Загрузить автореферат Халилуева М.Р.
advertisement
На правах рукописи ХАЛИЛУЕВ МАРАТ РУШАНОВИЧ Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 1 Работа выполнена Государственного в лаборатории научного исследовательского генной учреждения института инженерии растений Всероссийского научно- сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСБ РАСХН). Научный руководитель: Официальные оппоненты: кандидат сельскохозяйственных наук Сергей Владимирович Долгов. доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Соловьев, доктор биологических наук Илья Александрович Шилов. Ведущая организация: Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН. Защита состоится «_____» 2011 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42. Тел.: 8 (499) 977 6544; Факс: 8 (499) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru Автореферат разослан « » мая 2011 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук Светлана Александровна Меликова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Томат (Solanum lycopersicum L.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продуктов овощеводства как по своему значению, так и по объему производства. По данным ФАО, в 2009 г. томат в России промышленно выращивался на площади 117 тыс. га, а валовой сбор товарной продукции составил около 2,2 млн. т. Высокий спрос на эту культуру обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения целого ряда хозяйственно-ценных признаков и может быть достигнуто как традиционной селекцией, так и методами генетической инженерии. Применение трансгенных форм томата может существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность культуры. Устойчивость к биотическим стрессам и, в частности, к грибным и бактериальным патогенам – одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томата. Несмотря на достигнутые успехи в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости к неблагоприятным факторам биотической природы по-прежнему остается неразрешенной. Это относится также и к наиболее опасным болезням, таким как фитофтороз. Прямые потери урожая томата от фитофтороза в годы эпифитотии составляют больше, чем от всех других болезней вместе взятых и в полевых условиях достигают 100%. Фитофтороз приносит значительные экономические убытки в России, особенно в ее Средней полосе, где потери достигают критических величин, а также во многих странах Европы и США. Одной из приоритетных возможностей противостояния фитофторозу томата является получение и последующее промышленное выращивание устойчивых сортов. В последние десятилетия для повышения устойчивости растений томата к фитопатогенам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в частичном установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечив возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них является привнесение в геном томата чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки и 3 антимикробные пептиды (Broekaert et al., 1997; Edreva et al., 2005; Van Loon et al., 2006). Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.), содержащих гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, и оценка влияния экспрессии гетерологичных генов на устойчивость к фитопатогенам. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) получение трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ с генами хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus и гевеинподобных антимикробных пептидов из Stellaria media L.; 2) оценка экспрессии гетерологичных генов в полученных трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ и изучение ее влияния на устойчивость к возбудителю фитофтороза; 3) изучение характера наследования селективного гена в потомстве трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ; 4) разработка методики эффективной регенерации и генетической трансформации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены трансгенные растения томата, содержащие гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus (A. caudatus L. и A. retroflexus L.), а также гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. Впервые продемонстрировано влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата на повышение устойчивости к оомицету Phytophtora infestans (Mont.) de Bary. В результате проведенных экспериментов разработана система эффективной регенерации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен с частотой более 85%. Методом агробактериальной трансформации получены растения томата сорта Рекордсмен, экспрессирующие репортерный ген gfp. Полученные экспериментальные данные являются основой для проведения фундаментальных исследований в области изучения механизмов действия белков PR-4 семейства и гевеин-подобных антимикробных пептидов в защитных реакциях растений против фитопатогенов, а также использования 4 вышеперечисленных генов для повышения устойчивости к биотическим стрессам генно-инженерными методами промышленных сортов томата и других представителей рода Solanum. Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII, IX и XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2009, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень научных изданий, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 21 рисунок. Библиографический список включает 286 источников, из них 259 на иностранном языке. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал. В качестве растительного материала для экспериментов использовали следующие образцы томата: селекционную линию ЯЛФ и промышленный сорт Рекордсмен. Для введения томата в культуру in vitro использовали семена. Стерилизованные семена помещали в культуральные сосуды с питательной средой MS (Murashige and Skoog, 1962), дополненной 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Донорные растения и экспланты культивировали при температуре 23-25ºС, освещенности 2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь). Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные векторы. Для проведения экспериментов по генетической трансформации томата применяли следующие обезоруженные супервирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens: 1) СВЕ21 (Ревенкова и др., 1993) с бинарными векторами pBINmGFP5ER, pBI121ac и pR830; 5 2) AGL0 с бинарными векторами pB-AMP1 и pB-AMP2 . В состав Т-ДНК бинарного вектора pBINmGFP5ER входит оптимизированный для экспрессии в растениях ген gfp, содержащий N-концевой сигнальный пептид хитиназы Arabidopsis thaliana и С-концевой пептид HDEL, обеспечивающие локализацию продукта в эндоплазматическом ретикулуме. Бинарные векторы pBI121ac и pR830 содержат соответственно хитинсвязывающий ген ас из Amaranthus caudatus L. и гибридный ген RS-intron-Shir, кодирующий сигнальную последовательность и первые шесть аминокислот дефензина редьки (Rs) c интроном, а также хитинсвязывающий белок из Amaranthus retroflexus L. (Shir). Бинарный вектор pB-AMP2 содержит ген amp2, кодирующий лидерный пептид, два гевеин-подобных антимикробных пептида (SmAMP1 и SmAMP2), разделённых спейсером, и С-концевую часть из звездчатки (Stellaria media L.). В отличие от pB-AMP2, несущего полную копию кДНК гена звездчатки, pB-AMP1 содержит ген amp1, кодирующий только лидерную последовательность и один из антимикробных пептидов (SmAMP1). Все целевые гены находились под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S). Для отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген nptII, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину. Бинарные векторы с генами хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов сконструированы во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и любезно предоставлены А.А. Гулевичем (pBI121ac), В.Г. Луниным (pR830) и А.В. Бабаковым (pB-AMP1, pB-AMP2). Регенерация побегов томата. Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН (И.В. Корнеевой, Е.В. Парашиной) были проведены исследования, позволившие оценить регенерационную способность селекционной линии ЯЛФ томата. Было установлено, что оптимальной средой для регенерации побегов томата из семядолей является среда MS, содержащая 5,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ИУК. Для изучения регенерационной способности томата сорта Рекордсмен в качестве эксплантов использовали семядоли и сегменты гипокотилей длиной 7–10 мм, полученные от асептически выращенных 10-12 дневных проростков. 6 Индукцию органогенеза побегов осуществляли как на базовой питательной среде, составленной по прописи MS (MS0), так и на средах с добавлением различных типов и концентраций регуляторов роста (MS1-MS15) (табл. 1). Таблица 1. Состав питательных сред MS для индукции регенерации побегов томата сорта Рекордсмен. Вариант MS0 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 MS10 MS11 MS12 MS13 MS14 MS15 Вид и концентрация регулятора роста, мг/л зеатин 6-БАП ИУК НУК 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 0,1 1,0 0,5 2,0 0,1 2,0 0,1 3,0 0,1 4,0 0,1 5,0 0,1 5,0 0,1 5,0 0,1 2,5 0,1 2,5 0,1 1,0 2,5 0,1 - Культивирование эксплантов проводили на чашках Петри, которые содержали 30 мл среды. Каждый вариант опыта включал 3 повторности, количество эксплантов составляло 10 штук в каждой повторности. Оценку эффективности морфогенеза побегов проводили после 45 дней культивирования эксплантов по показателю частоты каллусообразования и регенерации побегов, количеству регенерантов, полученных от одного экспланта, а также по их морфометрической характеристике. Агробактериальная трансформация томата. Эксперименты по трансформации растений томата проводили методом кокультивации эксплантов с суспензией агробактерии. Ночную культуру агробактерии наращивали в 20 мл неагаризованной среды LB (Sambrook et. al, 1989), дополненной соответствующими селективными антибиотиками, на качалке (180 мин-1) в течение 24 часов при 260С в темноте. В экспериментах по трансформации использовали экспланты 10-12 дневных проростков. За трое суток до инфицирования их помещали на агаризованную питательную среду для 7 прекультивации. В случае использования семядолей перед инокуляцией у эксплантов отсекали небольшую часть у основания и верхушки, а на абаксиальную поверхность наносили 2-5 поперечных надсечек. Экспланты переносили в подготовленную бактериальную суспензию (OD600=0,4-0,6) и, периодически перемешивая, выдерживали в течение 30 мин. Подсушенные на воздухе экспланты переносили на бумажные фильтры, помещённые на поверхность чашки Петри со средой МS, и кокультивировали в темноте при температуре 18 ºС в течение 48 часов. После периода кокультивации экспланты отмывали неагаризованной средой МS с добавлением 300 мг/л тиментина (тикарциллин + клавулановая кислота) и переносили на питательную среду для элиминации агробактерии, содержащую регуляторы роста в оптимальных концентрациях. В последующих пассажах для отбора трансгенного каллуса в состав питательной среды вводили селективный антибиотик канамицин в концентрации от 10 до 25 мг/л. Длительность каждого пассажа составляла 15 дней. По достижении регенерирующими предположительно трансгенными побегами размера 1,5 см их отделяли от каллусной ткани и переносили на среду для ризогенеза, содержащую ½ дозы макросолей от прописи МS, 2% сахарозы, 0,7% агара, 0,2 мг/л ИМК и канамицин в концентрации 50 и 100 мг/л. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений томатов. Для экстракции тотальной геномной ДНК томата использовали листья растений in vitro. Выделение проводили по модифицированной методике Edwards с соавторами (Edwards et al., 1991) c дополнительной экстракцией фенолом. Подтверждение интеграции чужеродных генов проводили с помощью ПЦР-анализа. Реакционная смесь общим объемом 25 мкл состояла из следующих компонентов: по 2,5 mМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов, 1мкл Taq-полимеразы с активностью 5 ед/мкл, 10 пмоль прямого и обратного праймеров, 2,5 мкл 10x ПЦР-буфера для Taq-полимеразы, 3 мкл ДНК и стерильной бидистиллированной воды. Интеграцию в растительный геном селективного гена nptII определяли при помощи праймеров 5'-CGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAG-3' и 5'-GCATGCGCGCCTTGAGCCTGG-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 742 п.н. Интеграцию в растительный геном репортерного гена gfp определяли при помощи праймеров 5’-GGACGACGGGAACTACAAGA-3’ и 8 5’CATGCCATGTGTAATCCCAG-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 397 п.н. Для идентификации присутствия гена ас использовали праймеры к последовательности промотора CaMV35S (5'CTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC-3') и целевого гена (5'TTGAACACATTCACCAACTCCCATAGAT-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 300 п.н. Для амплификации последовательности гена Rs-intron-Shir использовали олигонуклеотиды на лидерную часть гибридного гена (5'CTCTCTTCTAGAATGGCTAAGTTTGCTTCTATCGTC-3') и терминатора pA35S (5'-TGTCACTGGATTTTGGTTTTAGGAA-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 1050 п.