Исследование пространственной структуры и динамики липид

Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
Научно-образовательный центр (НОЦ) ИБХ РАН
В 2011 г. Научно-образовательный центр (НОЦ) ИБХ РАН участвовал в выполнении
заданий Программы целевых расходов Президиума РАН «Поддержка молодых ученых» в
рамках проекта «Поддержка деятельности Научно-образовательного центра ИБХ РАН». В
соответствии с учебными программами в 2011 году были проведены теоретические и
практические занятия со студентами 15 специализированных кафедр 11 факультетов 8
ведущих московских вузов, среди которых:
- кафедра биоорганической химии, кафедра биофизики, кафедра иммунологии
биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова;
- кафедра химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова;
- кафедра физико-химической биологии и биотехнологии факультета молекулярной и
биологической физики Московского физико-технического института;
- кафедра биотехнологии, кафедра химии и технологии биологически активных соединений,
кафедра химии и технологии высокомолекулярных соединений факультета биотехнологии и
органического синтеза Московского государственного университета тонких химических
технологий им. М.В.Ломоносова;
- кафедра химии и технологии биомедицинских препаратов факультета химикофармацевтических технологий и биомедицинских препаратов Российского химикотехнологического университета им. Д.И. Менделеева;
- кафедра биотехнологии факультета биотехнологии и промышленной экологии Российского
химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева;
- кафедра мембранной технологии факультета инженерной химии Российского химикотехнологического университета им. Д.И. Менделеева;
- кафедра биотехнологии фармацевтического факультета Первого московского
государственного медицинского университета им. И.М.Сеченова;
- кафедра органической и биологической химии ветеринарно-биологического факультета
Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.
Скрябина;
- кафедра органической и биологической химии биолого-химического факультета
Естественно-экологического института Московского государственного областного
университета;
- высший химический колледж РАН.
В течение 2011 года в НОЦ ИБХ РАН прошли обучение 243 студента, из них 103 выполнили
курсовые и дипломные работы.
С 7 по 10 февраля 2011 г. Научно-образовательным центром ИБХ РАН при поддержке
РФФИ и Программы целевых расходов Президиума РАН «Поддержка молодых ученых»
была проведена ХXIII зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления
физико-химической биологии и биотехнологии". На заседаниях Школы присутствовало
более 300 слушателей из различных вузов, в том числе из МГУ им. М.В. Ломоносова,
МФТИ, МИТХТ им. М.В. Ломоносова, МГПУ и др., было представлено 44 устных доклада,
причем 24 из них были сделаны студентами, аспирантами и молодыми учеными. Кроме того,
на Школе молодыми учеными было представлено 138 стендовых сообщений.
С 14 по 17 ноября 2011 г. Научно-образовательным центром ИБХ РАН при поддержке
РФФИ был проведен Конкурс молодых ученых в рамках научной конференции по
биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича
Овчинникова». Конкурс проводился в три этапа (заочная экспертиза тезисов; собеседование
с участниками во время постерной сессии и отбор финалистов; устные доклады финалистов
и определение победителей). В конкурсе приняли участие 76 молодых ученых в двух
возрастных категориях – до 27 лет и с 27 до 35 лет.
Ученый совет
В 2011 году состоялось 6 заседаний Ученого совета
Основные вопросы, рассмотренные на заседаниях Ученого совета:
Утверждение плана научно-исследовательских работ на 2012 г.; отчета о выполнении
научно-исследовательских
работ, научно организационной деятельности и перечня
важнейших достижений лабораторий за 2011 г.
Выдвижение кандидатур на выборы в Российскую академию наук и Российскую
академию сельскохозяйственных наук.
Выдвижение на соискание Премии Президента РФ в области науки и инноваций для молодых
ученых за 2011 г. Чудакова Дмитрия Михайловича.
Изменения в структуре института, в том числе организация лаборатории
биофармацевтики и лаборатории молекулярной биофизики.
О кадровой политике в ИБХ РАН. Проведение конкурсов на замещение вакантных
должностей заведующих лабораториями, старших научных сотрудников, научных
сотрудников и младших научных сотрудников.
Выдвижение кандидатур на соискание грантов Президента РФ для государственной
поддержки ведущих научных школ и молодых российских ученых – докторов и кандидатов
наук.
Отчеты по грантам Президента РФ и проектам, выполняемым по Госконтрактам.
Поддержка проектов, выполняемых по Госконтрактам.
О работе вспомогательных подразделений ИБХ.
Утверждение и изменение тем диссертаций,
Рекомендация к печати в качестве научного издания монографии В.В. Безуглова и
И.В. Серкова «Химическая модификация биоэффекторных липидов. Подходы к новым
типам лекарственных препаратов».
Поддержка ходатайств о присвоении Льву Ивановичу Патрушеву и Андрею
Георгиевичу Зарайскому звания профессора по специальности “Молекулярная биология”.
Обсуждение финансовых вопросов деятельности ИБХ.
Специализированный совет по защитам диссертаций
В 2011г проведено 20 заседаний Диссертационного совета: защищено 20 диссертаций,
из них - 2 докторские и 18 кандидатских.
Аспирантура ИБХ
Подготовка научных кадров высшей квалификации
В аспирантуре Института в отчетном 2011 году обучалось 78 аспирантов. До
окончания срока отчислены по собственному желанию 5 человек. Окончили аспирантуру в
2011 году 14 человек, из них 4 успешно: досрочно защищены 4 диссертационные работы.
Сдали успешно вступительные экзамены и зачислены в аспирантуру на бюджетные места 25
человек.
IX. Сведения о результатах, достигнутых за отчетный период по
темам в рамках фундаментальных научных исследований,
предусмотренных Планом Института к выполнению в 2011 г. (по
направлениям)
Биология развития и эволюция живых систем (42)
Новые белки - регуляторы раннего развития головного мозга позвоночных.
Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза
Впервые выявлена способность секретируемых белков Noggin1 и Noggin2
ингибировать сигнальные каскады Activin/Nodal и Wnt. Ранее была известна только
способность белков Noggin подавлять сигнальный каскад BMP. На модели эмбрионов
шпорцевой лягушки показано, что необходимым условием развития переднего мозга
является подавление белком Noggin2 сразу трех сигнальных каскадов: BMP, Activin/Nodal и
Wnt. Ранее нами были идентифицированы два новых гомолога известного эмбрионального
индуктора, секретируемого белка Noggin1, – Noggin2 и Noggin4. Было установлено, что
Noggin2, экспрессируясь на ранних стадиях развития головного мозга, подавляет
функционирование сразу трех сигнальных каскадов, BMP, Activin/Nodal и Wnt, в клетках
зачатка переднего мозга. Таким образом, нами, во-первых, были выявлены новые свойства у
белков семейства Noggin, а во-вторых, была установлена важная фундаментальная
особенность механизма раннего развития мозга позвоночных, заключающаяся в том, что
необходимым условием дифференцировки переднего отдела мозга является длительная
изоляция его клеток в раннем эмбриогенезе от внешних инструктирующих сигналов,
передаваемых тремя типами ростовых факторов: BMP, Activin/Nodal и Wnt.
Изучали влияние ингибирования трансляции мРНК Zyxin на экспрессию некоторых
генных мишеней сигнального каскада Sonic hedgehog в клетках зачатка центральной нервной
системы эмбриона шпорцевой лягушки. Также проводили эксперименты по выяснению
молекулярного механизма ингибирования активности Shh-каскада белком Zyxin. В
результате было установлено, что такое ингибирование основано на связывании Zyxin с
эффектором Shh каскада – транскрипционным фактором Gli1. Эти данные были объединены
с полученными прежде данными в рамках ответа рецензентам ранее подготовленной
публикации. Выявление и изучение белков, взаимодействующих с Zyxin важно как для
понимания связи процессов морфогенеза и дифференцировки в эмбриональном развитии, так
и для возможного использования полученных данных в биомедицинских исследованиях, в
связи с известной ролью Zyxin при метастазировании раковых клеток.
В рамках доработки публикации проводился анализ регуляторного каскада,
связанного с функционированием малой ГТФазы Ras-dva1 в клетках эктодермы,
окружающей головную часть нервной пластинки эмбриона шпорцевой лягушки. В
результате были получены важные данные, подтверждающие активацию генов Xagr
сигналом на основе фактора Fgf8, передающегося внутрь клетки при посредстве Ras-dva1.
Были начаты эксперименты по анализу экспрессии генов Xagr и Ras-dva при регенерации
хвоста и задней конечности у головастиков шпорцевой лягушки. В рамках этих работ начато
создание трансгенных линий лягушек, экспрессирующих зеленый и красный
флюоресцентные белки под контролем генов Xagr2 и Ras-dva1.Получена линия трансгенных
лягушек, экспрессирующая гибридный белок Agr1-TagRFP под контролем промотора Agr1.
В дальнейшем мы планируем использовать эмбрионы этой линии для изучения роли Rasdva1 в секреции белков Agr. Совместно с лабораторией биофотоники (ИБХ РАН)
опубликована работа, в которой промотор гена Xagr2 был использован для создания
трансгенных головастиков, экспрессирующих белок KillerRed в клетках присоски. В
результате с помощью этой линии получены данные, подтверждающие важную роль клеток
зачатка присоски в развитии зачатка головного мозга.
Молекулярный дизайн и синтез низкомолекулярных биологически активных соединений и их
аналогов
Лаборатория органического синтеза
Продолжен поиск условий абиогенного синтеза аденозина/аденозинмонофосфта
Наработаны образцы пяти замещенных аденинов - N1-метиладенина, N6-метиладенина, N1,6диметиладенина, N9-метиладенина и N6,6-диметиладенина.
Разработка технологий получения трансгенных и нокаутных животных-биомоделей в
соответствии с международными требованиями
Питомник лабораторных животных ФИБХ
Получена устойчивая линия нокаутных мышей (кодовое обозначение 6514), которая
характеризуется заменой в своем геноме нормального цитохрома С «дикого типа» на
мутантный цитохрома С (с инактивированной апоптотической функцией). Полученная
модель позволяет изучать физиологические последствия инактивации цитохрома С в
различных видах гематопоэтических клеток, поскольку цитохром С в эукариотической
клетке, наряду с хорошо известными биохимическими функциями по переносу электронов,
необходимыми для процессов клеточного дыхания, служит важным медиатором
апоптотического каскада, а нарушения в механизмах апоптоза являются главной причиной
развития и устойчивости раковых клеток к используемым на сегодняшний день препаратам.
Проведено успешное размораживание, культивирование и трансплантация
доимплантационных эмбрионов линии MRS, хранившихся в криобанке НПП ПЛЖ на
протяжении 6 месяцев, с последующим получением нормального приплода.
В криобанк НПП ПЛЖ на длительное хранение заложено 350 эмбрионов
генномодифицированной линии мышей 6514, с возможностью проведения контрольного
размораживания.
Впервые в России разработана и внедрена модель инфаркта миокарда у мышей,
получаемая двумя способами: лигированием нисходящей ветви коронарной артерии и
термокоагуляцией небольшого участка миокарда.
Исследование гомеотических генов, влияющих на морфологию соцветия
сложноцветных на примере хризантем
Станция искусственного климата «Биотрон»
Высажены в теплицу 20 линий трансгенных растений хризантем с экспрессией гена
CDM59,7 линий трансгенных хризантем с экспрессией гена CDM44, 10 линий с экспрессией
гена CDM37, 6 линий с экспрессией гена CDM36. Все линии, включая нетрансгенные
растения, высажены в 15 кратной повторности.
Отобран растительный материал и выделена ДНК и РНК на различных этапах вегетации и
цветения для проведения молекулярно-биологического анализа. В настоящее время
проводится анализ сроков цветения и фенотипических изменений трансгенных линий
хризантем. Подтверждено опережение закладки бутонов, развития и цветения трансгенных
линий хризантем с экспрессией генов ортологов APETALA1 хризантемы CDM111 и
подсолнечника НАМ 92 и 75.
Экология организмов и сообществ (43)
Структура низкомолекулярных компонентов природного гуминового комплекса,
отвечающих за фотохимическую деградацию поллютантов в окружающей среде и
фитогормональную активность
Группа молекулярной экологии ФИБХ
С помощью многократно повторяющейся ультрафильтрации природной гуминовой
кислоты (ГК) через мембрану с номинальным размером пор 5 кДа проведено
исчерпывающее отделение низкомолекулярной
флуоресцирующей фракции ГК от
нефлуоресцирующей высокомолекулярной матрицы. Далее с помощью последовательной
ультрафильтрации через мембраны 3 кДа и 1 кДа проведено ее разделение на фракции,
обогащенные желтым и голубым флюорофором. С помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии на колонках с обращенной фазой осуществлена дополнительная
очистка флуорофоров и наработаны достаточные количества для их структурного анализа.
Проведен структурный анализ полученных флуорофоров с помощью комплекса
современных физико-химических методов
Структура и функции биомолекул и надмолекулярных
комплексов (46)
Иммуноактивные синтетические фрагменты эндогенных и экзогенных белков для
иммунопрофилактики, лечения и диагностики
Лаборатория синтетических вакцин
1.Синтезированы новые пептиды, способные оказывать иммунопротективное действие при
экспериментально индуцированной болезни Альцгеймера
2.Осуществлен выбор и наработка противопептидных антител, выявляющих различные
структурные формы опухолеассоциированных белков нуклеофозмина и сурвивина. Проведено
изучение их диагностического потенциала
С целью повышения иммуногенной и протективной активности синтетического
фрагмента (173-193) альфа-7 субъединицы ацетилхолинового рецептора синтезированы
производные этого пептида и изучена их способность в свободном неконъюгированном виде
стимулировать образование антител и восстанавливать пространственную память животных
в животной модели болезни Альцгеймера. Выявлено патентоспособное соединение,
проявившее наиболее высокую активность в перечисленных тестах. Анализ сывороток крови
детей, перенесших черепно-мозговую травму, показал наличие антител к участку (173-193)
альфа-7 субъединицы ацетилхолинового рецептора, уровень которых коррелирует с
тяжестью травмы.
Показано, что антитела, полученные на синтетические фрагменты (19-36) и (283-294)
нуклеофозмина селективно выявляют мономерные и олигомерные формы нуклеофозмина в
различных линиях опухолевых клеток и выявляют нуклеофозмин различной клеточной
локализации при цитохимическом анализе разных опухолевых линий клеток. Уникальные
свойства антител продемонстрированы при изучении ФГА-стимулированной стимуляции
лимфоцитов.
Показано, что антитела, направленные к различным участкам сурвивина, имеют
различное сродство к белкам с молекулярными массами 17кД, 38кД и 40 кД, которые могут
соответствовать мономеру и гомо- и гетеродимеру сурвивина. С помощью полученных
антител проведен сравнительный анализ состояния нуклеофозмина в образцах опухолей
молочной железы и мочевого пузыря.
Структура, динамика, механизмы действия и биологическая функция мембранных и
мембрано-активных белков и пептидов.
Отдел структурной биологии
Лаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопии
1. Исследование пространственной структуры и внутримолекулярной динамики
мембранных и мембрано-активных белков и пептидов в средах, имитирующих
биологическую мембрану (мицеллах, бицеллах, нанодисках и липосомах):
- гомо- и гетеродимеры трансмембранных доменов рецепторных протеинкиназ;
ErbB- и FGFR- семейств тирозинкиназ и их патогенных мутантов;
трансмембранный
домен
белка
амилоидного
предшественника
APP,
ассоциированного с развитием болезни Альцгеймера;
С помощью гетероядерной спектроскопии ЯМР, белковой инженерии, оптической
спектроскопии и молекулярного моделирования, проведены исследования пространственной
структуры и внутримолекулярной динамики гомодимеров трансмембранных доменов
рецепторных тирозинкиназ (РТК) ErbB1, ErbB3, ErbB4, Val659Glu(Gln)-ErbB2 с онкогенной
мутацией и FGFR3.
Разработан протокол экспрессии трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы
ErbB1tmjm, белка из 54 аминокислотных остатков, несущего на C- конце часть
прилегающего к мембране внутриклеточного домена. После оптимизации протокола очистки
в течение года было наработано около 10 мг «холодного» белка и около 7 мг 15N-меченого и
7 мг 15N13C-меченого белка. Установлены пространственная структура трансмембранных
фрагментов гомодимера ErbB1tm, экспериментально охарактеризована внутримолекулярная
динамика исследуемых трансмембранных фрагментов и охарактеризована пространственная
укладка его N-концевого фрагмента в пограничной области мембрана/раствор.
Показано на примере димеров ТМ спиралей РТК человека ErbB3 и ErbB4, что выбор
мембранной среды не влияет на интерфейс взаимодействия между ТМ α-спиралями, но
может локально изменять структуру спиралей и энергетику их взаимодействия. Контактная
поверхность между α-спиралями, а также структурные детали взаимодействия практически
не зависят от детергента, но существуют различия в кривизне спиралей, а также в
термодинамической стабильности димера.
Впервые измерены: свободная энергия
димеризации, энергия активации димеризации, изменения энтальпии, энтропии и
теплоемкости системы при димеризации ТМ α-спиралей. Полученные данные
продемонстрировали существенный вклад энтропии системы во взаимодействия пары αспиралей в мембраноподобных средах.
Разработан протокол экспрессии мутантного трансмембранного домена рецепторной
тирозинкиназы ErbB2tm (Val659Glu). После оптимизации протокола очистки в течение года
было наработано около 8 мг «холодного» белка и около 15 мг 15N-меченого и 10 мг 15N13Cмеченого белка. Начаты структурно-динамические ЯМР-исследования ассоциации ТМ
домена ErbB2 с проонкогенной аминокислотной заменой Val659Glu, получена структура
мономера Val659Glu-ErbB2tm. В липидном окружении предположительно реализуется
димерное состояние пептида Val659Glu-ErbB2tm, в то же время наблюдается локальный
конформационный обмен в интерфейсе ассоциации ТМ альфа-спиралей. Определено, что
Glu659 находится в липидном окружении и, видимо, участвует в межмономерном
взаимодействии, образуя при этом разнообразные водородные связи, что и приводит к
локальному конформационному обмену в интерфейсе димеризации (олигомеризации)
Val659Glu-ErbB2tm.
Охарактеризованы структурные и динамические особенности димеризации
трансмембранных сегментов рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3tm) в
мембрано-имитирующем окружении. Спираль-спиральная димеризация происходит по
гептадному
(YA374X2L377X2G380X2FF384X2IL388X2A391X2TL395)
мотиву
с
левозакрученной параллельной упаковкой с углом скрещивания 20° и расстоянием между
спиралями ~9А. Центральная область димера характеризуется относительно плотной
упаковкой, стабилизированной внутри- и межмолекулярным стекинговым взаимодействием
ароматических колец (Y379–FF384–F386), N-концевой фрагмент трансмембранной спирали
стабилизируется при формировании димера, что может быть связано с активацией
рецептора. Экспериментально установленная конформация левозакрученного гомодимера
FGFR3tm подразумевает, что три патогенных аминокислотных замены Tyr373Cys
(проонкогенная мутация), Gly380Arg (ахондроплазия) и Ala391Glu (синдром Крузона,
проонкогенная мутация) приходятся на димеризационный интерфейс, что указывает на
значимый вклад специфического взаимодействия ТМ доменов в передачу сигнала РТК в
норме и при патологиях организма.
Для изучения процессинга белка-предшественника амилоида, ассоциированного с
болезнью Альцгеймера (ПБА) были созданы три экспрессионные конструкции, несущие
гены трансмембранного домена ПБА, укороченного последовательно на 3, 6 и 9 аминокислот
с С-конца по сайтам щепления ферментом гамма-сектретазой - APP685-714, APP685-720 и
APP685-717. В настоящее время ведутся работы по оптимизации условий экспрессии в
E.coli.
Для изучения конформационных изменений трансмембранной спирали белкапредшественника амилоида, ассоциированного с болезнью Альцгеймера (ПБА),
сопряженных со связыванием ионов двухвалентных металлов, была создана экспрессионная
конструкция, несущая ген APP671-726, имеющий сайт связывания металлов. В настоящее
время ведутся работы по оптимизации условий экспрессии в E.coli.
Определена пространственная структура ТМ домена белка- предшественника амилоида
APP (amyloid precursor protein) в среде, имитирующей мембранное окружение. Также были
охарактеризованы структурно-динамические особенности димеризации ТМ сегментов АРР.
Гомодимеризация АРР происходит по спираль-спиральному механизму по классическому
гептадному мотиву (L705X2G709X3A713X2V717X2L720) с левозакрученной параллельной
упаковкой. Плотная упаковка спиралей в гомодимере обеспечивается гидрофобным
взаимодействием боковых групп по принципу «ключ в замок». N-концевой примембранный
участок исследуемого пептида имеет повышенную подвижность по сравнению с ТМ
сегметом и не образует упорядоченную вторичную структуру.
2. Исследование структуры и динамики вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP в
мицеллах детергентов с использованием спин-меченых аналогов домена. Исследование
топологии комплекса вольт-сенсорный домен KvAP / токсин VSTX1.
Разработка методов применения нанодисков для исследования мембранных белков и
мембраноактивных пептидов: исследование механизма взаимодействия VSTX1
с фрагментом мембраны нанодиска и с инкапсулированным в нанодиск вольтсенсорным доменом KvAP.
KvAP – белок длиной 282 а.к. состоящий из 6 ТМ доменов. Два С-концевых домена
S5 и S6 образуют пору канала, домены S1 – S4 являются вольт-сенсорами. Четвертичная
структура KvAP представляет собой гомо-тетрамер. ВСД-KvAP представляет собой
мономер массой 17 кДа, имеющий в своем составе четыре трансмембранные спирали.
Разработан протокол ковалентного присоединения тиол-рективной спиновой метки (MTSL) к
боковой цепи цистеина мутантных вариантов вольт-сенсорного домена KvAP. Показана
возможность методом спиновых зондов измерять взаимное расположение и подвижность
частей молекулы относительно друг друга: были показаны движения N-концевого участка
молекулы относительно связки спиралей S1-S2.
Исследовано взаимодействие токсина VSTx1 c нанодисками различного состава и отдельно с
их белковым компонентом (MSP). Оценена энергетика связывания токсина как с мембраной
нанодиска, так и с белковым компонентом.
3. Изучение пространственной структуры G-Белок-сопряженных рецепторов методом
спектроскопии ЯМР.
Получены аффинные сорбенты для изучения функциональной активности и
выделения бета-2-адренергического рецептора. Для проведения функциональных тестов
бета-2-адренергического рецептора был синтезирован алпренолол-цистаимин - лиганд
рецептора, содержащий первичную амино группу. Аффинные сорбенты были получены
присоединением алпренолол-цистаимна к карбокси-активированной агарозе и эпоксисефарозе. Использование алпренолол-цистамина позволяет количественно контролировать
присоединение лиганда к сорбенту.
4. Полноразмерные бактериородопсины (БР) из Halobacterium salinarium и
Exiguobacterium sibiricum.
Произведен подбор условий для съемки ЯМР спектров высокого разрешения
полноразмерного бактериородопсина Halobacterim salinarium. Образец полноразмерного
бактериородопсина Halobacterim salinarium при концентрации 15мг/мл в отрицательно
заряженных бицеллах DMPG:DHPC (0.4:1), соотношении белок:(липид+детергент) 1:200 и
температуре 45°С стабилен в течение трех месяцев, что позволяет снимать ЯМР спектры и
производить отнесение сигналов. Были приготовлены образцы бактериородопсина, в одном
из которых видны только сигналы NH протонов трансмембранной части белка, в другом
сигналы NH протонов, которые свободно обмениваются с водой, что позволило существенно
уменьшить перекрытие сигналов в спектрах ЯМР. Произведено отнесение 60% сигналов
бактериородопсина (142 из 236 аминокислотных остатков).
Подобраны условия получения 13C-15N-меченого бактериородопсина бактерий E.
sibiricum на минимальных питательных средах, где в качестве источника углерода 13С,
использовалась только меченая глюкоза. Сравнительно недавно был разработан новый
высокочувствительный метод (динамическая поляризация ядер, DPN) ЯМР твердого тела,
который в сочетании с вращением под магическим углом позволяет проводить структурные
исследования белков. Для использования данного подхода образец должен находиться в
среде глицерин:вода, 3:2, и концентрация белка должна составлять сотни мг/мл. В данных
условиях был получен образец бактериородопсина психротолерантных бактерий E. sibiricum
(ESR) в составе нанодисков различного состава и показано, что структура нанодисков и
функциональность белка в этих условиях сохраняются.
5.
Исследование
структуры
мембраноактивных
пептидов.
Исследование
пространственной структуры, динамики и механизма действия антимикробных
пептидов животного и растительного происхождения.
Цитолитический пептид оксиопинин (Oxt4a) из яда паука Oxyopes takobius (Oxyopidae).
Получена пространственная структура цитолитического пептида оксиопинина (Oxt4a) (30
а.о.) из яда паука Oxyopes takobius (Oxyopidae). В пептиде имеется одна дисульфидная связь
Рис. 1.
Пространственная
структура Oxt4a в
мицелле ДФХ по
данным ЯМР в
ленточном
представлении.
Боковые группы
остатков,
формирующих кластер
положительных
зарядов, отмечены
знаком "+".
(Cys4-Cys10), что является необычным для цитолитиков, которые либо не содержат их
совсем, или их количество превышает 3. В растворе пептид представляет собой
неупорядоченную структуру, а в мицелле ДФХ структура пептида состоит из двух частей: Nконцевой петли (остатки 1-10), стабилизированной дисульфидной связью, где формируется
кластер положительных зарядов, и альфа-спирали (остатки 12-25), соединённых гибким
фрагментом (остатки 11-12) (Рис.1). Участки пептида (остатки 1-3, 26-30) разупорядочены. С
учётом имеющихся данных об антибактериальной активности пептида сделан вывод о том,
что он наиболее активен в отношении грам-отрицательных бактерий. Дестабилизация
мембран этих бактерий пептидом Oxt4a происходит по механизму кластеризации заряда,
согласно которому пептид создаёт фазовое разделение фосфолипидов, кластеризуя вокруг
себя, главным образом, анионные компоненты. На границах областей мембраны с пептидом
и без создаются дефекты, через которые протекают токи утечки, рассеивая трансмембранный
потенциал. Наличие гибкого линкера пептида необходимо для его проникновения через
липосахаридный слой грам-отрицательных бактерий.
Исследование пространственной структуры и динамики дефенсина Lc-def в водном
растворе.
Пространственная структура дефенсина в воде представляет собой небольшую
глобулу с одним α-спиральным участком (остатки 21-27) и тремя β-тяжами (остатки 2-6, 3236 и 41-47). Вся структура стабилизирована 4-мя дисульфидными и 16-ю водородными
связями между атомами основной цепи. Анализ свойств поверхности дефенсина указывает
на отсутствие явно выраженной амфифильности у молекулы пептида, на поверхности не
наблюдается протяженных гидрофобных регионов, положительно и отрицательно
заряженные остатки распределены на поверхности пептида практически равномерно.
Подобные свойства поверхности дефенсина Lc-def указывают на отсутствие у пептида
мембранной активности. Тем не менее, небольшой положительный заряд поверхности
пептида (общий заряд молекулы +2) может обуславливать слабое сродство молекулы
дефенсина к мембранам, содержащим большое количество анионных липидов. Исследование
взаимодействия дефенсина Lc-def с липидными везикулами различного состава
подтверждает отсутствие выраженной мембранной активности у дефенсина Lc-def.
Вероятно, антигрибковая активность этого пептида связана со специфическим
взаимодействием пептид/мишень (мишени). При этом возможной мишенью для действия
пептида являются специфические компоненты мембраны или клеточной стенки клеток
грибов.
Были охарактеризованы, как общая вращательная диффузия молекулы дефенсина в
растворе, так и внутримолекулярная динамика основной цепи пептида в двух диапазонах
времен – в диапазоне быстрых движений (пико-наносекунды) и в диапазоне медленных
конформационных флуктуаций (микро-милисекунды). Дефенсин Lc-def в водном окружении
диффундирует изотропно и характерное эффективное время корреляции вращательных
движений (τR) составляет около 2.18 нс. Полученное значение соответствует
гидродинамическому радиусу 14.0 Å (при 300С) и согласуется с реориентацией мономера
пептида в растворе (характерные размеры молекулы аурелина 31×26×22 Å). Остатки Leu6,
Phe10, Lys11, Gly12, Arg34, Cys35, Arg36, Asp37, Asp38, Phe39, Trp42 и Cys43 участвуют в
процессах конформационного обмена (с характерными временами микросекундымиллисекунды (значения вклада обменных процессов в скорость R2 релаксации REX >30 Гц).
Остатки, участвующие в процессах конформационного обмена, сосредоточены в одном
регионе молекулы дефенсина. Этот регион содержит следующие пространственно
сближенные участки: петлю, соединяющую первый β-тяж и α-спираль, N-концевой фрагмент
α-спирали, а также петлю между вторым и третьим β-тяжами. Следует отметить, что
«медленные» обменные процессы в микро-миллисекундном диапазоне времен часто
наблюдаются на тех участках поверхности молекул, которые принимают участие в
образовании надмолекулярных комплексов. Таким образом, вероятный сайт связывания
молекулы дефенсина Lc-def с его мишенью(мишенями) формируется двумя петлевыми
участками. Возможно, что наблюдаемые процессы конформационного обмена связаны с
динамической изомеризацией двух пептидных связей Gly12-Pro13 и Ile15-Pro16 находящихся
в петлевом участке соединяющем первый β-тяж и α-спираль.
Рис.2. Структура дефенсина Lc-def в
ленточном представлении. Красным
цветом
выделены
остатки,
совершающие движения в пикосубнаносекундном
диапазоне
времен,
синим
–
остатки,
участвующие
в
процессах
конформационного
обмена
с
характерными
временами
микросекунды-миллисекунды.
Остатки Lys11 и Gly12, для которых
характерно и то, и другое, выделены
фиолетовым цветом. Оранжевым
цветом отмечены остатки, сигналы
которых значительно уширены, что
15
не
позволяет
измерить
N
релаксационные данные. Уширение
сигналов этих остатков также
свидетельствует
о
процессах
конформационного
обмена
с
характерными
временами
микросекунды-миллисекунды
Исследование пространственной структуры и динамики липид-транспортирующего
белка чечевицы (Lc-LTP2) в водном растворе и в комплексе с липидами.
Липидтранспортирующий белок Lc-LTP2 из проросших семян чечевицы Lens culinaris
состоит из 93 аминокислотных остатков и имеет аминокислотную последовательность:
AISCGAVTSDLSPCLTYLTGGPGPSPQCCGGVKKLLAAANTTPDRQAACNCLKSAAGSITK
LNTNNAAALPGKCGVNIPYKISTTTNCNTVKF
Пептид содержит в своем составе 7 остатков пролина, общий заряд молекулы +6,
пространственная структура стабилизирована четырьмя дисульфидными связями (возможная
схема замыкания I-VI, II-III, IV-VII, V-VIII). Рассчитанная пространственная структура
представляет связку из 4-х α-спиралей, сформированных остатками Gly5- Leu18, Pro26Ala37, Thr42- Lys53, Thr64- Cys74. Кроме того, в структуре на участках Ala55-Ser58 и Cys88Thr90 наблюдаются отдельные витки 310-спирали, а на участке Cys74-Cys88 вблизи от Сконцевого
фрагмента
молекулы
находится
длинная
неупорядоченная
петля.
Пространственная структура связки из четырёх α-спиралей характерна для всех LTP первого
семейства. В составе белка Lc-LTP2 присутствует большое количество гидрофобных
остатков, которые обращены во внутреннюю сторону и формируют гидрофобный канал,
проходящий через всю молекулу (Рис. 3). Первые три спирали амфифильны и параллельны
этому каналу и ограничивают его с одной стороны, с другой стороны канал ограничен
четвертой спиралью и С-концевой петлей. Аналогичные гидрофобные каналы наблюдаются
в пространственных структурах всех белков семейства LTP. Именно эта гидрофобная
полость служит сайтом связывания одиночных липидных молекул.
Рис. 3. Распределение гидрофобных (выделены жёлтым цветом) остатков в молекуле Lc-LTP2.
Серым цветом показана основная цепь белка. Жирными линиями и цветом показаны
консервативные остатки.
У входа в полость расположены консервативные остатки Tyr80 и Arg45. Согласно
литературным данным, остаток Tyr80 образует водородные связи с полярной головкой
связанного липида. Боковая цепь заряженного остатка Arg45 направлена внутрь канала. Этот
остаток, возможно, отвечает за электростатическое взаимодействие с полярными головками
липидов.
Анализ свойств поверхности Lc-LTP2 указывает на отсутствие явно выраженной
амфифильности у молекулы белка. Действительно, поверхность молекулы Lc-LTP2 в
основном гидрофильна, гидрофобные остатки находятся внутри и формируют канал для
связывания липидов.
Для Lc-LTP2 было показано наличие двух конформаций молекулы в водном растворе,
соотношение заселённостей двух конформеров составляет 1:2. Скорость реакции
конформационного обмена 5,4±0,1 с-1, константа равновесия наблюдаемого процесса
K=0,6±0,1 и изменение свободной энергии Гиббса, характеризующее конформационный
переход ΔG0=-0,4±0,1 ккал/моль. Следует отметить, что среднее время жизни двух
конформационных состояний Lc-LTP2, находящихся в состоянии обмена, составляет около
0,5 и 0,3 секунд. Наиболее сильные изменения химических сдвигов в процессе
конформационного обмена наблюдаются у остатков из спиралей S2 и S3, и межспиральной
шпильки S2-S3 (остатки 26-58), а также у нескольких остатков, чьи боковые цепи находятся
в тесном контакте со спиралями S2 и S3. Возможно, наблюдаемый процесс
конформационного обмена связан с изменением положения спиралей S2 и S3 относительно
других участков белка, индуцированного цис-транс изомеризацией пептидной связи 42Thr43
Pro.
Lc-LTP2 эффективно связывает одну молекулу липида. Скорость реакции
химического обмена Lc-LTP2/(Lc-LTP2/липид) составила 5 с-1, что говорит о высоком
энергетическом барьере взаимодействия Lc-LTP2/липид. Взаимодействие с молекулой
липида существенно стабилизирует структуру Lc-LTP2 с сохранением одной конформации.
При связывании Lc-LTP2 с липидом сильнее всего изменяется структура С-концевой петли и
α-спиралей S1-S3, формирующих «канал связывания» (рис. 3). Вторичная структура Lc-LTP2
при связывании с липидом практически не меняется. Существенные изменения вторичной
структуры наблюдались только в петле S2-S3 (остатки 39-43), а также в начале спирали S1
удлинившейся на1 виток с N-конца.
6. Структурно-динамические модели белков высокой точности, верифицированные
при помощи расширенного массива данных ЯМР-спектроскопии.
