тезисы докладов - Российский государственный медицинский

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
НАУЧНО-КООРДИНАЦИОННЫЙ СОВЕТ РАМН
по отраслевой программе «Новые клеточные технологии - медицине»
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И
СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ
РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ
Ежегодная Всероссийская и международная научная конференция
«Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении»
30-31 мая 2007
МОСКВА
Ул.Островитянова д.1 РГМУ Зал Ученого совета
ПРОГРАММА
30 мая 2007 год
9 часов 00 минут – 10 часов 00 минут – регистрация участников
конференции.
Утреннее заседание 10.00-14.00. Председатели: академик РАМН В.Н.Ярыгин, академик
РАМН Г.Т.Сухих.
1) 10 часов 00 минут – Приветственное слово академика РАМН В.Н.Ярыгина.
2) 10 часов 10 минут – Приветственное слово академика РАМН Г.Т.Сухих.
3) 10 часов 20 минут – Бочков Н.П.1, Константинов А.Б.1, Миланов Н.О.1, Гольдштейн
Д.В.2 1ГУ Российский научный центр хирургии имени академика Б.В.Петровского и
2
ЗАО «РеМеТекс», Москва. «Клинические исследования клеточной терапии в
хирургии».
4) 10 часов 30 минут – Ярыгин К.Н., Российский государственный медицинский
университет и НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН, Москва.
«Регенерация органов и тканей: иерархическая и стохастическая модели».
5) 10 часов 40 минут – Котельников Г.П., Волова Л.Т., Тюмина О.В., Ларцев Ю.В.,
Волчков С.Е., Кулагина Л.Н., Клементенко Ю.А. ГОУ ВПО Самарский
государственный медицинский университет Росздрава, ГУЗ Самарской области
«Клинический центр клеточных технологий», Самара. «Получение культур клеток из
стромы костного мозга и гиалинового хряща для хондропластики».
6) 10 часов 50 минут – Чиссов В.И.1, Сергеева Н.С.1, Свиридова И.К.1, Решетов И.В.1,
Баринов С.М.2, Франк Г.А.1, Тепляков В.В.1, Кирсанова В.А.1, Ахмедова С.А.1,
Агзамов Д.С.1, Филюшин М.М.1, Комлев В.С.2, Фадеева И.В.2, Козлов В.В.1,
Бухаров А.В.1, Хесуани Ю.Д.3 1ФГУ «Московский научно-исследовательский
онкологический институт им. П.А.Герцена Росмедтехнология», 2Институт физикохимических проблем керамических материалов РАН, ИПК РАН, 3Факультет
фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва. «Синтетитческие и
натуральные биоматериалы – 3D матриксы для культуры аутологичных
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при замещении костных
дефектов в эксперименте».
7) 11 часов 00 минут – Южаков В.В., Конопляников А.Г., Цыб А.Ф., Рошаль Л.М.*,
Сушкевич Г.Н.*, Семенова Ж.Б.*, Бандурко Л.Н., Ингель И.Э., Кальсина С.Ш.,
Верховский Ю.Г., Шевчук А.С., Цыганова М.Г., Лепехина Л.А. ГУ Медицинский
радиологический научный центр РАМН, Обнинск; ГУ НИИ неотложной детской
хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы, Москва.
«Действие аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на репаративные
процессы в нервной ткани при диффузной травме головного мозга крыс».
8) 11 часов 10 минут – Савченкова И.П., Ростовская М.С.1, Чупикова М.И.1, Дьяконов
Л.П., Тепляшин А.С.1 Всероссийский государственный НИИ экспериментальной
ветеринарии им. Я.Р.Коваленко РАСХН, 1ООО Институт стволовой клетки, Москва.
«Изменение экспрессии генов в процессе дифференцировки мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани человека в
клетки костной ткани».
9) 11 часов 20 минут – Доскалиев Ж.А., Каюпов Б.А. Казахская государственная
медицинская академия, Казахстан, г. Астана, Национальный научный медицинский
центр, Казахстан, г. Астана.
«Роль фетальных стволовых клеток в восстановлении нарушенных функций органов и
тканей».
Кофе брейк: 11 часов 30 минут – 12 часов 00 минут.
10) 12 часов 10 минут – Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н.,
Эпштейн О.И. ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра РАМН, Томск.
«Фармакологическая регуляция эндогенных ст воловых клеток».
11) 12 часов 20 минут – Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Ильина В.К., Кожевников
О.В., Иванов А.В., Родионов С.В.* ФГУ ЦИТО им. Н.Н.Приорова Росздрава и
*Институт иммунологии Росздрава, Москва. «Биомедицинские технологии управления
репаративным остеогенезом».
12) 12 часов 30 минут – Сазонов С.В., Вербицкая Т.Ю. ГУЗ Центр организации
специализированных видов помощи «Институт медицинских клеточных технологий»,
ГОУ ВПО Уральская государственная академия Росздрава, ГУЗ СО Детская областная
клиническая больница, Екатеринбург. «Экспрессия CD34 на бластных клетках при
SOMMON-ALL у детей».
13) 12 часов 40 минут – Конопляников А.Г., Петриев В.М., Кальсина С.Ш., Лепехина
Л.А., Семенкова И.В., Агаева Е.В., Коноплянникова О.А., Сморызанова О.А.,
Терехова Т.В., Скворцов В.Г., Цыб А.Ф. ГУ Медицинский радиологический научный
центр РАМН, Обнинск. «Распределение меченных рением-188 мезенхимальных
стволовых клеток, выращенных в культуре костного мозга человека, после системной
трансплантации мышам».
14) 12 часов 50 минут – Петров В.Н., Коноплянников А.Г., Лепехина Л.А., Кальсина
С.Ш., Семенкова И.В., Агаева Е.В., Коноплянникова О.А. ГУ Медицинский
радиологический научный центр РАМН, Обнинск. «Изучение иммуномодулирующей
активности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и кондиционной среды из-под
культур МСК методом хемилюминесценции».
15) 13 часов 00 минут – Конопляников А.Г., Коноплянникова О.А. ГУ Медицинский
радиологический научный центр РАМН, Обнинск. «Ацетилхолиновая регуляция
пролиферативной активности плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток
является NO-зависимой».
16) 13 часов 10 минут – Ермаков А.М., Ермакова О.Н., Леднев В.В. Институт
теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино. «Модуляция
пролиферативной активности стволовых клеток регенерирующих планарий с
помощью магнитных полей и фармакологических агентов».
17) 13 часов 20 минут – Тюмина О.В.1, Корымасов Е.А.2, Волова Л.Т.2, Котельников
Г.П.2, Гусарова Г.И.3, Гридасов Г.Н.4 1ГУЗ Самарской области «Клинический центр
клеточных технологий», 2ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский
университет Росздрава, 3Министерство здравоохранения и социального развития
Самарской области, 4ГУЗ Самарская областная клиническая больница им.
М.И.Калинина, Самара. «Организация научно-исследовательской работы в области
клеточных технологий в Самарской области».
18) 13 часов 30 минут – Тюмина О.В., Волчков С.Е., Трусова Л.М., Тороповский А.Н.,
Борискин П.В. ГУЗ Самарской области «Клинический центр клеточных технологий»,
Самара. «Работа банка пуповинной крови в Самарской области».
19) 13 часов 40 минут – Волова Л.Т., Россинская В.В., Яровенко Г.В., Герасимова Е.С.
ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Росздрава, Самара.
«Аутологичная трансплантация культуры клеток стромы лимфатических узлов для
купирования вторичной лимфедемы в эксперименте».
20) 13 часов 50 минут – Беляков Н.А., Зайчик А.М., Каюмов А.В., Михайлов В.М.,
Сериков В.Б.
ГОУ
ДПО Санкт-Петербургская медицинская академия
последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию, Санкт-Петербург. «Экспериментальные модели изучения
дифференцировки стволовых клеток в эндокриноциты у мышей, подвергшихся
рентгеновскому облучению».
Обеденный перерыв: 14 часов 00 минут – 15 часов 00 минут.
15 часов 00 минут – 16 часов 30 минут – круглый стол «Оборудование и материалы для
культуральной работы.
Кофе брейк: 16 часов 30 минут – 17 часов 00 минут.
Вечернее заседание: 17.00-18.00. Председатель: профессор К.Н.Ярыгин.
21) 17 часов 00 минут – Потапов И.В., Кириллов И.А., Вострикова О.Ф., Онищенко
Н.А. ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
«Влияние трансплантации аутологичных стромальных клеток костного мозга
различного фенотипа на сократительную функцию сердца при экспериментальном
инфаркте миокарда».
22) 17 часов 10 минут – Степанова О.И., Онищенко Н.А.*, Баранова О.В., Галахова
Т.В. ГУ Н Центр биомедицинских технологий РАМН и *ФГУ НИИ трансплантологии
и искусственных органов Росздрава, Москва. «Использование клеток аллогенного
костного мозга для коррекции сахарного диабета типа II в генетической модели».
23) 17 часов 20 минут – Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А. ФГУ НИИ трансплантологии
и искусственных органов Росздрава, Москва. «Прекультивированные изогенные
клетки костного мозга индуцируют процессы восстановительной регенерации бетаклеток при моделировании аутоиммунного сахарного диабета».
24) 17 часов 30 минут – Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф.,
Аврамов П.В., Зайденов В.А. ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов
Росздрава, Москва. «Фенотипическая и функциональная характеристика стромальных
мезенхимальных клеток, предназначенных для клинического применения».
25) 17 часов 40 минут – Аскаров М.Б., Трубицина И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко
Н.А. ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
«Аутологичные стромальные клетки костного мозга коррегируют факторы регуляции
морфогенеза и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка».
26) 17 часов 50 минут – Шиманский В.А., Кушнир В.А., Фролов В.И., Крашенинников
М.Е., Баранова О.В., Онищенко Н.А. ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных
органов
Росздрава,
Москва.
«Переартикулярное
введение
аутологичных
мононуклеарных клеток костного мозга стимулирует репаративную регенерацию
хряща при моделировании остеоартроза».
31 мая 2007 года
Утреннее заседание 10 .00-13.00. Председатели:
27) 10 часов 00минут – Суздальцева Ю.Г.1, Бурунова В.В.1, Вахрушев И.В.2,
Чеглаков И.Б.2, Ярыгин К.Н1,2 1Российский государственный медицинский
университет, Москва; 2НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН,
Москва. «Сравнительный анализ цитофенотипов, способности к дифференцировке и
иммунологические свойства клеток мезенхимального ряда в культурах постнатальных
органов и тканей человека».
28) 10 часов 10 минут - Бурунова В.В., Суздальцева Ю.Г., Воронов А.В.,
Вахрушев И.В.,
Ярыгин К.Н.,
Ярыгин В.Н.
Российский
государственный
медицинский университет, Москва. «Внедрение производственных стандартов для
клеточных материалов мезенхимального присхождения».
29) 10 часов 20 минут - Холоденко И.В.1,2, Холоденко Р.В.1,2, Таирова Р.Т., Чеглаков
И.Б.3, Ярыгин К.Н.1,3 1Российский государственный медицинский университет; 2
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова; 3Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва.
«Способность мезенхимальных клеток, выделенных из амниона человека,
дифференцироваться в нервные клетки in vitro и in vivo».
30) 10 часов 30 минут - Холоденко Р.В.1,2, Холоденко И.В.1,2, Чеглаков И.Б.3, Ярыгин
К.Н.1,3 1Российский государственный медицинский университет; 2Институт
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова;
3
Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва. «Мультипотентные
свойства клеток амниона человека in vitro».
31) 10 часов 40 минут – Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова
В.В., Ярыгин К.Н. Российский государственный медицинский университет, НИИ
биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН, Москва. «Дифференциальный
профиль поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов
кожи человека».
32) 10 часов 50 минут – Щепкина Е.А., Кругляков П.В., Соломин Л.Н., Тихилов Р.М.,
Полынцев Д.Г., Зарицкий А.Ю., Назаров В.А., Вийде С.В., Шведова Е.В. ФГУ
РНИИТО им. Р.Р.Вредена, ООО «Транс-Технологии», ГОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург.
«Оптимизация репаративного остеогенеза путем трансплантации аутологичных
мезенхимальных стволовых клеток на деминерализованном костном матриксе при
лечении ложных суставов и замещении костных дефектов».
33) 11 часов 00 минут – Зинькова Н.Н., Соколова И.Б., Кругляков П.К., Полынцев
Д.Г. ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург. «Клеточная терапия ишемического
инсульта у крыс».
34) 11 часов 10 минут – Кириллов Д.А., Смолянинов А.Б. Центр клеточной и генной
терапии «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский банк стволовых клеток.
«Регенеративная терапия аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками при
инфаркте миокарда»
35) 11 часов 20 минут – Стенина М.А., Кривов Л.И., Савчук В.И., Воеводин Д.А.,
Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т. Российский государственный медицинский
университет, НИИ акушерства, гинекологии и перинаталогии РАМН, Москва.
«”Антидиабетический” эффект фетальных миобластов человека на модели сахарного
диабета типа II у мышей DB/DB».
Кофе брейк: 11 часов 30 минут – 12 часов 00 минут.
36) 12 часов 00 минут – Кованько Г.Н., Смолянинов А.Б. Центр клеточной и генной
терапии «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский банк стволовых клеток, СанктПетербургская
академия
последипломного
образования,
Санкт-Петербург.
«Мониторинг количества стволовых клеток в периферической крови при инфаркте
миокарда и прогноз течения заболевания».
37) 12 часов 10 минут – Булгин Д.В., Смолянинов А.Б. Центр клеточной и генной
терапии «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский банк стволовых клеток
«Пуповинная кровь и перспективы ее применения».
38) 12 часов 20 минут – Паленая И.В., Смолянинов А.Б. Центр клеточной и генной
терапии «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский банк стволовых клеток.
«Генетические конструкты и их использование при создании биомедицинских
технологий на основе стволовых клеток»
39) 12 часов 30 минут – Смолянинов А.Б., *Арьев А.Л., Кириллов Д.А., *Кованько
Г.Н. Центр клеточной и генной терапии «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский
банк стволовых клеток и *Санкт-Петербургская академия последипломного
образования, Санкт-Петербург. «Мониторинг динамики изменения содержания
стволовых клеток в периферической крови больных инфарктом миокарда».
40) 12 часов 40 минут – Козлов В.А., Старостина Н.М., Пальцев А.И., Останин А.А.,
Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Лисуков И.А., Черных Е.Р. ГУ НИИ Клинической
иммунологии СО РАМН, Новосибирск. «Трансплантация аутологичных костномозговых клеток в лечении больных циррозом печени».
41) 12 часов 50 минут – Сизиков М.Ю., Останин А.А., Хейфец М.В. ФГУ НИИ
клинической иммунологии СО РАМН, ФГУ НИИ травматологии и ортопедии
Росздрава, ФГУ 333 Военный госпиталь МО РФ, Новосибирск. «Остеоиндукция
артифициального костного блока при межтеловом спондилодезе у собак посредством
трансплантации иммобилизованных клеточных фракций стромы костного мозга».
42) 13 часов 00 минут – Ковалев А.В., Васильев В.В., Иванищук П.П. ГОУ ВПО
«Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по
здравоохранению и социальному развитию», Иваново. «Репаративная регенерация
кожи при трансплантации аутологичных мультипотентных стромальных клеток
костного мозга и волосяных фолликулов в ацеллюлярной аллогенной дерме на
реципиентную поверхность в условиях жидкой среды».
43) 13 часов 10 минут – Волков А.В.1,3, Гольдштейн Д.В.1, Коновалов Н.А.2, Зеленков
П.В.2, Арутюнян И.В.1, Назаренко А.Г.2, Арутюнов Н.В.2, Ржанинова A.A.1,
Шевелев И.Н.2, Коновалов А.Н.2, Фатхудинов T.Х.1,3 1ЗАО «РеМеТекс», 2ГУ НИИ
нейрохирургии им. академика. Н.Н.Бурденко РАМН, 3ГУ НИИ морфологии человека
РАМН, Москва. «Клеточные технологии в вертебрологии».
44) 13 часов 20 минут – Кириллов А.М.1, Гольдштейн Д.В.3, Дьячков А.В.1,
Фатхудинов Т.Х.3, Коротеев А.В.1, Бочков Н.П.2 1ГУ Российский научный центр
хирургии имени академика Б.В.Петровского, 2ГОУ ВПО Московская медицинская
академия им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития РФ, 3ЗАО «РеМеТекс», Москва.
«Клиническое
исследование
трансплантации
аллогенных
мультипотентных
стромальных клеток в лечении дилатационной кардиомиопатии».
45) 13 часов 30 минут – Курсенко В.В. «СП», Набережные Челны. «Опыт применения
мезенхимальных стромальных клеток из пуповины человека в терапии рассеянного
склероза»
46) 13 часов 40 минут Румянцева С.А., Силина Е.В., Панкратов Е.В., Российский
государственный медицинский университет, г.Москва и Новосибирская медицинская
академия, г.Новосибирск. «Применение стволовых клеток в лечении больных в
прогродиентной неврологической патологии».
47) 13 часов 50 минут Галанин И.В., Скоромец Т.А., Бухарцев Н.Н., Второв А.В.,
Кругляков П.В., Полынцев Д.Г., ООО «Транс-Технология» г. С-Петербург.
«Применение стволовых клеток в Психиатрии и неврологии».
48) 14 часов 00 минут Беляев Н.Н., Богданов А.Ю., Рыбакова Т.М., Тлеулищева Р.Т.,
Институт молекулярной биологии и биохимии им. Айтхожина ЦБИ КН МОК РК
«Влияние Альфа-Фетопротеина (АФП) на биологическую активность различных
фракций гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (ГСК) мышей,
культивируемых EX VIVO».
49) 14 часов 10 минут Перфильева Ю.В., Супниязова Т.А., Закирьякова Г.К., Рысулы
М.Р., Беляев Н.Н., Институт молекулярной биологии и биохимии им. Айтхожина
ЦБИ КН МОК РК «Продукция супрессорных цитоксинов культурой мононуклеарных
клеток пуповинной крови человека».
50) 14 часов 20 минут Закирьякова Г.К., Рысулы М.Р., Жумабаева Б.А.,
Сатыбалдиева Ж.А., Беляев Н.Н., Институт молекулярной биологии и биохимии им.
Айтхожина ЦБИ КН МОК РК, ООО «Стемкорд», «Национальный центр эспертизы
лекарственных средств МЗ РК». «Исследование пролиферативной активности клеток
мононуклеарной фракции пуповинной крови человека».
51) 14 часов 30 минут Наханов А.К., Мамадалиев С.М., Сембаев К.Д., Битов Н.Т., НИИ
проблем биологической безопасности, Национальный центр биотехнологии,
Министерство образования и науки Республики Казахстан. «Выделение и
культивирование гемопоэтических стволовых клеток».
14 часов 40 минут – заключительное слово академика РАМН В.Н.Ярыгина и
фуршет.
Регенерация органов и тканей: иерархическая и стохастическая модели.
К.Н.Ярыгин
Российский государственный медицинский университет и
НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН,
Москва
Тканевой гомеостаз включает поддержание оптимального клеточного состава
путем скоординированных во времени процессов гибели части клеток и замещения их
новыми. После открытия стволовых клеток (СК) общепринятой стала иерархическая
модель регенерации органов и тканей как для поддержания гомеостаза, так и при
восстановлении после повреждений, согласно которой все новые клетки образуются из
резидентных или циркулирующих СК через стадию прогениторных, активно
размножающихся клеток. Вместе с тем, анализ регенерации печени показывает, что это не
всегда так. Восстановление печени может идти за счет СК, но чаще происходит за счет
дифференцированных клеток после их дедифференцировки. В последнем случае
реализуется стохастическая модель регенерации, при которой образовании е новых клеток
происходит не из специальных, а из любых клеток ткани.
Тканеспецифические соматические СК были первоначально обнаружены в
гемопоэтической системе. Эти недифференцированные клетки способны вступать в
асимметричный митоз, дающий одну клетку-реплику, идентичную материнской, и одну
коммитированную клетку, дифференцирующуюся в один из типов клеток крови. Каждая
резидентная гемопоэтическая СК мультипотентна, т.е. способна превращаться в любую
клетку крови.
В настоящее время СК в гемопоэтической системе изучены лучше, чем другие
соматические СК и могут служить моделью для того, чтобы планировать исследования
других региональных СК. В костном мозге существует определенная иерархия клеток,
которую можно представить в виде пирамиды. Находящиеся на вершине этой пирамиды
наименее дифференцированные клетки носят названия долгосрочно и краткосрочно
репопулирующих гемопоэтических СК (ГСК). Вступая на путь дифференцировки, они
дают начало прогениторным клеткам-предшественницам, соответственно, всего
миелоидного и всего лимфоидного ростка, из которых после серии делений и образуются
все зрелые клетки крови. Прогениторные клетки, в отличие от ГСК, не способны к
самовоспроизведению через асимметричный митоз. Необходимым и достаточным
условием восстановления гемопоэтической системы после ее полного разрушения
является просто трансплантация ГСК.
Гемопоэтическая система – это быстро обновляющаяся ткань мезодермального
происхождения. Регенерация быстро обновляющихся эпителиев, таких как эпителий
слизистой желудочно-кишечного тракта или эпидермис также происходит за счет
резидентных СК. В этих тканях также существует иерархия клеток, подобная той, которая
характерна для гемопоэтической системы.
До недавнего времени общепринятым было мнение, что регенерация печеночной
паренхимы происходит за счет дифференцированных клеток, в основном гепатоцитов, при
некотором участии других клеточных типов, таких как купферовские клетки, эндотелий
и эпителий желчных протоков. Было, в частности, показано, что в норме и в процессе
регенерации после повреждения как размножение клеток, так и их гипертрофия.
Некоторые гепатоциты увеличиваются в размерах и в них происходит эндоредупликация
геномной ДНК, но без митоза. Постепенно, однако, накапливаются данные,
показывающие, что принекоторых видах повреждения в регенерации печени участвуют не
только дифференцированные клетки, но и резидентные и циркулирующие СК.
Фактически, механизм восстановления печеночной паренхимы зависит от обстоятельств,
при которых оно происходит – норма, частичная гепатэктомия, отравление химическими
агентами и т.п. Более того, существенно различаются пути восстановления за счет
собственных ресурсов и за счет трансплантированных клеток.
У млекопитающих, в том числе у человека, может быть восстановлено до 75%
утраченной ткани печени. В экспериментах на лабораторных грызунах частичная
гепатэктомия достигается путем экстирпации определенных долей печени. После
удаления таким способом 75% ткани печени количество клеток в органе нормализуется в
течение нескольких дней, а первоначальная масса достигается за несколько недель.
Классические эксперименты с мечением клеток мышей 3Н-тимидином показали, что в
течение этого периода практически каждый оставшийся после операции гепатоцит
претерпевает по крайней мере одно деление. Интересно, что после удаления 15% ткани
печени пролиферируют лишь перипортальные гепатоциты. Вслед за гепатоцитами в митоз
вступают и другие эффекторные клетки печени, которые таким образом участвуют в
восстановлении массы органа. Остается неясным, почему после восстановления массы
печени размножение клеток и регенерация ткани останавливаются. Есть лишь некоторые
данные о том, что определенная роль в этом принадлежит трансформирующему фактору
роста бета 1 (TGFКак регенерация после частичной гепатэктомии, так и поддержание массы ткани и
нужного количества клеток печени в норме обеспечиваются пролиферацией
дифференцированных клеток и, по всей видимости, не зависят от СК. С другой стороны,
восстановление печени после отравления некоторыми химикатами СК-зависимо. В этом
случае в перипортальных зонах печеночных долек появляются мелкие клетки с
овальными ядрами, которые носят название «овальные клетки». Эти клетки активно
размножаются, мигрируют по направлению к центральным венам и дифференцируются в
гепатоциты, обеспечивая восстановление ткани. Овальные клетки происходят от
недифференцированных клеток зоны канала Херинга, которые многие авторы считают
печеночными СК. Сами овальные клетки рассматриваются как прогениторные, т.е. уже
вступившие на путь дифференцировки. Многие соединения, индуцирующие
пролиферацию овальных клеток, способны повреждать ДНК или обладают канцерогенной
активностью, в связи с чем некоторые авторы рассматривают их как предраковые. Вполне
вероятно, что СК-зависимая регенерация происходит в тех случаях, когда гепатоциты
утрачивают способность нормально делиться. Пролиферация овальных клеток
наблюдается при заболеваниях человека, связанных с хроническим поражением печени и
циррозом и в соответствующих экспериментальных моделях. Человеческие овальные
клетки можно идентифицировать по поверхностному маркеру
OV6. Они также
экспрессируют маркеры гепатоцитов (альбумин), эпителия желчных протоков
(цитокератин 19 – СК-19), альфа-фетопротеин, маркер ГСК CD34. Овальные клетки
крысы экспрессируют и другие маркеры ГСК, такие как фактор стволовых клеток (SCF),
рецептор SCF, c-kit тирозин киназу и Thy-1. Овальные клетки мыши экспрессируют
маркер ГСК Sca-1. Фенотипическое сходство овальных клеток и ГСК инспирировало
гипотезу о том, что овальные клетки происходят не от резидентных печеночных СК, а от
ГСК костного мозга.
Одним из самых информативных подходов при изучении биологии и функций СК
и других клеток является проведение тестов на способность клеток заселять
поврежденные участки ткани. Этот подход был впервые использован для доказательства
существования ГСК, а позже – в других моделях. Опыты с очищенными субпопуляциями
клеток костного мозга мыши позволили выявить типы клеток, обладающие наибольшим
репопуляционным потенциалом. В то время как дифференцированные клетки костного
мозга размножаются плохо, гепатоциты, причем не только диплоидные, но и
тетраплоидные и октаплоидные, весьма активны в репуляционных тестах.
Были получены экспериментальные доказательства того, что, наряду с гепатоцитами,
участвовать в репопуляции печени после массовой гибели паренхиматозных клеточных
элементов могут несколько других типов клеток, в том числе фетальные гепатобласты,
овальные клетки, клетки поджелудочной железы и ГСК. Фетальные гепатобласты,
экспрессирующие альфа-фетопротеин и маркеры, характерные для гепатоцитов
(альбумин) и холангиоцитов (СК19), обычно рассматриваются как СК фетальной печени.
Они обладают высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом и, после
трансплантации, способны полностью реконструировать поврежденную ткань. Овальные
клетки также бипотентны и легко репопулируют печеночную ткань после повреждения.
Известно, что в раннем онтогенезе гепатоциты, холангиоциты и все основные типы
паренхиматозных клеток поджелудочной железы развиваются из общего эндодермального
предшественника. Имеются доказательства того, что во взрослом организме в печени и в
поджелудочной железе присутствуют клетки-предшественники паренхиматозных клеток
обоих органов, так называемые печеночно-панкреатические СК. Это подтверждается тем,
что опухоли печени, особенно холангиокарциномы, экспрессируют маркерные энзимы
поджелудочной железы амилазу и липазу.
Костный мозг содержит несколько видов стволовых и прогениторных клеток, в том
числе ГСК, клетки-предшественники различных клеток крови, мезенхимальные стволовые
клетки (МСК), так называемые мультипотентные взрослые прогениторные клетки
(multipotent adult progenitor cells, MAPC) и др. В экспериментах на животных было
показано, что несущие генетические маркеры клетки костного мозга после
трансплантации способны дифференцироваться в гепатоциты. Более того, аутопсическое
исследование пациентов, умерших через месяцы и даже годы после пересадки
несовпадающего по полу костного мозга, показало присутствие в их тканях, в том числе в
печени, донорских эпителиальных клеток. В настоящее время предпринимаются попытки
идентифицировать типы клеток костного мозга, обладающие репопуляционной
активностью в отношении печеночной ткани. Было показано, что способностью
дифференцироваться в полноценные гепатоциты обладают ГСК, имеющие фенотип (ckithighThylowLinnegSca-1+).
Субпопуляция
человеческих
CD34+
клеток,
экспрессирующих молекулу комплемента Clq (ClqR(p)), после ксенотрансплантации в
организм мышей или овец также дает начало функционально активным гепатоцитам.
MAPC обладают свойствами, сближающими их с эмбриональными СК, в том числе
плюрипотентностью. Они дифференцируются в эпителиальные клетки печени in vitro, а
при трансплантации в интактных мышей проникают в печень реципиента, хотя и в
небольших количествах, и дифференцируются в гепатоциты.
Участие клеток костного мозга в поддержании гомеостаза печеночной паренхимы и ее
репаративной регенерации остается предметом споров. Не вполне ясно, играют ли ГСК
или другие клетки костного мозга клинически значимую роль в восстановлении печени
при
каком-либо заболевании человека. В настоящее время обсуждаются два
альтернативных пути репопуляции печени клетками костномозгового происхождения. Вопервых, некая субпопуляция клеток костного мозга может выходить в кровоток,
подвергаться хоумингу в печени и дифференцироваться в эпителиальные клетки. Эти
клетки могут быть либо общими мультипотентными предшественниками гепатоцитов и
клеток крови или специализированными эндодермальными прогениторными клетками.
Во-вторых, печеночные клетки костномозгового происхождения могут быть результатом
не дифференцировки, а слияния клеток.
Получение культур клеток из стромы костного мозга и гиалинового
хряща для хондропластики.
Котельников Г.П., Волова Л.Т., Тюмина О.В., Ларцев Ю.В., Волчков С.Е.,
Кулагина Л.Н., Клементенко Ю.А.
ФГУ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий»
Проблема регенерации гиалинового суставного хряща у пациентов с
дегенеративно-деструктивным остеоартрозом является чрезвычайно острой, так как
комплекс терапевтических и известных хирургических методов не позволяет достичь
положительного эффекта. Использование новых достижений в биологии и медицине –
клеточных технологий - является весьма перспективным и актуальным.
Разработка новых подходов и операций с использованием биологического материала для
обеспечения репаративного хондрогенеза при повреждении и разрушении хрящевой
ткани сустава.
Одной из главных задач данного комплексного исследования является получение
культур клеток из стромы костного мозга и гиалинового суставного хряща для
последующей их аутотрансплантации в зону разрушенной хрящевой ткани у
экспериментальных животных.
Эксперименты выполнены на кроликах (18 животных) породы Шиншилла, весом 3
кг, обоих полов. Животные были разделенные на 2 группы. В первой (8 животных) проводилась пункция костей конечностей и подвздошной кости с целью получения
костного мозга. Во второй (10 животных) - вскрывали коленный сустав и забирали
фрагменты хряща из разных участков хрящевой поверхности большеберцовой кости. Всех
животных содержали в условиях вивария, эксперименты на них выполнялись под общим
обезболиванием с соблюдением асептики и антисептики в ЦНИЛ СаГМУ.
Для культивирования в работе использованы среды a-MEM, DMEM или 199 (ООО
“Биолот”) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Инвертированные
микроскопы Carl Zeiss Аxiovert 40 c и Биолам П-2-1, гемоанализатор Реntra-60,
термостаты и СО2 - инкубаторы фирмы Sanyo (Incubator MIR-262) и ламинары II класса
защиты.
Клетки культивировали в стандартных условиях при температуре 37°С в
пластиковых культуральных флаконах с вентилируемыми крышками Orange Scientific
(производство Бельгии), Corning (производство США) площадью 25 и 75 см2.
Проводили ежедневную морфологическую оценку состояния нативной клеточной
культуры в течение одного месяца. После чего культуру фиксировали и окрашивали по
Романовскому-Гимза.
Отработана методика получения костного мозга у животных (кроликов).
Аспирацию костного мозга производили с помощью 5 мл шприца. Из подвздошной кости
можно получить не менее 1,5 мл костного мозга. Ядросодержащие клетки выделяли 2
методами: лизирование эритроцитов с последующей отмывкой и градиентное
центрифугирование (Ficoll, ООО «Биолот»). После чего ядросодержащие клетки
рассеивались на пластиковую посуду.
На третьей неделе культивирования появляются очаги фибробластоподобных
клеток, которые по сравнению с дермальными фибробластами значительно крупнее,
имеют короткие отростки и большое ядро. Обращает на себя внимание наличие колоний
по всей поверхности культурального флакона, центральная часть которых имеет сетчатую
структуру. По ее периферии обнаруживаются мелкоклеточные скопления с центрально
расположенным ядром (недифференцированных хондробластов). Эти структурные
образования клеток проявляют выраженные адгезивные свойства к поверхности пластика
флаконов. В течение 1 месяца клетки сохраняют жизнеспособность.
Культуру хондробластов получали из гиалинового хряща по модифицированной
методике первичных эксплантатов. Через 15 суток по периферии кусочка хрящевой ткани
определялась сетчатая структура, затем появлялись очень мелкие круглые клетки, по
форме и размерам аналогичные тем, которые определялись в культуре из костного мозга.
Клетки росли в виде пласта. К 30 суткам пролиферация клеток усиливалась и значительно
возрастало количество рядов крупных круглых клеток с центрально-расположенным
ядром.
Использованный алгоритм культивирования клеток, источником которых является
ткань гиалинового хряща позволяет получать хондроидный материал в виде пласта. В том
случае, когда источником клеточных культур является костный мозг, в процессе
культивирования образуются колонии фибробластоподобных клеток.
Синтетические и натуральные биоматериалы - 3D матриксы для
культуры аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных
клеток при замещении костных дефектов в эксперименте
Чиссов В.И.1, Сергеева Н.С.1, Свиридова И.К.1, Решетов И.В.1, Баринов См.2 , Франк Г.А.1,
Тепляков В.В.1, Кирсанова В.А.1, Ахмедова С.А.1, Агзамов Д.С.',Филюшин М.М.1, Комлев
B.C.2, Фадеева И.В.2, Козлов В.В.1, Бухаров А.В.1, Хесуани Ю.Д.3
ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им.
П.А.Герцена Росмедтехнология»
2
Институт физико-химических проблем керамических материалов РАН, ИПК РАН
3
Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова
1
Проблема эффективного способа доставки мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток (ММСК) в очаг поражения актуальна при различных патологических
состояниях: заболеваниях сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата,
неврологических расстройствах и др. В онкологической клинике использование ММСК
перспективно при реконструктивно-пластических операциях для замещения костных
дефектов сложных конфигураций и различных объемов. В то же время, из анализа
литературы и собственного опыта известно, что непосредственное введение культуры
ММСК в очаг поражения не приводит к ожидаемому терапевтическому эффекту
вследствие их быстрой элиминации. Использование нетоксичных, биосовместимых
каркасных 3D структур для культуры ММСК, которые могли бы обеспечивать оптимальные
условия для адгезии, экспансии иммобилизованных клеток и способствовать полной
интеграции имплантата с окружающими тканями, решает в определенной мере данную
проблему. Исходя из этого, разработка 3D материалов - матриксов для клеточных культур
(в том числе, стволовых) является своевременной и актуальной задачей.
Цель настоящего исследования - биомедицинские испытания в экспериментах in
vitro и in vivo ряда образцов пористой гранулированной наноструктурированной
кальцийфосфатной бифазной и замещенной биокерамики, а также натурального коралла
Acropora cervicornes в качестве 3D матриксов для культуры аутологичных ММСК;
использование наиболее перспективных образцов самостоятельно и в составе
биоинженерной конструкции (3D матрикс с иммобилизованными ММСК) для замещения
костных дефектов у экспериментальных животных .
Материалы и методы. Изучение острой токсичности данных материалов (24 часа
инкубации) и их матриксных качеств (3, 7, 10, 14, 17, 21, 28 суток культивирования)
проводили в экспериментах in vitro на модели иммортализованных фибробластов человека
(ФЧ). Метод оценки жизнеспособности клеток в динамике культивирования - МТТ-тест.
Биосовместимость материалов оценивали в экспериментах in vivo при их подкожной
имплантации мышам-самкам линии BDF1 (через 1, 2, 4 недели, 3 и 6 месяцев). Метод
оценки - световая микроскопия. Исследование эффективности использования
биоимплантатов
самостоятельно
и
в
составе
биоинженерной
конструкции
(иммобилизованные аутологичные ММСК на материале) проводили на двух
экспериментальных моделях: остеотомии голени крыс - самок линии Wistar
(биокерамические имплантаты) и сегментарной резекции большой берцовой кости барана
(имплантат из натурального коралла). Для исследования динамики закрытия костного
дефекта крыс через 3, 6, 9, 12 недель и 8 месяцев их выводили из эксперимента, и, после
декальцинации, производили морфологическое исследование зоны дефекта. В эти же
сроки осуществляли рентгенологическое исследование животных всех групп. Баранам
производили рентгенологические исследования трижды: накануне операции (для
определения размеров имплантата) и в динамике закрытия дефекта через 1 и 4 месяца после
операции. Далее после эвтаназии животного производили распил бедренной кости на
фрагменты с последующим гистологическим исследованием материала.
Результаты и обсуждение. В экспериментах in vitro изучена острая цитотоксичность
10 различных образцов гранулированной пористой кальцийфосфатной керамики: бифазных
материалов на основе гидроксиапатита (ГА) и трикальцийфосфата (ТКФ) с разным
процентным соотношением составляющих, карбонат- и кремнийзамещенной
гидроксиапатитовой биокерамики (КГА и КЗГА), композиционных материалов αТКФ βТКФ, чистого βТКФ, а также натурального коралла Acropora cervicornes. Показано, что все
образцы материалов не токсичны для клеток - через 1 сутки культивирования к их
поверхности прикрепляется и распластывается 80-90% от инициального пула ФЧ. Оценены
матриксные свойства поверхностей данных материалов по способности поддерживать
активный рост и пролиферацию клеток при совместном культивировании. Обнаружено, что
все образцы (за исключением композита αТКФ - βТКФ) обладали выраженными
матриксными свойствами - за период наблюдения пул ФЧ увеличивался в 7,5-9,0 раз vs 5,0 в
контроле (культуральный пластик полистирен). В экспериментах in vivo изучали
биосовместимость образцов ГА, ГА-ТКФ, КГА, КЗГА и натурального коралла. Выявлено, что
при подкожной трансплантации мышам данные образцы не вызывают реакции воспаления со
стороны окружающих тканей, т.е. являются биосовместимыми.
При динамическом наблюдении за процессом закрытия дефекта голени крысы с
использованием биокерамических имплантатов ГА-ТКФ, КЗГА и βТКФ без стволовых
клеток и в составе биоинженерной конструкции обнаружены остеоиндуктивные потенции
изученных биоматериалов разной степени выраженности. В целом, очаги оссификации в зоне
дефекта появляются в промежутках между гранулами уже через 3 недели после операции. К
6-ой неделе эти процессы нарастают, вокруг гранул, попавших в верхнюю часть дефекта,
начинает формироваться надкостница. Параллельно процессам формирования новой костной
ткани идут процессы резорбции биоматериалов, наиболее выраженные для βТКФ. К 12
неделе эксперимента биокерамические гранулы (за исключением КЗГА) почти полностью
резорбируются и замещаются зрелой костной тканью с формированием остеонов.
Использование биоинженерной конструкции в зоне дефекта приводит к более раннему
формированию очагов оссификации и, как минимум, на неделю раньше восстановления
костного дефекта. По скорости биорезорбции и остеоиндуктивным качествам изученные
биокерамические материалы могут быть представлены в следующей последовательности:
КЗГА→ГА-ТКФ→βТКФ).
Наиболее эффективной для замещения протяженного дефекта бедренной кости барана
оказалась биоинженерная конструкции из натурального коралла Acropora cervicornes,
насыщенного культурой аутологичных ММСК. Обнаружен выраженный остеоиндуктивный
эффект данной конструкции по сравнению с контролем (коралловый имплантатат без
клеток): через 5 месяцев после сегментарной резекции бедренной кости барана установлена
полная консолидация коралла с окружающими тканями. На гистологических препаратах
отмечено активное костеообразование с формированием зрелых остеонов с параллельной
резорбцией собственного вещества коралла.
Таким образом, синтетические кальцийфосфатные биокерамические материалы ГАТКФ, КГА, βТКФ и натуральный коралл Acropora cervicornes могут рассматриваться в
качестве перспективной системы иммобилизации и направленной доставки ММСК при
замещении
костных
дефектов.
Действие аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на
репаративные процессы в нервной ткани при диффузной травме
головного мозга крыс.
Южаков В.В., Коноплянников А.Г., Цыб А.Ф., *Рошаль Л.М., *Сушкевич Г.Н.,
*Семенова Ж.Б., Бандурко Л.Н., Ингель И.Э., Кальсина С.Ш., Верховский Ю.Г.,
Шевчук А.С., Цыганова М.Г., Лепехина Л.А.
ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск,
*НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения
г. Москвы
Травматическое повреждение головного мозга остается одной из серьезных
проблем здравоохранения. В отличие от многих других тканей, нервная система имеет
ограниченный потенциал самовосстановления. Высокодифференцированные нейроны не
обладают способностью к полной регенерации, а присутствующие в головном мозге
взрослого организма нейральные стволовые клетки имеют ограниченные возможности
генерировать новые функциональные нейроны в ответ на повреждение. Поэтому
актуальным является поиск новых методов терапии травм головного мозга с
использованием трансплантации стволовых клеток. Многочисленные исследования по
данному вопросу свидетельствуют, что необходимой пластичностью и терапевтическим
потенциалом для нервной системы обладают мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из
костного мозга взрослого организма. По данным литературы, трансплантация МСК
способствует репарации поврежденной нервной системы и восстановлению
неврологического статуса при фокальной церебральной ишемии и локальной травме
головного мозга.
В данной работе изучали влияние системной трансплантации МСК из костного
мозга взрослого организма на функциональную морфологию нейронов и репаративные
процессы в нервной ткани крыс после закрытой черепно-мозговой травмы. Исследования
выполнены на головном мозге крыс самцов линии Вистар в возрасте 2-х месяцев массой
тела 140-150 г, разделенных на 5 групп. Моделирование травмы головного мозга
осуществляли методом падающего груза. Груз весом 50 г свободно падал с высоты 110 см
в полой трубке диаметром 1,2 см на теменную область головы. Площадь ударной
поверхности импактора составляла 0,5 см2. Из выживших животных (около 50% от
общего количества) были сформированы группы сравнения. Группы были равноценны по
степени тяжести травмы головного мозга, которую оценивали по комплексу симптомов и
тестов в течение 30 минут после воздействия. Животные 1-й экспериментальной группы
(n=16) с травмой головного мозга лечение не получали. Крысам 2-й группы (n=10) с
травмой проводили базисную терапию на основе применения противоотечных,
антигипоксических и противовоспалительных препаратов. Животным 3-й группы (n=10)
через сутки после травмы однократно внутривенно вводили 2 × 106 МСК,
суспендированных в 0,5 мл физиологического раствора. Крысам 4-й экспериментальной
группы (n=10) проводили комплексное лечение путем сочетанного применения базисной
терапии и введения МСК. Контрольную группу составили 14 ложнотравмированных крыс.