н. Интеграцию генов антимикробных пептидов определяли при помощи пары праймеров 5'-TCATTCCATAGACTTGTTTATGA-3' и 5'CTTACATACAAAAGCTAGTCAC-3'. Размеры амплифицируемых фрагментов у образцов, трансформированных конструкцией рВ-АМР1 и рВ-АМР2, составляют соответственно 445 и 765 п.н. Для амплификации фрагмента бактериального гена virB использовали пару праймеров 5'-GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG-3' и 5'GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC-3'. Длина амплифицируемого фрагмента – 670 п.н. Анализ экспрессии генов проводили с помощью метода ОТ-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов RNA-ExtraSorb (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ГНУ ВНИИСБ РАСХН) в соответствии с протоколом изготовителя. Синтез кДНК осуществляли в стандартных условиях (Маниатис и др., 1984) с использованием шестичленных случайных праймеров (Синтол, Россия) (метода рассеянной затравки). В качестве контроля был использован ген актина томата Tom52 (NCBI, U60482). Для его амплификации использовали пару праймеров 5’-GCCAGGTATTGTGCTGGACT-3’ и 5’-ATCAGCAATACCAGGGAACA-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 450 п.н. Для оценки экспрессии гена ас использовали пару праймеров 5’GCGAGCTCGGTACCCCCGAA-3’ и 5’-ACCTGGACTACCAGCACCAGCA-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 298 п.н. Экспрессию на транскрипционном уровне гена Rs-intron-Shir определяли с помощью специфических праймеров 5’- CGCCCTTCTCTTCGCTGCTCT-3’ и 9 5’-TGCCAGATGGGCATCTACCT-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 120 п.н. Экспрессию генов amp1 и amp2 определяли с использование праймеров, приведенных выше. Визуализацию продуктов амплификации проводили методом электрофореза в агарозном геле с концентрацией 1% в 1х ТАЕ буфере с добавлением этидиум бромида. Размеры амплифицированных фрагментов определяли с помощью маркера FastRulerTM Low Range DNA ladder и GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, Литва). Флуориметрический анализ активности GFP. Детекцию экспрессии гена gfp проводили под флуорисцентным микроскопом Leica MZ FLIII (Leica Microsystems, Германия), укомплектованным барьерными фильтрами, имеющими λ = 450-490 нм (длина волны возбуждения) и λ = 515-550 нм (длина волны экстинкции белка GFP). Адаптация трансгенных регенерантов к условиям in vivo. Укорененные in vitro побеги отмывали от остатков агаризованной среды и высаживали в смесь торфа и песка (3:1). Адаптацию и последующее выращивание трансгенных растений проводили в теплице станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН со следующими условиями: температура в пределах 22-25 0С днем и 18-190С ночью, влажность 60-70%, освещенность 2500 люкс. Лабораторная оценка устойчивости трансгенных растений томата к Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Лабораторную оценку устойчивости к фитофторозу проводили методом искусственного заражения отделенных сегментов листьев томата, полученных от взрослых вегетирующих Т0-растений, выращенных в условиях защищенного грунта. Инокуляцию осуществляли зооспорангиями (5000 шт./мл суспензии) 10-суточной культурой трех изолятов Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, два из которых были выделены из плодов (ТПМ) и листьев (ТЛЗ) томата, а третий – из листьев картофеля сорта Ильинский (ИК3). Инфекционные капли объемом 50 мкл наносили на адаксиальную поверхность сегментов листа, помещенных в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную раствором кинетина (10 мг/л). Чашки Петри помещали в климокамеру с оптимальной температурой для развития патогена (19-21°С). Через 24 часа после инокуляции остатки суспензии удаляли фильтровальной бумагой, а сегменты листа помещали абаксиальной стороной 10 вверх. Оценку развития инфекции осуществляли на 7 сутки после заражения по размеру инфекционного пятна (см2), а также наличию и интенсивности спороношения (балл). Опыт проводили в трехкратной повторности, каждая из которой содержала три сегмента листа. Наследование селективного гена в поколении Т1 томата. Отбор трансгенных растений в потомстве томата проводили по признаку устойчивости к канамицину (экспрессии гена nptII). Семена, полученные в результате самоопыления, вводили в культуру in vitro и помещали на питательную среду MS, содержащую 150 мг/л канамицина. Оценку результатов проводили после 4 недель селекции. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Агробактериальная трансформация томата селекционной линии ЯЛФ бинарными векторами, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов. Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ разработана система агробактериальной трансформации селекционной линии ЯЛФ при использовании эксплантов семядолей (Корнеева и др., 2005). Установлено, что генотип обладает высокой отзывчивостью к интеграции чужеродных генов (Долгов и др., 2008; Korneeva et al., 2008). Одним из основных этапов генетической трансформации является эффективная доставка векторных конструкций в клетки-мишени, компетентные к регенерации растений. Многочисленными исследованиями показано, что при проведении процедуры трансформации и последующем культивировании трансформированной ткани регенерационная способность существенно снижается. До настоящего времени неоднозначным является выбор системы селекции трансгенной ткани. С одной стороны, использование высоких концентраций селективных агентов сразу с первых этапов культивирования позволяет проводить жесткий отбор трансгенной ткани и с высокой вероятностью избавляться от эскейпов. С другой стороны, сильное стрессовое воздействие селективных агентов и высокая к ним чувствительность эксплантов томата влечет за собой существенную потерю морфогенетического потенциала в результате ингибирования закладки регенерационных зон даже у трансгенных клеток (Дрейпер и др., 1991). В связи с этим, в исследовании была 11 использована стратегия постепенной адаптации эксплантов к селективному агенту, исключающая их шок и массовую гибель (первый пассаж без канамицина, второй – 10 мг/л, третий и последующие – 25 мг/л). За трое суток до инфицирования бактериальной суспензией экспланты семядолей помещали на среду для прекультивации, в результате чего происходило увеличение эксплантов в размере. После инфицирования бактериальной