Штамм Bacillus subtilis 11 В Штамм бактерий сенной палочки Bacillus subtilis 11 В выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе Башкирии. Идентификацию штамма проводили по « Определителю бактерий Берджи» М. Мир, 1997. Штамм Bacillus subtilis 11 В депонирован под номером ВКМ В- 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ШТАММА И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Культура штамма характеризуется следующими свойствами: B. subtilis ВКМ В-2218 Д - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре дают обильный рост. На МПА- образует серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки серовато-белого цвета и осадка. Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки, размером 2-3 х 0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, размер 0,9х0,6 мкм, расположены в клетке центрально или эксцентрично. Культура ферментирует глюкозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат натрия с глюкозой, не использует пропионат и малонат натрия, не расщепляет тирозин. Не растет в анаэробных условиях. Продуцирует каталазу, протеазу, амилазу. Не образует лецитиназу, уреазу и липазу. Редуцирует нитраты, не образует газ на среде с нитратами в анаэробных условиях. Не образует индол и сероводород. БЕЗОПАСНОСТЬ ШТАММА Культура штамма Bacillus subtilis 11 В проверена на безвредность (вирулентность, токсичность и токсигенность). Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при температуре 37 С. Выросшую биомассу смывали 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (161) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты исследований представлены в таблице 1. Таблица 1. Изучение вирулентности штамма Bacillus subtilis 11 В Кол-во ВводиСпособ КратКол-во Кол-во животмая доза введе-ния ность заболев- павших 9 ных в (х10 введения ших мышей опыте кл.мл) (раз) мышей (штук) (штук) (штук) Внутрибрюшинно 10 0,5 1 0 0 10 1,0 1 0 0 Перорально 10 1,0 5 0 0 10 3,0 5 0 0 10 5,0 5 0 0 Как следует из проведенных исследований культура штамма subtilis 11 В не вирулентна. Кол-во выживших мышей 10 10 10 10 10 Bacillus С целью более полного изучения безопасности штамма при пероральном введении, были испытаны высокие дозы штамма при разовом пероральном введении мышам (таблица 2). Таблица 2 Изучение безопасности штамма B. subtilis 11 В при разовом пероральном введении. Вводимая доза, млрд.кл/мл Количество животных (штук) Средняя масса животных, г Было выжило До введения Через сутки 1 5 10 10 15,40,3 15,60,3 16,90,3 2 10 10 10 15,70,2 15,90,3 17,00,2 3 20 10 10 16,00,2 16,00,2 17,20,2 N 1 Через суток 5 Установлено, что разовое введение per os высоких доз штамма - (1020)х109 кл/мл не приводит к снижению веса животных на первые сутки после введения и в последующие дни вес животных увеличивается. Для исследования токсичности (табл. 3) штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при 37 С, смывали 0,9 %-ным раствором хлорида натрия, готовили суспензию, содержащие от 1,0 до 5,0 млрд клеток в 1 мл, которые затем инактивировали прогреванием при 100 С в течение 1 часа. Суспензии вводили способами, описанными при изучении вирулентности. Для изучения токсигенности (табл. 4) штамм выращивали в течение 10 суток на мясо-пептонном бульоне при температуре 37 С. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный мясо-пептонный бульон. Таблица 3. Исследование токсичности штамма B. subtilis 11 В. Кол-во ВводиСпособ животмая доза введе-ния ных в (х109 опыте кл.мл) (штук) Внутрибрюшинно 10 1,0 10 2,0 10 3,0 Перорально 10 1,0 10 2,0 10 5,0 Кратность введе-ния (раз) Кол-во заболевш их мышей (штук) Кол-во павших мышей (штук) Кол-во выживших мышей 1 0 0 10 1 0 0 10 5 5 5 0 0 0 0 0 0 10 10 10 Таблица 4. Исследования токсигенности штамма B. subtilis 11 В. Кол-во Вводи- Способ КратКол-во Кол-во Кол-во животмая введеность заболевш павших выживных в доза, мл ния введе-ния их мышей ших опыте (раз) мышей (штук) мышей (штук) (штук) 1 2 3 4 5 6 7 Внутрибрюшинно 10 0,5 1 0 0 10 10 1,0 1 0 0 10 Перорально 10 1,0 5 0 0 10 10 2,0 5 0 0 10 10 3,0 5 0 0 10 Контроль - внутрибрюшинно 10 1,0 5 0 0 10 Контроль - перорально 10 3,0 5 0 0 10 Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма. ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 11 B В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Для определения специфической активности штамма B. subtilis 11 В исследовали антагонистическую активность в отношении тест культур патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений (табл. 5), человека и животных (табл. 6). Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной картофельно-глюкозной средой. Посевы инкубировали в термостате при 37 С в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37 С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельноглюкозной средой без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания представлены в таблице 5,6. Таблица 5 Спектр антагонистической активности штамма B. subtilis 11 В в отношении фитопатогенных штаммов, вызывающих заболевания растений N Тест-культуры Зоны торможения роста,мм 1 2 3 Грибов: 1 Fusarium avenaceum 18-20 2 Fusarium sporotrichiella 15-18 3 Fusarium oxysporum 15-20 4 Fusarium culmorum 12-15 5 Alternaria alternata 20-25 6 Alternaria brassicicola 15-20 7 Botrytis cinerea 15-16 8 Botrytis aclada F -81 15-20 9 Penicillium lividum 15-17 10 Emericellopsis glabra F 1312 18-20 11 Memnoniella echinata F-896 22-25 12 Thielaviopsis basicola F-972 18-20 13 Thielaviopsis basicola F-1927 20-22 Бактерии: 1 2 4 14 Erwinia carotovora 10-12 15 Xanthomonas malvaceae 12-15 Таблица 6 Спектр антагонистической активности штамма B. subtilis 11 В в отношении патогенных штаммов, вызывающих заболевания человека и животных Тест – штаммы 1 Бактерии Staphylococcus aureus (Никифоров) Staphylococcus aureus (Филиппов) St. aureus 66 Зона торможения роста, мм 2 St. aureus 67 20-22 St. aureus 81 18-20 Proteus vulgaris 177 Pr. vulgaris 12 15-20 14-16 P. vulgaris 48 12-15 Pr. vulgaris 41 12-15 Proteus mirabilis 237 Pr. mirabilis 40 18-20 15-20 Pr. mirabilis 36 15-18 Pr. mirabilis 35 15-20 Candida albicans Escherihia coli 177 E. coli 154 25-30 12-15 12-15 E. coli 140 12-15 Streptococcus 324 10-15 Streptococcus 362 12-15 Salmonella paratyphi 269 12-15 S. paratyphi 15 15-20 S. группа С infantis 155 15-18 S. группа D enteriditis 25 15-18 Shigella flexneri II 1230 22-25 Shigella sonnei 2290 18-20 Shigella HK 20-22 Грибы 20-25 20-25 15-16 Trichophyton rubrum 15-18 Microsporum canis 12-15 Aspergillus flavus N 6 12-15 Penicillium notatum N 3 12-15 Epidermophyton floccosum N 2 12-15 Из данных таблиц следует, что штамм B. subtilis 11 В обладает широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания человека, животных и растений, что создает возможность создания на его основе препаратов-пробиотиков, способных лечить широкий круг заболеваний и использоваться в медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике. УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 11B К АНТИБИОТИКАМ Чувствительность штамма к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9 %-ном растворе натрия хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (371) С в течение (182) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска. N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Антибиотикоустойчивость штаама В. subtilis 11 В . Антибиотики Зоны торможения роста, мм Содержание бактерий в 1 мл культуры штаама 1х107 5х107 1х108 5х108 1х109 5х109 Ампициллин 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 Бензилпенициллин 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 Карбенициллин 0 0 0 0 0 0 Полимиксин 0 0 0 0 0 0 Стрептомицин 0-8 0-8 0-8 0-8 0-8 0-8 Рифампицин 10-16 10-16 10-16 10-16 10-16 10-16 Гентамицин 0-7 0-7 0-6 0-6 0-6 0-6 Клотримазол 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 Левомицитин 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 Тетрациклин 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 Мономицин 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 Гептомицин 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 Клотримазол 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 Неомицин 10-14 10-14 10-14 10-14 10-14 10-14 Цепарин 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 Канамицин 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 Новограмон 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 Бисенгиол 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 Тобрамицин 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18 Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Штамм проявляет устойчивость к этим антибиотикам независимо от концентрации бактерий. 16 17 18 19