Полная генетическая коррекция клеток ИПС.
реклама
Полная генетическая коррекция клеток ИПС. Yasuhiro Kazuki,1 Masaharu Hiratsuka,2 Masato Takiguchi,1 Mitsuhiko Osaki,1 Naoyo Kajitani,1 Hidetoshi Hoshiya,1 Kei Hiramatsu,1 Toko Yoshino,3 Kanako Kazuki,1 Chie Ishihara,1 Shoko Takehara,1 Katsumi Higaki,3 Masato Nakagawa,4,5 Kazutoshi Takahashi,4 Shinya Yamanaka,4,5,6 and Mitsuo Oshimura1,7 Введение Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки имеют огромный потенциал для клеточной терапии генетическимх нарушений, так как такие клетки могут способствовать развитию специализированных функций любой ткани Тем не менее, одна потенциальная проблема использования ЭС клеток для лечения генетических заболеванийиммунологическое отторжение хозяином трансплантированных клеток. Хотя ЭС клеток для генной терапии могут быть созданы для пациента с использованием ядерной технологии передачи, возникают многие этические проблемы, связанные с этим. Наоборот, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPS) могут быть получены из тканей человека с определенными факторами. Генная и клеточная терапия клетками иПК, таким образом, имеют преимущества над переносом ядра ЭС клеточной генной терапии по отношению к этическим проблемам, а также уменьшает генетические различия и поэтому уменьшает вероятность отторжения . Гомологичные рекомбинации были использованы для восстановления генов при различных генетических дефектах в ЭС или иПК клетках с использованием собственной генетической информации. Тем не менее, генные дефекты с неизвестными сайтами мутаций и с большими делециями не могут быть восстановлены путем гомологичной рекомбинации. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) обусловлена нарушением функции гена дистрофина. У некоторых пациентов с МДД есть большие делеции в гене МДД, эти дефекты не могут быть восстановлены путем гомологичной рекомбинации или подхода с использованием пропуска экзона. Хотя некоторые векторы были разработаны для генной терапии МДД, не эписомной вектор, содержащий всю область генома дистрофина, как сообщается, из-за очень большого размера этого региона (2,4 megabases) человека искусственную имеет ряд преимуществ, как генная векторная терапия, что позволяет избежать инсерционного возникновения мутаций и возможности вносить большие вставки гена в том числе связанные нормати элементы. Поэтому мы недавно разработали ВАК вектор, содержащий весь геном дистрофина для генной терапии МДД. В этом исследовании мы установили, HAC-опосредованные транспортные системы в качестве парадигмы для лечения генетического заболевания, такого как МДД путем объединения производных иПК клеток пациентов и ВАК вектора, содержащего нормальную версию дефектного гена. Результаты Характеристика ИПС клетки мышей MDX Во-первых, мы попытались провести генетическую коррекцию клеток иПК, полученных у мыши MDX, в качестве модели для МДД (рис. 1).MDX-ИПС клетки, индуцированные из MDX мышиных фибробластов антиретровирусной инфекцией трех факторов, включая Klf4, Sox2, и Oct4. Трансдуцированные фибробласты мышей MDX произвели ЭС клеточные колонии, и эти колонии были выделены на основе морфологических критериев. Большинство MDX-ИПС клеток имели положительные маркеры ЭС клетки, отображали нормальный кариотип. (S1 Дополнительный рисунок). Два случайно выбранных клонов были использованы для следующих экспериментов. Коррекция MDX-ИПС клеток DYS-ВАК Ранее мы разработали новый вектор ВАК, содержащий полную длину генома дистрофина, который был назван DYS-HAC. DYS-ВАК, который содержит ген GFP маркер