Марусин А.В., Степанов В.А., Спиридонова М.Г., Бохан Н.А

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЭТАНОЛ-МЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ
ADH1B, ADH7 И CYP2E1 И РИСК РАЗВИТИЯ АЛКОГОЛИЗМА В РУССКОЙ
ПОПУЛЯЦИИ ЗАПАДНО-СИБИРСКОГО РЕГИОНА
1
Марусин А.В., 1Степанов В.А., 1Спиридонова М.Г., 2Бохан Н.А., 2Мандель А.И.,
1
1
Харьков В.Н., 1Пельс Я.Р., 1Пузырёв В.П.
ГУ Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского
научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук,
634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки 10;
тел.: (3822) 51-31-46; факс: (3822) 51-37-44; E-mail: andrey.marusin@medgenetics.ru
2
ГУ Научно-исследовательский институт психического здоровья Томского
научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук,
634014, г. Томск, Сосновый бор;
тел.: (3822) 44-47-80; факс: (3822) 72-44-25; E-mail: redo@mail.tomsknet.ru
Изучено распределение аллелей и генотипов двух генов
алкогольдегидрогеназ ADH1B (полиморфизм A/G (Arg47His; -/+Msl I; А1/А2) в
3 экзоне), ADH7 (полиморфизм G/C (+/- Sty I; В1/В2) в 5 интроне ) и гена
цитохром Р450 2Е1 (CYP2E1, полиморфизмы G/C (-/+PstI; С1/С2) в 5’-UTR и
Т/А (+/-Dra I; D/C) в 6 интроне) в выборках двух городских и сельской
популяций. В изученных популяциях частоты генотипов удовлетворяют
равновесию Харди-Вайнберга, а по частотам аллелей не обнаружено
межпопуляционных и половых отличий, поэтому все три выборки составили
общую группу популяционного контроля. В общей выборке для частот
аллелей 4 генов выполняется равновесие по сцеплению (или гаметическое
равновесие) по сочетаниям пар генов, за исключением полиморфизмов гена
CYP2E1, которые сцеплены. В общей выборке «мутантные» (производные)
аллели ADH1B*A2 (+Msl I), CYP2E1*C2 (+Pst I) и CYP2E1*С (-Dra I)
встречаются с низкой частотой (0,0627; 0,0276 и 0,0877 соответственно).
Полиморфизм гена ADH7 характеризуется высоким уровнем генетической
изменчивости, частота аллеля ADH7*B2 (-Sty I) составила 0,4649. Частоты
«мутантных» аллелей в группе больных (г. Томск) равны 0,0176; 0,5471;
0,0176 и 0,0647 для ADH1B*A2, ADH7*B2, CYP2E1*C2 и CYP2E1*С,
соответственно. Обнаружена ассоциация аллелей алкогольдегидрогеназы
ADH1B с риском развития алкоголизма коморбидного с туберкулёзом.
Отношение шансов (OR) развития алкоголизма у больных туберкулёзом для
носителей аллеля ADH1B*A2 составило 0,27 (95 % CI 0,07 – 0,91; P=0,015).
Для носителей аллеля ADH7*B2 OR было близко к статистически
значимому – 1,39 (95 % CI 0,98 – 1,96; P=0,052). Также выявлена
гетерогенность частот гаплотипов ADH1B и ADH7 (Р=0,012), частота
гаплотипа ADH1B*A1_ ADH7*B2 на 10 % выше в группе больных (Р=0,017).
Ключевые слова: этанол-метаболизирующие ферменты, генетический
полиморфизм, алкоголизм
ВВЕДЕНИЕ
У человека известно семь генов алкогольдегидрогеназ (ADH),
расположенных на небольшом участке хромосомы 4q21-23 и кодирующих
субъединицы , 1, 2, 3, 1, 2, ,  и  (или ). Это гены ADH1A, ADH1B*1,
ADH1B*2, ADH1B*3, ADH1C*1, ADH1C*2, ADH4, ADH5 и ADH7 [13, 17].
Продукт гена ADH6 не назван буквой древнегреческого алфавита. ADH1B*1,
2
ADH1B*2 и ADH1B*3 являются изоэнзимами: 1 – «дикий» тип, 2 – возникает
вследствие мутации GA в 3-ем экзоне, вызывающей замену Arg47His, а 3
обусловлен мутацией СТ в 9-ом экзоне гена, что ведёт к замене Arg на Cys в
369 положении аминокислотной последовательности фермента [13]. «Двойной»
мутант (47His и 369Cys) в мировой популяции до сих пор не обнаружен, но,
вероятно, может существовать [17]. ADH1C*1 (1) и ADH1C*2 (2) также являются
изоэнзимами. Полипептид 2 отличается от «дикого» типа 1 двумя мутациями
Arg271Gln и Ile349Val вследствие замен в 8-ом экзоне CT и GA ,
соответственно [5]. При изменении концентрации этанола в крови и печени
изменяется вклад различных изоэнзимов в его окисление [14]. Было обнаружено,
что при рН = 7,5, концентрации NAD+ 0,5 мМ и этанола 2-50 мМ активность
ADH1B3 в 2,9-23 раза ниже по сравнению с активностью ADH1B2.