Головной мозг для исследования брали у декапитированных под нембуталовым
наркозом крыс через 1 ч, 1, 3 и 14 сут после нанесения травмы. Выделенный мозг
фиксировали в 10%-ном формалине или 70% этаноле. После фиксации мозг разрезали на
два сагиттальных блока или на 4 фронтальных фрагмента на уровне рострального отдела
боковых желудочков, гиппокампа, среднего мозга и мозжечка. Срезы препаратов,
фиксированных в этаноле, окрашивали крезиловым фиолетовым и тионином по Нисслю.
Для иммуноокрашивания пролиферирующих клеток использовали мышиные
моноклональные антитела к PCNA (proliferating cell nuclear antigen) при разведении 1:50
(клон PC10, «Calbiochem»). Гистотопографическое картирование зон повреждений и
точное определение уровней коронарных срезов производилось по стереотаксическому
атласу головного мозга крыс.
Результаты исследования показали, что закрытая черепно-мозговая травма
вызывает у крыс диффузное повреждение головного мозга. Первичное повреждение
сопровождается сосудистыми нарушениями и травматическим отеком, достигающим
максимального развития на 1 сут. Формирование отека ведет к ишемическим
повреждениям нейронов коры и стволовой части мозга. Уже в ранние сроки после травмы
запускаются реактивные и компенсаторно-регенерационные механизмы с инициацией
пролиферации глии и клеток в зонах нейрогенеза. Однако фаза регенерации носит
пролонгированный характер с медленно протекающими репаративными процессами
поврежденных тканевых и клеточных структур головного мозга. Результаты наших
исследований согласуются с данными других авторов, которые показали, что
патологические события, формирующиеся при повреждении взрослого мозга,
стимулируют нейрогенез в паравентрикулярной зоне боковых желудочков и
субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа. Лечебный эффект после базисной
терапии по усилению пролиферативной активности клеток сосудистых сплетений,
микроглии и, особенно, клеток эпендимы и субэпендимального слоя определялся лишь на
3 сут после травмы. Через две недели у животных, получавших комплексное лечение,
гистологический рисунок коры и других отделов головного мозга практически не
отличался от вариантов нормы для животных контрольной группы. Тем не менее,
несмотря на восстановление морфологии нейронов, в коре, мозолистом теле и
промежуточном мозге сохранялись локальные очаги пролиферации клеток и повышенная
активность зон нейрогенеза. С учетом этого можно считать, что полноценного
восстановления поврежденных клеточных и тканевых структур мозга в данном периоде
времени после травмы, даже у животных, которым вводили МСК на фоне базовой
терапии, еще не происходит.
По нашим данным, при диффузной травме головного мозга нейропротекторным
действием МСК было не только усиление в фазе регенерации репаративных процессов в
целом (быстрое восстановление субстанции Ниссля в нейронах, ускорение глиогенеза и
ангиогенеза), но и, возможно, активация герминативных зон нейрогенеза. Анализ данных
по этому вопросу показывает, что лечебное действие МСК при повреждении нервной
ткани может реализовываться несколькими путями. Во-первых, есть сведения, что после
миграции в поврежденную нервную ткань МСК начинают экспрессировать нейрональные
и астроцитарные маркеры и, не исключено, что способны замещать погибшие клетки. Вовторых, продукты экспрессии МСК могут оказывать стимулирующее действие не только
на нервные стволовые клетки, но и на эндотелий сосудов. И, наконец, МСК активируют
клетки, которые дополнительно экспрессируют факторы роста в головном мозге. Так, по
данным литературы, после повреждений или дегенерации, обусловленной травмой,
выживаемость нейронов и их восстановление промотируют нейротрофические факторы,
которые экспрессируют глиальные клетки. Наши результаты свидетельствуют, что
индуцированную травмой пролиферацию глиальных клеток потенцирует базисная
терапия и активирует введение МСК. Возможно, снижая развитие отека и восстанавливая
микроциркуляцию, базовая терапия способствует более быстрому поступлению,
накоплению и/или миграции МСК в поврежденные участки головного мозга.
Таким образом, сравнительный анализ полученных результатов позволяет
заключить, что системно введенные в сингенный организм мезенхимальные стволовые
клетки обладают пролиферотропным, ангиогенным и, по-видимому, нейротрофическим
эффектами. Косвенные данные свидетельствуют, что в период регенерации нервной ткани
МСК могут активировать пролиферацию клеток в зонах нейрогенеза. Визуально лечебный
эффект определен на вторые сутки после внутривенного введения МСК. На фоне базисной
терапии нейропротекторное действие МСК усиливается. Можно предположить, что
комплексное лечение при общемозговой диффузной травме, основанное на применении
метаболической поддержки и внутривенного введения МСК, создает предпосылки для
активации механизмов компенсаторно-приспособительных процессов в период
репаративной регенерации и усиления трофики нервной ткани, необходимых для
восстановления функциональной морфологии поврежденных нейронов. Результаты
данной работы согласуются с выводами других авторов о положительном
терапевтическом действии МСК при травматическом повреждении головного мозга.
Изменение экспрессии генов в процессе дифференцировки
мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и
жировой ткани человека в клетки костной ткани.
Савченкова И.П., Ростовская М.С.1, Чупикова Н.И.1, Дьяконов Л.П., Тепляшин А.С.1
Всероссийский государственный научно-исследовательский институт экспериментальной
ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, 109428, г. Москва, Рязанский проспект, 24/1,
Россия,
ООО Институт стволовой клетки, г. Москва, Кузнецкий мост, 17/1, Россия
Введение. Появились сообщения о выделении из жировой ткани клеточной
популяции с фенотипом подобным ММСК КМ, которая обладает потенциями к
дифференцировке в клетки костной, хрящевой и жировой тканей. На сегодняшний день
достаточно хорошо изучены факторы, вызывающие дифференцировку ММСК в клетки
костной ткани. Интенсивно ведутся работы по моделированию остеогенеза, как в
монослое, так и в трехмерных структурах, т.е. на матрицах носителях. ММСК,
подвергнутые дифференцировке in vitro в клетки костной ткани представляют собой
удобную модельную систему in vitro для изучения событий, происходящих в остеогенезе
на молекулярном уровне.
Целью нашей работы было сравнить потенции ММСК, выделенных из костного
мозга и подкожно-жировой клетчатки при индукции дифференцировки в клетки костной
ткани in vitro на уровне экспрессии генов-маркеров остеогенеза: остеопонтина (ОП),
остеокалъцина (ОК) и костного сиалопротеина (КС).
Материал и методы.
В эксперименте использовали ММСК КМ и ПЖК человека. Для выявления
поверхностных АГ клетки анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на
цитометре Epics Elite Coulter. Первичные мышиные AT, используемые в наших
экспериментах, были против 23-х АГ человека фирмы «Becton Dickinson». В качестве
вторичных AT использовали анти-мышиные IgG козы, меченые ФЭ той же фирмы. Для
получения клеток костной ткани МСК высевали в чашки Петри диаметром 10 см в
концентрации 5x103 клеток/см2. Индукционной средой для дифференцировки в клетки
костной ткани была ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненная СПК
(10%), дексаметазоном (10-7 М), β-глицерофосфатом (10 мМ) и аскорбиновой кислотой (0,2
мМ) (Reyes et al., 2001).Через 14, 21 и 28 сут после начала индукции часть клеток
окрашивали по von Kossa и ализариновым красным, а часть клеток параллельно
использовали для выделения РНК. В качестве контроля были использованы клетки,
растущие без индукторов. Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора
SV Total RNA Isolation System (Promega), согласно рекомендациям производителя.
Концентрацию выделенной РНК определяли путем измерения оптической плотности при
длине волны 260 нм по формуле lOD=40 мкг РНК/мл. Реакцию обратной транскрипции
(ОТ-ПЦР) проводили в объеме 10 мкл. Для ПЦР-реакции были использованы следующие
праймеры на маркеры: остеокальцин (ОК), прямой 5'-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3'
и обратный 5'-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3' (Caterson et. al., 2002); остеопонтин
(ОП),
прямой
5'-ACCCTTCCAAGTAAGTCCAAC-3'
и
обратный
5'AGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3'; костный сиалопротеин (КС) II типа, прямой 5'AAGGGCACCTCGAAGACAAC-3' и обратный 5'-ACCATCATAGCCATCGTAGC-3';
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, прямой 5'- GGGCTCCTTTTAACTCTGGT-3' и
обратный 5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3'(Caterson et. al., 2002). Праймеры на ОП и
КС были подобраны к опубликованным последовательностям мРНК (соответственно,
ВС093033 и NM_004967, GenBank).
Результаты и обсуждение.
Ранее нами были выделены и охарактеризованы клетки с фенотипом подобным
ММСК из КМ и ПЖК взрослого организма человека (Тепляшин и др., 2005).
Цитофлуореметрический анализ выявил на их поверхности наличие АГ, экспрессия
которых характерна для ММСК человека. Так клетки, выделенные из КМ и ПЖК,
положительно окрашивались AT к АГ: CD10 (78.5 % и 79.4 %), CD13 (99.0 % и 99.5%),
CD29 (98.7% и 98.8%), CD44 (98.1% и 98.6%), CD49a (89.9 % и 69.2%), CD49b (90.1 % и
96.8%), CD54 (39.9 % и 91.4%), CD71 (88.1 % и 85.1%), CD73 (99.6 % и 99.2%), CD90 (99.2
% и 99.2%), CD105 (99.5 % и 97.4), CD166 (99 % и 97.9%), HLA ABC (99.4 % и 99%),
соответственно. Все типы клеток были отрицательны по CD34 (0.3 % и 3.2%), CD45 (0.1 %
и 1.2%) и CD133 (0.9 % и 1.6%) - маркерам, свойственным стволовым клеткам крови, CD31
(0.5 % и 2.3%) - маркеру эндотелиальных клеток, а также HLA DP (2.3 % и 1.85%), HLA
DQ (0.3 % и 1%) соответственно. Доля клеток положительно окрашенных AT к рецептору
фактора стволовых клеток c-kit (CD117) составляла 7% для клеточной популяции,
выделенной из КМ, а для ПЖК - 1.2 %. Данные приведены по 5-ти донорам.
Сравнительный анализ экспрессии АГ на ММСК КМ и ПЖК, выявил значительные
различия в количестве клеток, положительно окрашенных по а4 интегрину (CD49d) и
молекуле клеточной адгезии VCAM (CD 106). Подобные различия, наблюдаемые в наших
экспериментах, были выявлены и другими исследователями (De Ugarte et al., 2003).
Интересным оказался факт, что эти две популяции клеток были отрицательны по STRO-1,
экспрессия которого, как известно, характерна для стромальных клеток КМ с
остеогенным потенциалом. При культивировании в среде, индуцирующей
дифференцировку в клетки костной ткани, морфологические изменения в клетках,
выделенных из КМ, наблюдали на 14 сут, в то время как в клетках выделенных из ПЖК,
эти изменения были обнаружены только на 28 сут культивирования. Визуальная оценка
подтверждалась окраской экспериментальных образцов ализариновым красным и по von
Kossa . Формирование кости включает цепь последовательных событий, которые можно
условно разделить на три фазы: пролиферативную с секрецией матрикса, созревание
матрикса и минерализация матрикса (Owen et el., 1990). Для каждой из перечисленных фаз
характерна экспрессия различных генов. Считается, что ОП принадлежит к одному из
ранних маркеров, свидетельствующих об инициации дифференцировки ММСК в
остеогенном направлении. Его экспрессия характерна для предшественников
остеобластов (преостеобластов) (Yao et al., 1994). Анализ экспрессии генов в процессе
дифференцировки ММСК КМ и ПЖК в клетки костной ткани обнаружил, что клетки,
выделенные из КМ, как в контрольной, так и экспериментальной группах были позитивны
по ОП на 14 сут. В отличие от них, в клетках выделенных из ПЖК в среде без индуктора
экспрессия ОП не была выявлена. ОП появлялся в клетках подвергнутых
дифференцировке на 14 сут. К специфическим маркерам, характеризующим позднюю
стадию дифференцировки включая окраску по von Kossa (Puchtler et al., 1978), относят OK
(Tracy et al.,1990). Экспрессия OK свидетельствует об окончательной дифференцировке
остеобластов. В наших экспериментах экспрессия ОК была обнаружена только в клетках
КМ, подвергнутых дифференцировке на 14 сут. Наиболее специфичным маркером
поздней стадии дифференцировки в направлении остеогенеза является КС (Chen et al.,
1992). Его экспрессия характерна только для минерализованных клеток. На 14 сут в
клетках КМ подвергнутых дифференцировке была обнаружена экспрессия КС, которая
сохранялась на протяжении всего эксперимента (21 и 28 сут). В клетках выделенных из
ПЖК ОС и КС не был выявлен даже на 28 сут индукции.
Таким образом, несмотря на схожесть фенотипа популяций выделенных из КМ и
ПЖК эти клетки обладают разными характеристиками, в том числе потенциями
дифференцироваться в направлении остеогенеза. Сравнительный анализ уровня
экспрессии генов маркеров остеогенеза в модельных системах, полученных на основе
ММСК из двух разных источников показал, что клетки, выделенные из КМ являются
более перспективным источником при моделировании костной ткани in vitro.
Роль фетальных стволовых клеток в восстановлении нарушенных
функций органов и тканей.
Доскалиев Ж.А., Каюпов Б.А.
Казахская государственная медицинская академия, Казахстан, г. Астана
Национальный научный медицинский центр, Казахстан, г. Астана
Последние десятилетия в медицине ознаменовались рядом крупнейших
достижений молекулярной и клеточной биологии, на базе которых развились научнообоснованные, принципиально новые и эффективные биотехнологические способы
профилактики и лечения многих заболеваний человека, фетальная трансплантация в их
числе. В настоящее время в области клинического применения фетальных тканей и клеток
накоплен достаточно большой опыт. Однако в ведущих медицинских центрах мира не
прекращаются интенсивные научные исследования по разработке технологий фетальных
трансплантаций, что определяет эту область исследований как одну из самых
приоритетных в развитии медицины.
Построение рациональной системы применения фетально - клеточной
трансплантации в восстановлении нарушенных функций систем, органов и тканей.
В Национальном научном медицинском центре Казахстана, в рамках совместной с
Казахской государственной медицинской академией научно-технической программы, за
период 2001-2006 гг. проведено 1072 фетальные трансплантации.
Этические положения соответствовали законопроектам Международного комитета
по изучению аспектов трансплантации человеческих тканей (Канада, 1994 год),
Конвенции о правах человека и биомедицине (Страсбург, 1996).
В качестве источника фетального материала служили нежизнеспособные плоды
человека, массой не более 400гр, полученные от женщин, искусственно прерывающих
беременность по социальным и медицинским показаниям в сроках гестации от 18 до 20
недель. Забор фетального материала производился при условии отрицательных
результатов исследований сыворотки крови матери и плода при тестировании на СПИД,
сифилис, гепатиты В и С, цитомегаловирус, вирус простого герпеса и ряд
внутриклеточных бактерий (хламидии, микоплазма, уреплазма).
Изолированные фетальные клетки получали комбинированным методом
диссоциации, а для поддержания их жизнеспособности использовались сложные среды, в
состав которых входят аминокислоты, витамины, нуклеотиды, белки, желатин и
растворы Рингера, Рингер-Локка, Рингер-Тироде, Хенкса, Эрла.
Для долгосрочного хранения клеточных суспензий использовался метод
программной криопрезервации, материал хранился в условиях низкотемпературного
холодильника и в жидком азоте, в качестве стабилизатора клеточного материала
использовался глицерин и ДМСО.
При разработке оптимального способа пересадки фетальных клеток нами были
исследованы различные способы трансплантации клеток: подкожно, внутривенно,
интрапаренхиматозно, эндоваскулярно через чревный ствол и почечную артерию,
внутрисуставно и эндолюмбально. Результаты проведённого исследования приведены в
таблице 1.
Фетальная трансплантация в восстановлении нарушенных функций систем,
органов и тканей проявляется многогранными лечебными эффектами и значительно
превышает все известные современные методы лечения по глубине своего воздействия,
качеству, специфичности и, что самое важное – по эффективности. Наблюдение и оценка
клинического опыта продолжаются.
Таблица 1. Результаты фетальной трансплантации в восстановлении нарушенных функций систем,
органов и тканей
Нозологии
Циррозы печени
вирусной,
токсической,
аутоиммунной
этиологии
(n=600)
Сахарный диабет
типа 1и 2
СД 1 тип - n = 66
СД 2 тип – n= 58
(n=124)
Хронические
гломерулонефриты с
исходом в
хроническую
почечную
недостаточность
(n=96)
Гипотиреозы
различной
этиологии
(послеоперационны
й, врожденный,
аутоиммунный)
(n=48)
Ревматоидный
артрит,
асептический некроз
головки бедренной
кости.
(n=65)
Органическая
патология
центральной
нервной системы
(n=145)
Критерии эффективности
Маркеры холестаза и
цитолиза
Биопсия печени в динамике
МРТ, КТ в холангиорежиме
Кластеры дифференцировки
кроветворения
Гликозилированный
гемоглобин
С-пептид
Свободный инсулин
СД 3, СД 4
Функциональное состояние
почек (СКФ, креатинин)
УЗДГ сосудов почек
Биопсия почки
Иммунологические маркеры
клеток – предшественников
костного мозга
Гормоны щитовидной
железы
ТТГ
Антитела к тиреоглобулину
и тиреопероксидазе
УЗИ щитовидной железы
Клинические проявления
Рентгенологическая картина
РФ, СРБ, Ig
Антинуклеарные факторы
Морфология синовиальной
оболочки
Индекс Бартела
Шкала функциональной
независимости МРТ, КТ
ЭЭГ, Электромиография
Результаты
Снижение уровня синдрома холестаза у
87% больных, цитолиза у 76%,
портальной гипертензии у 68%,
морфологически - уменьшение индекса
гистологической активности по Knodell
на 5 баллов.
Стабилизация углеводного обмена – 96%;
Уменьшение доз инсулина в среднем на
30 – 35% - 88%;
Отмена инсулина при сахарном диабете 2
типа – 40%;
Регрессирование микроангиопатий – 72%
Отсутствие прироста уровня азотемии и
удлинение додиализного периода у 81%.
Стабилизация гемодинамики со
значительным снижением дозы
антигипертензивных препаратов у 96%.
Улучшение качества жизни в виде
снижения признаков уремической
интоксикации у 97%.
Повышение уровня тиреоидных гормонов
(трийодтиронин, тироксин) у 89%
больных.
Увеличение объема щитовидной железы у
87%.
Улучшение качества жизни (уменьшение
доз заместительной терапии) у97%.
Купированы болевой синдром,
сгибательная контрактура суставов,
синовиты у всех больных, положительная
рентгенологическая динамика через 3
месяца у 62%, снижение уровня
суммарных антиядерных антител у 61%,
уровня острофазовых проб у 70%.
Регресс неврологического дефицита
(снижение спастики мышц) у 87%
больных, улучшение качества жизни по
индексу Бартела у 94%.
Фармакологическая регуляция эндогенных стволовых клеток.
Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Эпштейн О.И.
ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск
Рациональный подход к решению задач регенераторной медицины могут
составить, на наш взгляд, манипуляции со стволовыми клетками, основанные на принципе
подражания естественному их функционированию в организме. Представляется, что
удобным способом стимуляции восстановления различных органов и тканей из
резидентных стволовых клеток является фармакологическая активация их функций. В
свою очередь, разработка неинвазивных методов клеточной терапии невозможна без
углубления знаний о закономерностях участия прогениторных элементов в развитии и
разрешении патологических процессов.
Целью нашего исследования явилось изучение роли мезенхимальных
предшественников различных классов в развитии патологических процессов и
совершенствование методов фармакологической стимуляции их мобилизации и
дифференцировки в тканеспецифические предшественники на моделях некоторых
распространенных заболеваний.
В различные сроки после воспроизведения острого инфаркта миокарда,
токсического гепатита, сахарного диабета, гипоксической энцефалопатии, либо
повреждения кожного покрова и введения веществ, влияющих на стволовые клетки, у
мышей и крыс исследовали функциональное и морфологическое состояние измененных
органов. В костном мозге и периферической крови определяли содержание
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и коммитированных
предшественников фибробластов. Кроме того, оценивали содержание региональных
прекурсоров в миокарде, печени, поджелудочной железе, головном мозге, либо в области
кожной раны.
Установлено, что развитие патологических процессов сопровождается активацией
примитивных и более дифференцированных мезенхимальных предшественников в
костном мозге, которая, однако, оказывается в большинстве случаев недостаточной для
мобилизации их в кровь, либо для устранения угнетающих эффектов токсических агентов
в отношении органов-мишеней. Стимуляция стволовых клеток препаратом
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) приводит к более раннему,
либо более выраженному повышению содержания мезенхимальных прекурсоров в
костном мозге и периферической крови. Увеличивается также количество региональных
предшественников в регенерирующих паренхиматозных органах. При этом в последних
уменьшается объем развивающейся соединительной ткани, либо степень инфильтрации, и
возрастает доля тканеспецифических структур. Ускоряется эпителизация раны на модели
кожного лоскута. Обнаружено, что в основе мобилизующего действия Г-КСФ лежит
ослабление связывания прогениторных элементов с клетками микроокружения, но не с
межклеточным матриксом. Аналогичная способность к мобилизации стромальных
прекурсоров и ускорению процессов восстановления поврежденных органов выявлена у
препарата сверхмалых доз антител к Г-КСФ, под влиянием которого стимулируется
выработка эндогенного Г-КСФ. Дополнительное к Г-КСФ введение препарата
гиалуронидазы усиливает мобилизующий эффект цитокина в отношении мезенхимальных
предшественников.
Биомедицинские технологии управления репаративным остеогенезом.
Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Ильина В.К.,
Кожевников О.В., Иванов А.В. Родионов С.В.*
ФГУ «ЦИТО им.Н.Н.Приорова Росздрава», Москва, РФ
*Институт иммунологии Росздрава, Москва, РФ
Восстановление целостности поврежденных костей остается одной из сложных и
до конца не решенных проблем в травматологии и ортопедии. Репаративная регенерация
костной ткани характеризуется многоэтапностью течения и зависит от многочисленных
факторов. Обширные костные дефекты, нарушение кровоснабжения зоны перелома,
наследственные заболевания соединительной ткани являются неблагоприятными
условиями восстановления поврежденных костей, которое может оказаться
неполноценным (ложные суставы) или замедленным (при компрессионнодистракционном остеосинтезе). В таких случаях очевидна необходимость стимуляции
репаративного остеогенеза.
Стимуляция репаративного остеогенеза при хирургической коррекции у детей на
основе использования аутологичных культивированных стволовых и прогениторных
клеток мезенхимального происхождения.
Нами начато исследование выраженности репаративных процессов костной ткани
после применения клеточной терапии. Комплексное лечение с использованием клеточной
терапии проведено 5 пациентам в возрасте от 5 до 16 лет с неравенством длины
конечностей, среди которых один ребенок имел врожденный ложный сустав костей
голени. В работе использовались клеточные культуры аутологичных стромальных
мультипотентных клеток (СМК) костного мозга, выделенных из биоптата крыла
подвздошной кости и культуры предшественников остеобластов надкостницы.
Для характеристики антигенового профиля клеточной поверхности популяций
культивированных
клеток использовали методику классификации флюоресцентактивированных (КФА) и магнито-заряженных клеток. Фенотипирование проводили с
моноклональными антителами (mAb) к антигенам человека на лазерном проточном
цитометре FACScan по программе Cellquest. Результаты показали, что на клетках
культуры отсутствовали антигены свойственные гемопоэтическим стволовым клеткам
(CD34), различным лимфоцитам (СD3, 20,23,25,45,80,HLA-DR), а также гранулоцитам,
макрофагам и нормальным киллерным клеткам (CD11b,14,15,16,45). Напротив, на
клетках культуры имелись антигены общие, как для остеобластов и фибробластов и их
предшественников СD 9,10, 13, 29, 44, 49b, 54(ICAM-1), 58, 90.
Перед трансплантацией клеток культуры проходили многочисленные контроли на
стерильность и
ДНК-диагностику на наличие возбудителей инфекций. Данные
заносились в паспорт культуры клеток, который вносился в историю болезни пациента.
Часть культуры помещалась в криобанк для длительного хранения с возможностью
использования в дальнейшем. Клеточная суспензия (1-3 млн клеток) в физиологическом
растворе инъецировалась непосредственно в область дистракции. Двум детям стимуляция
регенерата проведена после окончания удлинения, когда клетки вводились в имеющиеся
дефекты вновь образованной костной ткани. Остальным имплантация клеток
осуществлялась в процессе дистракции с кратностью 3-5 инъекций, раз в 5 дней.
Результаты проведенного исследования показали не только быстрое закрытие
дефектов, но и значительное улучшение качества регенерата при его динамической
стимуляции в периоде коррекции длины кости. Оценка состояния регенерата
осуществлялась по данным рентгенографии и ультразвукового исследования. При
выполнении УЗИ контроля в динамике через 1 мес. после начала стимуляции регенерата
мы отмечали высокую скорость артериального кровотока по сосудам регенерата с низким
индексом резистентности (RI = 0,4). Сонографически через 2, 5мес отмечались участки
костного регенерата с плотным кортикальным слоем, что является одним из показателей
ускоренной остеорепарации. Проведя анализ клинического материала, мы отметили
существенное сокращение сроков лечения. Они составили в среднем 5,5 месяцев при
компенсации укорочения на 6,2 см. Кроме того, у пациентки с рецидивом врожденного
ложного сустава костей голени удалось добиться сращения последнего уже через 2 месяца
после операции с хорошими показателями регенерации при билокальном замещении
дефицита длины конечности.
Таким образом, использование клеточной технологии открывает большие
перспективы для осуществления оптимального лечения детей с тяжелой патологией
опорно-двигательного аппарата. Хотя ранние доклинические и клинические данные
показывают безопасность и эффективность терапии СМК, остается еще много вопросов о
механизме
действия.
Требуется
дополнительная
информация
относительно
терапевтической эффективности трансплантированных клеток и механизмах
приживления, самонаведения и дифференциации in vivo.
Экспрессия СD34 на бластных клетках при common-all у детей.
Сазонов С.В., Вержбицкая Т.Ю.
ГУЗ Центр организации специализированных видов помощи «Институт медицинских
клеточных технологий», Екатеринбург
ГОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия Росздрава”
ГУЗ СО «Детская областная клиническая больница», Екатеринбург
В настоящее время современные протоколы лечения острых лимфобластных
лейкемий (ALL) кроме рутинных методов диагностики предполагают проведение таким
больным комплекса иммунологических и генетических исследований. Исследование с
помощью метода иммунофенотипирования поверхностных и цитоплазматических
дифференцировочных антигенов на бластных клетках позволяет определить не только
линейность опухолевого клона, но и стадию дифференцировки, на которой находятся
опухолевые клетки, что является обязательным условием в определении особенностей
проводимой терапии. Важность иммунофенотипирования и учета степени
дифференцировки бластов закреплена во всех современных протоколах лечения (ALLBFM, ALL-MВ) активно используемых в детской онко-гематологии в России.
В
настоящей
работе
проанализированы
особенности
экспрессии
дифференцировочного антигена CD34 на бластных клетках опухоли у детей с
иммунофенотипом, соответствующим Common-ALL. Исследования выполнялись в
лаборатории иммунофенотипирования ОДКБ (главный врач – к.м.н. С.Н.Боярский) на
проточном цитометре FACScan фирмы «Bacton Dickinson» с использованием
программного продукта LYSYS II, версия 1.1. Иммунофенотипические варианты ALL
определяли с учетом критериев, изложенных в протоколе ALL-BFM. Для их определения
использовали панель моноклональных антител, включающую: Т-линейные антитела CD2, CD1a, CD3, CD5, CD4, CD8, TCR, В-линейные - CD19, CD20, CD22, CD10, IgM,
CD79a, Kappa/Lambda, и дополнительно антиген стволовой клетки - CD34. Common-ALL
вариант устанавливался при наличии морфологии клеток L1 и экспрессии бластными
клетками CD10, CD79a, CD22, CD19 при отрицательной реакции с CD20, Kappa/Lambda и
cytIgM. Обследован костный мозг 160 пациентов с ALL с тотальным поражением
последнего. Из них 94 мальчика (56%) и 66 девочек (41%). Средний возраст мальчиков
составил 6,0±0,53 года, девочек – 5,8±0,91 года. Из 160 человек у 125 (78%) при
исследовании бластных клеток выявлена экспрессия CD34. Ее уровень колебался в
пределах от 27 до 97% и в среднем составил 77,8±5,15%. Однако в 22% случаев (35 чел.)
при исследовании экспрессии CD34 на опухолевых клетках не обнаружено. При анализе
этой группы больных не обнаружено достоверных отличий по полу и возрасту.
Таким образом, нами установлена иммунофенотипическая неоднородность
Common-ALL варианта у детей. Учитывая отсутствие учета экспрессии CD34 в выборе
особенностей терапии детей этой группы в используемых протоколах следует оценить
дальнейшую медико-биологическую значимость этого признака как возможного
прогностического критерия.
Распределение меченных рением-188 мезенхимальных стволовых
клеток, выращенных в культуре костного мозга человека, после
системной трансплантации мышам
Коноплянников А.Г., Петриев В.М.. Кальсина С.Ш.. Лепехина Л.А.. Семенкова
И.В., Агаева Е.В., Коноплянникова О.А., Сморызанова О.А., Терехова Т.В.,
Скворцов В.Г., Цыб А.Ф.
ГУ Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН, Обнинск
В настоящее время системная (внутривенная) трансплантация больших количеств
мезенхимальных стволовых клеток (МСК) рассматривается как перспективный метод
клеточной терапии ряда заболеваний человека, связанных с повреждением или потерей
клеток в различных жизненно важных органах и тканях. Это обусловлено возможностью
МСК поступать из кровеносного русла в различные органы и ткани, однако,
закономерности начального распределения и последующего перераспределения системно
трансплантированных МСК по органам и тканям изучены в настоящее время
недостаточно.
Поэтому в нашем исследовании была сделана попытка оценить эти закономерности
при ксеногенной трансплантации лабораторным мышам МСК человека, вводимых в
концентрации примерно 15 миллионов клеток на кг массы тела. Выращенные в культуре
клеток МСК 5 пассажа метили используя элюат рения-188 в виде перренатонатрия
(Na Re188 O4), полученного из генератора W188/ Re188 . После мечения МСК их вводили
внутривенно по 0,5 миллиона клеток (общая радиоактивность введенная животным
составляла 2,4 мкК) белым неимбредно разводившимся мышам (исходная линия Swiss),
самцам, массой 26-30 г. После введения радиоактивно меченных МСК человека мышей
забивали через 5 минут, 3, 24 и 48 часов. После забоя животных приготавливали навески
крови, щитовидной железы, легких, печени, почек, сердца, селезенки, желудка, головного
мозга и бедренной кости для измерения радиоактивности полученных тканей и оценки
доли введенных радиоактивных МСК, содержащихся в изучаемых тканях (возможное
накопление в тканях несвязанного с МСК рения-188, могло быть только достаточно
низким из-за прочности
связывания этого изотопа с МСК, а также низкой
радиоактивности щитовидной железы, которая способна накапливать освободившийся
рений-188). На каждую экспериментальную точку использовали по 4 животных.
Было обнаружено, что радиоактивно меченные МСК быстро покидают русло
крови, уже через 3 часа после введения радиоактивность крови с учетом распада изотопа
(время полураспада для этого радиоактивного изотопа составляет 16,7 часа) уменьшается
в 14 раз, а через 24 и 48 часов после введения – более чем в 50 раз. В ранний срок
наблюдения (5 мин после введения) наибольшая радиоактивность наблюдалась в легких,
почках и печени. Затем радиоактивность легких неуклонно снижалась, а для печени и
почек, снизившись к 3 часам после введения клеток, стабилизировалась на достаточно
высоком уровне (примерно 30-50% от исходного). Органы особого интереса для
проведения клеточной терапии – сердце и головной мозг, при относительно низком
исходном уровне включения радиоактивной метки к 24-48 часам подобно печени и
почкам стабилизируются на уровне радиоактивности, составляющего не менее 50% от
исходного уровня.
Таким образом, использование радиоактивного мечения МСК с помощью рения188 доказало попадание и удержание данного типа стволовых клеток в органах, которые
представляют значительный интерес для клеточной терапии. Одновременно, оценки
уровня попадания клеток в «мишенные» органы и ткани, сделанные этим методом,
являются достаточно важным дополнительным материалом, который необходим для
определения концентраций МСК при планировании и проведении клеточной терапии.
Изучение иммуномодулирующей активности мезенхимальных
стволовых клеток (МСК) и кондиционной среды из под культур МСК
методом хемилюминесценции
Петров В.Н., Коноплянников А.Г., Лепехина Л.А.. Кальсина С.Ш., Семенкова И.В.,
Агаева Е.В., Коноплянникова О.А.
ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Известно, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают уникальными
иммуномодулирующими свойствами, среди прочих проявлений которых находится
способность МСК ослаблять активность эффекторных клеток кроветворной и иммунной
систем при трансплантации в аллогенный или ксеногенный организм. В нашей работе с
использованием МСК, полученных при культивировании клеток костного мозга крыс
линии Вистар и гематологически здоровых людей-доноров костного мозга, а также с
применением кондиционной среды (КС) из под этих культур было изучено тормозящее
действие собственных и ксеногенных клеток на хемилюминесценцию перитонеальных
макрофагов крыс и нейтрофилов периферической донорской крови (не сингенных с
МСК). Суспензии МСК смешивали с суспензиями сингенных, аллогенных и ксеногенных
эффекторных клеток или с различными разведениями КС и оценивали уровень их
собственной и люминол-индуцированной хемилюминесценции.
В этих исследованиях было обнаружено, что как в сингенных, так и аллогенных
сочетаниях МСК (или КС из под культур МСК) с эффекторными клетками наблюдается
торможение собственной и индуцированной химилюминесценции эффекторных клеток,
связанной, как известно, со способностью продуцировать активные формы кислорода.
Степень торможения хемилюминесценции зависела, в первую очередь, от
концентрационных соотношений клеток в получаемых смесях (или от концентрации КС в
суспензии эффекторных клеток), и относительно мало определялась
характером
генетических соотношений смешиваемых клеток. Замораживание КС с последующим
размораживанием или нагревание до температуры 600 С в течение 20 минут не ослабляло
ее ингибирующую способность в отношении хемилюминесценции эффекторных клеток.
Таким образом, можно прийти к заключению о том, что МСК способны выделять в
окружающую среду (при культивировании, при смешивании с эффекторными клетками, а
также, возможно, и при введении в организм сингенного, аллогенного и ксеногенного
хозяина) продукты, которые тормозят способность эффекторных клеток гемопоэтической
и иммунной системы продуцировать активные формы кислорода. По-видимому, оценка
ингибирующей хемилюминесценцию способности МСК и КС в будущем можно будет
использовать в качестве одно из количественных критериев биологической активности
МСК и продуктов их жизнедеятельности, применяемых при клеточной терапии различных
форм заболеваний.
Ацетилхолиновая регуляция пролиферативной активности
плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток является NOзависимой
Коноплянников А.Г., Коноплянникова О.А.
ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Более 30 лет тому назад J.W. Byron показал, что покоящиеся плюрипотентные
гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) в условиях in vivo и in vitro могут быть
запущены в пролиферацию путем воздействия на одну из 3-х групп рецепторов:1.
холинергические; 2. β-адренергические; 3. стероидных гормонов. Особое внимание
J.W.Byron привлекла возможность запускать ГСК в пролиферацию in vivo путем
воздействия неостигмина (прозерина), агента подавляющего активность фермента
ацетилхолинэстеразы в синаптических щелях и способствующего сохранению
ацетилхолина, который может триггировать переход ГСК в пролиферацию. Было
показано, что стимулирующий пролиферацию эффект неостигмина достигается только в
условиях in vivo, но не после его внесения в суспензию костномозговых клеток, т.е., он
требует сохранения «микроокружения» данного типа стволовых клеток, которое должно
включать элементы нервной иннервации тканей. Можно было предположить, что с
помощью «неостигминовой модели» удобно изучать эффекты контролирующего
пролиферацию стволовых клеток со стороны нервной системы, однако, дальнейшие
исследования в этом направлении были остановлены. Мы вернулись к этой
экспериментальной модели на основании следующего соображения – многие реакции в
нервных клетках являются NO-зависимыми и следовало проверить является ли
ацетилхолиновая стимуляция пролиферации ГСК NO-зависимой.
Опыты проводились с использованием метода селезеночных экзоколоний, в
котором содержание ГСК в костном мозге подопытных мышей-доноров костного мозга
определялось по уровню КОЕ-С-8 (селезеночные колоние-образующие единицы,
формирующие колонии в селезенке летально облученных мышей-реципиентов на 8 сутки
после внутривенного введения им определенных порций костного мозга мышей-доноров,
подвергавшихся или неподвергавшихся воздействию неостигмина /0,3 мг/кг/, различных
ингибиторов синтеза оксида азота и фазовоспецифического агента – оксимочевины
/300 мг/кг/). В качестве подопытных мышей использовали гибридов F1(CBAxC57Bl/6),
самцов, в возрасте 3 месяцев. О повышении уровня пролиферации КОЕ-С-8 в костном
мозге мышей доноров, получивших неостигмин отдельно или вместе с ингибиторами NOсинтаз за 4 часа до взятия костного мозга, мы судили по изменению их выживаемости при
дополнительном введении донорам костного мозга фазовоспецифического агента –
оксимочевины, введенной за 2 часа до взятия костного мозга. Мышей-реципиентов
костного мозга за сутки до в/в введения суспензий костного мозга мышей-доноров
подвергали летальному гамма-облучению в дозе 9 Гр (Co60, аппарат «Луч», мощность
дозы порядка 50 сГр/мин). В каждой группе доноров было по 3 мыши, а в каждой группе
реципиентов – по 12 мышей.
В первой серии опытов были воспроизведены данные J.W. Byron, так как мы
наблюдали повышение «оксимочевинной гибели» КОЕ-С-8 примерно на 30% у мышей
получавших неостигмин, по сравнению с мышами, которые его не получали. Доля гибели
КОЕ-С-8 у обработанных оксимочевиной мышей по сравнению с КОЕ-С-8 у мышей, не
получавших оксимочевину, повышалась менее чем на 5 %. При введении вместе с
неостигмином мышам-донорам тестируемого костного мозга неспецифического
ингибитора NO-синтаз – L-NAME (левовращающий метиловый эфир нитроаргинина,
250 мг/кг) или специфического ингибитора нейрональной NO-синтазы – 7-
нитроимидазола (25 мг/кг) мы обнаружили значительное подавление стимулирующего
пролиферативную активность КОЕ-С-8 неосигмина, без собственного воздействия
ингибиторов на уровень данного типа стволовых клеток.
Таким образом, получено экспериментальное доказательство реализации в
условиях целостного организма NO-зависимого контроля со стороны нервной системы
«микроокружения» ГСК, определяющего пролиферативную активность этого типа
плюрипотентных стволовых клеток.
Модуляция пролиферативной активности стволовых клеток
регенерирующих планарий с помощью магнитных полей и
фармакологических агентов.
Ермаков А.М., Ермакова О.Н., Леднев В.В.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.
Представители класса Turbellaria (тип Platyhelminthes) обладают уникальной
системой стволовых клеток, необластов. Необласты планарий - единственные клетки
животных, которые во взрослом организме делятся и дифференцируются во все типы
клеток, включая половые, т.е. они являются тотипотентными. В процессе регенерации
необласты являются основными поставщиками клеточного материала.
Относительно хорошо изучены необласты свободноживущих планарий отряда
Triclada. В этих планариях количество необластов составляет 20-30 % от общего
количества клеток. Эта популяция клеток поддерживается на постоянном уровне за счет
пролиферации и не является однородной: более 50% от числа необластов являются
постмитотическими (находятся в G-1 фазе клеточного цикла), 40 % готовы вступить в
митоз (находятся в G-2 фазе), и только 3-5 % представлены непролиферирующими
стволовыми клетками.
Морфологически необласты – небольшие (5-10 мкм) базофильные клетки овальной
формы, распределенные в паренхиме, заполняющей пространство между эпителием и
кишкой. Отличительной особенностью необластов является их высокая чувствительность
к рентгеновскому облучению, после которого планарии полностью теряют способность к
регенерации. Применение метода РНК интерференции позволило выявить около 48 генов
так или иначе участвующих в деятельности необластов. В частности, выявленные у
планарий гены семейства PIWI, bruno-подобные гены весьма консервативны и схожи с
таковыми у других более высокоорганизованных животных, что указывает на общность
необластов и стволовых клеток других животных, включая и человека.
Оценить возможность управления деятельностью необластов физическими и
химическими факторами на примере регенерации головной части планарий.
Работа выполнена на плоских червях – планариях Girardia tigrina (бесполая
миксоплоидная лабораторная раса животных). Изучали влияние комбинированных
магнитных полей и фармакологических агентов на скорость регенерации планарий путем
измерения кинетики роста бластемы (вновь образуемой ткани) и оценки митотической
активности необластов в зоне постбластемы (ткань, непосредственно примыкающая к
бластеме). Пролиферативная активность необластов запускалась путем ампутации
головной части тела планарии.
Для измерения кинетики роста бластемы в экспериментальных и контрольных
животных использовали метод прижизненной компьютерной морфометрии, основанный
на регистрации фотоконтраста между старыми (пигментированными) и новыми
(прозрачными) частями тела планарий. Регенерирующих планарий фотографировали в
косом свете бинокуляра через 3 суток после ампутации. На полученных изображениях
планарий определяли площадь S всей планарии и площадь s прозрачной регенерирующей
бластемы. Скорость регенерации планарий характеризовали отношением s/S (индексом
регенерации). Величину биэффекта (%) оценивали как разницу между средними
значениями индекса регенерации для контрольных и опытных групп.
Митотическую активность клеток в постбластеме регенерирующих планарий
определяли с помощью ареста метафазных клеток колхицином. Сразу после ампутации в
среду добавляли колхицин в концентрации 0.05 %. Через 24 часа участки постбластемы
ампутировали и помещали для диссоциации в растворе Карнуа. Для выявления
метафазных фигур использовали флюоресцентный краситель Hoechst-3342. На
полученных препаратах клеток определяли число метафазных фигур на 1000 клеток
(митотический индекс) с помощью флуоресцентного микроскопа. Величину биэффекта
(%) оценивали как разницу между средними значениями митотического индекса для
контрольных и опытных групп.
Комбинированные магнитные поля (КМП) создавались путем накладывания на
постоянное геомагнитное поле (BDC=42 мкТл) коллинеарно направленных переменных
(синусоидальных)
полей,
созданных
с
помощью
катушки
Гельмгольца.
Экспериментальная группа регенерирующих животных помещалась в центре катушки
Гельмгольца, контрольная находилась на расстоянии 1,5 м от экспериментальной группы.
В качестве фармакологических агентов использовали мелатонин и транс ретиноевую кислоту. Ретиноевая кислота в растворе DMSO и мелатонин в растворе
этанола добавляли непосредственно в стаканы с прудовой водой, в которых находились
предварительно декапитированные животные до конечных концентраций 10-4М - 10-10М
(для мелатонина) и 10-6М - 10-10М (для ретиноевой кислоты).