визуализации и ген самоубийства, два независимых MDX-IPS клонов инфицированы этим вектором через микроэлемент-опосредованную передачу хромосомы (MMCT). Восемь GFP + клонов были отобраны и исследованы в следующих экспериментах (рис. 2а). ПЦР с использованием праймеров для выявления DYS-ВАК показали, что шесть из восьми клонов содержали нетронутые области дистрофина (рис. 2б). Обратная транскрипция ПЦР показала экспрессию дистрофина, DYS-ВАК был обнаружен в шести клонах с неповрежденным геномом дистрофина, тогда как зеленый флуоресцентный белк (EGFP) была экспрессирован во всех клонах (Рис. 2d). Флуоресцентная гибридизация (FISH) показала, что DYSВАК присутствовал в качестве отдельных хромосом в MDX-IPS клетках (рис. 2). Эти результаты показывают, что DYS-ВАК может быть передан иПК клеткам в сопоставимой эффективности, что и ЭС клеткам Для проверки ИПС клеток, ОТ-ПЦР анализ с использованием праймеров для ЭС -специфических генов был проведен (Рис. 2d). Эндогенные Rex1, Nanog, Oct4 и Sox2 были выявлены во всех MDX-IPS (DYS-HAC) клетках, сопоставимо с родительскими MDX-IPS и Nanog-IPS клетками порожденными ранее, в том числе с-Myc. Экзогенная экспрессия Klf4, Sox2, и Oct4 в большинстве MDX-IPS (DYS-HAC) клеток была ниже, чем у родителей MDX-IPS клеток. Чтобы определить, обладают ли MDX-IPS (DYS-HAC) клетки способностью дифференцироваться в трех эмбриональных зародышевых листках (энтодерме, мезодерме и эктодерме), клетки подкожно вводили мышам. Пересадка MDX-IPS (DYS-HAC) привела к типичным тератомам (п = 10) и GFP + ткани были обнаружены в этих тератомах (Дополнительный рисунок S2A, б). Гистологический анализ показал, что опухоль, содержала все три эмбриональных зародышевых листка (S2C дополнительный рисунок). FISH анализ показал, что DYS-ВАК был обнаружен в 90% клеток в опухолевых тканях (дополнительный рисунок S2D). Иммуногистохимический анализ обнаружил проявление человеческого дистрофина в мышечной ткани в тератомах, полученных от MDX-IPS (DYS-HAC) клеток, но не из MDX-IPS клеток (рис. 2, д). Экспрессия в тканях химерных мышей с DYS-ВАК Для того чтобы определить потенциал развития и экспрессии дистрофина в различных тканях, химерные мыши были получены при введении MDX-IPS (DYS-ВАК) (S2E дополнительный рисунок). Химеры с различными формами химеризма были получены. Ген EGFP управляется CAG промоутером экспрессированным DYS-ВАК во всех исследованных тканях (рис. 3а), предполагая, что DYS-ВАК стабильно поддерживается в естественных условиях. Для исследования того, как экспрессируются тканеспецифические изоформы дистрофина из DYS-ВАК, была выделена общая РНК из разных тканей, химеры были проанализированы с помощью ОТ-ПЦР, используя три пары праймеров, специфичных для обнаружения транскриптов дистрофина. Изоформы Dp427I и Dp427m были экспрессированы в химерных сердцах и скелетных мышцах, и Dp140 был экспрессирован в мозге, сравнимого с профилем экспрессии человека (рис. 3б). FISH анализ показал, что DYS-ВАК был обнаружен в 50% клеток, по крайней мере, в мозге, печени, почках, селезенке и скелетных мышцах (рис. 3в). Это обнаружение связано с цветным химеризмом, и DYS-ВАК присутствовал в качестве отдельных хромосом в химерных фибробластах (Дополнительный рисунок S2E, е). Иммуногистохимический анализ с использованием специфических антител против человеческого дистрофина показал, что человеческий белок дистрофин локализован в сарколемме в скелетных мышцах (рис. 3). Эти результаты показывают, что изоформы дистрофина на DYS-HAC были выражены в ткани определенным образом, и человеческий белок