Скорректированная относительно уровня экспрессии в печени, активность ADH4
составила 18-97 % от активности ADH1B1 при концентрациях этанола 2-50 мМ и
28-140 % различий между активностями ADH1C1 и ADH1C2. Поэтому аллель
ADH1B*3 может играть роль в протекторном эффекте к формированию
алкоголизма, тогда как эффект ADH4, возможно, является незначительным [13].
ADH I-го класса окисляют этанол поступивший перорально и наиболее
представлены в печени, ADH II-го класса (ген ADH4) расщепляет этанол только
при высоких концентрациях, ADH III-го класса (ген ADH5) – эволюционно
наиболее древняя ADH, также расщепляет длинноцепочечные алифатические и
ароматические спирты, бензохиноны, не окисляет метанол , ADH6
экспрессируется в большинстве органов и тканей и функционирует, главным
образом, как глутатионзависимая формальдегиддегидрогеназа, ADH IV-го класса
3
(ген ADH7) проявляет высокую активность к этанолу при больших его
концентрациях [1, 12, 27]. ADH7 экспрессируется преимущественно в кишечнике
и пищеводе [1, 19], ADH V-го класса (ген ADH6), как и ADH4, наименее изучена,
экспрессируется в печени и желудке. В совокупности, гены ADH сходны по
структуре, произошли от одного общего предшественника, а их продукты имеют
широкий спектр субстратной специфичности и сопряжены с восстановлением
NAD [12].
Было установлено, что ADH1B*47His обладает протекторным действием к
алкоголизму у китайцев и японцев и показано, что аллель ADH1C*1 находится в
неравновесии по сцеплению с аллелем ADH1B*47His и, поэтому, не оказывает
значимого влияния на риск развития алкоголизма в Восточной Азии и у
европеоидов [13]. В целом же, данные о вкладе полиморфизма ADH1B в
формирование алкогольной зависимости противоречивы [24, 7, 14].
CYP2E1 ([КФ 1.14.14.1]) - микросомальная монооксигеназа - участвует в
первой фазе детоксикации ксенобиотиков и, также, утилизирует этанол на первом
этапе, экспрессируется главным образом в печени [9]. Ген CYP2E1 локализован на
хромосоме 10q24.3-qter. Watanabe J. с соавт. (1990) описали тесно сцепленные
полиморфизмы RsaI и PstI в 5’– фланкирующем регионе гена [26]. Более редкий
мутантный аллель (С2; +Pst I/ -Rsa I; CYP2E1*5B), ассоциирован с высокой
транскрипционной и ферментативной активностью, большим содержанием белка,
по сравнению с аллелем дикого типа [25]. Индивиды, гомозиготные по ALDH2*1
и носители аллеля С2 гена CYP2E1 проявляют высокий риск злоупотребления
алкоголем [20].
4
Проблема алкоголизма и сопутствующего ему туберкулёза лёгких очень
актуальна. Лица с сочетанной патологией (туберкулёз и алкоголизм)
представляют большую эпидемиологическую опасность не только из-за высокой
распространённости туберкулёза среди страдающих алкоголизмом, но и в связи с
часто встречающихся у них тяжёлых деструктивных форм туберкулёза с
массивным бактериовыделением. Среди больных туберкулёзом и алкоголизмом
лекарственная устойчивость микобактерий туберкулёза наблюдается в 2 раза
чаще, а полирезистентность – в 6 раз чаще, чем у больных, не страдающих
алкоголизмом. Злоупотребляющих алкоголем в 3 – 5 раз больше среди больных,
длительно состоящих на диспансерном учёте, чем среди впервые заболевших
туберкулёзом лёгких. Туберкулёз лёгких у подавляющего большинства больных
развивается на фоне алкоголизма, реже предшествует ему. Это характеризует
большинство лиц, с сочетанной патологией, как больных алкоголизмом с
сопутствующим туберкулёзом [22]. Анализ литературы показал, что не
существует данных о связи генетического полиморфизма ферментов,
метаболизирующих этанол, с риском формирования алкоголизма отягощённого
туберкулёзом. Принимая во внимание полифункциональность этанолметаболизирующих ферментов, их способность повышать соотношение
NADH/NAD, влиять на концентрацию активных форм кислорода, а также
способность превращать ксенобиотики в активные метаболиты, в задачи
настоящего исследования входило оценить генетическую структуру трёх
популяций Западно-Сибирского региона по полиморфным выриантам ADH1B*1,
ADH7 Sty I, СYP2E1 Pst I и Dra I и проанализировать ассоциации полиморфизма
этих генов с алкоголизмом у больных туберкулёзом в этом регионе.