Основная цель проекта состояла в разработке алгоритма построения структурнодинамической модели белков высокой точности за счет совместного использования
расширенного набора данных гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярнодинамических траекторий. На данном этапе получена структурно-динамическая модель
нейротоксина II. Для определения структурной составляющей модели была рассчитана
структура 15N-,13C-меченного аналога NTII в растворе с помощью методов гетероядерной
ЯМР-спектроскопии. При получении структуры были использованы современные методики
нелинейного сэмплирования, криогенно охлаждаемые датчики, а также прямые
экспериментальные данные о замыкании 15N-Н•••O=13C' водородных связей в молекуле
белка. Полученный набор структурных данных ЯМР был интерпретирован в соответствии с
экспериментальными данными о подвижности основной цепи (Т1, Т2 и гетероядерный
ЯЭО), и данными о конформационном многообразии укладки основной и боковых цепей (на
основе спин-спиновых констант 3JHN-Ha и 3JHa-H). Также с помощью оригинальной
методики МД-проверки была обнаружена и скорректирована ошибочная интерпретация
части ЯЭО кросс-пиков, не приводивших к взаимным разногласиям внутри
экспериментального набора данных. Все это позволило получить структуру нейротоксина II
в растворе высокой точности. Для определения динамической составляющей модели были
рассчитаны МД-траектории белка с явно заданным растворителем в полноатомном силовом
поле AMBER99sbILDN общей длиной 1 мкс. МД-траектории были верифицированы путем
сравнения величин Т1, Т2, гетероядерного ЯЭО, а также спин-спиновых констант 3JHN-Ha и
3JHа-H, полученных экспериментально и рассчитанных из МД-траекторий. Получившиеся
при сравнении высокие коэффициенты корреляции позволяют использовать МД-траектории
как высокоточную динамическую составляющую модели.
Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул
В исследованиях тирозин киназного рецептора эфринов EphA2 показано, что основные
сигнальные события (гомоассоциация, и фосфорилирование) происходят преимущественно
на плазматической мембране, а не в эндосомальных компартментах, как предполагалось
некоторыми исследователями. Показан импульсный характер активации EphA2 лигандом с
достижением максимума через 5 мин и снижением фосфорилирования до исходного уровня
в течение 20 мин. Невозможность ре-активации ЕphA2 обеспечивается в значительной
степени за счет интернализации рецептора. Показано, что в отсутствии лиганда степень
фосфорилирования EphA2 и его локализация зависят от уровня экспрессии рецептора и
активности клеточных фосфатаз.
Созданы клеточные линии со стабильной экспрессией химерных рецепторов EphA1CFP и EphA1-YFP, а также с совместной экспрессией EphA2-CFP и EphA1-YFP, с помощью
которых получены предварительные данные о возможности гетеродимеризации рецепторов
EphA1 и EphA2 в клетках.
Создано 6 плазмид, содержащих ген EphA2-CFP с точечными заменами в
трансмембранном домене рецептора, для изучения роли этого домена в функционировании
EphA2 в клетках эукариот.
При изучении механизмов взаимодействия антимикробных пептидов латарцинов Ltc1,
Ltc3a и Ltc5 с мембранными и внутриклеточными мишенями установлено, что в
субтоксических
концентрациях
латарцины
связываются
с
мембраной
клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60 и нормальных лейкоцитов человека и
интернализуются без нарушения проницаемости плазмалеммы. Выявлены существенные
отличия между латарцинами по локализации в клетках HL-60, что связано с отличиями в их
структуре и, предположительно, в механизмах их интернализации.
Методами лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (использование
маркеров поляризации и проницаемости клеточных мембран, статистический анализ данных
сканирующей цитометрии, регистрация индуктивно-резонансного переноса энергии)
доказано, что основе бактерицидного эффекта Ltc5 в отношении S.aureus и R.equi лежит
механизм необратимой пермеабилизации мембраны бактерий.
Показано, что разработанная нами ранее бактериальная клеточная тест-система
обеспечивает направленный поиск лигандов к поровой части вольт-зависимых калиевых
каналов Кv1.3 в цельных ядах пауков, скорпионов и жаб, а также в их фракциях на всех
стадиях деления и очистки индивидуальных компонентов. (выполнено в сотрудничестве с
лабораториями нейрорецепторов и нейрорегуляторов, молекулярной токсинологии и группы
нанобиоинженерии ИБХ РАН).
Хорошее совпадение измеренных нами констант
диссоциации ряда известных лигандов Кv1.3 с опубликованными ранее данными
подтверждает возможность высокоэффективного использования бактериальной клеточной
тест-системы не только для поиска новых лигандов Кv1.3, но и для оценки их
функционального потенциала.
Антимикробные пептиды природного происхождения (из бактерий, грибов, растений и
животных): поиск, выделение, структурно-функциональное исследование и изучение
взаимодействия с мембранами
Научно-образовательный центр (НОЦ) ИБХ РАН
На основе плазмид pET-31b(+) и pET-32a(+) и фрагментов ДНК, синтезированных с
помощью ПЦР, получена конструкция pET-Acip1 для экспрессии рекомбинантного
антимикробного пептида из лейкоцитов осетра Acipencer guldenstadti в клетках E. coli в
составе гибридного белка, включающего тиоредоксин в качестве белка-носителя.
Использование белка-носителя позволяет нейтрализовать токсичность целевого пептида для
бактериальной клетки, а также предотвращает его быстрое расщепление внутриклеточными
протеазами E. coli. Между последовательностями белка-носителя и целевого пептида был
введен метиониновый кодон ATG, что позволило с помощью реакции расщепления
гибридного белка бромцианом в кислой среде получить рекомбинантный пептид,
идентичный природному. Для предотвращения фрагментации белка-носителя при обработке
бромцианом внутренний остаток метионина в положении 37 с помощью направленного
мутагенеза был заменен на остаток лейцина. Последовательность, кодирующая
антимикробный пептид, была получена методом амплификации соответствующего участка
геномной
ДНК
осетра
с
использованием
ПЦР-праймеров
№1
(GCGAGATCTGATCCGATGTCTGGAAGA-GGAAAGACTGG)
и
№2
(GCGAATTCGCGGATCCTTAATAGACCGGGGCTCCAG-CGC).
Для
обеспечения
возможности металлохелатной очистки гибридного белка в его структуру был введен Nконцевой фрагмент из восьми остатков гистидина. Размер плазмиды составил 5912 п.о.,
размер кодируемого гибридного белка – 175 аминокислотных остатков (18,9 кДа).
Конструкция pET-Acip1 предназначена для экспрессии в штамме E. coli BL21(DE3) и
аналогичных штаммах, содержащих ген РНК-полимеразы фага T7. Экспрессия протекает под
контролем промотора T7lac; индуктором может служить лактоза или ее синтетические
аналоги, например, изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ). Открытая рамка
считывания завершается стоп-кодоном TAA, а транскрибируемая область ограничивается
терминатором транскрипции фага T7. Плазмида несет ген β-лактамазы, придающий клетке
устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл) и дополнительный ген lac-репрессора.
Необходимые нуклеотидные последовательности были получены химико-ферментативным
путем с использованием ПЦР, реакций рестрикции и лигирования. Клонирование
промежуточных фрагментов ДНК проводили в клетках E. сoli штамма DH-10B. Первичный
отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляли методом «ПЦР с клонов».
Окончательное строение плазмиды, содержащей требуемый фрагмент, подтверждали
определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру.
Минипрепаративное выделение плазмиды проводили с помощью наборов реактивов и
микроколонок Promega и Zymo Research. Для наработки плазмидной ДНК использовали
штамм E. coli DH-10B (RecA–).
Плазмидная конструкция pET-Trx-LcLTP3 для экспрессии рекомбинантного липидтранспортирующего белка Lc-LTP3 из чечевицы Lens culinaris была создана на основе
BamHI-EcoRI фрагмента плазмиды pET-His8-Trx длиной 5736 п.н. и синтезированного с
помощью ПЦР фрагмента ДНК, кодирующего липид-транспортирующий белок.
Экпрессирующая плазмида pET-His8-Trx была получена ранее в НОЦ ИБХ путем
лигирования BglII-XhoI фрагмента плазмиды pET-31b (Novagen) с фрагментом, содержащим
промотор Т7, lac-оператор, сайт инициации трансляции и последовательность, кодирующую
N-концевой гистидиновый октамер и тиоредоксин. В составе исходной плазмиды
содержались гены устойчивости к ампициллину и белка-репрессора лактозного оперона, а
также сайт инициации репликации плазмиды pBR322. Последовательность, кодирующая LcLTP3, была получена методом амплификации соответствующего участка кДНК чечевицы с
использованием ген-специфичных ПЦР-праймеров, несущих сайты рестрикции в 5’концевых областях. Размер плазмиды составил 6043 п.н., размер кодируемого гибридного
белка – 218 аминокислотных остатков (22,8 кДа). Конструкция pET-Trx-LcLTP3
предназначена для трансформации штаммов E. coli BL21(DE3), способных к индуцибельной
экспрессии гена РНК-полимеразы фага T7. Для выделения и очистки суммарной РНК
чечевицы использовали набор реактивов «SV Total RNA Isolation System» (Promega).
Очищенную суммарную РНК элюировали деионизированной водой, не содержащей нуклеаз.
РНК переосаждали 95% этанолом в присутствии подкисленного ацетата натрия (pH 4,5) и
перерастворяли в воде. Одноцепочечную кДНК получали с помощью обратной
транскриптазы RevertAid (Fermentas), используя для инициации синтеза адаптерный oligo-dT
праймер (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN). По окончании реакции объем
смеси доводили водой до 200 мкл, затем инактивировали фермент нагреванием (5 мин при
80˚С). Синтез фрагмента ДНК, кодирующего Lc-LTP3, осуществляли с помощью
полугнездовой ПЦР с использованием ДНК-полимеразы «Taq Advantage II» (Clontech).
Продукты реакции подвергли экстракции: сначала равным объемом смеси фенол-хлороформ
(1:1, pH 8,0), а затем хлороформом. Очищенную от белков ДНК осаждали добавлением 95%
этанола и перерастворяли в деионизированной воде. После этого проводили рестрикцию
фрагмента рестриктазами EcoRI и BglII с образованием липких концов. Продукты реакции
разделяли в 1,5% агарозном геле, после чего фрагмент длиной около 300 п.н. очищали с
помощью набора «Zymoclean Gel DNA Recovery Kit» (Zymo Research). Фрагмент плазмиды
pET-His8-Trx длиной 5736 п.н. был получен путем обработки раствора плазмиды
эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI. Продукты реакции разделяли в 0,8% агарозном
геле и очищали указанным выше способом. Фрагменты векторной ДНК и вставки
лигировали по стандартной методике. Лигазную смесь выдерживали в течение 24 ч при
температуре 16°С и проводили электротрансформацию клеток E.coli DH-10B. Клеточную
суспензию высевали на LB-агар с добавлением 50 мкг/мл ампициллина и инкубировали при
37°С в течение 16-20 ч. Полученные на селективной среде колонии анализировали с
помощью ПЦР с ген-специфичными праймерами на вставку и праймерами T7-Forward и T7Reverse на плазмидный остов. Клоны с плазмидой, содержащей вставку требуемой длины,
пересевали в жидкую питательную среду LB с добавлением ампициллина и культивировали
в течение 16 ч при 37°С с частотой перемешивания 220 об/мин. Клетки осаждали
центрифугированием, после чего проводили выделение плазмидной ДНК с помощью набора
«GenElute Plasmid Miniprep Kit» (Sigma) согласно инструкции производителя. Правильность
сборки конструкции подтверждали секвенированием плазмидной ДНК с использованием
праймеров T7-Forward и T7-Reverse. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора
реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции
на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystem).
Для получения рекомбинантного препептида лантибиотика LchA1 была разработана
плазмидная конструкция, включающая в себя ген самого препептида, а также ген фермента
LchM1, ответственного за образование специфических пострансляционных модификаций в
структуре LchA1. В качестве основы для создания экспрессирующей плазмиды была
выбрана плазмида pET-His8, полученная в НОЦ ИБХ путем лигирования BglII-XhoI
фрагмента плазмиды pET-31b(+) (Novagen) с фрагментом, содержащим промотор фага Т7,
lac-оператор, сайт инициации трансляции и последовательность, кодирующую N-концевой
гистидиновый октамер. Полинуклеотидная вставка, кодирующая предшественник пептида
LсhA1 а также фермент LchM1, получившая название «LchA1-LchM1», была встроена в
экспрессирующую плазмиду по сайтам BamHI и XhoI в одной рамке считывания с
гистидиновым октамером. Ввиду отсутствия в штамме-продуценте сигнальной пептидазы
LchP, в ген гибридного белка был введен участок, кодирующий сайт расщепления фактором
Xa
–
тетрапептид
Ile-Glu-Gly-Arg,
обеспечивающий
возможность
отделения
октагистидиновой последовательности и сигнального пептида от последовательности
зрелого пептида в процессе очистки. Создание генно-инженерной конструкции было
осуществлено в несколько этапов. На первом этапе был амплифицирован участок гена lchA1,
а в его последовательность введены сайт для расщепления рестриктазой BamHI и участок,
кодирующий сайт расщепления фактором Xа. На втором этапе был получен фрагмент,
содержащий полную последовательность гена lchA1 и 5’-концевую часть гена lchM1 (1569
п.н.). На третьем этапе была амплифицирована 3’-концевой часть гена lchM1 (1816 п.н.). На
завершающем этапе на основе продуктов второго и третьего этапов был синтезирован
фрагмент, содержащий полную нуклеотидную последовательность генов lchA1 и lchM1.
Полученные на каждом этапе продукты фракционировали в агарозном геле, фрагменты
требуемой длины выделяли с помощью набора «Zymoclean Gel DNA Recovery Kit» (Zymo
Research). Экспрессирующая плазмида pET-His8 и ампликон «LсhA1-LchM1» были
обработаны смесью рестриктаз BamHI и XhoI, после чего фрагменты были разделены
методом электрофореза и выделены из агарозного геля. Целевая плазмида pET-His8-LсhA1LchM была получена в результате лигирования двух указанных фрагментов. Продуктами
лигазной реакции методом электропорации были трансформированы клетки E.coli DH-10B,
после чего трансформанты были высеяны на чашки Петри с селективной средой. Выросшие
колонии анализировали на наличие вставки требуемой длины с помощью ген-специфических
праймеров на последовательность генов lchA1 и lchM1. Отобранные клоны подращивали на
жидкой среде с ампициллином и выделяли плазмидную ДНК с помощью набора «GenElute
Plasmid Miniprep Kit» (Sigma). Нуклеотидные последовательности вставок были
просеквенированы по методу Сэнгера с использованием ген-специфических праймеров.
Анализ результатов секвенирования конструкции «LchA1-LchM1» и сравнение их с
геномной последовательностью штамма B. licheniformis ATCC14580 подтвердили
правильность сборки конструкции, а также показали наличие в гене lchM1 семи
нуклеотидных замен, которые, по предварительным оценкам, не должны влиять на
активность модифицирующего фермента.
Ареницины из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina принадлежат
к новому структурному семейству минидефенсинов. Arenicola marina относится к классу
Polychaeta (многощетинковые) типа Annelida (кольчатые черви).
Ареницины
вырабатывается целомоцитами - фагоцитирующими клетками целома червя. Каждая из
выделенных нами двух изоформ ареницина представляет собой немодифицированную
полипептидную цепь, содержащую 21 аминокислотный остаток и стабилизированную одной
дисульфидной связью, замыкающей цикл из 18 аминокислотных остатков. Определенная
нами полная первичная структура зрелых ареницинов и генов их предшественников
позволяет сделать вывод о выявлении нами оригинальных пептидов, не принадлежащих ни к
одному из известных ранее классов антимикробных пептидов эндогенного происхождения.
Оба пептида обладают антимикробной активностью в отношении грам-положительных и
грам-отрицательных бактерий, а также дрожжевых грибков.
Проведен полный анализ флуктуаций проводимости, индуцируемых ареницином-1 и
ареницином-2 в бислойных липидных мембранах, отвечающих по своему составу клеточным
мембранам грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выявлены виды
флуктуаций, наиболее характерные для мембран обоих типов, определены их основные
характеристики и рассчитаны наиболее вероятные размеры пор и каналов, образующихся в
мембране под действием ареницинов. Эти данные, в комбинации с результатами изучения
пространственного строения ареницина физико-химическими методами были использованы
для построения структурной модели, описывающей молекулярные механизмы
взаимодействия ареницинов с мембранами. Согласно этой модели, в основе антимикробной
активности ареницинов лежит их способность к образованию тороидальных пор,
формирующихся в мембране из двух, трех или четырех аренициновых димеров и липидных
молекул.
Исследование терапевтического потенциала аналогов пептида дельта-сна в
онкологии
Лаборатория химии пептидов
Осуществлен синтез пептида дельта-сна и нескольких аналогов высокой степени
чистоты и
в достаточном количестве для проведения экспериментов. Составлен
литературный обзор о токсических побочных эффектах цитостатиков при их использовании
в экспериментах и в клинике, где наибольшее внимание уделено цисплатину. Составлен
подробный протокол проведения анализа модулирующего действия пептидов на фоне
введения опытным животным цитостатика в острой дозе. Отобраны физиологические
показатели, изменения которых предложено оценивать на основе экспериментальных
данных, получаемых для животных контрольной и опытных групп.
Определена
максимально переносимая доза цисплатина, в которой цитостатик использован при
проведении экспериментов.
Проведено изучение антитоксических свойств пептидов при внутрибрюшинном и
внутривенном введении на фоне действия цисплатина. Проведенные опыты не выявили
существенного антитоксического действия двух изучаемых пептидов семейства ДСИП при
анализе некоторых
характерных токсических эффектов цисплатина в условиях
парентерального и внутривенного введения использованных доз пептидов. Изучаемые
пептиды приводили к нормализации количества тромбоцитов и эритроцитов в крови и
способствовали повышению репаративных процессов в печени и селезенке.
В модельных опытах по выявлению возможных кардиопротективных свойств пептидов
семейства ДСИП в условиях, моделирующих кардиотоксичность цитоксичекого и
хирургического лечения в онкологической практике, были получены достоверные данные о
существенном кардиопротективном действии исследуемых пептидов.
В целом, проведенные опыты не позволили выявить существенное антитоксическое
действие двух изучаемых пептидов семейства ДСИП при анализе ряда токсических эффектов
цисплатина в условиях парентерального и внутривенного введения использованных доз
пептидов и максимально переносимой дозы цисплатина, действие которой на испытуемых
животных оказалось весьма умеренным, что затруднило оценку действия пептидов. В связи с
этим
представляется целесообразным оптимизировать протокол исследования
антитоксического потенциала пептидов по способу введения пептидов и величине их доз и
доз цитостатика, а также по спектру анализа вызываемых токсических эффектов.
Представляется также продолжить изучение антигипоксических свойств пептидов этой
группы в условиях экспериментальной ишемии сердца и мозга.
Структурно-функциональные исследования природных и синтетических пептидов и
оценка перспективности их использования для биохимических и медицинских
исследований
Лаборатория химии пептидов
На основании исследований активности пептидных экстрактов из растений на клеточных
линиях А549 и Н1299 (рак легких человека), линии HeLa (рак шейки матки человека), на
клетках линий MCF-7 и MCF-10 РМЖ, HT1080 (фибросаркома человека) получен экстракт
смеси растений, которые могли бы обеспечить цитостатическую активность на всех
клеточных линиях. Проведен масс-спектроскопический анализ пептидов смеси растений и
пептидов каждого растения смеси. Показано, что экстракт смеси растений содержит не менее
20 компонентов, молекулярная масса которых не превышает 1000 Д. С помощью специально
созданной программы PeptIdent показано, что некоторые молекулярные массы компонентов
экстрактов растений совпадают с молекулярными массами фрагментов белков, обладающих
противоопухолевой активностью. На клеточных линиях проводятся работы по исследованию
цитостатической активности полученного экстракта.
Синтез и структурно-функциональные исследования иммуномодуляторов класса
мурамилпептидов для разработки новых иммунобиологических препаратов для
профилактики и иммунотерапии
Лаборатория химии пептидов
Изучение механизма действия ГМДП.
Показано, что совместное введение ГМДП и ОDN в физиологическом растворе
ингибировало продукцию антител к овальбумину, причем эта же доза ГМДП, введенная
отдельно обладала адъювантным эффектом, а ODN в используемой дозировке – нет. Сделано
заключение, что для демонстрации синергизма адъювантного действия ГМДП и ODN
необходимы дополнительные исследования для подбора их оптимального соотношения.
Показано, что при совместном введении манноза не ингибирует адъювантный эффект ГМДП
и, следовательно, ее рецепторы не входят, как предполагалось, в систему транспортных
белков ГМДП.
Изучение механизма протективного действия ГМДП в мышиной модели
аллергической бронхиальной астмы.
Проведено исследование влияния мурамилдипептидов в модели мышиной бронхиальной
астмы методом ПЦР-анализа с обратной транскрипцией на индукцию провоспалительных
цитокинов. Показано, что превентивная иммунизация ГМДП на стадии формирования
аллергической реакции в дыхательных путях предотвращала воспаление и ослабляла Th2опосредованный проаллергический ответ. Несмотря на уменьшение аллергической реакции
при действии ГМДП, проявлявшееся в уменьшении эозинофилии и IgEиммуноглобулиномии, продемонстрировано увеличение уровня экспрессии генов цитокинов
IL-4, IL-10, IL-13.
Изучение механизмов мукоадъювантного действия низкомолекулярных хитозанов. Для
синтеза конъюгатов использовали В-клеточные (Asp f 2 47-58, Asp f 2 254-268, Asp f 3 1-15 и
Asp f 3 47-61) и Т-клеточные (Asp f 2 235-249 и Der p 2 21-35) эпитопы белков-аллергенов из
грибов Aspergillus fumigatus и клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus и
фракцию олигосахаридов хитозана с
М.м. 23 кДа и степенью дезацетилирования
85%.Способность свободных пептидов и их конъюгатов с хитозаном стимулировать
образование антител была изучена на мышах линии BALB/c. Мышей 5-кратно
иммунизировали либо подкожно, либо интраназально указанными соединениями в ФФР.
Продукцию антител оценивали методом ИФА с использованием в качестве подложки
исходных пептидов. Анализ антительного ответа показал, что иммунизация данными
конъюгатами приводила к избирательному синтезу противопептидных IgG1 антител.
Встраивание в конъюгат дополнительного Т-эпитопа одновременно с В-эпитопом также
приводило к усилению иммунного ответа на целевой В-эпитоп.
Структурно-функциональное изучение флуоресцентных белков для разработки новых
технологий флуоресцентного мечения в живых системах
Лаборатории Молекулярных технологий и Биофотоники, Инновационный центр
Технопарк ИБХ
Структурно-функциональные исследования флуоресцентных белков.
С помощью химического синтеза модельных соединений были изучены возможные
механизмы созревания красного хромофора флуоресцентных белков DsRed-типа. Был
разработан метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, соответствующих
хромофору зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) c
ациламиноалкильными заместителями в положении 2 имидазолона. По сути, такие
соединения представляют собой GFP хромофор с фрагментом предшествующей белковой
цепи, что позволяет моделировать созревание хромофоров красных флуоресцентных белков
из предшественников с зеленым хромофором. Было обнаружено, что эти модельные
соединения легко реагируют с молекулярным кислородом с образованием DsRed-подобных
хромофоров и продуктов их дальнейшего распада. Наши данные впервые показали, что GFPподобный хромофор склонен к окислению по С-альфа атому аминокислоты в положении 65
(GFP хромофор формируется аминокислотными остатками в положениях 65-67).
Единственным требуемым фактором такого окисления являются щелочные условия. Следует
отметить, что условия автоокисления были сходны с таковыми при созревании
флуоресцентных белков. Так, для модельных соединений с небольшими заместителями
автоокисление проходило за 20 мин при комнатной температуре, что сопоставимо со
скоростью созревания многих красных флуоресцентных белков. Мы заключили, что в случае
красных флуоресцентных белков, созревающих через GFP-подобный интермедиат (таких как
z2FP574 и asFP595), роль белкового окружения в формировании красного хромофора
сводится к основному катализу.
Наши результаты проливают свет на эволюцию флуоресцентных белков. Ранее было
показано, что цветовое разнообразие GFP-подобных белков возникало независимо в
различных группах животных. В частности, многократное возникновение красных
флуоресцентных белков и хромобелков с химически идентичным DsRed-подобным
хромофором представляет собой интригующий пример конвергентной эволюции на
молекулярном уровне. Легкость окисления GFP хромофора по положению 65,
продемонстрированная в нашей работе, помогает объяснить эту загадку, показывая, что
превращение зеленого хромофора в красный – не такой сложный процесс, как думали ранее.
Наконец, наши результаты позволяют задать парадоксальный вопрос: почему не все
флуоресцентные белки являются красными? Возможно, только отсутствие сильных
основных групп вблизи положения 65 поддерживает стабильность зеленого хромофора.
Следовательно, введение аминокислотных остатков, способных играть роль основания, в
непосредственно близости от С-альфа атома в положении 65 представляет собой новый
подход к созданию красных флуоресцентных белков на основе существующих зеленых
флуоресцентных белков.
Разработка и применение новых генетически кодируемых сенсоров.
Недавно нами была получена улучшенная версия сенсора пероксида водорода HyPer,
содержащая замену A233V в регуляторном домене OxyR, названная HyPer2. HyPer2
характеризовался увеличенным динамическим диапазоном по сравнению с исходным
вариантом. Однако, время окисления и восстановления HyPer2 было заметно больше, чем
для HyPer. В ходе настоящей работы мы получили еще одну мутантную форму HyPer,
которая содержала замену H114Y в OxyR. Динамический диапазон флуоресцентного ответа
на пероксид водорода сенсора HyPer-H114Y был в 3 раза выше, чем у исходного сенсора
HyPer. Вместе с тем, оба сенсора имели сходные скорости окисления и восстановления.
Таким образом, был получен улучшенный вариант сенсора HyPer. С помощью сенсора
HyPer нами была изучена динамика продукции H2O2 макрофагами RAW264.7,
фагоцирующими гранулы опсонизированного сывороткой зимозана. Из результатов
предыдущих исследований продукции H2O2 макрофагами RAW264.7 опсонизированного
полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана (Opz) следует, что концентрация H2O2
начинает расти через несколько минут после добавления к клеткам Opz, достигает
максимума через 40 мин и постепенно снижается. Снижение концентрации до исходной не
наблюдается в течение нескольких часов. Все подобные исследования ранее проводились
только для популяции фагоцитов, в том числе макрофагов RAW264.7.Используя
высокоселективный к H2O2 флуоресцентный краситель Amplex UltraRed, мы также получили
кривую, отражающую продукцию H2O2 популяцией фагоцитирующих RAW264.7. Таким
образом, наша экспериментальная система представляет собой «классическую» модель для
исследования динамики окислительного взрыва при фагоцитозе.Для визуализации
окислительного взрыва в индивидуальных макрофагах использовали клетки RAW264.7,
транзиентно экспрессирующие HyPer цитоплазматической локализации (HyPer-Cyto). Для
получения серий изображений отдельных фагоцитирующих макрофагов применяли
конфокальную флуоресцентную микроскопию. Наблюдение за индивидуальными клетками
позволило установить, что концентрация H2O2 внутри клетки начинает расти немедленно
после захвата гранулы Opz, достигает максимума через 2 минуты, и возвращается на
исходный уровень через 10-15 минут. В некоторых клетках происходит более одного
транзиентного повышения уровня продукции внутриклеточного H2O2, причём можно
проследить корреляцию между моментами поглощения отдельных гранул Opz и
последующими «всплесками» продукции H2O2. Полученные нами графики продукции H2O2 в
индивидуальных фагоцитрующих макрофагах радикально отличаются от аналогичных
графиков для популяций клеток. Разницу между результатами, полученными с помощью
HyPer, и графиками продукции АФК популяцией макрофагов RAW264.7, полученных с
применением люминола и Amplex UltraRed, можно объяснить асинхронностью и
гетерогенностью профилей продукции H2O2 индивидуальных клеток. Быстрое окисление и
восстановление HyPer во время фагоциза может свидетельствовать о сигнальной функции
H2O2 в этом процессе.
Разработка технологий флуоресцентного мечения живых систем
Разработан новый метод количественного анализа альтернативного сплайсинга
целевого экзона на уровне отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии
и проточной цитофлуориметрии.
Предлагаемый метод направлена на анализ альтернативного сплайсинга кассетных экзонов,
пропуск (или вставка) которых приводит к сдвигу рамки считывания (т.е. длина экзона не
кратна 3). Согласно литературным данным, такие экзоны встречаются в более чем 1/3 всех
альтернативно сплайсированных транскриптов млекопитающих. Таким образом,
предлагаемый метод применим к большому числу генов. Для остальных экзонов, можно
использовать искусственное изменение длины альтернативного экзона на 1 или 2
нуклеотида. Метод основан на экспрессии генетических конструкций, кодирующих
фрагмент целевого гена и флуоресцентные белки двух цветов (например, красного и
зеленого). Согласно схеме, химерная конструкция организована следующим образом.
Фрагмент целевого гена (миниген), включающий в себя альтернативный экзон (AEn),
соседние интроны (I) и конститутивные экзоны (E), расположен между генами красного и
зеленого флуоресцентных белков с сохранением открытой рамки считывания экзонов:
rfp-E(n-1)-I(n-1)-AEn-In-E(n+1)-gfp. Таким образом, трансляция нормально сплайсированного
трансткрипта приводит к появлению красного и зеленого флуоресцентных белков. В случае
альтернативного сплайсинга с пропуском альтернативного экзона, образуется сдвиг рамки в
экзоне E(n+1), что ведет к синтезу только красного (но не зеленого) флуоресцентного белка.
Клетки, экспрессирующие данную конструкцию, проявляют красную и зеленую
флуоресценцию, яркость которой можно измерить с помощью флуоресцентной микроскопии
и проточной цитофлуориметрии. Отношение красного и зеленого сигналов может быть
использовано для вычисления соотношения нормального и альтернативного транстриптов в
каждой клетке. Для этого используется контрольная конструкция, соответствующая
нормальному трансткрипту без интронов, которая показывает соотношение красного и
зеленого сигналов в случае 100% нормального сплайсинга. Дополнительный красный сигнал
сверх этого значения соответствует альтернативному транскрипту. Данная схема была
успешно применена для анализа сплайсинга экзона 4 гена PIG3 человека.
Разработанный метод обладает следующими преимуществами:
1) Схема расположения флуоресцентных белков делает возможным количественный анализ
альтернативного сплайсинга через оценку флуоресцентных сигналов. Ранее предложенные
методы на основе флуоресцентных белков не позволяли вычислять соотношение
транскриптов в каждой клетке.
2) Анализу подвергается большой фрагмент неизмененного целевого гена, что сводит к
минимуму вероятность потери важных регуляторных последовательностей. Ранее
предложенные аналогичные методы не давали возможность включать в анализируемую
конструкцию соседние экзоны или требовали включения генов флуоресцентных белков в
состав альтернативного экзона, что может изменять регуляцию альтернативного сплайсинга.
Посттрансляционные модификации белков семейства GFP
Группа химии хромопротеинов
Разработан метод установления структуры флуоресцентных белков объединяющий
гомологичное моделирование in silico для определения общей пространственной структуры
белка и эксперименты in vitro для установления структуры хромофора. Экспериментальное
установление структуры хромофора включает в себя выделение из белка небольшого
хромофорсодержащего пептида и последующий его масс-спектрометрический анализ.
Включение структуры хромофора в рассчитанную модель белка позволяет получить полную
пространственную структуру исследуемого белка. С использованием данного метода
проведены работы по изучению пространственной структуры желтого флуоресцентного
белка phiYFP. Полученная модель на следующем этапе использовалась для определения
аминокислот в окружении хромофора, которые могут влиять на фотофизические свойства
белка, и по этим аминокислотам проводился направленный мутагенез. Анализ спектральных
свойств полученных мутантов показал, что несколько факторов определяют фотофизические
характеристики желтых флуоресцентных белков. Полученные результаты позволяют сделать
вывод, что π-π стэкинг-взаимодействия хромофора с фенольным кольцом Tyr203 вносят
лишь небольшой вклад (около 10 нм) в общий сдвиг спектров в красную область.
Дополнительный эффект может быть получен при введении Val в позиции 205. Также,
важным фактором является образование водородной связи между Glu222 и азотом
имидазолонового цикла хромофора.
Исследование пространственной организации и структурно-функциональной
взаимосвязи белков методами рентгеноструктурного анализа, биоинформатики,
молекулярной механики/динамики
Лаборатория рентгеноструктурного анализа
Методом рентгеноструктурного анализа на атомном уровне установлены пространственные
структуры высокого разрешения (в интевале 1.15 - 1.85 Å) красного флуоресцентного белка
дикого типа eqFP578 (из морского анемона Entacmaea quadricolor, эм = 578 нм) и его
дальне-красного генно-инженерного варианта Katushka (эм = 635 нм) при различных рН.
Установлена взаимосвязь между структурными особенностями исследованных белков и
спектральными характеристиками. Структурно-функциональные выводы подтверждены
результатами сайт направленного мутагенеза.
Координаты атомов четырех новых кристаллических структур депонированы в
Международный структурный банк белков с кодами доступа PDB_ID: 3PIB (eqFP578 pH5.5),
3PJB (eqFP578 pH4.0), 3PJ7 (Katushka pH8.5), 3PJ5 (Katushka pH5.0).
Показано, что пространственная организация мономера исследованных флуоресцентных
белков (ФБ) принимает форму закрытого с торцов β-бочонка сформированного из 11-ти
антипараллельных бета-сегментов и одной альфа-спирали, в центре которой располагается
хромофор, образованный в результате посттрансляционной модификации аминокислотной
триады Met63-Tyr64-Gly65. Хромофор представляет собой планарную бициклическую
систему сопряжённых двойных связей, сформированную из пятичленного имидазолонового
и фенольного циклов. Двойная ацилиминная связь С=N Met63, расположенная в плоскости
хромофора, дополнительно расширяет эту систему, приводя к наблюдаемому сдвигу
флуоресценции из зеленой в красную область спектра. Аминокислотные остатки
ближайшего окружения хромофора (в пределах 4Å) образуют развитую сеть водородных
связей. Посредством водородных связей сеть активно взаимодействует с хромофором,
формируя эффективную транспортную систему для электронов и протонов как при
созревании хромофора (в процессе посттрансляционной модификации), так и
флуоресценции.
Уникальной особенностью исследуемых дальне-красного варианта Katushka, также
предшественника дикого типа eqFP578, является ярко выраженная рН зависимость
флуоресценции с максимумом эмиссии при рН ~6-8, которая постепенно падает до нуля при
уменьшении рН до ~3–4. В этой связи, пространственная организация eqFP578 и Katushka
была установлена при двух значениях рН, отвечающих низкому и высокому уровням
флуоресценции. Установлено, что флуоресцентные состояния eqFP578 и Katushka отвечают
соответственно транс и цис конформациям хромофора, отличающимися поворотом боковой
цепи Tyr хромофора на 180 град вокруг связи СА-СВ. Было показано, что наблюдаемое
тушение флуоресценции при понижении рН у eqFP578 (от pH5.5 к pH4.0) и Katushka (от
pH8.5 к pH5.0) сопровождается противоположной транс-цис и цис-транс изомеризацией
хромофоров, соответственно. Анализ пространственных структур выявил три замены,
Asn143Ser, Phe174Leu и His197Arg, которые оказались ключевыми при конструировании
варианта Katushka (~635нм) из предшественниеа дикого типа eqFP578 (эмиссия при ~578нм).