суспензией и этапа кокультивации экспланты переносили на среду для каллусообразования и регенерации, в результате чего в конце пассажа по краям срезов и в местах поранений наблюдалось формирование светлой плотной каллусной ткани. Отмечено, что экспланты, трансформированные бинарными векторами с генами хитинсвязывающих белков ас и Rs-intron-Shir, отличались меньшей способностью к формированию каллуса по сравнению с семядолями, трансформированными рВ-АМР1 и рВ-АМР2 (табл. 2). Таблица 2. Эффективность каллусообразования и селекции эксплантов семядолей при трансформации генетическими конструкциями, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов. Бинарный вектор рВI121ac pR830 рВАМР2 рВАМР1 общее шт. % 90 120 125 115 100 100 100 100 Количество эксплантов образовавших погибших каллус от от канамицина бактерии шт. % шт. % шт. % 58 64,4 19 21,1 65 72,2 69 57,5 7 5,8 103 85,8 109 87,2 38 30,4 70 56,0 96 83,5 30 26,1 72 62,6 прошедших селекцию шт. % 6 10 17 13 6,7 8,4 13,6 11,3 Несмотря на относительную легкость получения каллусных тканей, регенерация из них полноценных трансгенных побегов оказалась более трудной задачей. После переноса эксплантов на питательную среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика происходило снижение интенсивности нарастания каллусных тканей, их частичная некротизация, причем степень ее значительно усиливалась при возрастании концентрации канамицина в последующих пассажах. Побеги, регенерировавшие на ранних этапах культивирования, впоследствии проявляли признаки хлороза и не были 12 трансгенными. В то же время на образовавшейся каллусной ткани некоторых эксплантов происходило формирование плотных зелёных глобулярных меристематически активных участков, не проявляющих признаков отрицательного воздействия селективного агента и интенсивно нарастающих на среде, содержащей канамицин в концентрации, сублетальной для нетрансгенной ткани (25 мг/л). Тем не менее, высокая чувствительность эксплантов и каллуса к селективному антибиотику являлась причиной гибели большей части растительной ткани, которая в зависимости от генетической конструкции составила от 56,0 до 85,8%. Кроме того, во всех экспериментах наблюдалась бактериальная контаминация части эксплантов, которая также служила причиной исключения их из дальнейшего культивирования. Вынужденное длительное культивирование растительных тканей на питательных средах с целью получения регенерантов, устойчивых к канамицину, способствовало постепенному накоплению веществ токсического действия (фенольных соединений), что приводило к формированию растений с измененной морфологией. Наблюдались такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных побегов и, как следствие, уменьшение или полная потеря их способности к укоренению. В результате экспериментов по генетической трансформации бинарными векторами pBI121ac, pR830, pB-AMP2 и pB-AMP1 получено соответственно 6, 10, 17 и 13 независимых линий, интенсивно и полноценно развивающихся из каллусной ткани. Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был проведен ПЦР-анализ. При амплификации с использованием специфических праймеров на последовательность гена nptII были получены фрагменты, соответствующие положительному контролю во всех случаях (рис. 1А, 2А). Интеграция целевых генов ас, Rs-intron-Shir (рис. 1Б) и amp1 (рис. 2Б), как и в случае маркерного гена, показана во всех проанализированных образцах. Полноразмерная копия кДНК гена Stellaria media L., интегрированная в геном томата при трансформации бинарным вектором pB-AMP2, отмечена только у 11 из 17 независимо регенерированных побегов. Кроме того, у всех изученных образцов была проведена проверка препаратов тотальной ДНК на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения ложноположительных результатов вследствие бактериальной 13 контаминации. агробактерии. Все проанализированные образцы были свободны от А) 742 п.н. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Б) 1050 п.н. 300 п.н. 300 п.н. Рисунок 1. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами хитинсвязывающих белков, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-9 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pBI121ac; 11-20 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pR830; 10, 21 – положительный контроль (плазмиды pBI121ac и pR830). А) 742 п.н. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Б) 445 п.н. 765 п.н. Рисунок 2. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами гевеин-подобных антимикробных пептидов, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-16 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pB-АМР1; 18-34 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pB-АМР2; 17, 35 – положительный контроль (плазмиды pB-АМР1и pB-АМР2). Таким образом, эффективность трансформации по целевому гену при использовании векторных конструкций pBI121ac, pR830, pB-AMP2 и pB-AMP1 составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и 11,3%. Анализ экспрессии целевых генов у трансгенных растений проводили методом ОТ-ПЦР. Поскольку РНК значительно менее стабильна, чем ДНК, необходимым условием при проведении ОТ-ПЦР-анализа является использование так называемого внутреннего маркера, в частности, гена актина 14 для подтверждения сохранности РНК и синтезированной на её основе кДНК. При амплификации со специфическими праймерами на последовательность гена Tom 52 на электрофореграмме детектировались фрагменты соответствующего размера (450 п.о.) у всех изученных образцов (рис 3в, г, рис 4в, г). 1 а 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 б 15 16 17 18 19 20 21 22 120 п.н. 298 п.н. 23 24 25 26 27 в 28 29 30 31 32 33 г 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 450 п.н. 450 п.н. Рисунок 3. Анализ экспрессии генов, кодирующих хитинсвязывающие белки (ас – a; RS-intron-Shir – б) и актин (Tom 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1, 11, 23, 33 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2, 12, 24, 34 – вода; 3, 13, 25, 35 – отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-9, 26-31 – трансгенные растения, содержащие ген ас (соответственно линии 105, 106, 224, 250, 506, 702); 10, 32 – положительный контроль (плазмида pBI121ac); 14-21, 36-43 – трансгенные растения, содержащие ген RS-intron-Shir (соответственно линии 3/11b, 5/12, 6/11, 7/12, 8/14, 8/25, 12/11, 12/32); 22, 44 – положительный контроль (плазмида pR830). 