дистрофин был локализован в правильном локусе в ИПС, полученных химерных скелетных мышц. Эти данные согласуются с результатами предыдущих исследований с использованием химерных мышей от нормальных клеток мыши с ES-DYS HAC. Коррекция DMD-IPS клетки DYS-ВАК Затем мы попытались провести генетическую коррекцию клеток, полученных из иПК МДД пациента (рис. 1). Мы выбрали пациентов с делециями экзонов 4-43 для индукции клетки иПК, из-за большой делеции этот тип не может быть исправлен даже с помощью гомологичной рекомбинации или других традиционных векторов. DYS-ВАК был введен в производные фибробластов через MMCT, мы смогли напрямую передавать ВАК в человеческий иПК или ЭС клетки человека, в связи с трудностью клонирования колонии, полученные от одной клетки после трансфекции или MMCT. DYS-ВАК был успешно передан МДД-фибробластам, как показано с помощью ПЦР и мультиплексного ПЦР анализа (рис. 4а и дополнительные Рисунок S3a). FISH анализ показал, что DYS-ВАК присутствовал в качестве отдельных хромосом в производных фибробластов (данные не представлены).ИПК клетки были получены из МДДфибробластов с DYS-HAC с использованием комбинации лентивирусов Slc7a1 мыши и ретровирусов KLF4, Sox2, OCT4 и С-MYC, как сообщалась ранее. Тридцать клонов GFP + и человеческих ЭС- DMD-IPS (DYS-HAC) клеток, полученных из трех независимых МДД-фибробластов (DYS-HAC) , были выбраны, и случайно выбранные девять клонов были проанализированы в следующих экспериментах. Для проверки стволовых клеток ИПС использован ОТ- ПЦР анализ с использованием праймеров для ЭС -специфических генов (рис. 4в). Эндогенные Rex1, NANOG, OCT4 и Sox2 были поразному экспрессированы в клетках ИПС. Экзогенные , KLF4, Sox2, и С-MYC были экспрессированы в некоторых клетках ИПС. Эти результаты показывают, что МДД-ИПС (DYS-HAC) клетки были сопоставимы с МДД-ИПС и нормальными человеческими клетками ИПС. ПЦР и мультиплексный ПЦР анализ показал, что DYS-ВАК сохранялась во всех изученных иПК клетках, сопоставимо с родительскими МДД-фибробластами (DYS-HAC) (Дополнительный рисунок S3a, б). FISH анализ показал, что DYS-ВАК присутствовал в качестве отдельных хромосом в МДД-ИПС (DYS-HAC) клетках (рис. 4б). Для изучения митотической стабильности DYS-ВАК в DMD-IPS (DYS-HAC) клетках, ИПС клетки культивировали в течение 4 месяцев без выбора. FISH анализ показал, что DYS-ВАК был независимо и стабильно поддерживается в МДД-ИПС(DYS-HAC) клетках (рис. 4д). Эти данные свидетельствуют о том, что DYS-ВАК может быть сохранен стабильно во время генерации ОЭС и даже после длительного культивирования в лабораторных условиях. Чтобы определить, могут ли МДД-ИПС (DYS-HAC) клетки дифференцироваться во все три эмбриональных зародышевых листка, клетки вводили в яички мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Пересадка МДД-ИПС (DYS-HAC) привела к типичным тератомам (п = 12) и GFP + ткани были обнаружены в этих тератомах (Дополнительный рисунок S4a). Гистологический анализ показал все три эмбриональных зародышевых листков во всех тератомах (S4b дополнительный рисунок). FISH анализ показал, что DYS-ВАК был обнаружен в 90% клеток в опухолевых тканях (S4C дополнительный рисунок). Иммуногистохимический анализ показал экспрессию человеческого дистрофина в мышечной ткани, как тератом, полученных из МДД-ИПС (DYS-HAC) клеток, но не из МДД клеток (рис. 4е). Эти данные были сопоставимы с результатами MDX-ИПС (DYS-HAC) экспериментов, упомянутых выше. Эти данные позволяют предположить, что потеря экспрессии дистрофина у МДД-производных мышечной ткани была восстановлена