Добавление мелатонина к регенерирующим планариям сопровождалось снижением
скорости роста бластемы. Максимальный эффект достигался при концентрации
мелатонина 10-4М (35±5%) и уменьшался при понижении концентрации мелатонина до
10-10М, достигая значения 15±6%, митотический индекс в опытной группе при
концентрации мелатонина 10-4М был меньше чем у контрольной группы животных на
50±3%. Раствор ретиноевой кислоты также достоверно подавлял скорость роста бластемы
у планарий. При концентрациях ретиноевой кислоты 10-6М, 5*10-7М, 10-7М, 10-9М, и 1010М эффект составлял 35±5%, 30±5%, 20±6%, 17±6% и 8±5% соответственно.
Митотический индекс у опытной группы планарий в растворе ретиноевой кислоты с
концентрацией 10-7М был меньше контрольной на 45±3%.
Воздействие КМП с кране слабой переменной компонентой fAC= 76 Гц, ВAC=1,6
мкТл стимулировало регенерацию планарий: рост бластемы увеличивало на 21±6%, а
митотический индекс - на 46±5%. При одновременном воздействии на регенерантов
указанного КМП ингибирующий эффект как мелатонина так и ретиноевой кислоты
значительно снижался. При совместном действии данного КМП и ретиноевой кислоты
(10-7М) индекс регенерации в опытной группе не отличался от такового для контрольной
(эффект составлял 3±5%). При совместном действии указанного КМП и мелатонина (106М) эффект составлял 2±5%.
КМП (ВAC=1,06 мкТл, fAC=50 Гц) увеличивало индекс регенерации (на 17±6%) и
митотический индекс (на 38±5%). При совместном воздействии данного поля с
ретиноевой кислотой (10-9М) индекс регенерации для опытных и контрольных групп не
отличался (4±6%); при совместном воздействии данного КМП и мелатонина (10-6М)
данный показатель составлял 3±6%.
Воздействие КМП (ВАС=140мкТл, fAC=50 Гц) приводило к замедлению роста
бластемы на 17±6%. Совместное действие этого типа поля с мелатонином (10-6М) давало
дополнительное ингибирование скорости роста бластемы планарий до 25±6%; при
совместном действии этого КМП и ретиноевой кислоты (10-9М) данный показатель
составлял 27 ±6%.
Результаты данной работы показывают, что скорость пролиферации стволовых
клеток планарий (необластов) можно существенно изменять - как активировать так и
ингибировать - с помощью слабых магнитных полей (неинвазивное воздействие) и
фармакологических агентов (в частности ретиноевой кислотой и мелатонином), а также с
использованием комбинации этих воздействий. Регенерирующие планарии могут быть
использованы в качестве весьма удобной тест-системы для изучения возможностей
модуляции пролиферативной активности и дифференцировки стволовых клеток с
помощью различных физико-химических факторов.
Организация научно-исследовательской работы в области клеточных
технологий в Самарской области.
Тюмина О.В.1, Корымасов Е.А.2, Волова Л.Т.2, Котельников Г.П.2,Гусарова Г.И.3,
Гридасов Г.Н.4
ГУЗ Самарской области «Клинический центр клеточных технологий»1,
ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»2,
Министерство здравоохранения и социального развития Самарской области3,
ГУЗ «Самарская областная клиническая больница им. М.И. Калинина»4
Экспериментальные и пока немногочисленные клинические наблюдения, в
основном зарубежных авторов, показали высокую эффективность клеточной терапии
стволовыми клетками и клетками-предшественниками при некоторых социально
значимых заболеваниях. Причинами отставания отечественных исследований в этой
области
является
отсутствие
целевого
финансирования,
низкий
уровень
комплексирования специалистов различных профилей, отсутствие необходимой
нормативно-правовой и этической базы, а также попытки необъективного подхода к
получаемым результатам. Внедрение клеточных технологий должно проводиться на
строго научной основе в рамках действующего законодательства.
В Самарской области с 2003 г. реализуется научно-практическая программа в
области клеточных технологий. С этой целью создано ГУЗ СО «Клинический центр
клеточных технологий», имеющий лицензию №99-01-001651 Росздравнадзора
(12.05.2005). Работа осуществляется в соответствие с Законом РФ «О трансплантации
органов и (или) тканей человека» (22.12.1992), Приказом МЗ РФ № 345 «О создании
Экспертного Совета по рассмотрению научных исследований в области развития
клеточных технологий и внедрению их в практическое здравоохранение» (29.08.2001),
«Временной инструкцией о порядке исследований в области клеточных технологий и их
использования в учреждениях здравоохранения» (18.04.2002), Отраслевой Программой
РАМН «Новые клеточные технологии - медицине» (29.05.2002), Приказом МЗ РФ № 325
«О развитии клеточных технологий в РФ» (25.07.2003). Министерством здравоохранения
и социального развития Самарской области и Самарским государственным медицинским
университетом издан Приказ №254/180 «О координации исследований в области
клеточных технологий» (10.08.2005), а на Ученом Совете СамГМУ принята научнопрактическая программа «Применение стволовых клеток в медицине» (26.11.2004), согласованная с Гематологическим Научным Центром РАМН. Разработаны протоколы научных
исследований по трём направлениям: 1) исследование эффективности аутологичных
прогениторных клеток костного мозга у больных с тяжелым атеросклеротическим
поражением сосудов нижних конечностей; 2) изучение эффективности клеточных
технологий в экспериментальной модели повреждения хрящевой ткани; 3) изучение
эффективности применения культуры собственных лактобацилл для восстановления
биоценоза влагалища. Экспериментальный этап работы выполняется на кроликах в ЦНИЛ
СамГМУ. Ограниченные клинические испытания проводятся методом двойного слепого
плацебо-контролируемого рандомизированного исследования на базе Самарской
областной клинической больницы. Участие пациентов в исследовании было
добровольным. Работа по выделению, культивированию стволовых клеток проводится в
«чистых помещениях» (2 класс). Отдельным большим направлением является заготовка,
криохранение образцов пуповинной крови в ГУЗ СО «Клинический центр клеточных
технологий». Все протоколы прошли экспертизу и получили одобрение Комитета по
биоэтике
при
СамГМУ
(№30
от
30.03.2005).
Контроль
осуществляет
Минздравсоцразвития Самарской области. Финансирование осуществляется из бюджета
области.
Методология научного поиска, положенная в основу экспериментальных и
клинических исследований, позволила получить статистически достоверные результаты.
При проведении клинической части работы каких-либо осложнений не отмечено. Все
больные перенесли применяемые способы и методы лечения удовлетворительно. В
настоящее время проводится изучение отдаленных результатов, после чего будет дана
объективная оценка эффективности клеточных технологий с позиций доказательной
медицины.
Клеточные технологии – стратегически важная область медицинской науки и
практики, один из компонентов обеспечения национальной безопасности страны. Научноисследовательская работа по этому направлению требует финансовой поддержки
государства, осуществления только в государственных учреждениях здравоохранения и
медицинских университетах или научно-исследовательских институтах под жёстким
контролем исполнительной власти.
Работа банка пуповинной крови в Самарской области.
Тюмина О.В., Волчков С.Е., Трусова Л.М., Тороповский А.Н.,
Борискин П.В.
ГУЗ Самарской области "Клинический центр клеточных технологий"
В г.Самаре с 2003 г. начал свою работу по заготовке, криохранению образцов
пуповинной крови (ПК), научно-исследовательской работе в области клеточных
технологий государственный банк пуповинной крови. Губернатором и Министерством
здравоохранения Самарской области поставлены задачи: организация публичного банка
стволовых клеток ПК с лабораторией культивирования, в соответствии с
международными стандартами для интеграции в международную сеть банков, внедрение
новых клеточных технологий в Самарской области для повышения качества медицинской
помощи.
Цель исследования. - оценить первый этап внедрения новых клеточных
технологий. Изучить влияние различных факторов (масса, рост плода, шкала Апгар, срок
гестации, на объём собранной пуповинной крови (ПК) и количество ядросодержащих
клеток (ЯСК). Сравнить способы обработки ПК.
Заготовка ПК осуществляется в 4-х родильных домах г.Самары. Все женщины доноры пуповинной крови
подписывают информированное согласие, проходят
тщательный дородовый скрининг на наличие показаний и противопоказаний к донорству
ПК, а также обследование на наличие гемотрансмиссивных инфекций.
1400 образцов ПК было подвергнуто обработке двумя методами: двойного
центрифугирования с HES и автоматическим методом на клеточном сепараторе Sepax.
Проводилось сравнительное исследование форменных элементов крови до и после
обработки ПК.
ы провели корреляционный анализ (n=102) зависимости объёма собранной ПК от
массы (r=0,268 p<0,01) и роста плода (r=0,203 p<0,05), шкалы Апгар (r=-0,092 p>0,1),
срока гестации (r=-0,003 p>0,1), а также анализ зависимости количества ядросодержащих
клеток в образце ПК от объёма собранной ПК (r=0,102 p>0,1) от массы (r=0,073 p>0,1),
роста плода (r=0,121 p>0,1), срока гестации (r=0,159 p>0,1), шкалы Апгар (r=-0,174 p>0,1).
При ручном методе обработки ПК медиана выхода ЯСК составила 86,3% (82,9-91,7), при
автоматическом методе – медиана выхода ЯСК 86,6% (78,3-92,2), достоверной разницы по
критерию Манна-Уитни не выявлено. Выявлена достоверная разница по выходу
лимфоцитов: при ручном методе медиана выхода лимфоцитов составила 84,6% (79,9-90), а
при автоматическом – 93,3% (89,5-99,3), p<0,01.
Имеется слабая корреляционная связь между объёмом собранной ПК, массой и
ростом плода; шкала Апгар и срок гестации не влияют на величину объёма. Количество
ЯСК в образце ПК не зависит от объёма собранной крови, массы, роста плода, шкалы
Апгар и срока гестации. Оптимизация ручного метода обработки пуповинной крови
позволила приблизить результаты к показателям автоматического метода.
Отработанная методика по заготовке, обработке и криохранению образцов ПК является
первым шагом внедрения новых клеточных технологий в Самарской области.
Аутологичная трансплантация культуры клеток стромы
лимфатических узлов для купирования вторичной лимфедемы в
эксперименте.
Волова Л.Т., Россинская В.В., Яровенко Г.В., Герасимова Е.С.
ФГУ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»
Вторичная лимфедема развивается при склерозе и атрофии регионарных
лимфатических
узлов
вследствие
хронических
воспалительных
процессов,
рентгенотерапии, хронической венозной недостаточности. Традиционное хирургическое
лечение оказывается часто малоэффективными. В связи с этим поиски новых методов, в
том числе с использованием клеточных технологий, весьма актуальны и перспективны.
Цель исследования - разработка способа купирования вторичной лимфедемы конечностей
при помощи трансплантации культуры аутологичных клеток стромы лимфатических
узлов в эксперименте на животных.
Эксперименты были проведены на 35 белых лабораторных крысах массой 120-150
г с соблюдением всех этических требований, предъявляемых к работе с
экспериментальными животными. Моделировали лимфостаз путем удаление всего пакета
паховых лимфатических узлов. Удаленные узлы использовали для получения культуры
стромальных клеток. Через 3 месяца после операции, когда формировалась вторичная
лимфедема, крыс разделили на 4 серии: в 1-й серии в паховую область пораженной
конечности инъекционно вводили суспензию
аутологичных стромальных клеток
лимфатического узла, во 2-й серии – суспензию дермальных фибробластов, в 3-ей серии 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 4-я серия служила контрольной. Во всех случаях
доза составляла 300 тысяч клеток в 0,2 мл 0,9% стерильного раствора хлорида натрия.
Культуру получали методом первичных эксплантатов и дробной трипсинизацией. Клетки
выращивали в культуральных флаконах Corning (производство США) объемом 25 см² при
37ºС в присутствии 5% СО² в средах МЕМ и RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной
бычьей сыворотки (ООО «БиолоТ». В работе использованы инвертированный микроскоп
Биолам П-2-1, термостаты и СО2 - инкубаторы фирмы Sanyo (Incubator MIR-262),
ламинарный бокс с вертикальным потоком воздуха II класса защиты.
Для трансплантации применяли культуру 4-8 пассажа. Наблюдение за динамикой
отека конечности проводили методом волюметрии. Верификацию культуры клеток и
тканей в области трансплантации клеток осуществляли морфологическими методами.
Клетки стромы паховых лимфатических узлов в культуре проявляют выраженные
адгезивные свойства к поверхности культуральных флаконов. На 1-2 пассажах в
начальной фазе роста клетки имеют полигональной формы тела и 3-5 отростков,
анастомозирующих с отростками соседних клеток. Начиная с 4 пассажа клетки
приобретают более вытянутую форму, количество отростков у них не превышает 3.
Отличаются от фибробластов в культуре несколько большими размерами (длина
стромальной клетки 67,3±3,1 мкм, фибробласта – 53,1±2,6 мкм, поперечный размер
соответственно 29±1,9 мкм и 21±2,1 мкм), большим количеством отростков на ранних
пассажах, замедленным по сравнению с фибробластами ростом, способностью
индуцировать образование лимфоидной ткани при трансплантации в паховую область.
Отек на конечности оперированных животных
нарастал к 20 дню и
стабилизировался к 6 неделе. После пересадки культуры аутологичных стромальных
клеток отмечен регресс отека, динамика которого составила через 10 дней от 7% до 13%.
Затем, в процессе наблюдения, нами зафиксировано дальнейшее уменьшение отека на 32
сутки до 42,6%, к 60 дню до 87,6%; полное его купирование наступало через 3 месяца
после введения клеток. При морфологическом исследовании через 3 месяца у таких крыс
выявлялись единичные, крупные лимфатические узлы с хорошо выраженными слоями
(кортикальным, паракортикальным, медуллярным). До 1,5 месяцев узлы были более
мелкие, в количестве 2-3, с хорошо выраженным корковым слоем, «размытыми»
синусами и медуллярным слоем.
У крыс 2-й и 3-й серии не происходило регресса отека на оперированной
конечности и новообразования лимфоидной ткани в
месте удаления пакета
лимфатических узлов.
Трансплантация культуры аутологичных клеток стромы лимфатических узлов
позволяет добиться купирования вторичного лимфатического отека в эксперименте
благодаря
формированию комплекса новых лимфатических узлов, имеющих
органотипическое строение, - органов, играющих ведущую роль восстановлении
лимфооттока в конечности.
Экспериментальные модели изучения дифференцировки стволовых
клеток в эндокриноциты у мышей, подвергшихся рентгеновскому
облучению
Н.А.Беляков, А.М.Зайчик, А.В.Каюмов, В.М.Михайлов, В.Б.Сериков
ГОУ ДПО Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, СанктПетербург.
Введение. В начале 21 века восстановление функции различных органов стало
одной из актуальных проблем медицинской и биологической науки. К настоящему
времени накоплен опыт практического применения стволовых клеток при различных
формах патологии.
Использование стволовых клеток в качестве биотехнологического материала стало
возможным благодаря нескольким научным открытиям последнего десятилетия: 1)
доказательству, что мишенью раковой трансформации являются стволовые клетки; 2)
формированию представлений о тканеспецифических стволовых клетках; 3) открытию
феномена пластичности стволовых клеток, в основе которого лежит возможность
транедифференцировки
соматических
стволовых
клеток
различной
тканевой
специфичности. Тем не менее, многие фундаментальные процессы, лежащие в основе
физиологической регуляции направленной дифференцировки стволовых клеток остаются
неизученными.
Цель исследования. Изучение возможности дифференцировки стволовых клеток в
эндокриноциты у мышей, подвергшихся рентгеновскому облучению.
Материалы и методы. Было проведено два вида экспериментов. В первой серии
экспериментов использовались мыши C57BL/6 и трансгенные мыши C57BL/6,
экспрессирующие GFP-протеин. После облучения в дозе 5 Гр и 7,5 Гр мышам C57BL/6
было введено 7 млн костномозговых клеток от трансгенных мышей C57BL/6,
экспрессирующих GFP-протеин («зеленые» мыши). Вторая серия экспериментов
проводилась на парабиотических парах мышей mdx и трансгенных мышей C57BL/6,
экспрессирующих GFP-протеин. В данном случае облучению подвергались мыши mdx в
тех же дозах. Криостатные срезы щитовидной железы облученных мышей были
фиксированы холодным этанолом, клеточные ядра окрашивались пропидиум иодидом.
Срезы щитовидной железы изучали с помощью конфокального микроскопа LSM 5
PASCAL. GFP-природа зеленых сигналов была подтверждена дополнительным
окрашиванием ткани срезов aHTH-GFP-антителами кролика с СУЗ-мечеными
вторичными антителами. Аналогичная методика была применена при изучении срезов
ткани надпочечников облученных мышей.
Результаты. В течение 2-3 месяцев после рентгеновского облучения у химерных
мышей отдельные GFP-положительпые клетки обнаруживались в стенках фолликулов и
между фолликулами. Спустя 10 месяцев после рентгеновского облучения доля GFPположительных фолликулов значительно возрастала. Отмечалось также совпадение
локализации GFP-сигналов с положительным окрашиванием тироцитов и коллоида
моноклональпыми антителами к тиреоглобулину. В эти же сроки во всех зонах коры
надпочечников были также обнаружены функционирующие эндокриноциты, содержащие
флюоресцирующий протеин.
Заключение. Стволовые клетки костного мозга участвуют в регенерации
щитовидной железы и коркового вещества надпочечников после рентгеновского
облучения. Полученные результаты могут служить основанием для разработки
технологии восстановления функциональной активности эндокринных желез при
нарушении их структурной организации.
Влияние трансплантации аутологичных стромальных клеток костного
мозга различного фенотипа на сократительную функцию сердца при
экспериментальном инфаркте миокарда.
Потапов И.В., Кириллов И.А., Вострикова О.Ф., Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Стромальные клетки костного мозга (СККМ) обладают свойствами стволовых, так
как могут дифференцироваться в фенотипы клеток мезодермального происхождения.
Показано,
что
СККМ
могу
дифференцироваться
в
эндотелиоцитои
кардиомиоцитоподобный
фенотипы. Однако сравнение способности этих клеток
восстанавливать сократительную функцию поврежденного миокарда не проводилось.
Цель исследования: Выявить отличия во влиянии трансплантированных
аутологичных СККМ различного фенотипа на функцию левого желудочка (ЛЖ) при
экспериментальном инфаркте миокарда (ИМ).
Для работ были использованы крысы линии Вистар массой 200-300 г. ИМ
моделировали методом криодеструкции (КД) ЛЖ. Животные были разделены на 4
группы: 1) с КД миокарда и введением в инфарктную зону культуральной среды (10
животных), 2) с КД и введением в инфарктную зону кардиомиоцитоподобных СККМ
(кСККМ) (10 животных), 3) с КД и введением в инфарктную зону
эндотелиоцитоподобных СККМ (эСККМ) (10 животных), 4) с КД и введением в
инфарктную зону недифференцированных СККМ (нСККМ) (10 животных).
Забор клеток КМ для получения культуры СККМ производили из большеберцовых
костей крыс, затем культивировали пластик-адгезивную фракцию в течение 10 суток с
пассировнием культуры. В последующем для получения кСККМ в среду вносили 5азацитидин, для получения эСККМ в среду вносили VEGF. Для пересадки использовали
3-недельную культуру СККМ. Трансплантацию клеточного материала проводили в
количестве 4-5х106 клеток, ресуспендированных в 100μл среды, инъекционно в 5 точек
периинфарктной зоны через 7 дней после КД. Через 4 недели после КД миокарда
оценивали сократительную функцию изолированных сердец в стендовых условиях по
методике Neely с применением нагрузочных тестов (дозированное последовательное
изменение преднагрузки и постнагрузки на ЛЖ). Обработку результатов исследования
производили с использованием t критерия Стьюдента и поправки Бонферрони.
Через 30 дней после КД мы наблюдали рубцово-измененный миокард
переднебоковой стенки ЛЖ округлой формы диаметром 5-6 мм снаружи и 3 мм со
стороны эндокарда. Макроскопически нами не было замечено отличий между группами в
размерах и форме рубца.
При увеличении преднагрузки на ЛЖ сердца групп с трансплантацией клеток
показали более существенные приросты аортального, минутного и ударного объема, чем в
контрольной группе. Особенно это было выражено в группе нСККМ за счет более
значительного увеличения ЧСС и уменьшения времени систолы в этой группе. При
увеличении постнагрузки было показано, что в группе с кСККМ происходили меньшая
убыль аортального и ударного объемов, больший прирост систолического давления и
работы. Между тем, при высоких постнагрузках сердца группы эСККМ более активно
сокращаются (меньшее время систолы, больше работа, больше систолическое давление),
чем сердца контрольной группы и кСККМ. Это свидетельствует о более быстрой
адаптации группы с эСККМ к постнагрузкам. Трансплантация клеток повышает
переносимость миокардом сверхвысоких постнагрузок: после сверхвысокой постнагрузки
происходило практически полное восстановление функции ЛЖ. Это происходило за счет
более эффективной перфузии миокарда. Особенно эти эффекты выражены у группы
эСККМ. Несмотря на увеличение коронарных объемов перфузионного раствора во всех
группах, в контрольной группе это не сопровождалось восстановлением функции ЛЖ.
Можно предполагать, полученный факт это свидетельствует о более выраженном сбросе
перфузионного раствора через артериовенозные шунты в контрольной группе.
Пересаженные аутологичные СККМ оказывают положительное влияние на
восстановление сократительной функции ЛЖ вне зависимости от своего фенотипа. Так,
улучшение систолической функции ЛЖ при увеличении преднагрузок можно расценить
как свидетельство улучшения эластических свойств миокарда ЛЖ. Однако проявляются и
отличия действия различных типов клеток. Положительное воздействие нСККМ в
основном ограничивается только на этапе высокой преднагрузки. Более быстрое
включение сократительных резервов (еще на этапах преднагрузок) в группе с эСККМ
свидетельствует о более эффективной перфузии миокарда, чем в группе кСККМ. Это
позволяет говорить о предпочтительности использования эСККМ в клинике.
Использование клеток аллогенного костного мозга для коррекции
сахарного диабета типа II в генетической модели.
Степанова О.И., Онищенко Н.А.*, Баранова О.В., Галахова Т.В.
ГУ НЦ Биомедицинских технологий РАМН, Москва
* ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Современная медикаментозная терапия сахарного диабета (СД) по-прежнему
неспособна надежно препятствовать прогрессированию клинических проявлений СД и его
осложнений. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается
актуальной проблемой диабетологии.
Целью исследования явилось изучение на генетической модели сахарного диабета
2 типа возможности коррекции углеводного и липидного обмена с помощью
гемопоэтической и стромальной фракций клеток аллогенных костного мозга (ККМ).
Для моделирования СД II типа использовали мышей линии С57BL/Ksdb/+ в
возрасте 136 дней, так как в это период у животных наблюдаются резкое снижение веса,
выраженная полидипсия и полиурия; в крови, выявляется высокий уровень содержания
глюкозы и гликозилированного гемоглобина, т.е. выявляются клинические признаки СД
напоминающие клинику СД I типа.
Для коррекции углеводного и липидного обмена использовали клетки костного
мозга от доноров мышей линии B10.GFP, клетки которых содержат ген зеленого белка.
Сначала вводили гемопоэтические ККМ (мононуклеарную фракцию) культивированные в
течение 5 суток и затем стромальные ККМ (фибробластоподобные) культивированные в
течение 14 суток.
Реципиентам мононуклеарную фракцию ККМ вводили внутрибрюшинно в
количестве по 4 млн. 4-х кратно с интервалом в 7 дней; стромальную фракцию клеток
ККМ вводили в количестве по 1,5 млн. 3-х кратно с интервалом в 14 дней, от первого
введения мононуклеарной фракции.
У мышей-реципиентов ККМ в течение 4-х месяцев, измеряли вес, содержание
глюкозы, гликозилированного гемоглобина в цельной крови. Определяли: вес селезенки,
поджелудочной железы, печени и почек.
На 120 сутки исследовали криосрезы
поджелудочной железы, селезенки, печени и почек на присутствие донорских ККМ с
геном зеленого белка.
Семикратно введенная доза культивированных гемопоэтических и стромальных
ККМ способствует пролонгированному снижению в крови содержание глюкозы и
гликозилированного гемоглобина в течение 117 дней от первого введения ККМ.
Отмечено также устранение мацерации кожных покровов, снижение аппетита и
исчезновение полиурии. В контрольной группе мышей вес резко снизился тогда, как в
экспериментальной группе животных вес за аналогичный период стабилизировался.
По окончании опытов возраст реципиентов в экспериментальной группы составил 256
дней (животные были забиты) тогда, как в контрольной группе срок жизни составлял 150189 дней (животные погибли).
После семикратного введения клеток при гистологическом исследовании органов мышей
линии С57BL/Ksdb/+ на 120 сутки эксперимента установлено:
В поджелудочной железе экспериментальных животных отмечалось увеличение
количества и размеров как самих островков, так и увеличение количества
дегранулированных β-клеток в островках. Большинство островков было среднего и
крупного размера, с довольно четкими контурами и большими центрами размножения,
площадью от 64762,5 усл. ед. до 128347,9 усл. ед. Площадь островка в среднем составляла
101462,7 усл. ед., что достоверно превышало размеры островков в контрольной группе в 4
раза. Среднее количество клеток в островке составило 258 клеток, что превышало
количества клеток в контрольной группе в 3 раза. Таким образом, анализ
морфологических изменений поджелудочной железы показал, что 7-и кратное введение
клеток ККМ приводит к выраженной гиперплазии эндокринной части поджелудочной
железы на фоне общей нормализации углеводного и белкового обменов.
В печени морфологическая картина изменений свидетельствовала о полном
восстановлении белково-синтетической функции печени в экспериментальной группе, что
проявлялось внутриклеточным накоплением большого количества гликогена. Отмечалось
также полное отсутствие признаков жировой дистрофии гепатоцитов по сравнению с
контролем. Таким образом, подтверждался положительный эффект от введения культур
ККМ, проявляющийся в уменьшении степени выраженности жировой дистрофии
гепатоцитов и улучшении белково-синтетической функции
В почках в экспериментальной группе отмечалось снижение степени выраженности
дистрофических изменений эпителия дистальных и проксимальных канальцев,
исчезновение эозинофильных масс в просвете канальцев, что было связано
с
нормализацией углеводного и белкового обменов.
В селезенке и лимфатических узлах животных экспериментальной группы имелись
признаки умеренной и выраженной гиперплазии, с образованием лимфоидных
фолликулов как среднего, так и крупного размера с большими центрами размножения.
Выявлялись признаки умеренного, а в некоторых наблюдениях – выраженного
мегакариоцитоза. Масса селезенки в этой группе колебалась от 0,053 до 1,027 г., что в
среднем превышало массу селезенки в контрольной группе в 11,4 раза. Площадь
лимфоидных фолликулов колебалась в пределах от 62313,5 усл. ед. до 249674,2 усл. ед.
Средняя площадь островка составляла 140447,8 усл. ед, что превышало площадь
лимфоидных фолликулов в контрольной группе в 5,38 раз и свидетельствовало о
восстановлении структуры селезенки, как иммуно-компетентного органа.
Оценка состояния введенных ККМ показала, что на 120 сутки после
внутрибрюшинного введения клеток в организм они не погибают, а сохраняют свою
жизнедеятельность, мигрируя в разные органы, в том числе в поджелудочную железу и
селезенку, стимулируя участие этих органов в ауторегенерации.
Использование многократного введения культивированных гемопоэтических и
стромальных фракций аллогенного ККМ позволяет достигнуть клинической
реабилитации больных и увеличивают продолжительность и качество жизни животных.
Прекультивированные изогенные клетки костного мозга индуцируют
процессы восстановительной регенерации бета-клеток при
моделировании аутоиммунного сахарного диабета.
Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Анализ современных концепций развития сахарного диабета (СД) I типа
показывает, что стойкая инсулиновая недостаточность при СД, является результатом
неэффективной репаративной регенерации поврежденных островков Лангерганса (ОЛ).
Недостаточность репаративных процессов в ОЛ в значительной мере обусловлена и
поддерживается глубокими нарушениями функций иммунной системы (аутоиммунный
процесс), которая более других интегративных систем организма ответственна за
регуляцию морфогенеза и поддержание структурного гомеостаза.
Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности применения
изогенных клеток костного мозга (ККМ) для ослабления иммунного дисбаланса и
восстановления регуляции регенерации β-клеток в поджелудочной железе (ПЖ) при
моделировании аутоиммунного СД.
Аутоиммунный СД моделировали на мышах линии С57Bl/6 (n=30), массой 20-24
гр., путем ежедневного 5-ти кратного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина
(“Sigma Chemical”, США) в дозе 40 мг/кг массы тела. Через 10 суток от начала
моделировавния СД, животным в экспериментальных группах осуществляли 3-х кратную
изотрансплантацию 2-х фракций прекультивированных ККМ от диабетических мышейдоноров с интервалом в 7 суток. Трансплантировали мезенхимальные стромальные ККМ
(I группа) и мононуклеарную фракцию ККМ (II группа) путем внутривенного введения
клеток в хвостовую вену. Животным в III группе (диабетический контроль) вводили
физиологический раствор. Культивирование ККМ проводили для восстановления
нормального уровня функциональной (миграционной) и морфогенетической активности
используемых фракций клеток.
В течение 1-2 месяцев от начала клеточной терапии, у животных в динамике
контролировали массу тела, а так же проводили глюкозо-толерантный тест и определяли
содержание глюкозы и инсулина в сыворотке крови, взятой натощак. В
экспериментальных (I, II) и контрольной (III) группах проводили морфометрическую и
морфологическую оценку состояния островковых клеток (ОК) ПЖ, гистологические
исследования сосудов брыжейки тонкого кишечника – для оценки степени тяжести
системной микроангиопатии, а так же селезенки – для оценки тяжести иммунной
дизрегуляции.
Установлено, что используемая в опыте аутоиммунная модель СД является
адекватной моделью для изучения эффектов клеточной терапии и оценки возможности
регенерации β-клеток ПЖ под ее воздействием. Показано, что на фоне многократного
введения ККМ происходило ослабление выраженности объективных клинических
признаков СД: уменьшалась полиурия, стабилизировался уровень глюкозы и повышался
уровень инсулина в сыворотке крови. В ткани ПЖ наблюдалось увеличение количества
новообразованных ОК в области экзокринных протоков.
В докладе будут продемонстрированы результаты воздействия ККМ на
клинические и морфологические проявления аутоиммунного СД, а также обсуждены
возможные механизмы коррекции возникающих патогенетических нарушений.
Фенотипическая и функциональная характеристика стромальных
мезенхимальных клеток, предназначенных для клинического
применения.
Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф., Аврамов П.В., Зайденов В.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
В последние годы появилась возможность легитимного применения
мезенхимальных стромальных клеток (МСК) - костного мозга (КМ), в практической
комбустиологии для ускоренного закрытия ожоговых поверхностей и спасения больных с
обширными и глубокими (критическими) ожогами. Для обоснования достоинств этого
метода необходимо было сравнить их биологическую активность с ранее используемыми
фетальными фибробластами (ФФ).
Цель исследования. Использовать фенотипическую и функциональную
характеристики различных культур (ФФ - фетальные фибробласты, ФМСК прогениторные прикрепившиеся, фибробластоподобные МСК КМ -) для обоснования
биологических достоинств использования аллогенных ФМСК при лечении ожоговых ран.
Опыты были выполнены на 115 крысах-самцах породы Вистар, 4 трансгенных
мышах B 10 GFP, и 20 мышах линии С57ВL/6. Ожоговые раны (ОР) моделировали
методом термодеструкции и использовали алло- и аутогенные культуры клеток. Культуры
ФФ– получали из легкого плодов крыс на 17-21 сутки гестации по методике Д.С.
Саркисова и соавт., (1991). Культуру МСК для предифференцировки в ФМСК получали из
аспирата КМ животных, который обрабатывали по общепринятой методике, включающей
этап культивирования для удаления клеток гемопоэтического ряда. Оставшаяся
малочисленная фракция клеток, прикрепившихся к пластику, представляла собой - МСК
(2-5 МСК на 106 мононуклеаров) и использовалась для дальнейшего культивирования с
целью размножения и предифференцировки в ФМСК. Культивацию клеток осуществляли
в среде IMDM (Gibco, USA) с добавками. Замену культуральной среды осуществляли
через каждые 4 суток. Сроки культивирования МСК составляли 4-5 пассажей с
интервалами рассева культуры в 2-3 недели.
Идентификацию ФФ, прогениторных МСК и ФМСК в культуре осуществляли
методом непрямой иммунофлуоресценции, используя моноклональные антитела к
маркерам – виментину, поверхностному антигену CD133, а также по коллагену III типа
(А. Лейси, 1992).
О функциональной активности клеток судили по накоплению цитокинов (IL-10, GCSF, TGF-β) в культуральной среде методом твердофазного иммуноферментного анализа
(ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург).
Пролиферативную активность клеток в культуре использовали для оценки потенциальной
способности наращивания клеточной массы; о жизнеспособности клеток в культуре
судили по прокрашиванию клеток трипановым синим.
Для идентификации трансплантированных клеток в тканях ОР использовали метод
Wakitani (1995) и клетки от трансгенных мышей. Оценивалась скорость заживления ран
методом компьютерной планиметрии. Достоверность результатов оценивали методами
вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Применив
иммунофлуоресцентный
и
иммуногистохимический
методы
идентификации маркерных белков, мы установили, что у 100% всех прикрепившихся
клеток в культуре выявляются виментин и коллаген I типа, а белок CD133 и коллаген III
типа не выявляется в культуре ФФ. В культурах прогениторных МСК и
предифференцированных ФМСК коллаген III типа выявляется у 100% клеток; маркер
CD133 – выявлялся в культуре МСК у 20-25% клеток, а в культуре ФМСК меньше, чем у
10% клеток.
Таким образом, изучение экспрессии маркерных белков в культурах ФФ, МСК и
ФМСК подтвердило общность мезенхимального происхождения этих клеток и показало,
что культуры адгезированных клеток, получаемые нами, однонаправлены и родственны.
Использование маркера CD133 позволило, однако, выявить различную степень
зрелости (дифференцировки) клеток в различных культурах МСК. Для характеристики
увеличения выраженности дифференцировки клеток в разных культурах по экспрессии
стромальных маркерных белков их следует расположить в следующем порядке: МСК
<ФМСК < ФФ из которого следует, что МСК и ФМСК менее дифференцированы и,
следовательно, обладают большим потенциалом биорегуляторной активности.
Подтверждением этого явился более высокий темп заживления поверхностных и глубоких
ОР при использовании ФМСК, по сравнению, с ФФ. Для обоснования выбора донорского
материала исследовали жизнеспособность и функциональную активность клеток костного
мозга (ККМ) обожженных и интактных доноров, (мыши С57ВL/6).
Установлено, что первоначально количество выживающих ККМ в культуре от
ожоговых доноров, остается относительно высоким, по сравнению с интактными
донорами. Однако, если в культурах КМ интактных доноров уже с 7-8 дня
культивирования на фоне элиминации гемопоэтических клеток начинал проявляться рост
МСК, то в культурах КМ от ожоговых животных усиливалась элиминация клеток, а рост
МСК не наблюдался. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ККМ ожоговых
доноров в острой фазе стрессорного повреждения оказываются под глубоким
ингибирующем действием на пролиферацию МСК и поэтому не пригодны для получения
клеток, назначение которых индуцировать процессы регенерации ОР. Донорами МСК и
ФМСК для животных с острой ожоговой травмой должны быть только здоровые
аллогенные доноры, имеющие исходно высокий уровень функциональной
(пролиферативной) активности клеток КМ.
Для оценки биологической активности стромальных клеток, используемых для
лечения ОР, необходимо осуществлять фенотипическую идентификацию ФФ,
прогениторных МСК и ФМСК, а также оценивать их пролиферативную активность.
Идентификацию культур ФФ, а также МСК и ФМСК КМ следует проводить
морфологически, а также иммуногистохимически по белку цитоскелета – виментину,
поверхностному антигену - CD 133 и по коллагену III типа.
Для получения стабильно высокого процента живых и активно пролиферирующих
ФМСК в культуре не следует использовать клетки КМ от обожженных доноров в остром
периоде; следует применять ФМСК от здоровых взрослых доноров с 75-80% монослоем
этих клеток и с повторением их пассажа не более 4 -5 раз.
Аутологичные стромальные клетки костного мозга коррегируют
факторы регуляции морфогенеза и ускоряют регенерацию длительно не
заживающих язв желудка.
Аскаров М.Б., Трубицина И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Регенерация труднорубцующихся язв желудка по прежнему остается актуальной
проблемой современной гастроэнтерологии.
Формирование язвенного дефекта и его регенерация регулируется соотношением
двух фаз раневого процесса – воспалительно-деструктивной фазы воспаления и
пролиферативно-регенерационной фазы, активность которого в свою очередь,
регулируется состоянием иммунного гомеостаза на местном и системном уровнях.
Известно, что хроническая язва желудка сопровождается иммунодепрессией, что
связано с нарушением миграционной активности и популяционного состава
иммунорегуляторных клеток, в том числе клеток костного мозга – как центрального
органа иммуногенеза.
Целью исследования явилось использование
прекультивированных клеток
аутологичного костного мозга для активизации процессов репаративной регенерации за
счет восстановления иммунорегуляторной и интегративной функции иммунной системы.
Экспериментальные исследования проведены на 20 крысах породы Wistar.
Длительно незаживающую язву желудка моделировали по модифицированному методу
S.Okabe, включающему дополнительно индукцию иммунопатологического компонента.
Для контроля восстановления регуляторной функции иммунной системы исследовали
содержание провоспалительных (ФНО, ИЛ-1β, ИФНg) и противовоспалительных (ИЛ-4,
ИЛ-10,TGFβ) цитокинов в сыворотке крови животных и в гомогенатах слизистой
оболочки желудка (СОЖ) из края язвенного дефекта, а также в культуральной среде
ФМСК после 9 суток культивирования. Цитокины определяли иммуноферментным
методом с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (С.Петербург). Для
контроля
адекватности
регуляции
репаративной
регенерации
язв
(пролиферация/дифференцировка) исследовали содержание вторичных мессенджеров –
цАМФ, цГМФ в гомогенатах СОЖ и сыворотке крови. Для оценки степени выраженности
деструктивного язвенного процесса определяли содержание эндогенного простагландина
Е2 (ПГЕ2) в биоптатах СОЖ и в сыворотке крови иммуноферментным методом.
Животные были разделены на 2 группы: с трансплантацией культивированных
аутологичных ФМСК (1 группа) и без применения клеточной трансплантации
(контрольная группа). ФМСК применяли в виде суспензии на 30 сутки после завершения
моделирования хронической язвы желудка.
Установлено, что наиболее высокий темп регенерации язвы был у животных 1
группы. Заживление наступало на 20-30 сутки. В контрольной группе регенерация язвы
принимала затяжное течение : так как даже через 2,5 месяцев регенерация не наступала.
В культуральной среде перед трансплантацией ФМСК отмечалось преимущественное
накопление противовоспалительных цитокинов.
Исследование содержания про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке
крови животных, а также в гомогенатах СОЖ показало, что через 10 суток после
трансплантации клеток отмечался высокий уровень уровень ИЛ-1β, к 14-15 суткам
повышался уровень ИФНγ и ФНОα, а на 30 сутки на фоне выраженного регенераторного
процесса в язве становилось высоким не только содержание ИЛ-10, но и TGFβ и ИЛ-4. Во
2 группе – даже к 30 суткам уровень провоспалительных цитокинов оставались
повышенными, а противовоспалительные пониженными.
Содержание цАМФ – регулятора пролиферации в СОЖ перед клеточной терапией
было снижено и составило -176 ± 27 пмоль/г ткани. По мере усиления регенераторных
процессов происходило повышение уровня цАМФ до 485 ± 32 пмоль/г ткани на 14-17
сутки. Уровень цГМФ до трансплантации клеток равнялся 96 ± 5 пмоль/г ткани, на 20
сутки- 132 ± 6 пмоль/г ткани, на 30 сутки повышался до 156 ± 5 пмоль/г ткани, что
свидетельствовало о переключении процессов пролиферации на дифференцировку
эпителиальных клеток и начале физиологической регенерации. В контрольной группе
содержание цАМФ и цГМФ на протяжении эксперимента оставалось сниженным.
Содержание ПГЕ2 было сниженным до трансплантации клеток костного мозга
максимально до 178 ± 40 нг/г в СОЖ и сыворотке крови. После трансплантации ФМСК
наблюдалось его повышение до 314 ± 47 нг/г ткани на 25-30 сутки, что свидетельствовало
об усилении воспалительно-деструктивной фазы язвенного процесса с очищением
язвенного дефекта и готовности к запуску фазы регенерации.
Проведенные исследования показали, что ускоренный темп заживления язв в 1
группе был обусловлен устранением депрессии клеток иммунной системы за счет
предварительного культивирования ФМСК и приобретения ими более высокого
функционального состояния. Под действием противовоспалительных цитокинов ФМСК
наблюдаются существенные изменения в динамике язвенного процесса – ускоренная
смена фазы деструктивного воспаления на фазу регенерации, что обусловлено
восстановлением местных и общих
адаптационных резервов за счет устранения
цитокинового дисбаланса, и дисбаланса БАВ (ПГЕ2), и устранения дисбаланса фаз
клеточного цикла.
Переартикулярное введение аутологичных мононуклеарных клеток
костного мозга стимулирует репаративную регенерацию хряща при
моделировании остеоартроза.
Шиманский В.А., Кушнир В. А., Фролов В.И., Крашенинников М.Е.,
Баранова О.В., Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Лечение воспалительных и дистрофических заболеваний суставов попрежнему
остается актуальной проблемой.
Целью данной работы являлось получение гистологических и рентгенологических
доказательств восстановления суставного хряща при моделировании остеоартроза и
последующем периартикулярным введении мононуклеарной фракции клеток костного
мозга (МФК).
У 12 кроликов-самок породы Шиншилла массой 3кг вызывали адъювантный
артрит с последующим развитием остеоартроза. Для этого, подкожно, в основание хвоста,
вводили суспензию метилированного бычьего сывороточного альбумина (мБСА) с
полным адьювантом Фрейнда. Через две недели кроликам вторично вводили мБСА
подкожно. Через 4 недели после первой инъекции кроликам вводили в коленные суставы
мБСА в растворе глюкозы.
Для контроля развития остеоартроза использовался рентгенологический метод.
Через 1 месяц после рентгенологического подтверждения развития двухстороннего
артроза коленных суставов (незначительное сужение суставной щели, субхондральный
склероз) проводили забор костного мозга, для проведения клеточной терапии коленных
суставов справа. Левые коленные суставы служили контролем.