Именно остатки Ser143, Leu174 и Arg197, расположенные вблизи хромофора, оказались
ответственными за транс-цис изомеризацию хромофора и, как следствие, желаемый сдвиг
флуоресценции в дальне-красную область спектра у Katushka. Остаток Ser143 вносит
существенный вклад в стабилизацию цис формы за счет образования водородной связи с
гидроксильной группой остатка Tyr хромофора. В свою очередь, остатки Leu174 и Arg197
предположительно дестабилизируют транс форму, сдвигая равновесие в пользу цис формы.
При этом, более низкоэнергетичная цис форма хромофора дает основной вклад в
наблюдаемый сдвиг максимума эмиссии в дальне красную область спектра (от 578нм к
635нм).
Исследование генома и протеома яда паукообразных и растений с целью
идентификации новых биологически-активных веществ, взаимодействующих с
клеточной мембраной.
Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов
Показано, что пуротоксин-1 (PT-1) в наномолярных концентрациях значительно
уменьшает активацию рецептора АТФ, стабилизируя стадию десенситизации рецептора.
Кроме того, PT1 оказывает анальгетическое действие в моделях воспалительной боли и
может рассматриваться как перспективный анальгетик направленного действия. В результате
анализа баз данных EST
ядовитых желез различных пауков были найдены гены,
кодирующие полипептиды, гомологичные PT1 и содержащие около 70% идентичных
аминокислотных остатков. Были получены 7 рекомбинантных аналогов PT1, для чего были
синтезированы гены, получены конструкции для экспрессии на основе вектора рЕТ32,
подобраны условия экспрессии, выделены гибридные белки с тиоредоксином, проведено их
расщепление с использованием каталитической субъединицы энтерокиназы человека,
проведена очистка целевых пептидом методом ВЭЖХ. Действие аналогов PT1 было
проверено на P2X2, P2X3 и P2X2/3 рецепторах, экспрессируемых в DRG нейронах крысы. Из
7 аналогов три оказались неактивными, один пептид в концентрации ~100 nM ингибировал
P2X2-опосредованные токи, три аналога проявляли стойкий ингибирующий эффект на P2X3
рецепторы, один аналог незначительно потенцировал токи, опосредованные P2X2/3
рецепторами. Новые модуляторы P2X могут быть использованы как для фундаментальных
целей, таких как исследование специфичности и структурно-функциональных особенностей
пуриновых рецепторов, так и для клинического использования.
Продолжена работа по тестированию биологических и химических образцов на
присутствие в них компонентов, способных модулировать активность рецепторов ASIC3,
экспрессированных в ооцитах лягушки Xenopus laevis, а также характеристике новых
выделенных соединений. В ходе работы:
- Установлена структура полипептида ASTX1 из морской анемоны Heteractis crispa,
который ингибирует активность ASIC3 рецептора (IC50 ~10 мкМ). ASTX1 (молекулярная
масса 4537 Да) состоит из 41 аминокислотного остатка, среди которых 6 остатков цистеина,
которые образуют между собой 3 дисульфидные связи. Ближайшими гомологами ASTX1
являются пептиды из морской анемоны Anthopleura elegantissima: APETx1- блокатор K+
каналов и APETx2 – известный селективный модулятор ASIС3 каналов.
- Из актинии Utricina grebelnyi (район обитания п-ов Камчатка) выделен пептид (М.м
3135Дa), вызывающий уменьшение как пикового, так и стационарного компонента токов
через ASIC3 каналы.
- Проведено тестирование ядов 6 тропических
актиний (Индонезия). В
концентрациях 1мг/мл какого-либо эффекта на активность ASIC3 рецепторов не обнаружено.
Установлено, что яд зоантарии Protopalythoa sp. оказывает очень сильное и стойкое
цитолитическое действие на мембрану ооцита, которое обусловлено пептидными
компонентами с молекулярной массой около 2000Да.
- выделен низкомолекулярный компонент из экстракта чабреца (Thymus sp.),
ингибирующий активность ASIC3 рецептора (IC50 ~ 300 мкМ).
- Проведено тестирование действия 13 образцов водных экстрактов морских червей в
концентрации 1мг/мл на ASIC3 рецепторы: 2 образца оказывают концентрационнозависимое ингибирование пикового компонента токов через ASIC3 каналы; один компонент
вызывает концентрационно-зависимое потенциирование
пикового компонента
и
ингибирование стационарного компонента токов через ASIC3 каналы.
- Проведено тестирование действия 41 алкалоида растений (Уфа) на ASIC3
рецепторы: три соединения оказывают концентрационно - зависимое ингибиторное действие
на пиковый компонент токов через ASIC3 каналы.
С целью создания эффективной клеточной тест-системы получена стабильная линия
клеток CHO, экспрессирующая рецептор rTRPV1 под контролем тетрациклин-зависимого
промотора CMV. Используя метод флуоресцентной спектроскопии в комбинации с
применением планшетного спектрофотометра с интегрированной автоматической системой
дозирования жидкостей NOVOstar (BMG LABTECH) и прибора RT-PCR (ДНК-Технология),
проведена характеристика рецептора, изучены ответы клеток на приложение различных
агонистов TRPV1 рецептора (капсаицин, 2APB, рН, температура). Разработан метод
скрининга, основанный на измерении Са2+ сигнала клеток, индуцируемого при стимуляции
клеток агонистами TRPV1 рецептора, без и в присутствии различных тестируемых
соединений. Проведено исследование действия ранее описанных анальгетических пептидов
APHC1-3 из анемоны Heteractis crispa в различных схемах активации рецептора TRPV1.
Показано, что пептиды APHC1-3, в отличие от капсазепина - известного низкомолекулярного
блокатора TRPV1 каналов, не вызывают значительного падения Са2+ ответа клеток при
однократной активации клеток капсаицином, а также при приложении рН=6.0-5.5 и
повышенной температуры (44˚С), однако, при применении слабого активационного стимула
(рН~6.5, 2АРВ) APHC1-3 значительно изменяют кальциевый ответ на последующий
капсаициновый стимул. Полученные данные свидетельствуют в пользу более сложного
механизма действия пептидов, затрагивающего различные переходные состояния рецептора
во время активации-десенсетизации.
Таким образом, показано, что данная клеточная
система может быть использована для быстрого скрининга и поиска новых активных
соединений по отношению к TRPV1-рецепторам, в том числе соединений, проявляющих
модулирующую активность.
Проведено тестирование ядов 6 тропических (Индонезия) и 3 холодостойких
(Камчатка) актиний на наличие в них компонентов, активных по отношению к TRPV1рецепторам. Определены яды 3-х видов актиний для дальнейшего фракционирования и
тестирования отдельных соединений.
Проведено исследование физиологических эффектов полипептидных модуляторов
TRPV1 рецептора пептидов APHC1 и APHC3 из анемоны Heteractis crispa
на
сократительную активность ГМ детрузора нормальных крыс и крыс с диабетической
моделью синдрома гиперактивности мочевого пузыря (СГАМП).
Известно, что TRPV1-экспрессирующие, капсаицин-чувствительные афферентные
нервные волокна, которыми иннервирован мочевой пузырь, осуществляют как сенсорную,
так и “эфферентную” функции. При этом сенсорная функция состоит в регуляции частоты
мочеиспускания и восприятии болевых ощущений, а “эфферентная” – преимущественно в
контроле сократимости гладких мышц (ГМ) детрузора. Одной из основных дисфункций
мочевой системы является синдром гиперактивного мочевого пузыря (СГАМП) различного
происхождения. Частой причиной развития СГАМП бывают изменения в нервной системе,
вызванные сахарным диабетом. При СГАМП плотность TRPV1 иммунореактивных нервных
волокон возрастает, а активаторы или блокаторы TRPV1 рецепторов способствует снижению
клинических симптомов.
Эксперименты проводили методом тензометрии на препаратах детрузора с
удаленным уротелием, которые характеризовались наличием спонтанных сокращений.
АРНС1 и АРНС3 применяли в концентрации 200 нМ. Оба пептида у здоровых крыс
вызывали временное повышение базального тонуса продолжительностью 13-15 мин, на фоне
которого наблюдалось также значительное увеличение амплитуды спонтанных сокращений.
По мере воздействия пептиды постепенно угнетали сокращения в ответ на 10-секундные
ритмические электрические раздражения интрамуральных нервов. Угнетение выходило на
стационарный уровень на 30-й мин и достигало для АРНС1 - 38,50±3,42% (n=5), а АРНС3 –
25,08±1,63% (n=5).
В модели экспериментального диабета АРНС1 и АРНС3 оказывали незначительное
влияние на базальный тонус и спонтанную сократительную активность ГМ детрузора, но
сильнее ингибировали вызванные сокращения. Максимальное угнетение последних
наблюдалось на 30-й мин воздействия и составляло для АРНС1 46,28±3,26 % (n=5), а для
АРНС3 – 43,87±1,81 % (n=5). Таким образом, в модели диабетического СГАМП у крыс
угнетающее действие на вызванные сокращения ГМ детрузора пептидов-модуляторов
TRPV1 выражено более сильно. Полученные данные свидетельствуют, что АРНС1 и АРНС3
могут рассматриваться как эффективные ингибиторы TRPV1-зависимой сократимости ГМ
мочевого пузыря, особенно при СГАМП.
На основе ранее предложенного метода представления аминокислотных
последовательностей в упрощенной форме - Single Residue Distribution Analysis была
разработана информационная схема анализа банков нуклеотидных последовательностей. В
соответствии с новым подходом проводился предварительный анализ мотивов
аминокислотных последовательностей для полипептидных токсинов морских анемон, в
результате чего было впервые предложено 14 различных мотивов их первичной структуры.
Качество разработанных мотивов и их пригодность к дальнейшему использованию при
анализе проверялось на референсной базе полипептидных последовательностей, где с
помощью них удалось идентифицировать все представленные в этой базе полипептидные
токсины морских анемон. Простота и эффективность SRDA методики при поиске
полипептидных токсинов в банке EST была продемонстрирована на примере анализа базы
данных EST из морской анемоны Anemonia viridis. Постадийный анализ всех имеющихся
39939 просеквенированных клонов позволил детектировать закодированные в
транскриптоме 5 белков предшественников ранее известных токсинов, 43 новых
полипептидных токсина и еще 39 вероятных полипептидных токсинов. Также было
обнаружено два белка предшественника, которые продуцируют новые пептиды с
предположительно нейротропной активностью.
Проведен эволюционный анализ последовательностей токсин-кодирующих EST паука
Agelena orientalis. Ранее (2005-2007) был исследован пептидом яда этого паука. В частности,
был проведен расчет соотношения частоты синонимичных и несинонимичных замен (dS/dN)
как для полных последовательностей EST, так и для последовательностей, кодирующих
сигнальные пептиды, пропептиды и зрелые цепи в отдельности. Было показано, что во всех
перечисленных случаях с высоким уровнем статистической значимости (> 0,95) наблюдается
повышенная частота несинонимичных замен по сравнению с синонимичными. Преобладание
несинонимичных замен наиболее выражено в последовательностях, соответствующих
зрелым токсинам, и наименее выражено в последовательностях, соответствующих
сигнальным пептидам. Эти факты свидетельствуют о наличии положительного отбора в
токсин-кодирующих генах и согласуются с литературными данными для токсинов из других
ядовитых животных. Кроме того, для этих же последовательностей было рассчитано
соотношение числа транзиций и трансверсий. Была обнаружена повышенная частота
транзиций по сравнению с трансверсиями, что не согласуется с опубликованными данными
для токсинов из других ядовитых организмов, в частности, конических моллюсков.
Создана исчерпывающая база данных α-токсинов скорпионов, воздействующих на
процесс инактивации потенциал-чувствительных натриевых каналов, которая содержит
информацию об их структуре и активности. Совместно с лабораторией моделирования
биомолекулярных систем проведен анализ созданной базы. Показано, что α-токсины можно
представить как составленные из двух «псевдодоменов»: консервативного «корового» и
вариабельного «RC-домена». Этим структурам свойственны три главных признака доменов:
обособленность структурная, функциональная и эволюционная. В настоящее время
функцией RC-домена считают придание токсину определенной специфичности действия.
Токсины, специфичные в отношении насекомых, характеризуются значительно более
высокой гидрофобностью и низкой подвижностью RC-домена в сравнении с токсинами,
активными против млекопитающих. Полученные данные будут использованы для
рационального дизайна токсинов с заданной специфичностью.
Из яда паука Oxyopes takobius (Oxyopidae) получен новый цитолитический пептид
оксиопинин 4a (Oxt 4a). Установлена полная аминокислотная последовательность Oxt 4a из
30 остатков. Пептид содержит единственную дисульфидную связь в N-концевой области
(Cys4-Cys10) и отличается от всех ранее изученных компонентов яда пауков. В
сотрудничестве с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии показано, что Oxt 4a
неупорядочен в растворе, однако приобретает характерную торпедообразную структуру при
взаимодействии с мицеллами детергента, состоящую из «головы» (остатки 1–11 с необычно
высокой концентрацией положительного заряда) и «тела» (остатки 12–25 формируют
амфифильную α-спираль). Осуществлен химический синтез Oxt 4a. Новый пептид
характеризуется широким спектром цитолитической и антимикробной активности. Oxt 4a,
отличаясь от других пептидов из яда пауков, проявляет поразительное сходство с пептидами
из кожи амфибий с так называемым мотивом "Rana-box". Параллелизм или конвергенция
проявляется на нескольких уровнях: структура, функция и биосинтез пептидов из этих
различных источников сходны.
Из яда того же паука O. takobius выделен уникальный полипептидный токсин OtTx 1a
(~12 кДа), проявляющий инсектицидную и антимикробную активности. Комбинация
методов белковой химии, масс-спектрометрии и генной инженерии позволила установить
полную аминокислотную последовательность OtTx 1 из 108 остатков. Первичная структура
OtTx 1 позволяет отнести его к новому семейству так называемых модульных токсинов
пауков. N-Концевой линейный модуль OtTx 1 соответствует «обычному» цитолитическому
пептиду. С-Концевой модуль содержит 5 дисульфидов и, вероятно, формирует укладку
«цистинового узла», характерную для большинства нейротоксинов пауков. С помощью
экспрессии синтетических генов в бактериальной системе получен полноразмерный
рекомбинантный токсин OtTx 1a, а также его С-концевой модуль. Кроме того, путем
химического синтеза был получен N-концевой модуль OtTx 1. Проведено исследование
инсектицидной и антимикробной активности полноразмерного OtTx 1 и его частей.
Обнаружено, что С-концевой модуль характеризуется высокой цитолитической
активностью, превосходящей известные аналоги.
Продолжена работа по разработке способа борьбы с внутриклеточными паразитами
(хламидиями Chlamydia trachomatis) с использованием конструкций, кодирующих гены
АМП из яда пауков. Совместно с лабораторией генной инженерии Научноисследовательского института физико-химической медицины Федерального агентства по
здравоохранению и социальному развитию изучен антихламидийный эффект пептида из яда
паука Lachesana tarabaevi – цито-инсектотоксина CIT1a, который представляет собой
линейный, катионный, амфифильный, -спиральный пептид, активный в отношении как
Грам-положительных, так и Грам-отрицательных бактерий.
Антихламидийная
активность
синтетического
пептида
CIT1a
была
продемонстрирована на (а) элементарных тельцах (ЭТ) C.trachomatis; (б) с использованием
стратегии регулируемой экспрессии гена cit 1a в инфицированной клетке. Показано, что
цито-инсектотоксин CIT1a
действует на ЭТ C.trachomatis при довольно высокой
концентрации - 100 мкМ, что согласуется с литературными данными по тестированию
биологической активности на хламидиях дефензинов и протегринов, и, по-видимому,
объясняется особенностями строения наружной оболочки ЭТ и структурной жесткостью ЭТ,
которая
определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной
мембраны.
Для изучения активности CIT1a по отношению к хламидийной инфекции в
инфецированной клетке был сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор, в
котором последовательность, кодирующая зрелую цепь CIT1a находится под контролем
тетрациклин-зависимого промотора CMV, а также в состав вектора входит ген
трансактиваторного белка rtTA. Продемонстрирована антихламидийная активность пептида
CIT1a после трансфекции рекомбинантного вектора pBI/rtTA/CIT1a в культуре клеток линии
HEK 293. Уровень ингибирования инфекции C.trachomatis составил около 80%, что
превосходит ингибирующий эффект мелиттина, продемонстрированный ранее. При этом
цито-инсектотоксин CIT1a обладает менее выраженным цитотоксическим действием по
сравнению с мелитином. C использованием различных схем заражения клеток и индукции
экспрессии гена, впервые показано, что антимикробная активность цито-инсектотоксина
реализуется на ранней стадии развития хламидийной инфекции.
Продолжены исследования по выделению и структурно-функциональному анализу
новых антимикробных пептидов растений. Из семян и цветков одуванчика (Tarahakum
officinale) выделено и изучено частично или полностью 26 пептидов, среди которых имеются
таковые с новым цистеиновым мотивом. Из цветков этого дикорастущего растения также
выделен и охарактеризован гликозилированный Pro/HyPro-богатый пептид.
Продолжены исследования пептидов семян ежовника обыкновенного (Echinochloa
crusgalli). Выделено пять новых пептидов с 4-Сys мотивом. Из листьев выделен один пептид
гевеиного типа и несколько пептидов с 4-Cys мотивом. Выполнена работа по пептидомному
анализу различных органов одуванчика и звездчатки (Stellaria media). Методами ЯМР в
растворе определена (совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ
РАН) пространственная структура антимикробного пептида EcAMP1 семян ежовника
обыкновенного (Echinochloa crusgalli), выделенного ранее совместно с группой
молекулярных основ иммунитета растений ИОГен РАН. Методами лазерной конфокальной
флуоресцентной микроскопии изучено взаимодействие пептида со спорами гриба Fusarium
solani.
Определены последовательности кДНК и генов, кодирующих предшественник пептида
WAMP-1 (гевеин-подобный антимикробный пептид с широким спектром антимикробной и
антигрибковой активности), ранее выделенного из семян пшеницы Triticum kiharae, и шесть
его близких гомологов. Предшественники пептидов состоят из сигнального пептида, зрелого
пептида и С-концевого продомена. Гены, кодирующие пептиды WAMP, не содержат
интронов. Анализ последовательностей кДНК позволил предположить происхождение генов
wamp из генов хитиназ. По-видимому, в результате делеции и сдвига рамки считывания был
утерян каталитический домен хитиназы, что привело к появлению генов wamp. Биотические
и абиотические факторы влияют на экспрессию генов wamp. Солевой стресс и
взаимодействие с разными патогенными грибами приводит к индукции экспрессии, что
предполагает важную роль пептидов WAMP в ответе на стресс. Так, при взаимодействии
проростков пшеницы с патогенным грибом Aspergillus niger меняется не только уровень, но
и профили экспрессии генов wamp. Впервые показана экспрессия генов гевеин-подобных
АМП в ответ на солевой стресс.
Механизмы взаимодействия Cys-петельных рецепторов с природными и
синтетическими токсинами
Отдел молекулярных основ нейросигнализации
Лаборатория рецепции нейропептидов
Получены новые кристаллические структуры комплексов ацетилхолин-связывающих
белков со стрихнином и d-тубокурарином, показаны различные ориентации этих
антагонистов в центрах связывания, а также возможность расположения двух молекул
стрихнина в одном и том же кармане связывания. На основании этих данных был предложен
механизм молекулярного распознавания стрихнина и тубокурарина различными
представителями Cys-петельных рецепторов и были продолжены работы по созданию новых
уточненных компьютерных моделей этих рецепторов, включая глициновый и
серотониновый, а также различных подтипов никотиновых холинорецепторов.
Компьютерное моделирование α3β4α5 типа никотинового рецептора дало возможность поновому оценить его роль в чувствительности к никотину. Компьютерные модели были
использованы также для дизайна и последующего синтеза новых аналогов альфаконотоксина PnIA из морских моллюсков семейства Conus а их биологические исследования
выявили соединения, значительно превосходящие природный альфа-конотоксин по
активности. В совместной работе с Отделом биоинженерии и Отделом структурной
биологии впервые получен гетерологически экспрессированный водорастворимый аналог
природного трехпетельного белка Lynx1 (эндогенного модулятора никотиновых
холинорецепторов), методом ЯМР определена его структура в растворе и получены
параметры его взаимодействия с некоторыми типами холинорецепторов и ацетилхолинсвязывающими белками. Впервые показано, что взаимодействие с никотиновыми
рецепторами мышечного типа происходит в участке связывания классических антагонистов,
а с нейрональными – вне его.
Новые полипептиды животных ядов, действующие на Cys-петельные рецепторы и
гемостаз
Лаборатория молекулярной токсинологии
Проведено клонирование и установлены нуклеотидные последовательности кДНК,
кодирующих аминокислотные последовательности нескольких фосфолипаз А2 из яда
степной гадюки Vipera ursinii. Эти фосфолипазы выделены из яда и изучено их влияние на
процесс сворачивания крови. В яде этой же гадюки обнаружен белок с молекулярной массой
13,8
кДа,
обладающий
способностью
взаимодействовать
с
никотиновыми
холинорецепторами. Определена N-концевая аминокислотная последовательность этого
белка, оказавшаяся гомологичной последовательностям трех-петельных токсинов. Также из
яда V. ursinii выделен токсичный для насекомых белок, N-концевая аминокислотная
последовательность которого гомологична таковой легкой цепи активатора фактора X из яда
гадюки V. ammodytes. Кроме того выделены две металлопротеиназы, одна из которых
расщепляет фибриноген, препятствуя таким образом нормальному процессу сворачивания
крови. Показано наличие гликозилирования металлопротеиназ и активатора фактора Х.
Создание новых лигандов Cys-петельных рецепторов на основе пептидных токсинов:
конструирование, синтез, активность
Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий
С помощью компьютерного моделирования был осуществлен направленный дизайн
большой серии аналогов альфа-конотоксина PnIA. 14 новых аналогов были синтезированы и
была проведена оценка их способности взаимодействовать с нейрональным никотиновым
холинорецептором альфа7 типа и ацетилхолин-связывающими белками. Три из них показали
более высокое сродство и селективность к определенной мишени. Были получены их
радиоактивные формы, сохранившие свои связывающие свойства и потенциально пригодные
для использования в качестве маркеров соответствующих мишеней. Для надежной детекции
альфа3/альфа6 нейрональных холинорецепторов проведен синтез аналогов α-конотоксина
MII, различающихся модификациями по N-концевому остатку для получения радиоактивных
производных, а также его флуоресцентного аналога. Все они были охарактеризованы в
биохимических тестах и на физиологическую активность и признаны годными в качестве
маркеров данного типа рецепторов. Охарактеризована также холинергическая активность
гетерологически экспрессированного водорастворимого эндогенного модулятора некоторых
типов никотинового холинорецептора – белка Lynx1.
Исследование механизма действия биокатализаторов, ферментов, каталитических
антител, компонент протеосомного комплекса
Лаборатория биокатализа
Методами предстационарной кинетики исследован механизм деградации
фосфорорганических соединений, в частности пестицидов каталитическими антителами.
Показаны стадии реакции разложения ФОВ, пестицида параоксона.
Подтверждены данные кинетической схемы, полученной на предыдущем этапе
исследования. Показано, что она соответствует трехстадийной реакции с участием стадии
ковалентного катализа. Реакция протекает по механизму «индуцированного соответствия».
Подтверждены данные, полученные на предыдущем этапе, демонстрирующие, что
именно с наличием субьединиц иммунопротеасомы связан альтернативный механизм
деградации ключевого нейроантигена, основного белка миелина. Высказано предположение,
что деградация основного белка миелина иммунопротеасомой не столь сильно зависит от
уровня убиквитилирования.
Проведено детальное исследование механизма действия протеазы ВИЧ. Методами
предстационарной кинетики установлен механизм взаимодействия ингибиторов с протеазой
ВИЧ. Получены элементарные константы взаимодействия фермента с субстратами и
ингибиторами. Детализированы «элементарные стадии процесса» Построена кинетическая
модель механизма действия.
Показано с помощью анализа библиотеки генов иммуноглобулинов больных
рассеянным склерозом, что в репертуаре этих иммуноглобулинов имеется ответ как на
нейроантиген, основной белок миелина, так и на белки вируса Эпштейна-Барра. Таким
образом, впервые продемонстрировано наличие «молекулярной росписи» вируса в
репертуаре больного РС.
Идентификация и структурно-функциональные исследования новых белков,
участвующих в патогенезе ряда социально-значимых заболеваний. Разработка на их
основе подходов для диагностики и лечения этих заболеваний
Лаборатория белков гормональной регуляции
Изучение взаимодействия NDP-киназы A сетчатки быка и легкой цепи динеина
типа 1.
Ферментативная активность нативной NDP-киназы в препаратах НСП, а также уровень ее
аутофосфорилирования при взаимодействии с рекомбинантным DYNLRB1 возрастали в 1,5
раза по сравнению с контролем. При исследовании зависимости величины активации и
уровня аутофосфорилирования рекомбинантной NDP-киназы А от концентрации DYNLRB1
было показано, что максимальное 10-кратное увеличение активации фермента наблюдалось
при соотношении молярных концентраций белков 1:10 соответственно, а максимальное 5кратное увеличение уровня его аутофосфорилирования достигалось при соотношении их
концентраций 1:30. Таким образом, DYNLRB1 влияет на обе стадии ферментативной
реакции, катализируемой NDP-киназой А. В системе E. сoli были экспрессированы
цитоплазматические домены активинов 1 и 2 — серин/треониновых протеинкиназ из
семейства TGF β рецепторов. Показано, что фосфорилирование DYNLRB1 активинами
в системе in vitrо не происходит. Однако, включение радиоактивного фосфата в состав
DYNLRB1 наблюдалось при совместной инкубации белков в
препаратах НСП, при этом фосфорилирование DYNLRB1 вызывало дополнительную 2кратную активацию NDP-киназы А. Полученные результаты свидетельствуют о том, что
фосфорилирование DYNLRB1 является важным процессом, регулирующим его
взаимодействие с NDP-киназой А, а также о том, что помимо активинов 1 и 2 для
фосфорилирования DYNLRB1 необходимы дополнительные факторы.
Изучение функциональной роли нейротрофного фактора из пигментного эпителия
PEDF при возникновении миопии.
Ранее нами был проведен анализ ряда последовательностей кДНК PEDF из склеры
близоруких глаз. В трех случаях были обнаружены мутации,
затрагивающие
полученный из образцов контрольной группы, и PEDF обнаруженных мутантных форм были
экспрессированы в бакуловирусной системе. Изучение свойств экспрессированных белков
показало, что мутантные формы PEDF не отличаются от контрольных образцов по
способности подвергаться протеолизу под действием матриксной металлопротеазы-2.
Исследование же с помощью атомно-силовой микроскопии и высоко специфических антител
на олигомерные структуры показало, что экспрессированные белки не отличаются также и
по способности к фибриллообразованию.
Выяснение функциональной роли в клетках иммунной системы новых белков (гапонин
и YM-1).
Для изучения
функциональной роли гапонина была создана панель генетически
модифицированных клеточных линий с измененными уровнями экспрессии белка. С
помощью лазерной конфокальной микроскопии клеток, сверхэкспрессирующих слитый
белок GFP-гапонин, и иммунофлуоресцентного окрашивания эндогенного гапонина было
показано, что гапонин, имеющий в своей аминокислотной последовательности сайты
ядерной локализации, преимущественно находится в клеточных ядрах. С помощью клеток,
сверхэкспрессирующих гапонин дикого типа, и клеток, в которых уровень экспрессии
гапонина был снижен методом киРНК, было установлено, что клеточная гибель в условиях
окислительного стресса, вызываемого добавлением к клеткам экзогенного пероксида
водорода, и метаболического стресса, вызываемого депривацией сыворотки, прямо
коррелирует с количеством гапонина в клетке. Полученные данные об участии гапонина в
молекулярных механизмах клеточного ответа на окислительный стресс в совокупности с
ранее продемонстрированной способностью гапонина связывать GAPDH, позволили
предположить, что гапонин способствует ядерной транслокации GAPDH в условиях
окислительного стресса и усилению сигнального каскада GAPDH/Siah1/клеточная гибель.
Определена полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующая открытый нами
белок rYM-1olf обонятельного эпителия крысы. Полноразмерная кДНК rYM-1olf крысы
(включающая 1545 п.о.) депонирована в международную базу данных
GenBank. Для выяснения роли белков rYM-1olf и р45 (Sec14р) крысы при воспалении
проводили сравнение уровней экспрессии их мРНК в клетках обонятельного эпителия
животных с синдромами острого и хронического воспалений. Результаты ПЦР-анализа в
реальном времени показали, что количество транскриптов гена rYM-1olf в ткани
животных в случае острого воспаления в первые сутки увеличивалось в 22,6 раза (p<0,05), а
гена rSec14р в 5,4 раз (p<0,05) по сравнению с контролем; а на седьмые сутки не отличалось
от контроля. Морфологические исследования тканей печени и тимуса подтверждали, что к
7 суткам животные выздоравливали. У животных с хроническим воспалением уровень
экспрессии этого гена был невысоким. Таким образом, острое воспаление сопровождается
резким увеличением экспрессии гена rYm1olf, а накапливание rYm1olf в тканях является
индикатором развития воспаления. Экспрессия гена Сhi3l3, кодирующего белок Ym1olf в
крысе экспериментально подтверждена впервые. Также показано отсутствие экспрессии в
обонятельной выстилке крыс гена Сhi3l4, наиболее близкого к изучаемому крысиному гену.
Исследование молекулярного механизма нейропротекторного действия пептида HLDF6.
Изучено влияние пептида HLDF-6 на рабочую память животных с моделями болезней
Альцгеймера. Было использован две модели: 1) трансгенные мыши линии B6C3Tg(APP695)85Dbo,Tg(PSENI)85Dbo,
экспрессирующие
белок
пресенилин
1
и
предшественник амилоидного белка (экспрессия двух белков обеспечивает раннее развитие
болезни Альцгеймера, обусловленное отложением в мозге бета-амилоидных образований); и
2) крысы, у которых болезнь Альцгеймера вызывали при помощи инъекции бета-амилоида
25-35 и иботеновой кислоты в гиппокамп. Рабочую память животных тестировали в модели
спонтанного чередования в У-образном лабиринте. Индекс спонтанного чередования,
являющийся показателем рабочей памяти, в случае животных обеих моделей был
значительно ниже, чем у животных контрольных групп. Инъекции пептида HLDF-6
восстанавливали рабочую память, как у трансгенных мышей, так и у крыс с болезнью
Альцгеймера, вызванную введением бета-амилоида и иботеновой кислоты, до уровня
контрольных животных.
Структура и функции белков ядрышек клеток млекопитающих
Лаборатория структурной биохимии
С помощью полученных нами противопептидных антител проведен анализ
нуклеофозмина в нормальных тканях крыс (мозге, печени, почках, сердце, легких). Впервые
показано, что наибольшее содержание нуклеофозмина в мозге и печени. Из этих тканей
получены более обогащенные нуклеофозмином препараты ядер, анализ которых позволил
впервые выявить, что мозг, в отличие от других тканей, содержит помимо мономерных
олигомерную форму нуклеофозмина;
Анализ нуклеофозмина в лимфоидных клетках здоровых доноров, больных со
злокачественными и незлокачественными заболеваниями крови позволил впервые выявить,
что при злокачественных заболеваниях крови основные изменения касаются олигомеров
белка, детектируемых противопептидными антителами к С-концевому домену изоформы
В23.1, локализованных в ядрышке. Увеличение содержания этих олигомеров коррелировало
с увеличением содержания Ki-67 позитивных клеток.
Методами иммунопреципитации и аффинной хроматографии с использованием
полученных нами моноклональных антител к белку ядрышка SURF-6 и оригинальных
генетических конструкций, кодирующих кДНК Surf-6-GST, установлено, что основными
белковыми партнерами SURF-6 в клетках HeLa являются факторы процессинга рРНК и
внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 – нуклеофозмин, Nop52 и EBP-2.
Взаимодействие SURF-6 с нуклеофозмином и Nop52 подтверждено также методом FRET в
живых клетках. Эти результаты говорят о том, что одной из функций SURF-6 у
млекопитающих является участие в биогенезе рибосом и, возможно, в развитии вирусных
инфекций, происходящих с участием белка EBP-2.
На полученных нами ранее генетически модифицированных фибробластах мыши линии
NIH/3T3-174 показано, что индуцированное повышение содержания SURF-6 приводит к
достоверному уменьшению продолжительности клеточного цикла в целом и фазы
репликации ДНК (S-периода), в частности. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу
участия белка SURF-6 в регуляции клеточного цикла и, возможно, его стимуляции. С
использованием метода Нозерн блотов доказано, что индуцированное повышение
содержания SURF-6 в клетках NIH/3T3-174 SURF-6 приводит к нарушениям биогенезе
рибосом. Таким образом, суммируя полученные результаты можно сделать вывод о том, что
основными функциями белка ядрышка SURF-6 являются участие в биогенезе рибосом и
регуляции клеточного цикла.
Методом высокочувствительной гибридизации in situ проведен анализ состоянии
незрелых форм пре-рРНК и зрелых рРНК в митозе у млекопитающих (на примере,
фибробластов мыши NIH/3T3. Доказано, что инкубация митотических клеток с кальциевым
ионофором А23187 индуцирует преждевременную (на стадии метафазы) сборку NDF у
млекопитающих. Эти наблюдения указывают на то, что ионы кальция играют важную роль в
реорганизации ядрышка в митозе. Проанализировано влияние различных параметров,
включая площадь ROI (region of interest) и температурные условия постановки эксперимента,
на мобильность белков в экспериментах с использованием метода FRAP (fluorescence
recovery after photobleaching). Впервые показано, что стандартизация площади ROI
необходима для получения воспроизводимых результатов в независимых сериях
экспериментов. Анализ подвижности белков ядрышка при физиологической (37о С) и
пониженной (27о С) температуре позволяет выявить белки, обладающие энзиматической
активностью.
Совместно с группой экспериментальной биологии с виварием) продолжена
работа по разработке лабораторной модели склеродермии человека – патологии иммунной
системы, сопровождающихся выработкой аутоантител к антигенам ядрышка. Показано, что
нелинейные (аутбредные) мыши CFW под действием хлорида ртути развивают системный
аутоиммунный процесс, характеризующийся совокупностью типичных признаков системной
склеродермии: появлением аутоантител к белку ядрышка фибрилларину, увеличением
уровня сывороточных иммуноглобулинов классов IgG1 и IgE, образованием герминативных
центров в селезенке, отложением иммунных комплексов в клетках почек, печени и
селезенки. Впервые показано, что аутоантитела, вырабатываемые аутбредными животными,
способны проникать внутрь клеток, что характерно также для больных такими
аутоиммунными заболеваниями как системная красная волчанка и склеродермия.