1 а 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 б 765 п.н. 445 п.н. 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 в 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 г 450 п.н. 450 п.н. Рисунок 4. Анализ экспрессии генов, кодирующих гевеин-подобные антимикробные пептиды (amp1 – a; amp2 – б) и актин (Tom 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1, 15, 29, 43 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2, 16, 30, 44 – вода; 3, 17, 31, 45 – отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-13, 32-41 – трансгенные растения, содержащие ген аmp1 (соответственно линии 2/11, 2/21, 3/35, 4/33, 4/42, 5/11, 6/17, 8/25, 9/11, 9/32); 14, 42 – положительный контроль (плазмида pB-AMP1); 18-27, 46-55 – трансгенные растения, содержащие ген аmp2 (соответственно линии 3/13, 4/34, 5/32, 5/48, 5/51, 6/41, 8/12, 8/24, 9/44, 11/24); 28, 56 – положительный контроль (плазмида pB-AMP2). Установлено, что экспрессия целевого гена на транскрипционном уровне отмечена у всех 6 регенерантов, содержащих в геноме хитинсвязывающий ген 15 ас, а также у 7 из 8 проанализированных растений, содержащих гибридный ген Rs-intron-Shir (рис 3a, б). Использование праймеров на нуклеотидную последовательность генов, кодирующих гевеин-подобные пептиды, позволило установить образование мРНК у 6 из 10 трансгенных растений с геном amp2 и у 8 из 10 трансгенных растений с геном amp1 (рис. 4а, б). Трансгенные регенеранты были клонально размножены, успешно адаптированы к условиям in vivo и выращены в условиях защищенного грунта (рис. 5). А) Б) В) Г) Рисунок 5. Коллекция трансгенных линий томата с генами хитинсвязывающего белка ac (А) и гевеин-подобного антимикробного пептида amp2 (Б). Клональное размножение (В) и выращивание трансгенных линий томата в условиях защищенного грунта (Г). В процессе выращивания были отмечены линии, фенотипически отличающиеся от контрольных растений, которые характеризовались большей высотой, количеством междоузлий, формированием утолщенных листовых пластинок. Установлено, что у ряда линий не происходило формирование плодов и соответственно семян. В некоторых случаях происходило образование бессемянных деформированных плодов. Потомство Т1-трансгенных линий, полученных в результате самоопыления, проанализировано на определение характера наследования гена npt II по признаку устойчивости к канамицину. По результатам генетического анализа было установлено, что у большинства проанализированных линий соотношение канамицин-устойчивых к канамицин-чувствительным проросткам соответствует 3:1, что свидетельствует об интеграции в геном одной копии гена npt II. Установлено, что у линии с гибридным геном Rs-intron-Shir (8/14) большая часть потомства от самоопыления оказалась устойчивой к канамицину, что свидетельствует о присутствии в геноме двух вставок гена npt II. Кроме того, у одной линии, содержащей ген amp 2 (8/12), семенное 16 потомство проявляло канамицин-чувствительный фенотип, что свидетельствует о полной потери экспрессии гена npt II (табл. 3). Таблица 3. Анализ наследования гена npt II в поколении Т1-трансгенных растений томата. Ген RS-intron-Shir amp1 amp2 Линия 8/14 7/12 5/12 6/17 4/42 4/33 4/34 9/44 8/12 Количество проростков, шт. общее KmR KmS 151 138 13 79 60 19 108 80 28 79 63 16 140 110 30 105 86 19 124 96 28 82 61 21 124 0 124 χ2 Расщепление 1,43 0,04 0,05 0,95 0,95 2,67 0,39 0,02 - 15:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 - Примечание: KmR – канамицин-устойчивые проростки; KmS – канамицин-чувствительные проростки; χ2 теор. = 3,84 (df=1; α=0,05) Для лабораторной оценки на устойчивость к фитофторозу было отобрано по пять линий Т0 с каждым гетерологичным геном. Проанализированы растения, экспрессирующие гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, исходная линия ЯЛФ (контроль №1), а также трансгенные линии, у которых не происходило образование мРНК целевых генов (контроль №2). В результате заражения сегментов листа зооспорангиями P. infestans (Mont.) de Bary установлено, что изоляты, выделенные из томата, обладают значительно большей агрессивностью, чем изолят, выделенный из картофеля. Первые симптомы развития болезни, выражающиеся в появлении инфекционного пятна у большинства трансгенных образцов в месте нанесения суспензии, проявились на вторые сутки после инокуляции изолятом ИК3. Следует отметить, что заражение контроля №1 происходило несколько позже (через 72 часа после инокуляции), но существенно активнее в динамике. В случае инокуляции тестируемых образцов «томатными» изолятами ТПМ и ТЛЗ первые симптомы проявления фитофтороза отмечались также позже, чем при заражении изолятом ИК3. Однако на 5 сутки отмечено активное проявление болезни (интенсивное спороношение на уровне 3-4 баллов) у всех трансгенных линий, экспрессирующих гены ас, Rs-intron-Shir, amp2 и amp1, а также 17 контрольных образцов. Это способствовало тому, что к завершению эксперимента их листовая ткань полностью некротизировалась. Таким образом, все изученные растения были сильно восприимчивы к изолятам ТПМ и ТЛЗ P. infestans. Статистически значимых различий по устойчивости между вариантами не установлено. Существенные различия по степени устойчивости были обнаружены при инокуляции тестируемых линий изолятом ИК3 (табл. 4; рис. 6). Установлено, что у двух линий, экспрессирующих соответственно ген amp1 и amp2, на 7 сутки эксперимента не наблюдалось никаких признаков проявления болезни. Таблица 4. Оценка устойчивости трансгенных и контрольных растений томата к изоляту ИК3 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Ген ac Rs-intron-Shir amp1 amp2 - Площадь инфекционного пятна (см2)1 0,37 abcd 0,06 ab 0,02 a 0,10 abc 0,49 abcde 0,90 cdef 0,25 abcd 1,28 efg 0,85 bcdef 0,30 abcd 0a 0,35 abcd 2,46 h 1,53 fgh 0,44 abcde 0a 2,24 gh 0,06 ab 0,37 abcd 0,02 a 0,96 def Линия 106 224 250 506 702 3/11b 5/12* 6/11 7/12 8/14 3/35 4/33* 4/42 6/17 9/32 3/13 5/48 8/12 9/44* 11/24 ЯЛФ Класс устойчивости III II II II III III III III III III I III IV V III I V II III II III * – трансгенные растения без экспрессии целевого гена (контроль №2); – площадь инфекционного пятна с учетом преобразования с помощью ; Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (α=0,05). 