5
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Контрольную группу составили индивиды из двух
городских популяций (г. Томск, 110 мужчин и 2 женщины в возрасте 40,65  0,77
лет; г. Северск, 99 мужчин и 89 женщин, 43,54  1,19 лет) и из сельской
популяции (пос. Каргала, 44 мужчины и 55 женщин, 36,56  0,81 лет). Группу
больных туберкулёзом с диагнозом алкоголизм, поставленным врачаминаркологами Областного противотуберкулёзного диспансера, туберкулёзного
отделения Областной психиатрической больницы, Областной Томской
Клинической туберкулёзной больницы, составили 62 мужчины и 23 женщины
(средний возраст 38,86  1,27 лет). Все группы однородны по этническому
составу (>90 % русские). Возраст в общей выборке варьировал от 8 до 75 лет.
Материал исследования – ДНК, выделенная из периферической крови методом
фенол-хлороформной экстракции и хранящаяся в банке ДНК ГУ НИИ МГ ТНЦ
СО РАМН [11].
Генотипирование полиморфизма ADH1B, ADH7 и CYP2E1.
Генотипирование четырёх однонуклеотидных полиморфизмов ADH1B, ADH7,
CYP2E1 Pst I и Dra I (NCBI Assay ID rs1229984, rs1154458, rs3813867 и
rs6413432) проводили методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа
полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликонов в 2-3 %
агарозных гелях. Условия ПЦР, структура праймеров описаны ранее [15, 17, 21,
23]. Праймеры поставлены ООО «Лаборатория МЕДИГЕН» (г. Новосибирск),
ферменты рестрикции - ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск). Полиморфизм GA
в 3 экзоне гена ADH1B, приводящий к появлению сайта рестрикции Msl I и
замене Arg47His, представлен двумя аллелями: А1 – «дикий» тип (685 п.н.) и А2 –
6
мутантный аллель (443 + 242 п.н.; +Msl I; 47His; ADH1B*2). Полиморфизм CG
в 5 интроне ген а ADH7, выявляемый по сайту рестрикции Sty I, приводит к
появлению аллелей В1 – «дикий» тип (263 + 214 п.н.) и В2 – мутантный аллель
(477 п.н.; -Sty I). Полиморфизм GC в 5’-фланкирующем регионе гена CYP2E1 (1293G>C) регистрируется рестрикцией Pst I и представлен предковым С1 (410
п.н.) и производным С2 (290 + 120 п.н.; СYP2E1*5B; +Pst I) аллелями. В 6
интроне гена CYP2E1 полиморфизм ТА (7632T>A) проявляется потерей сайта
узнавания рестриктазы Dra I: аллель «дикого» типа D (235 + 351 п.н.) и С –
мутантный аллель (686 п.н.; СYP2E1*6; -Dra I).
Статистические методы. Соответствие распределения генотипов
равновесию Харди-Вайнберга, наблюдаемую и ожидаемую гетерозиготности,
сравнение частот аллелей и генотипов в подгруппах, проверку гаметического
неравновесия (неравновесия по сцеплению) проводили общепринятыми методами
популяционной биометрии [3]. Поиск ассоциаций проводили путём сравнения
частот аллелей и генотипов в группе больных по сравнению с контрольной.
Различия частот генотипов и гаплотипов оценивали с помощью статистики
максимума правдоподобия критерия 2 (МП 2). Рассчитывали отношение шансов
(OR) и 95 % доверительный интервал (CI) риска развития заболевания по точному
тесту Фишера с двухсторонней оценкой достигнутого уровня значимости (Р) или
по критерию 2 Пирсона. Принят 5 % уровень статистической значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Описание генетической структуры популяций. Во всех изученных
группах не обнаружено межполовых отличий в частотах аллелей генов ADH1B
(Arg47His), ADH7 (Sty I), CYP2E1 (Pst I и Dra I), поэтому подгруппы мужчин и
7
женщин рассматривались вместе. Так как выборки двух городских и сельской
популяций статистически значимо не различались по частотам аллелей во всех
изученных локусах и распределение генотипов в них, для всех локусов,
соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга, они были
объединены в одну контрольную группу. Как видно из таблицы 1, локусы ADH1B,
CYP2E1 Pst I и Dra I, в отличие от локуса ADH7, характеризуются невысоким
уровнем генетической изменчивости и низкими значениями частот мутантных
аллелей. Это соответствует данным, полученным для большинства европейских
популяций [6, 8, 17, 24].
В общей выборке 399 человек обнаружена повышенная частота аллеля В2
гена ADH7 в старшей возрастной группе (после медианного возраста – 40 лет; 2 =
5,75; Р = 0,017; табл. 2). Это происходит за счёт снижения числа индивидов
гомозиготных по В1В1 на 9,17 % и увеличения количества индивидов с генотипом
В2В2 на 7,34 %. Частота гетерозигот В1В2 в подгруппах до 40 и после 40 лет
остаётся почти неизменной (49,75 % и 52,02 %). Эти данные могут
свидетельствовать о селективной значимости аллеля В2 (возможно, генотипа
В2В2) для доживания индивидов до возраста старше 40 лет. В выборке из г.