В рамках выполнения НИР по ГК №14.740.11.0116 была разработана методика
выявления сайтов активности РНК-полимеразы I на криосрезах яичников мышей после
гормональной стимуляции.
В культуральном фильтрате
недавно описанного гриба Fusarium asiaticum,
распространённого в Китае и вызывающего фузариоз пшеницы, впервые были
идентифицированы пектолитические ферменты (пектинметилэстераза, полигалактуроназа,
пектинлиаза). Пектолитические ферменты фитопатогенных грибов, разрушающие пектин
клеточной стенки и участвующие в процессе заражения растения грибом, являются
основными патогенными факторами в системе гриб – растение-хозяин. Особенностью
клеточной стенки пшеницы и других злаковых является низкое содержание пектина, поэтому
участие пектолитических ферментов грибов в процессе заражения пшеницы находится на
стадии изучения. Ранее зарубежными учёными было сделано предположение, что ферменты,
разрушающие клеточную стенку растения, являются важными патогенными факторами
близкородственного гриба Fusarium graminearum. В культуральном фильтрате гриба
Fusarium asiaticum были идентифицированы три формы пектинметилэстеразы (ПМЭ). Две
формы ПМЭ с молекулярной массой 31 и 42,5 кДа были очищены до гомогенности. Эти
формы не связываются с конканавалином А. Кроме того, было показано, что ПМЭ с
молекулярной массой 31 кДа термостабильна в интервале температур 25 – 55 0С, а оптимум
рН - 6,5.
Изучение структурно-функциональной организации и инженерия
рекомбинантных белков для медицины и биотехнологии
Отдел биоинженерии
Разработка бесклеточной системы продукции интегральных мембранных белков
Разработаны системы бесклеточной продукции бактериородопсина из Exiguobacterium
sibiricum и мускаринового ацетилхолинового рецептора типа М1. Для бесклеточной
продукции мембранных белков в растворимой и функциональноактивной форме был
опробован новый подход: синтез в присутствии мембраномоделирующих сред, таких как
мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски. Сравнительный
анализ функциональной активности бактериородопсина, синтезированного в присутствии
различных мембранных миметиков, показал, что наибольший выход активного белка в
растворимой форме наблюдается при ко-трансляционном встраивании бактериородопсина в
липид-белковые нанодиски. В случае мускаринового ацетилхолинового рецептора человека
М1 типа наибольший выход белка наблюдался при бесклеточном синтезе в виде осадка
трансляционной смеси в отсутствие каких-либо мембраномоделирующих компонентов.
Разработан протокол ренатурации рецептора в результате его солюбилизации из осадка
трансляционной смеси и последующего встраивания в липосомы. Эксперименты по
взаимодействию с лигандами атропином и телензипином показали наличие функциональной
активности полученного препарата рецептора.
Получение и исследование проапоптозного белка Noxa.
Разработана эффективная система продукции проапоптозного белка Noxa в
Escherichia coli. Оптимизированы условия выращивания бактерий и достигнут уровень
синтеза около 100 мг/л в богатой автоиндукционной среде и 50 мг/л в бедной среде.
Разработан протокол выделения и очистки белка, который включает две стадии
металлохелатной аффинной хроматографии и ионообменную хроматографию. Выделены
миллиграммовые количества 15N-меченного Noxa и получены ЯМР-спектры в различных
экспериментальных условиях В 15N-HSQC спектрах белка, растворенного в 20 мМ буфере
Трис при различных рН, присутствуют всего 11 кросс-пиков. Это говорит о том, что большая
часть белка Noxa не структурирована. По косвенным данным можно сделать вывод о том,
что на спектре виден N-концевой участок белка (совместно с лабораторией
биомолекулярной ЯМР-спектроскопии).
Изучение эффективности и специфичности расщепления энтеропептидазой слитных
белков с мутациями в сайте расщепления D4K.
Разработан новый эффективный подход для удаления аффинных и других тагов с
помощью каталитической субъединицы энтеропептидазы при получении рекомбинантных
белков различного назначения. Каталитическая субъединица энтеропептидазы широко
используется для высокоспецифичного расщепления слитных белков и удаления аффинных
тагов, однако, при использовании большого количества фермента часто происходит
расщепление и других участков полипептидной цепи, что ухудшает качество целевого
препарата. Проведенные исследования показали, что эффективность расщепления слитных
белков энтеропептидазой существенно улучшается при замене аминокислотного остатка K в
сайте расщепления D4K на R. При этом требуется в 4-6 раз меньше рекомбинантной
энтеропептидазы чем при использовании исходного (природного) сайта расщепления.
Уменьшение количество используемого фермента позволяет снизить стоимость полученного
целевого белка, что особенно важно при масштабном получении рекомбинантных белковых
препаратов.
Конструирование и получение рекомбинантных Fab’-фрагментов антител против
протективного антигена и летального фактора B. Anthracis.
Осуществлено выделение генов вариабельных доменов моноклональных антител,
обладающих нейтрализующей активностью в отношении протективного антигена (ПА) и
летального фактора (ЛФ) экзотоксина B. anthracis и предотвращающих развитие
инфекционного процесса при заражении бациллами сибирской язвы. Проведено
конструирование химерных (каппа, IgG1) Fab’-фрагментов антител против ПА и ЛФ, а
также их гуманизированных аналогов, у которых осуществлена замена мышиных
каркасных FR-доменов антиген-связывающего центра на FR-домены человека. Разработана
система бактериальной экспрессии и проведено выделение химерных и гуманизированных
фрагментов антител. По результатам иммунохимического анализа показано, что процесс
химеризации и гуманизации не повлиял на антиген-связывающие свойства, и аффинность
рекомбинантных химерных и гуманизированных антител полностью совпадает с данными,
полученными для моноклональных антител. Таким образом, полученные рекомбинантные
антитела против ПА и ЛФ могут быть использованы для разработки терапевтических
средств для борьбы с сибирской язвой.
Получение библиотек ДНК на основе 10 домена фибронектина человека.
Сконструированы 2 библиотеки ДНК, кодирующие рекомбинантный ген 10 домена
фибронектина человека (FN10) с заменами в петлевых участках BC, DE и FG на
статистический набор аминокислот. Библиотеки различаются набором нуклеотидов в
рандомизированных участках (KMT и NNB, соответственно). Полученный набор генов
объединен с геном RepA и экспрессирован в бесклеточной системе. Методом CIS-дисплея с
использованием биотинилированного фактора некроза опухолей (ФНО) произведен отбор
генов, кодирующих ФНО-связывающие белки. В результате экспрессии в клетках E. coli
методом
аутоиндукции
отобран
ряд
клонов,
проявивших
по
результатам
иммуноферментного анализа высокую степень связывания с антигеном.
Инженерия мутантных вариантов цитохрома с.
На основе анализа информационной структуры цитохрома с лошади предложена
модель функционирования цитохрома, основанная на подвижности структурных блоков,
соответствующих элементам информационной структуры (ЭЛИС) высшего ранга. Для
подтверждения модели сконструирован ряд мутантных вариантов белка с тремя или
четырьмя мутациями, содержащих cайт повышенной плотности ЭЛИС на участке 76-83 а.о.
белка, что должно приводить к снижению конформационной подвижности ADD-сайта, на
котором расположен остаток Met 80 цитохрома, и подавлению взаимодействия с белкамипартнерами дыхательной цепи. Получены гены мутантных вариантов цитохрома, которые
экспрессированы в бактериальной системе и соответствующие белки наработаны в
препаративных количествах.
Получение и исследование лиганда эфриновых рецепторов ephrin A1.
Рекомбинантный эктодомен эфрина А1, лиганда эфриновых тирозин-киназных
рецепторов, получен в прокариотической системе экспрессии. Разработана эффективная
методика выделения и ренатурации лиганда, выход ренатурированного белка составил 50
мг/л культуры. Проведено исследование функциональной активности лиганда in vitro на
клетках HEK293(EphA2-СFP), экспрессирующих химерный рецептор EphA2-СFP (СFP циановый флуоресцирующий белок). В результате проведенных экспериментов показана
способность рекомбинантного эктодомена эфрина А1 в мономерной водорастворимой форме
активировать рецепторы EphA2 в клетках НЕК293.
Разработка фундаментальных принципов конструирования неприродных антител
с заданными свойствами и нанокомплексов на их основе
Лаборатория молекулярной иммунологии
Продолжена разработка принципов конструирования гибридных биосовместимых
наноконструкций для биоимиджинга - визуализации опухолевых клеток человека in vitro и in
vivo на основе
флуоресцентных наночастиц различной природы и мини-антител,
специфичных к поверхностным рецепторам опухолевых клеток. Путем включения в
полимерные частицы получены стабильные водные суспензии флуоресцентных
нанокристаллов (квантовых точек) и их конъюгатов с противораковыми мини-антителами.
В работе получен набор флуоресцентных полимерных частиц, в том числе, содержащих КТ,
отвечающих требованиям биоанализа, и проведена оценка возможности использования
полученных частиц для визуализации биомолекул. Показано, что включение КТ в
полимерную матрицу блокирует их каналы тушения флуоресценции и дает возможность
получить полимерные частицы, интенсивно флуоресцирующие в широкой области спектра
от ультрафиолетовой до инфракрасной при возбуждении одним источником. Полученные
частицы использованы для маркирования биомолекул на примере реакции латексной
агглютинации и для визуализации клеточных рецепторов HER2/neu клеток аденомы яичника.
Показано, что полученные соединения специфически метят раковые клетки SKOV3 и
характеризуются высоким квантовым выходом и фотостабильностью.
Предложен новый метод конъюгации флуоресцентных наноалмазов, основанный на
взаимодействии высокоафинной белковой пары барназа:барстар. Приведенная реакция
проста и обеспечивает стойкое ковалентное связывание наноалмаза с барстаром. Впервые на
универсальной платформе белкового модуля барназа-барстар созданы конъюгаты
люминесцентных наноалмазов с флуоресцентным белком EGFP и с золотыми
наночастицами. Полученные наночастицы устойчивы в виде водных суспензий в течение
длительного времени, способны неспецифически метить эукариотические клетки, обладают
широким спектром излучения и фотостабильностью.
В отчетном году продолжена разработка универсальной технологии создания
магнитоуправляемых мультифункциональных наночастиц с заранее заданными свойствами с
применением адапторного белкового модуля барназа-барстар.
На основе разработанных универсальных принципов создания неприродных антител и
надмолекулярных комплексов с заранее заданными свойствами сконструированы и
охарактеризованы новые высокоэффективные иммунотоксины направленного действия для
адресного поражения патогенных клеток. Сконструирован и охарактеризован полностью
генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор, содержащий в качестве нацеливающей
молекулы анти-HER2/neu-мини-антитело 4D5scFv, а в качестве фотосенсибилизирующей –
фототоксический флуоресцентный белок KillerRed. Показано, что оба домена в составе
рекомбинантного белка сохраняют свои функциональные свойства – высокую аффинность к
опухолевому антигену и фототоксические свойства. Рекомбинантный белок 4D5scFv-KillerRed
показывает хорошую специфичность по отношению к HER2/neu-гиперэкспрессирующим
раковым клеткам и эффективно снижает их жизнеспособность при облучении, а также
усиливает действие противоопухолевого препарата цисплатина при сочетанном применении.
На основе другого агента, рибонуклеазы барназы, и специфического эпитопа
c-myc сконструирован и охарактеризован новый высокоэффективный иммунотоксин
направленного действия для адресного поражения модельных В-клеток.
С целью создания конструкций, применимых для генной терапии, разработан молекулярный
дизайн моногенных рекомбинантных конструкций, кодирующих аналоги полноразмерных
антител человека противоопухолевой специфичности; исследована экспрессия указанных
генных конструкций в молочных железах трансгенных мышей.
Структурно-функциональные исследования протеиназ, осуществляющих
процессинг белков и регуляцию клеточных функций.
Протеиназы социально опасных заболеваний
Лаборатория химии протеолитических ферментов
АТР-зависимый протеолиз
Продолжено изучение Lon-протеиназы из Escherichia coli (EcLon) с целью выявления
особенностей сопряжения функционирования единственного нуклеотид-связывающего и
двух альфа-спирализованных доменов и определения роли некаталитических областей для
реализации ферментом процессивного протеолиза.
Выявлены консервативные элементы альфа-спирализованных доменов, включающих
СС-участки, для LonА-протеиназ бактерий и эукариот, а также шаперонов Hsp100/ClpB. Для
выявления роли остатка R164 ЕсLon-протеиназы, предположительно выполняющего
сенсорную функцию, проведен направленный мутагенез гена lon, приводящий к замене
R164А. Продемонстрирована экспрессия формы ЕсLon-R164А в клетках E. coli штамма
BL21(DE3). Разрабатывается методика количественного выделения мутанта.
С целью предотвращения интенсивного автолиза в укороченную форму EcLon(173784) введена мутация S679А по каталитически активному остатку серина. Охарактеризованы
АТР-азная активность и олигомерное состояние мутанта.
Протеиназы экстремофилов
а) психрофильная протеиназа из микроорганизма Serratia Proteamaculans
Ограниченным протеолизом PSP с помощью химотрипсина получена укороченная
форма фермента. Укороченный вариант
PSP (предположительно 101-677) обладает
повышенной активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату и в отличие от
полноразмерного фермента, гидролизует высокомолекулярный субстрат – азоказеин. Это
подтверждает наши предположения, что N-концевая “скобка” (около 100 аминокислотных
остатков), которая, по данным теоретических расчетов, удерживает конформацию
каталитического домена PSP, препятствует гидролизу высокомолекулярных субстратов.
Начато конструирование укороченных вариантов этого фермента, обладающих большей
активностью по отношению к белковым субстратам.
Начато исследование свойств PSP в комплексе с шаперонами. Получен комплекс
рекомбинантного His6-PSP - с шаперонином типа GroEL Esherishia coli (1:1).
Продолжено изучение доменной структуры PSP с помощью сканирующей
микрокалориметрии. Показано, что в присутствии 50 мМ Са2+ температура денатурации двух
структурно независимых доменов молекулы этого белка составляет 43,10 и 45,90. В
отсутствие ионов кальция температура денатурации, соответственно, 40,20 и 44,80.
Энтальпия денатурации для менее стабильного, каталитического, домена (ΔdH1) в
присутствии ионов кальция также несколько повышается: с 980 до 1120 ккал/моль. Таким
образом, ионы кальция несколько повышают стабильность белковой молекулы этого
фермента.
б) термостабильные протеиназы
из кишечника личинок жука-кожееда
Dermestes maculates.
Из кишечника личинки жука-кожееда (Dermestes maculatus) выделен препарат
суммарной РНК. Двухцепочечная кДНК синтезирована на матрице суммарной РНК методом
SMART и амплифицирована методом PCR. Амплифицированная кДНК гена цистеиновой
протеиназы L клонирована в вектор и секвенирована по одной цепи. В Определена ее
нуклеотидная последовательность. Полученный фрагмент кДНК вставлен в экспрессионный
вектор рЕТ22_NHis#15 для получения рекомбинантного белка (цистеиновой протеиназы L) и
последующего изученияего свойств.
Механизмы эффекторного действия сериновых протеиназ на процессы
воспаления и репарации тканей.
В плане исследования инактивации протеиназ активируемого рецептора (PAR1)
синтезированы фрагменты PAR1 человека (PFWEDEEK-NESG) и крысы (PLGDEEEKNESI), содержащие уникальную последовательность, аналогичную последовательности
активационного пептида трипсиногена.
Исследован гидролиз этих пептидов
энтеропептидазой быка и легкой цепью энтеропептидазы человека. Показано, что гидролаз
этих специфических для энтеропептидазы быка осуществляется легкой цепью фермента на
два порядка более эффективно, чем полноразмерным ферментом.
Дуоденаза
В рамках исследования возможного участия дуоденазы как полифункциональной
протеазы в защитных реакциях организма проводилось изучение действия фермента на
некоторые факторы системы комплемента морской свинки и человека (С1, С4 и С3),
взаимодействия дуоденазы с С1 –ингибитором и гидролиза IgG в присутствии фермента.
Показано, что в присутствии дуоденазы наблюдается дозозависимое падение
гемолитической активности комплемента морской свинки, причём дуоденаза проявляет
большую активность в присутствии сенсибилизированных антителами эритроцитов, чем в
системе, содержащей только сыворотку. Показано, что компоненты С1 и С4 устойчивы к
протеолитическому действию дуоденазы. Антикомплементарная активность фермента
обусловлена инактивацией фактора С3 морской свинки дуоденазой, тогда как по отношению
к С3 человека дуоденаза может проявлять активирующие свойства.
Дуоденаза образует комплекс с С1-ингибитором, который относится к классу
серпинов. Разработан простой и надёжный метод определения ферментативной активности
дуоденазы в диапазоне концентраций от 0,4 до 3,1 мкг/мл по гидролизу IgG.
Показана принципиальная возможность дуоденазы влиять на защитные процессы,
контролируемые системой комплемента.
IgA1 протеаза из Nesseria meningitidis
Наработана IgA1 протеаза из культуральной среды и полупродуктов производства
менингококковой вакцины группы А. Получены образцы рекомбинантной IgA1 протеазы и
её мутантного варианта, на основе гена менингококка серогруппы В. Проведено сравнение
специфичности, ферментативной активности, иммунологических и серологических свойств
различных форм IgA1 протеазы. При изучении мутантного варианта IgA1 протеазы
показано отсутствие её ферментативной активаности при сохранении иммуногенных
свойств. В опытах на лабораторных животных показана протективная активность
полученных препаратов в отношении менингококков серогрупп А и В.
Работу проводили совместно с лаб. Полимеры для биологии (Жигис Л.С.) и группой
прикладных исследований пептидов и белков (Зинченко А.А.)
ВИЧ-1 протеиназа
Продолжены исследования предстационарной кинетики взаимодействия протеазы
ВИЧ-1 с ингибиторами разных поколений методом остановленного потока. Получены
данные, подтверждающие образование тройного комплекса протеазы, ингибитора и
субстрата, которые необходимы при разработке новых высокоэффективных ингибиторов
протеазы ВИЧ.
Теоретические исследования в области механизма действия протеиназ.
Компонент комплемента C1q.
Продолжается работа по исследованию комплексов C1q с низкомолекулярными
ингибиторами методом молекулярной динамики в модели <<гибкий лиганд – гибкий
рецептор>>. Разработанный расчетный метод для ингибиторов C1q компонента системы
комплемента был уточнен для лигандов, связывание которых было экспериментального
определено с помощью методов иммуноферментного анализа.
Проведен сравнительный анализ точности разработанного метода и
вычислительных затрат по сравнению с традиционными методами количественного
анализа "структура-свойство" (QSAR).
Синтез и биологическая активность индолсодержащих липидов
Лаборатория оксилипинов
В рамках общей программы синтеза новых индолсодержащих биоэффекторных
липидов в 2011 г. проведен синтез гибридных нейролипинов, содержащих остатки 5метокси- и 5-гидрокситриптамина, присоединенные к этаноламиду арахидоновой кислоты
(анандамиду) и арахидоноилглицину. Изучены биологические свойства синтезированных
соединений, а также веществ сравнения из семейства ацилнейротрансмиттеров.
Показано, что производные 5-метокси- и 5-гидрокситриптаминов обладают менее
выраженным нейрозащитным действием по сравнению с аналогичными производными
дофамина. Однако в модели фотоиндуцированного тромбоза головного мозга комбинация Nэйкозапентаеноил-5-гидрокситриптамина
и
N-арахидоноилдофамина
существенно
уменьшала зону поражения мозга, что было подтверждено ультраструктурными
исследованиями срезов головного мозга крыс. Этот эффект превосходил нейрозащитное
действие
каждого
из
нейролипинов
в
данной
модели.
В опытах по определению возможного цитотоксического действия синтезированных
соединений на клетки глиомы С6 крысы установлено, что гибридные соединения на основе
анандамида и триптаминов обладают заметной ингибирующей активностью (EC50 несколько
мкМ), тогда как амиды арахидоноилглицина с триптаминами оказались практически
неактивными в данном тесте. Однако цитотоксическое действие производных триптамина
оказалось значительно слабее эффектов производных дофамина. Последние, как наиболее
активные нейролипины, были изучены в более сложных моделях повреждения нейронов.
Так, совместно с НЦ Неврологии РАМН изучено нейропротекторное действие Nдокозагексаеноилдофамина на органотипические срезы гиппокампа мыши в модели
глутаматной токсичности и установлено, что добавление этого нейролипина к срезам,
предварительно обработанным 200 мкМ глутамата (это в контроле вызывает значительное
повреждение нервных клеток), оказывает существенный нейрозащитный эффект. Такой же
эффект наблюдали и в экспериментах на первичной культуре коры головного мозга крысы:
присутствие N-докозагексаеноилдофамина в концентрации 5мкМ в инкубационной среде
приводило к максимальному увеличению количества выживших нейронов (практически
100%). N-арахидоноилдофамин в такой же концентрации также защищал максимальное
количество нейронов (92%) от токсического действия глутамата. Этот эффект
дозозависимым образом усиливался в присутствии N-эйкозапентаеноилсеротонина
(наиболее
активного
соединения
из
изученных
производных
триптаминов).
Совместно с Нижегородской медицинской академией изучено влияние Nдокозагексаеноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность нейронной сети
первичной культуры гиппокампа крысы. Показано, что добавление этого нейролипина в
концентрации 20 мкМ в культуральную среду на фоне действия глутамата, приводит к
постепенному снижению уровня активности нейронной сети и наблюдается изменение
сетевого паттерна биоэлектрической активности с эффектом более быстрого восстановления
синхронизированной пачечной активности после периода молчания по сравнению с
нейронной сетью, в которую добавлялся только глутамат в концентрации 50 мкМ.
Следовательно, N-докозагексаеноилдофамин способен модулировать биоэлектрическую
активность нейрональной сети, частично восстанавливая характерный паттерн, нарушенный
под действием глутамата.
Отдельной серией экспериментов показано, что профилактическое введение Nарахидоноилдофамина перед моделированием острой гипобарической гипоксии снижало
смертность среди мышей, способствовало сохранению долговременной памяти в
постгипоксическом периоде, снижало неуверенность и тревожность животных.
Кроме того, продолжено изучение биологических свойств природных простамидов (амидов
простагландинов с биологически активными аминами). Совместно с институтом
фармакологии РАМН показано, что арахидоноил-гамма-аминомасляная кислота способна
усиливать мозговое кровообращение в условиях раздельной и сочетанной сосудистой
патологии мозга и сердца. Подобным эффектом обладал также амид простагландина E2 и
гамма-аминомасляной кислоты (природный аналог простамида E2), причем этот эффект был
чувствителен к ингибиторам рецепторов гамма-аминомасляной кислоты и не проявлялся в
отсутствии патологии. Таким образом, запланированные на 2011 г. исследования в рамках
пункта 46 основных направлений фундаментальных исследований РАН полностью
выполнены: за отчетный период были синтезированы новые биологически активные
соединения, близкородственные природным нейролипинам, и найдены новые свойства
природных биоэффекторных липидов, важные в плане разработки новых лекарственных
средств для лечения социально значимых заболеваний.
Синтез новых противоопухолевых веществ липидной природы, создание и
исследование форм их адресной доставки в опухоли
Лаборатория химии липидов
Синтезированы по разработанным ранее методикам липофильные пролекарства (ЛП)
метотрексата и мелфалана, а также липофильный гликоконъюгат тетрасахаридного лиганда
селектинов Sialyl Lewis X (SiaLeX) – вектор для получения адресных лекарственных
липосом.
Разработан синтез флуоресцентного BODIPY-меченого аналога диглицеридного
производного метотрексата – зонда для изучения внутриклеточного транспорта липофильного
пролекарства метотрексата. Рукопись статьи подготавливается.
Исследован противоопухолевый эффект адресных липосом с ЛП новых антимитотических
агентов – блокаторов тубулина – на модели рака молочных желез мышей. Показано, что ЛП 4арилкумаринового аналога природного агента комбретастатина А4 (СА-4) в липосомальной
форме превосходит как исходный 4-арилкумариновый аналог, так и липосомальную форму
ЛП СА-4.
Проведен ряд экспериментов по изучению внутриклеточного трафика
лекарственных липосом. В качестве модельного ЛП использовали диглицеридное
производное доксорубицина (DOX-DG), поскольку DOX обладает собственной
флуоресценцией. Сравнивали внутриклеточный трафик липосом различного состава:
нагруженных DOX во внутреннем водном объеме и несущих DOX-DG в мембране. По
полученным данным, липосомы с ЛП легче высвобождают лекарство в клетке, чем
«стандартные» липосомы с препаратом во внутреннем объеме.
Исследовано взаимодействия липосом с ЛП метотрексата и мелфалана с компонентами
крови человека. Изучение гемосовместимости включало тесты на гемолиз, коагуляцию и
активацию системы комплемента. Показано, что липосомы с ЛП мелфалана, в том числе,
оснащенные Sialyl Lewis X, не влияют на перечисленные показатели крови. В то же время, для
липосом с ЛП метотрексата наблюдалась активация системы комплемента (начального
компонента С3а и конечного мембраноатакующего комплекса) и коагуляции. Эти
нежелательные эффекты минимизировались при уменьшении нагрузки липосом ЛП (при
сохранении суммарной концентрации ЛП в анализируемом образце).
Впервые исследована локализация лекарственных SiaLeX-липосом (ЛП – диглицеридное
производное мелфалана) in vivo, на модели карциномы легких Льюис. Показано, что в
отсутствие адресного лиганда липосомы накапливаются во внеклеточном пространстве
опухолевой ткани за счет пассивного транспорта, в то время как введение SiaLe X-конъюгата в
состав липосом обеспечивает их активный транспорт к эндотелию опухолевых сосудов,
вызывая повреждение последних.
Синтез новых флуоресцентных зондов; изучение с их помощью строения и функций
мембран и закономерностей переноса энергии возбуждения; изучение апоптотических
процессов в клетках.
Лаборатория химии липидов
Синтезированы новые флуоресцентные зонды: BODIPY-FL-, BODIPY-564/570производные
фосфатидилэтаноламина,
производные
PEG-2000-дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, меченные остатками Rhodamane-Red-X и Texas-RedX, зонды
применены для изучения распределения меченых фосфатидилэтаноламинов в липидных
бислоях различной кривизны. Также синтезирован антрилвинил (AV)-меченый сульфатид,
примененый для изучения свойств мутантного специфического к сульфатиду гликолипидпереносящего белка. С применением AV-меченого церамида исследованы закономерности
межмембранного перенос церамидов. С использованием ранее синтезированных AVмеченых гликолипидов проведено дальнейшее изучение строения и функций гликолипидпереносящего белка.
Проведено изучение структуры ДНК/липидных комплексов в связи с эффективностью
трансфекции. Найдено, что эффективнее те комплексы, в которых ДНК сильнее
экранирована.
Изучено взаимодействие некоторых цитотоксинов змей с фосфолипидными мембранами
разного состава. Найдено, что при таком связывании определяющую роль играют полярные
группы фосфатидилсерина.
Синтезированы флуоресцентные субстраты фосфолипазы А2, предназначенные для
исследования роли этого фермента в развитии патологических процессов при инфаркте
миокарда.
Изучено включение в липосомы фенантролиновых комплексов европия и их
цитотоксичность в опытах in vitro.
Гликоландшафт эукариотической клетки
Лаборатория углеводов
Предложен простой метод синтеза сиалоолигосахаридов со связью Sia2-6Gal; в
качестве гликозил-доноров используются гликозилхлориды N-ацетилнейраминовой кислоты,
N-гликолилнейраминовой кислоты, 9-замещенной N-ацетилнейраминовой кислоты, а также
олигомеров нейраминовой кислоты.
Разработан метод химического блок-гликозилирования защищенными трисахаридами
GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal-X и Gal1-3(Fuc1-2)Gal-X, что позволило с хорошими выходами
синтезировать четыре тетрасахарида с групповой специфичностью крови А и четыре
тетрасахарида с групповой специфичностью крови В.
Предложен дизайн липофильных молекул, способных контролированно встраиваться
в мембрану клетки таким образом, что головная часть (гликан или пептид) находится на
необходимом расстоянии от поверхности мембраны. Синтезированы такие варианты,
которые отличаются только гибкостью линкерной части, в то время как головная и липидная
часть одинаковы, а линкерная имеет ту же самую формальную длину. Проведено сравнение
лиганд-связывающих свойств таких пар, отличающихся только гибкостью линкера.
Проведено сравнительное изучение гликан-связывающих свойств (паттерна
специфичности) человеческих и куриных галектинов тандемного типа, находящихся в
составе живой клетки, выявлены аналогии и принципиальные отличия.
С помощью лиганд-специфической хроматографии из крови здоровых доноров были
выделены антитела к дисахариду 4'-SuLacNAc и трисахариду PK. Высокая специфичность
антител была показана с помощью гликочипа (400 гликанов), прямого и ингибиторного
ИФА. Оказалось, что первые антитела неспособны взаимодействовать с фрагментом
человеческих гормонов 4'-SuLacdiNAc, то есть не являются аутоантителами, участвующими
в элиминировании гормонов из кровотока. Показано, что антитела к трисахариду P k
не
взаимодействуют с гликосфинголипидом Gb3, полярная голова которого как раз и является
трисахаридом PK, если Gb3 встроен в мембрану клетки или искусственную мембрану. Из
всего этого мы делаем предположение, что естественные антитела против 4'-SuLacNAc и PK
не являются аутоантителами, а их функцией, по-видимому, является блокирование
патогенных бактерий, содержащих аналогичные олигосахаридные мотивы в структуре
липополисахарида.
С помощью гликочипа, содержащего 400 гликанов, изучена динамика уровня антигликановых естественных IgG и IgM антител у новорожденных. Показано, что уровень этих
антител у новорожденных ниже, чем у взрослых людей, а репертуар их сильно отличается, а
именно, некоторые из специфичностей не выявляются вовсе в момент рождения, но
появляются через несколько месяцев. Интересно, что анти-гликановые антитела класса IgM
обнаруживаются у новорожденных, хотя уровень их низкий.
Проверена гипотеза, согласно которой существуют естественные анти-гликановые
ауто-антитела, которые блокированы высоко-гликозилированными муцинами, и поэтому не
связываются с собственными клетками, несущими те же гликаны-антигены. Для этого
моноспецифические антитела выделяли из крови человека с помощью антигенспецифической хроматографии, а затем изучали их блокирование отдельными
гликопротеинами (в том числе муцинами), синтетическими аналогами муцинов, а также
сывороткой крови, лишенной антител данной специфичности. Ни один из этих
экспериментов не подтвердил гипотезу о блокировании антител аутологичными
растворимыми глико-молекулами.
Изучена роль галектинов как дополнительных или альтернативных факторов,
влияющих на процесс рецепции и на инфекционный потенциал вируса гриппа. Для этого,
галектины нагружали на клетки или на вирусы, и изучали изменения в степени адгезии
вируса на клетке, а также влияние на уровень инфекционности. Показано, что галектины
могут способствовать инфекционности вируса гриппа, особенно в ситуации, когда
канонический путь (где задействован гемагглютинин вируса гриппа и сиалорецепторы
клетки) запрещен или реализуется плохо. Данный эффект не абсолютен: некоторые из
исследованных галектинов не влияют на процесс адгезии, также как не все штаммы вируса
гриппа чувствительны к наличию галектинов.
Проведено сравнение активности нескольких пар вирусов гриппа, отличающихся
заменой аминокислоты H274Y в нейраминидазе; эти мутанты показали высокую
устойчивость к действию современного противовирусного лекарства тамифлю, в то время
как другое лекарство того же механизма действия (ингибирование нейраминидазы)
продолжало действовать на мутантные штаммы. Найдено, что все мутантные H274Y
штаммы гидролизуют сиалоолигосахариды точно так же, как штаммы дикого типа. Анализ
комплекса нейраминидазы с ее ингибиторами и олигосахаридами-субстратами позволяет
объяснить наблюдаемый эффект с молекулярной точки зрения, и говорит о том, что вирус
значительно легче находит функциональные мутации для "обхода" тех блокаторов
нейраминидазы, которые имеют меньшее структурное сходство с природной Nацетилнейраминовой кислотой.
Успешно проведен дизайн экспериментальной системы, основанной на методе
плазмонного резонанса, - для изучения динамики и констант связывания вируса гриппа с его
рецепторами. Для этого трисахариды 6'SLN
и 3'SLN, являющиеся рецепторами
человеческих и птичьих вирусов гриппа, соответственно, иммобилизовали на SPR чип и
изучили интервал условий, при которых наблюдается надежный сигнал связывания
очищенных вирусов. Найденные условия будут использованы в дальнейшем для детального
изучения динамики связывания вируса гриппа с его сиало-рецепторами.
Рецептор IRR как сенсор щелочного рН в организме
Лаборатория клеточной биологии рецепторов
Insulin receptor-related receptor (IRR) входит в семейство инсулинового рецептора, в
которое входят также инсулиновый рецептор (IR) и рецептор инсулино-подобного фактора
роста (IGF-IR). Хотя кДНК рецептора IRR была клонирована в 1989 году, функция этого
рецептора оставалась неизвестной до недавнего времени. Нами было показано, что, в
отличие от своих гомологов, IRR активируется совершенно неожидаемым образом, а именно
при защелачивании внеклеточной среды. Таким образом, IRR является сенсором
внеклеточной щелочной среды.
Для определения участков в молекуле IRR, отвечающих за рН-чувствительность этого
рецептора, нами были созданы химерные белки, в которых внеклеточные части IRR были
заменены соответствующими доменами инсулинового рецептора. Обработка щелочным рН
клеток, трансфецированных такими конструкциями, показала, что для активации IRR важны
первые три домена его внеклеточной части. Активация IRR щелочным рН приводит к
фосфорилированию каскадных внутриклеточных белков (IRS-1, AKT-1) и вызывает сильные
изменения в цитоскелете клеток. Таким образом, нами показано, что IRR является сенсором
щелочного рН, так как его активация специфична, дозо-зависима и приводит к изменению в
конформации молекулы IRR. Путем инъекции раствора бикарбоната в кровь крысы, нам
также удалось показать, что в условиях алкалоза IRR активируется в почках живой крысы,
тогда как при контрольном введении в кровь раствора соли той же молярности, что и раствор
бикарбоната, мы не наблюдали активации IRR в почках животного.
Для доказательства физиологической роли IRR была получена линия мышей,
нокаутных по гену IRR. Эксперименты, проведенные на нокаутных мышах, показали, что у
них отсутствует нормальный компенсационный ответ на экспериментально-индуцированный
алкалоз, выраженный в недостаточном удалении избыточного бикарбоната почками.