1 18 А) Б) В) Рисунок 6. Сегменты листа устойчивой (А) и чувствительной (Б) трансгенных линий томата (соответственно линии 3/35 и 6/11), а также нетрансформированного контроля (В) на 7 сутки после инокуляции зооспорангиями изолята ИК3 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Кроме того, у трех линий, содержащих ген ас, и у двух линий, содержащих ген amp2, площадь инфекционного пятна в месте нанесения инокулюма была минимальной (не превышала 0,1 см2) и существенно отличалась от соответствующего значения контрольного нетрансгенного образца (0,96 см2). Показано, что все линии, содержащие ген Rs-intron-Shir, не отличались повышенной устойчивостью к «картофельному» изоляту по сравнению с контролем №1. Достоверное снижение устойчивости к изоляту ИК3 P. infestans (Mont.) de Bary по сравнению с нетрансформированной линией ЯЛФ в тесте с отделенными листьями наблюдали у 3 из 16 трансгенных растений (18,8%). Так, площадь инфекционного пятна у линий, экспрессирующих ген amp1 (4/42) и amp2 (5/48), была существенно больше, чем у контроля №1. Кроме того, на поверхности сегментов листа линий 5/48 и 6/17 наблюдалось спороношение на уровне 2-3 баллов, которое не отмечено ни у нетрасформированного образца, ни у других тестируемых трансгенных линий. Причиной снижения устойчивости может служить негативное плейотропное воздействие трансгена, отмеченное также при интродукции гена хитиназы в геном картофеля (Шахбазов и др., 2008). По результатам проведенной оценки испытуемых линий с использованием изолята ИК3 P. infestance (Mont.) de Bary все линии были подразделены на следующие классы, различающиеся по степени устойчивости (в порядке убывания): I – линии, у которых не отмечено симптомов развития болезни; II – линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна, площадь которого не превышала 0,1 см2 и была существенно ниже, чем у контроля №1; III – линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна, 19 площадь которого статистически незначимо отличалась по сравнению с контролем №1; IV – линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была больше и существенно отличалась по сравнению с контролем №1; V – линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была на уровне или больше, чем у контроля №1, а также наблюдалось спороношение. Таким образом, установлено, что при инокуляции сегментов листьев изолятом ИК3 P. infestance (Mont.) de Bary три линии, экспрессирующие ген ас, три линии, экспрессирующие ген amp2, и одна линия, экспрессирующая ген amp1, достоверно отличались повышенной устойчивостью по сравнению с нетрансформированным контролем. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии экспрессии генов хитинсвязывающего белка из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ на повышение устойчивости к возбудителю фитофтороза. Экспериментальные данные позволяют предположить перспективность использования вышеперечисленных гетерологичных генов для генетической трансформации промышленных сортов с целью повышения устойчивости к P. infestance (Mont.) de Bary и соответственно увеличения их продуктивности и качества товарной продукции. Одним из таких перспективных промышленных сортов томата является Рекордсмен, включенный в 2004 г. в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию на территории РФ. Сорт предназначен для выращивания в открытом грунте и находит широкое применение в Астраханской, Волгоградской и ряде других областей, являющихся основными отечественными поставщиками томата на российский рынок. Товарная продукция рекомендована для приготовления томатопродуктов. 2. Разработка эффективной системы регенерации в условиях in vitro промышленного сорта томата Рекордсмен. Одним из важнейших условий осуществления генетической трансформации является наличие высокой способности к регенерации полноценных фертильных побегов из культивируемых тканей и органов. При проведении агробактериальной трансформации растительные ткани подвержены целому ряду стрессовых факторов. Среди них можно отметить поранение экспланта, 20 непосредственный контакт с патогенным микроорганизмом, как правило, длительное культивирование на средах с регуляторами роста и селективными антибиотиками, а также сама инсерция Т-ДНК в геном. В связи с этим, регенерация целого растения является одним из наиболее критических этапов всей процедуры переноса гетерологичной ДНК, что требует проведения ряда экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro с частотой не ниже 80%. Анализ литературных данных свидетельствовал о том, что ранее морфогенетическая реакция в культуре ткани томата сорта Рекордсмен не изучалась, поэтому одной из задач настоящего исследования было оценить регенерационную способность различных типов эксплантов и на ее основе разработать методику эффективной регенерации. При помещении сегментов гипокотилей и семядолей на питательные среды различного состава наблюдалось увеличение размера клеток у обоих типов эксплантов. Так, уже на 5 сутки культивирования образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых впоследствии формировалась каллусная ткань. Установлено, что добавление в состав питательной среды регуляторов роста оказывало существенное влияние на процесс каллусогенеза (рис. 7). Рисунок 7. Эффективность каллусообразования эксплантов семядолей и гипокотилей при культивировании на питательных средах с различными типами и концентрациями регуляторов роста. 21 Так, на среде, не содержащей регуляторов роста (MS0), интенсивность нарастания каллусной ткани у гипокотилей была слабой, а у семядолей каллусогенез отсутствовал вовсе. В последнем случае наблюдалась массовая гибель клеток, в результате чего экспланты семядолей были полностью подвержены некрозу и прохождение дальнейших процессов морфогенеза отсутствовало. При помещении семядолей на питательные среды с добавлением регуляторов роста частота каллусообразования была максимальной и составила 100%. Аналогичные результаты наблюдались и при культивировании сегментов гипокотилей на средах MS2, MS3, MS4, MS5 и MS7, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с различными типами и концентрациями ауксина. Повышение концентрации зеатина (3-5 мг/л), а также использование большинства концентраций 6-БАП (MS11, MS12, MS13) в составе питательной среды существенно ингибировало процесс формирования каллуса у эксплантов гипокотилей. В целом, установлено, что каллусообразующая способность семядолей была существенно выше (93,8%), чем гипокотилей (86,2%). Образующаяся на семядолях и гипокотилях каллусная ткань при культивировании на различных