Из полученного костного мозга выделяли мононуклеарную фракцию клеток, и
культивировали их в течение четырех суток. Полученную суспензию аутологичных и
аллогенных МФК в дозе 2,2 и 8 млн клеток в 2мл бессывороточной среды вводили
периартикулярно, в коленные суставы справа.
Эффективность терапии МФК оценивали рентгенологически и гистологически
через 1, 3 и 5 месяцев после введения МФК, окрашивая срезы гемотоксилин-эозином, а
так же толуидином, для выявления протеогликанов.
Было установлено, что в контрольных коленных суставах к концу наблюдения
имеет место нарастающий артроз второй степени с уменьшением суставной щели,
субхондральным остеосклерозом сочленяющихся костей и заострением межмыщелковых
возвышений. В суставах с периартикулярным введением аутологичных МФК в конце
эксперимента (5 месяц) отмечалась 1 стадия развития артроза с замедлением процессов
разрушения внутрисуставной хрящевой ткани. Гистологически подтверждено, что
аутологичные МФК, в отличие от аллогенных, тормозят процесс разрушения хряща.
Гистологически отчетливые признаки торможения разрушения хряща были
отмечены при периартикулярном введении 8 млн. аутологичных прекультивированных
МФК.
У этих кроликов отмечалась выраженная гипертрофия отдельных хондроцитов,
размеры которых превышали размеры большинства клеток в 2 - 2,5 раза. В изогенных
группах клеток хрящевой ткани при окрашивании толуидиновым синим отмечалось
интенсивное сиренево-синее окрашивание перицеллюлярных отделов и области матрикса
по периферии этих групп. В контрольных суставах также отмечались признаки
регенерации суставного хряща, однако выраженность их была незначительной.
В
суставах
с
периартикулярным
введением
8
млн.
аллогенных
прекультивированных МФК обнаружены признаки остеоартроза, не отличающие
гистологически их от контрольных суставов. Отмечались явления выраженного отека и
разволокнения суставного матрикса со снижением метахромазии вследствие потери
протеогликанов, что подтверждалось, при окрашивании препаратов толуидиновым синим.
Выводы.
1. Отработана адекватная модель остеоартроза коленных суставов кролика.
2. Обнаружен доза-зависимый эффект от введения аутологичных МФК после их
прекультивироывания.
3. Периартикулярное введение аутологичных МФК оказывает системное стимулирующее
действие на репаративную регенерацию хрящевой ткани.
4.Рентгенологический и гистологический методы оценки позволяют достоверно оценить
эффективность клеточной терапии остеоартроза.
5.Гистологический метод позволил установить, что введение фракции аутологичных МФК
костного мозга достоверно замедляет разрушение хрящевой ткани суставов.
6.Введение аллогенных МФК усиливает дистрофические процессы в хряще.
Сравнительный анализ цитофенотипов, способности к
дифференцировке и иммунологические свойства клеток
мезенхимального ряда в культурах постнатальных органов и тканей
человека.
Суздальцева Ю.Г.1, Бурунова В.В.1, Вахрушев И.В.2, Чеглаков И.Б.2, Ярыгин К.Н1,2.
Российский государственный медицинский университет,
НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН, Москва.
1
2
Целью исследования являлось получение адгезивных культур фибробластов кожи
(ФК) человека, фибробластоподобных клеток пуповины (ФП) человека после нормальных
родов на 38-40 неделе гестации и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного
мозга человека, анализ экспрессии белков в полученных культурах методами
иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии, сравнение их способности
дифференцироваться в жировую, хрящевую и костную ткань, а также изучение
взаимодействия их с иммунокомпетентными клетками периферической крови.
Методами иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии проведен
сравнительный анализ экспрессии цитоплазматических (нестина, коллагена 1 и 2 типов,
фактора вон Виллибранда) и поверхностных (CD13, CD34, CD44, CD45, СD49b, CD54,
CD90, CD105, СD106, СD117) белков в культурах ФК, ФП и МСК костного мозга.
Полученные результаты показали, что культура МСК костного мозга была практически
однородной по экспрессии поверхностных белков, характерных для мультипотентных
стромальных клеток и практически не экспрессировала цитоплазматические белки
дифференцированных клеток. Культура ФП была неоднородна и cостояла по крайней
мере из двух субпопуляций клеток: 1) экспрессировавших только поверхностные белкимаркеры мультипотентных стромальных клеток, 2) коэкспрессировавших поверхностные
белки-маркеры мультипотентных стромальных клеток и цитоплазматические белки
дифференцированных клеток. ФК экспрессировали только некоторые поверхностные
белки-маркеры, характерные для мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток.
Проведен сравнительный анализ способности к дифференцировке в адипоциты,
остеобласты и хондроциты культур ФК, ФП и МСК костного мозга. Полученные
результаты показали, что МСК костного мозга обладают способностью
дифференцироваться в жировую, хрящевую и костную ткань и являются
мультипотентными стромальными клетками. ФП могут дифференцироваться в адипоциты
и хондроциты. И только незначительная часть ФП способна дифференцироваться в
остеобласты. Таким образом, мультипотентными стромальными клетками
может
считаться только часть клеток культуры ФП. Основная масса ФП обладает свойствами
бипотентных стволовых клеток. ФК могут дифференцироваться только в жировую ткань.
Изучение взаимодействия клеток полученных культур с мононуклеарными
клетками периферической крови (МПК) in vitro позволяет прогнозировать результат
взаимодействия
иммуннокомпетентных
клеток
реципиента
с
клетками,
предназначенными для трансплантации in vivo.
Уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости HLA-ABC
(МHC I класса) в культурах клеток важный показатель, который необходимо учитывать
при оценке пригодности клеток для аутологичных или аллогенных трансплантациях при
той или иной патологии и эффективности терапевтического применения препаратов из
них. Самый высокий уровень экспрессии HLA-ABC наблюдали в культуре ФК. Средний
уровень экспрессии HLA-ABC наблюдали в культуре МСК костного мозга. Культура ФП
была неоднородна. В ней встречались мелкие клетки со средним уровнем экспрессии
HLA-ABC, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на
фоновом уровне. Все клетки полученных культур не экспрессировали HLA-DR (МHC II
класса).
Изучение клеточно-опосредованной цитотоксичности при взаимодействии клеток
полученных культур и МПК проводили с использованием набора Сytotox 96 (Promega),
предназначенного для оценки функциональной активности NК-клеток. % поврежденных
клеток определяли по отношению уровня активности лактатдегидрогеназы (цитозольного
фермента, выделяющегося во время повреждения мембраны клетки-мишени и ее лизиса) в
лунках, содержащих смешанную культуру клеток-мишеней (ФК, ФП и МСК костного
мозга, а также культуры B-лимфом Raji и P3HR1 в качестве положительного контроля) с
клетками–эффекторами (МПК) к максимальному уровню активности лактатдегидрогеназы
клеток-мишеней. При максимальном соотношении МПК и клеток-мишеней 250:1 %
поврежденных клеток составил для P3HR1 – 98%, Raji – 84%, ФК – 5.1% , ФП – 5.8%,
МСК костного мозга – 1.3%. В условиях эксперимента МПК оказывали цитотоксическое
действие на клетки культуры Raji при соотношении клеток превышающем 6:1 и клетки
культуры P3HR1- 2:1 Цитотоксическое действие МПК на культуры клеток ФК, ФП и МСК
костного мозга в условиях эксперимента было незначительное и не зависило от
соотношения клеток-эффекторов и клеток-мишеней.
При кокультивировании в течение суток ФК и МСК костного мозга и МПК в
соотношении 1:50 уровень экспрессии HLA-ABC в культурах не менялся. В результате
кокультивироания МПК и ФП в культуре ФП оставались в основном клетки, не
экспресирующие HLA-ABC.
Изучение динамики изменения количества МСК и МПК при кокультивировании в
соотношении 1:50 показало, что в первые сутки кокультивирования количество
мезенхимальных клеток уменьшалось во всех полученных культурах: более всего в
культуре ФП, менее всего в культуре МСК костного мозга. К 7 дню кокультивирования
количество ФК достигало контрольного значения. Количество МСК костного мозга в
превышало контрольный, т.е. наблюдался стимулирующий эффект аллогенных МПК на
МСК. Количество ФП не достигало контрольного. Количество МПК незначительно
уменьшалось при кокультивировании со всеми видами клеток и в контроле.
Изучение изменения фракционного состава МПК при кокультивировании с ФК, ФП и
МСК костного мозга показало, что кокультивирование в течение 5-х суток не приводит к
изменению в соотношении CD4+, CD8+, CD56+, CD19+, CD14+ МПК по сравнению с
контролем.
Таким образом клетки мезенхимального ряда независимо от происхождения и
уровня экспрессии HLA-ABC обладают механизмами защиты от иммунного ответа, что
обосновывает их использование для аллогенных трансплантаций.
Внедрение производственных стандартов для клеточных материалов
мезенхимального происхождения.
Бурунова В.В., Суздальцева Ю.Г., Воронов А.В., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н.,
Ярыгин В.Н.
Российский государственный медицинский университет, Москва
В настоящее время, в РФ отсутствует нормативно-правовая база применения
клеточных материалов и единые стандарты их производства. Так, в Законах РФ «О
трансплантации органов и (или) тканей человека» (№ 4180-1 от 22.12.1992, ред. № 15-ФЗ
от 09.02.2007), «О донорстве крови и её компонентов» (№ 5142-1 от 09.06.1993,
ред. № 176-ФЗ от 24.12.2002), «Основы законодательства Российской Федерации об
охране здоровья граждан» (№ 5487-1 от 22.07.1993, ред. № 258-ФЗ от 29.12.2006), «О
лекарственных средствах» (№ 86-ФЗ от 22.06.1998, ред. № 231-ФЗ от 18.12.2006), «О
временном запрете на клонирование человека» (№ 54-ФЗ от 20.05.2002) отсутствует само
понятие клеточных технологий, что создаёт возможность бесконтрольного использования
продуктов этих технологий.
Изменение существующего нормативно-правового обеспечения использования
клеточных медицинских технологий предполагает обобщение и анализ опыта,
накопленного в этой области отечественными специалистами.
На протяжение трёх последних лет, лабораторией медицинских клеточных
технологий РГМУ внедряется система единых производственных стандартов для
клеточных материалов мезенхимального происхождения. Разработаны технологии
получения и культивирования первичных клеточных культур из постнатальных органов и
тканей человека, процедуры контроля качества и безопасности клеточных материалов,
способы их хранения и транспортировки, а также содержание пакета необходимой
документации.
Проведенная работа по стандартизации технологии производства клеточных
материалов является предпосылкой для разработки нормативной базы, регламентирующей
безопасное использование культур клеток в доклинических и клинических испытаниях.
Способность мезенхимальных клеток, выделенных из амниона человека,
дифференцироваться в нервные клетки in vitro и in vivo.
Холоденко И.В.1,2, Холоденко Р.В.1,2, Таирова Р.Т.1, Чеглаков И.Б.3, Ярыгин К.Н.1,3
Российский государственный медицинский университет,
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,
3
Институт биомедицинской химии им. В.Н. Орехович, Москва
1
2
До недавнего времени основным источником взрослых стволовых клеток являлся
костный мозг. Дифференцировочный и регенеративный потенциал мезенхимальных
клеток костного мозга изучен во многих исследованиях как in vitro, так и in vivo. Однако,
получение исходного биологического материала связано с неудобствами для пациента.
Кроме того, количество этих клеток и их «стволовость» снижается пропорционально
возрасту пациента. В связи с этим в течение нескольких последних лет многие
исследования были направлены на поиски альтернативных, более доступных источников
клеток, обладающих «стволовостью» и пригодных для регенеративной медицины. Такими
источниками являются экстра-эмбриональные органы, а именно: плацента, амниотическая
оболочка, пуповина.
Для проверки способности клеток амниона человека дифференцироваться в
различные типы нервных клеток in vitro, фибробласто-подобные клетки амниона человека
культивировали в средах двух видов. Одна среда представляла собой набор химических
реагентов (ДМСО, 2-меркаптоэтанол, KCl), так называемая «химическая»
дифференцировка. Вторая среда была дополнена целым набором нейротрофных и
ростовых факторов и гормонами (ретиноевая кислота, bFGF, EGF, NGF, NT-3, инсулин,
гидрокортизон, прогестерон), фактор-индуцируемая дифференцировка. В результате
«химической» дифференцировки клеток амниона человека в течение суток большая часть
клеток гибла. Однако оставшаяся часть клеток претерпевала существенные
морфологические изменения, а именно: появлялось множество отростков, морфология
клеток была подобна морфологии клеток астроглии. Кроме того, в этих клетках
существенно снижался уровень экспрессии нестина по сравнению с контрольными
клетками, культивируемыми в стандартных условиях. С другой стороны, эти клетки
начинали экспрессироваться на достаточно высоком уровне глиальный фибриллярный
кислый белок (GFAP), что не характерно для тех же клеток, растущих в обычных
условиях. Фактор-индуцируемая дифференцировка клеток амниона человека в течение 1
недели не привела к каким-либо существенным изменениям в морфологии клеток. Тем не
менее, как и при «химической» дифференцировке, в этих клетках заметно снижался
уровень экспрессии нестина и начинали экспрессироваться нейрональные белки, не
характерные для клеток амниона, культивируемых в стандартных условиях. Так,
несколько возрастала экспрессия GFAP, кроме того на достаточно высоком уровне
экспрессировался βІІІ-тубулин. Полученные результаты свидетельствуют о возможной
способности клеток амниона человека в определенных условиях дифференцироваться в
нейроно-подобные клетки.
Кроме экспериментов in vitro, были также проведены эксперименты in vivo с
использованием клеток амниона человека, меченых витальным красителем DIL, и крыс с
моделью ишемического инсульта. Через сутки после индукции ишемического инсульта
крысам внутривенно вводились человеческие клетки. Через 7, 14, 45 и 60 дней после
введения клеток был проведен иммуногистохимический анализ криосрезов пораженного
левого полушария головного мозга крыс. Подобный анализ позволил выявить по
флуоресценции витального красителя наличие в очаге поражения человеческих клеток
через 7 и 14 дней после введения. При этом на 7-е сутки после введения в области ишемии
наблюдалась массовая гибель клеток амниона человека, тогда как через 14 дней
обнаруженные в очаге поражения клетки имели целостную ненарушенную морфологию.
По истечении 45 дней после внутривенного введения человеческих клеток в пораженном
левом полушарии в области ишемии были обнаружены клетки слабо экспрессирующие
человеческий GFAP, а уже через 60 дней формирующие более разветвленные сети.
Иммуногистохимический анализ срезов левого полушария головного мозга крысы с
иснультом через 60 дней после введения клеток человека, также выявил наличие в области
поражения единичных клеток, экспрессирующих человеческий βІІІ-тубулин. Из
полученных результатов, можно сделать следующие выводы: во-первых, при поражении
головного мозга крысы, человеческие клетки, введенные внутривенно, способны
проникать в область поражения, преодолевая гематоэнцефалический барьер. Во-вторых,
попав в очаг ишемии, большая часть человеческих клеток гибнет, однако, клетки,
оставшиеся в области поражения по истечении полутора - двух месяцев претерпевают
изменения, возможно, связанные с их дифференцировкой, отражением чего служит
экспрессия глиального фибриллярного белка и βІІІ-тубулина.
Мультипотентные свойства клеток амниона человека in vitro
Холоденко Р.В.1,2, Холоденко И.В.1,2, Чеглаков И.Б.3, Ярыгин К.Н.1,3
Российский государственный медицинский университет,
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,
3
Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва
1
2
В данной работе были выделены и охарактеризованы клетки из амниотической
оболочки плаценты человека. Клетки, выделенные из кусочков амниона путем
ферментативного разрушения ткани и обладающие адгезивностью к пластику,
наращивали в среде DMEM-F12 с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки.
Полученные таким образом клетки имели фибробласто-подобную морфологию.
Амнион плаценты человека состоит из эпителиальных клеток и соединительной
ткани мезодермального происхождения. С целью определить иммунофенотип и
установить таким образом тип полученных клеток, был проведен фенотипический анализ
этих клеток. Было показано, что фибробласто-подобные клетки амниона человека имеют
иммунофенотип, схожий с мезенхимальными клетками костного мозга. Эти данные
позволяют заключить, что культивируемые клетки амниона человека являются
мезенхимальными клетками.
Экспрессия маркеров поверхности была изучена на разных пассажах
мезенхимальных клеток амниона. Оказалось, что значимых изменений в экспрессии
поверхностных маркеров не наблюдалось до 10 пассажа. Исключением явилась
экспрессия MHC I класса, которая монотонно возрастала от пассажа к пассажу.
Иммунофенотип
клеток
амниона
выглядит
следующим
образом:
CD54hiCD44hiCD90dimHLA-ABCloHLA-DR-CD34С целью оценить пролиферативные свойства мезенхимальных клеток амниона в
культуре и проанализировать их способность к дифференцировке, мы поставили перед
собой задачу определить уровни экспрессии таких внутриклеточных белков как нестин,
характеризующий наивное, недифференцированное состояние клеток, и Ki67, который
является маркером интенсивно делящихся клеток. Оказалось, что в популяции изучаемых
клеток содержится около 50% нестин-позитивных и 70% Ki67-позитивных клеток. Это
говорит о том, что большинство изучаемых клеток не дифференцированы и
пролиферируют.
Основным критерием “стволовости” клеток служит их способность
дифференцироваться в клетки разных зародышевых листков. С целью определить,
являются ли мезенхимальные клетки амниона человека стволовыми, мы изучили их
способность дифференцироваться в клетки мезодермального происхождения – остеоциты
и адипоциты, а также эктодермального происхождения – нервные клетки и
эндодермального происхождения – гепатоциты.
Условиями адипогенной дифференцировки являлись наличие в среде
культивирования дексаметазона, индометацина, инсулина и IBMX, а также 100%
конфлюентность клеток перед добавлением дифференцировочной среды. Через 3 недели
инкубации клеток в такой среде, с ее сменой каждые 3 дня, в клетках начали
накапливаться жировые вакуоли, количество и размер которых к концу 4 недели заметно
увеличивались.
В случае остеогенной дифференцировки среда для культивирования была
дополнена β-глицерофосфатом, дексаметазоном и фосфатом аскорбиновой кислоты.
Инкубация клеток в дифференцировочной среде в течение 4 недель привела к увеличению
экспрессии в клетках амниона маркерных белков остеоцитов – остеонектина и костного
сиалированного белка. Также была зарегистрирована активация щелочной фосфатазы,
фермента, активность которого повышена в остеоцитах.
Для дифференцировки клеток амниона человека в гепатоциты была использована
среда, содержащая ростовые факторы HGF и OSM, а также инсулин, трансферин и
дексаметазон. Через 4 недели инкубации клетки были проанализированы на экспрессию
альбумина и α-фетопротеина. Было обнаружено значительное увеличение экспрессии
альбумина в клетках, культивированных в дифференцировочной среде, по сравнению с
контрольными клетками. Однако в супернатанте клеток альбумина обнаружено не было,
что говорит об отсутствии или слабой секреции этого белка.
Для проверки способности клеток амниона человека дифференцироваться в
нервные клетки была использована среда, дополненная набором нейротрофных и
ростовых факторов и гормонами (ретиноевая кислота, bFGF, EGF, NGF, NT-3, инсулин,
гидрокортизон, прогестерон). Инкубация клеток амниона человека в течение 1 недели
привела к заметному снижению уровня экспрессии нестина и увеличению экспрессии
GFAP и βІІІ-тубулина, характерных белков нервных клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о способности клеток амниона человека в
определенных условиях дифференцироваться в клетки различного происхождения и
позволяют заключить, что полученные клетки амниотической оболочки плаценты
являются мультипотентными стволовыми клетками, а амниотическая оболочка плаценты
человека – альтернативным источником МСК.
Дифференциальный профиль поверхностных маркеров
мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов кожи человека.
Лупатов А.Ю.1,2. Каралкин П.А.1,2, Суздальцева Ю.Г.2, Бурунова В.В.2,
Ярыгин В.Н.2, Ярыгин К.Н.1,2
ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
ГОУ ВПО Российский Государственный медицинский университет Росздрава,Москва.
1
2
Необходимым условием широкого внедрения клеточных технологий в
клиническую практику является возможность стандартизации клеточных препаратов.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга либо пуповины
рассматриваются как наиболее перспективный материал для заместительной клеточной
терапии благодаря многообразию направлений дифференцировки и возможности
поддержания в культуре. Эти клетки имеют фибробластоподобную морфологию, что
делает их трудноотличимыми в культуре от фибробластов, которые так же имеют высокий
пролиферативный потенциал, но не обладают потенциалом к дифференцировке.
С использованием метода проточной цитофлюориметрии на проточном
цитофлюориметре-сортере FACSAria (Becton Dickenson Co) был проведён сравнительный
анализ экспрессии ряда поверхностных маркёров на мезенхимальных стволовых клетках
и фибробластах кожи человека. Клетки были получены из первичных культур в
Лаборатории клеточных медицинских технологий Отдела биомедицинских технологий
РГМУ. В экспериментах по цитофенотипированию использовали клетки, прошедшие не
более 10 пассажей и достигшие 50% конфлюэнтности.
Мы проанализировали 13 молекулярных маркеров, которые были условно
разделены на 4 группы в зависимости от их функциональной роли. Выявлено
существенное сходство между мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга и
пуповины в уровнях экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости,
молекул адгезии и рецепторов к некоторым факторам роста. Профиль экспрессии
поверхностных антигенов фибробластов кожи отличался от МСК более высоким уровнем
экспрессии маркеров, характерных для клеток с высоким уровнем дифференцировки. По
результатам проведенных исследований МСК из костного мозга и пуповины человека
могут быть охарактеризованы как клетки, имеющие фенотип - HLA-ABClow; CD13mod;
CD44low; CD54hi; CD91low, тогда как фибробласты кожи имеют фенотип - HLA-ABChi;
CD13hi; CD44mod; CD54neg; CD91mod.
Работа поддержана Государственным контрактом № 02.512.11.2063 Федерального
агентства по науке и инновациям.
Оптимизация репаративного остеогенеза путем трансплантации
аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на
деминерализованном костном матриксе при лечении ложных
суставов и замещении костных дефектов.
Щепкина Е.А., Кругляков П.В., Соломин Л.Н., Тихилов P.M., Полынцев Д.Г.,
Зарицкий А.Ю., Назаров В.А., Вийде СВ., Шведова Е.В.
ФГУ «РНИИТО им. Р.Р.Вредена Росздрава»; ООО «Транс-Технологии»;
ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Росздрава»
Санкт-Петербург, Россия
На основе экспериментальных исследований (Кругляков П.В. и др., 2005), в
которых было получено костеобразование в заселенном сингенными мезенхимальными
стволовыми клетками деминерализованном костном трансплантате при замещении
костных дефектов, нами разработан способ лечения ложных суставов (приоритет от
23.05.06 г., регистрационный номер 2006117605) с использованием биотрансплантата с
аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками.
Аутологичные мезенхимальные стволовые клетки (фенотип CD 34-; CD 45-; CD
44+; CD 90+; CD 105+; CD 106+), выделенные из костного мозга пациента, заселяли на
деминерализованные костные аллотрансплантаты в течение 24-72 часов с плотностью 7-10
млн на 1 см3. После резекции ложного сустава и открытой адаптации фрагментов через оба
костных фрагмента вырезали паз до 5x1,5 см, в который помещали подготовленные
трансплантаты, перекрывая зону ложного сустава. Дополнительно укладывали
трансплантаты параоссально, фиксируя их циркулярными швами. Использовали
чрескостный остеосинтез.
Способ апробирован при лечении 9 пациентов (10 сегментов) от 25 до 59 лет с
ложными суставами болынеберцовой и бедренной кости. У трех пациентов образование
ложного сустава произошло после консервативного лечения перелома, у 7 пациентов после хирургического лечения, при этом пациенты переносили от одной до четырех
операций остеосинтеза (погружного и внеочагового) на поврежденном сегменте.
Длительность заболевания от 6 месяцев до четырех лет. У трех пациентов в анамнезе
хронический остеомиелит. Лечение ложного сустава производилось при достижении
стойкой ремиссии после радикальной хирургической обработки очага остеомиелита.
Критерием для включения пациента в исследование была длительность ремиссии более 6
месяцев. Кроме этого биотрансплантат использован нами для замещения нециркулярных
посттравматических дефектов бедренной, болыпеберцовой, плечевой, пяточной костей у 8
пациентов. В послеоперационном периоде ежемесячно проводились рентгенография,
компьютерная томография, денситометрия. Для сравнения рентгено-томографической
картины обследована группа пациентов после пластики ложных суставов
деминерализованным костным транспланататом, не заселенным МСК. При замещении
дефектов интервал в исследованиях составлял 1,5-2 месяца.
При анализе данных рентгенографии и компьютерной томографии после костной
пластики ложных суставов во всех случаях без предварительной фазы резорбции
прогрессивно нарастала плотность ткани в трансплантате, сращение происходило
преимущественно через трансплантат, в котором быстрее происходило образование
компактной кости. В то же время динамика рентгенографической и томографической
картины при пластике деминерализованным трансплантатом, не заселенным МСК,
значительно отличалась: перестройка трансплантата происходила длительно, сращение
обеспечивалось преимущественно мощной периостальной мозолью, образование
компактной кости в трансплантате запаздывало по сравнению с другими участками
костной мозоли.
Сроки демонтажа аппарата внешней фиксации после костной пластики ДКТ,
заселенным аутологичными МСК, составили от 3 до 5 месяцев с полным восстановлением
опороспособности конечности, что соответствует срокам сращения переломов той же
локализации. В двух случаях вследствие вторичного смещения трансплантата сроки
фиксации продолжались до 7 месяцев. При использовании для пластики в области
ложных суставов деминерализованных костных трансплантатов, как и при костной
аутопластике сроки сращения в 1,5-2 раза превышают сроки консолидации переломов
соответствующей локализации. При пластике костных дефектов полная оссификация
трансплантата происходила к 5 месяцам после операции. У двух пациентов отмечена
частичная перестройка трансплантата в костную ткань в более поздние сроки, в одном
случае при оссификации трансплантата в области дефекта не произошло сращение
перелома.
Предварительные результаты позволяют считать перспективным дальнейшее
использование мезенхимальных стволовых клеток на деминерализованном костном
матриксе в реконструктивной хирургии. Динамика костной плотности перестраивающихся
трансплантатов позволяет предположить не только остеоиндуктивное воздействие, но и
остеокондуктивную роль при восстановлении целостности кости.
Клеточная терапия ишемического инсульта у крыс.
Зинькова Н.Н., Соколова И.Б., Кругляков П.К., Полынцев Д.Г.
ООО "Транс-Технологии", Санкт-Петербург
Клеточная терапия – перспективное направление лечения ишемического инсульта,
которое активно разрабатывается в настоящее время. В качестве агентов клеточной
терапии мы использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК).
Эксперименты проведены на крысах – самца линии Вистар – Киото. Ишемический
инсульт был смоделирован посредством окклюзии средней мозговой артерии (СМАо)
левого полушария головного мозга. МСК были выделены из костного мозга сингенных
животных и наращивались in vitro до необходимого количества (5 млн на каждое
животное). Перед внутривенной трансплантацией МСК были помечены флуоресцентным
красителем PKH26. Введение МСК проводили в день СМАо и через 3е сут. Провели
исследование восстановления когнитивной функции: в течение 6 нед тестировали
животных в водном лабиринте Морриса. Животных декапитировали через 1, 2, 3 и 5 сут и
1, 2, 4 и 6 нед после СМАо. Часть материала криофиксировали, изготавливали криосрезы
и на них определяли распределение флуоресцентно меченых МСК по мозгу. Остальной
материал фиксировали в формалине и изготавливали парафиновые срезы по стандартной
методике. Срезы окрашивали по методике Ниссля и исследовали динамику
морфологических изменений в головном мозге после СМАо. Методами
иммуногистохимического окрашивания оценивали клеточную пролиферацию в
субэпендимной зоне желудочков мозга (окраска Ki67), ангиогенез (окраска фактором фон
Виллебрандта), глиоз пограничной с повреждением зоны (окраска ГФКБ). Провели
морфометрические анализ площади повреждения головного мозга, количества сосудов и
неповрежденных нейронов в пенумбре.
Результаты проведенной работы показали, что внутривенная трансплантация МСК
примерно в 1, 7 раза повысила выживаемость животных после СМАо. Животные из
группы клеточной терапии сохраняли способность к обучению и выполняли тест в водном
лабиринте Морриса примерно в 2 раза быстрее, чем контрольная группа. Трансплантация
МСК положительно повлияла и на динамику постинсультных процессов в головном
мозге. Быстрее начинал сформироваться глиальный рубец между поврежденной и
неповрежденной тканью мозга (в группе клеточной терапии на 5 сут, а у контрольных
животных – через 1 нед). В группе клеточной терапии асептическое воспаление в месте
повреждения головного мозга полностью завершалось через 2 нед, а у контрольных
животных – через 3. Трансплантация МСК стимулировала постинсультные эндогенные
репаративные процессы. Ранее в литературе отмечалось, что СМАо у крыс приводит к
активации ангиогенеза в пенумбре и пролиферации нейрональных стволовых клеток в
субэпендимной зоне желудочков мозга. Мы показали, что в группе клеточной терапии
количество сосудов в пенумбре больше в 1, 8 раза, чем в контрольной группе. В группе
клеточной терапии мы выявили несколько слоев пролиферирующих клеток в
субэпендимной зоне желудочков, а у контрольных животных – единичные клетки.
Через 6 нед после СМАо в пограничной с повреждением зоне в группе
контрольных животных почти все нейроны погибли или имели признаки повреждения,
тогда как в группе клеточной терапии большинство нейронов были неповреждены.
Площадь тканевого дефекта в контрольной группе была в 1, 3 больше, чем у опытных
животных.
В качестве постинсультных осложнений можно рассматривать глиоз зоны,
пограничной с повреждением, и формирование ликворных кист на месте тканевого
дефекта. В контрольной группе мощный глиоз затрагивал пенумбру, неокортекс и
хвостатое ядро. В группе клеточной терапии глиоз был существенно меньше, не
деформировал ткань и локализовался в основном в пограничной с повреждением зоне. В
контрольной группе к 6 нед после СМАо у животных контрольной группы формировались
обширные ликворные кисты. У животных из группы клеточной терапии мы не выявили
единой большой кисты. Вместо нее мы наблюдали мелкие полости разной величины,
перемежающиеся с клеточными островками, состоящими из эндотелиальных клеток и
капилляров.
Следует отметить, что полученные результаты относятся в равной степени к
группам животных, которым МСК были трансплантированы в день СМАо или через 3 сут
после СМАо. Время введения МСК повлияло только на распределение клеток в головном
мозге. В первом случае МСК были выявлены в ткани мозга вдоль сосудов в обоих
полушариях. Визуально было отмечено, что в ипсилатеральном полушарии клеток
значительно больше, чем в контралатеральном. Во втором случае мы выявили единичные
меченые МСК в субэпендимной зоне желудочков. Итак, клеточная терапия с помощью
МСК восстанавливает кровоток в ткани мозга, пограничной с инсультной зоной; имеет
значительный нейропротекторный эффект; ускоряет течение постинсультных процессов
на ранних стадиях (до 3 нед) на 25 – 30%; активирует пролиферацию эндогенных
нейрональных стволовых клеток. Все эти процессы можно рассматривать как
ограниченную репарацию ткани головного мозга. В отличие от современных
нейропротекторных и ангиостимулирующих медикаментозных средств, максимальная
эффективность которых достигается при начале лечения в первые 2 сут после
ишемического приступа, клеточная терапия дает одинаковые результаты как при
немедленной, так и при отложенной до 4 сут трансплантации МСК. Планируется
продолжить исследования по эффективности применения клеточной терапии на более
поздних сроках.
«Антидиабетический» эффект фетальных миобластов человека на
модели сахарного диабета типа II у мышей DB/DB.
Стенина М.А.,Кривов Л.И.,Савчук В.И.,Воеводин Д.А.,Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т.
Российский государственный медицинский университет
НИИ акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
Предыдущий опыт работы по использованию прогениторных клеток скелетной
мускулатуры (миобластов) для лечения прогрессируюшей дистрофии скелетной
мускулатуры у mdx мышей привел нас к выводу, что используемый клеточный материал
проявляет многогранное биологическое действие. Помимо прямого эффекта в виде
частичного восстановления
экспрессии мышечного белка дистрофина, миобласты
проявляли кардиотропный эффект у мышей с редким пульсом, повышая его до нормы,а
также оказывали ревитализирующее действие на старых животных .
Целью настоящего сообщения стало описание и обсуждение “антидиабетического”
эффекта миобластов, неожиданного обнаруженного на небольшой группе db/db мышей.
Миобласты, полученные из тканей плода человека на 8-10 неделях гестации,
вводили внутримышечно в количестве 500 тыс. на мышь трем животным – взрослой
самке, взрослому самцу, молодому самцу. В последующие 84 дня периодически
производили взвешивание животных, определение глюкозы натощак. Состояние
сердечно-сосудистой системы оценивали на основании анализа ЭКГ у 33
ненаркотизированных мышей генотипа db/db и 5 животных генотипа db/+. Изменение
функции сердца на фоне клеточной терапии оценивали у трех животных. 10 мышей mdx,
получавших те же дозы миобластов с целью лечения прогрессирующей мышечной
дистрофии, составили контроль изменения веса животных в процессе клеточной терапии.
Спустя две недели после однократного введения миобластов, взрослые мыши db/db
обоего пола начинали худеть. В период между 30 и 50 днем после трансплантации вес
тела снизился до 91% от исходного уровня у самки и до 86,3 % у самца .
Повторное введение миобластов способствовало дальнейшей нормализации веса
самки. На 77 сутки животное весило 32 г при исходном весе 43г (74,4% от исходного ).
В отличие от самки вторая трансплантация миобластов не привела к дальнейшему
похуданию самца. Резкое снижение веса на 50 день было непродолжительным, в
последующем вес самца вернулся на уровень, достигнутый после первого введения
клеток. Самец, весивший исходно 49,5 г, похудел за 84 дня наблюдения на 6 г и весил 43,5
г (87,9% от исходного).
У молодого самца в течение 40 дней, предшествующих введению миобластов, был
зарегистрирован период интенсивного увеличения массы тела (от 35,5 до 40 г). Через 6
дней после начала введения клеток животное начало худеть. За 28 дней его вес снизился
до 30,5 г и составил 76% от максимального.
По данным литературы низкомолекулярное соединение с известным механизмом
действия ( DRF 2655),являющееся колигандом ядерных рецепторов PPAR и PPAR,
снижает вес db/db мышей в среднем на 19% после 30 дней перорального применения. По
сравнению с этим показателем амплитуда эффекта, достигнутого с помощью миобластов у
самки и молодого самца, была существенно выше (25% и 24% ) и не достигла этого
уровня у взрослого самца (12%).
Специфичность снижающего вес эффекта миобластов для тучных мышейдиабетиков мы оценили, сравнивая динамику зменения их веса с динамикой у mdx
мышей. В течение 50 дней после первого введения клеток и 44 дней после повторного
введения монотонного падения массы тела в последней группе не зарегистрировано.
У самки на фоне введения миобластов уровень глюкозы снизился до нормы.
Начиная с 30 суток после трансплантации и до 56 дня, концентрация глюкозы не
превышала 10 мМоль/л, снизилась еще больше после второго введения миобластов и
сохранялась на уровне 6,380,5 мМоль/л до конца эксперимента.
Концентрация глюкозы у взрослого самца снизилась не более чем в два раза (до
15 мМоль/л) и не поднималась в дальнейшем до исходного уровня. Однако на протяжении
периода наблюдения животному были свойственны значительные колебания содержания
глюкозы в крови.
У самки начало гипогликемизирующего эффекта совпало по времени с началом
снижения веса тела, а у самца снижение концентрации глюкозы несколько
предшествовало снижению веса.
У молодого самца период увеличения массы тела сопровождался нарастанием
глюкозы в крови. После введения миобластов концентрация глюкозы стала снижаться,
однако, за относительно короткий период наблюдения нормализации содержания глюкозы
не произошло.
Наряду со снижением веса и глюкозы миобластотерапия оказывала влияние на
физическое состояние мышей. У животных повысилась локомоторная активность,
восстановился исследовательский рефлекс “что есть что?”, появилась способность
реагировать на внешние раздражители.
У мышей db/db контрактильная дисфункция, по данным других авторов на
перфузируемом сердце, проявляется снижением аортального и коронарного кровотока,
сердечного выброса, а также снижением частоты сердечных сокращений. По нашим
данным бодрствующим мышам генотипа db/db , в отличие от мышей генотипа db/+,была
свойственна брадикардия (300-360 и 600-650 ударов/мин соответственно). При данных
дозах и данной схеме введения миобластов нормализации частоты сердечных
сокращений мы не наблюдали.
Мыши db/db несут мутацию в гене рецептора для лептина - нейрогормона
регулирующего жировой обмен. Фенотипические проявления мутации в виде ожирения,
выраженных метаболических сдвигов (гипергликемии, гиперинсулинемии, высокого
уровня свободных жирных кислот) сочетаются с признаками нарушения сократительной
функции миокарда. Все это делает db/db мышей привлекательной экспериментальной
моделью при решении проблемы лечения сахарного диабета II типа и диабетической
кардиомиопатии на основе новых клеточных технологий.
Клеточная терапия сахарного диабета развивается в настоящее время в двух
основных направлениях: а) получения продуцирующего инсулин клеточного материала in
vitro при направленной дифференцировке стволовых клеток в панкреатические островки и
-клетки; б) стимуляции регенерации островков in situ путем репопуляции
поджелудочной железы экзогенными стволовыми/прогениторными клетками. И в том, и в
другом случаях вопрос об источнике стволовых клеток (эмбриональные стволовые
клетки?,клетки костного мозга?, эпителий протоков поджелудочной железы?,
гепатоциты?) остается открытым. Мы показали закономерное, отсроченное от момента
начала терапии миобластами снижение веса тела и уровня глюкозы у мышей диабетиков.
Отсюда вытекает целесообразность дальнейшего исследования мышечной ткани как
потенциального источника клеточного материала для репарации поджелудочной железы.
Возможна и другая интерпретация полученных данных. “Антидиабетическое”
действие миобластов при сахарном диабете не является прямым следствием
дифференцировки экзогенных или стимуляции дифференцировки эндогенных
предшественников в клетки-продуценты инсулина. Полученные данные подтверждают
высказанный тезис о потенциальной многогранности биологического и терапевтического
эффектов фетальных миобластов и наводят на мысль о том, что. акцент клеточной
терапии сахарного диабета может быть перенесен с задачи компенсации абсолютного или
относительного дефицита инсулина на другие моменты патогенеза этого тяжелого
заболевания.
Мониторинг динамики изменения содержания стволовых клеток в
периферической крови больных инфарктом миокарда
Смолянинов А.Б.1, Арьев А.Л.2, Кириллов Д.А.1, Кованько Г.Н.2
Центр клеточной и генной терапии, Покровский банк стволовых клеток.
Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования.
1
2
Основные возможные механизмы клеточной регенерации при инфаркте миокарда
(ИМ) включают мобилизацию в очаг повреждения циркулирующих стволовых клеток,
локальную пролиферацию клеток-предшественников в ответ на повреждение и
пролиферацию кардиомиоцитов в ответ на повреждение. Ишемическое повреждение
приводит к выбросу из очага повреждения таких цитокинов, как сосудистый
эндотелиальный фактор роста-2 (VEGF-2), фактор стромальных клеток-1 (SDF-1),
инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор стволовых клеток (SCF) и другие. Эти
цитокины, воздействуя на свои рецепторы (VEGFR-2, CXCL12, IGF-1-R и c-kit (CD-117)
соответственно), обеспечивают выброс стволовых клеток (СК) из костного мозга и их
привлечение в очаг повреждения. Мобилизованные таким образом СК способны к
дифференцировке в кардиомиоциты и принимают участие в регенерации миокарда, в том
числе, возможно, за счет неоваскуляризации и паракринного воздействия на
регенеративные процессы.
Цель исследования: данной работы было изучение содержания СК в
периферической крови у больных ИМ для определения прогностической ценности этого
показателя.
Динамику изменения количества СК крови оценивали по данным проточной
цитометрии на проточном цитометре FACScan фирмы «Becton Dickinson» с
использованием тройной комбинации прямых моноклоальных антител CD34FITC/CD38
PE/CD45 PerCP. Проводилось определение содержания в крови клеток с
иммунофенотипом «CD45+CD34+CD38+» и «CD45+CD34+CD38-». Средний возраст
пациентов составил 681,4 лет. Уровень СК исследовали у 30 больных ИМ в 1, 9 и 15
сутки от дебюта заболевания на фоне стандартной терапии. У 14 пациентов группы
исследования был установлен диагноз Q-ИМ, а у 16 - не-Q-ИМ. Диагноз был
подтвержден изменениями ЭКГ и выявлением биохимических маркеров некроза
миокарда.
При мониторинге СК в периферической крови у больных с Q-ИМ их количество
составило в 1 сутки наблюдения «CD34+CD38+»-0,070,02%, «CD34+CD38-»-0%. У
пациентов с не-Q-ИМ в 1 день заболевания уровень СК в периферической крови составил
«CD34+CD38+»-0,150,02%, «CD34+CD38-»-0,020,001%. На 9 сутки у больных Q-ИМ
уровень стволовых клеток составил «CD34+CD38+»-0,130,01%, «CD34+CD38-»0,100,001%. У больных не-Q-ИМ на 9 день этот уровень составил соответственно
0,050,02% и 0,210,001%. Уровень СК периферической крови на 15 сутки терапии Q-ИМ
составил «CD34+CD38+»-0,180,01%, «CD34+CD38-»-0,120,001% (p<0,01). У больных
не-Q-ИМ после стандартной терапии через 15 дней уровень СК составил «CD34+CD38+»0,290,018%, «CD34+CD38-»-0,210,011% (p<0,05).
Таким образом, у больных ИМ в периферической крови в течение первых суток
заболевания отмечено отсутствие СК при Q-ИМ и незначительное количество СК при неQ-ИМ. Вероятно, отсутствие СК при Q-ИМ говорит о том, что большая зона повреждения
в миокарде поглощает полностью весь пул СК вышедший из костного мозга в
периферическую кровь. На фоне стандартной терапии уровень СК «CD34+CD38-»
увеличивался уже к 9 суткам ИМ и оставался повышенным до 15 суток. Выброс СК в
периферическую кровь был больше при не-Q-ИМ. Содержание СК в периферической
крови у больных ИМ является важным прогностическим признаком течения заболевания,
коррелирующим с его клинической картиной и течением. Дополнительные исследования
требуются, чтобы определить связь уровня СК в периферической крови на фоне ИМ с
эхокардиографическими показателями сократимости миокарда в исходе заболевания.
Трансплантация аутологичных костно-мозговых клеток в лечении
больных циррозом печени.
Козлов В.А., Старостина Н.М., Пальцев А.И., Останин А.А., Леплина О.Ю.,
Шевела Е.Я., Лисуков И.А., Черных Е.Р.
ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
В настоящее время единственным радикальным методом лечения терминальных
стадий хронических диффузных заболеваний печени, в частности цирроза печени (ЦП)
является ортостатическая трансплантация печени. Однако дефицит донорских органов,
необходимость иммуносупрессии и высокая стоимость ограничивают возможности
данного метода. Исследования в области биологии стволовой клетки открывают новые
перспективы.
Так,
возможность
костномозговых
стволовых
клеток
(СК)
дифференцироваться в гепатоциты позволяет рассматривать использования СК в качестве
регенеративной терапии при заболеваниях печени. Настоящее исследование посвящено
изучению переносимости и эффективности трансплантации костномозговых клеток в
комплексном лечении цирроза печени.
В исследование были включены 47 пациентов в возрасте от 15 до 65 лет с
диагнозом ЦП. В соответствии с классификацией Child-Pugh у 12 пациентов
диагностировался ЦП класса А, у 28 – класса В и 7 – класса С. Костный мозг забирали
стандартно из крыла подвздошной кости под общей анестезией. Мононуклеарные клетки
(МНК) выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Клетки
вводили внутривенно и внутрипеченочно в средней дозе 1,76 ± 0,12 х 107 МНК,
содержащих 5,8 ± 0,7 % CD34-позитивных клеток.
Введение костно-мозговых клеток не сопровождалась развитием побочных
эффектов. Аутологичная трансплантация клеток костного мозга (АТКМ) у больных с
классом А приводила к купированию астенического синдрома и синдрома цитолиза
(снижению АСТ и АЛТ), увеличению уровня сывороточного альбумина и количества
тромбоцитов. Кроме того, ультразвуковое исследование выявило ослабление признаков
портальной гипертензии (уменьшение размеров селезенки и диаметра воротной вены). В
группе с декомпенсированным циррозом (класс В и С) введение костно-мозговых клеток у
18 из 35 сопровождалось снижением суммы баллов тяжести ЦП (по шкале Child-Pugh)
через 1, 6 и 12 мес после начала терапии. АТКМ в этой группе также ассоциировалась со
снижением АЛТ и увеличением числа тромбоцитов через 1 и 6 мес наблюдения.
Терапия аутологичными костномозговыми клетками является безопасной
процедурой и может рассматриваться как новый подход к лечению больных циррозом
печени.
Остеоиндукция артифициального костного блока при межтеловом
спондилодезе у собак посредством аутотрансплантации
иммобилизованных клеточных фракций стромы костного мозга.
Сизиков М.Ю., Останин А.А., Хейфец М.В.
ФГУ НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
ФГУ НИИ Травматологии и Ортопедии Росздрава, г. Новосибирск
ФГУ 333 Военный госпиталь МО РФ, г. Новосибирск
В проведенном исследовании было проведено сравнительное изучение эффектов
аутотрансплантации выделенных из костного мозга клеточных фракций –
мононуклеарных клеток, стромальных клеток и стромальных стволовых клеток - на
формирование переднего костного блока при межтеловом спондилодезе у взрослых
беспородных разнополых собак.
Мы разработали собственный оригинальный способ создания локальной
иммобилизованной популяции аутологичных стромальных стволовых клеток костного
мозга (ССК КМ) в зоне костного дефекта на твердофазовом пористом носителе (Патент
№2269961 от 20.02.2006 г. «Способ аутотрансплантации иммобилизованных ССК КМ»,
Приоритетная справка
№2006106040 от 26.02.2006 г. «Способ иммобилизации
остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга»).
Целью проведенного исследования являлась разработка способа заместительной
клеточной терапии локальных расстройств репаративного остеогенеза.
Главной задачей исследования стала сравнительная оценка способности
аутологичных иммобилизованных стромальных и стромальных стволовых клеток
костного мозга обеспечивать оптимальную эффективную репарацию с формированием
полноценного костного блока в зоне межтелового дефекта двигательного сегмента
позвоночника после тотального удаления межпозвонкового диска.
В проведенном исследовании было использовано двадцать четыре взрослых
беспородных разнополых собаки. Животные были сертифицированы и аккредитованы
Управлением ветеринарии по Новосибирской области РФ. Всем животным были
выполнены:
- пункция гребня крыла правой подвздошной кости с аспирацией 10 мл костного
мозга,
- тотальная дискэктомия с резекцией смежных замыкательных пластинок на уровне
тел седьмого и восьмого поясничных позвонков и замещение межтелового дефекта
пористым металлическим имплантатом из никелида титана.
Все животные случайным образом были разделены на 4 группы по шесть в каждой.
В первой группе межтеловой дефект заполнялся безклеточным имплантатом, во второй
группе сквозные поры имплантата заполнялись фракцией мононуклеарных клеток
костного мозга, в третьей – фракцией прилипающих к поверхности пластика клеток
стромы костного мозга, в четвертой – фракцией выращенных в культуре остеогенно
индуцированных стромальных стволовых клеток. Каждая группа по срокам
гистологического исследования (один, три и шесть месяцев) подразделялась на три
подгруппы по два животных в каждой.
Каждый аспират костного мозга центрифугировали для получения гомогенной
взвеси костномозговых мононуклеарных клеток. Для получения обогащенной популяции
стромальных клеток выделенные мононуклеарные клетки инкубировали в пластиковых
флаконах с отделением клеток от пластиковой поверхности посредством трипсинизации.
С целью количественной экспансии и остеогенной предифференцировки стромальных
стволовых клеток полученная фракция прилипающих к пластику костномозговых клеток
дополнительно культивировалась в среде DMEM, дополненной остеогенными
индукторами, в течение 21 суток.
За сутки до имплантации поверхность пористой структуры имплантата покрывали
морфогенной средой. Для этого цилиндрическую заготовку инкубировали в растворе
коллагена и в среде DMEM, содержащей раствор желатиноля и остеогенный индуктор –
β-глицерофосфат. Объем сквозной пористой структуры имплантата равномерно
заполнялся клеточным материалом посредством активной диффузии суспензии за счет
выраженного капиллярного эффекта. Фиксацию клеток на поверхности проводили в СО2инкубаторе.
Затем
аутобиотрансплантант
ex
tempore
использовали
для
заполнениякостного дефекта при проведении межтелового спондилодеза.
Оценка результатов исследования проведена с использованием клинических
критериев,рентгенографии, макро- и микроскопического гистологического исследования.
В результате проведенного исследования в первой группе животных
(контрольной) выявлены отчетливые признаки замедленного формирования переднего
костного блока, образование гипертрофического межтелового псевдоартроза.
Во второй группе животных
на поздних сроках исследования достигнут
формирующийся артифициальный костный блок с паравертебральным гиперостозом.
Костеобразование шло по типу вторичного остеогенеза с формированием избытка
хрящевой ткани.
В третьей и четвертой группах к шестому месяцу исследования формируется
полноценный артифициальный костный блок. Достоверных различий в сроках и
морфологических параметрах формирования костного блока между этими двумя
группами не выявлено. Выявлены признаки первичного остеогенеза с полноценной
остеорепарацией.
Результаты проведенного исследования продемонстрировали отчетливый
остеоиндуктивный эффект в виде улучшения репаративного остеогенеза посредством
аутотрансплантации иммобилизованных прилипающих к пластику стромальных и
стромальных стволовых клеток костного мозга.
Выводы.
1. Применение аутотрансплантации иммобилизованных стромальных и
стромальных стволовых клеток костного мозга восстанавливает и ускоряет репаративный
остеогенез в зоне послеоперационного костного дефекта между телами поясничных
позвонков у собак.
2. Предложенный способ коррекции расстройств остеорепарации можно
рассматривать в качестве альтернативы костнопластическим операциям с пересадкой
массивных костных трансплантатов.
3. Выращенные в культуре стромальные стволовые клетки целесообразно
использовать условиях системных расстройств остеопоэтической функции с исходным
критическим дефицитом эндогенных предшественников костных клеток.
Репаративная регенерация кожи при трансплантации аутологичных
мультипотентных стромальных клеток костного мозга и волосяных
фолликулов в ацеллюлярной аллогенной дерме на реципиентную
поверхность в условиях жидкой среды.
Ковалев А.В., Васильев В.В., Иванищук П.П.
ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию», Иваново
Формирование неполноценных регенератов кожи - рубцов, лишенных
специфических кожных дериватов – волос и желез, имеющие атипичное строение дермы,
содержащей плотные, продольно расположенные волокна вместо разнообразной
структуры, образующейся в результате сложного переплетения волокон, на месте
полнослойных травматических дефектов, - причина актуальности поиска методов,
направленных на повышение полноты репаративной регенерации кожного покрова и
улучшение функциональных и косметических результатов лечения ран. В настоящее
время существуют подходы с использованием аллогенной ацеллюлярной дермы, и
биоискусственной кожи, созданной методами тканевой инженерии, прежде всего для
воссоздания дермы. Их применение требует тщательной подготовки реципиентной
поверхности, при этом важно обеспечить защиту восстанавливаемого участка кожи от
высыхания, инфицирования и механических повреждений, а так же создать над раневой
поверхностью среду, благоприятную для заживления ран. В предыдущих исследованиях
нами обнаружено повышение регенерационной способности кожи млекопитающих в
условиях жидкой среды. Применялись специальные камеры-изоляторы, заполненные
стерильными изотоническими водными растворами, куда погружалась травмированная
часть тела до полной эпителизации. Так же нами показана возможность применения
внутри изоляторов водной среды, по составу близкой к питательной, применяемой при
культивировании клеток. В среду добавляется комплекс антибиотиков, проводится
периодическая фильтрация и смена раствора, промывание антисептиками. Это позволяет
обеспечить пролиферацию клеток, отдаленных трехмерной биополимерной матрицей от
раневой поверхности. Известно, что трансплантированные аутологичные мезенхимальные
стволовые клетки костного мозга стимулируют заживление ран. А применение
микрографтов волосяных фолликулов как источников регенерации целесообразно,
учитывая наличие двух популяций стволовых клеток (в дермальном сосочке нижней части
фолликула, и в области утолщения волосяного фолликула), активно участвующих в
репарации повреждений кожи.
Цель исследования – изучить особенности репаративной регенерации кожи по
каркасу из
аллогенной ацеллюлярной дермы при внедрении в последнюю
культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга
(ММСК) и волосяных графтов.
30 лабораторным крысам массой 150 гр. наносились полнослойные раны 1.5Х2,0
см на боковой поверхности тела. Сразу на раневую поверхность заякоревалась аллогенная
ацеллюлярная дерма. Микроинъекциями в толщу аллогенной дермы вносились заранее
выделенные и культивированные ММСК костного мозга, в количестве 1х106 в виде
суспензии на 0,6 мл плазмалита-148. Подобно трансплантации волос, в аллодерму
пересаживались 30 волосяных фолликулов, выделенных из иссеченного лоскута кожи.
Рана покрывалась камерой-изолятором, постоянно заполненной средой DMEM c 5%
предварительно заготовленной аутологичной сывороткой. В контроле 1 (8 животных),
камера не заполнялась водной средой, в контроле 2 (8 животных) пересаживалась только
аллогенная дерма. Область регенерации подвергалась исследованиям с применением
световой и сканирующей электронной микроскопии на 5, 12 и 60 сутки.
У лабораторных крыс в контроле 1 сохранить аллогенную дерму без жидкой среды
не удалось. В контроле 2, дерма заполнялась воспалительным инфильтратом, и вживление
дермы не происходило. В опытной группе пересаженные фолликулы на 5 сут
формировали на поверхности аллодермы сливающиеся островки эпителизации,
представленные распластанными эпителиоцитами. На 12 сут аллодерма была полностью
покрыта ороговевающим эпидермисом. В условиях водной среды наблюдалось быстрое
вживление трансплантированного комплекса с формированием на 60 сут
органотипического регенерата, имеющего выраженные дермальные сосочки, кожные
дериваты и волокнистый остов, свойственный нормальной дерме. Обращает внимание
слабо выраженный фиброз регенерата и развитое микроциркуляторное русло,
сохраняемое к концу наблюдения. Графты волосяных фолликулов могут быть в
перспективе заменены тканевыми конструкциями – биоискусственными фолликулами, в
настоящее время активно исследуется проблема фолликулярного неогенезиса, в том числе
и в тканевой инженерии. Трансплантированные ММСК и фолликулярные графты
выступают в роли источников и инициаторов посттравматической регенерации кожи,
подтверждая известные данные о стимуляции миграции прогениторными клетками в
рану "клеток воспаления" и "клеток заживления", секретирующих IL-6, IL-8 и G-CSF,
инициирующих процесс регенерации. С другой стороны также подтверждено, что раневое
микроокружение способствует пролиферации клеток костного мозга и их
дифференцировке в фибробласты, синтезирующие белки экстрацеллюлярного матрикса.
В данном исследовании продемонстрирована возможность создания в особых
условиях жидкой среды методами восстановительной хирургии и клеточных технологий,
непосредственно на раневой поверхности, органотипического регенерата кожи с
волосяным покровом.
Клеточные технологии в вертебрологии.
Волков А.В.1,3, Гольдштейн Д.В.1, Коновалов Н.А.2, Зеленков П.В.2, Арутюнян
И.В.1, Назаренко А.Г.2, Арутюнов Н.В.2, Ржанинова A.A.1, Шевелев И.Н.2,
Коновалов А.Н.2, Фатхудинов T.Х.1,3
ЗАО «РеМеТекс»,
ГУ НИИ нейрохирургии им. академика. Н.Н.Бурденко РАМН,
3
ГУ НИИ морфологии человека РАМН, Москва.
1
2
Клеточные технологии являются перспективным направлением в лечении
дегенеративных заболеваний позвоночника, призванным восстановить нормальную
анатомию и функцию межпозвонкового диска. Разрабатываемый нами метод заключается
в культивировании аутогенных хондробластов, полученных в ходе операции по удалению
грыжи межпозвонкового диска, с последующим ведением в пораженный диск
тканеинженерной конструкции на основе полученной клеточной культуры. Первым
этапом нами была разработана репрезентативная и воспроизводимая экспериментальная
животная модель. Дегенерация межпозвонковых дисков у крыс достигалась путём
угловой компрессии межпозвонковых дисков хвоста при его сгибании и фиксации в
изогнутом положении.
Было выявлено прогрессирующее снижение высоты дисков в зоне повышенного
давления, дегенерация пульпозного ядра и фиброзного кольца. В дисках было также
выявлено снижение количества аггрекана, повышение активности аггреканазы появление
денатурированного коллагена II типа, нарушение соотношения коллагеновых белков.
После трансплантации тканеинженерной конструкции на всех сроках были выявлены
BrdU+ клетки, а так же заполнение полости удаленного ядра гиалиновым хрящом через 90
дней. Заключение: Представленная модель позволила смоделировать изменения в
межпозвонковых дисках, сходные с изменениями, наблюдаемыми при дегенеративных
заболеваниях позвоночника у человека.
Трансплантация тканеинженерной конструкции показала возможность заполнения
полости после удаления пульпозного ядра гиалиновым хрящом. Данная модель будет
использована авторами в разработке клеточных методик лечения дегенеративных
заболеваний позвоночника.
На основании данного исследования показана экспериментальная эффективность
технологии трансплантации аутогенных хондробластов в межпозвонковый диск. В рамках
первой фазы клинических исследований у шести пациентов получена устойчивая культура
аутогенных хондробластов. Цитогенетическое исследование показало отсутствие
хромосомных аномалий в культуре хондробластов после выделения и культивирования на
втором пассаже.
Таким образом, показана возможность использования тканеинженрной
конструкции, содержащей аутогенные хондробласты для первой фазы клинического
исследования.
Клиническое исследование трансплантации аллогенных
мультипотентных стромальных клеток в лечении дилатационной
кардиомиопатии.
Кириллов А.М.1, Гольдштейн Д.В.3, Дьячков А.В.1, Фатхудинов Т.Х.3, Коротеев
А.В.1, Бочков Н.П.2
ГУ Российский научный центр хирургии имени академика Б.В.Петровского,
ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития
РФ,
3
ЗАО «РеМеТекс», Москва.
1
2
В последнее время для лечения дилатационной кардиомиопатия (ДКМП)
применяются трансплантации стволовых клеток, что приводит к повышению
сократительной способности инвалидизированного миокарда и улучшению клинического
состояния больных. Наиболее часто в этих целях используют трансплантации
аутологичных стволовых клеток, полученных путем культивирования из жидкой фракции
красного костного мозга. Однако согласно современным представлениям, ДКМП
ассоциировано с целым рядом генетических мутаций, поэтому аутологичные стволовые
клетки могут нести в себе все эти мутации. Исходя из этого, представляется
обоснованным использовать в качестве трансплантата при лечении ДКМП аллогенный
клеточный материал.
Изучили
безопасность
и
эффективность
трансплантации
аллогенных
мезенхимальных стромальных клеток (МСК) у больных с сердечной недостаточностью,
обусловленной ДКМП.
Безопасность оценивали по отсутствию или наличию жизнеугрожающих
осложнений, которые могли быть обусловлены трансплантацией МСК: аритмий и
нарушений проводимости, ишемии миокарда; пирогенных и других иммунологических
реакций, отрицательной динамике клинического состояния.
В качестве критериев клинической эффективности ориентировались на динамику
клинического и функционального состояния пациента (6-ти минутный тест, клинические
симптомы сердечной недостаточности), эхокардиографических показателей насосной
функции сердца, уровня мозгового натрий-уретического пептида (BNP) в плазме крови.
Оценку выбранных критериев проводили в исходе, а также через 6 недель; 3 и 6
месяцев.
В исследование были включены 15 пациентов с ДКМП. Все больные были
мужского пола, в возрасте 47,3± 13,1 лет (от 22 до 68 лет). Клиническое состояние
пациентов соответствовало NYHA 3,3 ± 0,8, причем 47% включенных в исследование
имели IV ФК по NYHA. У всех пациентов имелась выраженная дилатация полостей
сердца: КДР 7,7 ± 1,1 см, КДО 252,9 ± 80,78 мл. Фракция выброса левого желудочка
составила 24,3 ± 8,2%. Уровень концентрации мозгового натрий-уретического пептида в
исходе составил 1200  120 пг/мл.
Клеточные трансплантаты представляли собой суспензию 1000 млн.
мультипотентных стромальных клеток в 10% растворе полигидроксиэтилкрахмала (ГЭК)
и были подготовлены в условиях GMP-лаборатории стволовой клетки ЗАО «Реметэкс».
Культура МСК была получена по стандартному протоколу из донорского костного мозга.
С помощью проточного цитофлюориметра по специфическим позитивным (CD44, CD90,
CD105) и негативным (CD34, CD45) маркерам был охарактеризован иммунофенотип
полученных культур. Относительное количество несущих позитивные маркеры клеток в
культурах составляло не менее 80-90% в соответствии с Паспортом клеточной культуры.
Функциональная активность культуры МСК оценивали по способности к направленной
дифференцировке в мезодермальные линии (миогенез, хондрогенез, остеогенез,
адипогенез) в стандартных средах. За несколько часов до трансплантации клетки снимали
с пластика чашек Петри, тщательно отмывая путем многократного центрифугирования от
компонентов культуральной среды. Затем клетки ресуспендировали в 10 мл 10% раствора
ГЭК и транспортировали при +4 С в операционную.
Аллогенные МСК вводились реципиентам интракоронарно в условиях
ангиографической лаборатории. Скорость введения составляла 100мл/час. Во время
введения мониторировалось 12 отведений ЭКГ. После введения клеточной суспензии в
каждую коронарную артерию проводили ангиографический контроль состояния
коронарного русла.
Случаев нарушения сердечного ритма и других осложнений, связанных с
трансплантацией аллогенных МСК, зафиксировано не было.
Клинический эффект от трансплантации аллогенных МСК проявлялся в купировании
признаков декомпенсации кровообращения, позитивном изменении функционального
класса (с 3,3  0,8 до 2,07  1,1), снижении концентрации мозгового натрий-уретического
пептида с 1200  120 до 600  110 пг/мл (р<0,05).
Динамики показателя фракции изгнания левого желудочка не обнаружено.
Клинический эффект наступал в течение первой недели после трансплантации и
сохранялся на протяжении 3 - 6 месяцев. В среднем функциональное состояние
улучшается на 1,2 ФК по NYHA, однако в исследовании встречаются наблюдения, когда
регресс сердечной недостаточности достигал 2-х ФК и пациенты переходили в 1-ый ФК.
Интракоронарная трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных
клеток не вызывает нарушений ритма и других осложнений и может считаться
безопасной для клинического применения.
Трансплантации аллогенных мультипотентных стромальных клеток обеспечивает
улучшение клинического и функционального состояния больных с сердечной
недостаточностью на фоне ДКМП, однако этот эффект является временным и сохраняется
от 3-х до 6-ти месяцев.
Применение стволовых клеток в психиатрии и неврологии.
Галанин И.В., Скоромец Т.А., Бухарцев Н.Н., Второв А.В., Кругляков П.В.,
Полынцев Д.Г.
Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический
институт им. В.М.Бехтерева.
Последние годы клеточная терапия применяется в различных областях медицины,
в том числе и при заболеваниях ЦНС. Считается доказанным, что пересаженные клетки
живут, встраиваются в нейрональные сети и в конечном счёте, оказывают положительное
клиническое воздействие. Этот метод уже получил достаточно широкое клиническое
применение при некоторых нейродегенеративных заболеваниях, в лечении некурабельных
форм эпилепсии, последствий инсультов и ЧМТ. Характерно, что основное внимание, при
описании эффектов нейротрансплантации, уделяется динамике неврологических
симптомов, практически «не замечая» изменений различных психических функций. В
тоже время известно, что даже незначительные изменения нейрохимических
взаимодействий мозга и тем более любые нейроморфологические изменения, влекут за
собой изменения (чаще патологические) тех или иных психических функций.
Влияние альфа-фетопротеина (АФП) на биологическую активность
различных фракций гемопоэтических стволовых клеток костного мозга
(ГСК) мышей, культивируемых ex vivo.
Беляев Н.Н., Богданов А.Ю., Рыбакова Т.М., Тлеулиева Р.Т.
Институт молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина ЦБИ КН МОН РК,
г.Алматы, Казахстан
Проведенные нами ранее обширные исследования показали, что ГСК и ранние
миелоидные предшественники (РМП), несущие маркер CD34, выделенные из костного
мозга мышей, обладают ярко выраженной натуральной иммуносупрессией, в том числе
угнетают цитолитическую активность NK-клеток и Т-киллеров, тормозят рост
лимфоидных клеток и переключают Т-хелперы в сторону образования Th2-типа. С
помощью изопикнического центрифугирования нам удалось выделить три фракции,
обогащенные (до 73,5%) CD34+ клетками со следующими фенотипами: фракция 1 CD34+, CD117+, CD3-, CD19-, CD11b-, CD123-, CD135-, CD133-, CD10-, CD33-, IL7R-,
TER119-; фракция 2 - CD34+, CD117-, CD3-, CD19-, CD11b-, CD123+, CD135+, CD133+
(частично), CD10-, CD33+, IL7R-, TER119-; фракция 3 - CD34+, CD117+, CD3-, CD19-,
CD11b-, CD123-, CD135-, CD133-, CD10-, CD33-, IL7R-, TER119-. Мы установили, что
иммуносупрессорная активность субпопуляций ГСК/РМП опосредовалась супрессорными
цитокинами, главным из которых оказался TGFβ, и зависела от воздействия индукторов,
таких как IL-2, IFNγ, гистамин, IL-3, GM-CSF и АФП. Последний представляет особый
интерес в связи с его известными функциями регулировать рост эмбриональных
стволовых клеток.
Целью настоящего исследования была оценка влияния АФП на пролиферативную,
метаболическую, белоксинтезирующую и супрессорную активности различных фракций
ГСК/РМП костного мозга мышей, а также секрецию TGFβ в условиях культивирования ex
vivo.
Опыты проводили на мышах линии СВА. Клетки костного мозга разделяли на
сложном градиенте плотности перкола по ранее разработанной нами методике. Фракция 1
(фр.1) соответствовала плавучей плотности 1,08 г/мл, фр.2 - 1,09 г/мл, фр.3 - 1,095 г/мл.
2×106 кл/мл каждой фракции культивировали в среде Stemline II, содержащей 10%
фетальной сыворотки быка, в присутствии АФП (1-100 мкг/мл) в течение 3 ч. Затем
клетки отмывали и культивировали в культуральных планшетах в концентрации 2×105
кл/лун при стандартных культуральных условиях в течение 48 ч. Индекс спонтанной или
АФП-индуцированной пролиферации всех трех изучаемых фракций анализировали при
помощи иммуноферментного анализа ДНК делящихся клеток, включивших
бромдиоксиуридин, используя коммерческий набор реактивов BrdU Labeling and Detection
Kit III. О метаболической активности судили по активности цитоплазматических
дегидрогеназ в МТТ-тесте. Белоксинтезирующую активность оценивали по включению
3Н-лейцина в клеточный белок. Продукцию TGFβ оценивали в иммуноферментном
анализе, используя коммерческую тест-систему. Супрессорную активность фракций
оценивали по продукции ими факторов, угнетающих метаболическую и пролиферативную
активность клеток быстроделящейся линии мышиной миеломы PAI, определяемую в
МТТ-тесте.
В результате было установлено, что АФП при воздействии на каждую из трех
фракций ГСК/РМП, оказывал дозозависимый пролиферативный эффект. Однако
наибольшая стимуляция пролиферативного потенциала под действием АФП (100 мкг/мл)
наблюдалась в культурах клеток фр.1 и фр.2, где уровень синтеза ДНК был более чем в 2
раза выше их спонтанного показателя. Во фр.3 пролиферация увеличивалась только на
80%. Анализ действия АФП на активность дегидрогеназ в ГСК/РМП показал
идентичность ответа у всех трех фракций и усиливался примерно на 80%. Синтез белка во
фракциях ГСК/РМП в ответ на воздействие АФП различался. Так, если во фр.2 он был
максимальным (увеличение на 180%), то во фр.3 он был минимальным (увеличение на
125%). Фр.2 занимала промежуточное положение (увеличение на 160%). Анализ
супрессорной активности выявил значительный ее уровень у супернатантов всех фракций
(фр.1 – 49,8±1; фр.2 – 52,6±1,4; фр.3 – 39,5±2,0 %), стимулированных АФП, в то время как
спонтанная супрессорная активность этих фракций полностью отсутствовала. Оценка
уровня продукции TGFβ показала резкое различие всех трех фракций ГСК/РМП друг от
друга. Так, во фр.1 было обнаружено максимальное количество TGFβ (2123±23 пг/мл).
Значительно меньше его обнаруживали во фр.2 (573±36 пг/мл). Во фр.3 АФП совсем не
вызывал продукции TGFβ.
Резюмируя полученные данные, можно сказать, что исследуемые фракции ГСК/РМП,
активируемые онкофетальным белком АФП, при большом сходстве в биологической
активности имеют и некоторые различия. Так, хотя все они сходным образом показывают
усиление пролиферации, метаболизма и синтеза белка, с которыми высоко коррелирует
супрессорная активность, но существенно различаются по продукции TGFβ, что
свидетельствует о наличии супрессорных факторов иной природы, в частности,
секретируемых клетками фр.3.
Продукция супрессорных цитокинов культурой мононуклеарных клеток
пуповинной крови человека.
Перфильева Ю.В. 1, Супниязова Т.А. 1, Закирьянова Г.К. 1, Рысулы М.Р. 2, Беляев
Н.Н. 1
1
Институт молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина ЦБИ КН МОН РК,
2
ТОО «Стэмкорд», г. Алматы, Казахстан
В настоящее время существует гипотеза, что в норме в организме поддерживается
циркуляция в периферической крови небольшого количества гемопоэтических стволовых
клеток (ГСК). В случае нарушения целостности какой-либо ткани в поврежденном очаге
начинают образовываться факторы, вызывающие хоуминг, то есть направленный
транспорт, ГСК в область повреждения. Одновременно идет мобилизация ГСК из
костного мозга. В результате в области тканевого поражения скапливаются ГСК,
осуществляющие репарацию поврежденной ткани. Ранее мы показали, что ГСК костного
мозга мышей с фенотипом CD34+ обладают натуральной супрессорной активностью,
выражающейся в способности секретировать факторы, угнетающие различные
иммунологические реакции, под действием некоторых цитокинов, гистамина и
онкофетального белка – альфа-фетопротеина. Мы предположили, что ГСК,
скапливающиеся в области тканевого повреждения, секретируют супрессорные факторы,
формирующие локальную зону иммуносупрессии, которая в данном случае необходима
для предотвращения местного воспаления, препятствующего репарации. Кроме того, ГСК
инициируют формирование иммунологической толерантности к образовавшимся в
результате тканевого повреждения аутоантигенам. В связи с использованием ГСК
пуповинной крови (ПК) для целей тканевой репарации актуальность вопроса о
способности ГСК человека секретировать иммуносупрессорные факторы кажется
очевидной. Между тем, на данный момент точно не известно, могут ли человеческие ГСК
обладать натуральной супрессорной активностью.
Целью настоящего исследования явилась оценка возможности продукции
супрессорных цитокинов культурой клеточной фракции ПК, обогащенной ГСК.
Эксперименты проводили на 7 образцах ПК, полученной в родильных домах г.
Алматы по отработанной ранее методике, при использовании стерильных систем,
содержащих гемостабилизатор «Глюгицир». Эритроциты удаляли с помощью осаждения в
растворе желатина. Фракцию ГСК выделяли по разработанному нами методу на
многоступенчатых градиентах плотности перкола. Полученную взвесь клеток
(2х105кл/лун) культивировали в 96-луночных планшетах в культуральной среде IMDM,
содержащей 30% фетальной телячьей сыворотки и 1% метилцеллюлозы при стандартных
культуральных условиях (37оС, 5% СО2 и 90% влажности) в течение 72 ч. По окончании
инкубации планшеты центрифугировали для осаждения клеток (10 мин при 400g).
Бесклеточные супернатанты собирали, замораживали и хранили при -70оС до
определения в них цитокинов. Определяли концентрацию IL-6, IL-10, ILиммуноферментном анализе с помощью коммерческих тест-систем.
Иммуноферментный анализ концентрации IL-6 в супернатантах культивируемых
ГСК показал, что образцы ПК исходно различаются по способности к продукции этого
цитокина. Так, 3 из 7 образцов показали низкую спонтанную продукцию IL-6 – 28,3±4,4
пг/мл (20-35 пг/мл), в то время как оставшиеся 4 образца показали очень высокую
продукцию данного цитокина – 1415±72,3 пг/мл (1211-1542 пг/мл). Исходный уровень
продукции IL-10 был невысок в 5 из 7 образцов и составлял в среднем 8,4±2,0 пг/мл (5-16
пг/мл). Оставшиеся два образца показали более высокий уровень продукции данного
цитокина – 69±15 пг/мл (54-84 пг/мл). IL-13 не был обнаружен ни в одном из образцов. Но
средняя концентрация этого цитокина в супернатантах ГСК составила 2974±247 пг/мл.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что ГСК ПК
обладают существенным иммуносупрессорным потенциалом, поскольку даже в
отсутствии индуцирующих сигналов способны секретировать значительные количества
IL-6, ILсвойствами. Это обстоятельство необходимо учитывать при проведении аллогенных
трансплантаций препаратов ПК при лечении злокачественных заболеваний крови.
Исследование пролиферативной активности клеток мононуклеарной
фракции пуповинной крови человека.
Закирьянова Г.К. 1, Рысулы М.Р.2, Жумабаева Б.А. 3, Сатыбалдиева Ж.А.3, Беляев
Н.Н.1
1
Институт молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина ЦБИ КН МОН РК,
2
ТОО «Стэмкорд»,
3
Национальный центр экспертизы лекарственных средств МЗ РК,
г. Алматы, Казахстан
В настоящее время пуповинную кровь (ПК) рассматривают в качестве
альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), пригодных для
клеточной терапии. Накоплен достаточно большой опыт использования ГСК ПК при
лечении злокачественных заболеваний крови, а также имеются данные по использованию
их в клеточной регенеративной медицине. Между тем оценка биологической активности
препарата ГСК представляет определенные трудности. На сегодняшний день не
существует стандартных тестов, позволяющих абсолютно объективно оценить качество
клеточного материала, предназначенного для аллогенной трансплантации. Наибольшей
популярностью пользуется тест на способность ГСК к колониеобразованию. Однако
длительность его составляет две недели, что сильно снижает его диагностическую
ценность. Мы решили оценить пролиферативную активность ГСК как интегральный
показатель биологической активности клеток. Существуют различные методы оценки
пролиферативной активности клеток, включающие (1) подсчет живых клеток,
неокрашивающихся трепановым синим до и после культивирования, путем
микроскопирования или с помощью специальных приборов; (2) определение ДНК
делящихся клеток радиоактивным или нерадиоактивным способом; (3) определение
активности клеточных метаболических ферментов, коррелирующей со степенью
пролиферации.
Целью исследования явилась оценка пролиферативной активности ядерных клеток
ПК в сравнении с клеточностью образца и содержанием в нем ГСК и ранних
предшественников гемопоэза (ПГ) с фенотипом CD34+.
Исследование проводили на 10 образцах пуповинной крови, полученных в
роддомах г.Алматы с помощью стандартной процедуры, и обследованных на
инфекционную безопасность (наличие антител к ВИЧ-I и ВИЧ-II, ВГ-С, ВГ-В и
трепонемным антигенам). Пролиферативную активность оценивали с помощью МТТтеста,
основанного
на
восстановлении
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолиум бромида (МТТ) при участии цитоплазматических дегидрогеназ в
нерастворимый формазан, количество которого коррелирует с метаболической
активностью клеток и уровнем пролиферации. CD34+ клетки оценивали с помощью
проточной цитофлуориметрии, используя реагенты фирмы BD (Германия) и прибор
FACS-Calibur. Образцы ПК, содержащие гемостабилизатор «Глюгицир», обрабатывали
раствором желатина для осаждения эритроцитов. Мононуклеарную фракцию клеток
выделяли стандартной процедурой центрифугирования на градиенте фикол-верографина
с плотностью 1,076 г/мл. Количество живых клеток подсчитывали под микроскопом при
использовании трепанового синего и камеры Горяева. Клетки культивировали двое суток
при 37оС, 90% влажности и 5% СО2 в 96-луночных планшетах (2х105 кл/лун) в
культуральной среде RPMI-1640, содержащей 30% фетальной телячьей сыворотки, в
присутствии митомицина С (контроль) или его отсутствии (опыт). За 4 ч до окончания
культивирования в культуру клеток вносили МТТ. По окончанию опыта из лунок удаляли
супернатант, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли диметилсульфоксидом и
колориметрировали при 570/630 нм. Рассчитывали индекс пролиферации по формуле: ИП
= (О-К)Кх100%, где О – оптическая плотность в опыте, К – оптическая плотность в
контроле. В качестве контроля использовали лунки с культурой клеток, содержащей
митомицин С, специфически подавляющий синтез ДНК, но не влияющий на активность
дегидрогеназ.
Анализ полученных данных показал, что образцы ПК существенно различаются по
всем трем исследуемым параметрам. Так, содержание мононуклеарных клеток в цельной
ПК колебалось от 105 до 3,3х106 кл/мл, составляя в среднем 7,95±0,39х105 кл/мл. CD34+
клетки составляли в среднем 0,88±0,31% (0,55-1,12%) от общего количества
мононуклеарных клеток. Пролиферативная активность (ИП) мононуклеаров также
широко варьировала от образца к образцу (3-104%), составляя в среднем 36,3±10,1%.
Корреляционный анализ не выявил никакой связи пролиферативной активности с
клеточностью образцов ПК и содержанием в них ГСК/ПГ (r=0,11 и -0,05 соответственно).
Таким образом, пролиферативная активность мононуклеарных клеток ПК
представляет собой самостоятельный показатель биологической активности препарата
ГСК ПК, значимость которого для трансплантации предстоит выяснить.
Выделение и культивирование гемопоэтических стволовых клеток
Наханов А.Х., Мамадалиев С.М.., Сембаев К.Д., Битов Н.Т.
Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности, Национальный
центр биотехнологии, Министерство образования и науки Республики Казахстан.
В связи с поисками новых путей решения проблемы заместительной терапии о
иеийлъ^ьА-нием стволовых клеток внимание биологов и клиницистов привлекла
способность гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ГСК) давать начало различным типам
специализированных соматических клеток под влиянием ряда индуцирующих ростовых
факторов и сохранять эту способность после длительной криоконсерващш. Основным:
источником стволовых клеток является костный мозг, способный, в дополнение к своей
основной гемопоэтической функции, генерировать предшественники клеточных
элементов большого числа тканей организма. Однако их можно в различных количествах
получить также из периферической и пуповинной крови.
Целью наших исследований является выделение и культивирование ГСК полученные
из костного мозга, пуповинной и периферической крови человека.
Материалы и методы
В работе были использованы пуповинная кровь, лейкоцитарная масса
периферической крови и пунктат костного мозга человека, Мононуклеарные клетки
выделяли методами градиентного центрифугирования с использованием Ficoli-Paque с
плотностью d=l,077 г/см3, обработки образцов лизирующим раствором, состоящего из
хлорида аммония, гидрокарбоната калия и натриевой соли этилендиамишсграуксусной
кислоты в соотношении 1:9 и седиментации клеток в 3% растворе желатина путем
наслаивания гепаринизированных образцов в соотношении 1:3.
Количество жизнеспособных клеток определяли путем окрашивания 1 % раствором
трипано-вого синего с последующим подсчетом неокрашенных клеток в камере Горяева.
Выделения СD34+ и CD133+ клеток из мононуклеарной фракции проводили с
помощью им-муномагнитного сепаратора MiniMACS (Miltenyi Biotec).
Для культивирования выделенных ГСК использовали питательные среды RPMI1640
(Sigma), L-15 (Sigma), DMEM/F12 (Sigma) и ПСП содержащие 10 % фетальной сыворотки
плода коровы. Кроме того, ГСК культивировали в среде RPMI 1640 содержащей 10%
фетальной сыворотки плода коровы с добавлением 1.00 нг/мл Flt-3 Ligand, 100 нг/мл Stem
Cell Factor , 20 нг/мл IL-3, 20 иг/мл TL-6. Клетки высевали в культуральные 24 луночные
плашки. Культивирование проводили при 37°С в увлажненной атмосфере содержащей 5%
С02. Во время культивирования проводили ежедневное микроскопирование
культуральных плашек с культурой клеток с помощью инвертированного микроскопа.
Результаты
При выделении ядросодержащих клеток из первичного материала (пуповинная и
периферическая кровь, костный мозг) оптимальным методом является использование
фиколла с плотностью 1,077 г/м и лизирующего раствора. Обработка пуповинной и
периферической крови указанными методами приводит к получению большей массы
клеток по сравнению методом обработки раствором 3% желатина. Однако использование
лизирующего раствора в наших условиях являлось оптимальным по сравнению с
фиколлом, из-за доступности компонентов применяемых в приготовлении данного
раствора.
Количество CD34 и CD133т клеток выделенных с помощью иммуномагнитного
сепаратора MiniMACS составило не более 1 % от общего количество мононуклеарных
клеток.
При культивировании CD34+ и СD1ЗЗ+ клеток на питательной среде RPMI 1640
содержащей 10 % фетальной сыворотки плода коровы как с добавлением 100 нг/мл Flt-3
Ligand, 100 нг/мл Stem Cell Factor , 20 нг/мл IL-3, 20 нг/мл IL-6 не наблюдали
пролиферации клеток, Культивирование ГСК из костного мозга человека на питательных
средах L-15 (Sigma), DMEM/F12 (Sigma), ПСП содержащие 10 % фетальной сыворотки
плода коровы без добавления цитокинов в течение 3-х недель культивирования
размножение выделенных меченых клеток не наблюдалось, На ранних сроках
культивирований наблюдали частичное прикрепление клеток на поверхности
культуральной посуды, по морфологическим признакам подобные лимфоцитам и
представляли собой относительно однородную совокупность округлых клеток. Часть
клеток находилась во взвешенном состоянии, сохраняя при этом изначальную форму.
Проводили культивирование немеченых ядросодержащих клеток, полученные после
магнитной сепарации, при таких же условиях, как и при культивировании CD34+ и CD133+
клеток. При культивировании на начальных этапах отмечали появление в культуральной
среде взвешенных клеток, состоящие из нескольких десятков клеток, которые на 2-3 сутки
прикреплялись к культуральной поверхности. Затем от этих колоний на 10 сутки
культивирования начинался рост фиб-робластоподобных клеток от центра к периферии.
Кроме того, к данному сроку культивирования в культуре отмечали появление крупных
клеток с зернистой цитоплазмой и клеток с ундулирующей мембраной характерные для
макрофатальных клеток. По мере культивирования наблюдали, что макрофагальные клетки
исчезали, а на их месте начинали расти фибробластоподобные клетки. На 13 сутки
культивирования число фибробластаых клеток в монослое начинали увеличиваться. Образование конфлюэнтного монослоя начиналось к 25 дневному сроку культивирования,
состоящего из фибробластовых клеток удлиненной формы.
Выводы
1. Выделение ядросодержащих клеток из пуповинной и периферической крови, а
также из костного мозга человека с использованием Flcoll Раque и лизирующего раствора
позволяют получать максимально очищенные мононуклеарные фракции;
2. Использование иммуномагнитной сепарации позволяет выделять избирательно ГСК с
фенотипами CD34+ и CD 133+ до 1% от общего количества мононуклеарных клеток.
3. Применений питательной среды RPMI 1640 в комплексе с ростовыми факторами и
цито-кинами для культивирования CD34+ и CD133+ клеток не привело к активации
пролиферативных свойств указанных клеток.
Роль BRAFV600E в стимуляции инвазивности клеток рака щитовидной
железы посредством активации NF-Kb. Прогноз последствий
возникновения BRAFV600E в Cancer Stem-Like клетках клеточных линий
рака щитовидной железы
Паленая И.В., Ph.D.,1 Смолянинов А. Б.,1 Намба Х., M.D., Ph.D.,2
Митсутаке Н., M.D., Ph.D.,2 Ямашита С., M.D., Ph.D.,2
-Центр клеточной и генной терапии, Покровский банк стволовых клеток, СанктПетербург, 2-Отделение молекулярной медицины, Институт болезней, вызванных
атомной бомбардировкой, Университет г. Нагасаки, Факультет биомедицинских наук
1
Цели исследования:
 Исследовать возможные механизмы BRAFV600E- зависимого онкогенеза.
 Изучить механизмы, посредством которых BRAFV600E индуцирует инвазивный
рост и метастазирование злокачественных опухолей яичников и молочной железы.
 Прогнозировать последствия возникновения BRAFV600E в cancer stem-like клетках
клеточных линий рака щитовидной железы.
 Определить возможности генно-терапевтического воздействия на cancer stem-like
клетки клеточных линий рака щитовидной железы.
Материалы и методы исследования:
 В исследованиях использовали WRO, NPA, KTC-3 клеточные линии рака
щитовидной железы человека.