путем передачи DYS-ВАК в МДД-ИПС клетки. Дискуссия Ранее, мышинные иПК клетки, полученные при серповидно-клеточной анемии были исправлены с использованием гомологичной рекомбинации, с помощью ИПС- у модели мышей. Совсем недавно, производные иПК клеток пациента с анемией Фанкони исправили с помощью вирусного вектора, а ИПС клетки могут привести к образованию кроветворных предшественников из миелоидных и эритроидных линий, показывая коррекцию заболевания. Тем не менее, генетическая реставрация гомологичной рекомбинацией и перенос генов с использованием традиционных векторов, в том числе вирусных и плазмидных векторов, не может быть применена у пациентов с МДД при больших делециях в гене. Результаты данной работы показали, что выполнена первая полная генетическая коррекция человеческого генетического заболевания, МДД, с удалением экзона 4-43, используя новые ВАК как эписомной вектор. Как Кимура и соавт. недавно сообщали о миогенном преобразовании фибробластов трансдуцией индуцибельным миогенным регулятором, MyoD (DYS-HAC), разработанной в данном исследовании, может представлять собой источник генной терапии. Насколько нам известно, ИПС клетки были получены из человеческой популяции первичных фибробластов, но не из клонированных клеток. В этом исследовании, мы могли бы генерировать клетки пациента, полученные генетическим исправлением иПК клеток из фибробластов даже после того, как проведено клонированние MMCT. Хотя несколько изоформ дистрофина не может быть экспрессировано с помощью векторных систем, наша система HAC вектор, содержащий весь геном дистрофина, включал изоформы из различных тканей с содержанием DYSВАК в ткани. Интеграция вирусных векторов была использована для ИПК в этом исследовании, однако, ИПС индукция используя неинтегративный вектор, система введения белка, химических малых молекул могут быть необходимы для безопасной генной терапии. ВАК вектор может быть перспективным средством для безопасного производства ИПС: ВАК является неинтегративным вектором. В методах MMCT, вполне возможно, что хозяйские хромосомы (например, A9 и СНО) могут быть переданы вместе с ВАК сразу. Тем не менее, мы редко наблюдается ко-передачи принимающей хромосомы во время MMCT (~ 1/100 клонов). В этом исследовании, принимающих хромосом не было обнаружено в MDX-IPS клетках и МДДфибробластах после MMCT (данные не представлены). Кроме того, предвидятся достижения в области эффективных методов дифференциации и очистки стволовых клеток, в том числе и иПК ЭС клеток . Барбери и соавт. сообщил о получении скелетных миобластов из человеческих ЭС клеток. Дараби и соавт. также сообщали о поколении функциональных скелетных мышц из ЭС клеток мыши при индукции Pax3 и лечении мышей с использованием многомерных ЭС клеток. Применение этих методов иПК клеток в сочетании с нашей системой HAC вектора может открыть путь к более сложным методам генной терапии. Взятые вместе, генетическая коррекция конкретного пациента, MMCT из DYS-ВАК, эффективная дифференциация иПК клеток в стволовые клетки мышц в пробирке, и трансплантация генетически исправленных аутологичных клеток у одного пациента, необходимы для генной терапии МДД (рис. 1). Таким образом, стволовые клетки, полученные из нескольких потенциальных источников в сочетании с HAC-опосредованной доставкой генов должно позволить безопасное лечение различных генетических дефектов в будущем. Материалы и методы Клеточные культуры. Фибробласты от МДД пациента (GM05169), содержащие делецию экзонов 4-43 в гене дистрофина были получены из Coriell института (Камден, штат