в Серия 5 – донор оксида азота - Российский НИИ гематологии и
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА» На правах рукописи Гришина Галина Викторовна ПРИМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА ПРИ ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 14.01.21– гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Ремизова Марина Иосифовна Санкт - Петербург 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 4с Введение 5 Обзор литературы 11 1 Нарушения кровообращения и метаболизма при геморрагическом шоке и 11 основные принципы их коррекции 2 Оксид азота и его участие в патогенезе геморрагического шока 1 21 Материалы и методы исследований 48 1.1 Общая характеристика материала исследования 48 1.2 Методы исследования 49 1.2.1 Определение содержания оксида азота в тканях крыс 49 1.2.2 Исследование системной гемодинамики и микроциркуляции 50 1.2.3 Определение напряжения газов крови и кислотно-основного 52 состояния в крови крыс 2 1.2.4 Статистическая обработка результатов исследований 52 1.3 Структура работы 53 Содержание оксида азота в тканях крыс при различных видах шока 56 2.1 Содержание оксида азота в тканях здоровых крыс 56 2.2 Содержание оксида азота в тканях крыс при ожоговом шоке 57 2.3 Оксид азота в тканях крыс при травматическом шоке 58 Содержание оксида азота в тканях крыс при геморрагическом 59 Изучение влияния регуляторов синтеза оксида азота на течение 62 2.4 шоке 3 геморрагического шока у крыс 3 4 Влияние донора оксида азота L-аргинина на течение геморрагического 67 шока у крыс при инфузионной терапии 4.1 Воздействие инфузии изотонического раствора натрия хлорида на 68 течение геморрагического шока у крыс (контроль) 4.2 Изучение возможности повышения эффективности инфузионной 71 терапии геморрагического шока донором оксида азота L-аргинином 5 Течение геморрагического шока при введении изотонического 76 раствора натрия хлорида и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота 5.1 Инфузия N6-(1-иминоэтил)-L-лизин гидрохлорида 76 5.2 Инфузия N5-(1- иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорида 80 5.3. Инфузия аминогуанидина 82 5.4 Инфузия S-метилизотиола 85 5.5 Сравнительная эффективность применения селективных 89 ингибиторов синтеза оксида азота при инфузионной терапии геморрагического шока Заключение 94 Выводы 109 Список литературы 110 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГШ – геморрагический шок ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови АД – артериальное давление МОК – минутный объем кровообращения УО – ударный объем сердца ОПС – общее периферическое сопротивление ЧСС – частота сердечных сокращений РИЛЖ – рабочий индекс левого желудочка МЦ микроциркуляция АЭ – агрегация эритроцитов КФК – количество функционирующих капилляров КОС – кислотно-основное состояние ФР – изотонический раствор натрия хлорида NO – оксид азота NOS – синтаза оксида азота еNOS – эндотелиальная синтаза оксида азота (конститутивная) iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота ОNOO- – пероксинитрит НАДФН – никотинамиддинуклеотидфосфат цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат PARP – поли-АДФ-рибозополимераза ДНКЖ – динитрозильный комплекс железа с глютатионом АДМА – ассиметричный диметиларгинин L-NАМЕ – NG-нитро L- аргинин метил эстер (метиловый эфир) L-NΙL – N6-(1-иминоэтил) – L-лизин L-NΙО – N5-(1-иминоэтил) – L-орнитин 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Совершенствование лечения шока и массивной кровопотери в условиях нарастания в мире угрозы локальных войн, техногенных и природных катастроф, тяжелых дорожно-транспортных происшествий не теряет своей актуальности. Несмотря на новые методы и средства лечения, смертность от острой массивной кровопотери все еще высока и существенной тенденции к ее снижению не наблюдается [9]. В патогенезе нарушений, развивающихся при шоке, ведущее место принадлежит изменениям системы кровообращения. В результате расстройств системной гемодинамики уменьшается количество крови, притекающей к различным органам и тканям. Вследствие этого, а также из-за изменения тонуса сосудов и ухудшения реологических свойств крови понижается транспорт кислорода, развивается гипоксия [2, 84]. Своевременное полное восстановление микроциркуляции и реологии крови в значительной мере определяет эффективность противошоковых мероприятий [6, 81]. Казалось бы, достаточная по объему инфузионная терапия (ИТ), как показывает практика, при тяжелых шоковых состояниях не приводит к ожидаемым результатам. Вливание кровезаменителей само по себе не обеспечивает нормализацию функции органов и систем. Использование препаратов, непосредственно влияющих на тонус сосудов при шоке, может расширить возможности инфузионной терапии кровопотери, направленной на восстановление гемодинамики и метаболизма. Вероятно, именно поэтому внимание исследователей в настоящее время привлечено к новому вазоактивному веществу – монооксиду азота (оксид азота, NO), поскольку влияя на его синтез в организме, можно осуществлять эндотелийзависимую регуляцию сосудистого тонуса при шоке. В патогенезе шока, в том числе и геморрагического (ГШ), значительная роль отводится нарушению сосудистого тонуса [60, 238]. Одним из основных регуляторов тонуса сосудов в организме является монооксид азота [10, 151, 172]. Оксид азота непрерывно продуцируется ферментативным путем [21, 148], 6 и при терминальных состояниях происходит резкое увеличение его содержания в крови [65, 207]. Гиперпродукция NO характерна для ожогового и септического шока [75, 120, 255], но относительно содержания оксида азота в тканях при геморрагическом шоке и его роли при этой патологии нет единого мнения. Существуют работы, свидетельствующие о благоприятном действии повышенной продукции NO на течение геморрагического шока [116, 211], другие исследователи придерживаются противоположного мнения [120, 255]. Противоречивы данные о длительности кровопотери, при которой происходит увеличение содержания оксида азота в организме. Условия, при которых защитное действие оксида азота переходит в повреждающее, недостаточно ясны. Многообразие биологических функций NO можно разделить на 3 группы: регуляторные, защитные и повреждающие [21, 68, 71]. Оксид азота в физиологических концентрациях восстанавливает сократимость сердечной мышцы, улучшая релаксацию кардиомиоцитов и диастолическую функцию [36, 93, 187], принимает участие в действии ангиотензина - регулятора объема циркулирующей крови [186, 226]. К настоящему времени выявлены далеко не все регуляторные эффекты NO, но уже сейчас ясно, что достигнутые в этой области успехи молекулярных имеют фундаментальное механизмов многих значение физиологических для и понимания биохимических процессов [21, 65]. Ответ организма на биологическое действие оксида азота в значительной степени определяется условиями его генерации: когда, в каких тканях, в каком количестве продуцируется это соединение. Увеличение концентрации оксида азота ведет к периферической сосудистой недостаточности и органным повреждениям [30, 135, 214], а уменьшение количества NO обусловливает активацию защитных механизмов организма и, несмотря на это, повышается экспрессия сосудистых хемокинов, цитокинов и молекул адгезии, что приводит к увеличению численности лейкоцитов, агрегации тромбоцитов [24, 29]. Снижение генерации оксида азота ведет к нарушению вазодилятаторных свойств сосудов, возникает необходимость 7 использования лекарственных препаратов, способных сохранить и поддержать уровень оксида азота [149]. Уникальные биологические свойства оксида азота и участие в разнообразных патологических процессах дают возможность, управляя его содержанием, изучить способы воздействия на процессы, опосредуемые NO. Регулировать количество оксида азота в организме возможно донорами оксида азота, поддерживающими его базальный уровень, и избирательными ингибиторами, снижающими генерацию NO [33, 35, 39]. Установлено, что прогрессирование гипоксии и состояние хронической ишемии ведет к истощению субстрата NO – L–аргинина и снижению синтеза NO [8, 43]. Показано, что применение экзогенных доноров NO на ранних стадиях шока благоприятно, а ингибирование конститутивной синтазы NO во время шока оказывает отрицательное действие [165, 166]. Имеются и противоположные данные о применении при шоке ингибиторов оксида азота, уменьшающих органные повреждения и увеличивающих продолжительность жизни животных, что подчеркивает сложность участия NO при этой патологии [237, 260]. Возможно, удаление избытка оксида азота может оказать благоприятное действие на течение геморрагического шока. Однако, на сегодняшний день нерешенная проблема избирательности ингибиторов и дозировки осложняет их терапевтическое применение [33, 62, 72]. NO регулирует многие физиологические процессы: состояние сосудистого тонуса, агрегацию тромбоцитов и их адгезию к сосудистой стенке [26, 29], от которых в значительной мере зависит эффект инфузионной терапии при кровопотере и шоке. Разработка методов, направленных на изменение содержания NO, является актуальным и перспективным направлением исследования для создания новых схем инфузионной терапии геморрагического шока [115, 120, 260]. Степень разработанности темы Несмотря на большое количество работ, посвященных оксиду азота, пока не удалось определить все "точки приложения" NО. Роль оксида азота в 8 патогенезе геморрагического шока не до конца ясна. Недостаточно изучены медикаментозные механизмы воздействия на продукцию оксида азота в условиях этой патологии. При значительном числе исследований, касающихся биологического значения NO, изменение содержания оксида азота при инфузионной терапии кровопотери и шока остается неизученным. Поэтому актуальным представляется изучение возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока с помощью регуляторов синтеза NO. Цель исследования Изучить влияние регуляторов синтеза оксида азота – донора L-аргинина и селективных и неселективных ингибиторов NO-синтаз на течение экспериментального геморрагического шока и возможность их применения для повышения эффективности инфузионной терапии шока. Задачи исследования: 1. Изучить изменения содержания NO в тканях крыс при различных видах шока. 2. Выбрать рабочую модель шока, отличающуюся выраженным и ранним увеличением содержания NO в тканях крыс. 3. Изучить влияние неизбирательного ингибитора(NW- нитро-L-аргинина) и донора оксида азота L-аргинина на течение геморрагического шока. 4. Исследовать возможность применения L-аргинина (изучить его действие на состояние гемодинамики, газовый состав крови и кислотноосновное состояние (КОС) организма) при инфузионной терапии геморрагического шока. 5. Изучить влияние различных ингибиторов NO-синтазы на системную гемодинамику и микроциркуляцию (МЦ) при инфузионной терапии геморрагического шока. 6. Выбрать наиболее эффективный регулятор синтеза оксида азота для введения в составе инфузионной среды при геморрагическом шоке. 9 7. На основании полученных результатов дать заключение о возможности разработки методов инфузионной терапии геморрагического шока, включающих регуляторы синтеза оксида азота. Научная новизна работы Впервые показано, что при геморрагическом шоке и его инфузионной терапии оксид азота, вырабатываемый под влиянием конститутивной синтазы, играет важную роль в централизации кровообращения, а именно, позволяет сохранить кровоток в жизненно важных органах. На основании полученных данных доказано, что введение донора синтеза оксида азота – L-аргинина до начала кровопотери задерживает нарушения кровообращения при ГШ. Инфузия L-аргинина в составе солевого раствора после кровопотери улучшает деятельность сердечно-сосудистой системы, в результате чего возрастает продолжительность жизни экспериментальных животных. Показано, что при инфузионной терапии геморрагического шока, проводимой с введением селективных ингибиторов синтеза оксида азота – производных лизина (L-NІL) и орнитина (L-NІО), аминогуанидина и Sметилизотиола, происходит коррекция нарушений системной гемодинамики, микроциркуляции, кислородного режима и кислотно-основного состояния организма. Наиболее высокая эффективность выявлена в отношении L-NІO и аминогуанидина, вводимых с изотоническим раствором натрия хлорида. Теоретическая и практическая значимость Выяснена роль NO в развитии централизации кровообращения при геморрагическом шоке. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности применения донора оксида азота Lаргинина и селективных ингибиторов индуцибельной NO-синтазы L-NІO и аминогуанидина в комплексной терапии геморрагического шока. Положения, выносимые на защиту 1. При геморрагическом шоке происходят выраженные и ранние изменения содержания NO в тканях крыс. Генерация оксида азота необходима 10 для сохранения перфузии периферических тканей в начальном периоде кровопотери. 2. Введение продуцента оксида азота до начала кровопотери задерживает нарушения кровообращения. L-аргинин, введенный при геморрагическом шоке в составе инфузионной среды, восстанавливает деятельность сердечнососудистой системы. 3. При сочетанном применении при геморрагическом шоке селективных ингибиторов синтеза оксида азота (L-NІO и аминогуанидина) и инфузионной среды происходит стойкая коррекция нарушений гемодинамики по сравнению с инфузией только кровезаменителя. Степень достоверности и апробация результатов диссертации Основные Всероссийских положения диссертации научно-практических доложены и обсуждены: на конференциях с международным участием “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии” 5-6 июня 2011., 24-25 октября 2012 г.; 24-25 июня 2014 г.; на первой конференции Российского национального общества по изучению шока в 2013 г. По теме диссертации опубликовано 18 работ (4 статьи в рецензируемых журналах). Структура работы Диссертация изложена на 136 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Работа содержит 33 таблицы, 6 рисунков. Список литературы включает 261 источник, из них 84 отечественных и 177 иностранных авторов. Работа выполнена в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Кроме того, исследования по определению содержания оксида азота в тканях крыс при различных видах шока проводились совместно с сотрудниками лаборатории физико-химических полимеров Института химической физики им. Н.Н. Семенова ФАНО (Москва). 11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 НАРУШЕНИЯ КРОВООБРАЩЕНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ШОКЕ И ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ИХ КОРРЕКЦИИ Массивная кровопотеря оказывает глубокое воздействие на все основные процессы жизнедеятельности организма, вызывая нарушения функции различных органов и систем. Интенсивность, быстрота и длительность кровопотери превращают кровотечение в геморрагический шок [83, 225]. Тяжесть состояния организма при геморрагическом шоке определяется, в первую очередь, гемодинамическими расстройствами, которые находятся в зависимости от объема и длительности кровопотери [157, 184]. На уменьшение объема циркулирующей компенсаторных реакций, крови (ОЦК) организм при неустраненной которые отвечает рядом причине шока трансформируются в патологические [24, 83]. Гемодинамические расстройства в большей степени связаны со снижением венозного тонуса. Уменьшение минутного объема кровообращения (МОК) обусловлено понижением венозного возврата крови к сердцу вследствие падения ОЦК и повышения общего периферического сосудистого сопротивления (ОПС) [24, 83]. Другой причиной уменьшения МОК является снижение сократительной способности миокарда. Помимо гемодинамической компенсации в это время проявляется множество нейрогенных и эндокринных реакций, направленных на оптимизацию кровотока. При массивной кровопотере возникает возбуждение симпатоадреналовой и гипоталамо-адреналовой систем, происходят функциональные изменения миокарда под влиянием нейрогуморальных факторов [83]. Уменьшение ОЦК и сердечного выброса приводит к спазму региональных сосудов, в первую очередь, артериол и прекапиллярных сфинктеров в различных органах, исключая мозг и сердце, артерии которых не имеют αадренорецепторов. Кровопотеря способствует выбросу надпочечниками катехоламинов, вызывающих спазм периферических сосудов и, соответственно, уменьшение объема сосудистого русла, что частично компенсирует возникший дефицит ОЦК [24, 83]. Установлено, что при шоке концентрация адреналина и 12 норадреналина в крови возрастает [83], что предупреждает чрезмерное падение системного артериального давления (АД). Отмечается образование активного октапептида - ангиотензина II, который по вазопрессорной активности превосходит норадреналин [83, 239]. Увеличивается выброс в кровь гормона гипофиза вазопрессина, а также уменьшается секреция предсердного натрийуретического гормона - атриопептида. Однако концентрация их в крови оказывается недостаточной для поддержания сосудистого тонуса [83]. В результате нарушения тонуса сосудов происходит увеличение ОПС, которое возрастает в соответствии с тяжестью кровопотери [24]. АД поддерживается благодаря возросшему ОПС [191]. Вследствие повышения ОПС затрудняется работа сердца, и создается добавочная нагрузка на миокард [24, 191]. За высоким АД при значительном снижении производительности сердца скрываются глубокие нарушения кровообращения. Однако при массивной кровопотере изменение ОПС не адекватно степени уменьшения сердечного выброса, поэтому этот механизм компенсации оказывается недостаточным для поддержания уровня АД. Все же, несмотря на централизацию кровообращения, артериальное давление снижается. Обратной стороной централизации кровообращения является вазоконстрикция микроциркуляторного русла, что ведет к ишемии тканей и усугублению гипоксии [83]. Важнейшими нарушениями, сопутствующими массивной кровопотере, являются расстройства кислородного режима и кислотно-основного состояния организма, водно-электролитного баланса [76, 181]. Понижение сердечного выброса ведет к уменьшению транспорта кислорода [22, 97]. Гипоксия при кровопотере носит, в основном, циркуляторный характер и степень её выраженности зависит от нарушений гемодинамики. Разжижение крови вызывает снижение концентрации гемоглобина в периферической крови и тем самым усугубляет уменьшение переноса артериального кислорода. По мере прогрессирования шока кислородная недостаточность тканей вызывает накопление в организме недоокисленных продуктов обмена веществ 13 и метаболический ацидоз с понижением рН крови, увеличением дефицита буферных оснований, падением уровня стандартного бикарбоната, уменьшением напряжения СО2. Ацидоз в начальных стадиях кровопотери носит компенсированный характер [83]. Происходит увеличение отдачи большего количества кислорода тканям из единицы объема протекающей крови. Падение рН крови ведет к увеличению диссоциации оксигемоглобина, что является важной приспособительной реакцией для обеспечения тканей кислородом при уменьшенном системном транспорте [34, 216]. При углублении кровопотери развивается некомпенсированный метаболический ацидоз со снижением pH в венозной крови до 7,0–7,05, в артериальной — до 7,17–7,20 и уменьшением щелочных резервов [24, 180]. Причем, большей тяжести шока соответствует и более выраженный метаболический ацидоз. В этих условиях диффузия кислорода и, следовательно, оксигенация крови существенно уменьшаются. В терминальной стадии кровопотери ацидоз венозной крови сочетается с алкалозом. Ацидотическое состояние (ацидоз), в свою очередь, оказывает угнетающее влияние на сократимость миокарда и гладкую мускулатуру сосудов. По мере прогрессирования шока происходит перераспределение выброшенной из сердца крови и обеспечивается необходимый уровень кровотока в коронарных и мозговых сосудах за счет уменьшения перфузии через почки, брюшную сосудистую систему, печень, кожу и мышцы [30, 83]. Из-за наступающих изменений гемодинамики при активации адаптационных механизмов нарушается периферическое кровообращение [35, 245]. Наступает спазм периферических сосудов, что рассматривают, как компенсаторную реакцию организма, направленную на поддержание АД [52]. Возрастание тонуса резистивных и емкостных сосудов приводит к уменьшению емкости сосудистого русла. Компенсаторная вазоконстрикция и рано возникающее учащение пульса, до известной степени, компенсируют уменьшение силы сердечных сокращений. Избирательное регионарное сужение сосудов после 14 кровопотери отсрочивает системное падение кровяного давления, предупреждает гипотензию. Нарушение периферического кровотока и недостаточная перфузия тканей является одним из центральных звеньев в патогенезе циркуляторных нарушений, возникающих при кровопотере и шоке [24, 30, 31]. Несомненно, кровопотеря с нарушением микроциркуляции является важнейшим фактором, который приводит к срыву компенсаторных и приспособительных реакций организма [23]. Изменения микроциркуляции становятся необратимыми раньше, чем другие изменения гемодинамики [29, 41, 83]. Уменьшение притока крови и выраженные расстройства микроциркуляции еще более затрудняют передачу кислорода клеткам [32, 192]. Можно сказать, что геморрагический шок – это состояние гипотензии, которое характеризуется уменьшением кровотока, а также нарушением подачи кислорода к тканям и снижением функциональной плотности капилляров в микроциркуляции [83]. Интенсивность и распространенность нарушений микрогемодинамики зависит от исходного уровня АД, степени его падения и длительности гипотензии. Длительное уменьшение кровотока приводит клетки к необходимости компенсаторной реакции – вазомоторная активность сосудов усиливается, а артериолы и прекапиллярные сфинктеры становятся более чувствительными к констрикторным стимулам. Капиллярные сфинктеры обычно принимают участие в контроле над распределением крови, выброшенной из сердца во внутренние органы. Они реагируют сужением на концентрацию адреналина в 100 раз меньшую, чем в норме, что приводит к длительной вазоконстрикции при уменьшении объема крови. Волемические расстройства связаны со снижением сосудистого тонуса и повышением сосудистой проницаемости. Изменение микроциркуляции на ранних стадиях шока способствуют восполнению ОЦК за счет внесосудистой жидкости, происходит мобилизация интерстициальной жидкости в кровь [83]. Транскапиллярное пополнение внутрисосудистого пространства при возникновении кровопотери восполняет около 60-70% исходного объёма плазмы, независимо от объёма кровопотери. 15 При падении АД ниже 50 мм рт. ст. замедляется движение крови, в отдельных капиллярах наблюдается стаз, сокращается число функционирующих капилляров. Происходит раскрытие артерио-венозных шунтов. При этом некоторая часть крови, минуя капилляры, через анастомозы проходит в венулы. В заключительной фазе шока прекапиллярные сфинктеры теряют тонус. Появляется спазм венул, вазоконстрикция на уровне венозных стволов обусловливает повышение центрального венозного давления и венозного возврата. Вазоконстрикция, хотя и обладает выраженной компенсаторной ролью, но оказывает вредное влияние на ткани, так как основная часть кровотока при спазме приходится на артерио-венозные анастомозы. С одной стороны, это приводит к увеличению притока крови к сердцу, а с другой – усиливает местную ишемию и гипоксию [31, 83]. Длительная вазоконстрикция ведет к некрозу тканей и перегрузке сердца [24, 43]. В терминальной стадии в отдельных капиллярах отмечаются микротромбы, которые могут привести к необратимым изменениям в органах и вторичной недостаточности сердца [32, 41]. Ишемия печени и почек может способствовать опасным функциональным и органическим изменениям. Причиной микроциркуляторных расстройств при геморрагическом шоке, наряду с падением сердечного выброса, может быть ухудшение реологических свойств крови. При многих патологических состояниях негативно изменяется весь комплекс микрореологических характеристик крови, что ухудшает ее транспортный потенциал [23, 26, 29, 76]. Наблюдается повышенная агрегация форменных элементов крови, которая усиливается вследствие реологических нарушений. Эффективность кровотока и сосудистое сопротивление в значительной мере зависят от агрегации эритроцитов и адгезии лейкоцитов [8183]. Кровопотеря, гиповолемия, нарушения микроциркуляции, развитие циркуляторной гипоксии и метаболический ацидоз инициируют увеличение вязкости, склонность к агрегации и увеличение адгезивности эритроцитов и тромбоцитов. Агрегация эритроцитов реализуется в основном в венулярном отделе микрососудистого русла и создает до 60% сопротивления в этом 16 сосудистом сегменте. Адгезированные к сосудистому эндотелию лейкоциты могут стать помехой движению эритроцитов, транспортирующих кислород [24]. Меняется форма эритроцитов и, следовательно, их продвижение по капиллярам[199]. В результате формируются "монетные столбики" из эритроцитов, что приводит к дальнейшей стагнации крови в микроциркуляторном русле [83]. Гиперкоагуляция, развивающаяся на самых ранних этапах геморрагического шока, приводит к диссеминированному внутрисосудистому свертыванию (ДВС), что еще более способствует нарушению периферического кровообращения. Развитие стаза и появление микротромбов, повышение свертываемости способствует и ДВС синдрому, и вторичному фибринолизу. Появление микротромбов связано с посттравматической гипоксемией, которая возникает под влиянием серотонина и других активных аминов, выделяющихся из тромбоцитов, находящихся в тромбах [24, 29, 83]. Нарушение периферического кровообращения способствует ухудшению кислородного режима организма. Развитие циркуляторной гипоксии вызывает нарушение энергетического обмена. Образующийся при гликолизе пируват не поступает в цикл трикарбоновых кислот из-за недостатка кислорода в окружающей среде и накапливается в цитоплазме, где превращается в лактат. Происходит увеличение концентрации пирувата и лактата в крови. Отмечаются признаки нарушения окислительных процессов в тканях в виде накопления избытка лактата. Содержание молочной кислоты превышает концентрацию пировиноградной. В связи с гипоксией и ацидозом происходит снижение чувствительности гладкомышечных стенок сосудов к циркулирующим в крови катехоламинам [83]. Уменьшение ОЦК сопровождается перемещением значительных объемов внеклеточной жидкости в сосудистое русло, что ведет к нарушениям водно-электролитного равновесия. Жидкость, поступающая в сосудистое русло, практически лишена белков. Поэтому концентрация их в плазме понижается, и онкотическое давление плазмы падает. При достижении нового равновесия между онкотическим и гидростатическим давлением в 17 капиллярах дальнейший приток межтканевой жидкости в сосудистое русло прекращается. Глубина расстройств кровообращения, развитие тяжелой гипоксии и изменение метаболизма определяет тяжесть и исход геморрагического шока. Регулирующие системы не способны поддерживать гомеостаз, деструктивные эффекты цитокинов приводят к нарушению проницаемости и функции эндотелия капилляров, развитию органной дисфункции. При прогрессировании шока формируется полиорганная недостаточность [83, 193], сердечная недостаточность, отек головного мозга и процесс вступает в необратимую фазу, летальность при которой составляет 70-80%. Значительная стойкая гипотензия в течение часа указывает на большую потерю крови и является показанием для немедленной трансфузионной терапии, направленной на коррекцию патологических изменений, возникающих в организме при шоке и кровопотере [3, 6, 83]. Современная терапия геморрагического шока включает большой комплекс лечебных средств, воздействующих на все звенья его патогенеза [200, 254]. Обязательным и безотлагательным при геморрагическом шоке является восполнение ОЦК, восстановление гемодинамики, газотранспортной функции крови, коррекция водно-солевого и кислотно-основного состояния [7, 83, 180]. Характер кровоснабжения различных регионов тела после кровопотери определяет устойчивость к гиповолемии. Исходя из большого значения гиповолемии в патогенезе шока, для устранения анемии, нарушений периферического кровообращения, улучшения реологических свойств крови применяют переливание кровезамещающих растворов, компонентов крови и биологически активных веществ [2, 3, 6, 161]. Трансфузионное обеспечение