Томска также обнаружена повышенная частота аллеля В2 в подгруппе индивидов
старше медианного возраста, не отмеченная в выборках г. Северска и с. Каргала
(табл. 2). Отсутствие статистически значимой связи изменчивости ADH7 с
возрастом в последних двух выборках, возможно, объясняется выборочными
смещениями возраста исследованных индивидов в с. Каргала в сторону младшего
и в г. Северске старшего возраста, а также несоответствием распределения
возраста индивидов в этих группах нормальному закону. Для общей контрольной
8
группы и выборки г. Томска была принята нулевая гипотеза о нормальном
распределении возраста.
По полиморфным локусам ADH1B (Arg47His; Msl I), ADH7 (Sty I),
CYP2E1 (Pst I и Dra I) во всех изученных популяционных выборках,
объединённом контроле и в группе больных алкоголизмом сочетанным с
туберкулёзом выполняется равновесие Харди-Вайнберга (табл. 3). Для всех
сочетаний пар генов выполняется равновесие по сцеплению (гаметическое
равновесие) в общей выборке и в группе больных. Исключение составляют
локусы CYP2E1 Pst I и Dra I, которые находятся в неравновесии по сцеплению (d
– мера неравновесия по Hill W.G. (1974) [3] равна +0,021142  0,006748; 2 =
83,13; Р < 10-6;  - коэффициент корреляции между локусами составил +0,4565).
Сходные оценки получены для группы больных алкоголизмом коморбидным с
туберкулёзом (d = +0,016508  0,013124; 2 = 22,08; Р = 3*10-6;  = +0,50967).
Очевидно, это обусловлено физическим сцеплением локусов, так как расстояние
между полиморфными вариантами ADH1B Msl I и ADH7 Sty I составляет 101,2
т.п.н., а между полиморфизмами в гене CYP2E1 Pst I и Dra I - 8,9 т.п.н. Следует
отметить близкое к статистически значимому гаметическое неравновесие между
локусами ADH1B и CYP2E1 Pst I (Р = 0,081), возможно, обусловленое
стохастическими причинами вследствие низких частот мутантных аллелей.
Ассоциации генетического полиморфизма ADH1B, ADH7 и CYP2E1 с
алкоголизмом, коморбидным с туберкулёзом. Выявлено статистически значимое
протекторное действие аллеля А2 гена ADH1B на риск развития алкоголизма
коморбидного с туберкулёзом (Р = 0,031) и близкое к статистически значимому
предрасполагающее к болезни влияние аллеля В2 гена ADH7 (Р = 0,052; табл. 4).
9
Не обнаружена ассоциация обоих полиморфизмов в гене CYP2E1 с алкоголизмом
больных туберкулёзом. Ассоциация CYP2E1*C2 с алкогольной болезнью печени
была выявлена Шангареевой З.А. с соавт. (2003) у мужчин, проходивших курс
терапии в Республиканском наркологическом диспансере г. Уфы [4]. Причинами
несоответствия результатов могут быть особенности формирования выборок,
различная этническая принадлежность изученных групп, а также стохастические
причины, вследствие низкой частоты мутантного аллеля С2 в русской популяции
Западно-Сибирского региона. Данные о полиморфизме CYP2E1 Pst I, сцепленного
с ним Rsa I, и о CYP2E1 Dra I в связи с различными заболеваниями и с
алкоголизмом в частности, остаются противоречивыми [4, 6, 8, 9, 10, 18, 24].
Raimondi S. с соавт. (2004) показана возрастная гетерогенность связи
полиморфизма CYP2E1 Rsa I и потребления алкоголя. У лиц старше 68 лет гомои гетерозиготных по мутантному аллелю (-Rsa I/+Pst I) отношение шансов (OR)
никогда не употреблять алкоголь равно 2,4 (95 % CI 1,2 – 4,8), тогда как для лиц
младше 47 лет эффект этих генотипов противоположен (OR = 0,5; 95 % CI 0,2 –
1,4) [18]. Повышение активности цитохромов Р450 и, в частности,
этанолиндуцибельного CYP2E1, влияет на образование активных форм
кислорода, что, в свою очередь, может приводить к окислительному стрессу. В
работе Бикмaевой А.Р. с соавт. (2004) показано, что инсерционный полиморфизм
(Ins96) в промоторной области, который, как и полиморфизм CYP2E1 Pst I,
повышает метаболическую активность CYP2E1 и связан с ожирением и
алкогольным поражением печени, также ассоциирует с риском развития
инфильтративного туберкулёза у жителей Республики Башкортостан [2].
10
Протекторное действие аллеля А2 гена ADH1B, возможно, объясняется
повышенной
активностью
фермента,
накоплением
ацетальдегида
и
его
метаболитов, что вызывает «отвращение» к алкоголю. Ассоциацию алкоголизма с
аллелем В2 гена ADH7 нельзя объяснить «физическим» сцеплением с локусом
ADH1B*47His (+Msl I). Они, как было упомянуто выше, находятся в равновесии
по сцеплению. Функциональное значение полиморфизма ADH7 Sty I не изучено.