 Для получения Dox-индуцибельных клеточных линий, несущих BRAFV600E была
использована T-Rex экспрессионная система (Invitrogen, Carlsbad, CA).
 Аденовирусные конструкты были получены путем субклонирования BRAFV600E и
GFP cDNA в pAdHM4CMV аденовирусный вектор.
 Для определения экспрессированных протеинов использовался Western Blotting
тест.
 Для определения ДНК-связывающей активности NF-kBтранскрипционного
фактора использовали DNA-binding тест- мультиканальный колориметрический
метод.
 In vitroинвазивный тест проводился с использованием Matrigel-coated Chemotaxicell
инвазивных камер (Kurabo, Osaka, Japan).
 Для детекции cancer stem-like (side population, SP) клеток, применялась проточная
цитофлуориметрия с использованием способности SP клеток избегать связывания
ДНК с красителем Hoechst 33342.
 Для оценки статистической достоверности полученных данных использовался
ANOVA тест.
Результаты:
 В WRO клеточной линии стабильно трансфецированной индуцибельным
BRAFV600E и WRO клеток, инфицированных рекомбинантным аденовирусом с
BRAFV600E наблюдалась активация Ras/Raf/MEK/MAPK.
 С помощью метода проточной цитолуориметрии была идентифицирована
небольшая популяция клеток- side population (SP). SP клетки были найдены в
анапластических раках щитовидной железы и имели BRAFV600E. Высокая
колониеобразующая активность, высокая онкогенность у nude-мышей, повышенная



активность генов, которые обычно активированы в стволовых клетках,
свидетельствует о наличии cancer stem-like клеток во фракции SP клеток.
BRAFV600E-индуцированная активность NF-kB, была подтверждена такими
методами, как 1) деградация цитоплазматического IkBα; 2) транслокация NF-kB в
ядро; 3) увеличение ДНК-связывающей активности субъединиц NF-kB с NF-kB
олигонуклеотидом.
Увеличение уровня экспрессии c-IAP-1, c-IAP-2 и XIAP протеинов, которые
являются хорошо известными NF-kB-зависимыми анти-апоптическими факторами,
подтверждает функциональную активность NF-kB, индуцированную BRAFV600E.
BRAFV600E увеличивает инвазивность клеток рака щитовидной железы посредством
повышения уровня экспрессии MMP и интегринов. Полученные результаты
демонстрируют вовлечение NF-kB сигнального пути в BRAFV600E-индуцированную
клеточную миграцию и инвазию.
Выводы:
 Активирующая мутация в BRAF ведет к конститутивной активации
транскрипционно активного NF-kB.
 BRAFV600E- индуцированная активация NF-kB увеличивает транскрипцию генов,
ответственных за антиапоптическое поведение и инвазивность клеток рака
щитовидной железы, что соответствует патогенетическим и клиническим
особенностям PTC, несущим эту мутацию.
 BRAFV600E активирует NF-kB, независимо от активации MAPK сигнальной
последовательности в клетках щитовидной железы и увеличивает инвазивность
клеток путем повышения уровня NF-kB-MMP экспрессии.
 Специфические NF-kB ингибиторы, такие как DHMEQ, могут использоваться дял
лечения более агрессивных раков щитовидной железы, несущих BRAFV600E
мутацию посредством преодоления не только апоптической резистентности, но и
клеточной инвазивности.
 Ингибирование BRAFV600E в клетках рака щитовидной железы и cancer stem-like
клетках с BRAFV600E наряду с ингибированием NF-kB потенциально могут
обеспечивать новые терапевтические возможности генной терапии рака
щитовидной железы.
Селективное фармакологическое ингибирование JNK-киназы в
облученных линиях клеток анапластического рака щитовидной железы
и роль Cancer Stem-Like Cells в химио- радиорезистентности
злокачественного опухолевого роста
Булгин Д. В.,1 Смолянинов А. Б.,1 Саенко В. А.,2 Митсутаке Н.,2 Ямашита С.2
-Центр клеточной и генной терапии, Покровский банк стволовых клеток, СанктПетербург, 2-Отделение международной медицины и радиационных исследований,
Институт болезней, вызванных атомной бомбардировкой, Университет г. Нагасаки,
Факультет биомедицинских наук,
1
Цель исследования
Оценка результатов селективного ингибирования JNK-киназы (c-Jun N-terminal
kinase) в облученных клетках анапластического рака щитовидной железы и анализ
внутриклеточных механизмов, участвующих в эффектах комбинированного воздействия.
Изучение особенностей cancer stem-like cells в клеточных линиях анапластического рака
щитовидной железы
Методы
Использовали долгосрочные линии клеток анапластического рака щитовидной
железы человека ARO, FRO и KTC-2. Однократное острое облучение клеток
рентгеновскими лучами в дозе до 10 Гр проводили на излучателе EXS-300 (Toshiba,
Япония; 200кВ, 15мА, 0.83 Гр/мин). Для селективного ингибирования JNK-киназы
применяли антрапираксалон SP600125 производства фирмы Calbiochem (Германия).
Определяли выживаемость клеток (классический клоногенный тест), повреждение ДНК в
индивидуальных клетках (метод ДНК-комет в щелочных условиях), активность JNKкиназы (инвитро-киназная реакция), уровни JNK-киназы, c-JUN, ATF-2 и их
фосфорилированных форм (иммуноблоттинг). С
использованием проточной
цитофлоурометрии выявляли популяции клеток, ядра которых не окрашиваются ДНКсвязующим красителем Hoechst33342.
Для оценки статистической достоверности
полученных данных использовали ANOVA тест.
Результаты
1. Селективное ингибирование активности JNK-киназы в клетках анапластического
рака щитовидной железы оказывает обратимый цитостатический эффект.
2. Применение SP600125 радиосенсибилизирует культивируемые опухолевые клетки.
В комбинации с облучением препарат достоверно снижает клоногенную
выживаемость во всех трех изученных клеточных линиях.
3. В клетках, облученных в дозе 10 Гр, ингибирование JNK-киназы значимо снижает
скорость восстановления повреждений ДНК.
4. Острое облучение рентгеновскими лучами вызывает быстрое повышение
активности JNK-киназы, достигающей максимума через 30 минут после облучения.
Наблюдается соответственное увеличение уровней фосфорилированных форм
субстратов JNK-киназы, транскрипционных факторов c-Jun и ATF-2, блокируемое
в присутствии ингибитора JNK-киназы.
5. В клеточных линиях анапластического рака щитовидной железы присутствуют в
небольшом количестве клетки (side population/SP) ядра которых не окрашиваются
ДНК-связующим красителем Hoechst33342 (ARO – 0.25%, FRO – 0.1 %).
6. Культивирование SP клеток показало их высокую клоногенную активность по
сравнению с другими опухолевыми клетками
7. Клеточная линия анапластического рака щитовидной железы ARO демонстрирует
наименьшую чувствительность к химическому и радиационному воздействию по
сравнению с другими изученными клеточными линиями (FRO, KTC-2).
Заключение (выводы)
В клетках анапластического рака щитовидной железы JNK-киназа играет
многофункциональную роль, влияя на пролиферативную активность клеток, скорость
восстановления радиационно-индуцированных повреждений ДНК и пострадиационную
выживаемость. Фармакологическое вмешательство в JNK-киназный каскад является
перспективным методом неоадъювантной химиотерапии, который в комбинации с
последующим радиологическим лечением может обеспечить улучшение результатов
лечения больных данной формой опухолевой патологии. В клеточных линиях
анапластического рака щитовидной железы присутствует небольшая популяция клеток,
ядра которых не окрашиваются ДНК-связующим красителем Hoechst33342, что
характерно для стволовых клеток нормальных тканей. Полученные данные являются
важным моментом, проясняющим особенности канцерогенеза в ткани щитовидной
железы и причины химио- и радиорезистентности анапластического рака щитовидной
железы.
Оценка генетической безопасности клеточной терапии.
Воронина Е.С.1, Гольдштейн Д.В.2, Ржанинова А.А.2, Никитина В.А.1, Буяновская
О.А.1, Бочков Н.П.1
1) ГУ Медико-генетический научный центр РАМН
2) ЗАО «Реметэкс»
Одним из главных условий применения клеточной терапии в практической
медицине является обеспечение безопасности ее проведения. Вопросам генетической
безопасности клеточных трансплантатов до последнего времени уделялось недостаточно
внимания. Между тем, культивирование клеток может приводить к возникновению
клеток с аберрантным кариотипом и их позитивной селекции в популяции, что может
явиться причиной «загрязнения» клеточного трансплантата. Генетически аберрантные
клетки в организме реципиента рано или поздно могут стать «бомбой замедленного
действия» в отношении злокачественного роста или нарушений иммунитета. Одним из
методов оценки генетической безопасности является цитогенетическое исследование. Оно
позволяет определить генетическую стабильность клеточных линий и выявлять линии,
несущие хромосомные перестройки.
Цель работы – разработка алгоритма и проведение цитогенетического анализа
стволовых клеток человека. Исследование было проведено на культурах мультипотентных
стромальных клеток (МСК), полученных из жировой ткани взрослых индивидов на
ранних (3-4) и поздних (10-14) пассажах.
Разработана методика цитогенетического исследования МСК человека.
Определены условия культивирования клеток, отработана методика фиксации культур и
приготовления цитогенетических препаратов. Цитогенетические параметры безопасности
стволовых клеток изучались по двум позициям: кариотипирование и оценка уровня
геномных мутаций анеуплоидии и полиплоидии.
При анализе дифференциально окрашенных (G-окраска) препаратов МСК на 4-14
пассажах в отдельных культурах выявлены клоны с измененными кариотипами
(моносомия по 6ой хромосоме, робертсоновская транслокация 21/22, трисомия по двум
хромосомам группы С). Для анализа уровня анеуплоидии и полиплоидии была применена
методика флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с центромерными зондами на
хромосомы 6 и 8. Обнаружена повышенная частота анеу- и полиплоидных клеток в
культурах поздних пассажей (10-14).
Экспериментальная работа с культурами МСК показала, что методические приемы
(снятие клеток с флаконов, гипотонизация, фиксация) для приготовления
цитогенетических препаратов должны быть щадящими. Разорванных клеток с
разбросанными хромосомами встречается много больше, чем в препаратах из культур
лимфоцитов. Может быть, по этой причине мало опубликованных работ по анализу
хромосомных наборов в культурах региональных стволовых клеток.
В 50% культур МСК поздних пассажей обнаружена хромосомная изменчивость,
которая выражается в виде нестабильных хромосомных аберраций, транслокаций
хромосом и анеуплоидий. Значимость таких изменений пока не ясна, но вряд ли они
безразличны для судьбы клеток, которые после культивирования будут
трансплантированы в организм. При этом надо иметь в виду, что примененные в данной
работе методы позволяют учитывать только крупные хромосомные аномалии и
анеуплоидии, а использование молекулярно-цитогенетических методов может выявить их
еще в большем масштабе.
Из наших наблюдений следует, что имеет место селективное размножение клеток с
аномальным кариотипом. Следовательно, необходим цитогенетический контроль
стволовых/прогениторных клеток перед их трансплантацией, как часть системы
обеспечения безопасности клеточной терапии. Клеточная терапия тем безопаснее, чем
меньше делений пройдет в культуре стволовых клеток.
Клиническое исследование применения комбинированного клеточного
трансплантата у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани
верхней и нижней челюсти.
Кулаков А.А.1, Гольдштейн Д.В.2, Алексеева И.С.1, Волков А.В.2,3
1
ФГУ «ЦНИИ стоматологии» Росздрава
2
ЗАО «РеМеТэкс»
3
ГУ НИИ морфологии человека РАМН
Изучение механизмов регенерации различных органов и тканей с использованием
клеточных технологий получило значительное развитие в последние годы, одним из
перспективных направлений в современных клеточных технологиях в медицине является
восстановление костной ткани с использованием тканеинженерных конструкций.
Технологии тканевой инженерии позволяют создавать тканевые эквиваленты костной
ткани - тканеинженерные конструкции: аутогенные клетки костной ткани, наносятся на
биосовместимый синтетический или биологический материал (биоматрикс), после
трансплантации тканеинженерной конструкции происходит активизации собственных
репаративных процессов в зоне поражения, что приводит к органотипической
регенерации костной ткани.
Реконструкция костной и соединительной ткани – самое изученное направление в
тканевой инженерии. Эквиваленты костной ткани получают путем направленной
дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)
костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани. Затем полученные остеобласты
наносят на различные материалы, поддерживающие остеоиндукцию (аллогенная кость,
гидроксиапатит и др). Полученную тканеинженерную конструкцию помещают в место
дефекта. При использовании аутологичного материала происходит практически полная
интеграция тканеинженерной конструкции со скорейшим восстановлением функции
регенерируемого органа.
Основой тканеинженерной конструкции является биоматериал с заданными,
прогнозируемыми
свойствами,
а
функционирующей
единицей
является
предефференцируемая в остеобластическом направлении ММСК Мультипотентные
мезенхимальные стромальные клетки обладают способностью к направленной
дифференцировке в стволовые отсеогенные клетки предшественники, высокая скорость
пролиферации ММСК позволяет нарастить достаточное количество клеток для
трансплантации.
В настоящее время создание тканевых эквивалентов костной ткани уже вышло за
пределы эксперимента и лаборатории. В экспериментальных и клинических работах
показана возможность восстановления костной ткани с использованием различных
биодеградируемых материалов и ММСК, дифференцированных в остеобластическом
направлении.
На базе ЦНИИС совместно с ЗАО «РеМеТэкс» ведется разработка методов
восстановления костных дефектов с помощью тканеинженерных конструкций на основе
ММСК и резорбируемого матрикса, начато клиническое исследование по применению
комбинированного клеточного трансплантата у пациентов с выраженным дефицитом
костной ткани в области верхней и нижней челюстей. Применение тканеинженерных
конструкций для восстановления костных дефектов является перспективным решением
сложной
клинической
задачи
по
стимуляции
репаративного
остеогенеза.
Трансплантируемая в зону дефекта тканеинженерная конструкция, позволит добиться
органотипического восстановления утраченной ткани в результате пролиферации и
дифференцировки трансплантируемых клеток, активизации механизмов репарации.
Использование тканеинженерных конструкций на основе ММСК позволит улучшить и
сократить сроки лечения больных с выраженным дефицитом костной ткани в области
верхней и нижней челюстей.
Модели изучения ангиогенеза при трансплантации клеток.
Фатхудинов Т.Х.1,2, Большакова Г.Б.2, Гольдштейн Д.В.1, Арутюнян И.В.1,
Ржанинова А.А.1, Быченко А.Б.1
ЗАО «РеМеТэкс»,
ГУ НИИ морфологии человека РАМН.
1
2
В настоящее время стимуляция роста кровеносных сосудов при трансплантации
стволовых/прогениторных клеток вызывает интерес у многих исследователей. Однако до
сих пор отсутствует универсальная экспериментальная модель для изучения стимуляции и
механизмов ангиогенеза in vivo. Ангиогенез, образование кровеносных сосудов,
происходит при репаративой регенерации любой ткани, ишемии и росте опухоли. В
соответствии с этим существуют три варианта экспериментальных моделей ангиогенеза.
Мы остановились на первом варианте, ангиогенезе при репаративном процессе, то есть
образовании грануляционной ткани, так как этот процесс можно наблюдать при любом
повреждении ткани, в том числе ишемическом. Грануляционная ткань – это рыхлая
волокнистая соединительная ткань, очень богатая сосудами, которая формируется во
время экссудативной и в начале продуктивной фаз воспаления любой ткани, и так же в
миокарде.
Объектом нашего исследования являлось новообразование кровеносных сосудов
при трансплантации ксеногенных мультипотентных стромальных клеток (МСК) костного
мозга с использованием различных суспензионных носителей клеток. В качестве
носителей клеток использовали человеческую плазму крови, богатую тромбоцитами (PRP,
platelet rich plasma), 10% полигидроксиэтилкрахмал (ГЭК) и измельченную
гемостатическую губку «Спонгостан». В эксперименте использовали половозрелых
самцов крыс Wistar, которым инъекционно в подкожно-жировую клетчатку
межлопаточного пространства вводили носитель без клеток или с клетками в объеме 1 мл.
Выведение животных из эксперимента проводили на 3, 7 и 14 сутки, из области введения
трансплантата выделяли ПЖК, соединительную и мышечную ткани, проводили
гистоморфометрическое и иммуногистохимическое (моноклональные антитела к CD31)
исследования.
В результате проведенного исследования было показано, что введение под кожу
крысе PRP, измельченной гемостатической губки и в меньшей степени ГЭК без нанесения
повреждения как такового вызывает активную миграцию незрелых клеток и клеток
воспалительного инфильтрата в субстрат и образование на этом месте рыхлой
волокнистой соединительной ткани, в некоторых случаях очень хорошо
кровоснабжаемой. Это может быть обусловлено как наличием в субстрате определенных
факторов роста и цитокинов, как случае с PRP, так и хемотаксической активностью
самого субстрата. Введенный субстрат можно четко отличить от окружающих тканей.
Новообразованная ткань представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью с
обширными участками грануляций, которые можно было наблюдать на 7 и 14 сутки после
введения. В образовании соединительной ткани и грануляций могут участвовать как
трансплантированные клетки, так и мигрировавшие незрелые фибробласты. При
определении объемной плотности сосудов отмечали большее их количество и большую
площадь поперечного сечения в группах с введением клеток. Предварительные
результаты проведенного исследования демонстрируют состоятельность предложенной
экспериментальной модели, которая позволяет количественно и качественно оценить
ангиогенный потенциал того или иного клеточного трансплантата. Использование
витальных маркеров клеток в трансплантате позволит в дальнейшем изучить роль
трансплантированных клеток и механизмы ангиогенеза.
Инъекционная форма тканеинженерной конструкции для лечения
стрессового недержания мочи.
Макаров А.В.1,3, Гольдштейн Д.В1, Адамян Л.В.2, Зайратьянц О.В.2,3, Арутюнян
И.В.1, Опаленов К.В.2, Смольнова Т.Ю.2, Яротская Е.Л.2, Волков А.В.1,3,
Ржанинова А.А.1
ЗАО «РеМеТэкс»
Кафедра репродуктивной медицины и хирургии ГОУ ВПО «Московский
государственный медико-стоматологический университет» Росздрава
3
ГУ НИИ морфологии человека РАМН
1
2
Лечение некоторых видов урогинекологических заболеваний (таких, например, как
стрессовое недержание мочи) и пороков развития мочеполовой системы требует
локального формирования дополнительного замыкательного или поддерживающего
механизма, который может быть создан за счет введения объемформирующих препаратов.
В качестве основы формообразующего препарата нами было впервые предложено
использовать гемостатическую желатиновую губку. В настоящей работе была
использована гемостатическая желатиновая губка Spongostan® (Ferrosan AG),
представляющая собой индивидуально упакованные стерильные пористые блоки объемом
1 см3 каждый. Гемостатическая желатиновая губка внесена в Государственный реестр
лекарственных средств РФ, не цитотоксична, биологически инертна, обладает высокой
адгезией к клеткам, а также достаточной прочностью и эластичностью. Губка стерильна,
не растворима в воде, резорбируется в тканях в течение 3-5 недель.
Выбор клеточного компонента тканеинженерной конструкции был основан на
соответствии культуры определенным параметрам: аутологичность, способность к
активному синтезу внеклеточного матрикса (преимущественно коллагена III типа),
высокая пролиферативная активность культуры, малая травматичность забора материала.
Вышеперечисленным критериям наиболее полно соответствует культура клеток
стромальной фракции жировой ткани. Культуру стромальных клеток жировой ткани
получали в соответствии со стандартным протоколом. Исследование хромосомной
стабильности показало, что доля аберрантных клеток в пассированной культуре не
изменяется по сравнению с первичной культурой и не превышает 3% нормы. Подлинность
культуры была подтверждена путем анализа иммунофенотипа с помощью проточного
цитофлуориметра: подавляющее большинство клеток экспрессировало такие стромальные
маркеры, как CD13, CD 29, CD 44, CD 63, CD 73, CD 90 и CD 166.
Для приготовления препарата, пригодного для инъекционного введения блоки
желатиновой губки измельчали с помощью дисперсионного гомогенизатора. Дальнейшие
исследования показали, что оптимальный размер частиц носителя, представляющего
собой трехмерное переплетение плоскостей и тонких волокнистых структур, колеблется
от 100 до 500 микрон. После получения необходимого количества биоматериала клетки
снимали раствором трипсина-Версена и осаждали центрифугированием. Носитель и
ресуспендированный осадок клеток смешивали и помещали в СО2-инкубатор при
стандартных условиях.
Для оценки устойчивости полученной конструкции к внешним воздействиям,
соответствующим условиям трансплантации, конструкцию переносили в шприц,
оставляли при температуре +4°С на три часа, а затем пропускали через иглу диаметром 0,6
мм. Витальность клеток определяли по исключению окрашивания 0,4% трипановым
синим. Клетки сохраняли свою распластанную форму.
Эксперименты по трансплантации тканеинженерной конструкции in vivo
проводили на 28 крысах-самках линии Вистар массой 250-300 гр. В ходе работы строго
соблюдали требования к проведению экспериментальных исследований на животных. Все
крысы были разделены на 3 группы (контрольную, сравнения и основную) и выводились
из эксперимента на 5-6-е, 12-21-е и 27-35-е сутки после однократного парауретрального
введения между влагалищем и уретрой в мочеполовую и тазовую диафрагмы 300 мкг
трансплантата или только его бесклеточного матрикса. В контрольной группе (10
животных) крысам вводили только бесклеточный матрикс, из них 3-м — методом
парауретральной инъекции с помощью инсулинового шприца (результат изучали на 5-е
сутки) и 7-и — парауретрально через небольшой разрез кожи слева между влагалищем и
уретрой (3-х животных исследовали на 14-е, и 4-х – на 35-е сутки). В группе сравнения (10
животных)
крысам
производили
парауретральную
инъекцию
клеточного
аллотрансплантата. Морфологическое исследование проводили на 6, 21-е (по 3 животных)
и 30-е сутки (4 животных). В основной группе (8 животных) парауретрально
инъецировали клеточный аутотрансплантат, а исследование проводили на 5, 12-е (по 2
животных) и 27-е сутки (4 животных).
Результаты исследования показали, что инъекционное введение разработанной
тканеинженерной конструкции в парауретральные ткани оказывает выраженное местное
активирующее влияние на пролиферацию клеточных популяций соединительной ткани.
Особенно выражен эффект при использовании аутологичных клеток, которые длительно
сохраняют свою жизнеспособность, пролиферативную и синтетическую активность.
Таким образом, использование инъекционной имплантации комбинированных алло- и
аутотрансплантатов открывает перспективы для лечения повреждений тканей и других
патологических процессов репродуктивной и мочевыводящей систем.
Прекультивирование и предифференцировка мезенхимальных
стромальных клеток костного мозга в хондробластном направлении.
Шиманский В.А., Крашенинников М. Е., Хохлова М.К.
Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Использование клеточных и тканеинженерных технологий является новым
подходом к лечению заболеваний суставов. Так как высоко дифференцированные клетки
хрящевой ткани – хонроциты не размножаются – то для разработки методов
реконструктивного лечения суставов с использованием тканеспецифичных клеток
необходимо использовать биологически более активные клетки - хондробласты,
обладающие пролиферативной активностью.
Целью данной работы является отработка оптимальных условий размножения
мезенхимальных стромальных клеток КМ и их последующей предифференцировки в
хондробластном направлении.
Мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из человеческого костного
мозга, наращивали культивированием в течение двух недель в ростовой среде (Iscovs) с
10%-ами сыворотки, гентомицином, инсулином, дексамитазоном и FGF2base(1/3 нормы –
2нг/мл).
Через две недели эти клетки пересевали либо на поверхность покровных стекол,
предварительно покрытую “матригелем”(для улучшения адгезии), в концентрации
10х104/мл, либо на плашку с адгезивным культуральным пластиком. Трое суток находясь
в ростовой среде, эти клетки адгезировали к поверхности. Затем среду меняли на
дифференцировочную; причем для всех клеток сначала использовали первый вариант
среды (DMEM LG с TGFβ3 (10ng/ml), BMP-2 (10ng/ml) и бычьим сывороточноым
альбамином (BSA) 0.5%), а затем второй вариант (Iscov’s с TGFβ3 (10ng/ml), BMP-2
(10ng/ml) и 10% сыворотки (FCS)), которые последовательно чередовали через каждые
трое суток.
Через две недели предифференцировки клетки были зафиксированы и покрашены –
на плашке - “сафранином O” на сульфатированные гликозаминогликаны и толуидином
синим на протеогликаны. Клетки, зафиксированные на стеклах, были подвергнуты
иммуногистохимическому окрашиванию, для выявления коллагена II типа.
Было установлено, что протокол размножения клеток КМ позволяет получить
популяцию активных стромальных клеток в течение двух недель.
Используемый в работе протокол предифференцировки активных стромальных клеток
позволяет получить клетки, развивающиеся в хондробластном направлении, так как через
две недели в культуре обнаруживаются сульфатированные гликозаминоглаканы
(окрашивание сафранином-О), протеогликаны (окрашивание толуидином) и клетки,
продуцирующие коллаген второго типа (иммуногистохимическое окрашивание на
коллаген второго типа), то есть полностью дифференцированные хондроциты.
Выводы: разработан метод культивирования и предифференцировки стромальных
стволовых клеток, позволяющий в течение месяца получить культуру клеток,
предифференцированных в хондробластном направлении, активно синтезирующих
протеогликаны, сульфатированные гликозаминогликаны и часть клеток, синтезирующих
коллаген второго типа (маркер зрелых хондроцитов).
Предварительная иммунокорекция и культивирование клеток костного
мозга повышают функциональную активность и изменяют
фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного
мозга у больных с хронической патологией.
Темнов А.А., Никольская А.О., Башкина Л.В., Гуреев С.В., Онищенко Н.А.,
Сухачев А.А., Васильев К.Н.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва.
Известно, что хронические длительно протекающие заболевания (хронический
стресс) сопровождаются ингибированием миграционной активности и нарушениями
популяционного состава иммунорегуляторных клеток, в том числе клеток костного мозга
(КМ). Ранее мы показали, что в связи с развитием хронической имуносупрессии у таких
больных снижена терапевтическая эффективность мононуклеарной фракции клеток
(МФК) КМ при проведении клеточной терапии.
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния предварительной
иммунокоррегирующей терапии и процесса культивирования МФК КМ на изменение
функциональной (миграционной) активности и фенотипического состава аутологичных
клеток КМ.
У кардиохирургических больных (N=20) исследовали фенотипический состав и
функциональную активность МФК из крови и КМ, взятых одновременно, без и после
подготовки иммунокоррегирующими препаратами, а также МФК из КМ до и через 5 суток
культивирования. Предварительную иммунокоррегирующую терапию осуществляли у
больных, если in vitro исходный индекс стимуляции МФК крови был <1 (ИС<1).
Исследования клеток крови и КМ проводили на проточном цитометре Cytomics FC500 фирмы Becman Coulter с использованием моноклональных антител к CD4, CD8, Bкл,
NK, Ta, и CD4/CD8. Результаты цитофлюориметрического анализа были подвергнуты
статистической обработке.
Выделив в исследуемой группе показатели, характеризующие морфогенетическое
звено иммунитета (СD4, СD8), мы установили, что у больных без иммунокоррегирующей
подготовки из костного мозга активно мигрируют в кровь не клетки, участвующие в
морфогенетических процессах, а клетки, участвующие в реализации общих иммунных
реакций организма (Вкл, NK,Ta). Подготовка больных иммунокорректорами тормозит
выход в кровь В кл,NК, Та из КМ, но активизирует выход из КМ клеток, участвующих в
процессах пролиферации и репаративной регенерации (СD4 и СD8). В процессе
культивирования аутологичных МФК КМ от больных без иммунокоррекции в культуре
снижалось содержание иммунорегуляторных популяций клеток (NK, Вкл и Та).
Предварительная иммунокорректирующая подготовка также снижала эти показатели у
больных, но они были все таки более выражены у больных без проведения
иммунокоррекции.
Иммунологическая подготовка активизирует миграционную активность из КМ в
кровь клеток, участвующих преимущественно в процессах пролиферации и репаративной
регенерации (СD4, СD8 и увеличивается отношение СD4/СD8).
Культивирование мононуклеарной фракции ККМ от больных без предварительной
иммунокоррекции снижает содержание в культуре клеток, не участвующих в
репаративных и пролиферативных реакциях (Вкл, NK, Та), но повышает содержание
клеток регулирующих восстановительный морфогенез (СD4, СD8) в большей степени,
чем у больных с иммунокоррекцией.
Более выраженная терапевтическая эффективность МФК КМ у больных после
предварительного культивирования и иммунокоррекции по сравнению с больными клетки
которых только после культивировались, обусловлена возвращением этих клеток в
организм, где уже восстановлена интеграционная функция иммунного статуса, спомощью
иммунокорректоров.
Компьютерные методы оценки качества и количества жизнеспособных
адгезированных клеток на единице поверхности плёнок и в единице
объёма трёхмерного матрикса.
Ливак Д.Н., Крашенинников М.Е., Долгих М.С., Богатырёв С.Р., Шагидуллин М.Ю.,
Закирьянов А.Р., Ворощук Р.С.*, Цигало А.В.**, Онищенко Н.А.
ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва
*Харьковский государственный медицинский университет, Украина
**Буковинский государственный медицинский университет, Украина
Для предотвращения миграции и гибели изолированных клеток, введенных в
организм, а также для создания условий развития сосудов к этим клеткам используются
различные носители, или матриксы, выполняющие функции каркаса - стромы. При выборе
наиболее подходящей подложки для клеток необходима объективная оценка степени её
заселения, а также жизнеспособности клеток и их пролиферативного потенциала.
На сегодняшний день отсутствуют доступные автоматические системы
распознавания, подсчета и определения состояния клеток на носителях. В то же время
общедоступная обзорная микроскопия без компъютерного анализа является субьективным
и недостоверным методом.
Разработан объективный метод оценки качества и количества жизнеспособных
адгезированных клеток на единице поверхности плёнок и в единице объёма трёхмерного
матрикса.
В опытах для культивирования клеток использовали пленки и матриксы на основе
бактериальных полисахаридов (ПС) которые были предоставлены центром по
исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава
(зав. - проф. Севастьянов В.И.), а также пленки на основе поливинилового спирта (ПВС) с
различным содержанием жирных кислот, которые были получены из МХТИ им. Д.И.
Менделеева). В качестве контроля прикрепления использовали культуральный пластик.
Для заселения пленок использовали клетки костного мозга крыс линии Вистар,
линии клеток Hep-G2, MCF-7, А-371. Культивирование проводили на среде ДМЕМ с
добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки.
После предварительного культивирования на пластике и достижения логарифмической фазы роста клетки пересевали на стерильные пленки.
Культивирование на пленках проводилось под контролем фазово-контрастной
микроскопии. По достижении 75-80% заселения на контрольном культуральном пластике,
в части материала проводили определение жизнеспособности клеток (методом Mosmann и
Monks на активность митохондриального дыхания, без растворения кристаллов и
определения оптической плотности раствора), а вторую часть материала окрашивали
гематоксилином и эозином для визуализации клеток. Полученные препараты фотодокументировали [Ахтемійчук Ю.Т., Цигикало О.В., 2000].
Используя разработанную методику (подана заявка на патент) на электронных
изображениях проводили подсчет соотношения площади, занятой клетками, к свободной
площади на пленке (степень заселения), а также соотношение занимаемой клеткой
площади к площади ее ядра (степень распластывания).
При анализе заселения матриксов, после завершения культивирования в проточной
среде, их фиксировали, заливали желатиной и изготовляли серийные криостатные срезы.
Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, полученные результаты
фотодокументировали.
Обработку изображений и анализ состояния клеток в объеме матрикса оценивали в
специально разработанном программном комплексе «Virtual Anatomist» [Бурых М.П.,
Ворощук Р.С., 2006], который позволяет получать изображения срезов воксельной модели
и использовать методы цифровой морфометрии и координатной топографии для
качественной и количественной характеристики клеток и структуры матрикса в
трёхмерном пространстве [Ахтемійчук Ю.Т., Цигикало О.В., Лівак Д.М., 2006;.
Для оценки состояния культуры в воксельных моделях определяли среднюю
плотность заселения клетками матрикса в единице объема и соотношение распластанных
клеток к шарообразным. Для характеристики собственно матрикса определяли
соотношение объемов, занимаемых материалом матрикса и порами, средний размер пор
матрикса, их пространственную ориентацию, форму и однородность по всему обьему.
Разработан компьютерный метод оценки качества и количества клеток на единице
поверхности плёнок.
Разработан компьютерный метод оценки трехмерной морфологической
характеристики клеток в матриксе, а также оценки структуры матрикса (характеристика
формы пор, их ориентации, степени однородности распределения по всей его толщине)
при помощи програмного пакета «Virtual Anatomist». Получены виртуальные трехмерные
модели матриксов и расположенных в них клеток.
Использование предложенных методик позволяет количественно охарактеризовать
и качественно оценить состояние жизнеспособных адгезированных клеток на пленках и
матриксах, в результате чего становится возможным оптимизация подбора плёнок и
матриксов для заселения на них различных типов клеток.
ИНФОРМАЦИЯ О КОМПАНИИ ДЕЛЬРУС
Компания ДЕЛЬРУС - международная научно-производственная торговая компания,
имеющая партнерские отношения с фирмами-производителями медицинских товаров из 20
стран мира, основана в 1991 году.
Основные функции предприятия - комплексное переоснащение медицинских
учреждений, разработка и реализация программ развития специализированных видов
медицинской помощи населению территорий, монтаж и техническое обслуживание
медицинского оборудования, обеспечение ЛПУ расходными материалами, производство
товаров медицинского назначения, оказание высокотехнологичных медицинских услуг
населению. Компания имеет специализацию в следующих областях:
 служба крови;
 лабораторная диагностика;
 анестезиология и реанимация;
 общая хирургия;
 кардиохирургия;
 интервенционная кардиология;
 холодильные камеры и холодовые цепи;
 чистые помещения, операционные и
палаты;
 эндоскопия;
 эфферентная терапия и диализ;
 акушерство, гинекология,
неонатология;
 функциональная диагностика;
 интраскопия.
На сегодня ДЕЛЬРУС – крупнейшая торговопроизводственная компания России в области продаж
современного медоборудования и товаров медицинского назначения. Компания занимает
лидирующие позиции на российском рынке по созданию и осуществлению комплексных
программ переоснащения станций и отделений переливания крови; более 80%
учреждений службы крови России являются партнерами ДЕЛЬРУС.
Широкий ассортимент товаров медицинского назначения позволяет полностью
укомплектовать лечебное учреждение практически любого профиля в кратчайшие сроки.
Товарная линейка компании включает в себя свыше 10 000 наименований. Общее
количество поставщиков из разных стран мира составляет более 200 партнеров, а с 26
иностранными компаниями-производителями подписаны эксклюзивные соглашения на
представление продукции на территории России. Товары с торговой маркой ДЕЛЬРУС
поставляются в более тысячи населенных пунктов России и сопредельных государств.
Список покупателей медицинской продукции компании содержит почти 10 тыс.
предприятий и учреждений.
Региональные подразделения ДЕЛЬРУС находятся в 45 крупнейших городах
России, Киргизии, Казахстана, Украины.
В компании работают более 2000 человек. Это специалисты с высшим
образованием, врачи и фармацевты с опытом работы в практическом здравоохранении,
инженеры, прошедшие стажировку в фирмах-производителях медицинского
оборудования и имеющие сертификаты компаний.
Ежегодно компания участвует в международных, всероссийских и региональных
выставках, симпозиумах, конференциях и конгрессах. Научные статьи и обзоры
сотрудников компании публикуются журналами «Трансфузиология», «Вестник службы
крови России», «Медицина, техника, стоматология».
Компания ДЕЛЬРУС имеет все необходимые лицензии.
Компания Дельрус является эксклюзивным дистрибьютером продукции фирмы
CHART Biomedical Ltd. – компании, занимающаяся разработкой и созданием
оборудования для хранения и транспортировки медико-биологических материалов.
Компания предлагает криохранилища с
широким спектром температур хранения: от -125
°С до -196 °С, что позволяет хранить в них
биологические
образцы
с
различными
требованиями к температуре хранения. Благодаря
широкому ассортименту аксессуаров в дьюарах
CHART Biomedical Ltd. возможно хранение
абсолютно
любого
медико-биологического
материала. Это могут быть и стволовые клетки, и
эритроциты, и половые клетки, и эмбрионы, и
фрагменты тканей, и части органов, и многое
другое.
Компания Дельрус предлагает Вам свои знания и опыт по созданию и оснащению
Банков долговременного хранения медико-биологического материала.
Мы осуществляем реализацию комплексных проектов с момента проектирования
до валидации оборудования (оснащение, монтаж и запуск оборудования). Также
занимаемся необходимыми преобразованиями
в помещениях будущих Банков
долговременного хранения медико-биологического материала (системы вентиляции,
трубы сброса давления), т.е. выполняем весь спектр работ, необходимый для создания и
нормального функционирования Банков.
Специалистами компании Дельрус уже реализовано несколько проектов. Наиболее
крупные из них:
Банк
долговременного
хранения
эритроцитов,
тромбоцитов,
стволовых
клеток
в
Научноисследовательском Институте
Скорой Помощи им.
Н.В.Склифосовского, г.Москва
Банк
долговременного
хранения
эритроцитов,
тромбоцитов, стволовых клеток в Военно–медицинской
Академии им. С.М.Кирова (ГВМУ), г.Санкт-Петербург
- Банк долговременного хранения стволовых клеток (костного мозга) в РДКБ,
г.Москва
- Банк долговременного хранения эритроцитов, стволовых клеток в ФГУ
"Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии имени В.А. Алмазова",
г.Санкт-Петербург
-
- Банк долговременного хранения эритроцитов, стволовых
клеток в Главном военном клиническом госпитале имени
академика Н.Н. Бурденко, г.Москва
- Банк долговременного хранения гомографтов в Институте
Сердца, г.Пермь
121359, Москва, а/я 5, ул.Маршала Тимошенко 19, офис 243
тел.моб. 721-05-58, , т/ факс (495) 415-09-75, 415-11-15
pmaster@labmetod.ru
E-mail:
10 лет на российском рынке !!!
Продажа медицинского лабораторного и общелабораторного
оборудования российских и зарубежных производителей.
Монтаж,
сервисное
обслуживание,
гарантийный
и
послегарантийный ремонт лабораторного оборудования
 Оборудование для криоконсервации и создания криобанка для
длительного хранения биоматериала в жидком азоте и его парах
производства фирмы Planer, Великобритания.
Программируемые замораживатели высокого класса точности
создаваемых программ. Широкий выбор моделей, различных по степени
загрузки образцов и техническим возможностям для работы с самым разным
биологическим материалом растительного и животного происхождения , в
том числе человеческого: костного мозга, стволовых клеток, образцов кожи,
спермы, эмбрионов, ооцитов и пр.
Криохранилища для длительного хранения биоматериала в жидком
азоте или его парах : обычные и программируемые, из нержавеющей стали
цилиндрической формы с узким горлом и в форме короба с широкой
прямоугольной крышкой сверху. Сосуды Дюара для транспортировки
биоматериала в парах жидкого азота различного объема и длительности
сохранения температурного режима без дозаправки жидким азотом. Сосуды
Дюара для жидкого азота.
Аксессуары для создания организованного банка биоматериала:
корзины, держатели, штативы, маркировочный материал для быстрого
нахождения образца.
Аксессуары для безопасной работы с жидким азотом : маски, фартуки,
криоперчатки.
 СО2-инкубаторы для выращивания культур клеток
производства фирмы RS Biotech Galaxy, Великобритания, и
фирмы Thermo Electron, США.
Электрический обогрев или водяная рубашка
Контроль СО2, О2: тепловой ( Т/С) или ИК- датчик
Стерилизация камеры: высокотемпературная стерилизация камеры (до
+140С)
121359, Москва, а/я 5, ул.Маршала Тимошенко 19, офис 243
тел.моб. 721-05-58, , т/ факс (495) 415-09-75, 415-11-15
pmaster@labmetod.ru
E-mail:
 Проточная цитометрия - приборы фирмы Partec, Германия
Проточные цитофлюориметры, анализаторы плоидности,
опция сортировки клеток, робот-автомат для проподготовки.
Приборы нового поколения
Модели серии Cy Flow - это проточники 1, 2 -х и 3-х лазерной
конфигурации, позволяющие проводить измерение от 3 до 16 оптических
параметров. Применение твердотельных диодных лазеров делает приборы
более компактными и мобильными с высокой степенью работоспособности
и надежности, увеличивает срок эксплуатации приборов. Использование в
конструкции метода абсолютного реального вольюметрического подчсета
клеток в фиксированном объеме.
Конструктивная совместимость узла проточной кюветы с опцией “
сортировщик клеток “ позволяет использовать прибор в качестве сортера .
Полностью автоматизированный робот для пробоподготовки Partec
Robby может применяться и как автономное устройство для подготовки проб
в иммунологии, цитологии, гематологии.
Открытость системы дает возможность работы на реагентах любых
известных производителей: Dako Cytomation, ID Labs, R&D, “ Сорбент “,
Россия.
 Микроскопы, цифровые комплексы, системы визуализации
для микроскопии на базе микроскопов фирмы Nikon, Япония
 Оборудование для молекулярной биологии : электрофорез,
термоциклеры, гибридизационные печи Techne,Великобритания
 Общелабораторное оборудование: ПЦР –боксы, ламинары,
вытяжные шкафы, термостаты, шейкеры, рН- метры, мешалки.
Организация Банка Стволовых Клеток
ООО «Инновационные Медицинские Технологии»
121108, Россия, Москва
ул. Ивана Франко, д. 4, корп. 15
тел./факс: + 7 495 380 36 62
www.thermogenesis.ru
E-mail: dr_fedorov@delrus-msk.ru; gerasimenkodv@haemoline.ru
На сегодняшний день изучение и применение стволовых клеток является одним из
самых актуальных направлений в медицине во всем мире. Уже сегодня стволовые клетки
успешно используются для лечения целого ряда заболеваний, так как традиционные
методы терапии бывают не эффективны.
Клеточные технологии являются одним из основных направлений деятельности
компании «Инновационные Медицинские Технологии» - лидера на рынке России и стран
СНГ по поставке оборудования и расходных материалов, предназначенных для выделения
стволовых клеток и их криоконсервации. Кроме того, компания осуществляет полное
проектирование и оснащение Банков Стволовых Клеток (БСК) «под ключ».
На сегодняшний день в РФ компанией «ИМТ» открыто три государственных банка
пуповинной крови:
• в Москве (Государственное учреждение здравоохранения г. Москвы «Банк
стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы»);
• в Самаре (Государственное учреждение здравоохранения Самарской области
«Клинический центр клеточных технологий»);
• в Казани (Государственное учреждение здравоохранения республики Татарстан
«Банк стволовых клеток Казанского Государственного Медицинского Университета»).