терапии кровопотери, особенно при массовом поступлении пострадавших, требует создания запаса трансфузионных сред и компонентов крови. Используется практически весь арсенал кровезамещающих растворов, начиная от физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида) и заканчивая декстранами. Однако наиболее предпочтительными при восполнении ОЦК 18 были и остаются компоненты крови: эритроцитная масса и тромбоконцентрат, свежезамороженная плазма [3, 6]. С появлениями новых знаний о механизме шока совершенствуются методы инфузионной терапии, включающие одновременно и фармакологические препараты, воздействующие на различные звенья патологического процесса [7, 254]. При оказании медицинской помощи при геморрагическом шоке и ликвидации гиповолемии, солевые растворы с различными добавками могут оказаться наиболее эффективными инфузионными средами. Они оказывают преимущественное действие на водносолевое равновесие и кислотно-основное состояние организма. При инфузионной терапии ГШ изотонический раствор натрия хлорида при его введении в большом объеме не приводит к ухудшению функции сердечнососудистой системы [83]. Однако инфузия солевых растворов, несмотря на коррекцию гемодинамики, КОС, водно-электролитного баланса организма, не устраняет гипоксию, которая является важным фактором патогенеза шока и кровопотери. Cопровождающее артериального давления массивную первично, является кровопотерю прямым снижение компенсаторным защитным механизмом, но способствует тромбообразованию. Ингибирование процессов внутрисосудистого свёртывания проводят путём применения гепарина. Оптимальным вариантом пополнения количества прокоагулянтов и факторов свёртывания является применение свежезамороженной плазмы крови. При этом одновременно больному переливается в соответствующем объёме эритроцитная масса, свежезамороженная плазма и необходимые кровезаменители. Учитывая современные тенденции в трансфузиологии и реаниматологии, состав инфузионно-трансфузионной терапии при массивной кровопотере, сопровождающейся шоком, претерпел качественные изменения Применение кровезамещающих растворов решает несколько [3, 7]. задач: восполнение недостатка объёма крови, регуляцию кровяного давления, сниженного вследствие потери крови или шокового состояния; очищение организма от ядов при интоксикациях, насыщение клеток организма 19 кислородом [7]. По функциональным свойствам кровезамещающие жидкости делятся на несколько типов: гемодинамические (антишоковые) – для коррекции нарушенной циркуляции крови по сосудам и капиллярам; дезинтоксикационные; кровезаменители–корректоры водно-электролитного и кислотно-щелочного равновесия; гемокорректоры; комплексные кровезамещающие растворы, обладающие широким спектром действия [2, 3, 6]. Никакие лекарственные средства не могут заменить правильно проведенную инфузионную терапию [83]. При геморрагическом шоке для коррекции гиповолемии широко используются кровезаменители гемодинамического действия, а также препараты, улучшающие реологические свойства крови. После выведения пациента из шока и устранения непосредственной угрозы для жизни восстанавливают нарушения отдельных звеньев гомеостаза (кислотнощелочной состав, гемостаз и так далее). Таким образом, нарушение гемодинамики при геморрагическом шоке носит характер сочетанной дисфункции работы сердца и сосудистого тонуса с преобладанием того или иного компонента. Остается неясным, в какой мере в развитии посттрансфузионной гиподинамии имеет значение нарушение сосудистого тонуса. Управление сосудистым тонусом, который обеспечивает распределение кислорода и метаболитов в организме, интенсивность транскапиллярного обмена, является трудной задачей. Сосудистый тонус регулируется двумя противоположными процессами вазоконстрикцией и вазодилятацией и определяется балансом между ними, уровнем артериального тонуса на данный момент. Вазоконстрикция приводит к гипоксии тканей и развитию ацидоза [2, 83]. В этих условиях протеолитические ферменты поджелудочной железы поступают в кровь и стимулируют образование кининов. Последние повышают проницаемость сосудистой стенки, что способствует переходу воды и электролитов в интерстициальное пространство. В результате в капиллярах происходит агрегация эритроцитов, создающая возможность для образования тромбов [24, 26]. 20 При физиологических условиях антикоагулянты и вазодилататоры в эндотелии являются основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции [29, 83]. Повреждение эндотелия сосудов и обнажение субэндотелиальных слоев запускает реакции агрегации, свертывания, препятствующие кровопотере, и вызывает спазм сосуда, который может быть очень сильным. При кратковременном действии повреждающих агентов эндотелий продолжает выполнять защитную функцию, препятствуя кровопотере. Но при продолжительном повреждении эндотелия, по мнению многих исследователей [49, 57], он начинает играть ключевую роль в патогенезе ряда системных нарушений. Дисфункция эндотелия, наступающая при воздействии повреждающих агентов, резко меняет направление его эндокринной активности [44, 57]. Это объясняется участием эндотелия в активизации ренин-ангиотензиновой и симпатической систем, переключением активности эндотелия на синтез оксидантов, вазоконстрикторов, агрегантов и тромбогенных факторов, а также уменьшением деактивации эндотелиальных биологически активных веществ из-за повреждения эндотелия некоторых сосудистых областей [57]. Как известно, одним из регуляторов тонуса сосудов является оксид азота. В организме человека и животных монооксид азота управляет механизмами физиологических и патологических процессов. Как избыток, так и недостаток NO, может быть значимым в патогенезе заболеваний [46, 49, 56]. Поддержание адекватного кровотока происходит под влиянием оксида азота, который синтезируется эндотелием и является сигнальной молекулой в сердечнососудистой системе [24, 36, 43]. Гиперпродукция оксида азота вызывает избыточную вазодилятацию и угнетение вазоконстрикции, что является важным звеном патогенеза различных видов шока [120]. Однако выраженность и направленность изменений кровотока при изменении синтеза оксида азота в норме и при патологии в различных сосудистых регионах не до конца изучена [30, 31, 192]. Широкий диапазон сдвигов в крови (по клеточному составу, количеству и структуре форменных элементов) при различных воздействиях 21 позволяет судить о характере нарушений, возникших в организме. Поэтому исследование крови и системы циркуляции являются базисными для изучения гуморальной регуляции в сфере физиологии оксида азота. 2 ОКСИД АЗОТА И ЕГО УЧАСТИЕ В ПАТОГЕНЕЗЕ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА Оксид азота непрерывно продуцируется ферментативным путем в организме млекопитающих, регулируя многие физиологические процессы: сосудистый тонус, деятельность органов дыхания, мочеполовой системы, влияет на функционирование органов внутренней секреции [151, 172] и т.д. Оксид азота – восстановленная форма моноокиси азота. Он высоко химически активен благодаря тому, что имеет на внешней орбите свободный электрон. NO2– NO-синтаза L – аргинин • NO NO3– цитруллин Рисунок 1. Образование NO из L-аргинина Образуется оксид азота в результате окисления кислородом гуанидиновой группы аминокислоты L-аргинина (рис.1). Неактивным продуктом этой реакции является цитруллин, который быстро вновь способен превращаться в аргинин, тем самым поддерживая его фонд в эндотелиальных клетках [10]. Свободный радикал оксида азота имеет короткий период полужизни – от 2 до 30 с. вследствие быстрого перехода в нитраты и нитриты [21, 65]. Это частично 22 объясняет трудности выявления NO в биологических жидкостях и тканях [10]. Нестабильность NO делает непригодным стандартные методы его определения 79]. [40, Среди непрямых методов определения NO наиболее распространенным является реакция на нитританион (NO2-) с использованием реагента Грисса. Этот метод имеет свои недостатки: соблюдения строгого рациона питания экспериментальных животных, необходимость довольно большого объема плазмы. Высокую чувствительность имеет метод, основанный на фотометрии метгемоглобина, образующегося в результате окисления оксигемоглобина NO. Применение двухволновой спектрофотомерии дает возможность определять до 2 нМ оксида азота [40]. Методически наличие и активность NO системы в тканях определяется иммунохимическим методом с помощью антисывороток к NOS, гистохимически по NADPH-диафорезу, а также по продукции цитруллина и с помощью NO– сенсоров, точность которых достигает 1нM. Электрохимический метод требует вживления в сосуды селективных электродов, обеспечивая возможность проведения мониторинга. Измерение свободного NO методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [10], ЭПР-томогрофии позволяет изучить пространственное распределение NO. ЭПР требует дорогостоящей аппаратуры, однако высокая избирательность в отношении NO характерна только для этого метода. В организме человека присутствуют как L- так и D-энантиомеры аргинина, однако только L-аргинин является субстратом для генерации NO [4, 39, 105]. Превращение L-аргинина в NO играет ключевую роль в нормальном функционировании эндотелия благодаря вызываемой им вазодилатации [156, 194]. Аргинин относится к полунезаменимым аминокислотам, является предшественником для синтеза белков и многих биологически важных молекул, таких как орнитин, полиамины, креатин [18]. L-аргинин в клетках, синтезирующих NO, повышает содержание интерферона- и интерлейкина-1β, которые ускоряют поступление L-аргинина внутрь клеток и стимулируют активность аргининсукцинатлиазы, катализирующей ресинтез его в L- 23 цитруллин [4, 39]. Реакция, приводящая к образованию NO, описана М. Марлетта [197]: 2L-Arginin+3NADPH +4O2 +3H+→ 2L-Citrullin +2 NO +3 NADP++4H2O Синтез NO происходит под влиянием изоформ фермента – синтазы оксида азота (NOS) [40, 197]. Синтазы оксида азота – сложно организованные ферменты, одновременно включающие 5 кофакторов [87, 113]. Они различаются по аминокислотной последовательности белковой части молекулы и механизмам, регулирующим их активность, однако, катализируют одну и ту же реакцию превращения аминокислоты с образованием оксида азота [74]. Снижение рН в цитоплазме клетки не влияет на синтез NOS, но препятствует участию донора электронов НАДФН в NOS-зависимом синтезе NO [40]. Синтез аргинина “de novo” осуществляется эндотелиальными клетками кишечника и почками [4]. В кишечнике цитруллин является промежуточным звеном в реакциях орнитинового цикла. Он образуется из глутамата, далее с током крови поступает в почки, где происходит синтез аргинина, необходимого для образования NO во многих тканях [105, 251]. Доступность L-аргинина для NOS снижается вследствие активности конкурирующей аргиназы [138, 251], в результате чего образуется мочевина и орнитин [100, 251]. Синтазы оксида азота обнаружены практически во всех внутренних органах [30, 66, 67], преимущественно в стенке кровеносных сосудов, где они могут оказывать сосудорасширяющий эффект [39, 57]. Синтезировать и выделять оксид азота могут большинство клеток организма [15, 112, 257]. Семейство ферментов, продуцирующих NO, найдено в эндотелиоцитах артерий и вен, в гладких миоцитах сосудов, в макрофагах, в тучных клетках, в неадренергических нехолинергических нейронах, в эпителиоцитах, в альвеолоцитах [21, 40, 53]. Наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, клетки нервной ткани (нейроны) и клетки соединительной ткани (макрофаги), обладающие высокой фагоцитарной активностью [191, 243]. 24 Существуют три основные изоформы NOS [87]. Экспрессия и активность той или иной изоформы может обусловливать способность NO являться физиологическим регулятором или же токсическим веществом [39, 123, 175]. Ферментная активность изоформ NOS оценивается количеством NО, образующимся в единицу времени. По характеру индукции и действия их разделяют на конститутивные: нейрональную (nNOS выделена из мозжечка крыс) и эндотелиальную (eNOS выделена из клеток эндотелия), и индуцибельную (iNOS макрофагальную или mNOS) [40, 53]. Основные каталитические различия изоформ заключаются в том, что для активности nNOS и eNOS, в отличие от iNOS, необходим Ca2+, который предварительно связывается с внутриклеточным кальцийсвязывающим белком кальмодулином, цитоплазматическим рецептором [40, 146]. При увеличении содержания ионов кальция в клетке он присоединяется к молекуле NO-синтазы, что приводит к активации фермента и синтезу NO. Генерация оксида азота конститутивными NOS способствует выделению небольшого количества NO в ответ на рецепторную и физическую стимуляцию [39, 40]. Эндотелиальная синтаза оксида азота существует в растворимой и мембраносвязанной форме. В плазматической мембране локализация eNOS способствует передаче сигнала при ускорении кровотока, увеличении напряжения сдвига, при гипоксических состояниях [36, 48, 56]. Различные физиологические и патологические условия могут модулировать уровень экспрессии еNOS [120, 125, 174]. eNOS образуется в эндотелиоцитах и поддерживается ацетилхолином и брадикинином [146]. Кроме того, eNOS существует в кардиомиоцитах, эритроцитах, мегакариоцитах, тромбоцитах [36, 154, 202]. Активность eNOS наиболее выражена в эндотелии артериальных сосудов и минимальна в эндотелии капилляров и венозных сосудов [126]. Установлено, что у животных, лишенных eNOS, среднее АД на 30 % выше, чем у мышей с нормальной функцией этого гена [40, 195]. eNOS на 80% относится к конститутивной форме и примерно на 20% к индуцируемой. 25 Считается, что нейрональная nNOS является только конститутивной, она может быть спонтанно активна, обеспечивая некоторый базальный уровень секреции NO, либо быстро активироваться в ответ на нервный импульс [39, 40]. nNOS также участвует в регуляции АД и ее активация способствует его снижению. Активация макрофагальной NOS (iNOS) является частью многих защитно-адаптационных реакций [40, 177]. iNOS является индуцируемой, для ее активации требуется время, после чего макрофаги, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, микроглиальные клетки, содержащие эту форму NOS, генерируют большое количество NO, намного превышающее его физиологические количества, вырабатываемые конститутивными формами NOS [98, 228, 242]. Образуется iNOS в ответ на биологически активные вещества: эндотоксины, цитокины, оксиданты [40, 133]. Индуцибельная NOS не связана с мембранными белками и является цитозольным ферментом [21, 40]. Кальмодулин соединен с iNOS очень прочно и ее активация Са2+ не является необходимой, что способствует сохранению активности фермента продолжительное время. Ранее считалось, что в клетках, находящихся в покое, iNOS не определяется [40]. Однако в настоящее время имеются доказательства конститутивной экспрессии iNOS в некоторых тканях [5, 105, 113]. Основной путь метаболизма оксида азота заключается в реакции с гемопротеинами [54]. Мишенью NO является растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) [10, 63]. ГЦ содержит гем, являющийся рецептором NO. Стимуляция рГЦ оксидом азота происходит при связывании NO с двухвалентным железом гема. Следствием стимуляции рГЦ является накопление циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) одного из вторичных мессенджеров системы регуляции тканевого метаболизма [63]. Вероятно, цГМФ оказывает действие на различные функции сосудов, но наиболее изученным является влияние на вазодилатацию [247]. Расширение сосудов связано с диффузией NO из эндотелия в соседние гладкомышечные клетки стенки сосуда, активацией в них гуанилатциклазы и образованием цГМФ [19]. Следовательно, участие NO в 26 метаболизме сводится, фактически, к роли цГМФ во внутриклеточных процессах [10, 27, 40]. Этот вывод подтверждается экспериментально: NO и аналоги цГМФ оказывают одинаковое воздействие на клеточную жизнедеятельность. В этом процессе, кроме цГМФ, ключевые роли играют цГМФ-зависимая протеинкиназа, Са2+-АТФаза и Са2+ [19, 151]. Под воздействием увеличенного содержания кальция активируется эндотелиальная форма NOS кальмодулин-зависимым механизмом. NO диффундирует в гладкомышечные сосудистые клетки, где связывает гем рГЦ, тем самым активируя ее. Продукция цГМФ уменьшает содержание клеточного кальция, в результате чего происходит релаксация гладких мышц сосудов. Вазодилататорное действие NO осуществляется не только путем активации гуанилатциклазы, но и в результате обратимого ингибирования цитохромоксидазы [113]. Взаимодействуя с такими железосодержащими белками-ферментами как аконитаза, цитохромы митохондриальной электронно-транспортной цепи, NO нарушает структуру их активных центров, в результате чего замедляются процессы окислительного фосфорилирования [112]. Молекулярными мишенями NО также являются железосодержащие ферменты и белки: собственно нитрооксидсинтаза (NOS), гемоглобин, ферменты цикла Кребса, синтеза белка и ДНК [89, 147, 182]. Биологические эффекты NO могут ослабляться его необратимой инактивацией в реакции с анионами супероксида в стенке кровеносного сосуда или связыванием с железосодержащими комплексами, например, гемоглобином в просвете кровеносного сосуда [40, 53, 88]. NO, присоединяясь к центральному гему гемсодержащих белков, образует метгемоглобин, который можно рассматривать как транспортную форму оксида азота [27]. В реакции с оксигемоглобином NO окисляется в нитраты, что нарушает [88] кислородтранспортную функцию крови и приводит к гемической гипоксии. Одним из путей восстановления кровотока является регулирование сосудистого тонуса [222, 231, 247], где важную роль играет продукция NO в эндотелиоцитах [123]. Как уже отмечалось, NO способен проявлять как 27 активирующее, так и ингибирующее действие на различные метаболические процессы в зависимости от физиологического состояния организма млекопитающих и человека [40, 175]. Стационарный уровень NO, необходимый для локальной эндотелиальной цитопротекции и поддержания сосудистого гомеостаза [125, 213, 231], не превышает нескольких микромолей. Регуляторные функции NO проявляются при его концентрации в несколько микромолей на 1 кг ткани. Сосуды кровеносной системы – артерии, вены, капилляры находятся в постоянном активном базальном состоянии релаксации под действием непрерывно образующегося в эндотелии оксида азота [68, 80]. Под воздействием NO снижается тонус артериальных и в большей степени венозных сосудов в малом и большом кругах кровообращения, уменьшается пред- и постнагрузка на сердце, а также давление в желудочках [21, 36, 218]. Вместе с тем, гладкомышечные клетки сосудов находятся в состоянии стойкого возбуждения вследствие их непрерывной нервно-гуморальной и механической стимуляции [39, 40]. По эфферентным нервам NO вызывает разнообразные гомеостатические воздействия на ткани внутренних органов: дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы. Он оказывает влияние как стимулятор нейронов и нейротрансмиттер периферической нервной системы [39, 40, 125]. Кроме действия на сосудистый тонус (как антагонист адренергической системы) NO способствует сохранению фильтрационной функции микрососудов [247]. Функционирующим эндотелием поддерживается циркуляция и текучесть крови [80]. Барьерная роль эндотелия сосудов определяет его главную роль в организме человека: поддержание гомеостаза путем регуляции равновесия противоположных процессов – тонуса сосудов (вазодилатация /вазоконстрикция), анатомического строения сосудов (синтез/ингибирование факторов пролиферации), гемостаза (синтез и ингибирование факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов) [16, 29, 256]. На эндотелии находятся рецепторы, которые воспринимают давление и объем движущейся крови, 28 стимулируют синтез противосвертывающих и сосудорасширяющих веществ [51, 130]. Стимулами для синтеза NO в эндотелиальных клетках служат стимуляция механорецепторов, вызванная напряжением потока крови [179, 199], пульсовые колебания давления [48, 256], а также вещества, повышающие уровень цитозольного кальция, что содействует реакции и активирует NOS [199, 250]. Синтез NO динамическом усиливается (стимулированная напряжении мышечных элементов секреция) при сосуда, сниженном содержании кислорода в ткани [95, 137, 212] в ответ на выброс в кровь ацетилхолина, гистамина, норадреналина, брадикинина, АТФ. Образующиеся вещества находятся в функциональном равновесии с NO, как часть системы обратной связи, поддерживающей тонус сосудов [40, 57]. Как уже отмечалось, синтез NO эндотелием увеличивается при ускорении тока крови, дополнительно подавляя сократительную активность гладких мышц, что вызывает расширение сосудов [40, 55, 57]. Поэтому при увеличении кровотока на фоне блокады NO возникают констрикторные реакции гладких мышц. Длительное увеличение напряжения сдвига и мышечное сокращение способствуют повышению уровня экспрессии eNOS [48]. Образующийся NO может действовать в самой клетке, либо достигает клеток–мишеней путем простой диффузии [140]. Молекулы NO, несмотря на свою высокую химическую активность, способны транспортироваться на расстояния, превышающие, по крайней мере, в несколько раз клеточные размеры [130]. Эффекты NO неоднозначны и зависят от стабильности NO и концентрации в тканях [10, 102]. При повышенной генерации NO проявляется его цитотоксическое или цитостатическое действие [75, 196]. Высвобождение большого количества NO под воздействием медиаторов воспаления вызывает резкую вазодилатацию, усиление сосудистой проницаемости, формирование отека и развитие воспалительной реакции [136]. В результате, нарушается деятельность сердечно-сосудистой системы, происходит дисфункция миокарда, ингибирование клеточного дыхания, что способствует изменению доставки, потребления кислорода и ухудшает кислородный статус организма [43, 44]. В 29 ответ на повреждение эндотелий сосудов вырабатывает семейство аминопептидов, называемых эндотелинами [16, 57]. Эндотелиальные клетки в ответ на гипоксию снижают экспрессию вазоконстрикторов – эндотелина и тромбоксана и усиливают высвобождение вазодилататоров – аденозина, простоциклина и NO [57]. Полагают, что вазодилататорное действие NO направлено противоположно действию эндотелинов [135]. При длительном действии повреждающих факторов, таких как гипоксия [181], воспаление [25, 73, 136], гемодинамическая перегрузка [35, 37] происходит изменение эндотелиального ответа с преобладанием гиперактивации вазоконстрикции и гемокоагуляции, факторов роста и пролиферации, что в конечном итоге ведет к развитию эндотелиальной дисфункции [8, 238, 239]. Дисфункция сосудистого эндотелия рассматривается как один из ведущих факторов патогенеза болезней сердца и сосудов [44, 51, 61]. В основе этих нарушений лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками биологически активных веществ в том числе и NO [135, 139]. Известно, что под влиянием различных повреждающих факторов, способность эндотелиальных клеток синтезировать вазодилататоры уменьшается (дефицит субстрата Lаргинина), а способность синтезировать вазоконстрикторы сохраняется – возникает эндотелиальная дисфункция, проявляющаяся в нарушении биодоступности NO, изменении экспрессии eNOS и ускоренном метаболизме NO [46, 57]. Как уже отмечалось, оксиду азота в зависимости от условий свойственны защитные и повреждающие функции [21, 69, 75]. Нарушения кровообращения при шоке приводят к кислородной недостаточности [22, 24]. Четко выявлена корреляция между содержанием оксида азота в тканях и гипоксией тканей [28, 86]. При умеренной гипоксии активность eNOS увеличивается в результате повышения концентрации внутриклеточных ионов Ca2+, уровень которого коррелирует с высвобождением эндотелиального NO [21]. Тяжелая гипоксия угнетает синтез NO в эндотелии [223]. Кроме того, увеличение активных форм кислорода трансформирует эффекты NO из защитных в цитотоксические [206]. 30 Прогрессирование гипоксии [212] и состояние хронической ишемии приводит к истощению субстрата NO – L-аргинина и снижению синтеза NO [39, 156], усиливается его утилизация в цикле трикарбоновых кислот. Последствия ишемии определяются не столько гемодинамическими изменениями, сколько развивающимися при этом тканевыми повреждениями [77, 228]. При гипоксии или ишемии активность NO-синтазного механизма снижается, в то время как повышается активность нитритредуктазных систем [66, 67]. Установлено, что при гипоксии и ацидозе возможно образование NO несинтазным (нитритредуктазным) путем, и интенсивность этого процесса увеличивается [40]. Тканевая гипоксия, с одной стороны, замедляет синтез оксида азота из L-аргинина (т.к. содержание кислорода снижено), с другой стороны, существуют данные, что этот процесс протекает за счет образования NO из нитритов [28, 50]. Значительный вклад в нитритредуктазную активность вносит гемоглобин в крови и миоглобин в мышечной ткани [54, 163]. Гемоглобин играет важную роль в элиминации образующийся NO: нитрозогемоглобин может быть источником NO на уровне микроциркуляции. В гипоксических тканях происходит повышенное высвобождение NO из нитрозоформ, в результате снижается региональное сосудистое сопротивление и поддерживается транспорт кислорода. Кроме того, оксид азота оказывает влияние на энергозависимые функции клеток, в том числе и через регуляцию потребления кислорода путем влияния на активность фермента цитохромоксидазы С [128]. Снижение рН в цитоплазме клетки, происходящее при кровопотере [34], препятствует участию в синтезе NO – синтазы оксида азота, снижая его уровень [163]. Известно, что гипоксия является одной из важных причин возникновения свободно-радикальных процессов [44, 57], в результате которых формируется супероксиданионрадикал и оксид азота, т.е. развивается как оксидативный [187, 232], так и нитрозильный стресс [49, 85]. NO обладает антиоксидантными свойствами [171], и одним из защитных действий NO является способность увеличивать активность антиоксидантных ферментов и экспрессию 31 кодирующих их генов [148]. Супероксидрадикал, а также железосодержащие соединения и гемоглобин могут регулировать уровни содержания NO в организме [143]. Ишемия и последующее восстановление кровотока служат индукторами образования супероксидных анионов в тканях [90, 169]. При физиологических (нейтральных) значениях рН этот анион быстро (в течение секунды) распадается. Супероксидрадикал тормозит экспрессию и активность eNOS, кроме того, он способен связывать и инактивировать NO, что ограничивает его распространение и способствует снижению концентрации оксида азота [143]. Предотвращение инактивации оксида азота супероксидом объясняет способность супероксиддисмутазы улучшать микроциркуляцию при воспалительных процессах и нормализовать кровоток после тромбозов, вазоспазма и других нарушений кровообращения [143, 187]. СОД увеличивает биодоступность NO [168], образование NO при низкой активности СОД не наблюдается, что возможно, связано с защитой от чрезмерной продукции пероксинитрита [177]. Избыток оксида азота при шоке вызывает нарушение функции органов различными путями: нарушением генной экспрессии и активности ряда ферментов. В условиях гиперпродукции свободных радикалов и при наличии дефектов системы антиоксидантной защиты, связанной с дефицитом СОД [150, 187], супероксиданион (О2-) окисляет NO до пероксинитрита, обладающего сильным окислительным потенциалом, способным окислять и разрушать важнейшие клеточные компоненты [107, 230]. Пероксинитрит выступает в качестве интегрального звена, объединяющего две системы активных низкомолекулярных агентов, образующихся в клетках и тканях NO и активных форм кислорода [159, 238]. Полагают, что пероксинитрит, в зависимости от концентрации, может оказывать не только повреждающее, но и защитное действие. При низких концентрациях пероксинитрит выступает как регулятор и цитопротектор, что связано с образованием S-нитрозотиолов. Результатом его защитного действия является уменьшение сердечной аритмии при ишемии/ реперфузии [40, 218]. 