Возможно, этот полиморфизм сцеплен с каким-либо другим, функционально
значимым
полиморфизмом,
оказывающим
эпистатический
эффект.
Это
предположение было высказано в работе Osier M.V. с соавт. (2004), при
исследования гаплотипов, формируемых семью полиморфизмами ADH I-го
класса и ADH7 Sty I, в этнической выборке китайцев Тайваня при сравнении 50
контрольных индивидов и 52 лиц больных алкоголизмом [16].
Авторы этого исследования выдвигают ещё одно объяснение эффекта
ADH7 Sty I, которое не противоречит первому: когда локусы ADH1B Arg47His и
ADH7 Sty I были сцеплены друг с другом, они вместе представляли собой
хромосомную линию с протективными аллелями в одном или нескольких сайтах.
За продолжительный период истории популяций этот кластер рекомбинировал,
что проявляется в равновесии по сцеплению между этими двумя локусами в
настоящее время. Только очень слабая рекомбинация происходит в последних
поколениях между этими маркерами, расположенными на расстоянии 101 т.п.н.
В сущности, имеется одна линия с этими двумя маркерами в цис-положении,
которая и проявляет протекторное действие к развитию алкоголизма.
Если это так, то полиморфизма ADH1B*Arg47His недостаточно для
объяснения протекторного эффекта с тех пор, как два гаплотипа с разными
11
аллелями ADH7 Sty I ассоциируют с различным риском формирования
алкоголизма [16]. В нашем исследовании не отмечено влияние ADH7 Sty I на
защитное действие ADH1B*47His (A2), возможно, вследствие низкой частоты
аллеля А2 в европеоидных популяциях. Тем не менее, обнаружена статистически
значимая гетерогенность частот гаплотипов между группой больных
алкоголизмом коморбидным с туберкулёзом и общей контрольной группой (табл.
5; МП 2 = 10,84; Р = 0,013). Также выявлено различие в частоте гаплотипа А1_В2
между контрольной выборкой больными (Р = 0,017; табл. 5). Поэтому, возможно,
при генетическом тестировании индивидов на подверженность к алкоголизму
необходимо исследовать и полиморфизм ADH7 (Sty I), несмотря на то, что
статистически значимого влияния этого полиморфизма отдельно, без учета
ADH1B Msl I, в нашем исследовании не отмечено.
Косвенным подтверждением функциональной значимости полиморфизма
ADH7 Sty I является изменчивость частот аллелей в разных возрастных
подгруппах общей контрольной выборки. Внутриинтроная локализация
полиморфизма ADH7 Sty I, вероятно, свидетельствует о нейтральности этого сайта
и обнаруженная ассоциация должна быть подтверждена на других популяциях, с
изучением других однонуклеотидных полиморфизмов в кодирующих областях
гена и вызывающих функциональные мутации. ADH7 экспрессируется, главным
образом, в желудке и пищеводе, является этанол-индуцибельным ферментом и
окисляет этанол при его высоких концентрациях [16]. Поэтому полиморфизм в
этом гене может играть значительную роль в предрасположенности к
алкоголизму и требует дальнейшего изучения.
12
Авторы выражают благодарность Е.Ю. Брагиной и И.А. Гончаровой за
предоставление образцов ДНК. Работа была поддержана грантами РФФИ 05-0498007-р_обь_а, Президента РФ МД-88.2003.04, Роснауки РИ-112/001/128 и РИ19.0/001/045.
13
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П. Алкогольдегидрогеназа млекопитающих – объект
молекулярной медицины // Усп. биол. хим. - 2003. - Т. 43. - С. 3-18.
2. Бикмаева
А.Р.,
Сибиряк
С.В.,
Хуснутдинова
Э.К.
Инсерционный
полиморфизм гена CYP2E1 у боьных инфильтративным туберкулёзом
легких в популяциях Республики Башкортостан // Мол. биол. – 2004. – Т.
38, № 2. – С. 239-243.
3. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. - М.: Наука, 1991. - 271 с.
4. Шангареева З.А., Викторова Т.В., Насыров Х.М., Сагидуллин А.Ф., Байков
И.Р. Анализ полиморфизма генов участвующих в метаболизме этанола у
лиц с алкогольной болезнью печени // Медицинская генетика. – 2003. – Т.
2, № 11. – С. 485-490.
5. Agarwal D.P. Genetic polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes //
Pathol. Biol. – 2001. – V. 49, N 9. – P. 703-709.
6. Bartsch H., Nair U., Risch A. et al. Genetic polymorphism of CYP genes, alone
or in combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers // Cancer
Epidemiol. Biomarkers & Prev. – 2000. – V. 9, N 1. – P. 3-28.
7. Birley A.J., Whitfield J.B., Neale M.C. et al. Genetic time-series analysis
identifies a major QTL for in vivo alcohol metabolism not predicted by in vitro
studies of structural protein polymorphism at the ADH1B or ADH1C loci //
Behav. Genet. – 2005. – V. 35, N 5. – P. 509-524.