Компания имеет богатый опыт по строительству БСК; их техническому и
коммуникационному оснащению, соответствующему международным стандартам и
стандартам GMP; получению разрешительной документации; решению вопросов
согласования с вышестоящими организациями; оснащению специальным оборудованием
для получения и хранения стволовых клеток ведущих мировых компаний-производителей
в области клеточных технологий; поставке стерильных, одноразовых расходных
материалов; установке лабораторных комплексов.
Банки клеток, оснащением которых занимается компания «ИМТ», включают в
себя следующее оборудование для получения, закладки и хранения образцов стволовых
клеток:
- для получения стволовых клеток используется
программируемый клеточный сепаратор Sepax ("Biosafe", Швейцария),
осуществляющий свою работу в рамках 8 протоколов, и позволяющий
проводить быстрое и полное разделение клеток в закрытой, стерильной
системе. С помощью аппарата Sepax можно выделять стволовые клетки
из пуповинной и периферической крови, а так же из костного мозга;
- для подготовки образцов к криохранению применяется
аппарат Coolmix ("Biosafe", Швейцария), с помощью которого
происходит охлаждение образца стволовых клеток и
автоматизированное добавление в него криоконсерванта;
- для криохранения стволовых клеток используется
автоматизированная система для хранения в жидком азоте
BioArchive ("Thermogenesis", США), являющаяся полностью
компьютеризированной и позволяющей закладывать на
хранение одновременно 3626 доз стволовых клеток;
- для лабораторных исследований поступающей в БСК
крови и полученных образцов используется целый комплекс
лабораторий, включающий в себя гематологическую
лабораторию, лабораторию группы крови, лабораторию
цитометрии, лабораторию генотипирования, баклабораторию,
лабораторию контроля жизнеспособности клеток,
биохимическую лабораторию, ИФА лабораторию и ПЦР
лабораторию.
Данное оборудование установлено в целом ряде ведущих научных и медицинских
учреждений России.
Все оборудование является самым современным и отвечает международным
сертификатам качества. Так, например, автоматизированная система BioArchive является
уникальной, не имеющей аналогов в мире. На сегодняшний день, система BioArchive
успешно используются более чем в 100 странах мира. Уникальность этой системы
заключается в ее особенностях, выраженных в полностью автоматизированном процессе
закладки, хранения и контроля за всеми процессами. Отсутствие промежуточного дьюара
и наличие двух программных замораживателей позволяет предохранить образец
стволовых клеток от малейших температурных колебаний, а также контролировать
процесс равномерного поэтапного замораживания образца, что обеспечивает его высокое
качество и высокую степень выживания клеток после разморозки.
Компания «ИМТ» осуществляет продажу оборудования, его инсталляцию,
обучение персонала, а так же оказывает информационную и техническую поддержку.
Клиентами компании являются БСК, станции переливания крови, онкологические
клиники, лечебно-профилактические учреждения, отделения акушерства и гинекологии.
ООО «Сигма-Алдрич Рус»
SIGMA-ALDRICH
дочерняя фирма корпорации СигмаАлдрич
Ул.Макаренко 2/21, стр. 1, №22
105062, Москва, Россия
Телефон: 7(495) 621-5818/6037/5923
Факс: 7(495) 621-5818/6037/5923
E-mail: ruorder@sial.com
Корпорация Сигма-Алдрич (США) является признанным лидером в производстве широкого
спектра биохимических, органических и неорганических реагентов, а также хроматографической
продукции. Производимые нашей корпорацией биохимические реактивы, стандарты и наборы
широко используются в научных исследованиях, в биотехнологии и разработке вакцин, лекарств и
диагностикумов, в химическом и фармацевтическом производстве, в контрольно-аналитических
лабораториях. Более 50 лет корпорация Сигма-Алдрич специализируется на разработке реактивов
и наборов для микробиологии и клеточных исследований и на настоящий момент предлагает
более 85000 наименований
продуктов. Мы предлагаем следующие реактивы для
специалистов, занимающихся исследованиями в области стволовых клеток:
Stemline™ Platform – специальные среды, разработанные для экспансии и мейоза
стволовых клеток.
Prod. #
Product Name
K3136 Keratinocyte Medium Supplement, 100x, BPE-free
S0189
S0192
S9945
S0196
S3194
S1694
Stemline™ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium
Stemline™ II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium
Stemline™ Keratinocyte Growth Supplement
Stemline™ Keratinocyte Medium II
Stemline™ Neural Stem Cell Expansion Medium
Stemline™ T Cell Expansion Medium
Stem Cell Factors – рекомбинантные ростовые факторы для стволовых клеток
Prod. #
Product Name
K0131
Monoclonal Anti-c-kit/SCF Receptor antibody produced in mouse clone K44.2, purified
immunoglobulin, buffered aqueous solution
SCF Soluble Receptor human >95% (SDS-PAGE), recombinant, expressed in Sf21 cells, lyophilized
powder
Stem Cell Factor from mouse recombinant, expressed in Escherichia coli, powder, cell culture tested
Stem Cell Factor human recombinant, expressed in Escherichia coli, powder, cell culture tested
S2437
S9915
S7901
Hematopoietic Cytokines-группа цитокинов, регулирующих и стимулирующих
клетки кроветворения
Prod.
#
Description
Prod.
#
Description
E5627 Erythropoietin (EPO), Human, recombinant
G5035
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating
Factor (GM-CSF), Human, recombinant
F3422
FLT-3/FLK-2 Ligand, Human, recombinant
G0282
G0407
Granulocyte Colony-Stimulating Factor (GCSF), Human, recombinant
Granulocyte Colony-Stimulating Factor (GCSF), Mouse, recombinant
I1646
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating
Factor (GM-CSF), Mouse, recombinant
Interleukin-3 (IL-3), Human, recombinant
G8160
Stem Cell Supplements – специальные саплементы для кератиноцитов
Prod.
#
Description
S9945 Stemline™ Keratinocyte Growth Supplement With bovine pituitary extract (BPE) and CaCl 2, For use with S0196,
Stemline® Keratinocyte Medium II
S0196 Stemline™ Keratinocyte Medium II Without L-glutamine, calcium-free, with HEPES, Sodium Bicarbonate, and
phenol red, sterile-filtered, Serum-free culture medium, requires supplementation
Stem Cell Books– техническая литература по стволовым клеткам
Полный список реактивов для культуральных исследований: аминокислоты,
сыворотки, антибиотики, ростовые факторы, витамины и т.д.
Пластик Corning® по специальным ценам.
В России корпорация осуществляет свою деятельность через ООО «Сигма-Алдрич Рус» дочернюю компанию корпорации Sigma-Aldrich, созданную в 1998 году для поставок химических
реактивов и лабораторного оборудования на Российский рынок. ООО «Сигма-Алдрич Рус»
работает по рублевым и валютным заказам с российскими предприятиями и организациями
любого направления деятельности, а так же международными грантующими организациями
(МНТЦ, АФГИР и т.д.). Специалисты ООО «Сигма-Алдрич Рус» готовы выполнить любой Ваш
заказ, рублевый или валютный, бесплатно доставить его по указанному Вами адресу с
соблюдением температурного режима, предоставить информацию о существующих скидках, а
также оказать Вам консультативную и техническую поддержку (предоставление сертификатов
анализа, сертификатов происхождения, карты безопасности и т.д.).
Офис ООО «Сигма-Алдрич Рус» расположен по адресу: 105062 Москва, ул. Макаренко, д.2/21,
стр.1, оф.22. Здесь Вы можете получить каталоги корпорации, дополнительную имеющуюся
литературу и консультационную поддержку, а также пройти обучение по E-Сommerce - системе
электронного оформления заказов через Интернет. Запросы можно посылать по электронной
почтой на адрес: ruorder@sial.com или по факсу: (495) 621-5818/6037/5923
.
Телефоны офиса: (495) 621-5818/6037/5923
Интернет-сайт: www.sigmaaldrich.com
The obtaining of cellular culture from the osseous marrow stroma and hyaline
cartilage for hondroplasty.
Kotelnikov G.P., Volova L.T., Tyumina O.V., Lartzev Yu. V., Volchkov S.E., Kulagina
L.N., Klementenko Yu.A.
Samara State Medical University Clinical center of cellular technologies
The problem of hyaline joint cartillage regeneration in patients with degenerativedistructive osteoarthritis is extremely urgent because the complex of therapeutic and existing
surgical methods fails to reach positive effect. The employment of the latest developments in
biology and medicine – cellular technologies seems to be very important and promising.
The Objectves. The develoment of new approaches and operations with the application of
biological metarial in order to provide reparative hondrogeneses in case of joint cartillage tissue
impairment and distruction.
One of the main priorities of the complex investigation carried out in Cebtral Scientific
Research Laboratory and Traumatological and Orthopedic Department of SamSMU together
with “Clinical Center of Cellular Technologies” is the obtaining of cellular cultures from the
osseous marrow stroma and hyaline joint cartillage for their subsequent autografting into the area
of destroyed cartillage tissue in experimental animals.
The experiments were carried out on the rabbits (18 animals) of Shinshilla breed,
weighing 3 kg, of both sex groups. The animals were devided into 2 groups. The animals of the
first group (8 rabbits) underment limbs bone and iliac bone punctions to obtain bone marrow. In
the second subgroup (10 animals) the knee joints were dissected and cartillage fragments were
obtained from different parts of the cartillage surface of the tibia. All the animals were kept in
vivarium, the experiments on the animals were carried out under general anasthesia following the
standards of asepsis and antiseptics in Central Scientific Research Laboratory of SamSMU.
In the process of cultivation we used the media a-MEM, DMEM or 199 (“Biolot”) with
the suppliment of 10% of fetal beef serum, inverted microscopes Carl Zeiss Axiovert 40 and
Biolam P-2-1, hemoanalyser Pentra-60, thermostats and CO2-incubators produced by Sanyo
company (Incubator MIR-262), laminar boxes with vertical air stream with second class
protection.
The cells were cultivated under standard conditions under the temperature of 37oC in
plastic culture bottles with ventilated covers Orange Scientific (production of Belgium) with the
surface of 75 cm2 and Corning (USA production) with the surface of 25 cm2.
Morphological evaluation of the state of native cellular culture was performed daily for
the period of one month. Then the culture was fixed and stained according to RomanovskyGimza.
We have developed the technique of obtaining of bone marrow in animals (rabbits). Bone
marrow aspiration was performed by means of a needle and a 5 ml syringe. Up to 1.5 ml of bone
marrow was aspirated from the iliac bone. Nuclei-containing cells were obtaned by two ways:
by erythrocyte lysing with subsequent washing and by gradient centrofuging (Ficoll, “Biolot”).
After that nuclei-containing cells were desseminated on the plastic plates. By the third week of
cultivation the foci (colonies) of fibroblast-like cells appear, which compared with dermal
fibroblasts are much bigger. They have short processes and a large nucleus. These structural
cellular formations in the culture (in vitro) demonstrate marked adhesive properties to the surface
of the plastic bottles. The cells maintain their vitallity during one month.The culture of
hondroblasts was obtained from hyaline cartillage following the modified technique of primary
explants. In 15 days the peripheral part of the cartillage tissue was analysed for the reticular
fibrillar structure, then very tiny circular cells with the nucleus located in the center of dark
colour appeared. The cells in the culture grew in the form of a layer. In 30 days the prolifiration
of precursor cells raised and the number of lines of large differentiating cells increased
considerably. They were circular cells with the nucleus located in the center (hondroblasts).
The current investigation has the status of preliminary and demands further thorough
analysis of cultures obtained with the application of phenotyping method in vitro.
The algorythm used in cells’ cultivation, the source of which is the hyaline cartillage
tissue, makes it possible to obtain hondroid material in the form of a layer. In case of bone
marrow used as a source of cellular cultures, the process of cultivation forms the colonies of
fibroblast cells.
Synthetic and natural biomaterials - 3d matrix for autologous multipotent
mesenchymal stromal cells (MMSC) culture in a bone defects repair experiment
Sergeeva N.S.1, Sviridova I.K.1, Reshetov I.V.1, Barinov S.M.2, Frank G.A. \ Tepljakov
V.V. \ Kirsanova V.A.1, Akmedova S.A.1, Agzamov D.S.1, Filjushin M.M.1, Komlev
B.S.2, Fadeeva I.V.2, Kozlov B.B.1, Bukharov A.B.1, Khesuani Yu. D3.
1
2
-Moscow Herzen Research Oncological Institue,Russian Federation
-Institute for Physicochemical Problems of Ceramic Materials Russian Academy of Sciences
Faculty of Basic Medicine, Moscow State University
An effective way to deliver multipotent mesenchymal stromal cells into a lesion is relevant in
treatment of cardiovascular, musculoskeletal, neurologic and other diseases. In oncology MMSC are
perspective to repair bone defects of different configuration and size. However, it is showed (by
personal experience and an analysis of literature) that simply introducing MMSC into the lesion
does not bring therapeutic effect due the fast elimination of these cells. A potential solution is to use
nontoxic, biocompatible frame 3D structures for MMSC culture, that can provide optimal conditions
for adhesion and expansion of immobilized cells and also promote a full integration of the implant
into the surrounding tissue. That is why, the development of 3D materials - matrixes for cell
cultures (including stem cells) is very a relevant problem nowadays.
Objectives. Biomedical in vivo and in vitro study of porous granulated nanostructured calcium
phosphate be-phase and substituted bioceramics and a natural coral Acropora cervicornes to
determine there usability as 3D matrixes for autologous MMSC culture; using the most potent
samples in a bioengineering construction (3D matrix with immobilized MMSC) to replace bone
defects in experimental animals.
Materials and methods. Investigating acute toxicity of the materials (24 hour incubation) and their
matrix qualities (3, 7, 10, 14, 17, 21, 28 days of incubation) was performed during in vitro
experiments on immortalized human fibroblasts (HF). An MTT-test was used to evaluate the cells'
vitality/proliferation during cultivation. The biocompatibility was evaluated using in vivo
experiments with female BDFj mice who had the materials injected under their skin (after 1, 2, 4
weeks and 3, 6 months). Light microscopy was used as an evaluation method. Two experimental
models: female Wistar rat shin osteotomy and segmental resection of sheep tibia were used to
investigate the effectiveness of bioimplants (bioceramic and natural coral implants, respectively)
independently and as a part of bioengineering construction with MMSC from bone marrow. The
dynamics of the rats bone defect repair was controlled by X-ray and a morphologic examination
(after 4,8,12, 16,24 weeks) additionally. Sheep were given a triple X-ray examination: before the
operation (to determine the size of the implant) and 1 and 4 months after the operation. After an
euthanasia the animal's femur was sawcut in fragments which were histologically examined.
Results. In vitro experiments were carried out to investigate acute cytotoxicity of 10 types of
porous granulated calcium phosphate ceramic samples: bi-phase materials based on hydroxyapatite
(GA) and tricalcium phosphate (TCP) with different components ratio, carbonate- and silicon
substitute hydroxyapatite bioceramics (CSHA and SSHA), composite materials TCP alpha - TCP
beta, pure TCP beta and natural coral Acropora cervicornes. It was showed that all samples were
not cytotoxic: after 1 day of cultivation 80-90% of human fibroblasts attach and spread on the
materials' surface. Matrix qualities of these materials were evaluated based on their capability to
support active cell growth and proliferation during joint cultivation. It was discovered that all
samples (except composite TCP alpha - TCP beta ) had marked matrix qualities - during the
observation the HF pool increased 7,5-9,0 times vs 5,0 in control ( on cultural plastic polystyrene).
Transplantation of HA, HA-TCP, CSHA, SSHA and natural coral subcutaneously in mice did not
cause an inflammatory reaction from the surrounding tissue, thus the materials were biocompatible.
An osteoinductive potential of different extent was discovered during dynamic observation
of rat shin defect repair using bioceramic implants HA-TCP, SSHA and TCP beta without stem
cells and in a bioengineering construction. Ossification between the granules in the defect zone
begins as early as 3 weeks after the operation. At the 6th week, the repair progresses and a
periosteum is formed around the granules in the surface part of the defect. Resorption of
biomaterials takes place simultaneously, notably with TCP beta. At the 12th week the bioceramic
granules (except SSHA) were fully resorbed and replaced with mature bone tissue with osteon
formation. Using a bioengineering construction in the defect zone leads to earlier forming of
ossification focuses and minimum a week earlier repair of the bone defect. The speed of
bioresoption and osteoinductive qualities of the studied materials increases from SSHA to HA-TCP
and to TCP beta.
The bioengineering construction consisting of natural coral Acropora cervicornes, saturated
with autologic MMSC culture proved to be the most effective in repairing an extensive sheep femur
defect. A marked osteoinductive effect of this construction was discovered comparing to control
(coral implant without cells): 5 months after a segmental resection of a sheep femur there was full
consolidation of the coral with the surrounding tissue. Histologically, active osteogenesis with
mature osteons and simultaneous resorption of the coral was discovered.
Thus, synthetic calcium phosphate bioceramic materials HA-TCP, TCP beta and natural
coral Acropora cervicornes can be viewed as a perspective immobilization and directional delivery
system of MMSC in bone defects repair.
Effect of autologous mesenchymal stem cells on reparative processes in the
nervous tissue in a rat model of diffuse traumatic brain injury
Yuzhakov V.V., Konoplyannikov A.G., Tsyb A.F., *Roshal’ L.M., *Sushkevich G.N.,
*Semenova Zh.B., Bandurko L.N., Ingel’ I.E., Kal’sina S.Sh., Verkhovskii Yu.G.,
Shevchuk A.S., Tsyganova M.G., Lepekhina L.A.
Medical Radiological Research Center of Russian Academy of Medical Science, Obninsk;
*Institute of Urgent Pediatric Surgery and Traumatology, Department of Public Health of
Moscow
Traumatic brain injury remains to one of serious problems of public health. The nervous
system, unlike many other tissues, has a limited capacity for self-repair. Mature neurons do not
possess the ability to full regenerate, and neural stem cells although they exist in the adult brain,
have a limited ability to generate new functional neurons in response to injury. For this reason,
search of new methods of therapy in traumatic brain injury with use of transplantation of stem
cells is actual. Numerous researches on the given question testify, that necessary plasticity and
therapeutic potential for nervous system mesenchymal stem cells (MSC) from adult bone
marrow possess. According to published reports, MSC transplantation promotes repair of
damaged nervous system and recovery of the neurological status in focal cerebral ischemia and
local brain injury.
We studied the effects of transplanted MSC, obtained by culturing bone marrow cells from
adult body, on functional morphology of neurons and reparative processes in the nervous tissue
of rats after closed craniocereberal trauma. The study was carried out on the brain of 2-monthold male Wistar rats weighing 140-150 g. The animals were divided into 5 groups. Modeling of
the brain trauma carried out by a falling weight. A 50-g weight fell free from a height of 110 cm
in a hollow tube (1.2 cm in diameter) onto the parietal area of animal head. The impact area was
0.5 cm2. The survived animals (about 50% of all affected) were included in compared groups.
The groups were equal in the severity of traumatic brain injury. The severity was estimated by
complex of symptoms and tests during 30 minutes after the trauma. Experimental group 1 (n=16)
consisted of animals with brain injury receiving no treatment. Group 2 (n=10) were animals with
injury receiving basic therapy, including antiedematous, antihypoxic, and anti-inflammatory
drugs. Group 3 (n=10) animals received a single intravenous injection of 2 x 106 MSC suspended
in 0.5 ml saline 24 h after the injury. Experimental group 4 (n=10) rats received combined
treatment, consisting of basic therapy and MSC injection. Control group consisted of shaminjured rats (n=14).
The rats were narcotized with nembutal 1 h, 1, 3, and 14 days after the injury; the brain was
isolated, placed into 10% formalin or 70% ethanol and then cut into two sagittal blocks or 4
frontal fragments at the level of the rostral compartment of the lateral ventricles, hippocampus,
midbrain, and cerebellum. Sections fixed in ethanol were stained with Nissl method (cresyl
violet and thionine). Mouse monoclonal antibodies to PCNA (proliferating cell nuclear antigen)
diluted 1:50 (clone PC10, Calbiochem) were used for immunostaining of proliferation cells.
Histotopographic mapping of damaged areas and precise determination of the levels of coronary
sections were carried out using stereotaxic atlas of the rat brain.
According to our date, the closed craniocereberal trauma causes diffuse damage to the
brain in rats. Primary injury is associated with vascular disorders and traumatic edema peaking
on day 1. The formation of edema leads to ischemic damages of the cortical and brain stem
neurons. The reactive and compensatory-regeneratory mechanisms with initiation of cell
proliferation in neurogenesis zones are triggered during the earliest periods after the injury.
However the regeneration phase is prolonged with slowly running reparative processes in
damaged tissue and cellular structures of the brain. Our results conform with the previous date
indicating that pathological events forming in traumatized adult brain and ischemic injury
stimulate neurogenesis in subventricular zone of lateral ventricles and subgranular layer of the
hippocampal dentate gyrus. In rats receiving basic therapy, the effect on proliferative activity of
cells in vascular plexuses, microglia, and, particularly, ependymal and subepedymal layers was
evaluated only on day 3 after the trauma. After 2 weeks the histological picture of the cortex and
other brain compartments in rats receiving combined treatment virtually did not differ from
normal variants in the control group. However, despite recovery of the neuron morphology, there
were still some local foci of cell proliferation and elevated activity of neurogenesis zones in the
cortex, corpus callosum, and diencephalons. Hence, by this term no complete recovery of
damaged cell and tissue structures of the brain was attained even in animal receiving combined
basic therapy and MSC injection.
According to our date, the neuroprotective effect of MSC in diffuse brain injury consisted
not only in stimulation of reparative processes during the regeneration phase in general (rapid
restoration of Nissl substance in neurons, acceleration of gliogenesis and angiogenesis), but also,
presumably, activation of the germinative zones of neurogenesis. Analysis of published date
suggests that the therapeutic effect of MSC in nerve tissue damage can be realized by several
pathways. First, some date indicate that after migration into damaged nervous tissue MSC start
expressing neuronal and astrocytic markers and the possibility cannot be excluded that they
replace dead cells. Second, it seems that MSC expression products stimulate not only nervous
stem cells, but also vascular endothelium. Moreover, MSC activate cells additionally expressing
growth factor in the brain. So, it was found that the neurotrophic factors expressed by glial cells
promote the survival of neurons and their recovery after injuries or injury-induced degeneration.
According to our date, trauma-induced proliferation of glial cells is potentiated by basic therapy
and activated by MSC injection. Presumably, by reducing the development of edema and
restoring the microcirculation, basic therapy promotes more rapid delivery, accumulation, and/or
migration of MSC to the damaged brain areas.
Hence, comparative analysis of the results indicated that systemic injection of
mesenchymal stem cells in a syngeneic organism produced proliferotropic, angiogenic, and,
presumably, neurotrophic effects. Indirect date indicate that during nervous tissue regeneration
MSC activate cell proliferation in neurogenesis zones. The therapeutic effect visually manifested
on day 2 after intravenous injection of MSC. The activating effect of MSC is potentiated by
basic therapy. Presumably, combined treatment of total diffuse brain injury, including metabolic
support and intravenous injection of MSC, create prerequisites for activation of the mechanisms
of compensatory adaptive processes during the reparative regeneration period and for
improvement of nervous tissue trophics, essential for restoration of functional morphology of
damaged neurons. These results are in line with conclusions of other authors on the positive
therapeutic effect of MSC in brain injury.
A change in gene expression during differentiation of human multipotent
mesenchimal stromal cells of bone marrow and adipose tissue to cells of bone
tissue.
Savchenkova I.P., Rostovskaya M.S.1, Chupikova N.I.1, Dyakonov L.P.,
Teplyashin A.S.1
All-Russian Kovalenko’s Institute of Experimental Veterinary, Russian Agricultural Academe
Science, 109428, Moscow, ul. Ryazanskei pr. 24/1, Russia
1
Institute of Stem Cell, Kuznetskei Most, 17/1, Russia
There were reports on isolation from an adipose tissue of a cellular population with a
phenotype similar BM MMSC and the capacity to differentiate toward osteogenic, chondrogenic,
adipogenic lineages. Up to date the factors inducing differentiation of MMSC in cells of bone
tissue are well enough studied. Works on modeling osteogenesis, both in a monolayer, and in
three-dimensional structures, i.e. on matrixes carriers are intensively conducted. MMSC,
subjected to differentiation in vitro in cells of bone tissue represent convenient model system in
vitro for studying the events occurring in osteogenesis at a molecular level.
The purpose of our research was to compare potency of ММSC, isolated from a bone
marrow and adipose tissue at induction of differentiation in cells of bone tissue in vitro at the
level of gene-markers expression of bone formation: osteopontin (ОP), osteocalcin (ОC) and
bone sialoprotein (BS).
In our experiments human BM MMSC and AT MMSC were used. Cells were analyzed
using a fluorescence-activated cell sorter FACS (Epics Elite Cоulter). The mАbs used in our
experiments, were against the 23 human antigens (Аg) “Becton Dickinson”. As secondary Abs
were used goat anti-mouse IgG, labeled PE obtained from the same producer. For induction of
differentiation to cells of bone tissue MMSC were sowed in plates (d-10 cm) in the concentration
5 103 cells/cm2.. Osteogenic media was DMEM-LG, supplemented with FBS (10%),
dexamethasone (10-7 M), -glycerophosphate (10 mM), and ascorbic acid (0.2 mM) (Reyes et
al., 2001). In 14, 21 and 28 days after the beginning of induction a part of cells stained on von
Kossa and Alizarin Red S solution, and a part of cells in parallel used for isolation of RNA. As
the control the cells growing without inductors have been used. Total RNA was prepared
following standard protocol provided by manufacturer SV Total RNA Isolation System
(Promega). Concentration of isolated RNA was determined by measuring transmission density at
length of wave 260 nm by formula (1OD=40µg RNA/ml). RT-PCR reaction was conducted in
10µl volume aliquots.
PCR amplification of the cDNA was performed using primer pairs designed to the
following genes: (F=forward oligo, R= reverse oligo) osteocalcin (OC) - F=5’ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3’and
R=5’-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3’
(Caterson et. аl., 2002); osteopontin (OP) - F=5’-ACCCTTCCAAGTAAGTCCAAC-3’ and
R=5’-AGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’ (BC093033 GenBank); bone sialoprotein (BS) II
type- F= 5’-AAGGGCACCTCGAAGACAAC-3’ and R= 5’-ACCATCATAGCCATCGTAGC3’ (NM_004967 GenBank); GAPDH - F=5’- GGGCTCCTTTTAACTCTGGT-3’and R= 5’TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3’(Caterson et. аl., 2002).
Previously we had been isolated and characterized cells with a phenotype similar MMSC
from adult human BM and AT (Teplyashin et al., 2005). MMSC isolated from BM and AT were
positively stained with Abs for the СD10 (78.5 % и 79.4 %), CD13 (99.0 % и 99.5%), CD29
(98.7% и 98.8%), CD44 (98.1% и 98.6%), CD49a (89.9 % и 69.2%), CD49b (90.1 % и 96.8%),
CD54 (39.9 % и 91.4%), CD71 (88.1 % и 85.1%), CD73 (99.6 % и 99.2%), CD90 (99.2 % и
99.2%), CD105 (99.5 % и 97.4), CD166 (99 % и 97.9%), HLA ABC (99.4 % и 99%)
correspondingly. These cells were negative for CD34 (0.3 % и 3.2%), CD45 (0.1 % и 1.2%) и
CD133 (0.9 % и 1.6%) – hematopoietic markers, СD31 (0.5 % и 2.3%) - endothelial cells
marker, as well as HLA DP (2.3 % и 1.85%), HLA DQ (0.3 % и 1%) accordingly. 7% of BM
MMSC were positive stained for receptor of stem cell factor c-kit (СD117), and 1.2% for AT
cells. The comparative analysis of the cells isolated from BM and from AT, has identified
significant difference in quantity of the cells positively stained for α4 integrin (CD49d) and a
molecule of cellular adhesion VCAM (CD106). The similar distinctions observable in our
experiments have been described also by other researchers (De Ugarte et al., 2003). Interesting
there was a fact, that these two cell populations were negative on STRO-1, expression which, as
is known, is characteristic for stromal cells of BM with osteogenic potential.
At culturing in the osteogenic medium, morphological changes in the cells isolated from
BM, observed on the 14th day while in cells isolated from AT, these changes have been found
out only on the 28th day of induction. The visual estimation proved to be true staining of
experimental samples with Alizarin red and by von Kossa.
Owen has described the developmental sequence of bone, which consist of three phases:
proliferation with matrix secretion, matrix maturation, and matrix mineralization (Owen et el.,
1990). Each phase is characterized by the expression of different genes. OP is early marker that
is expressed bimodally, with an early peak during the proliferative phase and another after initial
mineralization of the extracellular matrix. The early peak has been immunolocalized to the preosteoblastic cell stage (Yao et al., 1994). The analyses of gene expression during differentiation
of MMSC to cells of bone tissue has detected that cells isolated from BM were positive for OP at
14 day both control and experimental groups. As against, OP was not present in AT MMSC
culturing in medium without inductors. OP was present in AT MMSC subjected differentiation
at 14 days culturing. The final stage of progenitor cell development into the osteogenic lineage is
matrix mineralization. Numerous markers have been described which are specific this stage,
including von Kossa staining (Puchtler et al., 1978), OC (Tracy et al., 1990). OC expression
testifies to terminal differentiation of osteoblast. In our experiments OC was detected in BM
MMSC in osteogenic medium at 14 day. Bone sialoprotein (BS) is a late bone marker only
produced by mineralizing cell types (Chen et al., 1992). BS was found in BM MMSC at 14 day
culturing in osteogenic medium. BS was not identified in AT MMSC even 28 day culturing in
osteogenic medium.
In summary, despite of similarity of phenotype of populations isolated from BM and AT
these cells possess different characteristics, including potency to differentiation in a direction
osteogenesis. The comparative analysis of gene expression: osteopontin (ОP), osteocalcin (ОC)
and bone sialoprotein (BS) in RT-PCR reactions, has detected essential distinctions in potency of
these cells to differentiation in cells of bone tissue. BMMMSC are more perspective source at
modeling a bone tissue in vitro.
Pharmacological regulation of endogenous stem cells.
Gol’dberg E.D., Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zuyz’kov G.N., Epshtein O.I.
Institute of Pharmacology of RAMS SD TSC
Manipulations with stem cells, based on principles of imitations of their natural
functioning in the organism, can make up, on our opinion, rational method to decision of
regenerative medicine problems. Convenient way of stimulating recovery of different organs and
tissues from resident stem cells seems to be pharmacological activation of their functions. In
one’s turn, the creation of noninvasive methods of cellular therapy isn’t possible without
extending knowledge about regularities of progenitor elements role in the development and
resolution of pathological processes.
The aim of this work was studying the role of mesenchymal stem cells of different
classes in the development of pathological processes and perfection of pharmacological
stimulation methods of their mobilization and differentiation in tissue-specific precursors on the
models of some widespread diseases.
Functional and morphological states of damaged organs were studied in mice and rats on
different days after reproduction of myocardial infarction, toxic hepatitis, diabetes mellitus,
hypoxic encephalopathy or injuries of skin and administration of substances, influencing on stem
cells. It was determined the content of multipotent mesenchymal stromal cells and committed
fibroblast precursors in bone marrow and peripheral blood. Moreover, the number of local
precursors in myocardium, liver, pancreas, brain or region of skin wound was evaluated.
It was established, that the development of pathological processes is accompanied by
activation of primitive and more mature mesenchymal precursors in bone marrow, which is
insufficient in most cases for their mobilization in the peripheral blood or for elimination of
suppressing effects of toxic agents on organs-targets. The stimulation of stem cells by
granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) resulted in more early or more expressed increase
of mesenchymal precursors content in bone marrow and peripheral blood. Also, the number of
local precursor-cells in regenerating parenchymatous organs was raised. At that, regenerating
organs showed decreasing extent of developed conjunctive tissue or infiltration degree and
increasing part of tissue-specific structures. The epithelization of wound on the model of skin
flap was accelerated. It was found, that mobilizing action of G-CSF is based on weakening of
binding capacity of progenitor elements with microenvironment cells, but not with intercellular
matrix. Analogical ability to mobilization of stromal precursors and intensification of recovery
processes of damaged organs was revealed in drug of super-small doses antibodies to G-CSF,
stimulating the production of endogenous G-CSF. Additional administration of hyaluronidase to
G-CSF enhances mobilizing effect of cytokine in respect of mesenchymal precursors.
Distribution of Rhenium-188-labelled mesenchimal stem cells cultured from
human bone marrow after systemic transplantation to mice.
Konoplyannikov А.G., Petriev V.M., Kalsina S.Sh., Lepechina L.А., Semenkova I.V.,
Аgaeva Е.В., Кonoplyannikova О.А., Smoryzanova О.А., Тerchova Т.V.,
Skvortsov V.G., Tsyb А.F.
Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk
Now systemic (intravenous) transplantation of great deal mesenchymal stem cells (МSС)
is considered as a perspective method of cell therapy of some human diseases associated with
cells damage or loss in different vital organs and tissues. It is stipulated by a capability of МSС
to go from blood in different organs and tissues, however, of regularity of initial distribution and
subsequent reallocation systemic grafted МSС on organs and tissues are studied now
unsufficiently.
Therefore in our study the attempt was made to evaluate these of regularity during
xenogenic transplantation of human MSC (approximately 15 millions of cells on kg of body
weight) to laboratory mice. Produced in cell culture МSC from 5 passage has been labeled with
using the eluate of rhenium-188 by the way perrhenatosodium (Na Re188 O4), obtained from the
generator W188/Re188. After labeling 0,5 million МSС (general radioactivity of cells for injection
into animal made near 2,4 microCu) has been injected intravenously into white noninbred
multiplied mice (initial line was Swiss), male, with weight 26-30 g. After i/v injection
radioactive labelled human МSС these mice were sources of different tissues for radiometry 5
minutes, 3, 24 and 48 hours after injection. In these time points we prepared samples from blood,
thyroid gland, lung, liver, kidney, heart, spleen, stomach, brain and femoral bone for radiometry
of tissues and estimation of the fraction of radioactive МSС contained in analysed tissues
(possible accumulation in tissues disconnected with МSС rhenium-188 could be only rather low
because of strength of binding of this isotope with МSC, and also low radioactivity of the thyroid
gland, which one is capable to accumulate free rhenium-188). On each time point we used on 4
animals.
It was revealed that radioactive radiometry МSС fast escape from blood, even at 3 hours
after injection of radioactivity into blood with allowance for of decay of isotope (the time of
half-decay for this radioactive isotope makes 16,7 hours) it decreases in 14 times, and through 24
and 48 hours after injection - more than in 50 times. In early time of observation (5 mines after
injection) the greatest radioactivity was measured in lung, kidney, and liver. Then the
radioactivity of lung was steadily reduced, and for liver and kidney after decreasing 3 hours after
cells injection, it was stabilized on rather high level (approximately 30-50 % from initial).
The organs of special interest for realization of cell therapy, namely heart and brain at a rather
low original level of incorporation of radioactive label on 24-48 hours similarly to liver and
kidney are stabilized on the level of radioactivity component not less of 50 % from original level.
Thus, usage of radioactive labeling of МSС with using of rhenium-188 show intake and
retention of this type of stem cells in organs that represent considerable concern for cell therapy.
Simultaneously, the estimations of uptake level of cells in “target” organs and tissues made by
this method are a rather relevant padding material that is indispensable for assessment of МSС
number during planning and realization of cell therapy.
PETROV V.N., KONOPLYANNIKOV А.G., LEPECHINA L.А.. KALSINA S.Sh.,
SEMENKOVA I.V., AGAEVA Е.V., KONOPLYANNIKOVA O.А.
SI Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk, Russia
It is known, that the mesenchymal stem cells (MSC) have unique immunomodulatory
properties, among other manifestation which there is an ability of MSC to loosen the activity of
effector cells in hemopoietic and immune systems during MSC-transplantation in allogenic or
xenogenic organism. In our work with use of MSC obtained during cultivating of bone marrow
cells from Wistar rats and from human donor without hemopathy, and also with application of
conditioned media (СM) from MSC cultures we studied the inhibition action of inherent and
xenogenic cells on the level of chemiluminescence for rats peritoneal macrophages and for
human peripheral blood neutrophils (not syngenous with MSC). We mixed suspensions of MSC
with suspensions syngenous, allogenic and xenogenic effector cells or with different CM
dilutions and evaluated the level by own and luminol-induced chemiluminescence of these cells.
In these studies it was revealed that as in syngenous, and allogenic combinations of MSC (or
СM from MSC cultures) with effector cells can be shown inhibition own and induced
chemiluminescence of effector cells determined, as is known, with its ability to produce the
reactive oxygen species.
The level of chemiluminescence inhibition depended, first of all, on concentration ratio of
cells in received mixtures (or from MC concentration in suspension of effector cells), and was
determined by character of genetic interrelation of blended cells a little. The freezing of СM
with the subsequent defrosting or heating to temperature 600 C within 20 minutes did not loosen
its inhibitor activity concerning the level of chemiluminescence for effector of cells.
Thus, it is possible to get the conclusion that MSC are capable to release in its environment
(during cultivating, after mixing with effector cells, and also, probably, during transplantation in
organism of syngenous, allogenic or xenogenic host) products, which can inhibit ability of
effector cells of hemopoietic and immune systems to produce reactive oxygen species. It seems
reasonable to say that the estimation of inhibiting chemiluminescence ability of MSC and СM
will be possible to use as quantitative criteria of biological activity of MSC and its life products
in cell therapy of some forms of diseases.
Acetylcholine regulation of pluripotent hemopoietic stem cells proliferative
activity is NO-depended
Konоplyanniкоv А.G., Коnоplyanniкоvа О.А.
SI Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk, Russia
More than 30 years ago J.W. Byron has shown that the resting pluripotent hemopoietic
stem cells (HSC) in conditions in vivo and in vitro can be trigger in active proliferation by action
on one of the 3-rd groups of receptors: 1.cholinergic; 2. β-adrenergic; 3. steroid hormones. The
special attention J.W. Byron was attracted by the capability to start of HSC proliferation in vivo
after treatment by neostigmine, agent that inhibited activity of acetylcholinesterase in synaptic
gaps. In this case acetylcholine can be retained and triggered transition of resting HSC in active
proliferation. It has been shown that the stimulating effect of neostigmine on stem cells
proliferation was reached only in conditions in vivo, but not after its addition in bone marrow
cells suspension, i.e., this action requires preservation of “microenvironment” of this type of
stem cells, which one should actuate units of a nervous innervation of tissues. It was possible to
suspect, that with the help of “neostigmine models” are convenient for studying effects of
controlling proliferation for stem cells through a nervous system, but the further researches in
this direction were stopped. We have returned to this experimental model ground of following
reason - many responses in nervous cells are NO-depended and followed whether to test is
acetylcholine stimulation of HSC proliferation NO-depended.
The experience were conducted with usage of the method of exogenous spleen colonies
in which one the contents of HSC in bone marrow of experimental mice-donors was determined
on the level of CFU-S-8 (spleen colony-forming units that produced colonies in spleen of lethal
irradiated mice-recipients on 8th day after intravenous injection of standard portions of bone
marrow cells from mice-donors treated or not treated by neostigmine /0.3 mg/kg/, different
inhibitors of NOS and cell phase-specific agent - hydroxyurea /300 mg/kg/). As experimental
mice we used of hybrids F1(CBAxC57Bl/6), male, 3 months old. About increase of the
proliferation level in CFU-S-8 of bone marrow in mice-donors treated by neostigmine separately
or together with NOS-inhibitors 4 hours before isolation of femoral bone marrow we can be
judged by change of CFU-S-8 survival after additional treatment of mice-donors of bone marrow
cells by cell phase-specific agent - hydroxyurea 2 hours before isolation of bone marrow cells
for testing its survival by method of exogenous spleen colonies. Mice-recipients of bone marrow
cells one day before i/v injection of cells suspension we irradiated in lethal dose of Co60 gammarays (9 Gy, apparatus “Luch”, dose rate was 50 сGy/min). In each group of the donors were 3
mice, and in each group of recipients were 12 mice.
In the first series of our studies the data J.W. Byron were reproduced, as we discovered
increase of hydroxyurea induced CFU-S-8 loss approximately on 30 % for mice treated by
neostigmine as contrasted to by mice, which one did not treated by it. The level of CFU-S-8 loss
for the mice, treated by hydroxyurea, as contrasted to CFU-S-8 from mice not treated by
hydroxyurea was increased less than on 5 %. After injection in mice-donors of tested bone
marrow neostigmine together with nonspecific inhibitor NOS - L-NAME (250 mg/kg) or
selective inhibitor of neuronal NOS - 7-nitroindazole (25 mg/kg) we have found out
considerable suppression of neostigmine action on the CFU-S-8 proliferation rates without action
of these inhibitors on level of this type of stem cells in mouse bone marrow.
Thus, in our study has been received the experimental proof of implementation in vivo
conditions of the NO-dependent control of nervous system on activity of HSC
“microenvironment” determining proliferative activity of this type pluripotent stem cells.
Autologic transplantation of limphatic nodes stroma cells culture to control
the secondary lymphedema during the experiment.
Volova L.T, Rossinskaya V.V., Yarovenko G.V.,Gerasimova E.S.
State Educational Institution of Higher Professional Education «Samara State Medical
University»
Secondary lymphedema develops in case of regional lymphatic nodes sclerosis and
atrophy due to chronic inflammatory processes, X-ray therapy, chronic venous insufficiency.
Conventional surgical methods are often lacking efficacy. The search for new methods including
the application of cellular technologies is very actual and promising.
To develop the way of controlling the secondary lymphedema of extremities by means of
transplantation of autologic lymphatic nodes stroma cells culture to experimental animals.
The experiments were carried out on 35 white laboratory rats weighing 120-150 gr.
following the ethic norms obligatory for the work with the experimental animals. Lymphostasis
was caused by removing all groin lymphatic nodes. The removed nodes were used to obtain the
stroma cells culture. 3 months after the operation by which time the secondary lymphedema was
being formed, the rats were devided into 4 series: the rats of the 1st series were injected the
suspension of autologic lymphatic node stroma cells into the groin area of the damaged limb; the
rats of the second series were injected the suspension of dermal fibroblasts; the rats of the third
series were injected 0.2 ml of 0.9% of sodium chloride solution, and the rats of the 4th series
represented the comtrol group. In all cases the dose was 300,000 cells in 0.2 ml of 0.9% of sterile
solution of sodium chloride.
The culture was obtained by the method of primary explants and divided trypsinization.
The cells were being grown in the culture bottles Corning (USA production) with the volume of
25 cm2 under the temperature of 37oC, with 5% content of CO2 in the media MEM and RPMI1640, with 10% fetal beef serum supplement (“BioloT”). We used inverted microscope Biolam
P-2-1, thermostats and CO2-incubators produced by Sanyo company (Incubator MIR-262),
laminar box with vertical air stream with II class protection.