32 Образование оксида азота способствует поддержанию артериального давления [46, 60, 222] и функции миокарда [218, 233], защите от оксидативного повреждения [143]. Уникальные биологические свойства NO и его участие в разнообразных процессах дают возможность использования данного соединения (путем управления его содержанием) в лечебных целях [69]. Огромен потенциал воздействий, направленных на процессы образования NO [73, 229, 257]. Уровень оксида азота определяется балансом между интенсивностью его синтеза или экзогенного образования и интенсивностью инактивации. Генерация NO эндотелиального происхождения регулируется через изменение экспрессии либо активности самого фермента eNOS, либо вследствие изменения активности кофакторов или эндогенных ингибиторов [121]. С целью изыскания новых средств фармакотерапии исследователи проявляют большой интерес к выяснению роли NO в механизмах гипо- и гипертензии, тромбоза, последствий ишемии/реперфузии, а также поиску путей коррекции недостатка и избытка продукции NO [90, 219, 229]. Изменение уровня NO в тканях и жидкостях организма опосредует действие многих лекарственных препаратов и токсичных веществ, как доноров, так и акцепторов этого соединения [21]. Влиять на генерацию NO в организме для ослабления или усиления синтеза, исходя из данных о L-аргинин – NO- метаболизме, возможно: 1) регулированием уровня субстрата (L-аргинина) [164, 189, 204]; 2) активацией/индукцией или ингибированием NO-синтаз [202, 234]. Кроме того, в качестве терапевтических средств могут применяться экзогенные доноры NO [205, 229] или NO в виде компонента газовой смеси [21, 95]. Уменьшение уровня NO приводит к нарушению целого ряда процессов, происходящих в организме. Многие заболевания сопровождаются эндотелиальной дисфункцией и характеризуются снижением генерации NO [4, 5, 46]. Дефицит NO характерен для гипертензии, недостаточности кровообращения [20, 26, 46]. Одним из путей поддержания необходимого количества NO, уменьшающегося в результате угнетения активности eNOS, 33 может быть введение доноров NO [152, 235]. NO, образующийся при введении доноров, действует так же, как эндогенно продуцируемый. Оксид азота – важная физиологическая составляющая, участвующая в функциональной активности клеток крови – эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов [29]. Е.В.Шамова с соавторами [82], исследуя влияние доноров NO на функциональные и механические свойства клеток крови, установили, что доноры NO регулируют структурные и функциональные свойства тромбоцитов и эритроцитов [82], оказывают влияние на агрегацию форменных элементов крови и обладают дезагрегирующим действием. При введении доноров NO гемолиз эритроцитов уменьшается, упругость клеток сохраняется, повышается деформируемость эритроцитов [82], что еще раз подтверждает необходимость использования лекарственных препаратов, способных сохранить и поддержать уровень оксида азота. После открытия молекулы оксида азота вещества из различных фармакологических групп (нитраты, сиднонимины, нитропруссид натрия, никорандил) были объединены в одну фармакологическую группу донаторов оксида азота [205, 219, 241]. В клинической практике высокие дозы NO-содержащих препаратов используются при критических состояниях [14, 249, 257]. Ангиотропный эффект лекарственных нитратов, применяемых в клинике, коррелирует с выделением из них NO [104]. Нитрозовазодилататоры с активным метаболитом NO широко применяются для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся недостаточной генерацией эндогенного NO [45, 50]. Экзогенные доноры NO, исключая субстраты NO-синтаз, высвобождают NO, по-видимому, без участия специально синтезируемых энзимов [205, 249]. К подобным донорам NO относятся лекарственные препараты – нитросорбит, эринит, нитропруссид натрия, известные в фармакологии как нитраты, нитриты [205, 249]. Установлено гипотензивное действие наиболее распространенных вазодилататоров – нитроглицерина и нитропруссида [172, 198, 241]. Открытие сосудорасширяющего действия NO позволило объяснить механизм действия 34 самого распространенного лекарственного средства, применяемого для лечения спазма коронарных артерий, нитроглицерина [201, 205]. Оксид азота, выделяющийся из нитроглицерина, оказывает кардиопротекторное действие посредством увеличения коронарного кровотока, уменьшения количества нейтрофилов, поддержания функции эндотелия и сократительной функции миокарда без увеличения энергетических потребностей и снижения потребления кислорода [126]. Эффект оксида азота является дозозависимым [4]. Низкие концентрации доноров оксида азота увеличивают частоту сокращения предсердий, тогда как более высокие оказывают отрицательный хронотропный эффект [218]. Полагают, что существует оптимальная концентрация оксида азота для реализации протекторных свойств [131]. Нитрозовазодилататоры компенсируют дефицит эндогенного NO, купируя сосудистые спазмы [104], но их эффективность существенно ограничена. Так, нитропруссид натрия высвобождает токсичный цианид, применение нитратов в медицине вызывает у многих пациентов развитие толерантности, в частности, к нитроглицерину, которая сохраняется при увеличении дозы препарата [217]. Поэтому большое внимание уделяется поиску новых доноров NO, которые могли бы составить основу будущих лекарственных препаратов на основе нитровазодилататоров [172, 178, 205]. Инертным окислительным метаболитом оксида азота давно считается нитрит анион, окислительный продукт распада, который рассматривают в качестве диагностического маркера. В ранних экспериментальных работах описано сосудорасширяющее действие нитрита [258]. В более поздних исследованиях показана роль нитритов при ряде патологических процессов [118, 124, 153]. Предполагают, что в очагах ишемии без участия ферментов NOS, О2, и L-аргинина [120] нитрит может превращаться в NO, оказывать влияние на распределение кровотока в ишемизированной области, когда eNOS нефункциональна. Открытие значения нитрита как физиологического хранилища оксида азота в крови и тканях вызвало значительный интерес к нему и привело к 35 изучению его терапевтического потенциала [124, 182]. Этот процесс активируется в анаэробных условиях, что характерно для ишемии, ацидоза, наличия восстановленных форм гемсодержащих белков. В настоящее время нитриты изучаются в экспериментах на животных и оказываются эффективными при ишемии - реперфузии миокарда. Показана нитрит – опосредованная защита от повреждений органов и тканей и смерти при шоке [120, 123]. В последние годы для повышения образования оксида азота применяют донор – L-аргинин [1, 42, 74]. L-аргинин повышает биоактивность NO посредством прямой антиоксидантной активности, стимулирует выделение гистамина из клеток крови, снижает активность норадреналина и способствует действию эндогенных вазодилататоров [4]. Экзогенный аргинин оказывает защитное действие при гепероксии, гипотермии, заболеваниях печени [71, 91, 122]. В печени уровень L-аргинина остается повышенным в течение 30 минут после введения, в плазме крови – до 180 минут [74]. Установлено положительное влияние L-аргинина на прооксидантно-антиоксидантный баланс при ишемии/реперфузии печени у взрослых кроликов-самцов [240, 122], показан антиоксидантный эффект L-аргинина у крыс при гипоксии [33]. Количество аргинина, проникающего в эндотелиальные клетки сосудов, зависит от активности мембраносвязанной транспортной системы [4, 5, 74]. Имеющиеся данные указывают на то, что действие L-аргинина зависит от его концентрации в плазме крови [4, 217]. По данным литературы [4, 43, 204], введение L-аргинина улучшает функцию эндотелия сосудов у пациентов при стенокардии [42, 43], сохраняет функцию легких после кровопотери, о чем свидетельствуют увеличение рО2, рСО2 в крови, нормализует рН крови [91, 221], повышает резистентность к гипоксии при ишемии головного мозга [42, 196]. Установлено, что при сердечно-сосудистых заболеваниях после инфузии 30 г L-аргинина происходит увеличение средней скорости кровотока на 2810% по сравнению с 2210% в группе контроля [261]. При пероральном применении L-аргинин улучшает 36 эндотелийзависимую вазодилатацию у пациентов с нарушенной функцией эндотелия сосудов, снижает агрегацию тромбоцитов и уменьшает эндотелиальную адгезию моноцитов [5]. В 2009 г зарегистрирован и успешно применяется в клинической практике донор синтеза оксида азота – препарат тивортин, который обеспечивает организм субстратом для синтеза NO [47]. Введение крысам тивортина, содержащего L-аргинин, приводит к усилению образования оксида азота в организме и сопровождается увеличением NO в тканях, а также суммарного содержания его стабильных метаболитов NO2- и NO3- в плазме крови и моче [4, 5]. При его пероральном назначении пациентам с ишемической болезнью сердца в дополнение к традиционной терапии доза нитроглицерина уменьшалась с 3,6 до 1,1 таблетки в сутки. Тивортин существует в двух видах. При стенокардии и заболеваниях периферических сосудов эффективно внутривенное вливание – 4,2 % раствора тивортина [4]. В свободном состоянии молекула NO быстро превращается в нитриты и нитраты. Для расширения биологического действия, переноса между тканями и снижения токсического воздействия NO включается в соединения [145, 155]. В настоящее время большой интерес вызван к наночастицам, содержащим оксид азота, разработанным и запатентованным в 2011 г. (США) [160, 211]. Одной из форм депонирования монооксида азота в клетке могут выступать S- нитрозотиолы (RS-NO) [107, 155], обнаруживаемые в клетках и тканях животных, продуцирующих NO из L-аргинина. Стабилизация NO эндогенного происхождения в организме происходит путем его включения в динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с различными лигандами, которые рассматривают как наиболее перспективные доноры NO [58, 64, 205]. В крови ДНКЖ локализуются, в основном, в плазме и связаны с основным белком плазмы – альбумином [11]. Депо NO в форме ДНКЖ удается выявить методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [10]. Освобождаемый из ДНКЖ оксид азота поступает в увеличенных количествах в интенсивно работающие органы (сердце, почки) [58]. Формирование депо NO является одним из 37 механизмов адаптационной защиты при NO-зависимых нарушениях сосудистого тонуса: депо NO обеспечивает, с одной стороны, защиту от токсического действия избытка свободного NO при его гиперпродукции, а с другой стороны, может выполнять функции дополнительного источника NO при его дефиците [58]. В совокупности эти особенности создают уникальные возможности для регуляции всего синтеза NO и делают эту молекулу универсальным регулятором физиологических функций организма [64, 78]. Эффективными бывают весьма малые дозы ДНКЖ и нитрозотиолов [78]. В институте химической физики РАН (Москва) под руководством профессора А.Ф. Ванина создан первый отечественный донор NO – оксаком (динитрозильный комплекс железа с глютатионом) [11, 78]. Оксаком – перспективный и более стабильный по сравнению с S-нитрозотиолами единственный отечественный препарат, выпуск которого налажен в Российском кардиологическом научном центре. По мере распада он обеспечивает поступление NO в организм, способствуя длительной гипотензии. В Кардиологическом научном центре (Москва) оксаком уже применяется для лечения гипертонической болезни. Длительное время существовали противоречивые данные об усилении и уменьшении генерации оксида азота при шоке. В экспериментах у животных была обнаружена избыточная продукция оксида азота [244], которая, вероятно, возникает в результате увеличения активности индуцибельной синтазы оксида азота в гладких мышцах сосудов и макрофагах. Содержание NO увеличивается во время геморрагического шока и способствует гипотензии. Индукция iNOS на ранних стадиях шока при повышении давления имеет компенсаторное значение, ограничивающее подъем АД, но в дальнейшем синтезируемый в избытке NO подавляет активность эндотелиальной NO-синтазы (еNOS). В результате прогрессирует снижение продукции эндотелиального NO и эндотелийзависимое расслабление сосудов, которое играет большую роль в повышении АД [187]. В свою очередь, повышенное АД нарушает 38 эндотелийзависимую вазодилатацию и, таким образом, замыкает «порочный круг» [66, 67]. Рядом авторов выявлено, что при ГШ происходит снижение активности эндотелиальной конститутивной синтазы, уменьшается генерация оксида азота, которая поддерживает функцию жизненно важных органов [250, 253]. Исследованиями П. Кенборгарда и соавт. [183] установлено существование в эритроцитах eNOS, которая может служить источником NO, наличие еNOS в эритроцитах подтверждено А. Веб и др., П. Улькер с соавт. и др. [250, 253]. В противоположность этому мнению, сомнение относительно исследованиях М.П. Хилариус и соавт. высказали существования еNOS в эритроцитах[167]. В К. Чена, Р. Питтмена и др. количественным анализом подсчитана потеря при ГШ оксида азота в эритроцитах [124]. Показано, что при высоком гематокрите происходит незначительное уменьшение NO в эритроцитах в просвете сосудов. При увеличении кровопотери отмечается выраженное снижение NO. В результате гемодилюции при ГШ кровь имеет более низкий гематокрит [259], уменьшается вязкость крови, происходит сужение сосудов вследствие чего, образование NO в эритроцитах, вероятно, существенно снижается [117, 131, 233]. Роль NO на ранних и поздних стадиях шока не одинакова, что зависит от активности различных изоформ синтаз NOS. В ранней фазе ГШ NO, образующийся под влиянием eNOS, оказывает цитозащитное действие, предупреждая поражение органов, которое может быть следствием циркуляторной гипоксии. Показано, что тяжелая массивная кровопотеря вызывает сосудистую декомпенсацию из-за низкой доступности NO на ранней стадии кровопотери [116, 229]. В ряде работ исследована роль доноров оксида азота при ГШ при различных сроках их введения. Отмечено, что применение доноров NO эффективно на ранней стадии ГШ, но не обеспечивает стабилизацию сердечной деятельности в поздний период [234]. Экзогенный NO (в виде нитропруссида натрия), оказывая защиту в раннем периоде ГШ, не улучшает гемодинамику и 39 выживаемость животных после развития ГШ. Несмотря на увеличение органного кровотока, тканевой перфузии, сохранение микроциркуляции, нитропруссид натрия не может на 100% улучшить гемодинамику и выживаемость. Исследованиями других авторов установлено, что при кровопотере у крыс дополнительное применение NO стабилизирует кровоток в желудочно-кишечном тракте, но, несмотря на временное снижение давления, выживаемость также не увеличивается [235]. Уже отмечалось, что донором NO могут являться ДНКЖ. Известно, что при кровопотере усиливаются процессы свободно-радикального окисления [232, 240], а синтезированные химическим путем низкомолекулярные ДНКЖ с глютатионом или цистеином обладают антиоксидантными свойствами [78]. При их введении в кровь они также вызывают у животных длительную гипотензию, расслабляют изолированные кровеносные сосуды, подавляют агрегацию тромбоцитов, усиливают активность миокарда и ускоряют заживление кожных ран [11, 78]. Показана возможность восстановления микрососудистой перфузии без объемозамещающей терапии при введении экзогенных доноров NO. Для повышения эффективности инфузионной терапии ГШ можно использовать малый объем инфузии с экзогенными Экспериментальными данными кровезаменителя способствует Экзогенно небольших улучшению введенный [116, S-нитрозотиолами 211]. выявлено, что при ГШ введение без доз S-нитрозоглутатиона, кровообращения в S-нитрозоглутатион, сердечной нитрозотиола мышце поддерживает [116]. функцию центральной гемодинамики и защищает сердечную мышцу, предотвращает при гиповолемии перфузию, нарушение уменьшает сердечного ритма [116], метаболический ацидоз геморрагическом шоке S-нитрозоглутатиона сохраняет [90]. тканевую Инфузия при способствует увеличению перфузии тканей с расширением вен и артерио-венозных шунтов, что облегчает передачу давления от артериальной системы в венозную циркуляцию и создает благоприятный градиент давления для увеличения венозного возврата. 40 Восстановление базального уровня NO, нарушенного во время ГШ, может уменьшить многочисленные осложнения, предотвратить сердечно-сосудистую недостаточность и позволит поддержать системную и микрососудистую гемодинамику у животных. Протекторный эффект L-аргинина, как отмечалось выше, связан с улучшением физических свойств крови: уменьшением общего периферического сосудистого сопротивления, вязкости крови, увеличением скорости кровотока, проходимости микроциркуляторного русла [4]. Показано, что введение L-аргинина с изотоническим раствором натрия хлорида при ГШ (у свиней), способствует активации синтеза NO, что приводит к большей выживаемости животных. Внутривенное введение L-аргинина при тяжелой кровопотере у крыс улучшает гемодинамику и метаболизм [94]. При 40% кровопотере введение L-аргинина с солевым раствором (в три раза превышающим объем кровопотери), повышая уровень NO, улучшает перфузию периферических тканей и ослабляет воспаление в слизистой оболочке кишечника [94]. Авторы установили, что ингибирующее влияние аналогов Lаргинина на NOS при ГШ можно преодолеть введением избытка субстрата, что указывает на наличие конкуренции за фермент между L-аргинином и его аналогами [33, 70]. Предполагают, что уровни циркулирующего аргинина в 10 раз выше, чем необходимо в реакции с NOS, однако синтез NO не увеличен. Этот “аргининовый парадокс” можно объяснить присутствием эндогенных ингибиторов синтеза NO, которые увеличивают чувствительность системы к эндогенным субстратам. Представленные Т.К. Арора с соавт. данные доказывают, что шок ведет к увеличению уровня ассиметричного диметиларгинина (АДМА) и соответственно уменьшает образование NO, выступая в качестве конкурентного ингибитора NOS [94, 129]. Увеличение уровня NO при введении L-аргинина преодолевает конкурентное ингибирование АДМА [106] при геморрагическом шоке у крыс и способствует восстановлению перфузии, ослаблению воспаления [94]. 41 Как уже отмечалось выше, перспективно введение наночастиц, содержащих NO [103, 115]. Наночастицы использовали для повышения выживаемости животных после опасных для жизни кровопотерь [211]. Они, повышая уровень оксида азота в организме, расслабляли кровеносные сосуды, регулировали АД, помогали поддерживать циркуляцию крови и защитить жизненно важные органы. Таким образом, сохранялась стабильность сердечной сосудистой периферии во время шока и повышалась жизнеспособность тканей, снижались осложнения. При геморрагическом шоке нарушается синтез обеих синтаз – iNOS и eNOS. Избыточная продукция индуцибельной синтазы оксида азота – важное звено в патогенезе острой недостаточности кровообращения при геморрагическом и кардиогенном шоке [120, 165]. Острая гипотония является результатом чрезмерного образования оксида азота. В экспериментах на различных видах животных (собаки, кролики, крысы) было продемонстрировано усиление генерации NO при геморрагическом шоке. Чрезмерное образование NO в течение кровопотери может привести к повреждению органов и сосудов - гипореактивности вазоконстрикторов, что способствует низкой выживаемости во время тяжелого ГШ [35]. Рядом авторов предприняты попытки объяснить механизм нарушений, вызванных увеличением содержания NO при шоке [244, 248]. Избыточное формирование NO, обусловленное экспрессией iNOS, способствует образованию пероксинитрита и ведет к дисфункции ряда органов и тканей [162]. Согласно современным представлениям, избыточная продукция пероксинитрита вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, нарушает сосудистый эндотелий, ведет к агрегации тромбоцитов [214, 237], образованию нитрозотиолов, ингибированию рибонуклеотидредуктазы, которая регулирует скорость репликации ДНК [113]. Токсические эффекты пероксинитрита наиболее выражены в условиях ацидоза и в ишемизированных тканях [218, 238]. NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, что приводит к активации ряда механизмов, в частности стимуляции фермента 42 поли(АДФ-рибозо)пролимеразы (PARP) [193, 236, 238], что еще больше снижает уровень АТФ и приводит к клеточной гибели [142] (рис.2). Геморрагический шок Провоспалительные цитокины, хемокины iNOS Ингибиторы: 3аминобензамин, 5-йод -6 – амино- 1 , 2 -бензопирон Пероксинитрит Активация воспаления Поражение ДНК Активация ПАРП Активация провоспалительной сигнальной трансдукции (поли-АДФрибозополимераза) Клеточная дисфункция, некроз Рисунок 2. – Схема механизмов клеточного повреждения и дисфункций, связанных с формированием пероксинитрита при геморрагическом шоке [238]. Фармакологическое ингибирование PARP при состояниях, связанных с повышенным образованием оксида азота [173], считается перспективным. В течение последних двух десятилетий разрабатывались и проходят клинические испытания в качестве цитопротекторных средств и вспомогательных противоопухолевых терапевтических ингибиторов многие фармакологические ингибиторы PARP [108, 158]. Активными ингибиторами PARP неожиданно оказались некоторые антибиотики тетрациклинового ряда [158]. Трудно найти грань, определяющую цитозащитную и цитотоксическую роль NO. Условия, при которых NO меняет свои вазопротекторные свойства на токсические могут зависеть от ряда соединений, реагирующих с NO (супероксид, металлы с переменной валентностью). 43 Авторы [127] отмечали, что выработка индуцибельной синтазы оксида азота – это ответ на травму. Иммунофлюоресцентным методом было показано, что в течение ГШ активность iNOS значительно увеличивается в печени и в гепатоцитах центродолевого региона [127]. Доказано, что воспалительные стимулы могут индуцировать синтез iNOS и активировать ее во многих клетках, включая эндотелиальные и гладкомышечные клетки человека и животных [25, 30, 220]. Декомпенсированный геморрагический шок, возникающий при сужении сосудов под действием эндогенных вазоконстрикторов, катехоламинов и эндотелина, устраняется ингибиторами синтеза оксида азота [17, 234, 260]. Действие таких препаратов повышает АД и снижает количество вводимых вазоконстрикторов, необходимых для устранения артериальной гипотензии [12, 111, 255]. Поскольку все три изоформы NOS вовлечены в различные патологические процессы, то возникает потребность в различных ингибиторах, блокирующих избыточную продукцию оксида азота [69, 134, 224]. В качестве ингибиторов чаще всего выступают производные аргинина и родственные им соединения [33, 62]. Существуют избирательные ингибиторы, которые ингибируют в большей степени iNOS и неизбирательные, которые действуют и на eNOS [33]. Ингибирование iNOS при хронической почечной недостаточности полностью нормализует параметры свертывающей системы крови [255]. Первые исследования с ингибиторами синтаз дали большую надежду в отношении лечения гипотензии при геморрагическом шоке. В первоначальных работах были использованы неселективные блокаторы, способные значительно угнетать синтез NO [35, 71]. Однако даже самые ранние работы уже свидетельствовали об опасности чрезмерного угнетения активности NO-синтаз. Установлено, что инфузия L-NAME при геморрагическом шоке у крыс восстанавливает артериальное давление и сердечный ритм в сравнении с контрольной группой, в которой не вводили ингибитор [99]. При изучении различных доз L-NАМЕ на функцию сердечно-сосудистой системы и ряд 44 биохимических параметров во время раннего постгеморрагического периода у кроликов [93, 244] было выявлено, что подъем АД был гораздо более выражен при большей дозе ингибитора. Вероятно, ингибирование eNOS приводило к острым кардиоваскулярным метаболическим нарушениям во время шока. Показано [35], что неселективные ингибиторы NОS оказывают неблагоприятное действие и на кровоток в органах. В экспериментах на крысах исследована роль NO в регуляции печеночного кровотока в восстановительном периоде после ГШ [215]. Введение L-NАМЕ во время восстановительного периода вызывало увеличение ОПС, ухудшало микроциркуляцию, препятствуя тем самым нормализации печеночного кровотока [215], что свидетельствует о необходимости генерации NO при геморрагическом шоке для улучшения микроциркуляции и тканевой перфузии [29]. При инфузии неизбирательного ингибитора и блокаде синтеза NO производными L-аргинина (NG-монометил-L-аргинин, Nw-нитро-L-аргинин) нарушается баланс между сосудорасширяющими и сосудосуживающими факторами, а также нормальный контроль эндотелия над тонусом гладкомышечной ткани сосудистой стенки, что, в свою очередь, проявляется вазоконстрикцией и стойким увеличением артериального давления [35, 95]. Все эти нежелательные эффекты опосредованы чрезмерной выработкой NO, при которой проявляется цитотоксический эффект оксида азота. При внутривенном введении неселективного ингибитора Nw-нитро-L-аргинина наблюдалось достоверное снижение скорости кровотока в различных сосудистых областях, наиболее выраженное в печени - в органе с наименьшей скоростью исходного кровотока [71]. Попыткой ослабить резкое вазоконстрикторное действие неизбирательных ингибиторов синтеза NО при геморрагическом шоке является исследование [185], в котором изучали действие доноров NО и ингибиторов NО-синтазы в сочетании с инфузией 7,5% (гипертонического) раствора натрия хлорида при ГШ у собак. Введение ингибитора без солевого раствора вызывало значительное и длительное повышение АД. Было показано, что введение 45 солевого раствора предупреждает резкое и стойкое повышение АД, вызываемое ингибитором синтазы NО [185]. Вероятно, неселективное ингибирование синтаз усиливает органные повреждения при шоке. Однако при избыточной продукции NO селективное ингибирование iNOS может быть полезным для преодоления недостаточности кровообращения и поражения тканей [12, 13]. Низкий уровень селективности ограничивает возможность применения ингибиторов NO-синтаз in vivo [21, 33]. Ряд работ [72, 90, 91] посвящен исследованию действия селективных ингибиторов при шоке. Одним из первых соединений из производных гуанидина, для которого была выявлена селективность в отношении ингибирования iNOS [110, 234], являлся аминогуанидин. Благодаря введению аминогуанидина и L-NAME при ГШ наблюдалось снижение повреждения тканей и отмечалось повышение выживаемости более 72 часов [210]. Инфузия селективного ингибитора аминогуанидина в сочетании с ангиотензином II снижало действие NО при ГШ [209], вызывая улучшение функции сердечнососудистой системы и увеличивая выживаемость экспериментальных животных. При введении селективного ингибитора iNOS L-(иминоэтил)-L-лизина (LNIL) установлено, что iNOS вносит вклад в индуцированную ГШ экспрессию цитокинов – IL-6 и G-CSF в легких и печени [86, 91, 92]. Ингибирование iNOS L-NIL предупреждало отек легких [220]. Другие исследователи [203] полагают, что избыточная продукция NО при геморрагическом шоке вызывает поражение печени, которое заметно уменьшается при введении низкой дозы L-NIL (50 мкг/кг), что необходимо при введении учитывать. Введение высокой дозы ингибитора (150 мкг/кг) не защищает печень от повреждения [203]. Показано [80, 183], что в результате гиповолемии, вызванной кровопотерей, повышается активность iNOS в легочной ткани. Введение ингибитора L-NIL приводит к увеличению АД и МОК, которое более выражено, если кроме ингибитора iNOS вводят норадреналин. 