Для исследования разницы секреции бикарбоната в мочу у нокаутных мышей и
мышей дикого типа, мы индуцировали алкалоз у мышей в течение 7 дней, а затем выделяли
мембранную фракцию коры почек. Затем методом Вестерн-блота проводили детекцию
бикарбонатного обменника пендрина и протонного насоса Atp6V, которые экспрессируются
в бета-вставочных клетках. Так, мы показали, что нокаутные мыши при бикарбонатной
нагрузке имеют пониженную экспрессию (приблизительно на 40-50%) обменника пендрина
и протонного насоса Atp6V в клетках кортекса почки по сравнению с мышами дикого типа.
Данный результат указывает на то, что функция рецептора IRR в почках сопряжена с их
секреторным потенциалом.
Мы провели сравнение параметров крови и мочи у нокаутных по IRR мышей и
мышей дикого типа в условиях щелочной нагрузки. Оказалось, что у мышей с нокаутом гена
insrr содержание бикарбоната в крови и гематокрит были выше, чем у животных дикого
типа. Остальные параметры крови практически не отличались. Во второй серии опытов
метаболический алкалоз индуцировали внутривенным введением 1.3% раствора NaHCO 3.
Параметры крови определяли в начале опыта, через 5 и 15 мин после щелочной нагрузки.
Через 5 мин после инъекции щелочного раствора динамика изменения концентрации
бикарбоната и рН крови у мышей с нокаутом IRR была такой же, как и у мышей дикого типа,
т.е. наблюдалось повышение рН, а также содержания бикарбоната. У мышей обеих групп
через 15 мин после индукции алкалоза рН крови стал несколько ниже, чем через 5 мин.
Однако у мышей с нокаутом IRR через 15 мин отмечено существенное повышение
содержание бикарбоната и концентрации СО2 в крови по сравнению с мышами дикого типа.
Таким образом, животные дикого типа и с нокаутом гена insrr по-разному реагировали на
острый экспериментальный алкалоз, вызванный введением бикарбоната в кровь. Результаты
изучения компенсации индуцированного алкалоза в острых (5–15 мин) условиях
подтверждают нашу гипотезу о компенсаторной роли IRR в секреции бикарбоната.
Таким образом, мы можем заключить, что IRR является существенной частью одного
из физиологических механизмов регуляции кислотно-щелочного равновесия, а линия мышей
с нокаутом IRR может найти применение в качестве животной модели патологического
развития метаболического алкалоза.
Исследование действия иммуносупрессоров на модели химически индуцированного
аутоиммунитета
Группа экспериментальной биологии с виварием
В рамках научно-исследовательской работы проведено исследование способности
мышей аутбредного стока CFW развивать системный аутоиммунный процесс под действием
хлорида ртути. Были изучены основные характеристики аутоиммунного процесса –
образование аутоантител к белкам ядрышка, увеличение уровня общих сывороточных
иммуноглобулинов классов IgG1 и IgE и отложение иммунных комплексов в почках.
Исследование проводилось путем скрининга сывороток животных с целью определения
титра аутоантител методом иммуноцитохимии, концентрации иммуноглобулинов методом
иммуноферментного анализа, а титра иммунных отложений- методом иммуногистохимии.
Было показано, что хлорид ртути в дозе 1,6 мг/кг при введении 2 раза в неделю в течение 6
недель приводит к возникновению аутоантител к ядрышковым белкам в высоких титрах,
увеличению в 3-5 раз общих сывороточных IgG1 и IgE и отложению иммунных комплексов
как в клубочках, так и в сосудах почек.
Поиск новых ингибиторов герпесвирусной тимидинкиназы с помощью компьютерного
моделирования
Лаборатория изотопных методов анализа
Проведено клонирование и экспрессия ТК эталонного штамма ВПГ-1. Наработан и
очищен с помощью ионообменной и аффинной хроматографии препарат фермента,
пригодный для энзимологических исследований. Проведена биохимическая характеристика
полученного фермента.
Изучение структурно-функциональной организации антител G класса в процессе
формирования адаптивного иммунитета в норме и при вторичных иммунодефицитах
Группа кросс-сшивающих ферментов
На модели животных установлен алгоритм развития вторичной иммунологической
недостаточности (ВИН) с выделением доклинической и клинически выраженной стадии
заболевания. Получены доказательства, что в развитии ВИН узловую роль играют
расстройства процессов созревания антител G класса в плазматических клетках (ПК),
ведущие к преимущественной
(до 75-95%) секреции функционально неактивных
низкоавидных антител, которые возникают на самых ранних этапах агрессии этиотропных
агентов, предшествуют расстройствам других звеньев иммунитета и клиническим
проявлениям иммунодефицитных синдромов. Установлено, что супрессия фолдинга антител
в плазматических клетках не зависит от интенсивности процессов пролиферации и
дифференциации аффинных к антигену клонов В-лимфоцитов в ПК.
Проведены работы по изучению особенностей формирования иммунного ответа в норме
и начаты - при ВИН-синдроме с определением уровня антителогенеза специфических к
иммуногену антител G класса, их авидитета и конформационного состояния молекулы на
различных этапах иммунного ответа.
На основании определения содержания и диапазона колебаний двух дискретных групп
антител G класса к антигенам грам+/- бактерий (с высоким и низким авидитетом) у здоровых
доноров и пациентов с различными проявлениями иммунодефицитных синдромов
разработаны критерии дифференциации пациентов по степени выраженности ВИН на:
здоровых,
условно здоровых, с повышенным риском развития ВИН (состояние
предболезни), с латентнотекущими формами ВИН или с клиническими проявлениями
иммунодефицитных синдромов вне зависимости от наличия или отсутствия изменений в
показателях иммунограммы 1-2-го уровней.
Ингибиторы лизилоксидазы – лекарственные средства нового поколения,
замедляющие метастазирование опухолей
Группа кросс-сшивающих ферментов
К основным достижениям следует отнестикартирование интерактома лизилоксидазы
при помощи скрининга нормализованных библиотек кДНК человека. К настоящему времени
удалось провести систематизацию идентифицированных при помощи двугибридного
скрининга больших библиотек кДНК белков, способных взаимодействовать с
лизилоксидазой, – исключены ложноположительные клоны. Всего выявлено 12 белковинтеракторов с высокой степенью конфидентности в соответствии с ранее выработанными
критериями. Наибольший интерес привлек белок SOS2 (аббревиатура от английского Son Of
Sevenless); сайт взаимодействия с лизилоксидазой этого белка был обнаружен в так
называемом домене, богатом пролином. Этот белок-интерактор способствует диссоциации
ГДФ от ГТФазы ras, что стимулирует сигнальную трансдукцию при действии ряда ростовых
факторов. В настоящее время начато изучение возможной роли идентифицированных
взаимодействий в механизме прометастатической активности лизилоксидазы.
Интересным достижением также является продукцию прокариотического гомолога
лизилоксидазы. Большинство известных геномов животных, но не растений и грибов,
содержат от одного до пяти генов лизилоксидазы, что подчеркивает ее важную роль именно
для животных организмов. В подавляющем большинстве прокариотических геномов гены
лизилоксидазы отсутствуют, но тем интереснее наличие истинных гомологов лизилоксидазы
у некоторых неродственных бактерий, что, возможно, отражает уникальную историю этого
своеобразного фермента. Данный аспект представляет чрезвычайный интерес не только с
филогенетической точки зрения, но также и для возможных биотехнологических
приложений. Поэтому мы, используя синтез гена, впервые осуществили продукцию
рекомбинантной лизилоксидазы термофильной эубактерии Truepera radiovitrix и приступили
к исследованию ее каталитических свойств.
Изучение интерактомов белков, важных для роста раковых клеток
Группа мембранных биоэнергетических систем
К настоящему времени удалось разработать новый метод измерения конформационной
динамики трансглутаминазы TG2 в живых клетках, используя FRET, что позволило
локализовать разные конформации до и после индукции апоптоза. Нами было показано, что
значительное количество ТГ2 внутри клетки разполагается внутри эндосом в так называемом
околоядерном рециркулируемом компартменте (PNRC) и имеет «закрытую» конформацию.
Напротив, трансглутаминаза, расположенная в цитоплазме, концентрируется в
непосредственной близости от плазматической мембраны, находясь в «открытой», т.е.
каталитически активной конформации. После индукции апоптоза стауроспорином
происходит быстрая активация цитоплазматической ТГ2.
В 2011 году удалось закончить исследование роли димеризации белка сурвивина в его
взаимодействиях с другими белками и, соответственно, в регуляции апоптоза, что имеет
важнейшее значение для выживания раковых клеток. Ранее предполагалось, что все свои
функции сурвивин выполняет только ввиде гомодимера. Используя мутант сурвивина не
способный к димеризации, нами было показано, что мономер сурвивина in vitro и in vivo
способен взаимодействовать с такими белками как Smac/DIABLO и XIAP, что позволяет ему
защищать клетки от каспаззависимого апоптоза. Кроме этого, мы показали, что мутант
сурвивина не образующий димеров, блокирует выход AIF из межмембранного пространства
митохондрий и таким образом защищает клетки фибросаркомы человека HT1080 и от
каспазнезависимого апоптоза. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что сурвивин
выполняет часть своих функций находясь ввиде мономера, а часть ввиде димера, и механизм
регуляции равновесия мономер-димер, может может служить для «переключения» между
различными функциями сурвивина.
Молекулярный дизайн и синтез низкомолекулярных биологически активных
соединений и их аналогов.
Лаборатория оргнического синтеза и группа биоконъюгации
Разработан
удобный
препаративный
метод
синтеза
5-бром-N-ацетил-3ацетоксииндола. Совместно с ИОХ РАН разработан метод синтеза хромогенных конъюгатов
замещенных 3-гидроксииндолов с N-ацетилнейраминовой кислотой, основанный на
использовании N,N-диацетилнейраминовой кислоты.
Для проведения иммунофлуоресцентного анализа разработан синтез флуоресцентных
производных для определения малахитового зеленого, бриллиантового зеленого и 3(4гидрокси-3,5-дибромфенил)пропионовой кислоты.
Разработан метод увеличения эффективности флуоресцентных ДНК-зондов, принцип
действия которых основан на образовании эксимеров 1-фенилэтинилпирена. Показано, что
модификация зонда двумя остатками LNA-нуклеотидов (LNA = locked nucleic acid)
позволяет увеличить аффинность зонда и квантовый выход флуоресценции красителя.
Полученные результаты могут быть использованы в дизайне новых типов флуоресцентных
ДНК-зондов. Разработаны методы получения конъюгатов флуоресцентных неорганических
нанокристаллов (квантовых точек) с флуоресцентными красителями, олигонуклеотидами и
ДНК с помощью катализируемой медью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения
азидов и алкинов. Проведена систематизация литературных данных о методах получения
конъюгатов квантовых точек и ДНК. Разработан способ синтеза изомерно чистых
производных 4',5'-дихлоро-2',7'-диметокси-5(6)-карбоксифлуоресцеина (JOE). Совместно с
группой Н.Б. Пестова (ИБХ РАН) ведется работа по синтезу модифицированных ДНКаптамеров.
Продолжается
разработка
масс-спектрометрических
меток
на
основе
триарилметильных и других стабилизированных карбокатионов для детекции
специфических последовательностей ДНК. Продолжаются исследования по синтезу новых
типов флуоресцентных ксантеновых красителей (этинилоги флуоресцеинов и родаминов).
Проводится исследование по дизайну флуорогенных зондов для ПЦР в режиме
реального времени. Получены зонды, содержащие один или два остатка красителя и один
или два остатка тушителя флуоресценции.
Разработан метод синтеза конъюгата антитела с протяженным олигонуклеотидом.
Такой конъюгат обладает способностью связываться с антигеном. Олигонуклеотидная часть
конъюгата служит матрицей для ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, этот
конъюгат является ключевым инструментом в диагностической системе, основанной на
принципе иммуно-ПЦР. Разработаны методы синтеза олигоглицинов с N-бензильной
защитной группой, препятствующей самоассоциации олигоглицинов в процессе синтеза.
Поводится разработка методов синтеза псевдопептидов
со stealth-свойствами.
Разработана стратегия синтеза CMG-содержащих пептидов. В первом типе повторяющиеся
звенья расположены «голова к хвосту», и соответственно, псевдопептид имеет один
терминальный С-конец и один N-конец – как в обычных пептидах. Во втором типе
повторяющиеся звенья связаны карбоксильными группами, в результате образуются
псевдопептиды с двумя аминогруппами, распложенными по двум концам цепи. В третьем
типе повторяющиеся звенья связаны аминогруппами, что приводит к образованию
макромолекулы с двумя карбоксильными группами на концах цепи. Наличие трех типов
CMG-содержащих пептидов предоставляет возможность создания более сложных молекул,
используя CMG-линкеры.
Разработаны методы синтеза и синтезированы в препаративных количествах 35 новых,
ранее неописанных производных 2,3-диаминонафтохинона: а) 2-хлор-3-аминоарил-1,4хиноны, б) 2-циклоалкиламино-3-аминоарил-1,4-нафтохиноны.
Синтез биологически активных фрагментов и компонентов нуклеиновых кислот, их
аналогов и миметиков и изучение их физико-химических и биологических свойств
Лаборатория химии нуклеиновых кислот
Были продолжены исследования по синтезу и изучению свойств аналогов
нуклеиновых кислот.
В частности,
проведен скрининг различных защитных и
модифицирующих групп для 2´-гидроксила рибонуклеотидных мономерных синтонов для
синтеза фрагментов РНК фосфотриэфирным методом с использованием О-нуклеофильного
катализа. Усовершенствованы схемы синтеза мономерных синтонов, содержащих 2’-Оазидометильную,
2’-О-азидоэтильную,
2´-О-(азидометил)бензоильную,
2´-О-(пнитробензилокси)метильную, 2´-О-метоксиметильную и др. защитные и модифицирующие
группировки и О-нуклеофильную каталитическую 4-метокси-1-оксид-2-пиколильную
фосфат-защитную
группу.
Полученные
синтоны
тестировались
в
синтезе
олигорибонуклеотидов. В результате была разработана высокоэффективная методология
автоматического синтеза природных и модифицированных олигорибонуклеотидов,
открывающий перспективу для эффективного твердофазного синтеза стереоспецифических
фосфоротиоатных аналогов олигорибонуклеотидов и их 2´-О-модифицированных аналогов.
Кроме того, синтоны, содержащие по 2´-О-положению азидосодержащие группировки, после
введения в природные олигонуклеотиды использованы для постсинтетической модификации
последних различными метками и функциональными группами через азидную функцию.
Проверка эффективности гибридизационного взаимодействия олигорибонуклеотидов,
содержащих модифицирующие 2’-О-азидометильную и 2´-О-метоксиметильную группы с
комплементарными фрагментами ДНК и РНК показала, что наличие этих группировок не
оказывает значительного влияния на специфичность связывания олигонуклеотидов и
стабильность образованных ими дуплексов, поэтому подобные производные являются
перспективными соединениями для молекулярно-биологического применения. Кроме того,
разработана общая схема получения мономеров, содержащих различные 2´-Оалкоксиметильные группировки, введение которых в состав цепи олигонуклеотида,
позволило бы осуществлять ковалентное присоединение репортерных групп, например,
флуоресцентных и спиновых меток, меток для электрохимической детекции НК, а также
получать конъюгаты НК с соединениями, облегчающими их проникновение в клетку
(холестерин и поликатионные молекулы) и с биополимерами, осуществляющими их
адресную доставку (пептиды и углеводы).
В области разработки методов получения кросс-сшитых НК с помощью различных
бифункциональных реагентов проведено изучение структуры сшивок ДНК под действием
производных s-триазина, в частности тримеламола и N 2, N 4, N 6-триметилмеламина,
использующихся при лечении онкологических заболеваний. С этой целью был получен
конъюгат флуоресцентного красителя 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3a,4a-диаза-sиндацен-8-пропионовой кислоты (BODIPY) и N 2, N 4, N 6-триметилмеламина. Показано, что
последний в присутствии формальдегида способен образовывать кросс-сшивки ДНК in vitro
и что остаток триазина входит в состав образующегося при этом аддукта. С той же целью
начато изучение способности ряда ароматических диаминов давать кросс-сшивки ДНК в
присутствие форомальдегида. Эксперименты по определению предпочтительных участков
образования поперечной сшивки в двухцепочечной ДНК под действием этих реагентов, а
также по определению структурных особенностей образующихся при этом ДНК-аддуктов
продолжаются.
Изучение механизмов дальнего транспорта белков и РНК геномов по растению
Группа Молекулярная диагностика
С помощью метода дрожжевой двугибридной системы были найдены некоторые
ядерные белки-партнеры 4/1 белка. Среди них нуклеопорин NUP155 и компонент
экзосомного комплекса RRP43, а также транскрипционные факторы растений. Выявлены
взаимодействия с: 1) представителем семейства транскрипционных факторов типа C(2)H(2),
несущим структуру цинкового пальца; 2) фактором ATAF2; 3) этилен-чувствительным
фактором ERF03 (EREBP) и 4) гомеодоменным фактором BLH1. Все обнаруженные
транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с белком 4/1, участвуют в ответе
на условия биотического или абиотического стресса, что указывает на возможное участие
белка 4/1 в развитии ответной реакции на стрессовые условия. BLH факторы способны
образовывать ряд гетерологичных белок-белковых комплексов с другими гомеодоменными
транскрипционными факторами (например, STM). Ряд таких факторов обладают
способностью перемещаться от клетки к клетке подобно белку 4/1, но не транспортируются в
ядро в отсутствие BLH. Так как BLH1 способен связывать 4/1 белок, то можно
предположить, что между ними существует функциональное взаимодействие. Растительный
аналог белка животных и человека BAP31, играющего важнейшую роль в сортировке
интегральных мембранных белков из Nicotiana benthamiana, также является белкомпартнером Nt-4/1 белка. Причем сила и репрезентативность их взаимодействия в дрожжевой
двугибридной системе намного превосходит других партнеров Nt-4/1.
Была изучена субклеточная локализация белка 4/1 и его мутанта NDR при коэкспрессии с вироидной РНК. Мутант NDR локализовался во флоэме вне зависимости от
присутствия вироида. Ко-экспрессия с вироидом стимулировала локализацию белка 4/1
дикого типа во флоэме. При низкой концентрации агробактерий (менее 0,3 ОЕ) флоэмная
локализация наблюдалась лишь иногда, флоэмная локализация белка дикого типа сильно
зависит от условий выращивания растений (длина светового дня) перед агроинокуляцией.
Выращивание при длине светового дня равной 4 часа, 4/1 белок локализуется во флоэме
даже в отсутствие вироида. Ко-экспрессия 4/1 с вирусным супрессором сайленсинга,
способным связывать двуспиральные РНК, подавляет появление белка во флоэме. Белок
дикого типа также проявляет динамическую локализацию в листе и способен накапливаться
в минорных жилках листа. Этот тип локализации стимулируется коротким световым днем
при выращивании растений и ко-экспрессией с вироидом. Однако, ко-экспрессия с
ингибитором сайленсинга р19 блокирует флоэмную локализацию 4/1.
Обнаружена способность белка Nt-4/1 связывать двухцепочечную РНК вироида
клубней картофеля (potato spindle tuber viroid, PSTVd) (неопубликованные данные). Что
позволяет предположить, что 4/1 белок принимает участие в переносе различных видов
двухцепочечных РНК, и, таким образом, вовлечен в процессы роста, развития и/или ответа
растений на вирусные инфекции. Согласно этому предположению растительный белок 4/1
может участвовать в одном из путей процесса «умолкания генов» у растений.
Поиск пептидных маркеров рака яичника в сыворотке крови человека при помощи
протеомных технологий.
Лаборатория протеомики
Тандемной масс-спектрометрией, сопряженной с обращено-фазной ВЭЖХ, в образцах
сыворотки крови практически здоровых доноров (42), пациенток с раком яичников (17),
больных с колоректальным раком (14) и сифилисом (12) было идентифицировано 1935, 724,
527 и 620 пептидов, соответственно. Всего было идентифицировано 2732 неповторяющихся
пептида, являющихся фрагментами1778белков.
В результате коррекции построенной на предыдущем этапе исследований
математической модели, предназначенной для классификации масс-спектрометрических
профилей сыворотки крови, были получены значительно более высокие значения ее
специфичности по отношению к таким доброкачественным гинекологическим заболеваниям,
как аденомиоз (100%), миома матки (100%), гиперплазия эндометрия (72,7%),
доброкачественные новообразования яичников (100%), кистозный эндометриоз яичников
(88,9%). Специфичность ранее построенной модели по отношению ко всем перечисленным
заболеваниям женской репродуктивной системы была хуже 50%.
Протеомный анализ мха Physcomitrella patens
Лаборатория протеомики
Для исследования протеома протопластов использовали 1D электрофорез в
денатурирующих условиях с последующим анализом триптических пептидов методом
условиях с последующим анализом триптических пептидов методом nano_LC-ESI-MS/MS.
Данный подход позволил выявить 408 белков. Кроме того, для анализа изменений протеома
протонемы при получении протопластов использовали двумерный электрофорез с
дифференцирующим окрашиванием. Было установлено, что происходит распад ряда белков
(преимущественно хлоропластных).
Проведено исследование пептидома протопластов, полученных из протонемы мха. Для
анализа брали протопласты и точки регенерации 24, 48 и 72 часа. Полученные результаты
проанализированы с помощью нескольких поисковых машин, идентифицированы
пептидогенные белки. Установлено, что в процессе выделения протопластов происходит
деградация многих клеточных белков и в первую очередь белков фотосинтетического
аппарата. Изучение пептидома протопластов в процессе регенерации показало, что
происходит снижение общего количества пептидов в клетках, восстанавливается
фотосинтетическая активность.
Изучение биологически активных пептидов – ингибиторов ревертазы ВИЧ-I из
морских беспозвоночных (морские черви)
Лаборатория биотехнологии
Продолжена работа с пептидами из червя №75. После уже описанных в отчёте за
2010г. двух стадий выделения пептидов из червя №75 (см. «Схему делений»), полученные
вещества были поделены на колонке С-18 ВЭЖХ (дел.I и II). Деление каждой из загрузок
проводили дважды, чтобы иметь возможность сделать запись для фракций, выходящих с
колонки, отдельно при 220нм, а в следующем делении - при 280нм. В каждом делении
отобраны фракции, элюируемые при одинаковом времени выхода (τ в мин.) и обладающие
биологической активностью (БА) - ингибиторной способностью к обратной транскриптазе
или ревертазе (RТ-аза). Таким образом после деления I собрали три группы фракций:
начальные (τ от 6 до 15мин.), срединные (τ от 20 до 30мин.) и конечные (τ 32-34мин.).
Затем подобным образом были поделены фракции в делении II. Здесь были собраны
проявившие БА по RТ-азе фракции: начальные (τ 6-8мин.), срединные (23-30 мин.) и
конечные (34.3 мин.).
В результате, в делении I в составе начальных фракций отфиксировано вещество – τ
6- 6.3 мин., m 698, дающее полное ингибирование RТ-азы. Из срединных фракций в
делении 2 пики с τ 25-27 мин. и τ 27-30 мин. показали 85% остаточную активность.
Деление 3 дало лучшие результаты – фракции с τ 24-26 мин. обладали 32%-ной остаточной
активностью. В делении 7 срединные фракции (18-21 и 21-24 мин.) показали 50%
ингибирование.
Более активными оказались фракции из деления II (см. cхему) на колонке ВЭЖХ С-18.
Здесь даже начальные фракции (в делениях 5 и 10, 6 и 11) проявили хорошую активность,
например, остаточная БА для фр. 3 дел. 5 (τ 8 мин.) была 33%, фр. 2 дел.10 (τ 6 мин.) –
менее 10%, фр. 2 и 3 дел.6 (τ 7 мин.) – 27%.
И срединные фракции из этих делений были наилучшими: дел. 5 фр. 7 дала ингибирование
до 40% (и отфиксирована масса 1107Да). Фр.4 из дел.10 (пик 23,7 мин.) показала полное
ингибирование. В УФ-спектре этой фракции отмечен максимум 273нм (возможно наличие
ароматических аминокислот). Соответственно, в следующей паре делений (дел.6 и11),
загрузкой которых были более поздние фракции с колонки Р-60, отмечены: фракция 7 (τ
22-23 мин.) - ингибирование до 70%, следующий пик дел.8 (τ 23-27 мин.) – ингибирование
до 50%. Среди дальних фракций отмечен во всех делениях пик с τ 34,4 мин., содержащий
ароматику и дающий ингибирование до 40% остаточной активности. Выделенные БА
вещества изучаются.
Продолжена работа с пептидами из червя № 81 (Курильский вид). Изучены фракции
после колонки ПХР и деления на Р-60 (4). Получены фракции 12- 13 (фр. 3) и фракции 1517 (фр. 4) из области низкомолекулярных веществ (~ m 1КДа) с очень хорошей БА: для
фракции 3, БА упала до 37%, а 2 мкл фракции 4 (ОП280 0,12о.ед.) вызвали падение до 16%
остаточной
активности ревертазы. УФ-спектр этой фракции показал возможное
присутствие фенилаланина.
Функциональное влияние ионов магния на физиологическую активность
Cа2+-связывающих белков в сигнальных системах клетки.
Лаборатория химии белка ФИБХ
Продолжено изучение влияния ионов магния на структурные свойства рековерина
дикого типа и его мутантные формы с выключенными кальций связывающими центрами.
Методом люминесцентной спектроскопии проведено исследование эффективного сродства
рековерина к катионам кальция, в зависимости от концентрации свободного магния. Также
исследовано эффективное сродство рековерина к катионам магния, в зависимости от
концентрации ионов кальция. Проведён анализ зависимости термостабильности рековерина
от концентрации кальция и магния в растворе. Совокупность полученных данных указывает
на наличие в рековерине магний-специфичного центра, отличного от сильных кальций
связывающих центров белка.
Исследование особенностей регуляции ангиогенеза
Лаборатория химии белка ФИБХ
Самоформирующиеся пептиды способны образовывать из мономеров сложные
упорядоченные олигомерные структуры, имеющие потенциал использования в технике и
медицине. Так, филаменты, образуемые пептидом NH2-(RADA)4-COOH могут найти
применение в качестве среды для пролиферации клеток в тканевой инженерии, в частности,
при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ишемией.
Процесс образования филаментов из NH2-(RADA)4-COOH был исследован in silico
моделированием молекулярной динамики в Amber11 в явном водном окружении и силовом
поле ff03 пептидных мономеров, димеров, тетрамеров, октамеров и додекамеров с
использованием докинга в HEX6.1 в режиме учета геометрии модели и поверхностных
зарядов, а также GRAMM-X.
Анализ энергии образования комплексов ΔG, ΔµGBSA, EMM демонстрирует тенденцию
к образованию олигомерных структур. Данные по RMSd и RMSf, а также карты
Рамачандрана доказывают уверенную стабилизацию структур, начиная с тетрамера.
Показано, что ядром образования филамента можно считать тетрамер, в котором βантипараллельные структуры димеров стабилизируются гидрофобными взаимодействиями
остатков Ala между димерами, а сам филамент представляет собой двухслойную структуру,
где внутри каждого слоя присутствуют β-антипараллельные структуры, а слои связаны
между собой гидрофобными взаимодействиями.
Изучение структуры и субстратной специфичности ферментов высокоактивного
бактериолитического комплекса, продуцируемого бактерией Lysobacter sp. XL1.
Лаборатория химии белка ФИБХ
Фундаментальной задачей, на решение которой направлен данный проект, является
исследование первичной структуры и субстратной специфичности бактериолитических
ферментов, продуцируемых бактерией Lysobacter sp. XL1. Ранее были выделены 5
бактериолитических ферментов, один из которых оказался, как ранее было показано,
гомологом альфа-литической эндопептидазы бактерии Lysobacter enzymogenes, а 4 других
оказались новыми неизвестными ранее белками, по N-концевым аминокислотным
последовательностям (от 15 до 20 аминокислотных остатков) не имеющим гомологии с
аминокислотными последовательностями, представленными в международных банках
белковых структур. N-концевые последовательности этих белков зарегистрироваы нами в
международной базе белковых структур UniProt (UniProtKB/Swiss-Prot accession numbers: L1
– P85142, L2 – P85143, L3 – P85152, L4 – P85155, L5 – P85158). Ферменты обладают
различной специфичностью и способны гидролизовать пептидогликаны клеточных стенок
различных типов бактерий. Изучение бактериолитических ферментов представляет особый
интерес также в связи с их способностью расщеплять пептидные связи, образованные Dаминокислотами, являющихся компонентами пептидогликана клеточных стенок бактерий. В
результате работы получены следующие результаты:
1. Методами белковой химии проведен анализ первичной структуры одного из
труднодоступных бактериолитических ферментов, фермента L2 (~ 25 kDa), секретируемого
бактерией Lysobacter sp. XL1 в минорных количествах, однако, вносящего свой вклад в
расширение спектра атимикробной активности бактериолитического комплекса. Ранее было
показано, что фермент L2 является амидазой, расщепляющей в пептидогликане связь между
N-ацетилмурамовой кислотой и L-аланином.Для выделения бактериолитического фермента
L2 был получен малоактивный штамм Lysobacter sp. XL2, не секретирующий фермент L1 ,
но секретирующий повышенное количество фермента L2 по сравнению со штаммом XL1., и
разработана схема выделения белка. В результате был получен электрофоретически
гомогенный препарат в количестве около 0.5 мг, что дало возможность приступить к
изучению его первичной структуры. Осуществлен гидролиз белка трипсином, полученная
смесь фрагментов разделена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,
установлена структура 15 триптических пептидов, в сумме составляющих около 165
аминокислотных остатков, это дает возможность синтезировать зонды для выделения
кодирующей этот белок ДНК и приступить к определению его структуры, что является
целью дальнейшей работы.
2. Совместно с одной из лабораторий ИБФМ им.Г.К.Скрябина РАН определена первичная
структура внеклеточного бактериолитического фермента L5, продуцируемого бактерией
Lysobacter sp. XL1. Полученные нами данные об аминокислотной последовательности N-
концевого и внутренних участков молекулы бактериолитической эндопептидазы L1
позволили определить нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК Lysobacter sp. XL1
размером около 8 т.п.н., в составе которого идентифицированы две ОРС. Одна, размером
1197 п.н., кодирует эндопептидазу L1, вторая ОРС, размером 1200 п.н. кодирует
гомологичную ей (степень гомологии 59%) последовательность, которая по N-концевой
последовательности, определенной
нами ранее, соответствует полипептидной цепи
бактериолитической эндопептидазы L5.
3. Проведено частично изучение субстратной специфичности бактериолитического фермента
L5. При этом установлено, что фермент L5 активно разрушает клеточные стенки ряда
нативных и автоклавированных микроорганизмов. Показано, что фермент L5 является
эндопептидазой, и не проявляет мурамидазную активность. Особенно интересным
результатом является то, что фермент L5 обладает способностью разрушать клеточные
стенки нативных клеток грамотрицательных бактерий.
Синтез пептидов - агонистов неопиоидного рецептора бета-эндорфина и изучение их
активности при различных стрессорных воздействиях
Лаборатория пептидных биорегуляторов ФИБХ
Синтезированы октарфин TPLVTLFK, его циклические мономер и димер и
исследована их активность на моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у
крыс in vivo. Установлено, что все три пептида в дозе 1 мкг/кг корригируют, а в дозе 10
мкг/кг нормализуют содержание кортикостерона и катехоламинов в надпочечниках и плазме
крови крыс, подвергнутых геморрагическому шоку. Стресс-протекторное действие
октарфина и циклопептидов было зафиксировано также у крыс, подвергнутых гипоксии:
интраназальное введение пептидов в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до “подъёма”
нормализовало содержание кортикостерона и адреналина в надпочечниках и крови.
Аналогичный результат был получен на моделях холодового и теплового шока у крыс in
vivo: троекратное интраназальное введение крысам октарфина или его циклических
мономера и димера в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до шока
предотвращало резкое возрастание секреции кортикостерона и катехоламинов из
надпочечников в кровь, а также устраняло изменения содержания свободного гистамина и
активности диаминоксидазы в миокарде. Во всех изученных случаях циклодимер октарфина
был наиболее активен. На основании полученных результатов сделано заключение о
целесообразности дальнейшего исследования октарфина и его циклического димера в
качестве потенциальных стресс-протекторов.
Изучение продуктов побочных реакций в синтезе биологически активного пептида –
гормона трипторелина с целью оптимизировать его синтез и последующую очистку
Группа инструментальных методов синтеза ФИБХ
В ходе выполнения работы была исследована возможность устранения побочных
продуктов в синтезе гормона трипторелина pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, с целью повысить его выход. Синтез проводился с использованием Вос-стратегии на
твердой фазе (смоле Меррифильда) с последующим отщеплением пептида аммиаком. Были
отработаны несколько схем синтеза. В первой использовались аминокислоты без защит
боковых функциональных групп. Выяснилось, что этот способ дает самый низкий выход
продукта, менее 5%, так как сопровождается большим количеством побочных реакций.
Другой метод синтеза – использование только защищенных по боковым функциям
триптофана (Trp(For)) и гистидина (His(Tos)), что дало возможность повысить конечный
выход пептида, вероятно, за счет исключения алкилирования триптофана и эпимеризации
гистидина.
Однако, использование незащищённого по боковой цепи серина приводит к
накоплению продуктов олигомеризации серина, его О-ацилированных форм и продуктов
разложения этих соединений. По данным ВЭЖХ\МС в продукте присутствовала примесь
продукта включения лишнего остатка серина в количестве до 9%. Это согласуется с
литературными данными о том, что в ходе кондененсации с активированнными эфирами
незащищённого по боковой цепи серина протекает процесс О-ацилирования. Затем при
раскислении проходит миграция O,N-миграция серина, приводящая в нашем случае к
получению H-JHWSSYwLRPG-NH2. С помощью ВЭЖХ\МС был найден ряд побочных
продуктов возникающих в условиях аммонолиза. Например, продукт вероятной замены ОНгруппы серина на амино-группу, образующийся путём элиминирования с
модифицированного серина ацил-анион по типу реакции ретро-Михаэля, а затем
присоединения аммиака по двойной связи.
Для подавления побочной реакции ацилирования серина была сделана попытка
использовать его защищённое по боковой цепи производное, N-,O-полуаминаль метаналя
(ΨH,HPro). Таким методом была исключена димеризация серина. Однако, удаление
метиленового мостика в условиях снятия Boc-защиты приводило к O-ацилированию серина
и последующим осложнениям. И, наконец, был использован метод временного
силилирования гидрокси-групп серина и тирозина перед проведением реакции конденсации.
Применение этой схемы позволило исключить О-ацилирование тирозина, но не серина.
Количество и физико-химические свойства возникающих примесей не позволяют проводить
эффективную очистку продукта ни в одном из найденых нами хроматографических способов
выделения [D-Trp6] LH-RH. Вариант разделения с помощью ВЭЖХ на обращённофазном
сорбентее С18 приводил к выделению около 5% продукта. В качестве альтернативного
хроматографического метода разделения была выбрана распределительная хроматография на
силикагеле. Используя стандартные смеси растворителей для данного метода разделения
(галогеналканы-спирты-вода-кабоновые кислоты) нами были найдены условия в которых
удавалось выделять целевой продукт в количестве до 35 % от теоретически возможного.