8. Brennan P., Lewis S., Hashibe M. et al. Pooled analysis of alcohol
dehydrogenase genotypes and head and neck Cancer: a HuGE Review // Am. J.
Epidemiol. – 2004. – V. 159, N 1. – P. 1-16.
14
9. Ingelman-Sundberg M. Human drug metabolizing cytochrome P450 enzymes:
properties and polymorphisms // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2004. - V. 369, № 1. - P. 89-104.
10. Inoue K., Yamazaki H., Shimada T. Characterization of liver microsomal 7ethoxycoumarin O-deethylation and chlorzoxazone 6-hydroxylation activities in
Japanese and Caucasian subjects genotyped for CYP2E1 gene // Arch. Toxicol.
– 2000. – V. 74, № 7. Р. 372-378.
11. Johns M., Paulus-Thomas J. Purification of human genomic DNA from whole
blood using sodium perchlorate in place of phenol // Analyt. Biochem. - 1989. V. 80, № 2. - P. 276-278.
12. Jörnvall H., Höög J.-O., Persson B., Pares X. Pharmacogenetics of the alcohol
dehydrogenase system // Pharmacology. – 2000. – V. 61, № 3 - P. 184-191.
13. Lee Sh.-L., Höö J.-O., Yin Sh.-J. Functionality of allelic variation in human
alcohol dehydrogenase gene family: assessment of a functional window for
protection against alcoholism // Pharmacogenetics. – 2004. – V. 14, №11. - P.
725-732.
14. Li T.-K., Yin Sh.-J., Crabb D.W. et al. Genetic and environmental influences on
alcohol metabolism in humans // Alchol. Clin. Exp. Res. – 2001. –V. 25, N 1. –
P. 136-144.
15. Lin D.-X., Tang Y.-M., Peng Q. et al. Susceptibility to esophageal cancer and
genetic polymorphisms in glutathione S-transferases T1, P1 and M1 and
cytochrome P450 2E1 // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 1998. – V. 7, №
11. – P. 1013-1018.
15
16. Osier M.V., Lu R.-B., Pakstis A.J. et al. Possible epistatic role of ADH7 in the
protection against alcoholism // Am. J. of Med. Genet. Part B (Neuropsychiatric
Genetics). – 2004. – V. 126B, N 1. – P. 19-22.
17. Osier M.V., Pakstis A.J., Soodyall H. et al. A global perspective on genetic
variation at the ADH genes reveals unusual patterns of linkage disequilibrium
and diversity // Am. J. Hum. Genet. - 2002. - V. 71, № 1. - P. 84-99.
18. Raimondi S., Benhamou S., Coutelle C. et al. Association of metabolic gene
polymorphisms with alcohol consumption in controls // Biomarkers. – 2004. –
V. 9, N 2. – P. 180-189.
19. Satre M.A., Žgombić-Knight M., Duester G. The Complete structure of human
class IV alcohol dehydrogenase (retinol dehydrogenase) determined from the
ADH gene // J. Biol. Chem.- 1994. - V. 269, № 22. - P. 15606-15612.
20. Sun F., Tsuritani I., Honda R. et al. Association of genetic polymorphisms of
alcohol-metabolizing enzymes with excessive alcohol consumption in Japanese
men // Hum. Genet. - 1999. - V. 105, № 4. - P. 295-300.
21. Tanaka F., Shiratori Y., Yokosuka O. et al. Polymorphism of alcoholmetabolizing genes affects drinking behavior and alcoholic liver disease in
Japanese men // Alcohol. Clin. Exp. Res.- 1997. - V. 21, № 4 - P. 596-601.
22. URL: http://med.pfu.edu.ru/tub/tub2005_ru/07_conocom/07_04_alcohol.htm
23. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/.
24. Vidal F., Lorenzo A., Auguet T. et al. Genetic polymorphisms of ADH2, ADH3,
CYP4502E1 Dra-I and Pst-I, and ALDH2 in Spanish men: lack of association
with alcoholism and alcoholic liver disease // J. Hepatol. – 2004. – V. 41, N 5. –
P. 744-750.
16
25. Watanabe J., Hayashi S., Kawajiri K. Different regulation and expression of the
human CYP2E1 gene due to RsaI polymorphism in the 5’ flanking region // J.
Biochem. - 1994. - V. 116, № 2. - P. 321-326.
26. Watanabe J., Hayashi S., Nakachi K. et al. PstI and RsaI RFLPs in complete
linkage disequilibrium at the CYP2E gene // Nucleic Acids Res. - 1990. - V. 18,
№ 23. - P. 7194.
27. Yasunami M., Chen C.S., Yoshida A. A human alcohol dehydrogenase gene
(ADH6) encoding an additional class of isozyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
– 1991. – V. 88, № 17. - P. 7610-7614.
17
Таблица 1
Показатели генетической изменчивости и частоты мутантных аллелей (в
%) генов ADH1B, ADH7 и CYP2E1 в двух городских, сельской и объединённой
выборке трёх популяций Томской области
Ген/аллель
ADH1B
(+Msl I /A2)
Выборка
г. Томск
г. Северск
пос.