We used the culture of 4-8 passage for the transplantation. The dynamics of extremity
edema was followed-up by the method of volumetry. Cells and tissue cultures verification in the
transplantation area was done by means of morphological methods.
Stroma cells of the groin lymphatic cells in the culture demonstrate adhesive properties to the
surfaces of culture bottles. During the 1-2 passage at the initial stage of growth the cells have the
bodies of polygonal form and 3-5 processes forming anastomoses with the processes of the
neighbouring cells. Starting from the 4th passage the form of the cells becomes more protruded,
the number of their processes does not excede 3. They differ from the fibroblasts in the culture
by being bigger in size (the length of the stroma cell is 67.3±3.1 mcm, and the length of a
fibroblast is 53.1±2.6 mcm; the transverse size is 29±1.9 mcm and 21±2.1 mcm
correspondingly), by more processes at early passages, decreased growth in comparison with the
fibroblast’s growth, the capacity to induce lymphoid tissue formation in case of transplantation
into the groin area.
The edema of the extremity in the operated animal increased for 20 days and became
stabilazed by the 6th week. After autologic stroma cells culture transplantation edema regress
was clearly marked; its dynamics in 10 days was within 7% and 13%. Then in the process of
follow up we registered the further decrease of edema up to 42.6% by the 32nd day and up to
87.6% be the 60th day. Full control was achieved 3 months after the injecting of the cells.
During the morphological examination 3 months after , single big lymphatic nodes with clearly
marked layers (cortical, paracortical medullar) were revealed in such rats. Up to 1.5 months the
nodes were smaller, their number was 2 or 3, with clearly marked cortex layer “smoothed” by
sinuses and medullar layer.
The rats of the 2nd and 3rd series did not demonstrate the edema decrease in the operated
extremity, nor did they have the new lymphoid tissue formation in the area of total removal of
lymphatic nodes.
The transplantation of autologic cells culture of lymphatic nodes stroma enables us to achieve
secondary lymphatic edema control during the experiment due to the formation of a complex of
new lymphatic nodes which have the organotypical structure – these organs play a leading role in
the lymphatic flow restoration in the extremity.
Experimental models of stem cells differentiation into endocrinocytes in mice
exposed to X-ray irradiation
N.A.Belyakov, A.M.Zaichik, A.V.Kayumov, V.M.Mikhaylov, V.B.Serikov
St-Petersburg Medical Academy of Post-Graduate Studies affiliated to Federal Agency on Health
Careand Social Development, St-Petersburg
Introduction. At present restoration of functions of different organs has become one of the
crucial problems of medical and biological science. Nowadays certain experience of practical
application of stem cells in different forms of pathology has been accumulated. Biotechnological
application of stem cells has been stipulated by several scientific discoveries of recent years: 1)
stem cells as the target of cancer transformation; 2) tissue specificity of stem cells; 3) stem cells
plasticity phenomenon as the result of transdifferentiation of somatic stem cells of different
tissue specificity. Nevertheless, many basic processes of physiologic regulation of stem cells
specific differentiation remain unclear.
Objective. Studying of stem cells differentiation into endocrinocytes in mice exposed to
X-ray irradiation.
Materials and methods. Two types of experiments were carried out. The first series of
experiments included C57BL/6 mice and C57BL/6 transgenic mice, expressing GFP-protein.
After 5Gr and 7.5Gr irradiation C57BL/6 mice received 7 million bone marrow cells from
C57BL/6 transgenic mice, expressing GFP-protein («green» mice). The second series of
experiments was performed on parabiotic pairs of mice (mdx mice and C57BL/6 transgenic mice,
expressing GFP-protein). In this case mdx mice were exposed to the same doses of irradiation.
Thyroid gland cryostat slices from irradiated mice were fixed by cold ethanol, cellular nuclei were
stained with propidium iodide. Thyroid gland slices were studied using confocal microscope LSM
5 PASCAL. GFP-nature of green signals was confirmed by additional staining of slices with
rabbit anti-GFP-antibodies with CY3-labelled secondary antibodies. The above-mentioned
technique was used for investigation of adrenal tissue slices of irradiated mice.
Results. During 2-3 months after X-ray irradiation chimeric mice revealed separate GFPpositive cells in follicular walls and between the follicles. 10 months after X-ray irradiation ratio
of GFP-positive follicles increased significantly. Coincidence of localization of GFP-signals with
positive staining of thyrocytes and colloid by monoclonal antibodies to thyroglobulin was also
observed. During the same periods functioning endocrinocytes containing fluorescence protein
were also detected in all zones of adrenal cortex.
Conclusions. Bone marrow stem cells take part in regeneration of thyroid gland and
adrenal cortex after X-ray irradiation. Our results may contribute to the elaboration of
regenerative technology of endocrine glands functional activity restoration after structural
lesions.
Ischemic stroke cell therapy in rats
Zinkova N.N., Sokolova I.B., Kruglyakov P.V., Polintsev D.G
"Trans-Technologies", Ltd, Saint-Petersburg
Cell therapy is perspective, modern attempt to ischemic stroke treatment. It has been
being widely discussed recently. We suggest mesenchymal stem cells (MSC) as a cell therapy
agent in the therapy of this disease.
Experiments were carried out in inbred male Wistar-Kyoto rats. Animals were subjected
to middle cerebral artery occlusion (MCAO). MSCs were isolated from rat bone marrow,
expanded in culture and labelled with vital fluorescent dye PKH-26. Then 5x106 cells were
injected into the tail vein on the day of MCAO and three days later. Control group animals
received PBS injection (negative control). Cognitive function restoration was estimated by
Morris Water Maze testing during 6 weeks after MCAO. Animals were sacrificed 1, 2, 3, 5 days
and 1, 2, 4 and 6 weeks after operation.
The obtained material was partially fixed in liquid nitrogen and cryostat sections were used for
estimation of MSC distribution in the brain after MCAO. The other material was
paraformaldehyde-fixed and immersed into paraffin. Sections were made according to standard
protocol. Slides were stained according to Nissl technique and dynamic morphological changes
were studied. We also used immunohystochemical methods for studying of cell proliferation in
subventricular zone (Ki67), angiogenesis (vonWillebrandt factor), reactive gliosis of penumbra
(GFAP). Also a morphometrics of injured area, vessels quantity and undamaged penumbra
neurons quantity was carried out.
It was shown that intravenous MSC transplantation 1,7 times increased survival after MCAO.
Animals from cell therapy group kept abilities to study and it takes them twice less time to fulfil
Morris water maze task comparing to control group. MSC transplantation benefited post-stroke
processes dynamics. Glial scar formation began earlier (on the 5th day in the cell therapy group
comparing to 1 week in control group). Aseptic inflammation also completed earlier in cell
therapy group (2 weeks versus 3 weeks in control group). MSC injection stimulated endogenous
reparative processes. It is known that MCAO lead to angiogenesis activation in penumbra and
neuronal stem cells proliferation in subventricular zone. We demonstrated that in cell therapy
group penumbra vessels quantity was 1,8 times as much as in control group. Also a few layers of
proliferating cells in subventricular zone were revealed in the cell therapy group. On the
contrary, only single proliferating cells were found in the control group animals.
Six weeks after MCAO almost all neurons in penumbra of control animals were dead or had
signs of damage. By contrast, in cell therapy group the majority of neurons was undamaged.
Tissue defect area in the control group was 1,3 times as big as in experimental group.
Reactive gliosis of penumbra and liquor cysts formation can be regarded as post-stroke
after-effects. In the cell therapy group gliosis was substantially less pronounced than in control
group, was localised mainly in the border zone of injured area and did not deform brain tissue
much. Large liquor cysts were formed in the control group animals. In the experimental animals
many small cavities intermitted with cell islets (consisted of endothelial cells and capillaries)
were observed instead of one big cyst.
It should be mentioned that the obtained results concern both MSC transplantation terms:
on the day of MCAO or 3 days after MCAO. The time of transplantation influenced only MSC
distribution in the brain. When cells were injected on the day of MCAO, they were found around
vessels in both hemispheres; visually more cells presented in the damaged hemisphere. In the
case on MSC injection on the 3 day after MCAO single cells were revealed in the subependimal
zone of brain ventricles.
Thus, MSC cell therapy can restore microcirculation in the penumbra, causes neuroprotectory
effect, accelerates post-stroke processes course at early stages (up to 3 weeks), and activates
endogenous stem cells proliferation. All these processes can be regarded to as limited reparation
of brain tissue. In contrast to modern neuroprotectory and angiogenesis-stimulating medicines,
which maximum effectiveness can be achieved if the treatment was started not later than 2 days
after ischemic episode, cell therapy can be effective even if the transplantation was carried out 4
days after the stroke.
We are planning to continue studying of cell therapy effectiveness on more late terms
after stroke.
Monitoring the changes of stem cell level in peripheral blood in patients with
myocardial infarction
Smolyaninov A.B.1, Aryev A.L.2, Kirillov D.A.1, Kovanko G.N.2
1
Center of Cell and Gene Therapy. Stem cell Bank «POKROVSKI».
2
Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate Studies
The major possible mechanisms of cellular regeneration in myocardial infarction (MI)
include mobilization of circulating stem cells to the lesion, local proliferation of precursor cells
in response to injury and injury-induced proliferation of cardiac myocytes. Ischemic injury
causes discharge of cytokines from the lesion. These cytokines include vascular endothelial
growth factor-2 (VEGF-2), stromal cell-derived factor-1 (SDF-1), insulin-like growth factor-1
(IGF-1), stem cell factor (SCF) and others. These cytokines bind with their receptors (VEGFR-2,
CXCL12, IGF-1-R and c-kit (CD-117) correspondingly), and release of stem cells (SC) from
bone marrow and their homing to the lesion site. SC mobilized this way are capable of
differentiation into cardiac myocytes and they take part in myocardial regeneration including
their possible role in neovascularization and paracrine interactions in regenerative processes.
The goal of this work was to study the level of SC in peripheral blood of patients with MI
to determine its prognostic value.
Changes of the blood SC level were measured by flow cytometry with the use of the
«Becton Dickinson» FACScan flow cytometer with triple combination of direct monoclonal
antibodies CD34FITC/CD38 PE/CD45 PerCP. We measured blood content of cells with
immunophenotype «CD45+CD34+CD38+» and «CD45+CD34+CD38-». The mean patient age
was 681.4 years. The level of SC was studied in 30 MI patients on day 1, 9 and 15 from the
disease onset; the patients received standard treatment. Fourteen patients were diagnosed with Qwave MI and 16 patients – with non-Q-wave MI. The diagnosis was confirmed by ECG changes
and biochemical markers of myocardial necrosis.
The level of SC in peripheral blood of patients with Q-wave MI on day 1 amounted to
«CD34+CD38+»-0.070.02%, «CD34+CD38-»-0%. In non-Q-wave MI the level of SC in
peripheral blood on day 1 amounted to «CD34+CD38+»-0.150.02%, «CD34+CD38-»0.020.001%. On day 9 in patients with Q-wave MI the level of SC amounted to
«CD34+CD38+»-0.130.01%, «CD34+CD38-»-0.100.001%. In patients with non-Q-wave MI
on day 9 this level was 0.050.02% and 0.210.001% correspondingly. By day 15 of treatment it
was «CD34+CD38+»-0.180.01% and «CD34+CD38-»-0.120.001% (p<0.01) in Q-wave MI
patients. In non-Q-wave MI after 15 days of standard treatment the level of SC amounted to
«CD34+CD38+»-0.290.018%, «CD34+CD38-»-0.210.011% (p<0,05).
Thus, patients with Q-wave MI lack SC in peripheral blood during the first day from the
disease onset and only insignificant quantity of SC is found in non-Q-wave MI patients. It is possible
that the lack of SC in Q-wave MI indicates that large myocardial lesion absorbs the entire pool of SC
mobilized from the bone marrow to the peripheral blood. The level of CD34+CD38- SC increased
by day 9 of treatment and remained elevated till day 15 with standard treatment. Mobilization of
ST to peripheral blood was higher in non-Q-wave MI. Content of SC in peripheral blood of MI
patients is an important prognostic factor that correlates with the clinical picture and the course
of the disease. Additional investigation is necessary to determine the connection between the
level pf SC in peripheral blood and the resulting echocardiographic findings pertaining to
myocardial contractility.
Autologous bone marrow cell transplantation for treatment of patients with
liver cirrhosis
Kozlov V.A., Starostina N.M., Paltsev A.I., Ostanin A.A., Leplina O.Yu., Shevela E.Ya.,
Lisukov I.A, Chernykh E.R.
Institute of Clinical Immunology Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences,
Novosibirsk
Currently, orthotopic liver transplantation is the main therapeutic option for patients with
liver cirrhosis – the end-stage of chronic liver disease. However, a shortage of suitable donor
organs, requirement for immunosuppression and high cost restrict its usage. A novel approach
could be offered through the current developments in the field of stem cell biology. Thus, the
potential of bone marrow stem cells to differentiate into hepatocytes open new possibilities for
their use for regenerative liver therapy. The present study was devoted to the evaluation of
tolerance and efficacy of bone marrow cells transplantation in the complex treatment of liver
cirrhosis (LC).
Forty seven patients between 15 and 65 years with a diagnosis of LC were enrolled in the
study. According to Child-Pugh score the present subjects included 12 patients with grade A, 28
– with grade B and 7 – with grade C. Bone marrow was harvested from the ilium by standard
procedure under general anesthesia. Mononuclear cells (MNCs) were isolated by Ficoll density
separation. The mean number of 1.76 ± 0.12 х 107 MNC, consisting 5.8 ± 0.7% CD34-positive
cells, was infused intravenously and into the liver.
No major adverse effects were noted. Autologous bone marrow cell transplantation
(ABMT) therapy in grade A patients resulted in reduction of asthenia syndrome and decrease of
cytolysis (AST and ALT level), enhancement of mean serum albumin level and platelet count.
Besides, abdominal ultrasonographic study revealed portal hypertension decrease (spleen and
portal vein diameter reduction). Significant improved Child-Pugh scores were seen after 1, 6 and
12 months in 18 of 35 patients with decompensate LC (grade B and C). ABMT in this group was
also accompanied with decrease of ALT and enhancement of platelet count in a 1 and 6 months
after treatment.
ABMT is safe and should be considered as a novel strategy for treatment of patients with
liver cirrhosis.
Alpha-fetoprotein (AFP) influence on the biological activity of different
fractions of the mice bone marrow hematopoetic stem cells cultivated Ex Vivo.
Belyaev N.N., Bogdanov A.Yu., Rybakova T.M., Tleulieva R.T.
M.A.Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry CBI CS MES RK,
Almaty, Kazakhstan
Our extensive studies have shown that CD34+ HSC and early myeloid precursors (EMP),
selected from mice bone marrow, possessed ability to inhibit NK and CTL cytolytic activity,
lymphoid cell growth and switch Th1 into Th2 type. We were lucky to obtain three fractions
enriched with CD34+ cells (up to 73.5 %) by isopycnic centrifugation with following
phenotypes: Fraction 1 - CD34+, CD117+, CD3-, CD19-, CD11b-, CD123-, CD135-, CD133-,
CD10-, CD33-, IL7R-, TER119-; Fraction 2 - CD34+, CD117-, CD3-, CD19-, CD11b-,
CD123+, CD135+, CD133+ (partly), CD10-, CD33+, IL7R-, TER119-; Fraction 3 - CD34+,
CD117+, CD3-, CD19-, CD11b-, CD123-, CD135-, CD133-, CD10-, CD33-, IL7R-, TER119-.
Immunosuppressive activity of HSC/EMP fractions was mediated with cytokines main of which
was TGF . It depended on influence of several inductors, such as IL-2, IFN , IL-3, GM-CSF,
histamine and AFP. Later presents particular interest because of its known functions to regulate
growth of embryonic stem cells.
The purpose of this investigation was to estimate AFP influence on proliferative,
metabolic, protein synthetic and suppressive activities of different fractions of mice bone marrow
HSC/EMP, and also TGF
production under ex vivo cultivation.
CBA mice were used for experiments. Bone marrow cells were separated on complex
gradients of percoll density by our earlier developed method. The Fraction 1 (Fr. 1)
corresponded to buoyant density 1.08 g/ml, Fr. 2 – 1.09 g/ml, Fr.3 – 1.095 g/ml. 2×106 cell/ml of
each fraction were cultivated in Stemline II culture medium, supplied with 10% of fetal calf
serum, in presence of AFP (1-100 ug/ml) in 3 h. Then the cells were washed and cultivated in
culture plates (2×105 cell/well) in 48 h under standard culture conditions. Index of spontaneous
or AFP induced proliferation of the cell fractions was determined by immune-enzyme analysis of
bromodioxiuridine uptake into DNA of dividing cells. Metabolic activity was judged on
cytoplasmic dehydrogenase activity by MTT test. Protein synthetic activity was judged on 3Hleucine uptake into cellular protein. TGF
was determined by ELISA. Suppressor activity of
HSC/EMP was estimated as a production of factors suppressing metabolic and proliferative
activity of mice myeloma PAI by use of MTT test.
AFP has been established to induce dose depended proliferation of each HSC/EMP
fraction. However maximum stimulation was observed under influence of AFP (100 ug/ml) on
the Fr.1 and the Fr.2, where DNA synthesis was two times more than in case of AFP absent.
Proliferation increased in the Fr.3 only on 80%. Analysis of AFP influence on dehydrogenase
activity has shown response identical in all fractions which composed approximately 80%.
Protein synthesis in each HSC/EMP fraction was different. While it was maximal in the Fr. 2
(180%), it was minimal in the Fr. 3 (125%). Analysis of suppressor activity revealed its
significant level in supernatants of all fractions (Fr.1 – 49.8±1.0; Fr.2 – 52.6±1.4; Fr.3 – 39.5±2.0
%), stimulated with AFP, while spontaneous activity did not observe. Examination of TGF
production has shown significant differences of all fractions. The Fr.1 secreted maximal quantity
of TGF (2123±23 pg/ml). The Fr. 2 secreted substantially lesser quantity of TGF (573±36
pg/ml). The Fr. 3 did not secreted TGF at all under the influence of AFP.
This is evidence of existence of other suppressive factors, particularly secreted by the
Fr.3 of HSC/EMP.
Supressor cytokine production by culture of human cord blood mononuclear
cells
Perfilieva Yu.V.1, Supniyazova T.A.1, Zakiryanova G.K.1, Rysuly M.R.2, Belyaev N.N.1.
1
M.A.Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry CBI CS MES RK,
2
”Stemcord” Ltd., Almaty, Kazakhstan
At present time there is a hypothesis that in norm circulation of some quantity of
hematopoietic stem cells (HSC) maintained in peripheral blood. In case of disturbance of any
tissue the factors inducing HSC homing to the region of alteration start to form. Simultaneously
HSC mobilize from bone marrow. Earlier we have shown that mice bone marrow HSC with
CD34+ phenotype possessed natural suppressor activity, consisting in ability to secret the factors
which inhibited different immunological reactions under action of some cytokines and
oncophetal protein alpha-fetoprotein. We have suggested, that HSC, accumulating in the field of
tissue alteration, secret suppressive factors which form local zone of immunosuppression. It
needs for prevention of local inflammation, impeding tissue reparation. In addition HSC initiate
the formation of immunological tolerance to autoantigens arising as a result of tissue alteration.
In connection with using cord blood (CB) HSC for purpose of tissue reparation the urgency of
problem of human HSC immunosuppressive activity seem to be evident. Meanwhile at present it
does not known exactly if human HSC to possess natural suppressor activity.
The investigation was aimed onto estimation of possibility of CB cell culture enriched
with HSC to produce suppressive cytokines.
Experiments were carried out on 7 samples of CB supplied from Almaty maternity
hospitals by our earlier developed method using sterile system. Erythrocytes were removed by
precipitation with gelatin. The fraction enriched with HSC was separated by our method on
multi-step gradients of percoll. Obtained cell dredge (2х105 cell/well) was cultivated in 96-well
plates in culture medium IMDM, containing 30% of fetal calf serum and 1% of methylcellulose,
under standard culture conditions (37оС, 5% СО2 and 90% humidity) during 72 h. After
incubation the plates were centrifuged for cell sedimentation (10 min at 400 g). Cell-free
supernatants were collected, freeze and served at -70oC before determination of cytokines.
Concentrations of IL-6, IL-10, IL-13, and TGF
were determined by ELISA.
Analysis of IL-6 concentration in supernatants of HSC cultivated has shown that CB
samples were differed by ability to produce this cytokine. So, 3 from 7 samples showed low
spontaneous production of IL-6 amounting 28.3±4.4 pg/ml in average (20-35 pg/ml). At the
same time residuary 4 samples showed very high production of this cytokine amounting
1415.0±72.3 pg/ml (1211-1542 pg/ml). Initial level of IL-10 production in 5 from 7 samples was
low and amount in average 8.4±2.0 pg/ml (5-16 pg/ml). Residuary 2 samples showed higher
level of the cytokine production, 69±15 in average (54-84 pg/ml). IL-13 was not revealed in any
samples. TGF was found in all samples in high concentration (2974±247 pg/ml).
Thus obtained our data testify that CB HSC possess obviously significant
immunosuppressive potential, because even in absent of inducing signals they able to secret
considerable amount of IL-6, IL-10 and especially TGF , possessing absolute
immunosuppressive properties. These circumstances have to be remembered at carrying out of
allogenic transplantation of CB preparations during the treatment of malignant blood disease.
The study of proliferative activity of mononuclear cell fraction from
human cord blood.
Zakiryanova G.K.1, Rysuly M.R.2, Zhumabaeva B.A.3, Satybaldieva Zh.A.3,
Belyaev N.N.1.
1
2
M.A.Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry CBI CS MES RK,
“Stemcord” Ltd., 3National Centre of Drug Expertise MH RK, Almaty, Kazakhstan
Today the cord blood (CB) is considered as alternative source of hematopoietic stem cells
(HSC) suitable for cell therapy. It was accumulated the great experience to use of HSC CB for
treatment of the blood malignant disease and cell regenerative medicine. Meanwhile an
estimation of HSC biological activity presents some difficulty. At present time the standard test
allowing unbiased to evaluate cell material quality for allogenic transplantation does not exist.
The HSC colony formation test is the most-used test. However long-term realization decreases a
diagnostic value of this test. We decided to estimate the proliferative activity of HSC as integral
index of the biological cell activity. There are different methods of estimation of cell
proliferative activity, which include (1) calculation of live cells by exclusion of dead cells
stained with trypan blue before and after cultivation using microscopy or special apparatus, (2)
determination of DNA of dividing cells by radioactive and nonradioactive methods, (3)
determination of activity of cell metabolic enzymes which correlate with degree of proliferation.
The aim of the study was directed on the assessment of nuclear cell proliferative activity in
cord blood in comparison with cellularity and contents of HSC/early progenitor cells (PC) with
phenotype CD34+.
The investigation has been carried out on 10 samples of CB obtained from Almaty
maternity hospitals by standard procedure and checked up on infection safety (presence of
antibodies to HIV-I, HIV-II, VH-C, VH-B and trepanema antigens). Proliferative activity was
judged by MTT test based on reduction of 3-(4,5-dymethylthyazol-2-)-2,5-dyphenyltetrazolium
bromid (МТТ) by the assistance of cytoplasmic dehydrogenases into insoluble formazan, that
quantitatively correlated with metabolic activity and proliferation. CD34+ cells were judged by
flow cytofluorimetry using BD (Germany) reagents and FACS-Calibur. CB samples in presence
with hemostabilizator were treated with gelatin solution for erythrocyte precipitation. The
mononuclear cell fraction was isolated by standard methods of centrifugation in gradient of
density (1.076 g/ml). Live cells were counted by microscope using trypan blue and
hemocytometer. The cells was cultivated in 48 h in 96-well culture plates (2×105 cell/well) in
RPMI-1640 culture medium, containing 30% fetal calf serum, under 37оС, 90% humidity and
5% СО2 in presence (control) or absence (test) of mythomycin C. MTT added to cell culture 4
hours before finish of cultivation. Then the supernatant was aspirated from wells and formazan
dissolved with dymethylsulfoxyd and extinction was measured at 570/630 nm. Proliferation
index was calculated by following formula. IP = (О-К)Кх100%, O – optical density in test, K –
optical density in control. The wells with mythomycin C, which specifically suppressed DNA
synthesis and at the same time did not influence the dehydrogenase activity, used as a control.
The test showed that CB samples have the considerable differences on all three parameters.
So, the content of mononuclear cells in CB was 105-3.3х106 cell/ml, in average 7.95±0.39х105
cell/ml. CD34+ cells was in average 0.88±0.31% (0.55-1.12%) from total mononuclear cells.
Proliferative activity of mononuclears also varied between samples (3-104%), amounting in
overage 36.3±10.1%. Correlative analysis did not reveal connection between cellularity and
contents of HSC/PC (r=0.11 and -0.05 correspondingly).
Thus, the proliferative activity of CB mononuclears is independent index of biological
activity of HSC CB, whose concernment for transplantation the important shall have to be
clarified.
СПИСОК УЧАСТНИКОВ КОНФЕРЕНЦИИ
№№
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
ФИО
Айтхожина Нагима Абеновна
ак. НАН РК
Алферов Николай
Николаевич
Антохин Александр
Иванович
Арутюнян Ирина
Владимировна
Арчаков Александр
Иванович,
ак. РАМН
Аскаров Манарбек Бапович
ГОРОД
Алматы
Иркутск
Москва
Москва
Ахмедова Сурая
Абдуллаевна
8.
Бабаева Анна Георгиевна
9.
Банин Виктор Васильевич,
Чл.-корр. РАМН
Батенева Татьяна
Анатольевна
Батманов Юрий Евгеньевич
Беляев Николай Николаевич
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Белякова Маргарита
Владимировна
Бокерия Леонид Антонович
ак. РАМН
Бочков Николай Павлович
ак.РАМН
Брюховецкий Андрей
Степанович
Булгин Дмитрий Викторович
Буравкова Людмила
Борисовна
19.
Бурда Юрий Евгеньевич
20.
Бурунова Вероника
Вячеславовна
Василенко Вячеслав
Васильевич
21.
РГМУ
ООО «Реметекс»
makarov@iscct.ru
РГМУ
Москва
Москва
7.
Организация,телефон,
электронный адрес
Институт молекулярной биологии и
биохимии
НЦХ ВСНЦ СО РАМН
alferov@irk.ru
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Алматы
СанктПетербург
Москва
Москва
Москва
Санкт Петербург
Москва
Курск
Москва
Москва
ГУН Центр биомедицинских технологий
РАМН
ilak@mail.ru
МНИОИ им. П.А.Герцена Агентства
«Росмедтехнология»
prognoz .06@mail.ru
НИИ Морфологии человека РАМН
128-97-12
РГМУ
Газета «Известия»
РГМУ
Институт молекулярной биологии и
биохимии
Государственный медицинский
университет им. П.П. Павлова
Клиника пропедевтики внутренних
болезней
НЦССХ РАМН
Медико-генетический научный центр
ООО «НейроВита»
Центр клеточный и генной терапии.
Криоцентр. Покровский банк стволовых
клеток.
Институт медико-биологических проблем
РАН
8-499-195-20-63
Областная клиническая больница
(0712)35-88-08
РГМУ
«ГУТА-КЛИНИК»
vvvasilenko@inbox.ru
22.
Васильев Вадим Борисович
23.
24.
Васьковский Григорий
Григорьевич
Вахрушев Игорь Викторович
25.
Викторов Алексей Сергеевич
26.
27.
28.
Викторов Алексей Сергеевич
Викторов Илья Васильевич
Волков Алексей Вадимович
29.
Волова Лариса Теодоровна
30.
31.
Воронина Е.С.
Габитов Рустам Мавлитович
32.
33.
Гаврилюк Борис Карпович
Герасименко Денис
СанктПетербург
НИИ экспериментальной медицины
РАМН
Семипалатинская государственная
Семипалатинск
медицинская академия
РГМУ
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Самара
Москва
Оренбург
Пущино
Москва
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
Гехт Алла Борисовна
Гильмутдинов Ринат
Гаптрауфович
Гильмутдинова Флюра
Гаптрауфовна
Гисина Алиса
Глухова Елена Викторовна
Глухова Елена Викторовна
Гольдберг Евгений
Данилович
ак. РАМН
Гольдштейн Дмитрий
Вадимович
Горностаев Вадим Сергеевич
Грачев Сергей Витальевич
ак. РАМН
Гремякова Татьяна
Андреевна
Гуреев Сергей Васильевич
Денисов-Никольский Юрий
Иванович
ак. РАМН
Дербинян Татевик Грантовна
Дорош Жанна Валентиновна
Дьяконов Лев Петрович
Москва
Оренбург
Оренбург
Москва
Москва
Москва
Томск
Москва
СанктПетербург
Москва
Москва
Москва
ООО «Реметекс»
makarov@iscct.ru
ООО «Биолот»
Info@BioloT.ru
ММА им. Сеченова
Международный научно-технический
центр
НИИ Трансплантологии и искусственных
органов
НИЦ БМТ ВИЛАР
Москва
Москва
Москва
Москва
50.
ООО «Химмед»
728-41-91
ООО «Химмед»
НИИ им. Сербского
ООО «Реметекс»
makarov@iscct.ru
Самарский государственный
медицинский университет
Медико-генетический научный центр
Оренбургская областная станция
переливания крови
ИТЭБ РАН
ООО «Инновационные Медицинские
Технологии»
dr_fedorov@delrus-msk.ru;
gerasimenkodv@haemoline.ru
РГМУ
Оренбургская областная станция
переливания крови
Оренбургская областная станция
переливания крови
РГМУ
ООО «Химмед»
728-41-91
ООО «Химмед»
НИИ Фармакологии РАМН
Ермаков Артем Михайлович
Пущино
ООО «Биолаб» 939-10-05
РГМУ
Всероссийский государственный НИИ
экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.
Коваленко РАСХ моб. 8-903-519-64-57,
levdyakonov@mail.ru
Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН
ao_ermakovy@rambler.ru
51.
Житких Сергей Юрьевич
52.
Журнал Медицинский
вестник
Зайчик Альберт Михайлович
53.
54.
55.
56.
Закирьянов Артур
Русланович
Зинькова Наталья
Николаевна
Зюзьков Глеб Николаевич
Москва
Москва
СанктПетербург
Москва
СанктПетербург
Томск
57.
58.
59.
60.
Иллариошкин Сергей
Николаевич
Ильина Валентина
Клементьевна
Исаев Артур Александрович
Кириллов Дмитрий
Анатольевич
61.
Кирилов А.М.
62.
Кирсанова Валентина
Александровна
63.
64.
65.
Ковалев Алексей
Вячеславович
Ковальчук Леонид
Васильевич
Кованко Георгий
66.
Кованько Георгий
Николаевич
67.
Козлов Владимир
Александрович
ак. РАМН
Колесников Сергей Иванович
ак. РАМН
Коломбет Любовь
Васильевна
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
Москва
Москва
Москва
Санкт Петербург
Москва
Москва
Иваново
Москва
СанктПетербург
Санкт Петербург
Новосибирск
Иркутск
Серпухов
Комаров Андрей Борисович
Конопляников Анатолий
Георгиевич
Обнинск
Константинова Неля
Александровна
Москва
Коротеев А.В.
Котельников Геннадий
Петрович
ак. РАМН
Крашенинников Михаил
Москва
Москва
РГМУ
Журнал Медицинский вестник
Санкт-Петербургская медицинская
академия последипломного образования
ГУН Центр биомедицинских технологий
РАМН
logart@mail.ru
ООО "Транс-Технологии"
natalia_z@alkorbio.ru
ГУ НИИ фармакологии Томского
научного центра СО РАМН
amd@pharm.tsu.ru
НИИ Морфологии человека РАМН
490-20-43
ФГУ ЦИТО им.Н.Н.Приорова
450-09-31
Клеточные технологии
Центр клеточный и генной терапии.
Криоцентр. Покровский банк стволовых
клеток.
ГУ РНЦХ
МНИОИ им. П.А.Герцена Агентства
«Росмедтехнология»
prognoz .06@mail.ru
«Ивановская государственная
медицинская академия
РГМУ
«КриоЦентр Санкт-Петербург»,
georg.kovanko@stemcellbank.spb.ru
Центр клеточный и генной терапии.
Криоцентр. Покровский банк стволовых
клеток.
Директор НИИ клинической
иммунологии
Гос. дума
292-74-39
kolombet@toxicbio.ru
НИИЦ токсикологии и гигиенической
регламентации биопрепаратов ФМБА
РГМУ
ГУ Медицинский радиологический НЦ
РАМН
konopl@mrrc.obninsk.ru
РГМУ
ГУ РНЦХ
Ректор Самарского Мед. Университета
Самара
Москва
ГУН Центр биомедицинских технологий
Евгеньевич
76.
Кругляков Петр
Владимирович
77.
Кулагина Вера Викторовна
СанктПетербург
Самара
78.
79.
80.
81.
Куликов Александр
Владимирович
Курило
Любовь Фёдоровна
Курсенко Вадим
Владимирович
Левак Дмитрий Николаевич
83.
Лищук Владимир
Александрович
Лупатов Алексей Юрьевич
84.
Майорова Ольга Андреевна
85.
Макаров Андрей Витальевич
86.
Масчан Алексей
Александрович
Матвеева Ирина Антоновна
82.
87.
Пущино
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
Медведев Михаил Андреевич
ак. РАМН
Мухина Ирина Васильевна
Назаров Руслан
Владимирович
Никифоров Сергей
Борисович
Николаев Алексей
Геннадьевич
Омельченко Николай
Петрович
Онищенко Нина Андреевна
Опольский Михаил
Болеславович
Панкратов Евгений
Валерьевич
Перфильева Юлия
Викторовна
Поленкая Ирина Васильевна
Полтавцева Римма
Алексеевна
100. Полынцев Дмитрий
Генрихович
99.
Томск
Нижний
Новгород
СанктПетербург
Иркутск
Ярославль
Москва
Москва
Краснодар
Новосибирск
Алматы
Санкт Петербург
Москва
СанктПетербург
РАМН
krashen@rambler.ru
ООО "Транс-Технологии"
pitkus@alkorbio.ru
Самарский государственный
медицинский университет
ИТЭБ РАН
МГНЦ РАМН
324-13-20
РГМУ
НИИ Трансплантологии и искусственных
органов
НЦССХ
414-75-22
РГМУ
Московский банк стволовых клеток
пуповинной крови
ООО «Реметекс»
makarov@iscct.ru
РГМУ
Научный центр здоровья детей РАМН
телефон:430-70-93
IAMatveeva@yandex.ru
Сибирский медицинский Университет
ГОУ ВПО НижГМА Росздрава
mukhinaiv@mail.ru
РНХИ им. А.Л.Поленова
НЦХ ВСНЦ СО РАМН
telomer@mail.ru
Ярославская мед. Академия
ФГУ ЦИТО им.Н.Н.Приорова
450-42-31
НИИ Трансплантологии и искусственных
органов
2-ая гор. больница
ООО НКЦ Биотерапия
sep_ti@mail.ru
Институт молекулярной биологии и
биохимии
Центр клеточный и генной терапии.
Криоцентр. Покровский банк стволовых
клеток.
НИИ Акушерства и гинекологии и
перинатологии РАМН
ООО "Транс-Технологии"
polyntsev@alkorbio.ru
101. Пономарева Светлана
Ивановна
102. Потапов Иван Викторович
Москва
Москва
103. Пыхтин Евгений
Владимирович
104. Репин Вадим Сергеевич
Чл.-корр. РАМН
105. Ржанинова Алла
Анатольевна
106. Родионова Валентина
Ивановна
107. Ройтберг Григорий
Ефимович,
чл.-корр. РАМН
108. Росинская Виктория
Викторовна
109. Румянцев Александр
Григорьевич
чл-корр. РАМН
110. Румянцев Сергей
Александрович
111. Румянцева Софья Алексеевна
112. Рытенков Алексей
Николаевич
113. Савченко Валерий
Григорьевич
114. Савченко Игорь Петрович
Санкт Петербург
Москва
Москва
Москва
Самара
118. Свиридова Ирина
Константиновна
Москва
Москва
Москва
Москва
Семипалатинск
Екатеринбург
Москва
Москва
119. Сергеева Наталья Сергеевна
Москва
120. Ситников Владимир
Федорович
121. Скворцова Вероника
Игоревна
ак.РАМН
122. Смирнов Владимир
Николаевич
чл.-корр. РАН, ак. РАМН
123. Смирнов Сергей
Самарский государственный
медицинский университет
РГМУ
Москва
Москва
117. Сахурия Ирма Бухутиевна
ООО «Реметекс»
makarov@iscct.ru
ДПНБ-18
430-80-24
РГМУ
Москва
115. Савченкова Ирина Петровна
116. Сазонов Сергей
Владимирович
ООО «Биолаб»
939-10-05
ГУН Центр биомедицинских технологий
РАМН
picarus@gmail.com
Центр клеточный и генной терапии.
Криоцентр. Покровский банк стволовых
клеток.
РГМУ
Москва
РГМУ
РГМУ
РГМУ
ГНЦ РАМН
Семипалатинская государственная
медицинская академия
Всероссийский государственный НИИ
экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.
Коваленко РАСХ 8-917-557-99-33,
S-IP@mail.ru
ГУЗ Институт медицинских клеточных
технологий
imct@yandex.ru
ООО "КэмБио"
amri@chembio.ru
МНИОИ им. П.А.Герцена Агентства
«Росмедтехнология»
prognoz.06@mail.ru
МНИОИ им. П.А.Герцена Агентства
«Росмедтехнология»
prognoz .06@mail.ru
РГМУ
РГМУ
Москва
Москва
Институт экспериментальной
кардиологии РКНПК
Москва
НИИ им. Склифасовского
Владимирович
124. Смирнова Галина Олеговна
125. Смолянинов Александр
Борисович
126. Соколова Ирина Борисовна
127. Сорокин Виктор Федорович
128. Сорокин Виталий
Викторович
129. Стенина Марина
Александровна
130. Степанова Ольга Ивановна
Москва
СанктПетербург
СанктПетербург
Москва
Москва
Москва
Москва
131. Сторожаков Геннадий
Иванович,
ак. РАМН
132. Ступин Виктор
Александрович
133. Суздальцева Юлия
Геннадиевна
134. Супниязова Т.А.
135. Сухих Геннадий Тихонович
ак. РАМН
136. Тагирова Раиса
137. Темнов Андрей
Александрович
138. Тихонова Наталья Сергеевна
139. Ткачук Всеволод
Арсентьевич
ак. РАН и РАМН
140. Тороповский Андрей
Николаевич
141. Туманов Владимир Павлович
142. Тюмина Ольга Владимировна
143. Усов Антон Владимирович
144. Фаворова Ольга Олеговна
145. Фатхудинов Т.Х.
146. Фрегатова Любовь
Михайловна
147. Харченко Олег Иванович
148. Хватов Валерий Борисович
149. Хейфец Михаил
Владимирович
150. Хисамов Альберт
Ильдусович
151. Холоденко Ирина
Викторовна
РГМУ
Военно-Медицинская академия ГВМУ
МО РФ
ООО "Транс-Технологии"
sokolova@alkorbio.ru
РГМУ
РГМУ
РГМУ
ГУН Центр биомедицинских технологий
РАМН
8-916-663-10-98
РГМУ
Москва
Москва
Москва
Алматы
Москва
Москва
Москва
СанктПетербург
РГМУ
РГМУ
Институт молекулярной биологии и
биохимии
НИИ Акушерства и гинекологии и
перинатологии РАМН
РГМУ
НИИ Трансплантологии и искусственных
органов
ООО «Биолот»
Info@BioloT.ru
МГУ
Москва
ГУЗСО «Клинический центр клеточных
технологий»
Москва
РГМУ
ГУЗСО «Клинический центр клеточных
Самара
технологий»
Director@cordbank.ru
МНИО им. Герцена
Москва
AntonUsov@yandex.ru
Москва
РГМУ
ООО «Реметекс»
Москва
makarov@iscct.ru
СанктФедеральный центр сердца, крови и
Петербург
эндокринологии им. В.А. Алмазова
Москва
Стоматологический центр
Москва
НИИ им. Склифасовского
ФГУ НИИ Клинической Иммунологии СО
Новосибирск РАМН, г. Новосибирск
gph49@yahoo.com
«Медицинская газета»
Москва
Самара
Москва
РГМУ
152. Холоденко Роман
Васильевич
153. Чайлахян Левон Михайлович
чл.-корр. РАМН
154. Чайлахян Рубен Кариович
155. Чеглаков Иван Борисович
156. Честков Валерий Викторович
157. Чехонин Владимир Павдович
ак. РАМН
158. Шиманский Валерий
Андреевич
159. Штейнграт Берта Моисеевна
160. Шумаков Валерий Иванович
ак. РАН и РАМН
161. Щепкина Елена Андреевна
Москва
Пущино
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
Москва
СанктПетербург
162. Южаков Вадим Васильевич
Обнинск
163. Ярыгин Владимир Никитич,
ак. РАМН
164. Ярыгин Константин Никитич
165. Ясаманова Алла Николаевна
166. Ячков А.В.
Москва
Москва
Москва
Москва
РГМУ
ПТЭБ РАН
НИИ
РГМУ
«ПанЭко»
111-82-53
НИИ им. Сербского
НИИ Трансплантологии и искусственных
органов
ООО "КэмБио"
amri@chembio.ru
НИИ трансплантологии и искусственных
органов Росздрава
196-18-03
ФГУ «РНИИТО им. Р.Р.Вредена
Росздрава»
repozition@yandex.ru
ГУ МРНЦ РАМН
yuzhakov@mrrc.obninsk.ru
РГМУ
РГМУ
РГМУ
ГУ РНЦХ
ОРГКОМИТЕТ:
Сопредседатели:
академик РАМН, вице-президент РАМН Бочков Н.П.
академик РАМН, вице-президент РАМН Кулаков В.И.
академик РАМН член Президиума РАМН Ярыгин В.Н.
Члены:
академик РАМН член Президиума РАМН Бокерия Л.А.
академик РАН и РАМН Шумаков В.И.
академик РАМН Козлов В.А.
академик РАМН Лопухин Ю.М.
член-корр. РАМН Румянцев А.Г.
академик РАМН Сухих Г.Т.
доктор мед.наук Савченко В.Г.
доктор мед.наук Васильев В.Б.
Секретариат конференции:
Руководитель
Сорокин Виктор Федорович – т/ф.-434-12-83
e-mail: med2@rsmu.ru
Клищевский Вячеслав Николаевич т. 434-45-47
Авджян Феликс Геворкович т. 433-08-15
Контактные адреса по конференции:
по вопросам научной программы
Ярыгин Константин Никитич
тел. 509-82-21; 434-80-56; e-mail: const@rsmu.ru
по орг.вопросам
Безлихотнова Наталия Валерьевна
тел. 434-03-29; 434-61-29; Факс- 434-61-29;
e-mail: rsmu@rsmu.ru
пресс-центр
Артюхов Сергей Алексеевич
тел. 434-50-38; e-mail : iao@rsmu.ru