Нью-Джерси). Фибробласты выращивали в α-MEM плюс 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 2 ммоль / л L-глутамина. МДД мыши (MDX), были получены от Charles River (Иокогама, Япония) и мышиные эмбриональные фибробласты (MEFs) были выделены из эмбриона 13,5 дней. MDXMEF и платформа E клетки были выращены в среде Дульбекко (Sigma, Сент-Луис, Миссури), а также 10% FBS. A9 клетки, содержащие DYS-HAC были выращены ранее. СНО (DYS-HAC) клетки поддерживались в среде Хэма F-12 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), а также 10% FBS с 8 мкг / мл гидрохлорида бластицидина S (Фунакоши, Токио, Япония).A9 (DYS-HAC) клетки поддерживаются в среде Дульбекко плюс 10% FBS с 4 мкг / мл гидрохлорида бластицидина S. Родительская MDX-IPS клеточная линиия и микроэлемент гибридных клонов, MDX-IPS (DYSHAC), были сохранены в митомицин С (Sigma) Jcl: ICR (CLEA Япония, Токио, Япония) В клетках человека иПК были сохранены в SNL (STO) в клетках приматов ЭС (ReproCell, Токио, Япония) с добавлением 4 нг / мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (Вако, Осака, Япония). Мышинные и человеческие иПК клеток были сохранены, как описано ранее. Nanog-IPS (APS0001, IPS-MEF-Ng-20D-17), была получены из RIKEN BRC банка (Цукуба, Япония). Линия клеток SNL для фидерного слоя была получена из Sanger Institute (Кембридж, Великобритания). Генерация клеток ИПС. Генерация клеток иПК из MDX-MEFs была выполнена с использованием антиретровирусной системы, как описано ранее Короче говоря, ретровирусы были получены из Плат-E клеток. Ретровирусы Oct4, Klf4 и Sox2, были инфицированы в MDX-MEFs. Через четыре дня после трансфекции, MDX-MEFs были пересажены. 3,5 × 105 клеток на 100 см блюдо клеток MEF. На следующий день, среда была заменена на клетки ЭС. Через тринадцать дней после заражения, ЭС-подобные колонии были выбраны до подселения MEF клеток на 24-луночных планшетах. Поколение ИПС клетки из человеческих МДД-фибробластов проводили с помощью ретровирусной системы в сочетании с лентивирусной системой, как описано ранее Короче говоря, лентивирус с экспрессией Slc7a1 выделен с помощью 293T клеток и лентивирусом были инфицированы человеческие фибробласты. Четыре группы ретровирусов содержащие OCT4, KLF4, Sox2 и С-MYC инфицировали человеческие МДД-фибробласты. Четыре группы ретровирусных векторов экспрессии были получены из Addgene (Кембридж, Массачусетс). Через шесть дней после трансфекции фибробласты пересажены по 5 × 104 клеток на 100 см блюдо на клетки SNL. На следующий день, среда была заменена . Через тридцать дней после трансдукции, человеческие ЭС,-подобные колонии были выбраны до подачи SNL клеток на 24-луночных планшетах. MMCT. MMCT проводили, как описано ранее CHO или A9 клетки, содержащие DYS-HAC были использованы в качестве доноров гибридов. Короче говоря, MDX-IPS и МДД-клетки фибробластов были слиты с микроэлементами приготовленных из гибридных доноров СНО (DYS-HAC) или А9 (DYS-HAC) клеток. Геномный анализ ПЦР. Геномная ДНК была извлечена из клеточных линий и химерных образцов ткани с помощью комплекта извлечения генома (Gentra Systems, Minneapolis, MN) и ПЦР проводили с использованием праймеров следующим образом. Праймеры для выявления области человеческого гена дистрофина, были следующие: DYS3L/3R [163 пар оснований (п.о.)], 5'-AACAACTGAACAGCCGGTGGA-3 'и 5'-GGGGTGGTGGGTTGGATTTT-3' DYS4L/4R (128 б.п.) , 5'GCAAGAGCAACAAAGTGGCCTA-3 'и 5'-AGCTTCTTCCAGCGTCCCTCA-3' DYS5L/5R (132 б.п.), 5'ACCTTCAGAACCGGAGGCAAC-3 'и 5'-AGGGACCCTCCTTCCATGACTC-3' DYS6L/6R (170 б.