вариантах сред была преимущественно светлозеленого или желто-зеленого цвета, плотной зернистой структуры (рис. 8). А) Б) Рисунок 8. Формирование каллусной ткани гипокотилей (Б) томата сорта Рекордсмен. у эксплантов семядолей (А) и Данный тип каллуса обладал высокой морфогенетической способностью, в результате чего в конце первого – начале второго пассажей отмечалось образование большого количества меристематически активных участков, на которых впоследствии и происходила регенерация побегов. Наибольшая частота регенерации побегов из семядолей отмечена при культивировании эксплантов на среде MS1, содержащей 1 мг/л зеатина и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты (93,3%). Однако этот вариант статистически 22 незначимо отличался от питательных сред, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с более высокими концентрациями ИУК (MS2, MS3, MS6), а также при использовании НУК в качестве ауксинового компонента (MS4, MS7) (табл. 5). Таблица 5. Эффективность органогенеза побегов томата сорта Рекордсмен и их морфометрическая характеристика. Вариант Частота регенерации1, % среды семядоли гипокотили MS0 0,0 a 39,3 efg MS1 93,3 h 50,0 efg MS2 90,8 gh 88,4 h MS3 77,8 fgh 61,8 fgh MS4 68,9 efgh 67,1 gh MS5 4,5 ab 1,2 a MS6 58,7 cdefgh 36,0 defg MS7 64,1 defgh 58,5 fgh MS8 16,4 abc 53,3 efg MS9 34,8 bcdef 28,5 cdefg MS10 25,0 bcde 26,5 bcdef MS11 19,3 abcd 2,4 ab MS12 22,2 abcde 4,5 abc MS13 10,8 ab 19,3 abcde MS14 22,2 abcde 4,5 abc MS15 2,4 ab 23,2 bcdef Средняя 38,2 a 35,3 a 1 Количество побегов на один эксплант2, шт. семядоли гипокотили 0a 2,65 de 2,28 fg 2,10 cde 2,35 g 2,65 e 2,06 efg 1,59 bcde 1,82 defg 1,72 bcde 0,61 abc 0,54 ab 1,46 сdefg 1,34 abcde 1,59 cdefg 1,37 abcde 0,80 abcd 1,50 bcde 1,19 bcdef 1,40 abcde 0,90 bcd 1,53 bcde 0,99 bcde 0,30 a 1,16 bcdef 0,61 ab 0,69 abc 0,99 abc 1,56 cdefg 0,46 ab 0,30 ab 0,99 abc 1,24 a 1,36 a Длина побега3, см семядоли гипокотили 2,47 ± 0,21 1,67 ± 0,1 0,9 ± 0,17 2,11 ± 0,18 0,57 ± 0,01 1,82 ± 0,02 0,51 ± 0,14 1,24 ± 0,1 0,61 ± 0,06 0,65 ± 0,15 0,6 1,61 ± 0,24 1,1 ± 0,14 1,29 ± 0,13 0,75 ± 0,04 1,14 ± 0,04 0,48 ± 0,02 1,02 ± 0,37 0,54 ± 0,18 1,03 ± 0,1 0,59 ± 0,15 0,81 ± 0,16 1,25 0,77 ± 0,31 0,95 ± 0,15 2,9 ± 0,6 1,24 ± 0,29 2,97 ± 1,72 0,5 ± 0,2 0,75 0,88 ± 0,31 - – частота регенерации побегов с учетом преобразования с помощью угол – арксинус ; – количество побегов на одном экспланте с учетом преобразования с помощью ; 3 – длина побега ± ошибка средней; Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (α=0,05). 2 Снижение процессов морфогенеза наблюдалось при применении высоких концентраций зеатина. Аналогичные результаты обнаружены и при культивировании сегментов гипокотилей, за исключением варианта с использованием среды MS2, где была достигнута максимальная частота 23 регенерации (88,4%), тогда как применение среды МS1 было не столь эффективным (50,0%). В результате проведенного исследования установлено, что высокая концентрация НУК (0,5 мг/л) способствовала сильному ингибированию пролиферации побегов как из эксплантов семядолей, так и из гипокотилей. Кроме того, регенеранты, полученные на этом варианте, имели редуцированный статус (менее 1 см в длину), а количество побегов, полученных от одного экспланта, было сравнительно низким. Отмечена значительно более высокая частота регенерации побегов и большее их число при культивировании семядолей и гипокотилей на средах, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с ауксином в низких концентрациях (0,1 и 0,2 мг/л) по сравнению со средами, содержащими 6-БАП в качестве источника цитокинина. Кроме того, при использовании зеатина в низких концентрациях регенерация адвентивных побегов начиналась на 3-5 дней быстрее, чем в вариантах с 6-БАП. Рядом авторов приводятся сведения о положительном эффекте двух типов цитокининов на клеточную дифференциацию эксплантов томата in vitro (Osman et al., 2010; Krasnyanski et al., 2001). В настоящем исследовании сочетание 1 мг/л зеатина и 2,5 мг/л 6-БАП не только не способствовало увеличению, а, наоборот, существенно редуцировало частоту регенерации побегов из эксплантов семядолей и гипокотилей, а также снижало их количество по сравнению со средой MS2, содержащей один источник цитокина (зеатин) в концентрации 1 мг/л. Данные дисперсионного анализа не установили статистически значимых различий между типами эксплантов (в среднем по всем изученным вариантам питательных сред) по показателям частоты регенерации побегов (38,2% у семядолей и 35,3% у гипокотилей), а также по их количеству с одного экспланта (1,24 побега на семядолях и 1,36 побега на гипокотилях). Таким образом, разработан протокол эффективной регенерации растений из соматических тканей томата промышленного сорта Рекордсмен. Использование 1 мг/л зеатина в сочетании с 0,2 мг/л ИУК обеспечивало наибольший выход регенерантов как из эксплантов семядолей, так и гипокотилей. Данный состав питательной среды впоследствии был использован в эксперименте по генетической трансформации. 24 3. Разработка системы агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен. Успех в получении трансгенных растений во многом зависит от выбора концентрации селективного агента, позволяющего проводить селекцию трансформированных клеток, которые составляют весьма небольшую часть среди всех клеток экспланта. Для определения оптимальной концентрации селективного агента была проведена оценка влияния канамицина на прохождение процессов морфогенеза из эксплантов семядолей и гипокотилей. Установлено, что привнесение канамицина в состав регенерационной среды приводило к возрастанию степени некротизации обоих типов эксплантов и ингибированию процессов морфогенеза. Определено, что оптимальной концентрацией канамицина для отбора трансформированных клеток является 25 мг/л. В эксперименте по генетической трансформации бинарным вектором pBINmGFP5ER было использовано 150 эксплантов семядолей и 100 сегментов гипокотилей. После периода инокуляции и совместного кокультивирования с агробактерией экспланты помещали на регенерационную среду, содержащую регуляторы роста в оптимальном соотношении (1 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК) и антибиотик тиментин в концентрации 300 мг/л для элиминации агробактерии. В результате в начале первого пассажа происходило увеличение размера клеток растительной ткани и образование многочисленных глобулярных очагов каллусной ткани на всей поверхности трансформированных и контрольных семядолей. Частота каллусообразования эксплантов семядолей составила 90,0%. Что касается сегментов гипокотилей, формирование небольших очагов каллуса происходило по краям срезов и отмечалось лишь у 10,0% эксплантов. После переноса эксплантов на среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика наблюдалась некротизация каллусной ткани трансформированных и контрольных эксплантов, причем интенсивность ее значительно увеличилась при последующем культивировании на более высоких концентрациях канамицина (25 мг/л). Побеги, регенерированные в течение 1-го – 2-го пассажей, впоследствии проявляли признаки хлороза. Помимо высокой реакции чувствительности эксплантов к канамицину, у части семядолей наблюдалась бактериальная контаминация. Отмеченные явления приводили к тому, что после 1,5 месяцев культивирования большинство эксплантов погибло (табл. 6). 