Усовершенствование метода анализа трипторелина (подбор колонки, градиента) позволило
обнаружить разницу в степени чистоты образцов полученных после деления на обращённой
фазе и на силикагеле. Первые содержали до 15 % примесей, вторые оказались более
загрязнёнными. Основную проблему очистки создавали продукты побочных реакций по
незащищённому серину, которые имеют незначительное отличие во временах удерживания
относительно трипторелина.
Оптимизация синтеза новых и известных реагентов для пептидного синтеза.
Методологические проблемы синтеза пептидов
Лаборатория химии пептидов ФИБХ
Синтезированы 4 новых гетеробифункциональных реагента на основе моно-Nгидроксисукцинимидного эфира глутаровой кислоты, вторую карбоксильную группу
которой превращали в сложный тиоэфир. В качестве тиольной компоненты использовались
различные N-ацилпроизводные цистеамина и 4,6-диметилпиримидинтиол-2, не обладающие
ярко выраженным запахом, свойственным более летучим меркаптанам. Однако более
существенными преимуществами синтезированных конструкций следует считать
возможность а) тонко подстраивать электрофильность тиоэфирной функции посредством
варьирования электронных свойств N-ацильного заместителя в производных первого типа и
б) манипулировать реакционной способностью производных пиримидинтиола путём
изменения рН реакционной среды. Работоспособность новых реагентов продемонстрирована
в реакциях коньюгации методом нативной химической сшивки (NCL) на модельных парах:
первичный амин/пептид с N-концевым цистеином.
Исследование механизма взаимодействия кальций связывающего белка акворина с его
функциональным партнером – зеленым флуоресцентным белком (GFP).
Группа биоинженерии репортерных белков ФИБХ
Получен ряд генно-инженерных конструкций, кодирующих гибридный белок eGFPAeq,
содержащие мутации в донорном модуле(акворине). Исследование физико-химических
свойств полученных мутантных белков позволили локализовать аминокислотные остатки,
ответственные за Са-индуцированное взаимодействие донорного модуля с eGFP,
расположенные ( по данным рентгеноструктурного анализа) в псевдо петле акворина,
контактирующей с первой Са петлей. Биолюминсцентный анализ переноса энергии
мутантных белков позволил конкретизировать аминокислотные остатки в D – спиральной
структуре акворина, участвующих в взаимодействии с eGFP в составе гибридного белка.
Эти результаты в совокупности с результатами по мутагенезу eGFP, позволяют
предположить, что высокоэффектвный перенос энергии биолюминесценции в гибридном
белке eGFPAeq осуществляется посредством “слабых” взаимодействий боковых радикалов
аминокислот S147,S202, Y151, направленных наружу в модуле
eGFP с боковыми
радикалами аминокислот W79,K87, K88
и Т91
в модуле акворина. (нумерация
аминокислот дана по индивидуальным модулям).Эти взаимодействия ограничивают свободу
перемещений донора и акцептора в составе гибридного белка. В результате таких
ограничений хромофор eGFP (акцептор) и хромофор целентаразина в акворине (донор)
находятся в одной плоскости, что является оптимальным условием переноса энергии по
теории Ферста. Блокирование перечисленных аминокислотных остатков посредством белков
ингибирует перенос энергии биолюминесценции.
В рамках совместной работы с институтом биохимии им.Баха для изучения индуктивнорезонансного переноса энергии, получены генетически-кодируемые FRET-пары на основе
тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP.
Получены два новых каспазных FRET-сенсора на основе тербий-связывающего пептида и
красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP. Методом люминесцентного анализа
подтвержден перенос энергии внутри обоих сенсоров. Эффективность переноса энергии
внутри отTb3+- к акцепторным белкам составляет 28% и 35% для DsRed2 и TagRFP
гибридных белков.
Структурно-функциональные исследования ферментов нуклеинового обмена и их
биотехнологическое применение
Группа технологии синтеза нуклеиновых кислот и их компонентов ФИБХ
Определены кинетические параметры мутантных форм дезоксирибонуклеозид
монофосфаткиназы
(dNMP-киназы)
бактериофага
Т5,
содержащих
единичные
аминокислотные замены: - S13A, D16N, T17N, T17S, R130K, K131E, Q134A, G137A, T138A,
W150F, D170N, R172I, E176Q. Удельная активность мутантных форм фермента была
исследована на природных акцепторах фосфорильной группы (dAMP, dCMP, dGMP, dTMP).
Было показано, что замены заряженных аминокислот dNMP-связывающего домена –
R130, R172, D170 и E176, - приводят к практически полной потере ферментативной
активности. Очевидно, эти заряженные аминокислоты абсолютно необходимы для
связывания и фосфорилирования всех четырех канонических dNMPs. Аргинины, вероятно,
участвуют в связывании γ-фосфата донора и α- и β-фосфатов акцептора фосфорила.
Аминокислотные замены G137A, T138A и T17N ведут к резкому снижению
активности на трех субстратах с сохранением достаточно высокой активности на четвертом
(в случае треониновых мутантов - dAMP, а в случае G137A – dCMP). У мутанта Q134A
сохраняется активность на dAMP и dCMP. Замены в АТP-связывающем сайте (S13A, D16N)
приводят к значительному снижению активности лишь на одном из субстратов: в случае
S13A это dGMP, а в случае D16N – dTMP. Замены W150F, K131E, T17S не приводят к
значительному изменению активности ни на одном из субстратов.
Таким образом, падение ферментативной активности на различных акцепторах
фосфорильной группы в результате мутагенеза происходит неодинаково. Следовательно,
несмотря на наличие одного сайта связывания субстрата, тип азотистого основания
оказывает влияние на катализ.
Анализ последовательности белка позволил получить модель структуры активного
центра молекулы. Установлено взаимное расположение P-петли АТФ-связывающего центра
и альфа-спиральных участков активного центра молекулы.
Сравнение аминокислотных последовательностей известных бактериальных
пуриннуклеозидфосфорилаз
с
полученной
в
настоящей
работе
пуриннуклеозидфосфорилазой
G.stearothermophilus
(PuNPII)
выявило
общую
консервативную структуру в активном центре ферментов, за исключением Tyr192, Ser234,
Met236 и Ala237. Возможно, указанные аминокислотные остатки играют важную роль в
повышении стабильности изучаемого фермента по сравнению с аналогом из E.coli. Для
сравнения
ферментативных
активностей
природных
и
рекомбинантных
нуклеозидфосфорилаз были определены константа Михаелиса и константа равновесия в
реакциях фосфоролиза нуклеозидов. Пуриннуклеозидфосфорилаза G.stearothermophilus
имеет Km для инозина 90мкМ, что близко к значениям ферментов-аналогов из E.coli, но
имеет более высокую аффинность к гуанозину – 70 мкМ. Константы равновесия,
определенные у изучаемых ферментов, полностью коррелируют с данными природных
аналогов у родственных штаммов.
Предполагаемая
высокая
температурная
стабильность
рекомбинантных
нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus, подтвердилась при проведении очистки
ферментного препарата пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) от белков штаммахозяина путем прогревания клеточных лизатов в течение 30 мин при 70 oС и последующего
осаждения термолабильных белковых агрегатов высокоскоростным центрифугированием.
Полученный препарат имел чистоту около 80-85% по целевому белку и не содержал
интерферирующих активностей. Производительность полученного штамма-продуцента
PyNP составляла 283±22 мг белка ферментного препарата из 1 литра культуры.
Производительность полученного штамма-продуцента PuNPII составляла 364±43 мг белка
ферментного препарата из 1 литра культуры.
В ходе работы были получены данные о стабильности иммобилизованных
ферментных препаратов (ИФП) нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus в широком
диапазоне значений pH и температуры. Оптимум рН для ИФП в реакции
трансгликозилирования в целом совпадал с оптимумом растворимых нуклеозидфосфорилаз
(pH 7.5-8.0), но область значений, при которой фермент сохранял полную стабильность, была
шире (рН 6.5-11.5). Оптимум температуры при синтезе dAdo варьировал от 80 oС (при
соотношении по активности PuNPII к PyNP 2:1) до 86 oС (при соотношении по активности
PuNPII к PyNP 1:2), что на 5-10 oС выше температурного оптимума для растворимых
препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus.
Из полученных в исследовании данных следует, что трансгликозилазная активность
ферментного препарата при 20-кратном использовании снижалась приблизительно на 0.60.7% за цикл при 70 oС, что представляется достаточно хорошим показателем и
обеспечивает технологическую перспективу для полученных ИФП. Кроме того, благодаря
высокой удельной активности ИФП удалось достигнуть более 80% глубины превращения за
4-10 ч при содержании биокатализатора в реакционной смеси всего 1-5% (по объему). Это
позволило эффективно использовать полученные ИФП для проведения реакций
трансгликозилирования с широким спектром субстратов, в том числе, плохо растворимых,
таких как гуанин, а также для синтеза фармацевтически значимых препаратов: 2-хлор-2’дезоксиаденозин (2CldAdo), 9-β-D-арабинофуранозил-2-фтораденин (2FaraА), 1-β-Dрибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирин) и ряда природных нуклеозидов
Молекулярная генетика, механизмы реализации генетической
информации, биоинженерия (47)
Исследование особенностей генетической вариабельности при аутоиммунных и
онкологических заболеваниях человека
Лаборатория сравнительной и функциональной геномики
Проведен функциональный анализ обширной группы AluY ретроэлементов в
интронах генов, продукты которых регулируют процессы дифференцировки и,
предположительно, малигнизации лимфобластов.
По результатам генотипирования выборок здоровых доноров и больных с острым
лимфобластоидным лейкозом (ОЛЛ) определены частоты встречаемости Alu-содержащих
аллелей свыше 90 генов и отобрано 28 кандидатных локусов генома, для которых
установлено статистически достоверное изменение частот встречаемости Alu-содержащего
аллеля в выборке больных ОЛЛ. Так, для генов PTPLB, PTPN22, PTPRA и ERBB4,
кодирующих тирозиновые протеинкиназы или их рецепторы, выявлено выраженное
повышение частоты встречаемости Alu-содержащих аллелей в выборке больных.
Превышение частот варьирует от 0,08 до 0, 23, а соответствующие факторы риска (OR)
могут достигать 2,97. Выявлено резкое снижение (в 8-64 раза) транскрипции Aluсодержащих аллелей 18 генов в лимфоидных клетках больных ОЛЛ и здоровых доноров.
Для 12 Alu-содержащих аллелей обнаружено полное ингибирование транскрипции в Влимфобластах из крови и пунктатов костного мозга больных ОЛЛ. На основе Aluсодержащих аллелей, проявляющих наиболее выраженную активность в Т- и В-бластоидных
клетках больных с острым лимфобластоидным лейкозом, нами создан уникальный набор
функциональных молекулярно-генетических маркеров, который может найти применение
как при проведении дальнейших исследований процессов дифференцировки и малигнизации
лимфобластов, так и в медицинской практике для прогнозирования риска возникновения и
развития онкологических заболеваний крови.
Разработан и успешно применен новый экспериментальный подход к определению
полного индивидуального репертуара Т-клеточных рецепторов периферических
лимфоцитов и выявлению клональной экспансии при аутоиммунных заболеваниях.
Подход объединяет а) оригинальный метод получения исчерпывающих селективных
библиотек зрелых генов бета-цепей Т-клеточного рецептора (TCR-B) периферических
лимфоцитов,
б)
оптимизированное
использование
современных
платформ
крупномасштабного секвенирования кДНК (NGS Next Generation Sequencing) и в)
биоинформатический анализ данных NGS для реконструкции репертуара Т-клонотипов по
структуре антиген-распознающих участков (CDR3) зрелых Т-клеточных рецепторов.
Применение разработанного подхода для долговременного мониторинга репертуара Тклеток у больных анкилозирующим спондилитом (АС) позволило выявить и
охарактеризовать клональные экспансии и общую динамику репертуара при аутологичной
трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) и других видах терапии.
Создана серия экспрессионных конструкций, содержащих протективный и рисковый
гаплотипы гена ERAP1
Полифункциональная аминопептидаза ERAP1 относится к числу ключевых
ферментов, определяющих чувствительность лимфоцитов к ряду цитокинов и других
факторов клеточной дифференцировки. Ранее нами по результатам анализа встречаемости 5
несинонимичных SNP нами были определены предположительно протективный и рисковый
гаплотипы этого гена. За отчетный период создана серия экспрессионных конструктов,
содержащих четыре аллельных варианта ERAP1(оба гаплотипа и их инвертированные
мутанты) и получена панель лимфоцитарных (Jurkat, HL60, HT1080) клеточных сублиний,
транзиентно
экспрессирующих
исследуемый
трансген.
Предварительный
иммунохимический анализ полученных трансфектантов и культуральных сред выявил
выраженные отличия в накоплении растворимой формы рецептора TNF – продукта одной из
функциональных активностей аминопептидазы.
Структурный, функциональный и эволюционный анализ геномов и его применение в
биотехнологии
Лаборатория структуры и функции генов человека
Исследование эволюционно-консервативной эпигенетической регуляции процессов
раннего развития и герминогенного опухолеобразования путь к терапии
герминогенного рака.
Были продолжены комплексные исследования функций белков семейства PIWIL при
развитии герминогенных опухолей человека. Разработана система для сравнительного
определения уровня метилирования регуляторной области L1. Для 8 образцов ткани
герминогенных опухолей и прилегающих к ним нормальных тканей яичка показано
деметилирование 5’НТО (нетранслируемой области) L1 ретропозонов в герминогенных
опухолях, при этом преимущественному деметилированию подвергаются человекспецифические ретропозоны (семейство L1HS). Поскольку снижение уровня метилирования
может приводить к повышению уровня транскрипции транспозонов, проведено исследование
уровня мРНК L1 в герминогенных опухолях. Показано, что количество транскриптов
достоверно повышается в 6 (из 8) образцах опухоли по сравнению с соответствующими
нормальными тканями. Таким образом показана корреляция деметилирования 5’НТО
транспозонов L1 с повышением их транскрипции при образовании опухоли яичка. Для
последующего изучения структуры внутриклеточных популяций коротких РНК,
ассоциированных с каждым членом семейства белков PIWIL созданы генетические
конструкции, содержащие кДНК piwil1-4 Получены 4 клеточные линии, стабильно
экспрессирующие соответствующие белки. Синтез белков подтвержден вестерн-блот
анализом с использованием антител на соответствующий PIWIL. Найдена новая изоформа
белка PIWIL2, характерная только для тканей яичка и герминогенных опухолей. Определена
нуклеотидная последовательность мРНК, соответствующей этой изоформе.
Сравнительный анализ транскриптомов патогенных микобактерий M. Tuberculosis
при развитии инфекционного процесса in vivo.
Разработан метод инфицирования мышей M. tuberculosis штамм H37Rv
внутрибрюшинно, для получения фагоцитов, инфицированных M. tuberculosis. Приток
нейтрофилов через 16 часов и макрофагов через 120 часов симулировали введением пептона
мышам линии В6. При недостаточно чистом обогащении макрофагами (примесь
нейтрофилов из-за немедленной реакции на введение микобактерий) использовали
предварительное удаление нейтрофилов in vivo c антителами анти-Ly6G.
Разработан метод выделения РНК из фагоцитов, обогащенной РНК M. tuberculosis,
включающий в себя дифференциальный лизис инфицированных фагоцитов, выделение
тотальной РНК и деплецию рибосомальных РНК.
Разработанными методами получены образцы РНК, выделенные из нейтрофилов и
макрофагов (мыши линии В6), инфицированных M. tuberculosis. Проведен синтез кДНК
PowerScript (Clontech), обогащение образцов микобактериальной кДНК подтверждено
секвенированием отдельных клонов.
Проведение негативно-позитивной селекции инсуляторов в ретровирусной системе.
Получение библиотеки
Полученными на предыдущем этапе ретровирусными частицами были инфицированы
клетки-мишени линии CHO. Клетки, в геном которых интегрирован вектор, отбирались по
их устойчивости к неомицину (G-418). Неомицин-устойчивые клетки были подвергнуты
селекции в присутствии ганцикловира (негативная селекция). В этих условиях выживают
только те клетки, которые перед минимальным промотором содержат вставки из фрагментов
библиотеки, обладающие энхансер-блокирующей активностью. Таким образом, если в
векторе между энхансером и промотором CMV будет расположена последовательность,
обладающая активностью, снижающей экспрессию тимидинкиназы, то популяция дочерних
клеток трансфицированной таким вектором клетки выживет. Подобную устойчивость к
ганцикловиру могут придавать клеткам последовательности двух типов – инсуляторы и
сайленсеры. Однако активность сайленсера может распространяться также и на промотор
гена неомицинфосфотрансферазы, и клетки, несущие такой вектор погибают на стадии
позитивной селекции, поскольку сайленсер определяется как элемент генома, способный
подавлять активность промотора независимо от его положения и ориентации относительно
природного или гетерологичного промотора. Таким образом, в результате позитивнонегативной селекции отбираются лишь энхансер-блокирующие последовательности.
На матрице выделенной из этих клеток геномной ДНК при помощи ПЦР со специфичных к
концам клонов праймеров был амплифицирован пул потенциальных энхансер-блокирующих
последовательностей, затем клонированый в плазмидный вектор. В результате описанных
выше экспериментов была получена библиотека потенциальных инсуляторов
Секвенирование библиотеки, анализ последовательностей, построение и анализ
физической карты расположения инсуляторов.
Полученная на предыдущем этапе работы библиотека потенциальных инсуляторов
была секвенирована по технологии 454 (Roche). Всего было получено 220
последовательностей, картирующихся в исследуемой области генома. Сравнение этих
последовательностей между собой выявило 17 независимых элементов, положения которых
были нанесены на физическую карту локуса.
Молекулярно-функциональный анализ процессов клеточной трансдифференцировки
в ходе формирования клеточного микроокружения в опухолях легкого и
поджелудочной железы человека
Проведен анализ экспрессии генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального
перехода в клетках и тканях опухолей поджелудочной железы и легкого. В ходе выполнения
работы была показана повышенная активность генов ZEB2 и SNAIL (транскрипционных
регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода) в клетках стромального
микроокружения рака поджелудочной железы.
Изучено влияние ростовых факторов опухолевого микроокружения на активность
промоторов генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода. Показано что
ростовой фактор опухолевого микроокружения TGF-beta усиливает активность промоторов
генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода (ZEB2 и SNAIL) в
опухолевых клетках рака поджелудочной железы и легкого, а также повышает активность
анти-апоптотического гена сурвивина (BIRC5).
Разработка эффективных промоторных модулей для универсального использования в
генно-терапевтических противоопухолевых средствах
1) Получены двойные тандемные промоторы на основе широко используемых
опухолеспецифичных промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы (phTERT) и
сурвивина человека (phSurv). Показано на панели клеточных линий различного
происхождения, что сконструированные двойные промоторы phTERT-hSurv, phSurv-hTERT
функционально не являются механической суммой двух составляющих промоторов, а
образуют новый функциональный многопрофильный промотор, отличающийся от всех
известных промоторов, как по точке начала транскрипции, так и по повышенной активности
в широком спектре опухолей.
2) Получены искусственные варианты промотора гена сурвивина человека с мутированным
сайтом связывания белка p53. На панели клеточных линий человека и мыши различного
происхождения показано, что активность ряда полученных мутантных вариантов промотора
гена сурвивина человека превосходит активность нативного промотора гена сурвивина в
несколько раз.
3) Сконструирована система усиления опухолеспецифической экспрессии гибридного генаубийцы
цитозиндезаминазы-урацилфосфорибозилтрансферазы (FCU1),
в
которой
используется сочетание двух экспрессирующих конструкций: гена рекомбиназы Cre под
контролем модифицированного промотора гена сурвивина человека (phSurv4) и гена FCU1,
отделенного от конститутивного промотора цитомегаловируса терминатором транскрипции
вируса SV40, который содержит по краям сайты узнавания рекомбиназы Cre (loxP-сайты).
Показано, что одновременное введение этих двух конструкций в клеточные линии с
фенотипом р53(-) приводит в присутствии 5-фторцитозина к увеличению цитотоксического
эффекта в 4-5 раз по сравнению с прямой регуляцией экспрессии FCU1 промотором pSurv4.
Это происходит за счет Cre-зависимого удаления терминатора, приводящего к экспрессии
гена FCU1 под контролем сильного промотора pCMV. Использование системы Cre-LoxP не
приводит к усилению экспрессии гена FCU1 в клетках с фенотипом р53(+).
Регуляция синтеза рибосомных белков
Лаборатория структуры и функции генов человека
1. Исследование транскрипционного контроля оперонов р-белков in vivo
Для генов рибосомных белков E. coli (rpsA, rpsB, rpsO, rpsT) показано, что их экспрессия
регулируется не только на стадии инициации трансляции по механизму ауторепрессии, но и
на стадии транскрипции. Промоторы этих генов (Р1 и Р3 rpsA, PrpsB, PrpsO, P1 rpsT)
подвержены негативной регуляции низкомолекулярным алармоном ppGpp, который
синтезируется в клетке в ответ на индуцируемое голодание по серину при обработке
серингидроксаматом. Впервые показано, что природные ингибиторы аминоацил-тРНКсинтетаз (АРСаз), антибиотики микроцин С и альбомицин, вызывают не только остановку
синтеза белка и роста клеточных культур, но и ингибируют транскрипцию генов,
кодирующих рРНК и р-белки, по механизму строгого ответа (stringent response) благодаря
повышению уровня синтеза ppGpp RelA-синтазой в ответ на аминокислотное голодание.
Также впервые показано, что RelA-зависимый синтез ppGpp жизненно необходим для
выживания клеток E. coli в условиях остановки роста под действием антибиотиковингибиторов АРСаз: в ppGpp+-штаммах микроцин С и альбомицин проявляют только
бактериостатические свойства (выживаемость близка к 100%), а в ppGpp0-мутантах
оказывают сильный бактерицидный эффект (выживаемость падает на 4-5 порядков).
Предположительно, в отсутствие ppGpp невозможно переключение транскрипции на
промоторы, узнаваемые альтернативными сигма-факторами и отвечающими за синтез
антистрессовых белков.
2. Изучение роли транскрипционного фактора DksA в регуляции транскрипции
оперонов р-белков
Белок DksA является кофактором алармона ppGpp, и при делеции гена dksA ppGpp не
способен эффективно ингибировать транскрипцию с промоторов оперонов рибосомных
РНК. Исследование влияния DksA на транскрипцию генов рибосомных белков методом ОТПЦР показало, что их промоторы реагируют на делецию dksA-гена сходным образом: при
отсутствии DksA в клетке многие промоторы генов р-белков не снижают эффективности при
повышении уровня ppGpp при аминокислотном голодании (имеются исключения).
Интересно, что хотя транскрипционные профили рибосомных генов в ppGpp0- и dksAмутантах в целом похожи, мутанты, не способные к синтезу ppGpp, под действием
микроцина С или альбомицина погибают, а dksA-мутант сохраняет 100% выживаемости. Это
позволяет сделать вывод, что в отличие от ppGpp для включения антистрессовых
механизмов фактор DksA не требуется.
Структурная и функциональная геномика вирусов бактерий
Лаборатория молекулярной биоинженерии
Выделено два бактериофага Pseudomonas, отличающиеся необычными условиями
существования (горячие источники), вероятно представляющие собой новые
таксономические виды вирусов.
Получены кристаллы протеазоустойчивого фрагмента белков хвостового чехла (gp29) и
базального стержня (gp131) бактериофага phiKZ, получен набор дифракционных данных,
определены структуры белков.
Определены квазиатомные структуры белков хвостовых шипов и аппарата инъекции ДНК
ряда бактериофагов (gp43 фага SN, gp164 фага phiKZ, gp27 фага 297, gp76 фага AP22,
получен ряд делеционных мутантов с целью выяснения закономерностей строения и
функций.
В сотрудничестве с институтом кристаллографии РАН метод малоуглового рассеяния
применен для определения структуры фибриллярного белка gp37 фага Т4 и шаперонина фага
ЕL.
Разработана и опробована генетически обоснованная система ПЦР-типирования
терапевтических бактериофагов Pseudomonas и Staphylococcus для подбора лекарственных
смесей, промышленно выпускаемых НПО «Микроген»
Определены условия кристаллизации 4 белков, предназанченных для кристаллизации в
условиях микрогравитации во время экспедиций МКС 23 - 29.
Исследование механизмов активации клеточной пролиферации при развитии
злокачественных опухолей мочеполовой системы
Группа геномного анализа сигнальных систем клетки
По распространенности среди опухолей мочевыделительной системы рак мочевого
пузыря (РМП) занимает 2-е место, а среди всех злокачественных новообразований — 9-е
место в мире. Нами для одних и тех же образцов тканей впервые было проведено системное
исследование таких молекулярно-генетических аспектов развития РМП, как: изменения
транскриптома, изменения метилирования геномной ДНК, изменения в представленности
коротких РНК, наличие протяженных геномных делеций и дупликаций. Исследование было
проведено для выборки из 18 раковых и 30 нормальных тканей. Использовались методы
секвенирования нового поколения на платформе Illumina, супрессионной вычитающей
гибридизации кДНК, микрочиповой гибридизации кДНК и геномной ДНК, ПЦР в реальном
времени, биоинформатической обработки больших массивов данных. Были обнаружены
шесть новых молекулярных маркеров развития РМП. Кроме того, в рамках настоящего
проекта мы создали пакет программного обеспечения, осуществляющий автоматическую
обработку данных микрочиповой гибридизации для анализа активированных или
подавленных путей внутриклеточной сигнализации.
Характеристика транскрипционно-регуляторной активности мобильных элементов
генома человека, располагающихся вблизи точек начала транскрипции известных
генов
Группа геномного анализа сигнальных систем клетки
Обнаружено единственное специфичное для ДНК человека семейство мобильных элементов,
названное CpG-SVA. Представители семейства содержат на 5'- конце CpG-островок гена
MAST2, а на 3'- конце – фрагмент ретротранспозона SVA. Мы показали, что
последовательность CpG-островка играет ключевую роль в транскрипционной регуляции и
обеспечивает активацию в сперматогониальных клетках, способствуя быстрому накоплению
геномных копий CpG-SVA. Обнаруженное нами семейство, названное CpG-SVA,
сформировалось уже после разделения предковых линий человека и шимпанзе и присутствует
только в человеческом геноме, будучи представленным по крайней мере 76 копиями. Мы
показали, что последовательность CpG-островка имеет важнейшую роль в регуляции
транскрипции представителей CpG-SVA и обеспечивает транскрипционную активацию в
созревающих сперматогониальных клетках. Мы показали высокий уровень корреляции между
уровнями экспрессии CpG-SVA, гена MAST2 и других активных мобильных элементов
человека. Важно, что наблюдалась также положительная корреляция с экспрессией белков
ретротранспозона L1, обеспечивающих размножение CpG-SVA в геноме. Таким образом,
разгадана загадка аномальной «успешности» CpG-SVA: ведь единственный предковый
элемент CpG-SVA в геноме человека (то есть <0,1% от всех копий SVA) дал ~9% от всех
зафиксированных в геноме человек-специфичных вставок SVA. Кроме того, показана
корреляция уровней транскрипции гена MAST2 и активных мобильных элементов не только у
человека, но и у других млекопитающих. Предложена гипотеза, что у млекопитающих
активация MAST2 на определенных стадиях сперматогенеза происходит под действием
специфического набора транскрипционных факторов, одновременно с волной массированного
деметилирования ДНК, высвобождающей экспрессию мобильных элементов.
Исследование мутагенеза у эукариот
Лаборатория биотехнологии
В 2011 г. при выполнении этапа «Разработка метода снижения фона из-за
неспецифических разрывов ДНК» была решена проблема фона, возникающего за счет
внесения в ДНК анализируемой последовательности неспецифических разрывов при ее
обработке. Начат переход на анализ продуктов рестрикции методом цифровой ПЦР. Для
этого совместно с С-Петербургским Институтом аналитического приборостроения
усовершенствован и испытан прибор для счета отдельных молекул ДНК методом
твердофазной ПЦР.
При выполнении этапа «Поиск новых мутаций путем секвенирования всего гена
CYP21» был секвенирован полноразмерный ген у 16 пациентов с признаками
гиперандрогении. Установлено, что ген обладает уникальным полиморфизмом: набор
однонуклеотидных замен в гене не повторялся ни у одного пациента. При этом была
обнаружена новая синонимическая однонуклеотидная замена в экзоне 8. Полиморфизмы
кластеризованы в гене и располагаются по границам некоторых экзонов, а также в
окрестностях инициирующего и терминирующего кодонов гена. На основании полученных
данных высказывается предположение о новом генетически детерминированном механизме
возникновения патологического фенотипа у обследованных пациентов. В соответствии с
гипотезой, считавшиеся ранее нейтральными однонуклеотидные замены на самом деле могут
изменять пространственную структуру предшественника мРНК или самой мРНК и нарушать
ее нормальный процессинг или трансляцию, понижая экспрессию гена. Гипотеза будет
проверена в 2012 г. путем секвенирования дополнительных генов, а также определения
гаплотипов уже секвенированных генов и построения моделей пространственной структуры
участков последовательностей, содержащих SNP.
При выполнении этапа «Разработка метода анализа метилирования промотора с
использованием цифровой ПЦР» предложен новый метод выявления метилированных
участков ДНК, основанный на появлении или исчезновении сайтов рестрикции в ДНК,
подвергнутой бисульфитной модификации.
Ишемический инсульт в молодом возрасте
Лаборатория биотехнологии
В 2011 г. при выполнении этапа «Выявление 12 мутаций в генах системы гемостаза
у больных с инсультом» темы «Ишемический инсульт в молодом возрасте» для уточнения
диагноза были дополнительно исследованы 12 генов системы гемостаза и метаболизма
варфарина у 20 пациентов. Исследование на этом было завершено. В настоящее время
проводится обработка всех полученных результатов.
Выявление и изучение новых компонентов протеома человека, участвующих в
формировании и экспорте мРНК из ядра
Лаборатория механизмов генной экспрессии
C помощью генетического (дрожжевая двухгибридная система) и биохимического
(соосаждение белков из клеточных лизатов) подходов показаны взаимодействия
специфических субъединиц РНК-полимеразы II человека hRPB11b и hRPB11с сразу с
четырьмя различными компонентами фактора инициации трансляции EIF3 Homo sapiens
(eIF3a, eIF3i и двумя вариантами eIF3m), в том числе с впервые обнаруженной изоформой
eIF3m = ncEIF3m (242 а.о.), имеющей предпочтительно ядерную локализацию. В протеоме
человека впервые найдены белки-партнёры этого нового белка Homo sapiens: установлено,
что eIF3m, помимо трёх разных изоформ субъединицы hRPB11 (hRPB11a, hRPB11b и
hRPB11с), взаимодействует также с субъединицей фактора инициации трансляции человека
eIF3a, а также с белком p15 (NXT1, MTR2), участвующим в транспорте мРНК из ядра в
цитоплазму.
Структурно-функциональный анализ энзиматического метилирования ДНК эукариот
в эпигенетических процессах
Лаборатория биотехнологии растений
При сотрудничестве со специалистами из Белорусского Республиканского научнопрактического центра гематологии и трансфузиологии (г. Минск) был проведен анализ сайтспецифического метилирования в образцах ДНК, выделенной из нормальных и
патологических ядросодержащих клеток крови и костного мозга пациентов с различными
формами лейкозов и находящихся на разных стадиях течения и терапии заболевания.
Выявлены особенности сайт-специфического метилирования регуляторно-промоторной
области гена MDR1, характерные для различных стадий развития и протекания
гематологических неоплазий, что создает предпосылки подходов к разработке
высокочувствительного метода молекулярной диагностики лейкозов и, по-видимому,
позволит включить данные по анализу метилирования промотора данного гена в список
молекулярных онкомаркеров. Анализ регуляторно-промоторной области гена MDR1 показал
присутствие специфических повторяющихся последовательностей (ALU-повторы), которые
могут оказывать существенное влияние на локальную конформацию хроматина в
зависимости от степени метилирования.
С учетом сайтовой специфичности и размеров DNMT1, cинтезированы
модифицированные олигодезоксинуклеотиды, проявляющие по отношению к ней
ингибирующее действие. Проведена сборка и очистка олигодезоксинуклеотид-белковых
комплексов, состоящих из модифицированного белка M.HhaI-GFP, и продемонстрировано их
ингибирующее действие на коммерческие препараты человеческой ДНК-метилтрансферазы
DNMT1.
Сконструирован специализированный вектор, содержащий модифицированный сигналом
ядерной локализации ген CpG-специфичной бактериальной ДНК-метилтрансферазы HhaI
под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. С применением
разработанного в лаборатории метода трансформации, полученной конструкцией проведена
трансформация растений Mesembryanthemum crystallinum. Проведен анализ морфологобиохимических а также молекулярно-биологических особенностей характерных для
растений Mesembryanthemum crystallinum трансформированных геном M.HhaI в нормальных
условиях и в условиях засоления (0,5 M NaCl) и засухи по сравнению с нормальными
контрольными растениями.
Исследовано взаимодействие растений Mesembryanthemum crystallinum с бактериями
Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida, Methylovorus mays. Обнаружены изменения
уровня метилирования генома колонизированных растений.
Реконструкция in vitro мультиферментного комплекса биосинтеза экзополисахаридов
у симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum
Группа молекулярной экологии
Показано, что ко-трансляция мРНК гликозилтрансфераз PssE, PssD и PssА в
присутствии липосом, полученных из фосфолипидов клеток Rhizobium leguminosarum,
приводит к образованию протеолипосом. При этом интеграция белков PssE и PssD в
липосомы происходит только при совместной трансляции
cоответствующих
мРНК.Эффективность связывания белков PssE, PssD и PssА с липосомами возрастает при
трансляции мРНК всех трех гликозилтрансфераз.
Установлено, что гликозилтрансферазы в составе протеолипосом функционально
активны. Ферментативную активность белков анализировали при инкубировании
протеолипосом с предшественниками синтеза ЭПС (UDP-[14С]-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcA).
В результате показано, что
PssA является UDP-глюкоза:полипренилфосфатглюкозофосфотрансферазой, а PssD и PssE – субъединицами UDP-глюкуронозил(-4)-глюкозилтрансферазы.
Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки,
иммунитета и онкогенеза (48)
Исследование молекулярных механизмов аутоиммунных заболеваний на примере
болезни Бехтерева
Группа Флуоресцентных инструментов
Новые алгоритмы анализа и новая версия программного обеспечения для системного
анализа массивов данных репертуаров Т клеточных рецепторов.