46 Фармакологическое ингибирование L-NIL-(производных лизина) или инактивация iNOS, включается в регуляцию функции гладких мышц кишечника [166] и приводит к уменьшению NO в легких и печени [91, 224]. Ингибирование iNOS приводит не только к восстановлению функции кишечника, но также существенно снижает индуцированные шоком его морфологические повреждения. Следовательно, применение селективных ингибиторов благоприятно и способствует уменьшению повреждений почек, печени, легких, кишечника [141, 166]. Однако существует мнение, что селективные ингибиторы iNOS, в частности, 2-аминоэтилизотиол может нарушать печеночный кровоток либо усиливая, либо уменьшая органное кровообращение и функцию печени в зависимости от экспериментальной модели [13, 252]. Кроме того, iNOSингибиторы могут вызывать дополнительное фармакологическое действие, не связанное с ингибицией iNOS. Так, S-метилизотиол обладает антиоксидантным действием, в то время как аминогуанидин ингибирует каталазную активность [33]. Применение ингибиторов на сегодняшний день имеет серьезные ограничения [177]. Ни один из существующих ингибиторов NO-синтазы не обладает достаточной избирательностью и даже высокоселективные ингибиторы iNОS в больших дозах могут потенциально интерферировать с активностью еNОS. Проблемы с избирательностью изоформ NОS и с дозировкой ингибиторов осложняют их терапевтическое применение при геморрагическом шоке [203, 234]. Предпочтительным является использование ингибиторов, более селективных в отношении iNOS, что препятствует повреждениям, развивающимся при шоке. Удаление избытка NО, генерируемого iNOS, и в то же время сохранение так называемого ″базального″ уровня NО может оказывать благоприятное влияние на исход тяжелого ГШ. Однако поддержание активности одновременное предупреждение представляется трудной еNОS, или задачей являющейся ингибирование терапевтического защитной, активации и iNОS манипулирования 47 активностью синтаз и регуляции синтеза NO при кровопотере. По мнению ряда авторов, важно лишь снижать, но не ингибировать полностью активность iNOS, так как ″остаточный″ NО, продуцируемый iNOS, может выполнять защитные функции [120]. Тем не менее, селективное ингибирование, хотя и не используется пока в клинике, остается привлекательной областью исследований. Анализ приведенных литературных данных показывает, что, несмотря на большое число исследований, посвященных патогенетической роли оксида азота, пока не удалось определить все "точки приложения" NО. Многие свойства оксида азота продолжают изучаться фармакологами, медиками различных специальностей. Говоря о значении NO при ГШ, трудно найти ту грань, которая определяет цитозащитную и цитотоксическую роль NO. Снижение активности эндотелиальной конститутивной синтазы приводит к нарастанию эндогенной недостаточности NO, ухудшению коронарной гемодинамики и кровотока в венозном русле [35, 211], а избыточное количество может привести к ишемии органов и ткани. С другой стороны, не надо забывать, что NO улучшает микроциркуляцию и тканевую перфузию и поэтому полностью подавлять продукцию оксида азота нельзя. Кроме того, на сегодняшний день практически нет сведений о влиянии регуляторов синтеза оксида азота, применяемых вместе с инфузионными средами, восполняющими кровопотерю при геморрагическом шоке. Таким образом, проблема повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока актуальна и по сей день. Представляется перспективным исследование роли оксида азота как одного из потенциальных регуляторов cосудистого тонуса при инфузионной терапии ГШ. Есть основание полагать, что направленное воздействие на метаболизм оксида азота с помощью доноров NO и ингибиторов NO-синтаз позволит расширить возможности инфузионной терапии ГШ и явится новым подходом в лечении нарушений кровообращения при шоке. 48 1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1 Общая характеристика материала исследования Исследования выполнены на 123 белых крысах обоего пола массой 170230 г. Эксперименты согласованы с этическим комитетом ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России и проведены в соответствии с требованиями Женевской Конвенции International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (Geneva, 1990). Во время опыта животные находились под тиопенталовым наркозом. Прежде всего, необходимо было выбрать модель шока, при котором происходят наиболее выраженные изменения содержания NO в тканях крыс. Далее, именно на этой модели, планировалось изучить возможность повышения эффективности инфузионной терапии шока с помощью веществ, влияющих на эндотелийзависимую регуляцию сосудистого тонуса. Ожоговый шок моделировали нанесением на область спины и боковых поверхностей туловища нагретой до 200-240° С латунной пластинкой. На момент нанесения травмы животных фиксировали на станке. Крысам внутрибрюшинно вводили 1% раствор тиопентала натрия из расчета 0,08 мл/100 г массы тела (35-40 мг/кг). Площадь ожога с поражением всей толщи кожи составляла 20-25 % от общей поверхности тела. По истечении сроков наблюдения – через 4 и 24 ч животных декапитировали. Органы (печень, почки, селезенка) для определения содержания NO извлекали через 4 и 24 ч после термической травмы. Ткани органов измельчали, замораживали в пресс-форме и помещали в сосуд Дюара с жидким азотом (-196°С), где они хранились до момента определения содержания NO . Травматический шок моделировали сдавливанием обоих бедер крыс с помощью миниатюрных тисков с винтовым зажимом в течение 4-х часов. Пробы тканей органов для исследований забирали через 3-6 и 18 ч после окончания четырехчасового сдавливания. При моделировании геморрагического шока препарировали левую сонную артерию, которую брали на лигатуры. Для регистрации 49 физиологических параметров и взятия проб крови ее катетеризировали полиэтиленовым катетером. Через катетер сонной артерии вводили раствор гепарина из расчета 0,07 мл/100 г массы тела. Измеряли исходное артериальное давление в артерии, после чего начинали эксфузию крови. АД измеряли дискретно через каждые 2,5-5 мин в течение всего периода наблюдения за животным. Кровопотерю проводили, снижая АД до 4,7-5,3 кПа (35-40 мм рт.ст.), которое поддерживали на этом уровне в течение 20-25 минут и заканчивали при стойком снижении АД до 40 мм рт.ст. Для дальнейшего анализа брали ткани, печени, селезенки и почки. Контролем служили здоровые животные, в печени, почках, селезенке которых также определяли содержание NO. Для прямого количественного определения содержания NO вводили “ловушку”. Компоненты “ловушки” были введены за 30 мин до декапитации – внутрибрюшинно раствор Na-ДЭТК (диэтилдитиокарбамат) (С5Н10NS2Na, 500 мг/2,5 мл H2O/кг) и в бедро подкожно раствор FeSO4 + цитрат Na (20 мг + 95 мг/2,5 мл H2O/кг). 1.2 Методы исследования 1.2.1 Определение содержания оксида азота в тканях крыс Количественное измерение содержания NO в тканях проводили в лаборатории физико-химических полимеров Института химической физики ФАНО (Москва) методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). Спектры ЭПР регистрировали при 77К на модифицированном радиоспектрометре ЭПР – Радиопан (Польша) в Х-диапазоне. Гаммарезонансные спектры электродинамического снимали типа с на ГР- спектрометре равноускоренным ИХФ движением РАН -квантов. Количественную оценку выработанного в тканях крыс NO проводили по включению его в парамагнитные мононитрозильные комплексы ДЭТК-Fe2+. “Ловушка” способна накапливаться в тканях и связывать как свободный NO, так и перехватывать его с эндогенных нитрозильных комплексов. В отличие от эндогенных комплексов NO, комплекс «ловушка-NO» стабилен в биологической среде при действии кислорода и других окислителей. Поэтому 50 интенсивность соответствующего сигнала ЭПР отражает интенсивность синтеза NO в тканях. Эти комплексы характеризуются сигналами электронного парамагнитного резонанса с положением g1=2,035; gII=2,012 и сверхтонкой триплетной структурой при g1=2,035. Содержание NO в тканях выражали в условных единицах. Одна условная единица соответствует 3,3-м нанограммам окиси азота на 1 г влажной ткани. 1.2.2 Исследование системной гемодинамики и микроциркуляции Для оценки состояния кровообращения [37] в исходном периоде, через 30 минут гипотензии (перед инфузией), через 10 мин, 1ч после инфузии кровезаменителя регистрировали показатели и производили забор проб крови. Перечень регистрируемых в экспериментах показателей представлен в таблицах 1-3. Таблица 1 Показатели системной гемодинамики, их условные обозначения, единицы измерения №№ Показатели п/п 1. Артериальное давление в сонной артерии Условные Единицы Методы определения, обозначения измерения приборы АД кПа (мм рт.ст.) Ртутный манометр Метод тетраполярной 2. Ударный объем сердца УО мл/кг реографии Реограф РПГ 2-02, электрокардиограф ЭКЗЧ-01* 3. Частота сердечных сокращений 4. ЧСС Минутный объем кровообращения удмин-1 По электрокардиограмме мл/мин МОК 100 г МОК= УО ЧСС массы 5. Общее периферическое сопротивление 6. Рабочий индекс левого желудочка ОПС РИЛЖ динссм-5/ ОПС= АД/МОК 1332 кг массы 60 10-4 кГм РИЛЖ= АД МОК 0,0135 51 Для определения ударного объема сердца методом тетраполярной реографии в ходе выполнения данной работы был создан комплекс, состоящий из реографа РПГ 2-02, электрокардиографа ЭКЗЧ-01. * — Оценка микроциркуляции. Микроциркуляцию исследовали методом прижизненной контактной микроскопии в отраженном свете в стенке тонкой кишки крыс, в ее серозной оболочке. По состоянию микрогемодинамики серозной оболочки тонкой кишки в определенной степени можно судить и о микроциркуляции во всем организме. Кроме того, тонкий кишечник является удобным объектом для исследования, так как его обнажение не связано со значительной травматизацией животного. Извлекали петлю тонкой кишки, помещали на марлевую салфетку, которую орошали раствором 0,9% натрия хлорида. Для оценки нарушений во всей микроциркуляторной единице в лаборатории была разработана шкала [38] (таблица 2). О состоянии микроциркуляции в стенке тонкого кишечника судили по количеству функционирующих капилляров, замедлению скорости кровотока и по агрегации эритроцитов, оцениваемым по балльной системе. За ноль принимали исходное состояние кровотока. Таблица 2Шкала оценки нарушений микроциркуляции в стенке тонкого кишечника крыс Показатели Количество функционирующих капилляров (в мм2) Внутрисосудистые изменения Замедление скорости и состояние кровотока в микрососудах Агрегация эритроцитов Характеристика Оценка Увеличение или уменьшение их числа % к исходн. Ток крови сплошной, отдельные эритроциты неразличимы Отдельные эритроциты различимы с трудом Отдельные эритроциты ясно различимы Прерывистость кровотока Стаз Отсутствует Единичные агрегаты, свободно проходящие по капиллярам Множественные агрегаты, свободно проходящие по капиллярам Агрегаты забивают просвет капилляров в баллах 0 1 2 3 4 0 1 2 3 52 1.2.3 Определение напряжения газов крови и кислотно-основного состояния в крови крыс Содержание газов в крови и показатели кислотно-основного состояния организма определяли на газоанализаторе ABL500 (Radiometer, Дания) (таблица 3). Таблица 3 Показатели газового состава крови и кислотно-основного состояния артериальной крови крыс, их условные обозначения, единицы измерения №№ Показатели п/п 1. 2. 3. 4. Условные Единицы обозначения измерения РаО2 мм рт. ст. РаСО2 мм рт. ст. рН Н+ ВЕ ммоль/л Напряжение кислорода в артериальной крови Напряжение углекислого газа в артериальной крови Концентрация ионов водорода в артериальной крови Дефицит буферных оснований 1.2.4 Статистическая обработка результатов исследований. При оценке полученных данных для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибка среднего или медиана [59]. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин осуществляли оценкой по критерию Стьюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. С помощью рангового критерия Манна-Уитни оценивали статистическую значимость различий независимых выборок. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при значении р≤0,05. 53 Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики в программе Statistica 7.0. 1.3 Структура работы. Основой работы явились данные, полученные на 123 белых крысах. По структуре работа состоит из трех разделов. В первом разделе приведены данные по определению содержания оксида азота в тканях здоровых крыс и при различных видах шока (38 экспериментов, табл. 4). Таблица 4 Опыты с определением содержания оксида азота в тканях здоровых крыс и при различных видах шока Контроль Здоровые Вид травмы Количество крыс - 9 животные - - Время введения Fe2+-ДЭТК За 30 мин до Сроки взятия тканей, ч после введения ”ловушки” 0,5 после травмы - взятия тканей Ожоговый шок 4 За 30 мин до 7 взятия тканей 24 Травматический 5 За 30 мин до 3-6 шок (сдавливание 7 взятия тканей 0,5 4 0,5 18 1,5 0,5 мягких тканей) - Геморрагический шок 6 5 мин до кровопотери В дальнейших исследованиях, в 1 и 2 сериях содержание оксида азота в тканях сопоставляли с изменениями АД (таблица 5). Следующий раздел (3-5 серии) посвящен изучению возможности влияния регуляторов синтеза оксида азота, вводимых без инфузионных сред, на течение геморрагического шока (таблица 5). В третьем разделе регуляторы синтеза оксида азота (донор и селективные ингибиторы) применяли при инфузионной терапии геморрагического шока. Общее количество взятой крови в этих экспериментах составляло – 3,1 0,15 54 мл/100 г массы животного. Во всех опытах в качестве инфузионной среды применяли изотонический раствор натрия хлорида (ФР) в объеме, в два раза превышающем объем кровопотери. Через трехходовый кран внутриартериально проводили инфузию раствора со скоростью 0,08 мл/мин с помощью перфузионного насоса. В 6-й серии изучали влияние изотонического раствора натрия хлорида на течение геморрагического шока (контроль). В 7-й – 12-й сериях инфузионная терапия проводилась в сочетании с регуляторами синтеза оксида азота. В 7-й и 8-й серии применяли L-аргинин. В 9 –12 сериях, через 10 мин после начала лечения в инфузионный раствор вводили селективные ингибиторы синтеза NO, растворенные в 1,0 мл изотонического раствора натрия хлорида и далее продолжали инфузионную терапию. В качестве регуляторов синтеза оксида азота применяли: 1. Неселективный (неизбирательный) ингибитор синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинин (ICN Biomedicals Inc.) – в 4 серии. 2. Донор NO L-аргинин моногидрохлорид (Merk) – 5,7,8 серии. 3. Селективные (избирательные) ингибиторы синтеза оксида азота – N6(1-иминоэтил)-L-лизин гидрохлорид (L-NIL) (ICN Biomedicals Inc.), N5-(1иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорид (L-NIО), аминогуанидин и S- метилизотиол – 9-12 серии. Перечень серий экспериментов с указанием дозы кровезаменителя, используемых регуляторов синтеза оксида азота, их доз и сроков введения представлен в таблице 5. 55 Таблица 5 Характеристика серий опытов Регуляторы синтеза оксида азота Доза № Кровеза- крове- серии менитель заме- Ингибиторы NО Донор NО e NOS нителя L-аргинин NнитроLаpгинин iNOS Амино L-NIL L-NIО -гуанидин Sметилизотио -мочевина Количество живот -ных 1. Определение содержания оксида азота в тканях здоровых крыс 9 2. Определение содержания оксида азота в тканях крыс при ГШ 6 3. ФР 1,0 мл – – – – – –– 6 250 мг/кг до кровопо тери – – – – – 8 – – – –– 6 контроль 4. ФР 1,0 мл – 5. ФР 1,0 мл 300 мг/кг до кровопотери 6. ФР 1:2 – – – – – –– 16 1:2 150 мг/кг за – – – – –– 10 контроль 7. ФР 20 мин до начала кровопотери – – – – –– 7 1:2 150 мг/кг после окончания кровопотери в составе ФР – –– – – – 9 ФР 1:2 – – 50 мг/кг – – – 7 11. ФР 1:2 – – – 50 мг/кг – – 6 12. ФР 1:2 – – – – 150 мг/кг – 2 мг/кг 9 8. ФР 1:2 9. ФР 10. 56 Состояние животных оценивали до кровопотери, перед инфузией и через 10 и 60 мин после инфузии. По окончании эксперимента катетеры из сосуда удаляли, операционные раны зашивали, животных помещали в виварий для наблюдения в течение 24 часов. В эксперименте принято считать выжившими животных, которые прожили более суток (24-х часов). Эвтаназию осуществляли тиопенталом натрия в дозе 0,1 г/кг массы тела животного. 2 СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ ШОКА 2.1 СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ ЗДОРОВЫХ КРЫС Этот раздел исследований выполнен совместно с сотрудниками лаборатории физико-химических биополимеров Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН (г. Москва). Как показали эксперименты, cодержание NO в тканях крыс неодинаково (табл. 6). В контроле (здоровые животные) наибольшее содержание NO выявлено в ткани селезенки, самое низкое – в почках – в 17 раз меньше, чем в печени. По степени образования оксида азота печень занимает промежуточное положение между селезенкой и почками. Однако содержание NO в печени и селезенке не имеет статистически значимых различий. Полученные результаты совпадают с данными литературы, согласно которым, в здоровых почках продуцируется в 10-15 раз меньше NO, чем в печени [30,31,71]. Таблица 6 Содержание оксида азота в тканях здоровых крыс, n=9 Содержание NO в тканях (условные единицы), Mm печень почки селезенка 3,40,4 0,20,1 5,60,8 57 2.2 СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ОЖОГОВОМ ШОКЕ В ранние сроки после нанесения ожоговой травмы (через 4 часа) оксид азота в почках и селезенке животных не выявляется (таблица 7), а в печени содержание его было таким же, как в контрольной серии. Во всех исследуемых тканях животных через сутки после термической травмы оксид азота образуется в большем количестве по сравнению со здоровыми крысами, и также по сравнению с 4-мя часами после ожога (таблица 7). Наиболее выражены и статистически значимы эти различия в печени. Таблица 7 Содержание оксида азота в тканях здоровых и обожженных крыс через 4 ч и 24 ч после ожога Вид эксперимента Содержание оксида азота в тканях (усл. ед.), n Mm печень почки селезенка здоровые 9 3,40,6 0,20,1 5,60,8 4 ч после ожога 4 1,80,9 0 0 24 ч после 7 10,00* 2,20,5* 10,62,3 ожога Примечание: в этой и последующих таблицах статистически значимые различия (р 0.05) отмечены знаком – *. Нужно отметить, что только через 24 ч после ожога выявлено статистически значимое увеличение содержания оксида азота в почках и в печени по сравнению со здоровыми крысами (таблица 7). В селезенке отмечена лишь тенденция к его росту. Таким образом, в ранние сроки после ожога в исследуемых тканях крыс (печень, почки, селезенка) не выявлено увеличения синтеза оксида азота по сравнению со здоровыми животными и только через сутки после нанесения термической травмы происходит нарастание содержания оксида азота. Как и у 58 здоровых крыс, так и у обожженных, оксида азота в тканях печени и селезенки содержится значительно больше, чем в почках. 2.3 ОКСИД АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКОМ ШОКЕ В ранние сроки (3-6 ч) после сдавливания мягких тканей обоих бедер (травматический шок) содержание оксида азота в исследуемых тканях крыс несколько возрастало по сравнению со здоровыми животными (таблица 8), но эти различия не были достоверными. Увеличение содержания оксида азота по сравнению с контролем во всех тканях было выявлено лишь через 18 ч после травмы. Статистически значимо увеличение NO в печени (таблица 8). Таблица 8 Содержание оксида азота в тканях в контроле и через 3-6 и 18 часов после сдавливания мягких тканей. Вид эксперимента здоровые через 3-6 ч после сдавливания через 18 ч после сдавливания Содержание оксида азота в тканях (усл. ед.), Mm n печень почки селезенка 9 3,40,4 0,20,1 5,60,8 5 4,00,5 1,20,4 10,03,6 7 10,81,9* 2,60,9 10,01,6 Таким образом, при сдавливании мягких тканей, как и при ожоговом шоке, в ранние сроки после травмы не выявлено статистически значимых различий скоростей синтеза оксида азота в печени, почках, селезенке по сравнению с контролем. В более поздние сроки (через 18 ч после сдавливания тканей) происходит увеличение содержания оксида азота во всех исследуемых 59 тканях, и оно более выражено по сравнению с 3-6 часами после травмы. Обращает на себя внимание высокая интенсивность образования оксида азота в ткани селезенки во всех сериях экспериментов с травматическим шоком. 2.4 СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ШОКЕ Геморрагический артериального давления, шок характеризующийся нарушениями центральной низким уровнем гемодинамики и микрокровотока, сопровождается образованием значительного количества оксида азота в тканях печени и почек (2 серия, табл. 9), достоверно отличающимся от содержания оксида азота в тканях здоровых животных (1 серия). Как видно из таблицы 10, содержание NO к концу кровопотери в печени было в 10 раз, а в почках – в 15 раз выше, чем в контроле. Количество оксида азота в тканях селезенки было практически таким же, как в контрольных опытах. Таблица 9 Содержание оксида азота в тканях здоровых крыс и при геморрагическом шоке Содержание оксида азота в тканях (усл. ед.), Серии опытов 1 n 9 здоровые 2 геморрагический шок 6 Mm печень почки селезенка 3,40,4 0,20,1 5,60,8 36,25,6* 3,30,1* 5,32,2 Примечание: статистически значимые различия (р 0,05) между 1 и 2 сериями отмечены знаком – *. Во 2-й серии экспериментов к окончанию кровопотери, помимо определения содержания оксида азота в тканях, измеряли АД. Как и в описанных выше опытах, при геморрагическом шоке наибольшее содержание оксида азота выявлено в печени. При сопоставлении АД и содержания оксида 60 азота в ткани печени оказалось, что чем выше АД, тем меньше оксида азота в печени и наоборот, низкому АД соответствовало высокое содержание оксида азота (рисунок 3). Поскольку при тяжелой кровопотере отмечено усиление генерации NO в исследуемых тканях, вероятно, у животных активно функционирует NOсинтаза. Причем, в ткани печени NO синтезируется более интенсивно, чем в ткани почек и селезенки. Скорее всего, повышение NO в тканях печени обеспечивает достаточность кровотока в ней при ГШ. Роль NO в регуляции АД при геморрагическом шоке подтверждается данными о высоком содержании NO в печени крыс с относительно небольшим АД и низким содержанием NO при высоком АД. Возможно, такие характерные для шока нарушения, как снижение тонуса сосудов, падение давления обусловлены, в определенной мере, и образованием избыточного количества NO, являющегося регулятором сосудистого тонуса. Таким образом, именно на модели геморрагического шока выявлены выраженные изменения NO в тканях. АД NO 150 120 90 60 30 0 NO АД Рисунок 3– АД (мм рт.ст.) в сонной артерии и содержание оксида азота (усл.ед.) в печени белых крыс после массивной кровопотери 61 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В соответствии с задачами этого раздела работы было изучено изменение эндогенной продукции оксида азота в тканях крыс при различных видах шока (ожоговом, геморрагическом, травматическом) в сравнении со здоровыми животными. Из представленных материалов видно, что содержание оксида азота в тканях здоровых крыс неодинаково (таблица 10). Так, в селезенке его больше, чем в почках. Промежуточное положение занимает печень. По сравнению с печенью в почках оксида азота содержится в 17 раз меньше, что соответствует данным литературы, согласно которым, в здоровых почках млекопитающих продуцируется оксида азота в 10-15 раз меньше, чем в печени [111]. Как показывают полученные результаты, при всех моделируемых видах шока происходит усиление генерации оксида азота в исследуемых органах животных (таблица 10). Однако содержание его в значительной мере зависит от длительности патологического процесса. В ранние периоды ожогового шока уровень оксида азота в тканях низкий (таблица 7), при сдавливании мягких тканей такой же, как у здоровых животных (таблица 8), что объясняется, скорее всего, низкой активностью iNOS. Нарастание его синтеза происходит лишь через сутки после ожога и через 18 часов после сдавливания мягких тканей. Таблица 10 Содержание оксида азота в тканях здоровых крыс и у крыс при различных видах шока Вид эксперимента Здоровые животные (контроль), n=9 Ожоговый шок (24 ч после травмы), n=7 Травматический шок (18 ч после травмы), n=7 Геморрагический шок, n=6 Содержание оксида азота в тканях (усл. ед.), Mm печень почки селезенка 3,40,4 0,20,1 5,60,8 10,00* 2,20,5* 10,62,3 10,81,9* 2,60,9 10,01,6 36,25,6* 3,30,1* 5,32,2 62 При геморрагическом шоке, характеризующимся низким давлением и другими выраженными гемодинамическими нарушениями, наблюдалось значительное образование NO в тканях печени и почек. Как видно из таблиц 9 и 10, выявлена значительно более интенсивная генерация оксида азота у животных при геморрагическом шоке в ткани печени, по сравнению с животными после ожоговой травмы или сдавливания тканей, что свидетельствует о том, что в печени при тяжелой кровопотере активнее функционирует NO-синтаза. Также высоким было содержание оксида азота в почках (достоверно выше, чем в контроле). Результаты по содержанию оксида азота в тканях, а также данные о зависимости между содержанием NO и артериальным давлением послужили обоснованием для изучения возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока с использованием методов эндотелийзависимой регуляции сосудистого тонуса. 3 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА НА ТЕЧЕНИЕ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА У КРЫС Опыты в 3-5 сериях были направлены на выяснение роли регуляторов синтеза оксида азота, вводимых без инфузионной среды, воздействия их на сосудистый тонус при геморрагическом шоке. Были поставлены 3 серии экспериментов (с 3,4,5). Неизбирательный ингибитор NO-синтаз N-нитро-Lаргинин (4 серия, 250 мг/кг) и донор NO L-аргинин (5 серия, 300 мг/кг) вводили до начала кровопотери внутрибрюшинно в 1,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. В 3-й серии, служившей контролем к 4-й и 5-й, животным перед началом кровопотери вводили внутрибрюшинно 1,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. Во всех сериях опытов ГШ вызывали кровопусканием, которое прекращали при наступлении выраженных нарушений микроциркуляции: прерывистость кровотока, агрегация форменных элементов крови, спазм большинства капилляров и стаз в части из них. В контроле резкие нарушения МЦ наступали через 363 мин от начала кровопотери (при объеме кровопотери 63 3,20,1 мл/100 г массы). АД в этот момент составляло 536 мм рт.ст. (табл. 11). У животных 4-й серии (неселективный ингибитор NO) выраженные нарушения МЦ возникали в два раза быстрее — уже через 183 мин от начала кровопотери при сохраняющемся высоком АД (1267 мм рт.ст. в исходном состоянии, 1277 мм рт.ст. к концу кровопотери). Приэтом, объем кровопотери, вызывающий те же нарушения МЦ, что и в 3-й серии, составлял 2,40,2 мл/100 г массы, т.е. был существенно меньше, чем в контроле. У животных 5-й серии при введении продуцента NO нарушения МЦ наступали значительно позднее (через 708 мин) и для этого требовался значительно больший, чем в контроле объем кровопотери (4,20,2 мл/100 г массы). При этом гипотензия была такой же, как в контроле: АД 6010 мм рт.ст. (при исходном АД 1315 мм рт.ст.) (табл. 11). Животные в 5-й серии опытов, судя по продолжительности жизни, оказались более устойчивы к кровопотере. Таблица 11Объем кровопотери, артериальное давление, время наступления нарушений микроциркуляции при введении регуляторов синтеза оксида азота до начала кровопотери. Cерии опытов Объем кровопотери (мл/100 г массы) Время наступления выраженных нарушений МЦ после начала кровопотери (мин.) 3 Контроль 3,20,1 363 (n=6) 4 Ингибитор NO, 2,40,2 183* (n=8) 5 4,20,2*+ 708*+ Донор NО, (n=4) Примечание: статистически значимые различия (р АД, мм рт.ст. Продолжительность жизни крыс (мин) Исходное К моменту выраженных нарушений МЦ 1414 536 658 1267 1277* 524 1315 6010*+ 8312 0,05) между 3 и 4 сериями отмечены знаком – *, между 4 и 5 сериями +. С изменениями гемодинамики и МЦ коррелировали и сдвиги кислотноосновного состоянии крови (табл. 12). У всех животных нарастали явления метаболического ацидоза, о чем свидетельствовали снижение рН и рост дефицита буферных оснований. 64 К моменту выраженных нарушений микроциркуляции во всех сериях опытов в равной степени возрастал дефицит буферных оснований, что свидетельствовало о развитии метаболического ацидоза (табл. 12). В 5-й серии при большем объеме кровопотери при введении донора оксида азота L- аргинина метаболические нарушения были менее выражены. В опытах 4-й и 5-й серий выявлены большие колебания рН и рО2 при введении регуляторов синтеза NO. В 4-й серии (ингибитор NO), к моменту выраженных нарушений микроциркуляции более низкому рН соответствовало более высокое напряжение кислорода в крови (рис. 4). Иными словами, чем значительнее был ацидоз, а, следовательно, кислородная недостаточность, тем большим было рО2 в артериальной крови, т.е. наблюдалась обратная зависимость. При более выраженном нарушении МЦ после введения ингибитора синтеза NO напряжение кислорода в артериальной крови сохранялось высоким, дыхательных мышц, что объясняется усилением их увеличением сократимости и, кровоснабжения следовательно, возрастанием легочной вентиляции [67, 190]. Таблица 12 Содержание кислорода и кислотно-основное состояние крови у крыс при введении различных регуляторов синтеза оксида азота, Мm Серии опытов Показатели Исходное состояние К моменту выраженных нарушений МЦ 3 Контроль n=4 РаО2 рH ВЕ 92,68,3 7,420,05 1,7 2,5 73,120,1 7,270,03* -13,12,2* 4 Ингибитор синтеза NO n=4 5 Донор NO n=4 РаО2 рH ВЕ 101,47,7 7,370,05 3,1 1,8 93,115,7 7,260,11 -11,23,6* РаО2 рH ВЕ 84,112,3 7,370,01 0,7 1,5 79,910,6 7,350,06 -11,43,3* Примечание: достоверность различий (р 0,05) между данными в исходном состоянии и к моменту выраженных нарушений микроциркуляции отмечена знаком – *. 