Каргала
Всего
г. Томск
ADH7
г. Северск
(-Sty I/B2)
пос.
Каргала
Всего
CYP2E1
(+Pst I/C2)
г. Томск
г. Северск
пос.
Каргала
Всего
г. Томск
Частота, %
8,04  1,82
6,65  1,28
3,54  1,31
Hobs
16,07
13,30
7,07
Hexp
14,78
12,41
6,82
n
112
188
99
6,27  0,86
43,75 
3,31
50,00 
2,58
42,93 
3,52
46,49 
1,77
1,34  0,77
3,19  0,91
3,54  1,31
12,53
51,79
11,75
49,22
399
112
47,87
50,00
188
55,56
49,00
99
50,88
49,75
399
2,68
5,32
7,07
2,64
6,18
6,82
112
188
99
2,76  0,58
10,27 
2,03
8,24  1,42
8,08  1,94
5,01
20,54
5,36
18,43
399
112
РСТ
РСК
РТК
0,999 0,131 0,063
0,151 0,114 0,923
0,187 1,000 0,201
г. Северск
14,36 15,13 188 1,000 1,000 0,502
пос.
16,16 14,86 99
Каргала
Всего
8,77  1,00 16,54 16,00 399
Примечание. Приведены значения и стандартные ошибки частот
мутантных аллелей, значения наблюдаемой Hobs и ожидаемой Hexp
гетерозиготностей, n – объём выборки, РСТ, РСК, РТК – достигнутые уровни
значимости различий в частотах аллелей по двухстороннему точному тесту
Фишера между парами: г. Северск – г. Томск, г. Северск – пос. Каргала и г. Томск
– пос. Каргала, соответственно.
CYP2E1
(-Dra I/C)
18
Таблица 2
Частота аллеля В2 (-Sty I) гена ADH7 в различных возрастных группах
популяционных выборок и общем контроле
Выборка
Me
Частота аллеля В2, %
P
n
(=)< Me
>(=) Me
г. Томск
40
33,33 (57)
54,55 (55)
0,002
112
г. Северск
50,5
49,47 (94)
50,53 (94)
0,837
188
с. Каргала
38
44,68 (47)
41,35 (52)
1,000
99
Общая выборка
40
42,29 (201)
50,76 (198)
0,019
399
Примечание. Me – медианный возраст; (=)< и >(=) - индивиды старше
(или равно) и младше (или равно) Ме возраста (лица с возрастом равным Ме
разнесены по подгруппам так, чтобы размеры подгрупп были приблизительно
одинаковы); в скобках указано число индивидов в подгруппах; Р – достигнутый
уровень значимости различий частот аллелей в подгруппах по двухстороннему
точному тесту Р. Фишера; n – объём выборки.
19
Таблица 3
Распределение и частоты генотипов ADH1B (Msl I; Arg47His), ADH7 (Sty
I), CYP2E1 (Pst I и Dra I) в группах больных алкоголизмом сочетанным с
туберкулёзом (n = 85) и контрольной группе (n = 399)
Количество (частота, %)
Ген/генотип
Больные
Контроль
ADH1B*: A1/A1
82 (96,47)
349 (87,47)
A1/A2
3 (3,53)
50 (12,53)
2
2
 = 0,03; P = 0,869
 = 1,78; P = 0,182
ADH7: B1/B1
17 (20,00)
112 (28,07)
B1/B2
43 (50,59)
203 (50,88)
B2/B2
25 (29,41)
84 (21,05)
2
2
 = 0,04; P = 0,841
 = 0,20; P = 0,655
CYP2E1: C1/C1
82 (96,47)
378 (94,74)
C1/C2
3 (3,53)
20 (5,01)
C2/C2
0 (0,00)
1 (0,25)
2
2
 = 0,03; P= 0,863
 = 1,69; P = 0,194
CYP2E1: D/D
74 (87,060
331 (82,96)
D/C
11 (12,940
66 (16,54)
C/C
0 (0,00)
2 (0,50)
2
2
 = 0,41; P = 0,522
 = 0,45; P = 0,502
Примечание. * - гомозиготы по мутантному аллелю не обнаружены; 2, Р
– значение критерия и достигнутый уровень значимости различий соответствия
наблюдаемых распределений генотипов ожидаемым при равновесии ХардиВайнберга.