25 Таблица 6. Эффективность каллусообразования и селекции трансформантов томата сорта Рекордсмен при использовании векторной конструкции pBINmGFP5ER. общее Тип экспланта семядоли гипокотили шт. % 150 100 100 100 Количество эксплантов образовавших прошедших погибших каллус селекцию от от бактерии канамицина шт. % шт. % шт. % шт. % 135 90,0 18 12,0 131 87,3 1 0,7 10 10,0 0 0 100 100 0 0 В результате длительного культивирования на селективной среде (более 6 месяцев) из экспланта семядоли была сформирована одна интенсивно и полноценно развивающаяся каллусная ткань (рис. 9Б, 9В). Впоследствии из неё было регенерировано 5 зелёных побегов. Вероятнее всего, они являются результатом одного трансформационного события, то есть представляют собой клоны. Регенерированные побеги образовали хорошо развитую корневую систему на среде для укоренения, содержащей 100 мг/л канамицина, и были признаны как предположительно трансгенные (рис. 9Г). А) Б) В) Г) Рисунок 9. Этапы генетической трансформации томата сорта Рекордсмен при использовании вектора pBINmGFP5ER: А) трансформированные и контрольные экспланты семядолей; Б) формирование каллуса и начало регенерации побегов на селективной среде с добавлением 25 мг/л канамицина; В) массовая регенерация канамицин-устойчивых побегов; Г) укоренение побегов на среде для ризогенеза с добавлением 100 мг/л канамицина. В результате проведенного ПЦР-анализа было установлено, что все пять полученных канамицин-устойчивых регенерантов являются трансгенными как по селективному, так и репортерному генам (рис. 10). Флуориметрический анализ установил наличие стабильной экспрессии репортерного гена GFP в листьях и корнях трансгенных растений (рис. 11). 26 А) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Б) В) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 742 п.н. 397 п.н. 3 4 5 6 7 8 9 670 п.н. Рисунок 10. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК канамицинустойчивых регенерантов томата на наличие фрагментов генов gfp (А), nptII (Б) и virB (В) при помощи метода ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-8 – трансгенные регенеранты томата; 9 – положительный контроль (плазмида pBINmGFP5ER). а а б 1) белый свет а ультрафиолетовый свет а б 2) Рисунок 11. Детекция экспрессии гена gfp в листьях и корнях растений томата: 1) контрольное (нетрансгенное) растение; 2) трансгенное растение; а) лист; б) корень. Таким образом, в результате проведенных исследований разработана система агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен. Эффективность трансформации при использовании эксплантов семядолей составила 0,7%, тогда как применение гипокотилей не привело к получению трансгенных растений. Полученные результаты согласуются с литературными данными, что коммерчески значимые сорта обладают меньшей, чем модельные генотипы эффективностью трансформации и требуют индивидуальной разработки протоколов агробактериальной трансформации (Дрейпер и др., 1991; Sharma et al., 2009; Chaudhry and Rashid, 2010). Разработанная система генетической трансформации позволяет впоследствии интегрировать гетерологичные гены в геном томата промышленного сорта Рекордсмен, в том числе, гены, кодирующие хитинсвязывающий белок из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. 27 ВЫВОДЫ 1) Методом агробактериальной трансформации получены трансгенные растения томата селекционной линии ЯЛФ (6, 7, 6 и 8 независимых линий с генами ас, Rs-intron-Shir, amp1 и amp2 соответственно), у которых экспрессия гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеинподобных антимикробных пептидов подтверждена молекулярногенетическим анализом. 2) Экспрессия генов хитинсвязывающих белков из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ приводит к повышению устойчивости к возбудителю фитофтороза. 3) Установлен различный характер наследования селективного гена npt II в поколении Т1-трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ. У семи трансгенных линий содержится одна инсерция гена npt II, у одной линии – две инсерции гена npt II. У одной линии наблюдалось замолкание экспрессии селективного гена. 4) Разработана методика эффективной регенерации и агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Разработка системы регенерации и изучение трансформационного потенциала томата промышленного сорта // Доклады РАСХН. 2010. № 3. С. 22-26. 2. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Генетическая трансформация томата (Solanum lycopersicum L.) генами защитных хитинсвязывающих белков и антимикробных пептидов // Известия ТСХА. 2010. № 6. С. 75-83. 3. Чабан И.А., Халилуев М.Р., Долгов С.В. Цитоэмбриологическое изучение трансгенных растений томатов с аномальным фенотипом // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 18-21 октября 2010 г). С. 84. 4. Халилуев М.Р., Мамонов А.Г., Смирнов А.Н., Долгов, С.В. Получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.) с повышенной устойчивостью к фитофторозу // Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс» (Москва, 9-12 ноября 2010 г). С. 373-374. 28 БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность всем соавторам по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы, помощь при проведении исследований и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории генной инженерии растений Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Особую признательность автор выражает всем своим близким, в особенности, родителям, за всестороннюю помощь, поддержку и терпение. 29