65 120 pО2 pH 7,4 рО2 ,мм рт.ст. 100 80 7,3 рН 60 40 20 0 7,2 рО2, мм рт.ст. а Серия 3 – контроль 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pО2 pH 7,5 7,4 7,3 рН 7,2 7,1 7,0 б Серия 4 – ингибитор синтеза оксида азота рО, мм рт.ст. 120 pО2 pH 7,4 100 80 60 7,3 рН 40 20 0 7,2 в Серия 5 – донор оксида азота Рисунок 4. – Изменение напряжения кислорода и рН в артериальной крови у животных после массивной кровопотери к моменту выраженных нарушений микроциркуляции в контроле (серия 3), при предварительном введении ингибитора синтеза оксида азота NG-нитро-L-аргинина (серия 4) и донора оксида азота L-аргинина (серия 5). 66 В опытах 3-й серии (в контроле) наблюдалась тенденция к прямой зависимости между рH и рО 2 в крови, которая статистически недостоверна. В 5-й серии при введении донора NO, увеличивавшего образование NO в организме, в опытах с более низким рН отмечалось и более низкое рО 2 в крови, т.е. имелась прямая зависимость между этими показателями. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Таким образом, развитие ГШ характеризовалось гипотензией и выраженными нарушениями МЦ в стенке тонкого кишечника крыс (3 серия). Выявленное в этих опытах ограничение кровотока можно рассматривать как проявление централизации кровообращения, благодаря которой предупреждается значительное уменьшение кровотока в жизненно важных органах и тканях (головной мозг, сердце, легкие, частично печень, дыхательные мышцы). При ингибировании синтеза NO, высокое АД и нарушения МЦ (в 4-й серии опытов) свидетельствуют о выраженном спазме периферических сосудов, об усилении централизации кровообращения. Нарушения МЦ у этих животных наступают гораздо раньше, чем в контроле. чрезмерная централизация кровообращения, имеющая Наблюдаемая отрицательные последствия, сопровождалась значительными нарушениями метаболизма, отягощающими течение геморрагического шока. Уменьшение продукции NO, происходящее под влиянием неизбирательного ингибитора его синтеза, приводило к выраженным нарушениям микроциркуляции и к спазму периферических сосудов, вследствие чего наблюдалась более ранняя гибель животных, по сравнению с контрольными экспериментами. У животных, получавших донор NO до кровопотери, продолжительность жизни была больше, чем у тех, которым вводили ингибитор синтеза NO – 8312 и 524 мин соответственно. Контрольные животные жили 658 мин. Бóльшая устойчивость к кровопотере у животных 5-й серии опытов при введении донора NO свидетельствует о том, что гиперпродукция NO ограничивает нарушения 67 кровообращения, возникающие при развитии шока, уменьшая степень централизации кровообращения, возникающей в ответ на снижение объема циркулирующей крови. В этих условиях не повышается кровоток в дыхательных мышцах. С увеличением кислородной недостаточности (судя по ацидозу) насыщение кислородом артериальной крови не возрастало, а наоборот, снижалось. Можно предположить, что нормализация микроциркуляции происходит за счет вазодилатации, антиагрегатного и антикоагуляционного действия NO. Исходя из полученных данных можно заключить, что на ранних стадиях геморрагического шока продукция NO носит защитный характер, уменьшая развитие циркуляторной гипоксии тканей и их повреждение. Подавление этой реакции приводит к чрезмерной централизации кровообращения, которая может иметь отрицательные последствия для организма. Следовательно, оксид азота играет важную роль в регуляции кровообращения при геморрагическом шоке. Методами эндотелийзависимой регуляции сосудистого тонуса, вероятно, возможно повысить эффективность инфузионной терапии кровопотери и шока. Полученные данные послужили основанием для изучения влияния регуляторов синтеза оксида азота на течение геморрагического шока при их введении с инфузионной средой. 4 ВЛИЯНИЕ ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА L- АРГИНИНА НА ТЕЧЕНИЕ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА У КРЫС ПРИ ЕГО ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ В последние годы большое внимание уделяется поиску новых доноров NO, которые могли бы составить основу будущих лекарственных препаратов. Имеются основания полагать, что доноры NО могут повышать устойчивость организма к кровопотере [4]. Как показано в предыдущем разделе, при геморрагическом шоке необходимо поддерживать так называемый “базальный” уровень оксида азота, который обеспечивает нормальную перфузию жизненно важных органов. Этот уровень NO регулируется конститутивной синтазой 68 (еNOS), субстратом для которой в организме является L-аргинин. Поэтому в представленных далее исследованиях было изучено влияние донора оксида азота L-аргинина на течение ГШ у крыс при его инфузионной терапии. Поскольку донор оксида азота вводили с изотоническим раствором натрия хлорида, необходимо было изучить воздействие его инфузии на течение ГШ. 4.1 ВОЗДЕЙСТВИЕ ИНФУЗИИ ИЗОТОНИЧЕСКОГО РАСТВОРА НАТРИЯ ХЛОРИДА НА ТЕЧЕНИЕ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА У КРЫС (КОНТРОЛЬ) Кровопотеря у животных (6 серия) приводила к выраженному снижению АД – со 141±3 до 59±4 мм рт.ст. (таблица 13). Ухудшались и другие регистрируемые показатели – значительно падал МОК, УО, повышалось ОПС. РИЛЖ к концу кровопотери уменьшался более чем в 8 раз по сравнению с исходным значением (таблица 13). Таблица 13 – Системная гемодинамика у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида, М±m Показатели До После Серия кровопотери кровопотери Время после окончания инфузии, мин 10 60 АД 6 141±3 59±4+ 100±4+* 100±5+* МОК 6 15,5±0,2 4,4±0,2+ 12,8±0,9* 11,5±0,8+* УО 6 0,37±0,01 0,13±0,01+ ОПС 6 7,3±0,2 11,0±0,7+ 6,4±0,3* 7,3±0,5* РИЛЖ 6 296±6 36±3+ 179±18+* 162±17+* ЧСС 6 425±10 342±10+ 375±21 358±15 0,35±0,02* 0,32±0,02* Примечание: статистически значимые различия (р 0,05) здесь и в последующих таблицах отмечены по сравнению с исходными данными – +, по сравнению с окончанием кровопотери – *. 69 К концу кровопотери наблюдали ухудшение состояния микроциркуляции в тонком кишечнике крыс, замедлялась скорость кровотока, отмечалась агрегация эритроцитов, снижалось количество функционирующих капилляров (таблица 14). Таблица 14 – Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида, М±m До Показатели Серия кровопотери После кровопотери Время после окончания инфузии, мин 10 60 82±6* 98±8* КФК 6 100±0 52±4+ V 6 0±0 -3,54±0,08+ -1,00±0,25+* -1,17±0,18+* АЭ 6 0±0 2,54±0,08+ 1,15±0,17+* 1,33±0,09+* После кровопотери в артериальной крови крыс развивался метаболический ацидоз, о котором свидетельствовал выраженный дефицит буферных оснований и нарушался газовый состав крови (таблица 15). Таблица 15 – Газовый состав и кислотно-основное состояние артериальной крови у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида, M±m До После Время после окончания инфузии, мин 10 60 Показатели Серия РаО2 6 84,6±4,3 103,3±6,3 РаСО2 6 44,6±1,3 25,2±1,4+ 31,7±0,9+* 26,6±1,6+ рН 6 7,38±0,01 7,34±0,02 7,37±0,02 7,37±0,04 ВЕ 6 1,0±0,6 -11,4±0,7+ -6,5±0,9+* -7,8±1,6+ кровопотери кровопотери 94,1±3,0 96,0±4,6 70 Следовательно, введение изотонического раствора натрия хлорида проводили на фоне выраженных нарушений системной гемодинамики, микроциркуляции и метаболического ацидоза. Инфузия солевого раствора (6 серия – контрольная) вызвала повышение АД по сравнению с тем, которое отмечалось в конце кровопотери. Через 10 мин после окончания инфузионной терапии сниженное в результате кровопотери АД возрастало почти вдвое и оставалось на этих значениях через 60 мин после завершения инфузии (таблица 13), но исходного уровня не достигало. Улучшались и другие показатели системной гемодинамики: УО и МОК, сниженные к окончанию кровопотери в 3 раза, после инфузии солевого раствора значительно возрастали, не достигая, однако, исходных величин. Введение кровезаменителя способствовало достижению УО к концу наблюдения (1 час после инфузии) до исходных значений и нормализации ОПС. Однако РИЛЖ не восстанавливался (таблица 13), существенно уменьшенный после кровопотери, через час после инфузии составлял лишь 50% исходного уровня. КФК возвращалось к исходным значениям, но скорость кровотока полностью не нормализовалась. Количество агрегатов эритроцитов в капиллярах было значительным, хотя несколько и уменьшалось в результате инфузии солевого раствора (таблица 14). Не отмечалось существенных изменений в газовом составе крови (таблица 15). Оставалось сниженным напряжение углекислоты в крови, наблюдался выраженный дефицит буферных оснований. Инфузия солевого раствора способствовала некоторому уменьшению ацидоза, снижался дефицит буферных оснований, однако, к окончанию наблюдения он вновь возрастал. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Таким образом, инфузия изотонического раствора натрия хлорида после кровопотери способствовала некоторому улучшению системной гемодинамики, но АД, МОК и РИЛЖ не достигали исходных величин. В меньшей степени отмечалось улучшение микроциркуляции. Скорость кровотока не 71 восстанавливалась и наблюдались агрегаты эритроцитов. В крови сохранялся метаболический ацидоз. Все это способствовало тому, что в этой серии выжили (более 24 часов) 54% животных. 4.2 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА ДОНОРОМ ОКСИДА АЗОТА L-АРГИНИНОМ В этом разделе изучалась возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока с помощью донора NO – Lаргинина, который вводили в 7-й серии опытов за 20 минут до начала кровопотери (n = 10) и после окончания кровопотери осуществляли инфузию ФР. В 8-й серии (n= 7) L-аргинин в той же дозе вводили в составе инфузионной среды после окончания кровопотери. Как видно из данных представленных в таблице 16, в результате кровопотери АД во всех группах животных снижалось почти в 3 раза по сравнению с исходным состоянием. Показатели минутного объёма кровообращения и ударного объёма сердца снижались в 3,0-3,5 раза, значительно уменьшался рабочий индекс левого желудочка и общее периферическое сопротивление кровотоку. В серозной оболочки стенки тонкой кишки крыс наблюдались выраженные нарушения МЦ (таблица 17): уменьшение на 50% количества функционирующих капилляров, замедление скорости кровотока, агрегация эритроцитов. В артериальной крови снижался рН, отмечался выраженный дефицит буферных оснований, увеличивалось напряжение углекислоты (рСО2) (таблица 18). Необходимо отметить, что к окончанию кровопотери как в контроле, так в 7-й и 8-й сериях опытов наблюдаемые изменения практически не отличались друг от друга. Инфузионную терапию проводили на фоне выраженных нарушений системной гемодинамики, МЦ и метаболического ацидоза. 72 Таблица 16 Изменения системной гемодинамики у крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия изотонического раствора натрия хлорида (контроль, n=16), 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10), 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели АД, мм рт. ст. МОК, мл/мин х 100 г УО, мл/кг ОПС, дин х сек х см-5 10-4 /кг РИЛЖ, кгм / кг х мин ЧСС, уд х мин-1 Серии До кровопотери После кровопотери Время после окончания инфузии, мин 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 140±3 135±4 139±6 15,3±0,2 15,0±0,3 15,2±0,4 0,36±0,01 0,38±0,01 0,39±0,02 7,3±0,1 57±5 54±4+ 48±6+ 4,2±0,2+ 5,6±0,5+ 6,1±0,5+ 0,12±0,01+ 0,17±0,01+ 0,17±0,02+ 10,8±0,7+ 10 99±2+# 100±2+# 102±5+# 13,1±0,5# 19,1±0,4+#* 24,1±2,2+#• 0,34±0,01# 0,52±0,03+#* 0,66±0,06+#• ^ 6,2±0,3+# 7 8 6 7 8 6 7,2±0,2 7,4±0,2 289±7 274±5 283±12 428±8 8,3±0,8+ 7,0±1,3+ 34±4+ 43±7+ 39±6+ 347±8+ 4,0±0,2+#* 3,5±0,2+#• 180±11+# 280±16+#* 337±46+#• 391±17 4,6±0,6+#* 3,3±0,2+#• 161±13+# 245±16+#* 292±31#• 370±13 7 8 399±6 399±21 330±12+ 326±17+ 396±12 369±17 393±15 394±8 + 60 100±3+# 101±3+# 91±6+# 11,8±0,6+# 17,9±1,3+#* 23,5±2,0+#• 0,31±0,02# 0,48±0,03+#* 0,60±0,07+#• 7,2±0,6# Примечание: здесь и в последующих таблицах достоверность различий (р<0,05) отмечена по сравнению с исходными данными – +, с данными после окончания кровопотери – #, между данными 6 и 7 серий – *, 6 и 8 серий – •, 7 и 8 серий – ^. 73 Таблица 17 – Микроциркуляция у крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия изотонического раствора натрия хлорида (контроль, n=16), 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10), 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели Серии Количество капилляров в поле зрения, % исх. 6 7 8 Замедление кровотока в капиллярах, баллы 6 7 8 Агрегация эритроцитов, баллы 6 7 8 До кровопотери 100±0 100±0 100±0 После кровопотери 50±3+ 55±6+ 43±3+ Время после окончания инфузии, мин 10 60 # 85±5 96±5# 93±7# 96±3# 97±3# 97±3# 0±0 0±0 0±0 0±0 -3,56±0,07+ -3,30±0,21+ -3,71±0,4+ 2,56±0,07+ -0,81±0,20# -0,90±0,41# 0±0#•^ 1,15±0,14+# -0,93±0,14+# -0,80±0,10+# 0±0#•^ 1,33±0,09+# 0±0 0±0 2,40±0,10+ 2,71±0,14+ 1,10±0,31+# 0±0#•^ 0,80±0,21+# 0,14±0#•^ Через 10 мин после окончания инфузии во всех сериях опытов АД статистически значимо повышалось, но не достигало исходных величин (таблица 16). МОК и УО также увеличивались, хотя и в разной степени. Введение L-аргинина как до начала, так и после кровопотери способствовало значительному росту вышеуказанных параметров (таблица 16). Однако в контрольной серии этого не отмечалось. В большей степени оказывал положительное воздействие донора NО, вводимый после кровопотери в составе инфузионной среды. РИЛЖ, резко сниженный в результате кровопотери, возрастал после инфузии, но меньше всего в контроле. L-аргинин способствовал статистически значимо большему увеличению РИЛЖ по сравнению с введением только солевого раствора. ОПС уменьшалось после проведения инфузионной терапии. Самые низкие показатели ОПС были в результате введения L-аргинина в составе инфузионной среды (8-я серия). Исследование состояния МЦ в стенке тонкого кишечника крыс показало, что количество функционирующих капилляров, резко сниженное в результате кровопотери, восстанавливалось после инфузионной терапии. Это 74 восстановление было одинаковым при применении продуцента (таблица 17). Увеличивалась и скорость кровотока в капиллярах. Причем, L-аргинин, введенный до начала кровопотери, практически не влиял на скорость кровотока, о чем свидетельствуют значения этого показателя, близкие к контролю. В то же время L-аргинин, вводимый в составе инфузионной среды, способствовал, как видно из таблицы 17, полному восстановлению скорости кровотока, до нормы снижалось количество агрегатов эритроцитов. При анализе газового состава крови животных (рО2 – напряжение кислорода, рСО2 – напряжение углекислоты) выявлено, что рО2 после кровопотери незначительно увеличивалось, а рСО2 снижалось. В ходе эксперимента рО2 практически не изменялось (таблица 18). Таблица 18 – Газовый состав и кислотно-основное состояние в артериальной крови крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия изотонического раствора натрия хлорида (контроль, n=16); 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10); 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m Показатели РаО2, мм рт.ст. РаСО2, мм рт.ст. рН ВЕ, ммоль/л Серии До кровопотери После кровопотери Время после окончания инфузии, мин 6 83,5±3,4 104,4±5,0 10 94,6±2,4# 7 76,7±3,4 88,2±6,7+ 86,9±8,3 87,7±7,6 8 81,7±6,4 89,0±4,1+ 88,6±6,5 84,4±5,1 6 43,7±1,1 23,6±1,2+ 32,1±0,9+# 27,1±1,6+ 7 40,6±1,9 25,8±1,5+ 30,8±1,3+ 29,1±2,5# 8 43,7±2,3 30,3±2,7+ 29,9±1,2+ 30,5±1,8+ 6 7,39±0,01 7,35±0,02+ 7,36±0,02 7,37±0,03 7 7,41±0,01 7,36±0,02+ 7,39±0,01 7,41±0,03# 8 7,38±0,02 7,34±0,02+ 7,42±0,02# 7,40±0,02# 6 0,9±0,5 -11,9±0,6+ -6,6±0,8+# -7,6±1,5+ 7 0,2±0,4 -10,1±0,8+ -5,9±0,9+# -5,6±1,1+#* 8 0,5±1,2 -7,8±1,3+ -4,0±1,4+# -4,5±1,6+# + 60 95,7±3,7+ 75 Как видно из таблицы 18, в результате проведения инфузионной терапии наибольшая коррекция ацидоза отмечалась в 8-й серии экспериментов – после введения L-аргинина в составе ФР. К окончанию инфузии дефицит буферных оснований уменьшился и в серии с предварительным введением продуцента NО. Применение L-аргинина позволило увеличить сроки жизни животных. Выживаемость крыс составляла в 6-й серии лишь 50%, в то время как в 7-й серии – 80% ,а в 8-й – 86%. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Таким образом, L-аргинин улучшает работу сердечной мышцы, снижает ОПС, восстанавливает нарушенную микроциркуляцию. Можно полагать, что введение L-аргинина для увеличения генерации NO [90, 116], способствует сохранению его “базального” уровня, что необходимо для поддержания вазодилятаторного тонуса как в артериальных, так и в емкостных сосудах. Подтверждением этого являются результаты 8-й серии экспериментов (введение L-аргинина после окончания кровопотери в составе солевого раствора), в которых при низком ОПС отмечалось выраженное восстановление микроциркуляции. Механизм защитного действия L-аргинина на сердце, возможно, связан и с тем, что аргинин защищает кардиомиоциты от действия свободных радикалов [43], поскольку аргинин через орнитин может превращаться в глютаминовую кислоту, обладающую антиоксидантным действием. Таким образом, предварительное (до начала кровопотери) введение донора NО – L-аргинина повышает устойчивость животных к геморрагическому шоку. L-аргинин, введенный после кровопотери в составе инфузионной среды, облегчает течение тяжелой кровопотери и способствует большей выживаемости животных по сравнению с контролем. 76 5 ТЕЧЕНИЕ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА ПРИ ВВЕДЕНИИ ИЗОТОНИЧЕСКОГО РАСТВОРА НАТРИЯ ХЛОРИДА И ИЗБИРАТЕЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА При геморрагическом шоке в организме происходят серьезные нарушения вследствие избыточной активации iNOS и усиления генерации NO. Ограничение избыточного содержания NO может оказать благоприятное влияние на течение геморрагического шока. В этом разделе изучалось действие селективных ингибиторов iNOS на течение геморрагического шока у крыс при его инфузионной терапии. 5.1 ИНФУЗИЯ N6-(1-ИМИНОЭТИЛ)-L-ЛИЗИН ГИДРОХЛОРИДА Избирательный ингибитор NОS – N6-(1-иминоэтил)-L-лизин гидрохлорид (L-NΙL) вводили в дозе 50 мкг/кг массы белых крыс в составе инфузионной среды – изотонического раствора натрия хлорида (9 серия). Инфузию начинали при состоянии гемодинамики практически такой же, как и в контроле (6 серия). После окончания лечения АД повышалось по сравнению со значениями, регистрируемыми после кровопотери. Это повышение было таким же, как и при введении только солевого раствора и не достигало исходных значений (таблица 19). Внесение в состав инфузионной среды ингибитора вызывало значительный рост МОК и УО (таблица 19). Оба эти показателя через 10 мин после завершения инфузии повышались более чем в 5 раз, причем, УО даже достоверно превосходил значения, регистрируемые в исходном состоянии. Существенно возрастал РИЛЖ: через 10 мин после окончания кровопотери он достигал исходных величин, а к 60-й мин несколько снижался. Важно отметить, что при этом не увеличивалось ЧСС (таблица 19). ОПС, возросшее в результате кровопотери, достоверно уменьшалось и было ниже, чем в контроле (6серия). При исследовании состояния микроциркуляции выявлено, что скорость кровотока после инфузии хотя полностью и не восстанавливалась, но была 77 достоверно выше как по сравнению с данными по окончании кровопотери, так и по сравнению с контролем (таблица 20). Снижалось число агрегатов эритроцитов и увеличивалось КФК, превышающее исходные значения (таблица 20). Таблица 19 Системная гемодинамика у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-NIL, М±m Серии 6 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 9 Изотонический раствор натрия хлорида и селективный ингибитор синтеза оксида азота L-NIL n=9 До кровопотери После кровопотери АД 140±3 МОК Показатели Время после окончания инфузии, мин 10 60 57±5+ 99±2+* 100±3+* 15,3±0,2 4,2±0,2+ 13,1±0,5* 11,8±0,6+* УО 0,36±0,01 0,12±0,01+ 0,34±0,02* 0,31±0,02* ОПС 7,3±0,1 10,8±0,7+ 6,2±0,3* 7,2±0,6* РИЛЖ 289±7 34±4+ 180±11+* 161±13+* ЧСС 428±8 347±8+ 391±17 370±13 АД 142±4 58±4+ 97±4+* 96±6+* МОК 15,3±0,2 4,2±0,4+ 22,6±1,3+* 18,2±2,2* УО 0,38±0,02 0,13±0,01+ 0,58±0,05+* 0,47±0,06+* ОПС 7,5±0,3 11,6±1,2+ 3,6±0,3+* 4,5±0,4+* РИЛЖ 293±8 33±5+ 296±22* 241±26* ЧСС 413±20 340±7+ 397±13 376±20 Примечание: здесь и в последующих таблицах статистически значимые различия (р 0,05) отмечены по сравнению с исходными данными – +, по сравнению с окончанием кровопотери – *, между сериями – . 78 Таблица 20 Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-NIL, М±m Серии Время после окончания инфузии, мин 10 60 Показатели До кровопотери После кровопотери V 0±0 -3,56±0,07+ -0,81±0,20+* -0,93±0,14+* АЭ 0±0 2,56±0,07+ 1,06±0,14+* 1,20±0,14+* КФК 100±0 50±3+ 85±5* 96±5* V 0±0 -3,67±0,11+ -0,44±0,11* -0,78±0,22+* АЭ 0±0 2,67±0,11+ 0,89±0,11+* 1,11±0,11+* КФК 100±0 54±6+ 102±4* 95±6* 6 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 9 Изотонический раствор натрия хлорида и селективный ингибитор синтеза оксида азота L-NIL n=9 Напряжение кислорода в крови животных после введения ингибитора практически не изменялось, как и в 6-й (контрольной) серии (таблица 21). Содержание углекислоты увеличивалось к 10-й мин после инфузии, а затем снижалось, как и в контроле. 79 Таблица 21 – Газовый состав и кислотно-основное состояние артериальной крови у крыс при геморрагическом шоке, инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-N1L, M±m Серии Показатели До крово- После Время после окончания кровопотери инфузии, мин потери 10 60 6 Изот. раствор РаО2 83,53,4 104,4 5,0 94,6 2,4 95,7 3,7 натрия хлорида РаСО2 43,71,1 23,6 1,2+ 32,7 0,9+* 27,1 1,6+ рH 7,390,01 7,350,02 7,360,02 7,370,03 ВЕ 0,9 0,5 -11,9 0,6+ -6,6 0,8+* -7,6 1,5+ Изот. раствор РаО2 72,94,8 107,23,5 92,62,8 88,16,0 натрия хлорида РаСО2 40,01,5 22,31,6+ 28,71,2* 26,11,5+ рH 7,420,01 7,280,03 7,360,01* 7,380,03* ВЕ 1,70,5 -14,91,7+ -8,01,1+* -8,61,8+* (контроль) n=16 9 и L-NIL n=9 Динамика рН и ВЕ в 10-й серии достоверно не отличалась от контроля. Однако дефицит буферных оснований после применения ингибитора имел бóльшую тенденцию к восстановлению, чем в 6-й серии. Так, к началу инфузии в контроле ВЕ составлял -11,9±0,6 ммоль/л, а через 60 мин после окончания инфузии -7,6±1,5 ммоль/л, т.е. снизился на -4,3; в 9-й серии это снижение было более значительным -6,3 ммоль/л (таблица 21). Восстановление рН в 9-й серии было также бóльшим: 0,02 в 6-й серии и 0,10 в 10-й. Из 9 крыс более 24 часов прожили 6. Выживаемость составила 67%. Таким образом, введение крысам после тяжелой кровопотери избирательного ингибитора NОS L-NΙL в составе изотонического раствора натрия хлорида вызывало значительное улучшение работы сердца и восстановление микроциркуляции. 80 5.2 ИНФУЗИЯ N5-(1- ИМИНОЭТИЛ)-L-ОРНИТИН ДИГИДРОХЛОРИДА N5-(1- иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорид (L-NΙО), как и L- NΙL вводили в составе изотонического раствора натрия хлорида в дозе 50 мкг/кг по окончании периода гипотензии. АД, сниженное в результате кровопотери, увеличивалось почти вдвое, но не достигало исходных величин (таблица 22). Таблица 22 Системная гемодинамика у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-NIO, М±m Серии 6 Время после окончания инфузии, мин 10 60 Показатели До кровопотери После кровопотери АД 140±3 57±5 + 99±2+* 100±3+* МОК 15,3±0,2 4,2±0,2+ 13,1±0,5* 11,8±0,6+* УО 0,36±0,01 0,12±0,01+ 0,34±0,01* 0,31±0,02* ОПС 7,3±0,1 10,8±0,7+ 6,2±0,3* 7,2±0,6* РИЛЖ 289±7 34±4+ 180±11+* 161±13+* ЧСС 428±8 347±8+ 391±17 370±13 АД 125±4 49±8+ 101±5+* 99±8+* МОК 15,5±0,5 5,4±0,9+ 26,4±1,6+* 25,9±2,8+* УО 0,42±0,03 0,16±0,03+ 0,64±0,03+* 0,65±0,05+* ОПС 6,5±0,2 9,2±2,2+ 3,2±0,1+* 3,2±0,3+* РИЛЖ 263±14 41±10+ 376±20+* 355±54* ЧСС 390±38 360±34 394±25 399±25 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 10 Изотонический раствор натрия хлорида и селективный ингибитор синтеза оксида азота L-NIO n=9 Примечание: здесь и в последующих таблицах статистически значимые различия (р 0,05) отмечены по сравнению с исходными данными – +, по сравнению с окончанием кровопотери – *, между сериями – . 81 Показатели сердечной деятельности – МОК и УО в результате инфузии ингибитора значительно возрастали и даже превышали исходные значения (таблица 22). Увеличивался РИЛЖ, причем ЧСС не изменялось. ОПС, повышенное после кровопотери, снижалось и составляло половину исходного уровня (таблица 22). После инфузии L-NΙО изменялось состояние микроциркуляции в стенке тонкого кишечника крыс (таблица 23). Возрастала скорость кровотока, снижалось число агрегатов эритроцитов. КФК практически возвращалось к исходным значениям (таблица 23). Таблица 23 Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-NIO, М±m Серии 6 До После Время после окончания крово- крово- инфузии, мин потери потери 10 60 V 0±0 -3,56±0,07+ -0,81±0,20+* -0,93±0,14+* АЭ 0±0 2,56±0,07+ 1,06±0,14+* 1,20±0,14+* КФК 100±0 50±3+ 85±5* 96±5* V 0±0 -3,29±0,14+ -0,86±0,14+* -0,71±0,14+* АЭ 0±0 2,29±0,14+ 0,86±0,14+* 0,71±0,14+* КФК 100±0 47±4+ 95±7* 93±3* Показатели Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 10 Изотонический раствор натрия хлорида и селективный ингибитор синтеза оксида азота L-NIO n=10 82 Показатели КОС крови улучшались в той же степени, что и в контроле. Напряжение углекислоты после введения L-NIO возрастало и было статистически значимо выше, чем при инфузии только кровезаменителя (таблица 24). Таблица 24 – Содержание газов и кислотно-основное состояние артериальной крови у крыс при геморрагическом шоке, инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота L-NIO, M±m До Серии Время после окончания Пока- кровопо- После инфузии, мин затели тери кровопотери 10 60 6 Изотонич. РаО2 83,53,4 104,4 5,0 94,6 2,4 95,7 3,7 раствор натрия РаСО2 43,71,1 23,6 1,2+ 32,7 0,9+* 27,1 1,6+ рH 7,390,01 7,350,02 7,360,02 7,370,03 ВЕ 0,9 0,5 -11,9 0,6+ -6,6 0,8+* -7,6 1,5+ хлорида (контроль) n=16 10 Изотонич. раствор натрия хлорида и L-NIO РаО2 80,85,4 96,66,7 92,85,4 79,63,8 РаСО2 41,31,6 28,61,9+ 32,61,3* 32,21,6+ рH 7,380,02 7,290,03 7,350,02* 7,350,04* ВЕ -0,20,6 -11,90,8+ -6,91,0+* -6,21,4+* n=9 Следовательно, введение крысам после тяжелой кровопотери селективного ингибитора NОS – L-NIO в составе изотонического раствора натрия хлорида способствовало улучшению работы сердца и восстановление микроциркуляции. Выживаемость в этой серии составила 100%. 5.3 ИНФУЗИЯ АМИНОГУАНИДИНА Аминогуанидин гидрохлорид вводили по окончании кровопотери в составе ФР в дозе 150 мг/кг массы животного (11-й серия, n=6). Объём ФР превышал в 2 раза кровопотерю. 83 Как видно из таблицы 25, в результате кровопотери АД снижалось в 2,5 раза по сравнению с исходным. Минутный объём кровообращения и ударный объём сердца падали в 3,0-3,5 раза, значительно уменьшался рабочий индекс левого желудочка, увеличивалось общее периферическое сопротивление кровотоку. В серозной оболочке тонкой кишки крыс по сравнению с исходным уровнем снижалось количество функционирующих капилляров, значительно замедлялась скорость кровотока, появлялись агрегаты эритроцитов (таблица 26). В артериальной крови снижался рН, отмечался выраженный дефицит буферных оснований, увеличивалось напряжение углекислоты (таблица 27). Необходимо подчеркнуть, что к окончанию кровопотери в обеих сериях отмечались практически не отличающиеся друг от друга изменения. Таблица 25 – Изменения системной гемодинамики у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (6 серия, n=16) и селективного ингибитора синтеза оксида азота – аминогуанидина (11 серия, n=6) в составе изотонического раствора натрия хлорида Серии Показатели До После кровопотери кровопотери Время после окончания инфузии, мин 6 АД МОК УО ОПС РИЛЖ ЧСС 140±3 15,3±0,2 0,36±0,01 7,3±0,1 289±7 428±8 57±5 4,2±0,2+ 0,12±0,01+ 10,8±0,7+ 34±4+ 347±8+ 99±2 13,1±0,5 0,34±0,01 6,2±0,3 180±11+ 391±17 100±3+ 11,8±0,6 0,31±0,02 7,2±0,6 161±13+ 370±13 АД МОК УО ОПС РИЛЖ ЧСС 138±2 15,0±0,3 0,35±0,02 7,4±0,2 279±5 430±19 53±9+ 4,3±0,6+ 0,14±0,02+ 10,7±1,7+ 33±11+ 325±22+ 122±5# 23,1±3,0+# 0,56±0,06+# 4,4±0,6+# 377±36+# 380±20 124±7# 23,3±2,9+# 0,60±0,07# 4,6±0,9+# 384±45+# 392±26 10 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль), n=16 11 Изотонический раствор натрия хлорида и аминогуанидин,n=6 + 60 + Примечание: в этой и последующих таблицах статистически значимые различия (р 0,05) отмечены по сравнению с исходными данными – +; по сравнению с окончанием кровопотери – , между 6 и 11 сериями – #. 