Разработана новая версия программного обеспечения для системного анализа массивов
данных индивидуальных репертуаров Т клеточных рецепторов человека, которая, в отличие
от предыдущей версии, позволяет проводить анализ альфа цепей Т клеточных рецепторов, и
использует более эффективный алгоритм коррекции типичных ошибок платформ
секвенирования нового поколения 454, Illumina и IonTorrent, в том числе с ассиметричной
коррекцией исходных данных флуорограмм. Введены новые возможности для системного
анализа, кросс-сравнения и экспорта массивов данных Т клеточных рецепторов и продуктов
их анализа. Частично опубликовано в EMBO Mol Med. 2011, основные результаты в
процессе публикации. Отработана технология мультиплекс амплификации вариабельных
фрагментов Т-клеточных рецепторов с малых количеств ДНК из FACS-сортированных
популяций фиксированных Т лимфоцитов. Технология необходима для последующего масссиквенс анализа специфических субпопуляций Т-лимфоцитов, требующих предварительной
фиксации перед сортировкой. В частности, непосредственный интерес для нашей работы
представляют субпопуляции Th17 лимфоцитов и регуляторных FoxP3-позитивных Тлимфоцитов.
Тетрамеры MHC HLA-B27 с УФ-выщепляемыми замещаемыми лигандами.
В совместной работе с проф. Шумахером (Амстердам), получены тетрамеры HLA-B27 с УФвыщепляемыми замещаемыми лигандами (conditional ligands). На их основе получен ряд
тетрамеров HLA-B27, несущих различные вирусные пептиды. Показана их высокая
эффективность для окрашивания специфичных субпопуляций Т лифмоцитов.
Технология амплификации библиотек вариабельных фрагментов тяжелых и легких
цепей иммуноглобулинов.
На примере образов крови 4 больных аутоиммунным заболеванием, отработана технология
равномерной амплификации и массированного секвенирования вариабельных фрагментов
тяжелых и легких цепей антител человека. Ведется разработка программного обеспечения
для эффективного анализа данных.
Красные и дальнекрасные флуоресцентные белки
Разработанный в ходе предыдущей работы белок eqFP650 с высокой яркостью в
инфракрасном диапазоне, опубликованный группой в 2010 году, был использован в
совместной работе с группой проф. Luker в США для визуализации опухолевых клеток в
модельных мышах при исследованиях закономерностей взаимодействия различных подтипов
опухолевых клеток в ходе метастазирования.
Получен низкотоксичный супермономерный красный флуоресцентный белок, оптимальный
для мечения белков слияния. На его основе получены дальнекрасный и фотоактивируемые
супермономерные версии.
Изучение биологической активности и механизма действия миелопептидов. Разработка
новых лекарственных средств на основе миелопептидов
Лаборатория клеточных взаимодействий
Анализ дифференцировочных эффектов МП-4 и МП-6 в модели оценки стимуляции
эритропоэза клеток линии К-562 по выработке ими гемоглобина (бензидиновый тест).
Создание препаратов, способных восстанавливать процесс дифференцировки
трансформированных клеток-предшественников, является одним из новых разрабатываемых
подходов к лечению лейкозов. Ранее нами было продемонстрировано, что миелопептиды
МП-4 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью в культуре опухолевых клеток
костномозгового происхождения. Основываясь на этих данных, мы протестировали
способность МП-4 и МП-6 к индукции созревания эритромиелолейкозной линии К562 до
зрелых, функционально активных клеточных форм – продуцентов гемоглобина. С
применением бензидинового метода детекции гемоглобина было установлено, что под
действием миелопептидов МП-4 и МП-6 уровень синтеза гемоглобина в культуре клеток
К562 достигает и даже значительно превосходит таковой, достигаемый при использовании
ДМСО – стандартного индуктора дифференцировки клеток К562 в эритроидном
направлении. Полученные результаты указывают на возможность использования МП-4 и
МП-6 для создания новых противолейкозных препаратов.
Новые подходы к коррекции иммунного ответа: исследование иммуномодулирующих
эффектов белков теплового шока, ганглиозидов и пептидов – аналогов
иммунодоминантных эпитопов антигенов
Лаборатория клеточных взаимодействий
Сравнительный анализ иммуномодулирующих эффектов взаимодействия с NKклетками БТШ70 и стресс-индуцируемых протеинов семейства MICA.
В работах многих авторов и в наших исследованиях было продемонстрировано, что
присутствие стресс-индуцируемых протеинов, в частности БТШ70 и MICA, на поверхности
опухолевых клеток приводит к активации цитотоксических эффекторов иммунной системы,
в том числе NK-клеток. В то же время внеклеточные формы этих протеинов оказывают
прямо противоположное действие на цитотолитическую активность клеток-киллеров. Для
анализа причин указанных различий нами были проведены исследования влияния
экзогенного пула БТШ70 на экспрессию MICA опухолевыми клетками. Было обнаружено,
что внеклеточные БТШ70 оказывают ингибирующее действие на уровень экспрессии
поверхностных MICA. Причем данный ингибирующий эффект регистрировался как в
нормальных условиях культивирования клеток, так и в условиях клеточного стресса. Мы
рассматриваем полученные результаты как одно из проявлений хорошо известных
протективных свойств экзогенных БТШ70 и как свидетельство двойственной роли пула этих
протеинов во взаимодействии NK-клеток с опухолевыми клетками-мишенями.
Разработка гетерологичных пептидных вакцин против аллергии, вызванной грибами
Aspergillus, Penicillum и клещами домашней пыли.
При разработке противоаллергенных вакцин использован особый прием,
позволяющий вызывать иммунный ответ на основные белки аллергена при минимальной
затрате ресурсов организма. Прием основан на использовании предсуществующих Т-клеток
памяти, специфичных к другим антигенам (белкам вируса гриппа). Для мобилизации
имеющегося у большинства населения пула Т-клеток памяти получены специально
устроенные коньюгаты пептидов, включающие отобранные пептиды капсидных белков
вируса гриппа штамма N1H1. Указанная популяция регуляторных Т-клеток активирует
протективный В-клеточный ответ, специфичный к содержащимся в вакцине пептидам –
аналогам В-эпитопов основных белков аллергенов. Разработанная вакцина представляет
собой суспензию наночастиц из модифицированного хитозана, внутри которых размещены
гидрофобные пептиды-Т-эпитопы белков вируса гриппа, а на внешней поверхности
наночастиц экспонируются гидрофильные пептиды аллергена.
Разработка системы доставки противоопухолевых препаратов (доксорубицина) на
основе модифицированного хитозана.
Хитозан используется не только носителем для разрабатываемой нами
противоаллергенной вакцины, но также и для доставки противоопухолевых препаратов.
Нами совместно с лабораторией полимеров для биологии разработан метод получения
наночастиц из гидрофобного модифицированного хитозана. Также отработан метод
химической коньюгации доксорубицина с хитозаном и формирование частиц их
коньюгированного хитозана. Полученные частицы имеют размер около 150 нм. Нами
проведены исследования сравнительной активности доксорубицина и доксорубицина в
составе наночастиц в мышиной модели рака молочных желез WNT1. Показали, что
активность доксорубицина не отличается, но токсичность снижается при доставке лекарства
с помощью наночастиц хитозана.
Новые подходы к коррекции иммунного ответа: исследование иммуномодулирующих
эффектов белков теплового шока, ганглиозидов и пептидов – аналогов
иммунодоминантных эпитопов антигенов
Группа липидных модулятороыв иммунитета
1.
Для характеристики влияния ганглиозида GM1 на уровень упорядоченности
липидов мембраны исследовано фазовое состояние модельных многокомпонентных
рафтообразующих мембран путем регистрации и анализа температурной зависимости
анизотропии флуоресценции метки, связанной со сфингомиелином. Данная метка
распределяется преимущественно в жидко-упорядоченную (рафтовую) фазу. Измерения
проведены при концентрации ганглиозида GM1 в мембранах в диапазоне 0-7 моль%. Для
анализа результатов проведено приближение дискретной экспериментально определяемой
зависимости r'(T1) двумя линейными функциями. Показано, что при низкой концентрации
ганглиозида (0–2 моль%) в системе происходит фазовый переход при температуре Th  33–
35°С. При увеличении концентрации GM1 (3–7 моль%) появляется новый фазовый переход
при температуре Tl  21–25°С, связанный, по-видимому, с формированием доменов,
обогащенных ганглиозидом и сфингомиелином. Одновременно пропадает фазовый переход
при температуре Th, что объясняется отпочкованием рафтовых областей от исходной
мембраны при высоком содержании GM1.
2. Ганглиозид GD2 – антиген, ассоциированный с нейробластомой и меланомой. Он
также экспрессирован, в разной степени, на поверхности клеток рака кости, саркомы мягких
тканей, мелкоклеточного рака легких. Моноклональные антитела (мАТ) к ганглиозиду GD2
способны индуцировать апоптоз клеток этих опухолей. Применение антител существенно
ограничивают их низкая способность проникать внутрь плотных сòлидных опухолей, а
также проходить через гемато-энцефалический барьер, поэтому были получены и
охарактеризованы специфические к ганглиозиду GD2 Fab-фрагменты антител, лишенные
этих недостатков. МАТ, специфические к ганглиозиду GD2, выделены из кондиционной
среды гибридомы, их Fab-фрагменты получены протеолитическим расщеплением папаином
Оценка специфичности Fab-фрагментов на клетках мышиной лимфомы EL-4 и методом дотблота с ганглиозидом GD2 показала связывание фрагментов с антигеном с такой же
эффективностью, как и для полноразмерной молекулы антитела. Показано, что Fabфрагменты, также как и целые антитела, ингибируют пролиферацию клеток мышиной Тлимфомы EL-4 дозо-зависимым способом и уже через 24 ч инкубации индуцируют их
апоптоз.
Функции нового опухолевого супрессора PDLIM4 (RIL) в нормальных клетках и при
опухолевой трансформации
Группа экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки
основной акцент в исследованиях был сделан на выявление корреляции между
злокачественным фенотипом линий клеток рака молочной железы истатусом активации
онкогена Src. Согласно выдвинутой нами гипотезе, опухоли молочной железы можно
подразделить на две группы, в зависимости от механизма активации гена Src. В слабоинвазивных раках мы ожидали эпигенетическую супрессию гена RIL, за счет которой
происходит умеренная активация онкогена Src без его активирующей мутации. Напротив, в
высокоинвазивных раках молочной железа мы ожидали проявление активирующих мутаций
гена Src, причем уровень белка RIL может быть либо неизмененным, либо повышенным (как
компенсация на повышенную активность Src). Эта гипотеза смогла бы объяснить
противоречивые данные, полученные нами ранее, при которых выраженность
трансформированного фенотипа была большой в случае нормальных или несколько
повышенных уровнях экспрессии гена супрессора RIL. Для выяснения этого вопроса нами
проведено измерение активности Src в панели линий клеток рака молочной железы.
Активность измеряли в киназном тесте, с измерение фосфорилирования стандартного
субстрата онкогена Src. Полученные данные указывают на то что, в линиях клеток,
характеризующихся повышенной инвазивностью (MDA-MB231, -435S, -436 и BT-474)
активность онкогена Src была более чем на порядок выше по сравнению с линиями с
меньшей инвазивностью (MCF-7, BT-20, T-47D и MDA-MB-468). Для определения влияния
экспрессии белка RIL на злокачественный фенотип в две линии клеток, характеризующихся
противоположными свойствами (MDA-MB231 и MCF7) была введена лентивирусная
конструкция экспрессирующая полноразмерный RIL, после чего определены параметры
роста клеток, наряду с анализом строения цитоскелета. В высокоинвазивной линии клеток
RIL не вызывал заметых изменений, в то время как в линии клеток MCF7 наблюдалось
резкое замедление скорости роста, вплоть до полной остановки делений, сопутсвующее
изменению актинового цитоскелета. Мы также провели иммунопреципитацию белка RIL и
измерили активность онкогена Src в иммунопреципитатах. Активность детектировалась
только в линии MCF7, и не детектировалась в MDA-MB231, несмотря на более высокий
уровень активности белка Src в тотальном экспракте. Эти данные указывают на нарушение
связывания киназы Src с белком RIL в клетках MDA-MB231.
Второе направление было связано с изучением роли короткой изоформы белка RIL в
регуляции актинового цитоскелета. Было установлено, что эта изоформа имеет короткий
период жизни, что объясняется альтернативной слабоструктурированной C-концевой
частью. Короткая изоформа RIL быстро разрушается в 20S протеасомах. Мы установили
также что короткая изоформа RIL связывается с полноразмерной изоформой и направляет ее
в разрушение, в результат чего в клетках экспрессирующих повышенные уровни короткой
изоформы наблюдается снижение уровня белка RIL. Эти изменения проходили параллельно
с изменениями актинового цитоскелета, изменением формы клеток и их подвижности.
Наконец, мы установили, что некоторые стрессовые воздействия, такие как окислительный
стресс, вызывают стабилизацию короткой изоформы RIL, что приводит к заметному
изменению подвижности клеток
Изучение роли GMDP-связывающего белка YB-1 в передаче сигнала мурамилпептидов.
Группа иммунохимии ФИБХ
В соответствии с запланированными на 2011 год исследованиями к белку YB-1 были
получены моноклональные антитела. Для получения моноклональных антител мыши линии
Balb/c были иммунизированы кроличьим YB-1, и полученные в результате гибридизации
клоны-продуценты моноклональных антител размножены в составе асцитной жидкости.
Всего было получено 5 клонов. Моноклональные антитела были охарактеризованы и
проанализированы в иммуноблотинге. Все антител принадлежали к классу IgG и содержали
легкую kappa-цепь. Проведено эпитопное картирование полученных антител. Антитела YB1-1, YB-1-3, YB-1-5 узнавали последовательность QPPAAPA, соответствующую Nконцевому участку YB-1. Антитела YB-1-4 узнавали последовательность APEGQAQQ,
соответствующую участку 177-184 YB-1.
Для анализа физического взаимодействия белка YB-1 с белками семейства NLR
предполагалось
клонировать
фрагменты
последовательностей,
кодирующих
соответствующие белки, и экспрессировать белковые продукты для последующей
иммунизации. С этой целью была амплифицирована последовательность кодирующая
аминокислоты 1-220 белка NOD2, и соответствующий полипептид экспрессирован в клетках
E. coli Rosetta. Продукт экспрессии был выделен с помощью металл-хелатной
хромотографии.
Моноклональные антитела для диагностики энтеротоксинов стафилококков:
получение и применение
Группа иммунохимии ФИБХ
В соответствии с запланированными на 2011 год исследованиями к энтеротоксину Н и
токсину тканевого шока стафилококков были получены моноклональные антитела. Для
получения моноклональных антител мыши линии Balb/c были иммунизированы
соответствующими токсинами, полученные в результате гибридизации клоны-продуценты
моноклональных антител размножены, а антитела наработаны в составе асцитной жидкости.
Всего было получено 5 клонов для SEHи 18 моноклональных антител к TSST.
Моноклональные антитела были охарактеризованы и проанализированы в ИФА и
иммуноблотинге. Все антител принадлежали к классу IgG и содержали легкую kappa-цепь.
Анатитела к давали одну пару к токсину, а антитела к TSST давали три независимых пары,
анализ в тесте аддитивности показал наличие антител независимо реагирующих с токсином,
предположительно имеющих дистанцировавнные эпитопы.
Биофизика, радиобиология, математические модели в биологии,
биоинформатика (50)
Структура, динамика, механизмы действия и биологическая функция мембранных и
мембрано-активных белков и пептидов
Лаборатория моделирования биомолекулярных систем
Исследование димеризации ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида (ПБА).
Получен набор моделей пространственной структуры димеров ТМ фрагментов
полноразмерного ПБА (ПБАтм), двух его мутантов (T714I, V717G), а также варианты,
укороченные на 3 (первый сайт ферментативного расщепления) и на 6 остатков (второй сайт
ферментативного расщепления). (2) Примембранный участок может модулировать
димеризацию посредством образования водородных связей с ТМ участком. (3) Катионсвязывающий домен может стабилизировать димер за счет контактов между катионсвязывающими доменами. (4) Изучены эффекты, вызванные изменением границ ТМ спирали
в белке дикого типа и его мутантных формах за счет погружения примембранного участка
пептида в бислой. (5) Мутации не оказывают сильного влияния на структурно-динамические
характеристики димеров, но затрагивают процессинг ПБА, изменения которого могут
приводить к развитию заболевания. Так, мутации в примембранном участке вызывают
заглубление ТМ-фрагмента ПБА в мембрану, что может способствовать появлению
укороченных фрагментов ПБА и вызывать формирование амилоидных бляшек. Мутации в
ТМ спирали могут оказывать влияние на эффективность переходов димер-мономер и,
следовательно, тоже влиять на процессинг ПБА.
Конформационная динамика димеров ТМС рецептора типа 3 фактора роста
фибробластов (FGFR3) и ее возможная роль в активации рецепторов.
Набор моделей пространственной структуры ТМ димеров FGFR3 получен с
использованием вычислительного подхода, описанного выше, а также с помощью
оригинального метода оценки свободной энергии димеризации. Сравнение полученных
результатов с экспериментальными данными позволило предложить механизмы возможных
конформационных перестроек, происходящих при активации рецептора. Показано, что: (1)
Для ТМС FGFR3 дикого типа возможны два состояния димера с симметричной областью
контакта. Структуры стабильны в липидных бислоях с разными физико-химическими
свойствами – из ДМФХ и ПОФХ. Энергия димеризации для этих состояний различна и не
зависит от бислоя. (2) Мутации не вызывают существенных структурных перестроек
димеров и не влияют на эффективность взаимодействия ТМС в структуре с минимальной
энергией (конформация S1), а эффективность димеризации второй структуры (S2)
возрастает. (4) Предложена модель конформационных перестроек, происходящих при
активации рецептора. В неактивном состоянии рецептор находится в состоянии S1, а при
связывании лиганда переходит в состояние S2. Мутации вызывают смещение равновесия в
сторону активной формы, что приводит к неконтролируемой передаче в клетку сигнала
пролиферации и, в итоге, к развитию патологических процессов. Указанная модель
позволяет объяснить большинство из известных экспериментальных данных по димеризации
ТМС FGFR3.
Димеризация ТМС в семействе рецепторов 1-4 эпидермального фактора роста:
Erbb1, Erbb2, Erbb3, Erbb4.
Для этого семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК) изучен характер упаковки всех
возможных гомо- и гетеродимеров. Установлено, что онкогенная активность пар ErbB1ErbB2 и ErbB2-ErbB3 (а также ErbB2 с патогенной мутацией V659Q) коррелирует с высокой
эффективностью упаковки ТМС в соответствующих гетеро- и гомодимерах. Изучено
влияние липидного окружения (бислои ДМФХ, ПОФХ, сфингомиелин, ДЕФХ) на
эффективность димеризации ТМС ряда белков (Bnip3, Epha2, Erbb1/Erbb2, PDGFR-β) с
использованием расчетов МД в явно заданном окружении. Для димера PDGFR-β показано,
что стабильность право- и левозакрученной конформаций зависит от липидного состава
мембраны. Левозакрученная конформация димера наиболее стабильна в рафт-подобных
липидных бислоях (например, содержащих сфингомиелин). Полученные результаты
согласуются с данными спектроскопии ЯМР.
Построение модели пространственной организации тримера из ТМС гемагглютинина
вируса гриппа.
Изучен характер формирования мембранных тримеров для фрагментов гемагглютининов
H6 и H14, относящихся к разным функциональным группам белков данного семейства.
Показано, что гомо-тример H14 имеет более плотную упаковку и стабильную структуру по
сравнению с H6. Важную роль в формировании межспиральных контактов в тримере Н14
играют ароматические остатки. Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися
биохимическими данными.
Структурно-динамические свойства смешанных липидных бислоев, имитирующих
мембраны эукариот и бактерий.
Методом МД проведена серия длительных (80-100 нс) расчетов гидратированных 2компонентных бислоев, состоящих из цвиттерионных (диолеоилфосфатидилхолин, ДОФХ) и
анионных
(диолеоилфосфатидисерин,
ДОФС)
липидов,
имеющих
одинаковые
ненасыщенные ацильные цепи, но разные полярные головка. Всего исследовано 9 систем с
разным содержанием ДОФХ/ДОФС. Цель: Изучение на молекулярном уровне структурнодинамические и др. физико-химические свойства смешанных бислоев, имитирующих
мембраны бактерий; Анализ латеральных микро-гетерогенностей (до 10 нм), определяющих
квазиравновесные характеристики и, следовательно, функциональные свойства 2компонентных мембран. Результаты: 1) Показано, что рассчитанные значения
геометрических и динамических параметров рассмотренных систем (площадь на молекулу
липида, толщина бислоя, параметры порядка ацильных цепей липидов) хорошо согласуются
с имеющимися экспериментальными данными, что подтверждает адекватность выбранного
вычислительного подхода. 2) Геометрические параметры меняются линейно в зависимости
от концентрации одного из липидных компонентов. 3) При 20-30% содержании ДОФС
липидный бислой имеет ряд важных особенностей – необычные (по сравнению с другими
ДОФХ/ДОФС системами) параметры взаимодействия молекул липидов с катионами и
молекулами воды, характеристики латеральной кластеризации липидов, наличие
аномального пика плотности ацильных цепей в середине бислоя и др.). Интересно, что в
составе клеточных мембран содержание анионных липидов также составляет 20-30%. 4) При
увеличении концентрации ДОФС площадь гидрофильной части поверхности бислоя
увеличивается за счет уменьшения нейтральной. При этом доля площади гидрофобной
поверхности бислоя не меняется. Сделаны выводы о роли анионных липидов в структурнодинамической и гидрофобной организации липидных бислоев.
Взаимосвязь конформационной подвижности цитотоксинов из яда змей с их мембранолитической активностью.
Методом МД в воде проведен сравнительный анализ конформационной подвижности
петлевых участков трех цитотоксинов: ЦТ А3 из Naja atra, ЦТ2, ЦТ1 (N. Oxiana). Результаты
сравнивали с данными по цитолитической активности рассматриваемых ЦТ, которая убывает
в ряду A3 > ЦТ2 > ЦТ1. Показано, что подвижность петли-1 меняется в следующем порядке:
А3 < ЦТ2 < ЦТ1. Напротив, стабильное состояние петли-2 (ω-образное) наблюдается у
наименее цитотоксичного ЦТ1. Кроме того, показано, что ω-образная конформация петли-2
и ее стабильность в ходе МД коррелируют с наличием в петле-2 ЦТ молекулы связанной
воды. Таким образом, для цитолитической активности ЦТ важны стабильная конформация
петли-1 и конформационная лабильность петли-2 (точнее, её способность к адаптации –
образованию т.н. «гидрофобной подошвы», необходимой для взаимодействия ЦТ с
мембраной).
Динамические и гидрофобные характеристики α-токсинов яда скорпионов как основа
селективности действия насекомые–млекопитающие (совместно с лабораторией
нейрорецепторов и нейрорегуляторов).
Для ряда α-нейротоксинов из яда скорпионов, отличающихся селективностью действия
«насекомые–млекопитающие», проведено моделирование динамических свойств и
гидрофобных характеристик, позволившее найти важное отличие между группами токсинов,
действующих на потенциал-чувствительные Na+-каналы (ПЧНК) млекопитающих и
насекомых. Кроме того, отличия были обнаружены и в гидрофобных характеристиках петель
ПЧНК, предположительно участвующих в связывании этих токсинов. Найденное
соответствие позволяет построить модель взаимодействия α-токсинов с IV потенциалчувствительным доменом ПЧНК.
Характеристические участки поверхности белков как функциональные детерминанты
их активности.
Для выявления характеристических участков поверхности токсинов была разработана
методика, основанная на расчете значений молекулярного гидрофобного потенциала,
кривизны и электростатического потенциала в каждой точке поверхности. Это позволяет
одновременно характеризовать как полярные, так и геометрические свойства поверхности.
Разработанные методики были оптимизированы для анализа набора поверхностей белков,
полученных в ходе расчета их молекулярной динамики. Анализ таких функциональных
детерминант (характеристических участков поверхности) был выполнен для ряда α-токсинов
из яда скорпионов и пауков. В результате были найдены аминокислотные остатки,
формирующие эти участки поверхности, в основном ароматические и заряженные.
Полученные данные были сопоставленны с имеющими данными мутагенеза для
исследуемых молекул. Интересно, что выявленные остатки также являются остатками,
ключевыми для активности токсина.
Биотехнология (51)
Исследование нанобиоструктур методами сканирующей зондовой микроскопии
Группа электронной микроскопии
При помощи СЗМ высокого разрешения, на примере рекомбинантных спидроинов
1F9 и 2E12 обнаружена новая форма надмолекулярной агрегации белков паутины – ламели.
Методом атомно-силовой микроскопии показано, что, в них молекулы имеют конформацию
плоского зигзага. Также в данной работе впервые получены изображения отдельных молекул
рекомбинантного спидроина. Средняя толщина ламелий (высота над подложкой) составляет
0,6±0,2 нм для 1F9 и 0,7±0,2 нм для 2Е12. Эти значения были получены путем усреднения
высот, измеренных на ста сечениях. Поскольку ламели из белков 1F9 и 2Е12 имеют близкие
высоты, а сами белки имеют сходную структуру, то можно предполагать одинаковую
конформацию молекул, находящихся в составе ламелей. Отметим, что на АСМизображениях ламели имеют практически постоянную ширину. Хотя ширина объектов не
может быть измерена с высокой точностью из-за конечного радиуса кривизны зонда (ширина
ламели, измеряемая на половине высота, составляла 11-18 нм для обоих белков, значение
существенно зависело от конкретного используемого зонда), постоянство ширины
однозначно следует из имеющихся изображений, и оно важно для выяснения способа
укладки молекул. Хотя длины ламелей варьируются в широких пределах, видно, что ламели
белка 1F9 имеют большую протяженность, чем ламели 2E12. Предположительно, это связано
с присутствием остатков пролина в белке 2Е12, которые мешают образованию протяженной
регулярной укладки.
Было проведено сопоставление морфологии нитей после растворения белка двумя
способами. Изображения нитей на слюде, полученные после обработки 1F9 в гуанидин
тиоцианате и в смеси LiCl с муравьиной кислотой, сопоставлены на рисунке 1. Видно, что
наблюдаемые структуры морфологически сходны, и это говорит о том, что их формирование
не является результатом обработки белка конкретным хаотропным агентом.
Длина протяженных структур, адсорбированных вторым слоем, для обоих белков
варьируется в широких пределах от 20 до 250 нм. При дальнейшем повышении
концентрации раствора подложка быстро целиком покрывается белком. При помощи СЗМ
высокого разрешекния показано, что молекулы рекомбинантных спидроинов могут
существовать в водных растворах в двух разных агрегационных состояниях: в виде
нанофибрилл и в виде отдельных молекул. Впервые обнаружено, что молекулы
рекомбинантных белков паутины могут агрегировать с образованием ламелей, в которых
каждая молекула имеет конформацию зигзага. Показано, что возможность формирования
ламелей не зависит от использования конкретного хаотропного агента. Укладка молекул в
составе ламелей в конформации плоского зигзага подтверждается наблюдаемыми размерами
ламелей, а также существующими представлениями об укладке хиральных молекул,
имеющих тенденцию к образованию антипараллельных бета-листов.
Совершенствование биотехнологических процессов получения субстанций генноинженерного инсулина человека и его аналогов
Группа прикладных исследований пептидов и белков
Создана методологическая база для получения три-N-замещенных производных
генно-инженерного инсулина человека и его аналогов с тремя одинаковыми, двумя или
тремя различными заместителями. Разработаны способы селективного ацилирования αаминогрупп остатков GlyA1 и PheB1 и ε-аминогруппы остатка LysB29 инсулина человека.
Исследованы условия получения три-N-замещенных производных генно-инженерного
инсулина человека и инсулина лизпро с различным сочетанием лигандов: с двумя и тремя
различными заместителями. Синтезированы новые три-N-замещенные соединения: ди-
NαA1,NαB1-липоил-NεB29(B28)-стеароил инсулин (инсулин лизпро), а также NαA1-липоил-NαB1биотинил-NεB29-стеароил инсулин. Обнаружена высокая устойчивость модифицированных
производных к протеолизу в сравнении с исходными гормонами. Показано, что
синтезированные соединения обладают высокой гипогликемической активностью и
увеличенной длительностью гипогликемического действия.
Оптимизированы способы получения и выделения и очистки рекомбинантной IgA1
протеазы N.meningitidis и ее мутантной формы, используя ранее полученные штаммы.
Основное внимание было уделено процессам очистки телец включения, их растворению и
ренатурации денатурированного белка. При этом варьировались состав и рН буферных
растворов, концентрации и природа детергентов и восстанавливающих агентов,
концентрации белков, времени и температуры проведения процессов, методы рефолдинга.
Наибольший выход активной и мутантной IgA1 протеазы в процессе рефолдинга получен
при использовании белков, предварительно очищенных хроматографическими методами в
денатурирующих условиях. Максимальный выход целевых белков при хроматографической
очистке получен при использовании Q-сефарозы и Ni-агарозы. Оптимизированные способы
получения IgA1 протеазы позволяют выделять высокоочищенные белки с выходом
конечного продукта около 4 мг из 1 г биомассы.
Разработка молекулярно-генетических методов детекции патогенов и продуцируемых
ими токсинов
Группа Молекулярная диагностика
Разработка тест-систем в формате «реального времени» для детекции грибов рода
Fusarium по спектру продуцируемых ими токсинов.
Ввиду высокой межвидовой гомологии последовательностей нуклеотидов ДНК
близкородственных видов, а также с целью уменьшения количества анализов, нами
предложен подход, позволяющий с помощью одной пары праймеров детектировать
несколько видов со сходным профилем продуцируемых микотоксинов. Анализ имеющихся в
базе данных последовательностей нуклеотидов ДНК представителей рода Fusarium показал,
что гены рРНК и β-тубулина высокогомологичны и не позволяют осуществить межвидовое
разграничение. В качестве генетического маркера для подбора праймеров был выбран ген
tef1α. Он обладает достаточной дивергенцией, кроме того известно, что степень гомологии
последовательностей этого гена между разными видами коррелирует со спектром
продуцируемых ими токсинов. Поэтому праймеры подбирали к участкам гена,
консервативным в пределах выбранной группы, но вариабельным между группами.
На основании известных данных о спектре продуцируемых вторичных метаболитов было
разработано 4 пары специфических праймеров и 3 флуоресцентно-меченых зонда,
обеспечивающих детекцию результатов ПЦР в формате «реального времени».
Специфичность олигонуклеотидов показана в тестах на 38 моноспоровых изолятах грибов
рода Fusarium 12 видов. Кроме того, определена чувствительность тест-систем, которая
составила 102 копий специфической ДНК на реакцию. Разработанная система является
перспективной с точки зрения создания на её основе стандартных наборов для рутинной
диагностики возбудителей фузариоза. Данные, получаемые с помощью таких наборов,
позволяют охарактеризовать видовой состав патогенов в партии зерна и продуктах его
переработки и спрогнозировать, какие микотоксины могут накапливаться в процессе
хранения и транспортировки.
Оптимизация методики проведения иммуно-ПЦР для детекии токсина А и токсина
тканевого шока золотистого стафилококка
Для проведения иммуно-ПЦР использовали надмолекулярные комплексы,
формируемые из фрагментов ДНК, биотинилированных с двух концов, и стрептавидина. Для
приготовления комплексов использовали биотинилированную по обеим концам
двухцепочечную ДНК длиной 750 пар оснований. Показано, что комплексы образуются
быстро (менее 1-2 сек) и являются стабильными, при этом, по большей части, используется 2
«валентности» молекулы стрептавидина. Размер образуемых трехмерных комплексов
зависит от молярного отношения стрептавидина и ДНК, используемых при их образовании.
При соотношении 1:1 образуются наиболее протяженные комплексы электрофоретической
подвижностью соответствующие ДНК размером 1500-50000 п.н. На первом этапе был
разработан базовый протокол проведения иммуно-ПЦР. Для анализа использовали
разведения чистого антигена от 100 нг/мл до 100 фг/мл. Таким образом оптимизирована
методика проведения иммуно-ПЦР на токсины А и тканевого шока золотистого
стафилококка с использованием надмолекулярных конъюгатов ДНК-стрептавидин и
биотинилированных антител, с чувствительностью 1 пг/мл.
Получение и исследование новых полимерных материалов для биосепарации и
биоанализа, иммобилизации клеток и молекул (ферментов, пептидов, биолигандов,
ДНК и др.) и разработка новых методов и систем на основе предложенных материалов
Лаборатория полимеров для биологии
В ходе исследований (проведенных совместно с группой Молекулярной диагностики
ИБХ РАН и МИТХТ им. М.В. Ломоносова) оптимизирован «матричный» метод получения
композиционных полианилин-содержащих сорбентов. При этом в качестве полимерного
модификатора использовали либо предварительно полученный (готовый) поликомплекс
ПАНИ-полисульфокcилота, либо (как вариант) этот поликомплекс формировали
непосредственно в процессе синтеза на поверхности носителя. Показано, что мономер
(анилин) в процессе матричной полимеризации (где «матрицей» служит макромолекула
поликислоты) расходуется на образование поликомплекса, т.е. собственно полимерного
модификатора, а не на образование частиц ПАНИ в объеме реакционной смеси (которые в
случае традиционной осадительной полимеризации загрязняют конечный продукт и требуют
проводить интенсивную отмывку сорбента перед использованием). Получение указанного
поликомплекса не требует применения низкомолекулярной кислоты в качестве допанта.
Эффективность применения полученного композита продемонстрирована на ряде примеров
выделения нуклеиновых кислот из различных источников.
Для получения стабильных при длительном хранении препаратов очищенных
нуклеиновых кислот разработан новый способ получения композитов, модифицированных
поликомплексами ПАНИ с полистиролсульфокислотой (отличающейся по строению и
физико-химическим свойствам от применяемых ранее сополимерных поликислот).
Оптимизирован разработанный ранее метод озон-инициированной сополимеразции
фтормономеров на поверхности обработанного озоном кремнезема, что позволило модифицировать,
в среднем, по 20 г носителя за цикл. Эффективность использования озонированного кремнезема
в качестве гетерогенного инициатора полимеризации была продемонстрирована при
проведении окислительной полимеризации анилина в отсутствии традиционных для таких
систем окислителей, растворимых в реакционной среде. Показано, что при инкубировании
озонированного кремнезема в подкисленном водном растворе анилина, не содержащем
низкомолекулярного окислителя, ПАНИ образуется только на только поверхности носителя.
Равномерность образующегося ПАНИ покрытия подтверждали данными ртутной
порометрии и тестами на гидролитическую стабильность. Измеренные толщины
полимерного покрытия составили, в среднем, 8.5 нм. Значительное увеличение стабильности
материала в условиях щелочного гидролиза (в 7 раз по сравнению с немодифицированным
носителем) подтверждает, что бездефектное полимерное покрытие образуется как на
внешней поверхности частиц носителя, так и на внутренней поверхности пор.
Продолжены работы по внедрению метода спектрально-фазовой интерференции (SPI
2, ИОФ РАН) в практику исследований процессов, протекающих на границе раздела фаз
твердая поверхность/жидкость.
Были исследованы конформационные перестройки глобул иммобилизованной
рекомбинантной олигопептидазы В при взаимодействии с субстратами с гидрофобными
остатками в P2-положении Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA, и обнаружен необычный эффект
ингибирования субстратом в области их высоких концентраций, значительно более
выраженный в отсутствие ионов кальция.