20
Таблица 4
ADH1B, ADH7 и CYP2E1 с
Ассоциации полиморфизма генов
алкоголизмом сочетанным с туберкулёзом
Ген/аллель
Группа N (%)
OR
P
Больные
Контроль
(95 % CI)
ADH1B
(-Msl I /A1)
167 (98,24)
748 (93,73)
0,27
0,015*
(+Msl I /A2)
3 (1,76)
50 (6,27)
(0,07 – 0,91)
ADH7
(+Sty I/B1)
77 (45,29)
427 (53,51)
1,39
0,052
(-Sty I/B2)
93 (54,71)
371 (46,49)
(0,98 – 1,96)
CYP2E1
(-Pst I/C1)
167 (98,24)
776 (97,24)
0,63
0,600*
(+Pst I/C2
3 (1,76)
22 (2,76)
(0,15 – 2,26)
CYP2E1
(+Dra I/D)
159 (93,53)
728 (91,23)
0,72
0,325
(-Dra I/C)
11 (6,47)
70 (8,77)
(0,35 – 1,44)
Примечание. * - Р рассчитан по точному двухстороннему тесту Фишера;
N – количество аллелей; P, OR, 95 % CI – достигнутый уровень значимости,
отношение шансов риска формирования алкоголизма коморбидного с
туберкулёзом и 95 % доверительный интервал OR.
21
Таблица 5
Частоты гаплотипов (в %) ADH1B Msl I (A1/(Arg); A2 /(His)) и ADH7 Sty I
(B1/(+Sty I); B2/(-Sty I)) в общей выборке из трёх популяций и в группе больных
алкоголизмом коморбидным с туберкулёзом
Гаплотип
Контроль (2N = 798)
Больные (2N =170)
Р
A1 – B1
49,83
44,37
0,178
A1 – B2
43,90
53,87
0,017
A2 – B1
3,68
0,92
0,146
A2 – B2
2,59
0,84
0,079
Примечание. Для таблицы сопряжённости 24 максимум правдоподобия 2
= 10,84; Р = 0,0126; 2N – число хромосом; Р – достигнутый уровень значимости
отличий в частотах гаплотипов между больными и контроле по точному
двухстороннему тесту Р. Фишера.
22
ALCOHOL METABOLIZING ENZYMES ADH1B, ADH7, CYP2E1
GENE POLYMORPHISM: ASSOCIATION WITH ALCOHOL DEPENDENCE
IN RUSSIAN POPULATIONS OF WEST-SIBERIAN REGION
Marussin A.V.1, Stepanov V.A.1, Spiridonova M.G.1, Bochan N.A.2, Mandel’ A.I.2,
Kharkov V.N.1, Pels J.R.1, Puzyrev V.P.1
1
Research Institute of Medical Genetics, Tomsk Research Center, Siberian Division,
Russian Academy of Sciences; Tomsk, 634050, Naberegnaja river Ushaiky 10;
tel.: (3822) 51-31-46; fax: (3822) 51-37-44; E-mail: andrey.marusin@medgenetics.ru
2
Research Institute of Mental Health, Tomsk Research Center, Siberian Division,
Russian Academy of Sciences; Tomsk, 634014, Piny Forest (Sosnovy Bor),
tel.: (3822) 21-47-80; fax: (3822) 72-44-25; E-mail: redo@mail.tomsknet.ru
SUMMARY
The allele and genotype distribution of two alcohol dehydrogenase genes
ADH1B (exon 3 polymorphism A/G (Arg47His; -/+Msl I; А1/А2)), ADH7 (intron 5
polymorphism G/C (+/-Sty I; В1/В2)) and cytohrome P450 2E1 gene (CYP2E1; 5’flanking region G/C (-/+PstI; С1/С2) and intron 6 T/A (+/-Dra I; D/C) polymorphisms)
were examined in two urban (Seversk, n=188 and Tomsk, n=112) and one rural
(Kargala, n=99) Russian populations. The genotype frequencies obeyed the HardyWeinberg equilibrium in all population samples. No interpopulation or sex difference in
allele frequencies was revealed. Therefore they were joined in total control group. The
alleles were in linkage equilibrium (gametic equilibrium) in the total sample except for
two CYP2E1 gene polymorphisms. Those were in linkage disequilibrium. The
frequencies of the derived alleles at ADH1B (*A2 (+Msl I) allele), CYP2E1 (*C2 (+Pst
I) allele) and CYP2E1 (*С (-Dra I) allele) were low (6.27%, 2.76% and 8.77%,
accordingly). ADH7 gene polymorphism shows the high level of genetic variability; the
frequency of the “mutant” ADH7*B2 (-Sty I) allele was 46.49 %. The alcohol
dehydrogenase gene ADH1B polymorphism was significantly associated with an
increased risk of comorbidity of alcoholism and tuberculosis (n=83) in Tomsk
population. The frequencies of the derived ADH1B*A2, ADH7*B2, CYP2E1*C2 and
CYP2E1*C allele were 1.76%, 54.71%, 1.76% and 6.47% in patients accordingly.
Odds ratio (OR) and 95% confidence intervals (CI) in individuals with ADH1B*G allele
for significantly increased risk of comorbidity of alcoholism and tuberculosis was 0.27
(95 % CI 0.07 – 0.91; P=0.015). OR for ADH7*B2 allele was nearly to statistical
significance – 1.39 (95 % CI 0.98 – 1.96; P=0.052). The haplotype frequencies for the
ADH1B and ADH7 were heterogeneous (P=0.012) in controls and alcoholics. The
haplotype ADH1B*A1_ADH7*B2 frequency was on 10 % higher in group with the
diseases (P=0.017).
23