84 Таблица 26 – Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (6 серия, n=16) и селективного ингибитора синтеза оксида азота – аминогуанидина (11 серия, n=6) в составе изотонического раствора натрия хлорида Серии 6 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 11 Изотонический раствор натрия хлорида и аминогуанидин n=6 Время после окончания инфузии, мин 10 60 Показатели Исходные После кровопотери V 0±0 -3,56±0,0+ -0,81±0,20+ -0,93±0,14+ АЭ 0±0 2,56±0,07 1,06±0,14+ 1,20±0,14+ КФК 100±0 50±3+ 85±5 96±5 V 0±0 -3,67±0,16+ -0,17±0,16+# -0,33±0,14+# АЭ 0±0 2,67±0,16+ 0,67±0,16# 0,50±0,16# КФК 100±0 48±4 92±7 95±5 После введения аминогуанидина наблюдался подъём АД, которое статистически значимо было выше, чем в контроле (таблица 25). Улучшались и показатели сердечной деятельности: МОК возрастал в 5 раз и оставался высоким до конца периода наблюдения. Такое же улучшения происходило с УО. Существенно возрастал РИЛЖ, он даже превышал исходные значения, чего не наблюдалось в контроле. ОПС был статистически достоверно ниже, чем в 7-й серии. Частота сердечных сокращений, несколько сниженная в результате кровопотери, имела тенденцию к росту после инфузии ФР с аминогуанидином, но не отличалась от контроля. В результате применения ингибитора существенно восстанавливалась МЦ, вызванная кровопотерей (таблица 26). Так, почти до исходного уровня увеличивалось КФК, значительно выше, чем в контроле была линейная скорость кровотока, уменьшалось количество эритроцитарных агрегатов в микрососудах. 85 Показатели содержания газов в крови животных и КОС не отличались от контроля (таблица 27). Таблица 27 – Изменения газового состава и кислотно-основного состояния в крови у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (6 серия, n=16) и селективного ингибитора синтеза оксида азота аминогуанидина (11 серия, n=6) в составе изотонического раствора натрия хлорида До Серии Время после окончания Пока- кровопо- После инфузии, мин затели тери кровопотери 10 60 6 Изотонич. РаО2 83,53,4 104,4 5,0 94,6 2,4 95,7 3,7 раствор РаСО2 43,71,1 23,6 1,2+ 32,7 0,9+* 27,1 1,6+ рH 7,390,01 7,350,02 7,360,02 7,370,03 ВЕ 0,9 0,5 -11,9 0,6+ -6,6 0,8+* -7,6 1,5+ натрия хлорида (контроль),n=16 11 Изотониич. РаО2 91,07,6 109,15,9 81,94,8 82,33,2 раствор натрия РаСО2 41,81,7 24,02,6 34,92,8 31,42,2 рH 7,390,01 7,370,03 7,330,04 7,390,01 ВЕ 0,20,5 -10,21,2 -6,31,5 -5,02,2 хлорида и аминогуанидин, n=6 Применение аминогуанидина при инфузионной терапии тяжелой кровопотери способствовало 100% выживаемости, в то время как в контрольной (6-й серии) она составляла лишь 50%. 5.4 ИНФУЗИЯ S-МЕТИЛИЗОТИОЛА Инфузию изотонического раствора натрия хлорида с избирательным ингибитором синтеза оксида азота S-метилизотиолом (12-я серия) начинали практически при тех же показателях системной микроциркуляции, КОС, что и в контроле (6-я серия). гемодинамики, 86 Сниженное в результате кровопотери до 60±4 мм рт.ст. АД через 10 мин после окончания инфузии ФР и S-метилизотиола повысилось более чем вдвое (133±4 мм рт.ст.), не отличалось от исходного и было выше, чем в контроле (табл. 28). Таблица 28 Системная гемодинамика у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота изотиомочевины, М±m Время после окончания инфузии, мин 10 60 Показатели До кровопотери После кровопотери АД 140±3 57±5 + 99±2+* 100±3+* МОК 15,3±0,2 4,2±0,2+ 13,1±0,5* 11,8±0,6+* раствор натрия УО 0,36±0,01 0,12±0,01+ 0,34±0,01* 0,31±0,02* хлорида ОПС 7,3±0,1 10,8±0,7+ 6,2±0,3* 7,2±0,6* РИЛЖ 289±7 34±4+ 180±11+* 161±13+* ЧСС 428±8 347±8+ 391±17 370±13 АД 148±5 60±4+ 133±4* 124±9+* раствор натрия МОК 15,5±0,5 5,2±0,5+ 15,1±2,0* 11,3±2,0* хлорида и УО 0,37±0,01 0,14±0,01+ 0,39±0,02* 0,31±0,04* ингибитор синтеза ОПС 7,8±0,3 10,2±0,8+ 8,5±1,6+ 9,8±1,6+ оксида азота РИЛЖ 310±7 42±5 272±36* 189±12* ЧСС 413±7 353±13 353±15 350±19 Серии 6 Изотонический (контроль) n=16 12 Изотонический селективный S-метилизотиол n=10 Примечание: здесь и в последующих таблицах статистически значимые различия (р 0,05) отмечены по сравнению с исходными данными – + , по сравнению с окончанием кровопотери – * и между сериями – . МОК и УО также достигали исходного уровня к 10-й мин после окончания инфузии, но через час начали падать. Возрастало ОПС, как после кровопотери, так и после введения ингибитора. РИЛЖ, значительно 87 уменьшенный в результате кровопотери, увеличился, хотя и не достигал исходного уровня, но был достоверно выше, чем в контроле (таблица 28). При изучении микроциркуляторного русла тонкого кишечника оказалось, что после введения ингибитора скорость кровотока возрастала, увеличивалось КФК и отмечалось уменьшение агрегатов эритроцитов. При сравнении с контролем (6-я серия) видно, что микроциркуляция улучшалась в той же степени, что и при инфузии только солевого раствора (таблица 29). Таблица 29 Микроциркуляция у крыс при геморрагическом шоке, инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота S-метилизотиола, М±m Серии 6 До После Время после окончания кровопо- крово- инфузии, мин тери потери V 0±0 -3,56±0,07+ -0,81±0,20+* -0,93±0,14+* АЭ 0±0 2,56±0,07+ 1,06±0,14+* 1,20±0,14+* КФК 100±0 50±3+ 85±5* 96±5* V 0,11±0,11 -3,33±0,11+ -1,00±0,25+* -1,00±0+* АЭ 0,11±0,11 2,33±0,11+ 1,29±0,14+* 1,29±0,14+* КФК 100±0 45±5+ 86±7* 83±5* Показатели 10 60 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) n=16 12 Изотонический раствор натрия хлорида и селективный ингибитор синтеза оксида азота S-метилизотиол n=10 Введение S-метилизотиола способствовало статистически значимому по сравнению с контролем увеличению напряжения углекислоты в артериальной крови животных (таблица 29). Явления метаболического ацидоза, развившиеся 88 в результате геморрагического шока, в этой серии несколько уменьшились, но не отличались от контроля (таблица 30). Таким образом, введение после тяжелой кровопотери изотонического раствора натрия хлорида с избирательным ингибитором синтеза оксида азота – S-метилизотиолом вызывало выраженный подъем АД и ОПС, увеличение МОК и УО, которые не отличались от контроля, достоверный рост РИЛЖ. Показатели микроциркуляции улучшались в той же мере, что и при инфузии только солевого раствора. Таблица 30 – Газовый состав и кислотно-основное состояние артериальной крови крыс при геморрагическом шоке, инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективного ингибитора синтеза оксида азота Sметилизотиола, M±m Время после окончания Серии Пока- До После затели кровопо- кровопотери инфузии, мин 10 60 тери 6 Изотонич. РаО2 83,53,4 104,4 5,0 94,6 2,4 95,7 3,7 раствор РаСО2 43,71,1 23,6 1,2+ 32,7 0,9+* 27,1 1,6+ рH 7,390,01 7,350,02 7,360,02 7,370,03 ВЕ 0,9 0,5 -11,9 0,6+ -6,6 0,8+* -7,6 1,5+ натрия хлорида (контроль), n=16 12 Изотонич. РаО2 74,42,3 102,94,9 81,68,6 84,37,8 раствор РаСО2 48,71,6 30,32,8+ 37,14,0* 32,62,1+ рH 7,350,02 7,310,02 7,320,04 7,300,03 ВЕ 0,40,5 -10,30,6+ -7,31,2+* -9,42,1+ натрия хлорида и Sметилизотиол, n=10 В крови увеличивалось напряжение углекислоты, сохранялись явления метаболического ацидоза. Из 9 животных погибло 5, т.е. выживаемость составила 44%. 89 5.5 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ СЕЛЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА ПРИ ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА Анализ изменений параметров системного кровообращения при инфузии ФР и селективных ингибиторов синтеза NО свидетельствует о том, что изученные препараты вызывают изменения МОК и УО (таблица. 31). Во всех сериях после проведения инфузионной терапии работа сердца улучшалась, но в разной степени. Применение селективных ингибиторов синтеза оксида азота показало, что самым высоким МОК и УО оказались в результате введения LNIО (10 серия, таблица 22) , примерно в равной степени влияли на МОК и УО L-NIL (9серия, табл. 20) и аминогуанидин (11серия, табл. 25). В экспериментах с введением L-NIL, L-NIО (10 серия), аминогуанидина, где ОПС было низким, АД все же поддерживалось на удовлетворительном уровне. S-метилизотиол (12 серия) в этом отношении оказался наименее эффективным (табл.28), т.к. вышеуказанные показатели работы сердца в результате его введения практически не отличались от контроля (6 серия). Как видно из таблицы 28, после введения S-метилизотиола увеличение АД было наибольшим, а ОПС снизилось в наименьшей степени по сравнению с другими ингибиторами. Наглядно это отображено на рисунках 5 и 6. Наименьшей после введения Sметилизотиола была и коррекция показателей КОС (таблица 30,32). Линейная скорость кровотока, КФК, количество агрегатов эритроцитов в результате введения ингибиторов изменялись однонаправлено, но в разной степени. 90 Таблица 31 – Величина изменений показателей гемодинамики по сравнению с окончанием кровопотери после инфузии изотонического раствора натрия хлорида и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота Показатели гемодинамики и их изменения по сравнению с окончанием кровопотери Серии 6 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 9 Изотонический раствор натрия хлорида и L-NIL 10 Изотонический раствор натрия хлорида и L-NIО 11 Аминогуанидин 12 Изотонический раствор натрия хлорида и Sметилизотиол AД, мм рт.ст. МОК, мл/мин•100 г УО, РИЛЖ, мл/мин•кг кГм Время после инфузии, мин ОПС, дин•сек•см-5/кг КФК, % к исх. 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 +42 +43 +8,9 +7,6 +0,22 +0,19 +146 +127 -4,2 -3,6 +25 +46 +39 +38 +18,4 +14,0 +0,45 +0,34 +263 +208 -8,0 -7,1 +48 +41 +52 +50 +21,0 +20,5 +0,48 +0,49 +335 +314 -6,0 -6,0 +48 +46 +69 +71 +18,8 +19,0 +0,47 +0,47 +344 +351 -6,3 -6,1 +44 +47 +74 +74 +10,7 +10,4 +0,28 +0,25 +344 +351 -1,9 -2,1 +21 +54 Примечание: в этой и следующей таблице увеличение показателей по сравнению с окончанием кровопотери обозначено знаком плюс (+), уменьшение – знаком минус (-). 91 Таблица 32 –Величина изменений показателей газов крови и кислотно-основного состояния в крови крыс (по сравнению с окончанием кровопотери) после инфузии изотонического раствора натрия хлорида и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота Содержание газов крови и КОС Серии рН РаО2, мм рт.ст. ВЕ, ммоль/л РаСО2, мм рт.ст. Время после инфузии, мин 10 60 10 60 10 60 10 60 -9,8 -8,7 +0,01 +0,02 +5,3 +4,3 +8,5 +3,5 -14,6 -19,1 +0,08 +0,10 +6,9 +6,3 +6,4 +3,8 -3,8 -17,0 +0,06 +0,06 +5,0 +5,7 +4,0 +3,6 -27,2 -26,8 -0,04 +0,02 +3,9 +5,2 +10,9 +7,4 -21,3 -18,6 +0,01 -0,01 +3,0 +0,9 +6,8 +2,3 6 Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 9 Изотонический раствор натрия хлорида и L-NIL 10 Изотонический раствор натрия хлорида и L -NIО 11 Аминогуанидин 12 Изотонический раствор натрия хлорида и Sметилизотиол 92 Увеличение скорости кровотока и количества функционирующих капилляров было наименьшим в 12 серии (S-метилизотиола, табл.29), остальные препараты оказывали практически одинаковое действие. Агрегация эритроцитов снижалась менее всего также после введения S-метилизотиола. Полученные результаты позволяют полагать, что селективные ингибиторы синтеза NО –L-NIL, L-NIО, аминогуанидин, снижая генерацию оксида азота, активированную при кровопотере iNOS, улучшают деятельность Рисунок 5 АД у крыс при геморрагическом шоке при инфузии изотонического раствора натрия хлорида (серия 6) и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота – L-NIL (серия 9), L-NIO (серия 10), аминогуанидина (серия 11), Sметилизотиола (серия 12) сердечно-сосудистой системы. Результатом этого является выживаемость животных по сравнению с контролем (таблица33). и высокая 12 -5 -4 ОПС, дин х сек х см х 10 /кг 93 Исходное 9 6 3 Исходное 10 7 60 мин инфузии 10 мин После Окончание кровопотери 11 13 12 Рисунок 6 – ОПС у крыс при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида (серия 6) и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота – L-NIL (серия 9), L-NIO (серия 10), аминогуанидина (серия 11), S-метилизотиола (серия 12) Таблица 33 – Выживаемость животных при геморрагическом шоке и инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективных ингибиторов синтеза оксида азота Селективный Выживаемость животных % Серии ингибитор выжили погибли выживаемости 6 (контроль) — 8 8 50 9 L-NIО 7 0 100 10 L-NIL 6 3 67 11 Аминогуанидин 6 0 100 12 S-метилизотиол 4 5 44 Как видно из таблицы 33, при введении аминогуанидина и L-NIО в составе солевого раствора выживаемость крыс, перенесших тяжелую кровопотерю, была 100%. Иными словами, те ингибиторы, которые в большей степени улучшали деятельность сердечно-сосудистой системы, способствовали самой высокой выживаемости. 94 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработка новых геморрагического схем шока инфузионно-трансфузионной является важной трансфузиологии. Остро развивающаяся задачей терапии современной недостаточность кровообращения жизненно важных органов в условиях гиповолемии и развивающейся циркуляторной гипоксии [181, 195, 245] нередко приводит к необратимому коллапсу и смерти. Лечение кровопотери, осложненной длительной постгеморрагической гипотензией, приобретает особую сложность в связи с развивающимся перенапряжением компенсаторных механизмов организма, глубокими нарушениями периферического кровообращения и метаболизма [23, 83]. Длительное ограничение кровотока в органах сопровождается развитием необратимых повреждений тканей [2, 81, 84]. Для коррекции расстройств кровообращения, как в крупных магистральных сосудах, так и в сосудах микроциркуляторного русла, помимо инфузионно-трансфузионных сред необходимы дополнительные средства, способные длительно поддерживать транскапиллярный обмен [227, 246]. Исследования последних лет позволили по-новому интерпретировать механизмы различных физиологических и патологических процессов благодаря открытию биологической роли оксида азота. Участие оксида азота в разнообразных патологических состояниях дает возможность изучения способов воздействия на процессы, опосредуемые NO. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния регуляторов синтеза оксида азота – экзогенного донора, селективных и неселективных ингибиторов NO-синтаз на течение экспериментального геморрагического шока при его инфузионной терапии. Для изучения возможности повышения эффективности инфузионной терапии шока средствами, влияющими на содержание оксида азота, необходимо было определить, как изменяется эндогенная генерация оксида азота при шоке различной этиологии. Установлено, что при ожоговом, геморрагическом и травматическом шоке синтез оксида азота в тканях крыс 95 усиливается, но в разные сроки после нанесения травмы. Содержание оксида азота в ранний период наблюдения при ожоговом и травматическом шоке было таким же, как у здоровых животных, что объясняется, вероятно, низкой активностью iNOS. Известно, что iNOS при шоке экспрессируется значительно позже, чем eNOS и отличается от конститутивных форм длительностью действия и скоростью образования NO [144]. Проведенные нами эксперименты показали, что синтез оксида азота в тканях увеличивается только через 18-24 часа после нанесения ожоговой травмы или сдавливания мягких тканей. Отсутствие нарастания содержания NO в тканях обожженных крыс в ранние сроки после травмы в определенной степени объясняет данные о периферическом спазме сосудов и централизации кровообращения в первые часы после ожога, вследствие чего сохраняется довольно высокое АД [24, 83]. Известно, что продукция NO и циклического гуанозинмонофосфата у обожженных крыс возрастает не ранее, чем через 8 часов после ожога [120]. Именно к этому времени активируется iNOS. Увеличение содержания NO в печени, почках в этот период можно рассматривать как реакцию, направленную на сохранение кровообращения в этих жизненно важных органах [31]. В представленных нами исследованиях при травматическом шоке наблюдался сходный с ожоговым шоком характер изменений содержания NO в исследуемых тканях, но усиление генерации оксида азота происходило несколько раньше. Проведенные эксперименты показали, что при геморрагическом шоке происходит более раннее увеличение концентрации оксида азота (через 2 часа) в печени и почках, чем у животных после ожоговой травмы (через 24 часа) или сдавливания мягких тканей (через 18 часов). В ткани печени NO синтезируется интенсивнее (36,2±5,6 усл.ед.), чем в ткани почек (3,3±0,1 усл.ед.) и селезенки (5,3±2,2 усл.ед.). При сопоставлении величин АД и содержания NO в печени крыс при геморрагическом шоке оказалось, что чем выше АД, тем меньше оксида азота содержится в печени, а при понижении АД количество оксида азота в печени 96 возрастает. Взаимосвязь выработки оксида азота и величины АД позволяет говорить о важной роли NO в патогенезе геморрагического шока. Данные о содержании оксида азота в тканях и зависимости изменения АД при геморрагическом шоке от количества NO в печени крыс послужили обоснованием для изучения возможности повышения эффективности инфузионной терапии с использованием методов его эндотелийзависимой регуляции сосудистого тонуса. Прежде всего, необходимо было выяснить, как влияют регуляторы синтеза NO, вводимые без кровезаменителя, на течение массивной кровопотери. Выявлено, что предварительное введение регуляторов синтеза NO (неселективного ингибитора NW-нитро-L-аргинина и донора оксида азота L-аргинина), существенно изменяет развитие геморрагического шока у крыс. Известно, что NO влияет на поддержание системной и локальной гемодинамики, мускулатуры способствует сосудов и снижению регулирует повышенного уровень АД [21, тонуса 35, гладкой 36]. При предварительном введении регуляторов синтеза оксида и сопоставлении величины АД, объема кровопотери, времени наступления выраженных нарушений МЦ, продолжительности жизни экспериментальных животных оказалось, что после введения неселективного ингибитора синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинина тяжелые нарушения МЦ в стенке тонкого кишечника крыс развиваются рано (через 18±3 мин). При этом артериальное давление остается на исходном уровне, что свидетельствует о выраженном спазме периферических сосудов. Таким образом, при массивной кровопотере (2,4±0,2 мл/100г массы) после введения неселективного ингибитора, блокирующего конститутивную еNOS, быстро развиваются выраженные нарушения микроциркуляции в жизненно важных органах. При ингибировании синтеза NO неселективным ингибитором в организме в ответ на кровопотерю усиливается централизация кровообращения, о чем свидетельствует высокое АД с значительными нарушениями МЦ в тканях крыс. Уменьшение продукции NO под влиянием NW-нитро-L-аргинина сопровождается изменениями метаболизма, 97 отягощающими геморрагический шок и приводит к быстрой гибели животных (через 52±4мин, по сравнению с 658 мин в контроле). При предварительном введении донора оксида азота повышалась устойчивость животных к кровопотере. Нарушения микроциркуляции, те же, что и при введении ингибитора, наступали значительно позднее (70±8 мин) и при большем объеме кровопотери (4,2±0,2 мл/100г массы). Вероятно, увеличение содержания оксида азота в результате инфузии донора оксида азота поддерживало вазодилататорный тонус сосудов, что обеспечивало сохранение микрокровотока. Бóльшая кровопотеря у крыс до наступления выраженных нарушений микроциркуляции при введении донора NO свидетельствует о том, что NO задерживает нарушения кровообращения, развивающиеся при шоке, уменьшая степень централизации кровообращения. Изменениям системной гемодинамики и микроциркуляции соответствовали и сдвиги кислотно-основного состоянии крови. Во всех опытах при введении регуляторов синтеза NO нарастали явления метаболического ацидоза, о чем свидетельствовали снижение рН и рост дефицита буферных оснований. При введении донора NO большему ацидозу соответствовало меньшее напряжение кислорода в крови, при большем объеме кровопотери, осуществляемой в течение более продолжительного времени. Известно, что на ранних стадиях геморрагического шока продукция оксида азота носит защитный характер, уменьшая развитие циркуляторной гипоксии тканей [74, 94, 165]. Кроме того показано, что при ишемии/реперфузии L-аргинин нормализует рО2 в печени [122]. В наших экспериментах при введении Lаргинина наблюдалась меньшая кислородная недостаточность, бóльшая коррекция ацидоза, чем при введении ингибитора синтеза оксида азота. При инфузии ингибитора NO к моменту выраженных нарушений микроциркуляции более низкому рН соответствовало более высокое напряжение кислорода в крови. При введении ингибитора, чем значительнее был ацидоз, а, следовательно, кислородная недостаточность, тем большим было рО2 в артериальной крови, т.е. наблюдалась обратная зависимость. Согласно 98 данным литературы, существует независимый путь образования NO в скелетных мышцах, в том числе и в дыхательных [67]. Показано, что при ишемии изолированного сердца и скелетных мышц, сопровождающейся гипоксией, происходит нарастание содержания NO, независимое от активности NO-синтаз [118, 190]. Эти данные позволяют понять, почему при более тяжелом состоянии животных после введения ингибитора синтеза NO, напряжение кислорода в артериальной крови оказывается высоким. Скорее всего, это объясняется увеличением кровоснабжения дыхательных мышц, усилением их сократимости и, следовательно, возрастанием легочной вентиляции. Известно, что кровопотеря вызывает перераспределение кровотока – выраженную централизацию кровообращения, которая является приспособительным механизмом. Вероятно, увеличение образования оксида азота происходит в ответ на централизацию кровообращения [83], что предупреждает значительное уменьшение кровотока в органах и тканях. Поэтому можно полагать, что продукция NO на ранних стадиях шока направлена на поддержание перфузии в жизненно важных органах в условиях централизации кровообращения, вызванной массивной потерей крови. Таким образом, предварительное введение регуляторов синтеза оксида азота изменяет течение геморрагического шока, так как оксид азота, несомненно, играет важную роль в регуляции кровообращения. Высокая устойчивость к кровопотере у животных при введении донора оксида азота свидетельствует о том, что гиперпродукция NO в начале кровопотери задерживает нарушения микроциркуляции. Следовательно, возникает необходимость поддерживать так называемый “базальный” уровень NO на ранних стадиях геморрагического шока, что подтверждают наши результаты с предварительным введением донора NO – L-аргинина. Активность конститутивной синтазы, поддерживает базальный уровень оксида азота и органный кровоток. Именно поэтому eNOS экспрессируется в организме постоянно в эндотелиальных и других клетках и ее уровень не превышает 99 нескольких микромолей [36, 109, 174]. Анализ имеющихся в литературе данных и представленных экспериментальных материалов о зависимости изменения АД от содержания NO в тканях крыс, а также полученных нами результатов по влиянию неконкурентного ингибитора и донора на течение геморрагического шока явилось обоснованием для изучения возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока, сочетаемой с различными регуляторами синтеза NO. Регулировать содержание оксида азота при геморрагическом шоке возможно донорами NO [116, 178], поддерживающими его базальный уровень, и ингибиторами, снижающими избыточную генерацию NO [12, 170]. На сегодняшний день известно, что при геморрагическом шоке активируется индуцибельная синтаза NO, а активность конститутивной синтазы подавляется. Избыточная генерация NO в поздних стадиях кровопотери вследствие активации iNOS способствует образованию токсического пероксинитрита, что ведет к воспалению и тканевым повреждениям [166]. Поддержание активности eNOS, являющейся защитной, и одновременное предупреждение или ингибирование активации iNOS представляется сложной терапевтической задачей. Нами исследована возможность повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока у животных с помощью регуляторов сосудистого тонуса. Было изучено влияние донора оксида азота – L-аргинина и ряда избирательных ингибиторов синтаз оксида азота на гемодинамику, кислотно-основное состояние и содержание газов в крови животных. Введение как доноров, так и ингибиторов NO проводили на фоне инфузии изотонического раствора натрия хлорида в объеме, в два раза превышающем объем кровопотери. В качестве донора был использован L-аргинин, который в одной серии вводили до начала кровопотери, после чего проводили инфузию солевого раствора, в другой серии L-аргинин вводили в составе инфузионой среды. 100 Инфузионная терапия геморрагического шока только солевым раствором способствовала частичной коррекции системной гемодинамики и в меньшей степени восстановлению микроциркуляции. Статистически значимо повышалось АД, но при этом не достигало исходных величин. МОК и УО также увеличивались, хотя и в разной степени. В контроле МОК после замещения кровопотери был ниже, чем до начала инфузии. Введение Lаргинина как до начала кровопотери, так и после нее в составе инфузионной среды способствовало значительному росту УО и МОК. Причем, в большей степени оказывал положительное воздействие донор NО, вводимый после кровопотери в составе инфузионной среды. РИЛЖ, резко сниженный в результате кровопотери, возрастал во всех экспериментах, но менее всего – в контроле. L-аргинин способствовал достоверно большему увеличению РИЛЖ по сравнению с инфузией только кровезаменителя. ОПС после проведения инфузионной терапии уменьшалось. Самым низким оно было в результате введения L-аргинина в состав инфузионной среды. L-аргинин способствовал лучшему восстановлению скорости кровотока и обладал выраженным дезагрегирующим действием. Таким образом, введение L-аргинина как до начала кровопотери, с последующим введением солевого кровезаменителя (изотонический раствор натрия хлорида), так и после ее окончания в составе инфузионой среды значительно повышает эффективность проводимой инфузионной терапии геморрагического гемодинамики. шока и Полученные способствует нами восстановлению результаты согласуется системной с данными литературы [71, 94]. Известно благоприятное влияние L-аргинина на коронарное кровообращение, обусловленное увеличением содержания NO, дефицит которого играет существенную роль [43, 44]. Полагают, что защитное действие L-аргинина на сердце, возможно, связано и с тем, что аргинин, являющийся субстратом не только для NO-синтаз, но и для конкурирующего фермента – аргиназы [100, 138], защищает кардиомиоциты от действия 101 свободных радикалов [43, 44], поскольку через орнитин может превращаться в глютаминовую кислоту, обладающую антиоксидантным действием. Введение L-аргинина до кровопотери способствовало большему накоплению его в организме (в результате активации конкурирующей аргиназы только часть расходовалась на образование NO), что приводило к увеличению продукции NO и оказывало кардиопротекторный эффект, реализующийся в значительной степени за счет вазодилататорных реакций коронарных и периферических сосудов. Вероятно, при этом в эндотелиальных клетках происходило увеличение промежуточного продукта метаболизма аргинина – гидрокси-L-аргинина, который облегчает процессы окисления аргинина NOS и тормозит активность аргиназы [251], которая может значительно повышаться [138, 251]. Данные о состоянии МЦ показали, что КФК, резко сниженное в результате кровопотери, восстанавливалось после инфузионной терапии. Это восстановление было одинаковым во всех сериях экспериментов. Увеличивалась скорость кровотока в капиллярах. Введение L-аргинина после кровопотери в составе кровезаменителя способствовало полному восстановлению скорости кровотока и снижению количества агрегатов эритроцитов до нормы. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими об увеличении скорости кровотока, проходимости микроциркуляторного русла при геморрагическом шоке и инфузии L-аргинина [94]. Известно, что L-аргинин, введенный после травмы, кровопотери улучшает органный кровоток, значительно повышает сниженную функцию макрофагов [74, 105], снижает агрегацию тромбоцитов и уменьшает эндотелиальную адгезию моноцитов [5]. Исследования последних лет свидетельствуют о возможности эффективного и безопасного применения Lаргинина в клинической практике при риске сердечно-сосудистых заболеваний и при прекапиллярной легочной гипертензии, почечной патологии и др. [4, 47, 101]. 