL и p53 в климактерическом периоде снижен по сравнению с аналогичными параметрами у женщин фертильного возраста. В пременопаузальном периоде также снижено сывороточное содержание sFas и экспрессия мРНК XIAP в ткани эндометрия, а в постменопаузальном периоде отмечается усиление экспрессии мРНК р53 и XIAP в эндометрии. В постменопаузальном периоде сывороточный уровень sFas и экспрессия в эндометрии мРНК XIAP выше, чем у женщин в пременопаузе. 5. У женщин в постменопаузе курс заместительной гормональной терапии приводит к нормализации апоптоза периферических лимфоцитов и снижению сывороточного содержания sFas и р53, повышению содержания 21 Fas+ макрофагов в эндометрии и угнетению уровня экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия. Отмечаются различия в действии препаратов заместительной гормональной терапии: препарат «Климодиен» повышает апоптоз-индуцирующую способность периферических лимфоцитов и моноцитов, а препарат «Анжелик» нормализует апоптоз эндометриальных лимфоцитов. 6. Низкий уровень FasL-позитивных моноцитов в периферической крови женщин постменопаузального периода ( 22%) позволяет с точностью 82,60% диагностировать хронический эндометрит у данного контингента пациенток. Практические рекомендации Рекомендуется женщинам в постменопаузальном периоде определять содержание FasL+ моноцитов и при значениях показателя равном или менее 22% диагностировать хронический эндометрит. Рекомендуется у женщин в постменопаузе в ходе лечения препаратами заместительной гормональной терапии определять параметры апоптоза клеток иммунной системы. Рекомендуется дифференцированный подход к назначению препаратов заместительной гормональной терапии женщинам в постменопаузальном периоде: препарат «Анжелик» рекомендуется назначать женщинам с выраженными изменениями параметров апоптоза клеток иммунной системы в эндометрии, а препарат «Климодиен» - женщинам с преимущественными изменениями на системном уровне. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васильева И.А., Богатова И.К., Букина Е.А. Особенности апоптоза иммунокомпетентных клеток периферической крови и эндометрия в менопаузальном периоде // Сборник материалов VII Российского форума «Мать и дитя».- Москва, 11-14 октября 2005 г. - С.343-344. 2. Васильева И.А., Букина Е.А., Богатова И.К., Сотникова Н.Ю. Особенности апоптоза лимфоцитов эндометрия в постменопаузальном периоде и влияние на него заместительной гормональной терапии // Russian Journal of Immunology.- 2006.-V. 9, Suppl.3.- P.121. 3. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. влияние заместительной гормональной терапии на апоптоз иммунокомпетентных 22 клеток периферической крови в постменопаузальном периоде // Ж. Медицинская иммунология.- 2006. – Том 8. - № 2-3. – С.307-308. 4. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А., Астраух Н.В., Шныркова М.А. Влияние препарата «Климодиен» на апоптоз периферических лимфоцитов в постменопаузе // Материалы 8 Всероссийского научного форума «Мать и дитя».- Москва, 3-6 октября 2006г.- С.343. 5. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. Влияние препарата «Климодиен» на апоптоз лимфоцитов периферической крови женщин постменопаузального периода // Ж. Физиология и патология иммунной системы.- 2006.- №10 (приложение 1). – С.24-25. 6. Крошкина Н.В., Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Астраух Н.В., Шныркова М.А., Соловьева Т.А. Fas-зависимый апоптоз мононуклеарных клеток периферической крови женщин постменопаузального периода и влияние на него препарата Климодиен // Ж. Вестник Уральской медицинской академической науки.-2006.-№3-1(14).- С.112-115. 7. Васильева И.А. Влияние заместительной гормональной терапии на апоптоз лимфоцитов эндометрия в постменопаузальном периоде // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области» 19-27 апреля 2006 г. – С.105-107. 8. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А., Соловьева Т.А. Влияние препаратов ЗГТ на сывороточный уровень sFas и sFasL у женщин постменопаузального периода // Russian Journal of Immunology.2007.-V. 9, Suppl.4.- P.75-76 9. Васильева И.А. Апоптоз клеток иммунной системы в постменопаузе и заместительная гормональная терапия // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области» 16-20 апреля 2007 г. – С.70. 10.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Соловьева Т.А. Влияние препарата «Климодиен» на экспрессию мРНК р-53 и Bcl-2 в эндометрии женщин постменопаузального периода // Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т.2(11).-№2-3.- С.285. 11.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю. Букина Е.А. Влияние препаратов заместительной гормональной терапии на сывороточное содержание sFas и р53 у женщин менопаузального периода // Ж. Проблемы репродукции.2008.-Спец. Выпуск.-С.15. 12.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Астраух Н.В., Шныркова М.А., Букина Е.А. Влияние препарата Климодиен на сывороточное уровень sFas в периферической крови женщин постменопаузального периода // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. - Москва, 2008.С.322. 13.Васильева И.А. Влияние Климодиена на экспрессию мРНК р-53 и Bcl-2 в эндометрии женщин постменопаузального периода // Материалы научнопрактической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА 23 «Неделя науки – 2008» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области» 21-25 апреля 2008 г. – С.83. 14.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Анциферова Ю.С., Богатова И.К. Параметры апоптоза периферических лимфоцитов и фагоцитов у женщин в менопаузе // Российский иммунологический журнал.- 2009.- т.3(12).- № 1.- С.65–71. 15.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А. Особенности апоптоза нейтрофилов в постменопаузальном периоде // «Бюллетень ВоенноМедицинской академии».- 2009.- №1(25).- С.288. 16.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А. Влияние препаратов «Климодиен» и «Анжелик» на апоптоз МНК периферической крови и эндометрия женщин постменопаузального периода // Ж. «Медицинская иммунология». - 2009.- т.11.- №4-5.- С.404-405. 17.Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. Особенности сывороточного содержания sFas и р53 у женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах // Ж. «Аллергология и иммунология». -2009.- т.10.- №2.- С.253.