п.), 5'TGGAACGCATTTTGGGTTGTT-3 'и 5'-AAAACAATGCGCTGCCTCAAA-3' DYS7L/7R (151 б.п.), 5'TTTGCATCCTTTTGGCGTGAT-3 'и 5'-AAACTCAAGCCTGCCCCACTC-3' DYS8L/8R (155 б.п.), 5'GCTGCTAGCAATGCCACGATT-3 ' и 5'-GGATGGGCTGGGAATCCATAG-3 '. Для выявления EGFP на ВАК, генома мыши (A9), а генома хомяка (СНО) были следующими: EGFPL / R (479 б.п.), 5'-CCTGAAGTTCATCTGCACCA-3 'и 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3' Cyp3a13 -5L/6R (239 б.п.), 5'-GCTCAGCAGGCTCAGCCCTGA-3 'и 5'TCCAAGCCAGTAAAGGAAAGAATTAT-3' Фурин-L / R, 5'-ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAG GGAGG-3'и 5'GCTCGAGCGGCTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC-3'. Мультиплексная ПЦР для выявления делеций экзонов в человеческом дистрофине была проведена в соответствии с протоколами производителя (Максим Biotech, Сан-Франциско, Калифорния). СНО (DYS-HAC), А9 (DYS-HAC), HFL1 и HFL1-IPS были использованы в качестве положительного контроля. MDX-IPS, DMD-фибробласты, DMD-IPS, СТО, СНО, и A9 клетки были использованы в качестве отрицательного контроля. ОТ-ПЦР анализ. Вся РНК из химерных образцов ткани была подготовлена на основе ISOGEN (Nippon Gene, Токио, Япония) и очищена с использованием RNeasy колонок (Qiagen, Hilden, Германия), в соответствии с инструкциями производителя, а затем обработана РНКазой без ДНКазы I (Вако ). Первая нить комплементарной ДНК (кДНК) Синтез осуществляется с помощью случайных гексамеров и обратной транскриптазы (Invitrogen). EGFP и GAPDH были использованы в качестве внутреннего контроля. КДНК человека была использована в качестве положительного контроля, а кДНК и ДНК из C57BL / 6 тканей мышей были использованы в качестве отрицательного контроля. Всего РНК из культивируемых клеток очищали с Trizol (Invitrogen) и обрабатывают Turbo ДНК (Ambion / Applied Biosystems, Токио, Япония), чтобы удалить загрязнения геномной ДНК. Первая цепь кДНК Синтез проводился с помощью олиго-(дТ) 20 праймеров и ReverTraAce-α (Toyobo, Осака, Япония). В анализах мыши иПК клеток, Nanog-IPS и мышь ES (АС2) клетки были использованы в качестве положительного контроля, а MDX-MEF был использован в качестве отрицательного контроля. Nat1 был использован в качестве внутреннего контроля. При анализе человеческих клеток IPS, DMD-фибробласты были использованы в качестве отрицательного контроля. Nat1 был использован в качестве внутреннего контроля. ПЦР проводили с использованием кДНК ExTaq (Takara Bio, Оцу, Япония) или AmpliTaq Золото (PerkinElmer, Waltham, MA) Амплификация проводились при температуре отжига 58 ° C в течение 30-35 циклов, фрагменты были разделены с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, а затем окрашивания бромидом этидия. Последовательность распределились следующим образом: для дистрофина изоформы Dp427m, DYS 427me1L/DYS427me1R (211 б.п.), 5'TTCCCCCTACAGGACTCAGA-3 'и 5'-TCTTCCCACCAAAGCATTTT-3 "для дистрофина изоформы Dp427I, DYS427le1L/DYSe3R (150 б.п.), 5 '-CTCATGATGAAAGAGAAGATGTTCAA-3' и 5'-CTGTCAGGCCTTCGAGGA-3 "для дистрофина изоформы Dp140, DYS 140e1L/DYS e45R (189 б.п.), 5'-TGCTGGCTGCTCTGAACTAA-3 'и 5'GGCTTCCCAATTTTTCCTGT-3" для EGFP, EGFPL / R (479 б.п.), 5'-CCTGAAGTTCATCTGCACCA-3 'и 5'TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG, для GAPDH (мыши и человека), RPC1 / 2,5-CCATCTTCCAGGAGCGAGA-3' и 5'TGTCATACCAGGAAATGAGC-3 '. Для DYS6L/6R, DYS7L/7R и DYS8L/8R такие же, как в геномных анализов ПЦР. RT-PCR для выявления маркеров эндогенной и экзогенной ES трансгены были выполнены с использованием праймеров, как описано ранее. 