102 Анализ содержания газов в крови животных выявил, что рО2 после кровопотери незначительно увеличивалось, а рСО2 снижалось. В ходе экспериментов рО2 мало изменялось, что свидетельствовало о нормальной перфузии легочной ткани. В результате проведения инфузионной терапии наибольшая коррекция ацидоза отмечалась в экспериментах с введением Lаргинина в составе ФР. К окончанию инфузии дефицит буферных оснований уменьшился и у животных с предварительным введением донора NО. Известно, что аргинин как регулятор связывания макромолекул с клетками крови в высоких концентрациях снижает вязкость крови[4], может способствовать деполяризации мембран эндотелиоцитов и регулировать рН в этих клетках, а также в крови [40]. Приведенный экспериментальный материал свидетельствует о том, что Lаргинин, применяемый, как до начала кровопотери, так и введенный после кровопотери в составе инфузионной среды, улучшает работу сердца, восстанавливает МЦ, способствует коррекции ацидоза и обеспечивает восстановление периферического кровообращения, несмотря на снижение ОПС. Результаты экспериментов показали, что предпочтительнее вводить аргинин в составе инфузионной среды, а не предварительно до начала кровопотери, т.к. в этом случае, вероятно, в меньшей степени проявляется действие конкурирующей аргиназы. При применении аргинина в составе инфузионной среды (по сравнению с введением его до начала кровопотери) отмечалась значительная коррекция гемодинамики: в большей степени восстанавливались МОК и УО сердца, увеличивался РИЛЖ, возрастала скорость кровотока в капиллярах, и, несмотря на низкое ОПС, наблюдалось выраженное восстановление микроциркуляции. Можно полагать, что увеличение продукции NO из L-аргинина усиливало генерацию базального уровня NO и поддерживало нормальную перфузию жизненно важных органов. Все это способствовало увеличению количества выживших животных. Выживаемость в группе с предварительным (до кровопотери) введением L- 103 аргинина составляла 80%, при введении L-аргинина в составе инфузионной среды – 86%, что значительно выше, чем в контроле (54%). Известно, что при геморрагическом шоке активируется индуцибельная синтаза NO, под влиянием которой продуцируются избыточные количества NO, приводящие к воспалительным процессам после кровопотери [166]. Иными словами, NO, продуцируемый iNOS, может вносить вклад в органные повреждения при шоке [120, 237]. Образующийся в результате увеличения NO мощный окислитель мембран, нарушает пероксинитрит сосудистый вызывает повреждение клеточных эндотелий, увеличивает агрегацию тромбоцитов [238], что предопределяет необходимость снижения концентрации NO селективными ингибиторами NOS. В настоящей работе избыточную генерацию оксида азота при геморрагическом шоке уменьшали сочетанием изотонического раствора натрия хлорида с избирательными ингибиторами, в меньшей степени влияющими на eNOS. В качестве селективных ингибиторов синтеза оксида азота использовали производные лизина (L-NІL) и орнитина (LNІО), аминогуанидин и S-метилизотиол, которые вводили в сочетании с изотоническим раствором натрия хлорида в объеме, в два раза превышающем кровопотерю. Общая характеристика изменений изучаемых показателей системного кровообращения при инфузии изотонического раствора натрия хлорида и селективных ингибиторов синтеза оксида азота сводится к тому, что все они вызывают увеличение МОК и УО сердца (правда, в разной степени), тогда как АД и ОПС меняются неоднозначно. При действии S–метилизотиола в составе инфузионной среды при геморрагическом шоке АД и ОПС увеличивались, тогда как при введении L-NІL АД повышалось незначительно, не достигая исходных значений, а ОПС снижалось. Казалось бы, при введении ингибиторов ОПС не должно снижаться. Вероятно, селективное ингибирование избыточной продукции NO нормализовало его содержание и способствовало улучшению сердечной деятельности. МОК и УО сердца возрастали более всего при введении L-NІО, менее после инфузии S-метилизотиола. Возможно, S- 104 метилизотиол, ингибируя значительное количество NO, затрагивал активность конститутивной eNOS [35] и снижал базальный уровень оксида азота, что неблагоприятно при геморрагическом шоке. Состояние микроциркуляции в серозной оболочке стенки тонкого кишечника животных, линейная скорость кровотока и КФК изменялись однонаправлено при использовании всех четырех ингибиторов, но в разной степени и, несмотря на снижение ОПС, отмечалось восстановление МЦ. Скорость кровотока в капиллярах после инфузии увеличивалась во всех экспериментах, более всего, после сочетанного введения изотонического раствора натрия хлорида с L-NІL и аминогуанидином и менее всего – после инфузии S-метилизотиола. Рост КФК был наименьшим после введения Sметилизотиола, практически как в контроле. Число агрегатов эритроцитов также снизилось во всех сериях, причем, наиболее значительно в результате введения L-NIО и аминогуанидина, менее всего – после инфузии Sметилизотиола. Вероятно, L-NIО и аминогуанидин оказались достаточно селективны и способствовало ингибировали необходимое количество оксида азота, что уменьшению числа агрегатов эритроцитов при геморрагическом шоке. В результате наших исследований выявлены различия механизмов изменения гемодинамических параметров после введения селективных ингибиторов, а именно неодинаковое участие сердечного и сосудистого компонентов в восстановлении уровня АД. Повышение АД при инфузии изотонического раствора натрия хлорида в сочетании с S-метилизотиолом обеспечивалось преимущественно за счет сосудистого компонента, поскольку ОПС несколько повышалось, а величины МОК и УО восстанавливались в меньшей степени, чем при использовании L-NІL, L-NІО и аминогуанидина. При инфузии S–метилизотиола наблюдалась наиболее выраженная централизация кровообращения, о чем свидетельствуют довольно высокие значения АД и возрастание ОПС. В наших начальных исследованиях отмечалось усиление централизации кровообращения при использовании 105 неселективного ингибитора синтеза оксида азота (NW-нитро-L-аргинина), что позволяет сделать заключение о меньшей селективности S-метилизотиола по сравнению с L-NІL, L-NІО и аминогуанидином. S-метилизотиол, являясь менее селективным ингибитором, ингибирует не только индуцибельную, но и конститутивную синтазу, что нежелательно при геморрагическом шоке, так как нарушается перфузия ряда органов и тканей. Инфузия менее селективного ингибитора S-метилизотиола свидетельствует о необходимости при геморрагическом шоке базального уровня оксида азота, т.к. оксид азота позволяет сохранить кровоток в жизненно важных органах. Это еще раз подтверждает полученные нами данные о роли NO в централизации кровообращения при геморрагическом шоке. Однако не следует игнорировать и частичное участие сердечного компонента при инфузии S-метилизотиола, поскольку (под влиянием его введения) через 10 мин после окончания инфузии МОК и УО все же достигали исходных величин. При введении S-метилизотиола происходит умеренная централизация кровообращения, при которой улучшается кровоток в тканях с уменьшением гипоксии. Вероятно, участие сосудистого компонента по сравнению с сердечным недостаточно эффективно для восстановления перфузии тканей при инфузионной терапии геморрагического шока. Под влиянием L-NІL в составе инфузии АД восстанавливалось в той же мере, что и в контроле, но показатели сердечной деятельности улучшались значительно. Особенно выражено участие сердечного компонента в экспериментах с L-NІО и аминогуанидином, где зарегистрировано повышение АД и высокие УО и МОК. Расчет РИЛЖ в этих экспериментах свидетельствует о том, что он значительно возрастал и даже превышал исходные значения. Следовательно, увеличение ударного объема было вызвано, скорее всего, усилением сократительной активности миокарда. Известно, что избыток оксида азота неблагоприятно влияет на коронарный кровоток и сократительную активность миокарда [151]. Согласно литературным данным, значительным источником NO во время циркуляторного шока в сердечной мышце может 106 являться митохондриальная изоформа синтаз [89, 112]. Известно, что NO угнетает функцию митохондрий [112, 114]. Возможно, усиление работы сердца, выявленное в наших экспериментах под влиянием селективных ингибиторов, связано с улучшением функции митохондриального аппарата клеток миокарда (активацией процессов тканевого дыхания в кардиомиоцитах). Показатели КОС и содержания газов в артериальной крови животных во всех сериях опытов не отличались. Можно лишь отметить, что дефицит буферных оснований уменьшался более заметно после использования L-NΙО. При инфузионной терапии геморрагического шока у животных селективные ингибиторы L-NΙО и аминогуанидин оказались более активными по сравнению с L-NΙL и S-метилизотиолом, что позволяет говорить об их высокой селективности при использовании на данной модели геморрагического шока. Согласно данным литературы, все селективные ингибиторы практически в той или иной степени неселективны, т.е. могут частично угнетать и конститутивную синтазу оксида азота. Авторы [33] предлагают для определения изоформенной селективности ингибиторов разделить их на неселективные (превышение активности одной изоформы к другой менее чем в 10 раз, например в нашем случае NG-нитро-L-аргинин), частично селективные (превышающие в 10-50 раз, L-NΙL и аминогуанидин) и селективные (превышающие более чем в 50 раз). Результаты наших экспериментов показали, что селективное ингибирование избыточной продукции NO при геморрагическом шоке L-NΙL, L-NΙО и аминогуанидином оказалось благоприятным, вероятно, оно не затрагивало eNOS. Таким образом, избирательные ингибиторы синтеза NO, снижая его генерацию при инфузионной терапии геморрагического шока, улучшают деятельность сердечно-сосудистой системы, вероятно, за счет увеличения коронарного кровотока и как следствие, сократительной активности миокарда, восстанавливают МЦ несмотря на сниженное ОПС. Ингибиторы с большей степенью селективности способствуют высокой выживаемости. Об этом свидетельствуют данные о продолжительности жизни животных: 100% после 107 введения L-NΙО и аминогуанидина, 67% после введения L-NΙL, в то время как в контроле (инфузия только солевого раствора) – 54% . После введения менее селективного ингибитора S-метилизотиола выживаемость животных была даже меньшей, чем в контроле – 44%. Следовательно, оксид азота, несомненно, играет важную роль в регуляции кровообращения при геморрагическом шоке. Предварительное введение регуляторов синтеза оксида азота существенно изменяет развитие массивной кровопотери. Полученные данные позволяют полагать, что на ранних стадиях геморрагического шока продукция оксида азота носит защитный характер. Подавление генерации оксида азота неселективными ингибиторами его синтеза вызывает чрезмерную централизацию кровообращения, которая может привести к повреждению органов и тканей и ранней гибели животных. Необходимость поддержания “ базального уровня” оксида азота подтверждается нашими исследованиями с предварительным введением донора NO L-аргинина, а также данными с применением относительно селективного ингибитора S-метилизотиола. Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что при инфузионной терапии геморрагического шока необходимо эндотелийзависимое регулирование сосудистого тонуса. L-аргинин, как донор NO, можно рекомендовать при геморрагическом шоке в клинической практике для улучшения деятельности сердечно-сосудистой системы. При введении Lаргинина с инфузионной средой восстанавливается МОК, и это происходит не в результате изменения частоты сердечных сокращений, а благодаря увеличению ударного объема сердца, т.е. усиливается сократительная активность миокарда. Кроме того, L-аргинин увеличивает скорость кровотока в капиллярах. Lаргинин, с нашей точки зрения, можно рассматривать как перспективное средство для применения как в предоперационном периоде, так и при инфузионной терапии геморрагического шока. Результаты экспериментов позволили выявить высокую эффективность избирательных ингибиторов NO при инфузионной терапии геморрагического шока. Большинство из них, 108 регулируя содержание оксида азота при кровопотере и шоке, селективно уменьшают избыток NO. Полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей [203], показавших, что применение при геморрагическом шоке селективных ингибиторов iNOS вызывает рост сердечного выброса, увеличение венозного возврата крови, а также сохранение почечного кровотока, скорости фильтрации, защиту от органных повреждений и увеличение выживаемости экспериментальных животных [170, 203]. Таким образом, проведенные нами эксперименты и полученные результаты, позволяют выяснить роль оксида азота при геморрагическом шоке и открывают новые терапевтические возможности повышения эффективности инфузионной терапии шока регуляторами синтеза оксида азота. 109 ВЫВОДЫ 1. При геморрагическом шоке происходит изменение содержания оксида азота в органах и тканях крыс по сравнению со здоровыми животными. Отмечается раннее и значительное усиление генерации оксида азота в тканях печени и почек. 2. Неселективный ингибитор синтеза оксида азота NW-нитро-L-аргинин, введенный до начала кровопотери, снижая продукцию оксида азота, приводит к росту АД, метаболизма выраженным и быстрой нарушениям гибели микроциркуляции, животных, что расстройствам свидетельствует о необходимости сохранения базального уровня оксида азота для адекватной перфузии тканей при геморрагическом шоке. 3. Донор оксида азота L-аргинин сохраняет базальный уровень оксида азота при геморрагическом шоке, задерживая нарушения микроциркуляции и уменьшая степень централизации кровообращения. 4. Введение L-аргинина до начала кровопотери с инфузией солевого раствора по окончании кровопотери повышает устойчивость животных к геморрагическому шоку. L-аргинин, вводимый в составе солевого раствора после кровопотери, способствует улучшению работы сердца, увеличению рабочего индекса левого желудочка и восстановлению микроциркуляции, в результате чего возрастает продолжительность жизни экспериментальных животных. L-аргинин можно рассматривать как перспективное средство предоперационной подготовки пациентов и в качестве лечебного средства для включения в схемы инфузионной терапии геморрагического шока. 5. Избирательные ингибиторы синтеза оксида азота, введенные после кровопотери с солевым раствором, существенно улучшают деятельность сердечно-сосудистой системы, что приводит к увеличению выживаемости. Более селективные ингибиторы оказывают более увеличивают продолжительность аминогуанидина и L-NΙО жизни выживаемость выраженный эффект, животных. крыс, кровопотерю, составляет 100% (в контроле 54%). При перенесших введении тяжелую 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алмакаева Л.Г, Литвинова Е.В. Аргинин и его применение в медицине и фармации // Лики Украины. – 2011. – №1(5). – С. 23-26. 2. Аполлонова Л.А. Острая кровопотеря и гипоксия: обоснование принципов инфузионной терапии // Патогенез. Гипоксия. – 2011. – №3. – С. 16. 3. Афендулов С.А., Журавлев Г.Ю. Переливание компонентов крови и кровезаменителей – Тамбов: Изд-во ТГУ, 2010. – С.48-57. 4. Бабушкина А.В. L-аргинин с точки зрения доказательной медицины // Укр. Мед. Журнал. – 2009. – №6(74). – С. 43–48. 5. Бабушкина А.В. Эффективность перорального применения L-аргинина у пациентов с эндотелиальной дисфункцией // Укр. Мед. Журнал. – 2010. – № 1(75). – С. 24-30. 6. Баландин В.В. Инфузионно-трансфузионная терапия в клинической медицине: руководство для врачей / В. В. Баландин, Г. М. Галастян, Е. С. Горобец; Под ред. Б. Р. Гельфанда.// М.: Мед. информ. Агентство, 2009. –256 с. 7. Барышев Б.А. Кровезаменители. Компоненты крови: справочник для врачей – СПб: Изд. Н-Л, 2010. – 204с. 8. Билецкий С.В. , Билецкий С.С. Эндотелиальная дисфункция и патология сердечно-сосудистой системы // Внутренняя медицина. – 2008. – № 2 (8). – С. 36-41. 9. Братищев И.В. аутогемотрансфузии Методика в практике интраоперационной аппаратной анестезиолого-реанимационных бригад// Клиническая анестезиология и реаниматология. – 2007. – №4. – С. 35-38. 10. Ванин А.Ф. Оксид азота – регулятор клеточного метаболизма // Соровский образовательный журнал. – 2001. – №11. – С. 7-12. 11. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа эндогенные сигнальные агенты в клетках и тканях животных и человека (Гипотеза) // Биофизика. – 2004. – Т.49, №4.– С. 581-568. 12. Верховский Ю.Г. Синтез и отбор новых ингибиторов продукции биогенного оксида азота/ Ю.Г. Верховский, Н.Б. Борышева, Г.А. Лушникова и 111 др./ Труды Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. – Калуга. – 2008. – Вып. 13. – С. 254-265. 13. Верховский Ю.Г. Исследование связи между структурой и NOSингибирующей активностью S-замещенных производных изотиомочевины и обоснование нового направления в создании на их основе антигипотензивных средств широкого спектра действия/ Ю.Г. Верховский, О.Н. Боровая, Г.А. Лушникова и др. // Труды Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. – Калуга. – 2009. – Вып. 14. – С. 361-372. 14. Гиляревский С.Р. Применение нитратов при лечении сердечнососудистых заболеваний: роль изосорбида мононитрата // Трудный пациент. – 2006. – № 11. – С. 8-15. 15. Голубева Е.К. Оксид азота - регулятор внутриклеточных механизмов эритродиереза / Е.К.Голубева, Е.Е.Мясоедова, С.Б. Назаров и др. // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2004. – Т. 90, №8. – С. 144-145. 16. Гомазков О.А. Эндотелин в кардиологии: молекулярные, физиологические и патологические аспекты // Кардиология. – 2001. – №2. – С. 50-58. 17. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. – 360 с. 18. Граник В. Г. Метаболизм L-аргинина. // Хим-фарм. журн. – 2003. – №3. – С. 3–20. 19. Грибкова И.В., Шуберт Р., Серебряков В.П. NO активирует Ca2+ активируемый К+ ток гладкомышечных клеток хвостовой артерии крысы через GMP - зависимый механизм // Кардиология. –2002. – №8. – С. 34-37. 20. Гуревич М.А., Стуров Н.В. Дефицит оксида азота в поддержании сосудистого гомеостаза: роль мононитратов и проблемы цитопротекции // Трудный пациент. – 2006. – № 3. – С. 23-29. 21. Доровских В.А. Оксид азота в химии, биологии и медицине/ В.А. Доровских, Т.А. Баталова, А.А. Сергиевич и др. – Благовещенск: ГОУ ВПО АГМА, 2007. – 41с. 112 22. Еременко А.А. Оценка кислородного статуса у больных в критических состояниях // Неотложная медицина в мегаполисе: Науч. матер. межд. форума. – М., 2004. – С. 76-77. 23. Ефремов А.В., Самсонова Е.Н., микроциркуляции и периферического Начаров Ю.В. кровообращения – Нарушения Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2009. – 44 с. 24. Ефремов А.В., Самсонова Е. Н.,. Начаров Ю. В. Патофизиология. Основные понятия –М. : ГЭОТАР–Медиа, 2008. – 256 с. 25. Жаворонок Т.В. Нарушение окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях/ Т.В. Жаворонок, Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева и др.// Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. – № 12. – С. 10-14. 26. Замышляева, М.В., Тихомирова, И.А., Волков, Ю.Н. Реологические свойства крови у лиц с артериальной гипотонией // Вестник Костромского ГУ. – 2006. – Т. 12, №6. – С. 18 - 22. 27. Зинчук В.В., Глуткина Н.В. Кислородсвязывающие свойства гемоглобина и монооксида азота // Российский физиологический журнал– 2013. –№ 5. – С. 537-554. 28. Каламкаров Г.Р. Нитриты способны расширять сосуды при гипоксии и защищать сетчатку от ишемии/ Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева и др. // Докл. РАН. – 2007. –Т. 417, №2. – С. 263-264. 29. Киричук В.Ф. Оксид азота и микроциркуляторное звено системы гемостаза/ В.Ф. Киричук, Е.А. Андронов, А.Н. Иванов и др. //Успехи физиол. наук. – 2008. –Т. 39, №4. – С. 83-91. 30. Ковальская К.С., Мордвинцев П.И., Ванин А.Ф. Влияние кровопотери на содержание оксида азота в печени, слизистой оболочке и мышечном слое тонкой кишки крыс // Общая патология и пат. физиол. –1999. – Т.128, №8. – С. 153-156. 31. Коваленко Н.Я., Архипенко Ю.В., Мациевский Д.Д. Органоспецифические особенности кровоснабжения печени, почек и мозга при 113 острой кровопотере у крыс с различной устойчивостью к циркуляторной гипоксии // Пат. физиол. и экспер. терапия. – 2001. – № 2. – С. 20-22. 32. Козлов В.И. Гистофизиология системы микроциркуляции// Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2003. –Т. 2,№4 – С. 79-85. 33. Косенкова Ю.С., Половинка М.П., Салахутдинов Н.Ф. Ингибиторы NOсинтаз химический аспект проблемы// Химия в интересах устойчивого развития . – 2010. – № 18 – С. 669-690. 34. Костюченко С.С. Кислотно-щелочной баланс в интенсивной терапии – Минск: ОИТАР МОКБ, ГрГМУ, 2009. – 268с. 35. Кочетыгов Н.И. Влияние регуляторов синтеза оксида азота на гемодинамику при геморрагическом шоке в эксперименте/ Н.И. Кочетыгов, М.И. Ремизова, К.А. Гербут, Г.В. Гришина// Мед. Академ. журнал. – 2003. – №.3, приложение 4. – С. 133-134. 36. Кравченко Н.А., Ярмыш Н.В. Регуляция экспрессии эндотелиальной NOсинтазы и дисфункция сосудистого эндотелия при сердечно-сосудистой патологии// Цитология и генетика. – 2008. – №4. – С. 69-79. 37. Кузьков В. В., Киров М. Ю. Инвазивный мониторинг гемодинамики в интенсивной терапии и анестезиологии. – Архангельск: СГМУ, 2008. – 244 с. 38. Куликов А.М. Системная гемодинамика и микроциркуляция при лечении ожогового шока кровезамещающими растворами: Дис. канд. мед. наук. Л. – 1981. – 275с. 39. Львова О.А. К вопросу о роли оксида азота в норме и при патологи нервной системы / О.А. Львова, А.Е. Орлова, В.В. Гусев и др. // Эл. науч. журн.”Системная интеграция в здравоохранении” – 2010. – №4(10). – С. 20-34. 40. Малахов В.А. Проблема оксида азота в неврологи/ В.А. Малахов, А.Н. Завгородняя, В.С. Лычко и др. –Харьков, 2009.– 242 с. 41. Маколкин В.И. Микроциркуляция в кардиологии – М.: Визарт, 2004. – 135 c. 114 42. Максимович Н.Е., Маслаков Д.А. Аминокислота L- аргинин и перспективы ее использования в клинике// Здравоохранение . –2003. – №5. – С. 35-37. 43. Марков Х.М. L-аргинин - оксид азота в терапии болезней сердца и сосудов // Кардиология. – 2005. – № 6. – С. 87-95. 44. Марков Х.М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия // Патолог. физиология и эксперим. терапия. –2005. – № 4. – С .5-9. 45. Марцевич С.Ю. Современные взгляды на терапию нитратами больных ишемической болезнью сердца // Сердце: журнал для практикующих врачей. – 2003. – № 2(8). – С. 88-90. 46. Маянская С.Д. Артериальная гипертония и дисфункция эндотелия. / С.Д. Маянская, А.А. Попова, Н.Н. Маянская и др. //Вестник современной клинической медицины. – 2009. – Т. 2, № 3. – С. 43-47. 47. Медведь В.И. Долгожданный донатор оксида азота // Здоровье Украины. – 2009. – №13-14. – С. 62. 48. Мелкумянц А.М., Балашов С.А., Хаютин В.М. Регуляция просвета магистральных артерий в соответствии с напряжением сдвига на эндотелии // Физиолог. журн. – 1992. – №6. – С. 70-78. 49. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания/ Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. – Новосибирск: APTA, 2008. – 284 с. 50. Микоян В.Д. Протонирование нитрита необходимая стадия в процессе генерации оксида азота из нитрита в биосистемах/ В.Д. Микоян, Л.Н. Кубрина, Г.Н. Хачатрян, А.Ф. Ванин // Биофизика. – 2006. – Т. 51, вып.6. – С. 968-975. 51. Минушкина Л.O. Дисфункция эндотелия: связь с полиморфизмом гена рецептора (тип.1) ангиотензина II у больных ишемической болезнью сердца / Л.O. Минушкина, Д.А. Затейщиков, О.Ю. Кудряшова и др. // Кардиология. – 2000. – Т. 40, № 1. – С. 20-24. 52. Небиеридзе, Д.В. Микроциркуляторные расстройства при артериальной гипертонии и перспективы их коррекции /Д.В. Небиеридзе, Е.В. Шилова, С.Н. 115 Толпыгина // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2004. – № 4. – С. 28-32. 53. Недоспасов А.А., Беда Н.В. Биогенные оксиды азота// Природа. – 2005. – №7.– С. 35-42. 54. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов// Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 259-292. 55. Осадчий Л.И., Балуева Т.В., Сергеев И.В. Эндотелийзависимый механизм формирования реакций системной гемодинамики // Рос. физиол. журнал. – 2003. – Т. 89, № 7. – С. 810-816. 56. Парахонский А.П. Значение оксида азота в развитии патологии// Фундаментальные исследования. – 2007. – № 5 – С. 88-89 57. Петрищев, Н.Н. Дисфункция эндотелия: Причины, механизмы, фармакологическая коррекция – СПб. : Изд-во СПб ГМУ, 2003 – 181с. (С. 3234). 58. Писаренко О. И. Кардиопротекторный эффект динитрозильного комплекса железа с цистеином у крыс in vivo / О.И. Писаренко, Л.И. Серебрякова, О.В. Ткитишвили и др. // Известия РАН, серия «Биология». – 2008. – № 1. – С. 1–5. 59. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. – М.: изд-во РАМН, 2000 – 52с. 60. Покидышев Д.А. Роль оксида азота в развитии и предупреждении острой гипотензии при тепловом шоке / Д.А. Покидышев, В.Д. Микоян, Л.Н. Кубрина и др. // Дизрегуляционная патология органов и систем. ІІІ Российский конгресс по патофизиологии с международным участием: Москва. – 2004. – С.158. 61. Покровская Т.Г. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Кубанский науч. мед. вестн. – 2007. – №1-2. – С. 146-150. 116 62. Проскуряков С.Я. Структура, активность и биологические эффекты субстрат-подобных ингибиторов NO-синтаз / С.Я. Проскуряков, А.Г. Коноплянников, В.Г. Скворцов и др. // Биохимия. –2005 – Т. 70, № 1. – С. 14-32. 63. Пятакова Н.В., Северина И.С.Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме действия лекарственных средств.// Биомед. химия. – 2012. – Т.58, №1. – С. 32-42. 64. Ремизова М. И. Влияние динитрозильного комплекса железа с глютатионом как донора оксида азота на кровообращение у здоровых животных/ М. И. Ремизова, Н. И. Кочетыгов, К. А. Гербут, А. Ф. Ванин // Биофизика. – 2008. – Т. 53, № 5. – С. 867–873. 65. Ремизова М.И. Роль оксида азота в норме и при патологии // Вестн. Службы крови России. – 2000. – № 2. – С. 53-57. 66. Реутов В.П. Оксид азота (NO) и цикл NO в миокарде: молекулярные, биохимические и физиологические аспекты/ В.П. Реутов, В.Е. Охотин, А.В. Шуклин и др. // Успехи физиологических наук. – 2007. – Т.38, № 4. – С. 39-58. 67. Реутов В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности // Биохимия. – 2002. – Т. 67. – №3. – С. 353-376. 68. Сагач В.Ф. Роль оксида азота в регуляции кровообращения // В кн.: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск: Технопринт., 2003. – C. 110-113. 69. Сайфутдинов Р.Г. Роль оксида азота при заболевании внутренних органов. //Вестник современной клинической медицины. – 2009. – Т .2, № 3. – С. 48-53. 70. Салей А.П., Рецкий М.И. Роль оксида азота в формировании мотивационного поведения и обучения. //Вестник ВГУ. Серия химия, биология, фармация. – 2003. – №1. – С. 75–80. 71. Салей А.П., Вашанов Г.А., Мещерякова М.Ю. Роль оксида азота в регуляции гемодинамических показателей и метаболических функций печени//Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2009. – №2. – С. 129-135. 117 72. Салей А. П. Влияние аминогуанидина на некоторые функции печени/ А. П. Салей, О. И. Бахметьева, М. Ю. Мещерякова и др. //Физиология и психофизиология мотиваций: межрегион. сб. науч. работ. – Воронеж, 2008. – Вып. 9. – С. 41-47. 73. Сомова Л.М., Плехова Н.Г. Оксид азота как медиатор воспаления // Вестник ДВО РАН. – 2006. – №6. – С. 77-80. 74. Степанов Ю.М. Аргинин в медицинской практике./ Ю.М. Степанов, И.Н. Кононов, А.И. Журбина и др. // Журн. АМН Украины. – 2004 – №10(1). – С. 340-352. 75. Стокле Ж.-К. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов / Ж.-К. Стокле, Б. Мюлле, Р. Андрианцитохайна и др.// Биохимия. – 1998. – Т.63,в.7. – С.976-983. 76. Стуканов М.М. Оценка параметров гемостаза, электролитного и кислотно-щелочного баланса больных в состоянии геморрагического шока при использовании различных вариантов инфузионной терапии/ М.М. Стуканов, В.Н. Лукач, А.О. Гирш и др. // Хирургия. – 2011. – №5. – C. 51-55. 77. Тимошин А.