Продолжены работы по изучению влияния состава подвижной фазы на образование
комплексов между поверхностно-привитыми боронатсодержащими полимерами и муцином,
и их разрушение в присутствии различных сахаров, прежде всего фруктозы.
Изучена динамика образования комплексов между иммобилизованным альгинатом натрия
(Alg) и поливиниловым спиртом (ПВС), а также формирования многослойных
наноразмерных пленок Alg/ПВС/поли-L-лизин (PLL). Разработана методика получения
тонких (30-100 мкм) слабонабухающих Alg/ПВС, Alg/ПВС/PLL пленок. В условиях in vitro с
использованием клеток HBL и клеток, полученных из лимбальной зоны глаза кролика,
показано, что полученные пленки не оказывают выраженного цитотоксического воздействия
на указанные клетки, в частности клетки лимба эффективно прикреплялись и
распластывались по поверхности пленок, и сохраняли жизнеспособность, по крайней мере, в
течение 14-20 суток. В условиях in vivo Alg/ПВС пленки разрушались (глаз кролика) в
течение 2-3 суток, а Alg/ПВС/PLL пленки сохраняли свою целостность в течение, по крайней
мере 8-10 суток, при этом в отсутствие любого медикаментозного лечения отмечается
слабовыраженное воспаление глаза.
Выполнено физико-химическое исследование коммерческого препарата хитозана
фирмы Sigma. Молекулярную массу полимера оценивали тремя независимыми методами:
капиллярная вискозиметрия, гель-проникающая хроматография и динамическое
светорассеяние. Проведена химическая модификация хитозана с целью оптимизации
амфифильных свойств и обеспечения растворимости при физиологическом значении pH.
Синтезированы конъюгаты с рядом пептидов-эпитопов и противоопухолевым
антибиотиком доксорубицином. Полученные препараты исследованы в экспериментах in
vitro и in vivo.
Оптимизированы условия экстракции IgA1-протеазы из цетавлонового осадка,
относящегося к отходам производства менингококковой вакцины. Наиболее высокий выход
получен при экстракции 0,05 М ацетатом аммония, рН 8 с добавлением пропилового спирта
(20 %). После очистки методом адсобционной хроматографии на МПС-500 и методом
гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе получено приблизительно 1 мг IgA1протеазы, удельная активность которой составляет 750 усл. ед./мг.
Разработан оптимизированный метод выделения из нормальной крови IgA1, пригодного
для использования в качестве субстрата IgA1 протеиназы. Из 29 мл плазмы получено 35 мг
очищенного IgA1 (чистота ок. 90%), который связывается с неактивной рекомбинантной
IgA1 протеазой и расщепляется активной рекомбинантной IgA1 протеазой. По данным ИФА
титр препарата IgA1 при концентрации белка 1 мг/мл составляет около 2,5 тыс. Полученный
IgA1 можно использовать для характеристики и определения активности различных
препаратов рекомбинантной и природной IgA1 протеиназы.
Разработаны
биоматериалы для тканевой инженерии в виде биодеградируемых
микроносителей на основе полилактидов (PLLA, PDLLA) и полилактида-ко-гликолида
(PLGA) и
полимерных
гидрогелевых матриксов на основе модифицированного
поливинилового спирта с модифицированной поверхностью, обеспечивающей хорошую
адгезию клеток. В модели in vitro на основе мультиклеточных опухолевых сфероидов,
полученных в микрокапсулах при культивировании аденокарциномы молочной железы
человека (MCF-7), исследовано фотодинамическое воздействие двух фотосенсибилизаторов
(Хе6 и ФС®); показано, что клетки в сфероидах более устойчивы к воздействию ФДТ, чем
клетки в монослойной культуре (2D модель).
Разработка биотехнологии синтеза новых модифицированных нуклеозидов с
помощью ферментов нуклеинового обмена
Лаборатория биотехнологии
Создание химико-ферментативных подходов к синтезу серии 2,6-пуринзамещенных
нуклеозидов серии рибозы и 2’-дезоксирибозы.
Получены предварительные данные о возможности синтеза нуклеозидов трех типов
(рибо-, дезоксирибо- и арабино-) из 2-NAc-6-хлор-, 2-NAc-6-окси- и 2-NAc-6метоксипуринов – ключевых синтонов для получения аналогов неларабина. Показано, что в
реакции синтеза рибо- и дезоксирибозных производных 2-NAc-6-окси- и 2-NAc-6метоксипурина в реакционных смесях присутствует два продукта с эквивалентными
массами, что свидетельствует об образовании N7-,N9-изомеров нуклеозидов по пуриновому
кольцу.
В
случае
использвания
в
качестве
донора
арабинозы
1-β-Dарабинофуранозилурацила в реакции получается один продукт, структура которого
устанавливается в настоящий момент. Целевые продукты из реакционной смеси выделялись
с
помощью
обращеннофазовой
хроматографии.
Синтезированные
соединения
охарактеризованы данными ВЭЖХ, масс-спектрометрии и 1Н-ЯМР-спектроскопии.
Синтез новых аналогов противоопухолевого препарата Кладрибина, содержащие 3’амино-2’,3’-дидезоксирибозу. Проведение оценки их терапевтического потенциала,
наряду с Кладрибином, в культурах мононуклеарных клеток крови больных
различными формами рассеянного склероза (РС).
Фармацевтическая субстанция Кладрибина и два его принципиально новых
структурных аналога (2-амино-6-хлор-пурин-2’-дезоксирибозид, iso-CdA; 3’-амино-2’,3’дидезокси-2-хлораденозин, amino-CdA) получены в ИБХ РАН биотехнологическим
способом с использованием генно-инженерных ферментов. В качестве исходных соединений
в синтезе нуклеозидов использовались 2-амино-6-хлор-пурин, 2-фтораденозин и 2хлораденозин, полученные по новой технологии в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН.
Остатки 3’-амино-2’,3’-дидезоксирибозы присоединяли к гетероциклическим основаниям с
помощью генно-инженерных ферментов пуриннуклеозидосфорилаз по реакции
трансгликозилирования. Этим способом были получены два соединения: amino-FdA, aminoCdA и 3’-N-оксим-CdA с выходами (72, 63 и 24 % соответственно). После изучения физикохимических характеристик синтезированных соединений созданы сертификаты соответствия
со спецификациями, содержащими данные 1Н ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии и
ВЭЖХ. На следующем этапе работ было проведено масштабирование технологии синтеза
модифицированных нуклеозидов по разработанным нами способам, наработаны партии
препаратов, достаточные для проведения первичного биологического скрининга в системах
in vitro. Показано цитотоксическое действие аналогов Кладрибина на покоящиеся
лимфоциты больных РС и здоровых доноров: средние концентрации, вызывающие 50%-ную
гибель покоящихся МКПК (LD50) для Кладрибина лежат в диапазоне 0,003-0,01, для АminoFdA - в диапазоне 3-10 мкг/мл, a для Аmino-CdA - 10-30 мкг/мл. Таким образом,
экспериментальные данные о цитостатической активности синтезированных соединений для
клеток здоровых доноров и больных РС выявило существенно меньшую цитотоксичность
amino-FdA и amino-CdA (по сравнению с Кладрибином). Изучение динамики влияния
различных доз аналогов Кладрибина на пролиферативные свойства лимфоцитов выявило
сходную картину ингибирования неспецифической пролиферацию МКПК как здоровых
доноров, так и больных РС.Сравнение новых аналогов Кладрибина с исследованными ранее
по мере убывания средних концентраций, вызывающих 50%-ную гибель покоящихся МКПК
здоровых доноров и больных РС, позволило выстроить их в следующий ряд: CdA ≈ 2-F-dA <
F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < OH-Ara-A ≈ 2-ОМе-dA < Amino-FdA < F,F-BI-dR ≈N-оксимCdA ≤ Iso-CdA ≤ Amino-CdA. Сравнение новых аналогов Кладрибина с исследованными
ранее по мере убывания средних концентраций, вызывающих 50%-ное ингибирование
пролиферации МКПК здоровых индивидов и больных РС позволило выстроить их в
следующий ряд: МК - CdA ≈ 2-F-dA < F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < Amino-FdA ≤ OH-Ara-A ≈
2-ОМе-dA < F,F-BI-dR ≈N-оксим-CdA ≤ Iso-CdA< Amino-CdA.
Синтез клинически важных противоопухолевых нуклеозидов (кладрибина и
клофарабина) с помощью каскадных ферментативных реакций.
Нами было доказано, что применение каскадного подхода к получению
модифицированных нуклеозидов возможно не только для разработки способа синтеза уже
известных соединений, но и для получения принципиально новых производных для
последующего тестирования их биологической активности.
В 2011 г. проведены следующие работы:

синтезирован ряд пентофураноз, модифицированных по С2 и/или С3 атомам углерода,
и изучена их субстратная активность в реакциях, катализируемых РК;

изучены сахара-пентофуранозы, проявившие удовлетворительную субстратную
активность в РК реакции, в качестве исходных в каскаде ферментативных реакций
ведущих к пиримидиновым (РК, ФПМ, УФ/ТФ) или пуриновым (РК, ФПМ, ПНФ)
нуклеозидам;

определен надежный химический метод синтеза D-пентофуранозо-1-фосфатов и их C2
и/или C3 модифицированных аналогов для использования в каскадном методе синтеза
новых модифицированных нуклеозидов;

синтезирован ряд перацилпроизводных пентофураноз, модифицированных при C2
и/или C3 атомах углерода и изучение их превращения в соответствующие
пентофуранозо-1-фосфаы; изучена субстратная специфичность пентофуранозо-1фосфатов в реакциях, катализируемых УФ, ТФ и ПНФ.

Впервые проведен синтез клинически важных противоопухолевых нуклеозидов
(кладрибина и клофарабина) с помощью каскадных ферментативных реакций.
Получена серия замещенных по амидной группе производных рибавирина –
потенциальных противовирусных нуклеозидов.
Проведены работы по получению серии новых модифицированных нуклеозидов с
помощью генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз исходя из 21 новых
гомологов 1,2,4-триазол-3-карбоксамида, замещённых по 5-ому положению гетероцикла
и (или) по амидной. Углеводная часть молекул представлена: рибозой, 2’-дезоксирибозой
или 3’-дезокси-3’-амино-рибозой. Проведены работы по изучению физико-химических
свойств экспериментальных образцов целевых нуклеозидов, созданы сертификаты
соответствия и наработаны препараты для скрининга противовирусной активности
полученных соединений.
Разработка технологий производства терапевтических препаратов в эукариотических
клетках
Лаборатория биотехнологии
Получение клеточной линии rhuFSH/IK, экспрессирующей человеческий ФСГ на
основе линии клеток яичника китайского хомячка СНО К1 DXB11.
Исходным материалом для создания продуцента ФСГ служила линия клеток яичников
китайского хомячка СНО К1 DXB11, полученная из Российской коллекции клеточных
культур (РККК) при Институте Цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Основатель
линии -Dr. Lawrence Chasin (Колумбийский Университет, Нью-Йорк, США). Исходную
линию культивирровали в среде F12 с добавлением 10% FBS (эмбриональная телячья
сыворотка) как адгезионную культуру при 370С с 5% содержанием СО2. Пересев
осуществляют 0.25% раствором трипсина каждые 2-3 дня с кратностью рассева 1:10 или
5х105 клеток на флакон с поверхностью 25 см2. В клеточной линии СНО К1 DXB11 одна
аллель гена dhfr делетирована, другая подверглась мутации с потерей функции. Линия
ауксотрофна по гипоксантину или аденину, глицину, тимидину и пролину. Фермент
дегидрофолатредуктаза (DHFR) катализирует редукцию 5, 6-дигидрофолата дo 5, 6, 7, 8тетрадегидрофолата, необходимого для синтеза ДНК. Клетки линии СНО К1 DXB11 не
обладают активностью DHFR и растут только в среде с добавлением пуриновых
предшественников гипоксантина и тимидина, пока они стабильно не трансфецированы
вектором, содержащим ген dhfr. Линию СНО К1 DXB11 адаптировали к росту в среде
ДМЕМ с добавлением 1:100 100х раствора антибиотики/антимикотики (А/А), 2 mM
глутамина, 1:100 100x раствора заменимых аминокислот, 1:50 50х добавки HT, содержащей
гипоксантин и тимидин (все среды и добавки фирмы Invitrogen, США). Линию тестировали
на отсутствие активности DHFR (дегидрофолатредуктазы) , то есть ауксотрофность по
гипоксантину и тимидину: исключение добавки HT из среды приводило к постепенной
остановке деления и последующей гибели клеток. Линию также проверяли на отсутствие
микоплазменной контаминации окрашиванием флюоресцентными красителями ДНК DAPI
и Hoechst.
Экспрессионные плазмиды pcDNA/FSH
и pOptiVEC/FSH
котрансфецировали в
клетки линии CHO К1 DXB11 методом липосомальной трансфекции. После двойной
селекции в селекционной среде определённого химического состава не содержащей
гипоксантина и тимидина с добавлением селекционного агента генетицин (G418) получают
пул стабильно трансфецированных клеток. Дальнейшую амплификацию экспрессионных
кассет осуществляли посредством культивироваия клеток в присутствии возрастающих доз
(50-100 нМ) метотрексата (МТХ). Полученный пул клеток, устойчивый к МТХ, клонировали
методом лимитирующих разведений. Полученные из единичных клеток клоны
анализировали методом иммуноферментного анализа. Выбирают 5-6 клонов с максимальным
уровнем секреции ФСГ. Отобранные клоны тестировали по таким параметрам, как уровень и
стабильность экспрессии целевого белка, а также адаптируемость к росту и продуции ФСГ в
суспензии. Отобранный клон с начальной продуктивностью не менее 12 МЕ/мл,
размножали на ранних пассажах (3-5) и сохраняли методом криоконсервирования для
последующего создания мастер банка.
Культуральные свойства
Клетки клона выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 1:100 100х раствора
антибиотики/антимикотики (А/А), 2 mM глутамина, 1:100 100x раствора заменимых
аминокислот (Gibco), 10% диализованной FBS (Sigma), 100 нМ метотрексата (МТХ , Sigma)
при 370, 5% СО2 как адгезионную культуру. Пересев монослоя осуществляли 0.25%
раствором трипсина с кратностью 1:10 каждые 3-4 дня. Начальный фенотип К1, присущий
родительской линии, подтвержден отсутствием роста в среде, не содержащей пролин.
Подтверждено отсутствие грибов, бактерий и микоплазмы в культуре. Продукцию
человеческого ФСГ определяли методами ИФА и иммуноблота.
Продукция ФСГ сохраняется на начальном уровне, по крайней мере, в течение 30
пассажей (3-х месяцев) при культивировании с МТХ (в селективных условиях) и, по крайней
мере, в течение 15 пассажей (1.5 месяцев) без МТХ (в неселективных условиях), что
указывает на высокую стабильность геномных копий целевых генов. Высокая стабильность
позволяет сделать заключение о создании линии, потенциально применимой в
фармацевтической промышленности для производства лекарственных форм ФСГ. Линия
получает название rhuFSH/IK.
Продуктивность суспензионной культуры после адаптации к росту в суспензии в
бессывороточных средах составляет 18 МЕ/106 клеток в день, что в 1.5 раза превышает
продуктивность ранее созданных продуцентов ФСГ, описанных выше.
Конструирование экспрессионных плазмид и эффективных бактериальных и
дрожжевых продуцентов полипептидов медицинского назначения, обладающих
антибактериальной, антивирусной и противоопухолевой активностью
Лаборатория биотехнологии
Блок антиангиогенных рекомбинантных полипептидов, состоящий из фрагментов
природных ингибиторов ангиогенеза (эндостатина, тумстатина и пигментного
эндотелиального фактора), создан с помощью генно-инженерных технологий. Вначале
осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в Esherichia coli
искусственных генов, кодирующих фрагмент тумстатина Tum8 (69 – 95), фрагмент PEDF (24
– 57) и фрагмент эндостатина (1 – 49). Сконструированы: рекомбинантная плазмида,
содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные
последовательности фрагмента PEDF (24 – 57); плазмида, содержащая гибридный ген белка,
в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента эндостатина (1 – 49) и
плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные
последовательности фрагмента фрагмента тумстатина Tum8 (69 – 95). Созданы
высокоэффективные штаммы-продуценты и наработаны опытные партии целевых пептидов.
Исследования
проводились
совместно
с
сотрудниками
лаборатории
экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.
Блохина РАМН. Для подтверждения антиангиогенной активности полученных пептидов был
проведен стандартный комплекс тестов, позволяющий оценить действие пептидов на ранних
этапах
ангиогенеза
(пролиферация
эндотелиальных
клеток
и
образование
капилляроподобных структур). Антиангиогенные свойства пептидов PEDF(44–77),
эндостатин (1-49) и тумстатин (L69K-95) были изучены в диапазоне концентраций от 20 нМ
до 0,1 нМ. В работе использовали иммортализованную культуру эндотелиальных клеток
(ЭК) мыши SVEC-4-10. В исследованиях in vitro все три пептида продемонстрировали
способность подавлять начальные этапы ангиогенеза. Были определены эффективные
концентрации препаратов для дальнейших испытаний in vivo: 10 нМ для эндостатина (1-49) и
тумстатина (69-95), 1 нМ для PEDF (44-77).
Биологическая активность тестируемых пептидов изучалась in vivo на моделях
заболеваний глаз, протекающих с ангиогенезом. Исследования проводились совместно с
сотрудниками отделения офтальмологии ЦКБ РАН. В работе использовали две модели
неоваскуляризации роговицы кролика для оценки антиангиогенной активности тестируемых
пептидов на разных стадиях развития патологического процесса. С помощью первой модели
анализировали способность препаратов предупреждать развитие патологической
неоваскуляризации: пептиды вводили в глаза животных одновременно с индукцией
ангиогенеза. Вторая модель позволяла выявить аваскулогенный эффект пептидов, т. е. их
способность резорбировать вновь образованные сосуды, и оценить эффективность
препаратов на более поздних стадиях развития заболевания. В этом эксперименте пептид
вводили в глаз через 8 дней после индукции ангиогенеза, когда сосудистая сеть частично
сформирована.
Первую модель ангиогенеза формировали путем прошивания роговицы с лимба
викриловыми швами. Все 3 антиангиогенных пептида оказывали сопоставимый клинически
значимый антиангиогенный эффект, который проявлялся в том, что сосуды, несмотря на
нанесенную травму и внесение индуктора ангиогенеза (шовный материал), в роговицу не
врастали. Помимо антиангиогенной активности пептиды оказывали противоотечный эффект.
Наиболее выраженными противоотёчными свойствами обладал фрагмент PEDF: площадь
помутнения роговицы в соответствующем опытном глазу не превышала 10%, в то время как
аналогичный показатель для фрагмента тумстатина составил 42%, а эндостатина – 82%. На
второй модели ожога роговицы кролика был продемонстрирован клинически значимый
дозозависимый аваскулогенный эффект фрагмента тумстатина (69-95). Предположена
гипотеза, что взаимодействие данного пептида с интегринами на поверхности ЭК может
приводить к нарушению контактов этих клеток с базальной мембраной и последующему
апоптозу ЭК.
В целом для подавления патологического ангиогенеза предлагается комплексный
подход с применением на ранних стадиях PEDF и тумстатин, а на поздних – эндостатин и
тумстатин. Эндостатин и тумстатин, наряду с антиангиогенным эффектом обладает
способностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток.
2 Создана гибридная конструкция, в состав которой помимо гена фактора роста
эндотелия сосудов человека VEGF165 входили ген тиоредоксина и последовательность,
кодирующая сайт для расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV протеазой). В
качестве штамма-носителя использовали клетки E.coli C3030 (NEB), содержащие в своем
геноме ген дисульфидизомеразы. Уровень биосинтеза гибридной конструкции достигал 40%
от общего клеточного белка, при этом более 90% ГБ было получено в биологически
активной димерной форме. ГБ очищали с помощью ионообменной хроматографии на
колонке Q Sepharose HP (GE Healthcare) и расщепляли TEV протеазой (выход реакции
составил 40%).
Разработка способов посттрансляционной модификации рекомбинантных
полипептидов с помощью химико-ферментативных методов
Лаборатория биотехнологии
Разработан метод получения рекомбинантного тимозина бета 4 – представляющего
собой 43-членный полипептид,
N-концевая аминокислота которого ацетилирована.
Тимозин β4 проходит клинические испытания в качестве препарата для лечения
трофических язв, ран и ожогов роговицы, а также острого инфаркта миокарда. В данной
работе мы предлагаем способ получения рекомбинантного предшественника тимозина β4 и
его последующего направленного химического ацетилирования. Дезацетилтимозин β4
получали в составе гибридного белка с тиоредоксином и специфическим сайтом для
расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV протеазой). Была разработана
следующая схема выделения дезацетилтимозина β4: (i) биосинтез растворимого гибридного
белка (ГБ) в Escherichia coli; (ii) очистка ГБ с помощью ионообменной хроматографии; (iii)
расщепление ГБ TEV протеазой; (iv) очистка дезацетилтимозина β4 от тиоредоксина с
помощью ультрафильтрации. Аминоконцевое ацетилирование полученного пептида
осуществляли добавлением уксусного ангидрида к раствору дезацетилтимозина β4 при pH
3,0. Выход реакции составил 55%. Дальнейшую очистку тимозина β4 производили с
помощью
обращённо-фазовой
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии.
Разработанный нами способ выделения рекомбинантного тимозина β4 является
перспективным для масштабирования и позволяет получать высокоочищенный препарат
для медицинского применения с выходом 20 мг с 1 л культуры
Получены
синтетические гены трех аналогов гирудина (гирудин-1, [Leu1,
Thr2]гирудин-1 и [Leu1, Thr2]гирудин-1/3), которые были клонированы в экспрессионный
вектор pTwin1 в одной рамке считывания с геном мини-интеина DnaB из Synechocystis sp.
Штаммы-продуценты соответствующих гибридных белков были созданы на основе штамма
E.coli ER2566. Разработаны схемы получения 63-десульфатогирудина-1 и его аналогов,
включающие стадии выделения гибридного белка после разрушения клеточной биомассы
штаммов-продуцентов, ренатурацию целевого пептида в составе гибридного белка, его рНиндуцируемое расщепление и хроматографическую очистку целевого продукта. Получены
конъюгаты аналогов гирудина с альдегидами полиэтиленгликоля (5 кДа) и полисиаловой
кислоты (14 кДа). С помощью стандартного амидолитического теста были определены
антитромботические активности полученных пептидов.
Получение ферментов, важных для жизнедеятельности микобактерий , вызывающих
туберкулез с целью изучения их пространственной структуры и механизма работы
активного центра
Лаборатория биотехнологии
Рекомбинантный микобактериальный фермент Фосфопантетеин аденилилтрансфераза
Mycobacterium tuberculosis (РРАТ Mt) получен в клетках E. сoli с использованием
сконструированного бактериального штамма-продуцента. Биомассу содержащую целевой
фермент суспендировали в лизирующем буфере, подвергали дезинтеграции ультразвуком и
центрифугировали. Супернатант, фракционировали на колонке с Sepharose Q XL в градиенте
NaCl. Контроль фракций проводили спектрофотометрически при 280нм и с помощью SDSPAGE в 15% геле. Фракции, содержащие РРАТ, объединяли и фракционировали на Sepharose
Q HP в градиенте NaCl. Фракции, содержащие РРАТ объединяли, концентрировали
ульрафильтрацией и отделяли минорные количества белковых и небелковых примесей с
помощью гель-фильтрации на Sepharose S-200. Полученный фермент концентрировали до
концентрации 17,3мг/мл и хранили при -70 С.
Кристаллы фермента выращены методом встречной диффузии в капиллярах в условиях
невесомости в оборудовании японского космического агентства JAXA, в экспериментальном
модуле Kibo [1]. От выращенных кристаллов на синхротроне SРring8 собраны
дифракционные наборы до разрешения 1.6Å (свободный РРАТ Mt) и 1.5 Å (комплексы РРАТ
Mt/СоА, PPAT Mt/ДФСоА).
С использованием полученных наборов методом молекулярного замещения решены
структуры PPAT Mt в апо-форме и в комплексах с лигандами. Структуры уточнены при
разрешении 1.69, 1.59 и 1.59 Å, Rf составили 0.1704, 0.1611 и 0.1627, Rfree – 0.2195, 0.2108 и
0.2115 соответственно для апо-формы, комплекса с СоА и комплекса с ДФСоА. В
полученных структурах определены места связывания лигандов, охарактеризовано их
окружение, прослежены конформационные изменения, сопровождающие связывание
лигандов.
Разработка технологии изучения безопасности продуктов, полученных
биотехнологическими методами
Лаборатория биологических испытаний
Изучено влияние экзогенного белка теплового шока 70 кДа на развитие
грамположительного сепсиса у крыс. Показано, что белок теплового шока 70 кДа способен
уменьшать токсические эффекты липотейхоевой кислоты, которая является структурным
компонентом клеточной стенки Staphilococcus aureus. Внутривенное введение
липотейхоевой кислоты вызывает гибель до 50% животных, белок теплового шока 70 кДа
снижал гибель животных до 10%.
Получение и молекулярно-генетический анализ модифицированных растений для
современной биотехнологии
Лаборатория биотехнологии растений
С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ
получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Проведен
молекулярно-биологический и биохимический анализ растений поколений F0 и F1. Показан
стабильный синтез HBs-антигена в безмаркерных растениях табака и томата поколения F1.
На лабораторных мышах проведены испытания иммуногенности клубней безмаркерного
картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. Показано
значительное повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных
животных, сохраняющееся в течение более года после начала иммунизации. До настоящего
времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой
продолжительности при использовании трансгенных растений в качестве съедобной
вакцины. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем
модифицированного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с
четырьмя энхансерами. Количество HBs-антигена достигало 0,1% от общего растворимого
белка растений, что достаточно для исследования иммуногенности.
Получены трансгенные растения табака с суперэкспрессией гена антимикробного
пептида цекропина Р1 (сесР1). Для трансформации использовали полученную конструкцию
бинарного вектора pPCV91::сесР1. Экспрессия клонированного гена осуществлялась под
контролем конститутивного суперпромотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты
(CaMV 35S), содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и
нетранслируемую ΔΩ лидерную последовательность тРНК вируса табачной мозаики.
Проведена агробактериальная трансформация растений табака. Полученные трансгенные
растения проявляли повышенную устойчивость к фитопатогенным бактериям Erwinia
carotovora, Pseudomonas syringae и грибам Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi.
Получены колонизированные растения томата, картофеля, земляники и табака с
повышенной устойчивостью к фитопатогенам (Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum) и
ксенобиотикам (нафталин, паракват). Для микробной колонизации использовали полезные
ассоциативные штаммы Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida и Methylovorus mays.
Изменения в репродуктивной сфере у трансгенных растений табака с модифицированной
экспрессией гена hmg1 продемонстрированы с применением биохимических и
микроскопических методов, а также с помощью сочетания методов ОТ-ПЦР и ПЦР в
реальном времени. Показано снижение генеративных функций у «антисмысловых» линий
растений, что выявлено как в развитии мужской и женской репродуктивной сферы, так и при
формировании семени. Обнаружено ингибирование уровня экспрессии гена hmg1 в
пыльниках этих линий. Методами микроскопии и мезоструктурного анализа показано
изменение толщины листа и плотности упаковки клеток у трансгенных линий, выявлена
корреляция между анатомией листа «смысловых» форм трансгенных растений и их
устойчивостью к Pseudomonas syringae. Ингибирование экспрессии гена hmg1 снижало
устойчивость «антисмысловых» линий растений табака к действию тяжелых металлов.
Детальное исследование содержания стеринов в листьях трансгенных растений продолжено
с помощью метода газовой хроматографии. Проведена агробактериальная трансформация
растений томата и картофеля генетическими конструкциями с геном hmg1.
Полевые испытания и вопросы биобезопасности трансгенных растений
Станция искусственного климата «Биотрон»
Закладка опытного участка для изучения вертикального переноса гетерологичного
генетического материала в насаждениях многолетних древесных культур на
экспериментально сертифицированном МВГКИД полигоне для испытаний трансгенных
растений начата в 2010 году. Однако экстремальные погодные условия лета 2010 года
привели к гибели значительной части насаждений и задержке развития уцелевших, что
потребовало перезакладку значительной части насаждений.
Весной 2011 года были высажены трансгенные растения сливы сорта Стартовая
экспрессирующие гены GFP и GUS. В частности содержащих кассету экспрессии
pNov35SGFP 9 линий по 3 растения; pBin35SmGFP5-ER 1 линия, 3 растения; pGAGFP-AFVY
4 линии по 3 растения; pCam35SGFP 7 линий по 3 растения и 3 линии трансформированные
конструкцией pCamPPVRNAi содержащей в качестве репортерного гена GUS. В качестве
доноров высажены нетрансгенные растения сливы того же сорта на расстояниях 3, 5. 10, 25,
50, 100 и 150 м для оценки частоты переноса трансгенной пыльцы, перекрестного опыления
и образования гибридного потомства. Высажено 10 саженцев трансгенной яблони, в том
числе 4 растения содержащих репортерный ген gfp и 6 растений четырех линий, содержащих
репортерный ген gus. Также высажены контрольные нетрансгенные саженцы яблони на
расстоянии 3, 10, 50, 100 и 150 м для проведения анализа переноса генов с пыльцой от
трансгенных деревьев к нетрансгенным.
Разработка методов и получение растений с/х культур, устойчивых к биотическим и
абиотическим стрессам и с улучшенным качеством урожая
Станция искусственного климата «Биотрон»
Для проведения экспериментов по генетической трансформации хозяйственно-ценного
генотипа томата ЯЛФ использовали вектор pBI35SAgNHX2, содержащий ген вакуолярного
Na+/H+ антипортера agnhx, клонированного из генома растения-галофита Atriplex gmelina, а
также содержащий ген-селективный маркер nptII.
В результате субкультивирования инокулированных агробактериальной суспензией
эксплантов семядолей на питательной среде для индукции органогенеза побегов с
добавлением селективного агента (канамицин, 25 мг/л) было отобрано 13 независимых
канамицин-устойчивых каллусных тканей, из которых впоследствии регенерировали
полноценные зеленые побеги, успешно пролиферирующие и укореняющиеся в присутствии
летальных доз канамицина (100 мг/л)
Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был
проведен ПЦР-анализ. При амплификации с использованием специфических праймеров на
последовательность гена nptII были получены фрагменты, соответствующие позитивному
контролю (плазмидной ДНК) во всех случаях, тогда как интеграция гена agnhx обнаружилась
только у семи из тринадцати канамицин-устойчивых линий. Препараты тотальной геномной
ДНК также проанализировали на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения
ложноположительных результатов вследствие бактериальной контаминации. Эффективность
трансформации, рассчитанная как отношение полученных трансгенных побегов к общему
числу эксплантов, линии ЯЛФ томата с использованием бинарного вектора pBI35SAgNHX2
составила соответственно 10,0% (по селективному гену) и 5,4% (по целевому гену).
Получение растительной системы синтеза рекомбинантных белков (биофарминг)
Станция искусственного климата «Биотрон»
В результате проведённых исследований получены трансгенные растения табака и ряски
малой, экспрессирующие пептид М2е вируса гриппа птиц H5N1 Curgan2005 в
трансляционном слиянии с белками β-глюкуронидазой и субъединицей Б рицина. Методом
ИФА был проведен количественный анализ уровня накопления целевых протеинов в
трансгенных растениях, экспрессия слитого белка М2е- β-глюкуронидаза в растениях табака
находилось в диапазоне 0,005-0,2% общего растворимого белка, М2е- субъединица Б
рицина- 0,1-0,3%. Уровень экспрессии этих белков в ряске малой был существенно выше,
экспрессия слитых белков М2е- β-глюкуронидаза и М2е- субъединица Б рицина находилась
в диапазоне 0,4-2,6% и 0,2-1,2% общего растворимого белка, соответственно. В результате
отобраны линии трансгенных растений ряски, экспрессирующих слитые белки М2е- βглюкуронидаза на уровне 2,6% и М2е- субъединица Б рицина- 1.2% общего растворимого
белка, соответственно. В настоящее время проводится тестирование биомассы полученных
растений-продуцентов на лабораторных животных.
Изучение молекулярных механизмов секреторного процесса внеклеточных
бактериолитических ферментов грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. XL1
Лаборатория нейрохимии ФИБХ
Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. XL1 является продуцентом внеклеточных
литических ферментов, разрушающих компоненты клеточной стенки других бактерий и
простейших эукариот. Установлены их антагонистические свойства в отношении
болезнетворных микроорганизмов грамположительных и грамотрицательных бактерий,
грибов, дрожжей, оомицетов, что предполагает использование в медицинской и
ветеринарной практике в качестве альтернативы антибиотикам. Задача создания
высокоэффективных штаммов-продуцентов литических ферментов делает необходимым
исследование их механизмов секреции. Секретируемые бактерией сериновые эндопептидазы
- AlpA и AlpB, на 59% гомологичные друг другу, первоначально синтезируются в виде
белков-предшественников, содержащих сигнальный пептид, N-концевой пропептид и
зрелую часть, превращающуюся в активную форму в процессе созревания и секреции
ферментов. Для иммунохимического исследования процессинга и секреции ферментов AlpA
и AlpB были получены и охарактеризованы представительные панели моноклональных
антител против пропептидов эндопептидаз AlpA и AlpB. Задача получения моноклональных
антител значительно осложнялась высокой степенью гомологии между исследуемыми
антигенами. Так из 12 полученных моноклональных антител против пропептида
эндопептидазы ALpA, только 2 (ProA-1 и ProA-2) не обладали иммуноперекрестной
реактивностью с нативной формой пропептида AlpB. Однако при этом все 12 полученных
моноклональных антител против пропептида AlpB не взаимодействовали с нативной формой
пропептида AlpA. Проведена иммунохимическая характеристика моноклональных антител,
не обладающих перекрестной иммунореактивностью: изотипирование, константы
аффинности. Для антител ProA-1 и ProA-2 константа, характеризующая их взаимодействие с
нативной формой пропептида AlpA, составляла 3.5х109М-1 и 2.9х109М-1,соответственно.
Значения констант аффинности моноклональных антител против пропептида AlpB
варьировали от 1,5х108М-1 до 2.2х109М-1. Показано также отсутствие перекрестной
иммунореактивности с денатурированными формами исследуемых антигенов для антител
против пропептида эндопептидазы AlpB и для антител ProA-1 и ProA-2 Полученные данные
свидетельствуют о высокой специфичности полученных моноклональных антител и их
пригодности в качестве инструментов исследования для изучения белок-белковых
взаимодействий и механизмов секреции этих эндопептидаз. С помощью полученных
моноклональных антител против ProB был идентифицирован AlpB-белковый комплекс и
оптимизированы условия его стабилизации химическими кросс-сшивающими реагентами в
клетках Lysobacter sp. XL1, секретирующих исследуемые ферменты. Исследована кинетика
образования AlpB-белковых комплексов а, следовательно, и уровня секреции фермента в
зависимости от времени культивирования Lysobacter sp. XL1.