6 пар праймеров для определения трансгенов в CMYC и SOX 2 были следующими: hMYC-S3148/pMXs-AS3095, 5'-CAGAGGAGGAACGAGCTAAAAC 3 'и 5'-AGACCAACTGGTAATGGTAGCG-3' hSOX2-S691/pMXsAS3206, 5'-GGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTC-3 'и 5'TTATCGTCGACCACTGTGCTGGCG-3'. Поколение химерных мышей. Химерных мыши были получены от двух MDX-IPS и три MDX-IPS (DYS-HAC) клеточных линий. Производство химер проводили, как описано ранее. Формирование тератомы и гистология. Для создания тератомы, 2 × 106 MDX-IPS (DYS-HAC), MDX-IPS, а MDX-фибробластов вводились подкожно в CD1 (ICR) мышей (Charles River) и 1 × 106 DMD-IPS (DYS-HAC), DMD-IPS, а DMD-фибробластов (DYS-HAC) вводили в яички мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Charles River). Через 5-6 недель в MDXIPS серии и 9-13 недель в DMD-IPS серии, удаленные тератомы были зафиксированы в 20% формалине и обрабатываются для парафиновых срезов, а затем окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический анализ. Зафиксированные в формалине и парафине образцы и OCT были использованы для иммуногистохимии. Первичные антитела, используемые в этом исследовании, были следующие: кроличьи поликлональных антител против человеческого и мышинного дистрофина (1:100; лаборатории Vision, Fremont, Калифорния), а мышиные моноклональные антитела против человеческого дистрофина (MANDYS106, разбавленный 1:4; подарок Гленн Д. Моррис, Университет Киля, Шропшир, Великобритания). Иммунореакциея была разработана с помощью SAB (стрептавидин-биотин) пероксидазы комплексным методом с Histofine SAB-PO Kit (Nichirei, Токио, Япония) Ссылки. Evans MJ, and Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292:154– 156. [PubMed] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282:1145–1147. [PubMed] Dennis C. Cloning: mining the secrets of the egg. Nature. 2006;439:652–655. [PubMed] Hall VJ, Stojkovic P, and Stojkovic M. Using therapeutic cloning to fight human disease: a conundrum or reality. Stem Cells. 2006;24:1628–1637. [PubMed] Takahashi K, and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126:663–676. [PubMed] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131:861–872. [PubMed] Park IH, Arora N, Huo H, Maherali N, Ahfeldt T, Shimamura A, et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 2008;134:877–886. [PMC free article] [PubMed] Rideout WM, 3rd, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, and Jaenisch R. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. Cell. 2002;109:17–27. [PubMed] Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun CW, Meissner A, Cassady JP, et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science. 2007;318:1920–1923. [PubMed] Odom GL, Gregorevic P, and Chamberlain JS. Viral-mediated gene therapy for the muscular dystrophies: successes, limitations and recent advances. Biochim Biophys Acta. 2007;1772:243–262. [PMC free article] [PubMed] Koenig M, Monaco AP, and Kunkel LM. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell. 1988;53:219–228. [PubMed] Perloff JK, de Leon AC, Jr, and O'Doherty D. The cardiomyopathy of progressive muscular dystrophy. Circulation. 1966;33:625–648. [PubMed] Chelly J, Hamard G, Koulakoff A, Kaplan JC, Kahn A, and Berwald-Netter Y. Dystrophin gene transcribed from different promoters in neuronal and glial cells. Nature. 1990;344:64–65. [PubMed] Zhao J, Uchino M, Yoshioka K, Miyatake M, and Miike T. Dystrophin in control and mdx retina. Brain Dev. 1991;13:135– 137. [PubMed] Byers TJ, Kunkel LM, and Watkins SC. The subcellular distribution of dystrophin in mouse skeletal, cardiac, and smooth muscle. J Cell Biol. 1991;115:411–421. [PMC free article] [PubMed] Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, and Kunkel LM. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 1987;50:509–517. [PubMed] Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, et al. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochem Biophys Res Commun. 2004;321:280–290. [PubMed] Kazuki Y, Hoshiya H, Kai Y, Abe S, Takiguchi M, Osaki M, et al. Correction of a genetic defect in multipotent germline stem cells using a human artificial chromosome. Gene Ther. 2008;15:617–624. [PubMed] Basu J, and Willard HF. Artificial and engineered chromosomes: non-integrating vectors for gene therapy. Trends Mol Med. 2005;11:251–258. [PubMed] Oshimura M, and Katoh M. Transfer of human artificial chromosome vectors into stem cells. Reprod Biomed Online. 2008;16:57–69. [PubMed] Hoshiya H, Kazuki Y, Abe S, Takiguchi M, Kajitani N, Watanabe Y, et al. A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene. Mol Ther. 2009;17:309–317. [PMC free article] [PubMed] O'Connor TP, and Crystal RG. Genetic medicines: treatment strategies for hereditary disorders. Nat Rev Genet. 2006;7:261– 276. [PubMed] Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP, Wulffraat N, Leboulch P, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 2003;302:415–419. [PubMed] Raya A, Rodríguez-Pizà I, Guenechea G, Vassena R, Navarro S, Barrero MJ, et al. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature. 2009;460:53–59. [PMC free article] [PubMed] Kimura E, Han JJ, Li S, Fall B, Ra J, Haraguchi M, et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 2008;17:2507–2517. [PMC free article] [PubMed] Müller LU, Daley GQ, and Williams DA. Upping the ante: recent advances in direct reprogramming. Mol Ther. 2009;17:947–953. [PMC free article] [PubMed] Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, and Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 2008;322:945–949. [PubMed] Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, and Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 2008;322:949–953. [PubMed] Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hämäläinen R, et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 2009;458:766–770. [PubMed] Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324:797–801. [PMC free article] [PubMed] Li W, Wei W, Zhu S, Zhu J, Shi Y, Lin T, et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 2009;4:16–19. [PubMed] Kaji K, Norrby K, Paca A, Mileikovsky M, Mohseni P, and Woltjen K. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 2009;458:771–775. [PMC free article] [PubMed] Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 2009;4:381–384. [PubMed] Nakano M, Cardinale S, Noskov VN, Gassmann R, Vagnarelli P, Kandels-Lewis S, et al. Inactivation of a human kinetochore by specific targeting of chromatin modifiers. Dev Cell. 2008;14:507–522. [PMC free article] [PubMed] Barberi T, Bradbury M, Dincer Z, Panagiotakos G, Socci ND, and Studer L. Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells. Nat Med. 2007;13:642–648. [PubMed] Darabi R, Gehlbach K, Bachoo RM, Kamath S, Osawa M, Kamm KE, et al. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat Med. 2008;14:134–143. [PubMed] Tomizuka K, Yoshida H, Uejima H, Kugoh H, Sato K, Ohguma A, et al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. Nat Genet. 1997;16:133–143. [PubMed] Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/ Оригинал статьи: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2839293/?tool=pubmed