А. Взаимосвязь образования оксида азота с повреждениями кардиомиоцитов при региональной ишемии и реперфузии сердца крысы/ А.А. Тимошин, О.В. Цкитишвили, Д.Ю. Дроботова и др. // Биофизика. – 2008. – Т.53, № 4. – С. 679-683. 78. Тимошин А.А. Динитрозильные комплексы железа с глутатионом в ткани миокарда крысы в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы/ А.А. Тимошин, О.И. Писаренко, О.В. Цкитишвили и др. // Биофизика. – 2010. – Т.55, № 6. – С. 1099-1107. 79. Тимошин А.А. Влияние экзогенных доноров на уровень оксида азота в органах животных in vivo: исследование методом микродиализа с использованием спиновых ловушек/ А.А. Тимошин, Д.Ю. Дроботова, В.Л. Лакомкин и др. // Сборник статей "Проблемы биологической физики" (Под ред. В.А.Твердислова). "УРСС", Москва. – 2010. – С. 107-124. 118 80. Тюренков И.Н., Воронков А.В. Изменение кровотока в различных сосудистых регионах при стимуляции и блокаде синтеза эндогенного оксида азота // Регион. кровооб. и микроцир. – 2006. – Т.5, №6. – С. 93-95. 81. Чернеховская Н.Е. Коррекция микроциркуляции в клинической практике/ Н.Е. Чернеховская, В.К. Шишло, А.В. Поваляев и др. – Изд-во: Бином, 2013. – 208 с. 82. Шамова Е. В. Регуляция функциональных и механических свойств тромбоцитов и эритроцитов донорами оксида азота/ Е. В. Шамова, О. Д. Бичан, И. В. Дрозд и др. // Биофизика. – 2011. – Т. 56. – С. 265-271. 83. Шок: Теория, клиника, организация противошоковой помощи / Под общ. ред. Г.С.Мазуркевича, С.Ф. Багненко. – СПб. : Политехника, 2004. – 539 с. 84. Шпектор В. А. Гипоксия глазами клинициста (терминология, классификация) // Вестник интенсивной терапии. – 2007. – №1. – C. 12-15. 85. Aga R.G., Hughes M.N. The preparation and purification of NO gas and the use of NO releasers: the application of NO donors and other agents of nitrosative stress in biological systems. // Methods Enzymol. – 2008. – V. 436. – P. 35-48. 86. Agani F.H. Role of nitric oxide in the regulation of HIF-1α expression during hypoxia/ F.H. Agani, M. Puchowicz, J.C. Chavez et al.// Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2002. – V. 283 – P. 178-186. 87. Alderton W.K. Cooper C.E, Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition // J.Biochem. – 2001. – V. 357. – P. 593-615. 88. Allen B.W., Piantadosi C.A. How do red blood cells cause hypoxic vasodilation? The SNO-hemoglobin paradigm// Am J Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2006. – V. 291(4). – H. 1507-1512 89. Alvarez S. Oxygen dependence of mitochondrial nitric oxide synthase activity/ S. Alvarez, L.B. Valdez, T. Zaobornyj et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2003. – V. 305. – P. 771-775. 90. Anaya-Prado R. Ischemia/Reperfusion Injury /R. Anaya-Prado, L.H. ToledoPereyra, A.B. Lentsch et al. //J .Surg. Res. – 2002. – V. 105 – P. 248–258. 119 91. Anaya-Prado R. The attenuation of hemorrhage-induced liver injury by exogenous nitric oxide, L-arginine, and inhibition of inducible nitric oxide synthase/ R. Anaya-Prado, L.H. Toledo-Pereyra, R.F. Guo et al. // J. Invest. Surg. – 2003. – V. 16. (5) – P. 247-261. 92. Anaya-Prado R. Exogenous nitric oxide donor and related compounds protect against lung inflammatory response after hemorrhagic shock and resuscitation/ R. Anaya-Prado, L.H. Toledo-Pereyra, J. Walsh et al. // Journal of Trauma. – 2004. – V. 57(5). – P. 980–988. 93. D'Annunzio V. Diastolic function during hemorrhagic shock in rabbits/ V. D'Annunzio , M. Donato , A. Fellet et al. // Mol Cell Biochem. – 2012. – V. 359(1-2). – P. 169-76. 94. Arora T.K. L-Arginine infusion during resuscitation for hemorrhagic shock: impact and mechanism/ T.K. Arora, A.K. Malhotra, R. Ivatury et al. // The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. – 2012. – V. 72, № 2. – P. 397-402. 95. Atkins JL, Johnson KB, Pearce FJ. Cardiovascular responses to oxygen inhalation after hemorrhage in anesthetized rats: hyperoxic vasoconstriction// Am J Physiol. Heart Circ Physiol. – 2007. – V. 292(2). – H. 776-785. 96. Azarov I. Nitric oxide scavenging by red blood cells as a function of hematocrit and oxygenation/ I. Azarov, K.T. Huang, S. Basu et al. // J Biol. Chem. – 2005. – V. 280 – P. 39024–39032. 97. Ba Z.F. Alterations in tissue oxygen consumption and extraction after trauma and hemorrhagic shock/ Z.F. Ba, P. Wang, D.J. Koo et al. //Crit Care Med. – 2000. – V. 28(8). – P. 2837-2842. 98. Bai Y. Increase in fasting vascular endothelial function after short-term oral Larginine is effective when baseline flow-mediated dilation is low: a meta-analysis of randomized controlled trials/ Y. Bai, L. Sun, T. Yang et al. // Am. J. Clin. Nutr. – 2009 – V. 89(1). – P. 77–84. 99. Balaszczuk A.M. Nitric oxide synthases are involved in the modulation of cardiovascular adaptation in hemorrhaged rats/ A.M. Balaszczuk, N.D. Arreche, M. Mc Laughlin et al. // Vascular Pharmacology. – 2006. – V. 44, № 6 – P. 417–426. 120 100. Bachetti T. Arginase pathway in human endothelial cells in pathophysiological conditions/ T. Bachetti, L. Comini, G. Francolini et al. //J. Mol. Cell. Cardiol. – 2004. – V. 37. – P. 515-523. 101. Bennett-Richards K.J. Oral L-arginine does not improve endothelial dysfunction in children with chronic renal failure / K.J. Bennett-Richards, M. Kattenhorn, A.E. Donald et al. // Kidney Int. –2002. – V. 62(4). – P. 1372–1378 102. Bernatova I. Chronic low-dose L-NAME treatment increases nitric oxide production and vasorelaxation in normotensive rats / I. Bernatova, J. Kopincova, A. Puzserova et al. // Physiol. Res. – 2007. – V. 56, Suppl 2. – P. 17-24. 103. Blecher K. Nitric oxide-releasing nanoparticles accelerate wound healing in NOD-SCID mice/ K. Blecher, L.R. Martinez, C. Tuckman-Vernon et al. //Nanomedicine. – 2012. – №8. – P. 1364-1371. 104. Bode-Boger S.M., Kojda G. Organic nitrates in cardiovascular disease//Cell Mol Biol. – 2005 –V. 51(3). – P. 307–320. 105. Böger R.H. The pharmacodynamics of L-arginine // J. Nutr. – 2007. – V. 137 – 1650S-1655S. 106. Böger G.I. Asymmetric dimethylarginine determines the improvement of endothelium-dependent vasodilation by simvastatin: effect of combination with oral L-arginine/ G.I. Böger, T.K. Rudolph, R. Maas et al. // J. Am. Coll. Cardiol. – 2007. – V. 49(23). – P. 2274–2282. 107. Borutaite V., Brown G.C. S-nitrosothiols inhibition of mitochondrial complex I causes a reversible increase in mitochondrial hydrogen peroxide production. // Biochim. Biophys. Acta. – 2006. – V. 17(57), №5-6. – P. 562-566. 108. Booz GW. PARP inhibitors and heart failure—Translational medicine caught in the act// Congest Heart Fail. – 2007. – V. 13 – P. 105-112. 109. Bredt D. S. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and pathophysiology//Free Radic Res. – 1999. – V. 31(6). – P. 577-596. 110. Brindicci C. Effect of an inducible nitric oxide synthase inhibitor on differential flow-exhaled nitric oxide in asthmatic patients and healthy volunteers/ C. Brindicci, K. Ito, P.J. Barnes et al. // Chest. – 2007. – V. 132. – P. 581-588. 121 111. Broere A. Human renal and systemic hemodynamic, natriuretic, and neurohumoral responses to different doses of L-NAME/ A. Broere, A.H. Van Den Meiracker, F. Boomsma et al. // Am. J. Physiol. – 1998. – V. 275, № 2. – H. 870877. 112. Brown G.S. Nitric oxide and mitochondria // Frontiers in Bioscience. – 2007. – V. 12. – P. 1024-1033. 113. Вryan N.S. , Bian K., Murad F. Discovery of the nitric oxide signaling pathway and targets for drug development // Frontiers in Bioscience. – 2009. – V. 14. – P. 1-18. 114. Buerk DG. Nitric oxide regulation of microvascular oxygen// Antioxid Redox Signal. – 2007. –V. 9 – P. 829-843. 115. Cabrales P. Reversal of Hemoglobin-Induced Vasoconstriction with Sustained Release of Nitric Oxide/ P. Cabrales, G. Han, P. Nacharaju et al. // Am J Physiol. Heart Circ Physiol. – 2011. – V. 300(1). – H 49-56. 116. Cabrales P, Tsai AG, Intaglietta M. Exogenous nitric oxide induces protection during hemorrhagic shock//Resuscitation. – 2009. – V. 80 (6). – P. 707-712. 117. Cabrales P, Tsai AG, Intaglietta M. Microvascular pressure and functional capillary density in extreme hemodilution with low and high plasma viscosity Hbbased and O2 carrier//Am J Physiol. Heart Circ Physiol. – 2004. – V. 287(1). – H 363-373. 118. Calvert JW, Lefer DJ. Clinical translation of nitrite therapy for cardiovascular diseases//Nitric Oxide. – 2010. – V. 22(2) – P. 91-97. 119. Cachofeiro V. Renal dysfunction after chronic blockade of nitric oxide synthesis / V. Cachofeiro, L.A. Fortepiani, J. Navarro-Cid et al. // Antioxid. Redox. Signal. – 2002. – V. 4, № 6. – P. 885-891. 120. Сauwels A. Nitric oxide in shock // Kidney Int. – 2007. – V. 72, №5. – P. 557565. 121. Chatterjee A, Catayas J.D. Endothelial nitric oxide (NO) and its pathophysiologic regulation // Vascul. Pharmacol. – 2008. – V. 49 (4–6). – P. 134– 140. 122 122. Chattopadhyay P. L-arginine protects from pringle manoeuvere of ischemiareperfusion induced liver injury/ P. Chattopadhyay , N. Verma , A. Verma et al.// Biol. Pharm Bull. – 2008. – V. 31(5). – P. 890-892. 123. Chen K., Popel A.S. Theoretical analysis of biochemical pathways of nitric oxide release from vascular endothelial cells // Free Radic. Biol. Med. – 2006. – V. 41, №4. – P. 668-680. 124. Chen K., Pittman R. N., Popel A. S. Hemorrhagic shock and nitric oxide release from erythrocytic nitric oxide synthase: A quantitative analysis// Microvasc Res.– 2009. – V. 78(1). – P.107-118. 125. Chen K, Popel AS. Vascular and perivascular nitric oxide release and transport: biochemical pathways of neuronal nitric oxide synthase (NOS1) and endothelial nitric oxide synthase (NOS3)// Free Radic Biol. Med. – 2007. – V. 42 –P. 811-822. 126. Chen X. A model of NO/O2 transport in capillary-perfused tissue containing an arteriole and venule pair/ X. Chen, D.G. Buerk, K.A. Barbee et al.// Ann Biomed Eng. – 2007 b. – V. 35. – P. 517–529. 127. Collins JL. Characterization of the expression of inducible nitric oxide synthase in rat and human liver during hemorrhagic shock/ J.L. Collins, Y. Vodovotz, C. Hierholzer et al. // Shock. – 2003. – V. 19. – P. 117–122. 128. Cooper C.E., Mason M.G., Nicholls P. A dynamic model of nitric oxide inhibition of mitochondrial cytochrome c oxidase // Biochim. Biophys. Acta. – 2008. – V.1777. – P. 867-876. 129. Cooke J.P. ADMA: its role in vascular disease // Vase. Med. – 2005. – V. 10, Suppl 1. – P. 11-17. 130. Deanfield J.E., Halcox J.P., Rabelink T.J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance//Circulation. – 2007. – V. 115. – P. 1285– 1295. 131. Deonikar P., Kavdia M. A computational model for nitric oxide, nitrite and nitrate biotransport in the microcirculation: Effect of reduced nitric oxide 123 consumption by red blood cells and blood velocity/ Microvascular Research. – 2010. – V 80( 3) – P. 464–476 132. Denizbasi A. Role of nitric oxide in gastric injury induced by hemorrhagic shock in rats/ A. Denizbasi, C. Yegen, M. Ozturk et al.//Pharmacology. – 2000. – V. 61. – P. 106-112. 133. McDonald M. Tyrphostin reduces the organ injury in haemorrhagic shock: role of inducible nitric oxide synthase/ McDonald M., M. Abdelrahman, S. Cuzzocrea et al. //Resuscitation. –2003. – V. 58(3). – P. 349-361. 134. McDonald M.C. A novel, potent and selective inhibitor of the activity of inducible nitric oxide synthase (GW 274150) reduces the organ injury in hemorrhagic shock/ McDonald M.C., M. Izumi, S. Cuzzocrea et al. // J. Physiol. Pharmacol. – 2002. – V. 53, №12. – P. 555-569. 135. Donato A. Vascular endothelial dysfunction with aging: endothelin-1 and endothelial nitric oxide synthase/ A. Donato, L. Gano, I. Eskurza et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2009. – V. 297. – P. 425-432. 136. Douzinas E.E. The effect of hypoxemic resuscitation from hemorrhagic shock on blood pressure restoration and on oxidative and inflammatory responses/ E.E. Douzinas, O. Livaditi, I. Andrianakis et al. //Intensive Care Med. – 2008. – V. 34. – P. 1133-1141. 137. Douzinas E.E. Hypoxemic resuscitation from hemorrhagic shock prevents lung injury and attenuates oxidative response and IL-8 overexpression/ Douzinas E.E., Betrosian A., Giamarellos-Bourboulis E.J. et al. // Free Radic Biol Med. – 2011. – V. 50. – P. 245-253. 138. Durante W., Johnson F.K., Johnson R.A. Arginase: a critical regulator of nitric oxide synthesis and vascular function//Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2007. – V. 34. – P. 906-911. 139. Duvall W.L. Endothelial dysfunction and antioxidants // Mt. Sinai J. Med. – 2005. – V. 72, № 2. – P. 71-80. 124 140. El-Farra NH, Christofides PD, Liao JC. Analysis of nitric oxide consumption by erythrocytes in blood vessels using a distribuёted multicellular model// Ann Biomed Eng. – 2003. – V. 31. – P. 294-309. 141. Erdely A. Resistance to renal damage by chronic nitric oxide synthase inhibition in the Wistar-Furth rat / A. Erdely, G. Freshour, C. Baylis // Am. J. Physiol. Regulatory. Integrative. Сomp. Physiol. – 2006. – V. 290, № 1. – P. 66-72. 142. Evgenov OV, Liaudet L. Role of nitrosative stress and activation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 in cardiovascular failure associated with septic and hemorrhagic shock// Curr Vasc Pharmacol. – 2005. – V. 3. – P. 293-299. 143. Ferdinandy P., Schulz R. Nitric oxide, superoxide and peroxinitrite in myocardial ischemia-reperfusion injury and preconditioning // Br. L. Pharmacol. – 2003. – V. 138. – P. 532-542. 144. Frankel D.A. Physiologic response to hemorrhagic shock depends on rate and means of hemorrhage/ D.A. Frankel, J.A. Acosta, D.J. Anjaria et al. // J Surg Res. – 2007. – V. 143. – P. 276-280. 145. Friedman A.J. Improved antimicrobial efficacy with nitric oxide releasing nanoparticle generated S‐nitrosoglutathione/ A.J. Friedman, K. Blecher, D. Schairer et al. //Nitric Oxide. – 2011. – V. 25. – P. 381-386. 146. Fleming I, Busse R. Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase//Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. – 2003. – V. 284. – P. 1-12. 147. Flögel U. Myoglobin: a scavenger of bioactive NO/ U. Flögel, M.W. Merx, A. Gödecke et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. – 2001. – V. 98, № 2. – P. 735-740. 148. Forstermann U. Nitric oxide and oxidative stress in vascular disease// Pflügers Archiv. – 2010. –V. 459, №. 6. – P. 923-939. 149. Friedman A, Friedman JM. Novel Biomaterials for the Sustained Release of Nitric Oxide: Past, Present, and Future // Expert Opin Drug Deliv. – 2009. – V. 6(10). – P. 1113-1122. 125 150. Fukai T. Extacellular superoxide dismutase and cardiovascular disease / T. Fukai, R.J. Folz, U. Landmesser et al. // Cardiovasc. Res. – 2002. – V. 55. – P. 239249. 151. Furchgott R.F. Endothelium-derived relaxing factor: discovery, early studies, and identification as nitric oxide // Biosci. Rep. – 1999. – V. 19, № 4. – P. 235 -251. 152. Gates P.E. Impaired flow-mediated dilation with age is not explained by Larginine bioavailability or endothelial asymmetric dimethylarginine protein expression/ P.E. Gates, M.L. Boucher, A.E. Silver et al. // J. Appl. Physiol. – 2007. – V. 102. – P. 63-71. 153. Gladwin M. T. The emerging biology of the nitrite anion/ M. T. Gladwin, A. N. Schechter, D. B. Kim-Shapiro et al. //Nat Chem Biol. – 2005. – V. 1(6). – P. 308– 314. 154. Gladwin MT. Does eNOS stand for erythrocytic NO synthase? // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 2595-2596. 155. Glantzounis G.K. Formation and role of plasma S-nitrosothiols in liver ischemia-reperfusion injury/ G.K. Glantzounis, S.A. Rocks, H. Sheth et al. // Free Radic Biol Med. – 2007. – V. 42. – P. 882-892. 156. Gornik H.L., Creager M.A. Arginine and endothelial and vascular health // J. Nutr. – 2004. – V. 134, № 10. – P. 2880-2887. 157. Gutierrez G, Reines HD, Wulf-Gutierrez ME. Clinical review: hemorrhagic shock//Crit Care. – 2004. – V. 8. – P.373-381. 158. Graziani G, Szabo C. Clinical perspectives of PARP inhibitors// Pharmacol Res. – 2005. – V. 52. – P. 109-118. 159. Goldstein S., Merenyi G. The chemistry of peroxynitrite: implication for biological activity // Methods in Enzymology. – 2008. – V. 436. – P. 49-61. 160. Han G, Friedman AJ, Friedman JM. Nitric oxide releasing nanoparticle synthesis and characterization//Methods Mol Biol. – 2011. – V. 704. – P. 187-195. 161. Hatoum Abu O. Continuous fluid resuscitation for treatment of uncontrolled hemorrhagic shock following massive splenic injury in rats/ Abu O. Hatoum, Y. Bashenko, M. Hirsh et al. //Shock. – 2002. – V. 6. – P. 574-579, 126 162. He T. Inducible nitric oxide synthase mediates hypoxia-induced hypoxiainducible factor-1 alpha activation and vascular endothelial growth factor expression in oxygen-induced retinopathy/ T. He, M. Ai, X.H. Zhao et al. //Pathobiology. – 2007. – V. 74. – P. 336-343, 163. Herold S, Exner M, Nauser T. Kinetic and mechanistic studies of the NO*mediated oxidation of oxymyoglobin and oxyhemoglobin// Biochemistry. – 2001. – V. 40. – P. 3385-3395. 164. Heffernan K.S., Fernhall B. Hemodynamic and vascular response to resistance exercise with L-arginine//Med. Sci. Sports Exerc. – 2009. – V. 41. – P. 773-779. 165. Hierholzer C, Billiar TR. Molecular mechanisms in the early phase of hemorrhagic shock// Langenbecks Arch Surg. – 2001. – V. 386. – P.302-308. 166. Hierholzer C. Inducible nitric oxide promotes intestinal inflammation following hemorrhagic shock/ C. Hierholzer, J.C. Kalff, T.R. Billiar et.al. // Am. J. Phisiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2004. – V. 286, №2. – P. 225- 233. 167. Hilarius P.M. Human erythrocytes contain negligible amounts of endothelial type NO synthase (eNOS): Abstracts of the Second International Meeting of the Role of Nitrite in Physiology/ P.M. Hilarius, P.T. Goedhart, C. Ince et al. // Pathophysiol Therapeut. – 2007. – P. 90-91. 168. Hines I.N. Endothelial nitric oxide synthase protects the post-ischemic liver: potential interactions with superoxide/ Hines I.N., Harada H., Flores S. et al. //Biomed Pharmacother. – 2005. – V. 59. – P. 183-189. 169. Hines IN, Grisham MB. Divergent roles of superoxide and nitric oxide in liver ischemia and reperfusion injury. //J Clin Biochem Nutr. – 2011. – V. 48(1). – P.5056. 170. Hua TC, Moochhala SM. Influence of L-arginine, aminoguanidine, and NGnitro-L-arginine methyl ester (L-name) on the survival rate in a rat model of hemorrhagic shock// Shock. – 1999. – V. 11(1). – P.51-57. 171. Hummel S.G. Nitric oxide as a cellular antioxidant: A little goes a long way / S.G. Hummel, A.J. Fischer, S.M. Martin et al. // Free Radic. Biol. Med. – 2006. – V. 40. – P. 501-506. 127 172. Ignarro L. J. Nitric oxide: Biology and Pathobiology. Academic Press. – 2009. – P.139-154. 173. Jagtap P, Szabo C. Poly (ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors// Nat Rev Drug Discov. – 2005. – V. 4. – P. 421–440. 174. Jones S.P. Endothelial nitric oxide synthase overexpression attenuates myocardial reperfusion injury/ S.P. Jones, J.M. Greer., A.K. Kakkar et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003. – V. 286. – H. 276-282. 175. Jones SP, Bolli R. The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection.// J Mol Cell Cardiol. – 2006. – V. 40. – P. 16-23. 176. Kan W. Lung, spleen, and kidney are the major places for inducible nitric oxide synthase expression in endotoxic shock: role of p38 mitogen-activated protein kinase in signal transduction of inducible nitric oxide synthase expression/ W. Kan, K.S. Zhao, Y. Jiang et al. //Shock. – 2004. – V. 21. – P. 281–287. 177. Kan W.H. Selective inhibition of iNOS attenuates trauma- hemorrhage/resuscitation-induced hepatic injury/ W.H. Kan, J.T. Hsu, M.G. Schwacha et al. // J Appl Physiol. – 2008. – V. 105. – P. 1076-1082. 178. Katsumi H. Development of nitric oxide donors for the treatment of cardiovascular diseases / H. Katsumi, M. Nishikawa, M. Hashida // Cardiovasc. Hematol. Agents. Med. Chem. – 2007. – V. 5, № 3. – P. 204-208. 179. Kavdia M, Popel AS. Wall shear stress differentially affects NO level in arterioles for volume expanders and Hb-based O2 carriers// Microvasc Res. – 2003. – V. 66. – P. 49–58. 180. Kellum JA. Clinical review: reunification of acid-base physiology// Crit Care. – 2005. – V. 9. – P. 500-507. 181. Kiang JG, Tsen KT. Biology of hypoxia// Chin J Physiol. – 2006. – V. 49. – P. 223-233. 182. Kim-Shapiro DB, Schechter AN, Gladwin MT. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics//Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2006. – V. 26(4). – P. 697-705. 128 183. Kleinbongard P. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase/ P. Kleinbongard, R. Schulz, T. Rassaf et al. // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 2943-2951. 184. Kline J.A. Heart function after severe hemorrhagic shock/ J.A. Kline, L.R. Thornton, G.D. Lopaschuk et al. //Shock. – 1999. – V. 12(6). – P. 454–461. 185. Krausz M.M., Amstislavsky T., Bitterman H. The effect of nitric oxide synthase inhibition on hypertonic saline treatment of controlled hemorrhagic shock // Shock. – 1997. – V. 8, № 6. – P.422-426. 186. Kumar R., Singh V.P., Baker K.M. The intracellular renin-angiotensin system: implications in cardiovascular remodeling // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2008. – V. 17, № 2. – P. 168-173. 187. Landmesser U., Harrison D.G., Drexler H. Oxidant stress a major cause of reduced endothelial nitric oxide availability in cardiovascular disease // Eur. J. Clin. Pharmacol. – 2006. – V. 62, Suppl 13. – P. 13-19. 188. Lee C.I., Liu X., Zweier J.L. Regulation of xanthine oxidase by nitric oxide and peroxynitrite // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275, №13. – P. 9369-9376. 189. LeeC. L-arginine supplementation reduces cardiac noradrenergic neurotransmission in spontaneously hypertensive rats/ C. Lee, D. Li, K. Channon et al. // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2009. – V. 47. – P. 149-155. 190. Lepore D.A. Nitric oxide synthase-independent generation of nitric oxide in muscle ischemia-reperfusion injury // Nitric oxide: biology and chemistry. – 2000. – V. 4, № 6. – P. 541-545. 191. Levy A.S. Nitric oxide and coronary vascular endothelium adaptations in hypertension/ A.S. Levy, JC.S. Chung, J.T. Kroetsch et al. // Vascular Health and Risk Management. – 2009. – V. 5. – P. 1075-1087. 192. Lhuillier F. Nitric oxide and liver microcirculation during autoregulation and haemorrhagic shock in rabbit model/ F. Lhuillier, M.-O. Robert, P.Crova et al. // British J. Anaesthesia. – 2006. – V. 13. – P. 1-10. 129 193. Liaudet L. Protection against hemorrhagic shock in mice genetically deficient in poly(ADP-ribose)polymerase/ L. Liaudet, F.G. Soriano, E. Szabo et al. // Proc Nat Acad Sci USA – 2000. – V. 97. – P. 10203–10208. 194. Lin C.C. Supplements of L-arginine attenuate the effects of high-fat meal on endothelial function and oxidative stress/ C.C. Lin, W.C. Tsai, J.Y. Chen et al. // Int. J. Cardiol. – 2008. – V. 127. – P. 337–341. 195. Liu L., Simon M.C. Regulation of transcription and translation by- hypoxia // Cancer. Biol. Ther. – 2004. – V. 3, № 6. – P. 492-497. 196. Mander P., Brown G.C. Nitric oxide, hypoxia and brain inflammation // Biochemical Society Transactions. – 2004. – V.32, part 6. – P. 1068-1069. 197. Marletta M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism // J. Biol. Chem. – 1993. – V. 268. – P. 12231-12234. 198. Marsh N., Marsh A. A short history of nitroglycerine and nitric oxide in pharmacology and physiology // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2000. – V. 27, №4. – P. 313-319. 199. Martini J. Mechanotransduction and the homeostatic significance of maintaining blood viscosity in hypotension, hypertension and haemorrhage/ J. Martini, P. Cabrales, A.G. Tsai et al. //J. Inter. Med. – 2006. – V. 259(4). – P. 364372. 200. Martini J. Survival time in severe hemorrhagic shock after perioperative hemodilution is longer with PEG-conjugated human serum albumin than with HES 130/0.4: a microvascular perspective/ J. Martini, P.KA. Cabrales, S.A. Acharya et al. //Crit Care. – 2008. – V. 12(2). – R54. 201. Mayer B., Beretta M. The enigma of nitroglycerin bioactivation and nitrate tolerance: news, views and troubles // British Journal of Pharmacology. – 2008. – V. 155. – P. 170-184. 202. MBor-Kucukatay. The effects of nitric oxide on red blood cell deformability / M Bor-Kucukatay, R. B. Wenby, H. J. Meiselman et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003. – V. 10. – P. 1152. 130 203. Menezes J.M. The modulation of hepatic injury and heat shock expression by inhibition of inducible nitric oxide synthase after hemorrhagic shock/ J.M. Menezes, C. Hierholzer, S.C. Watkins et al. // Shock . – 2002. – V. 17, №1. – P. 13-18. 204. Miller A.L. The effects of sustained-release-L-arginine formulation on blood pressure and vascular compliance in 29 healthy individuals // Altern. Med. Rev. – 2006. – V. 11, № 1. – P. 23-29. 205. Miller M, Megson I.L. Recent developments in nitric oxide donor drugs// Br. J. Pharmacol. –2007. – V. 151. – P. 305-321. 206. Möller M. Acceleration of nitric oxide autoxidation and nitrosation by membranes/ M. Möller, Q. Li, Jr J.R. Lancaster et al. // IUBMB Life. – 2007. – V. 59. – P. 243-248. 207. Moncada S, Higgs EA. The discovery of nitric oxide and its role in vascular biology// Br J Pharmacol. – 2006. – V. 147. – S.193–201. 208. Montalvo-Jave E.E. Factors in the pathophysiology of the liver ischemiareperfusion injury/ E.E. Montalvo-Jave, T. Escalante-Tattersfield, J.A. OrtegaSalgado et al. //J Surg Res. – 2008. – V. 147. – P. 153-159. 209. Moochhala S.M., Siew-Yang K.L. The role of inducible nitric oxide synthase inhibitor on the arteriolar hyporesponsiveness in hemorrhagic-shocked rats // Life Sci. – 2003. – V. 73(14). – P. 1825-1834. 210. Moochhala S.M. Preservation of neurological functions by nitric oxide synthase inhibitors in conscious rats following delayed hemorrhagic shock / S.M. Moochhala, K.L. Siew-Yang, J. Sung et al.// Life Sci. – 2004. – V. 76, № 6. – P. 661670. 211. Nachuraju P. Exogenous nitric oxide prevents cardiovascular collapse during hemorrhagic shock/ P. Nachuraju, A.J. Friedman, J.M. Friedman et al. // Resuscitation. – 2011. – V. 82(5). – P. 607–613. 212. Natarajan R. Hypoxia inducible factor-1: regulation by nitric oxide in posthypoxic microvascular endothelium/ R. Natarajan, D.G. Jones, B.J. Fisher et al. // Biochem Cell Biol. – 2005. – V. 83(5). – P. 597–607. 213. Nowicki M.J. Developmental expression of endothelial nitric oxide synthase 131 (eNOS) in the rat liver/ M.J. Nowicki, D. Shi, Z. Cai et al. // Pediatr Res. – 2003. – V. 54. – P.732–738. 214. Pacher P., Beckman J.S., Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease // Physiol. Rev. – 2007. – V. 87, № 1. – P. 315-424. 215. Pannen B.H. Regulation of hepatic blood flow during resuscitation from hemorrhagic shock: role of NO and endothelins/ B.H. Pannen, M. Bauer, G.F. Nuldge-Schomburg et al. // Am. J. Physiol. 1997. V. 272, № 6. H. 2736- 2745. 216. Park M. Clinical utility of standard base excess in the diagnosis and interpretation of metabolic acidosis in critically ill patients/ M. Park, L.U. Taniguchi, D.T. Noritomi et al. // Braz J Med Biol Res. 2008. V. 41(3). P. 241-249. 217. Parker J.O. The effect of supplemental L-arginine on tolerance development during continuous transdermal nitroglycerin therapy/ J.O. Parker, J.D. Parker, R.W. Caldwell et al. //J. Am. Coll. Cardiol. 2002. V. 39(7). P. 1199–1203. 218. Paton J.F., Kasparov S., Paterson D.J. Nitric oxide and autonomic control of heart rate: a question of specificity // Trends Neurosci. 2002. V. 25, № 12. P. 626-631. 219. Phillips L. Nitric oxide mechanism of protection in ischemia and reperfusion injury/ L. Phillips, A.H. Toledo, F. Lopez-Neblina et al. // Journal of Investigative Surgery. 2009. V. 22(1). P. 46–55. 220. Pittet J.-F. Reactive nitrogen species inhibit alveolar epithelial fluid transport after hemorrhagic shock in rats / J.-F. Pittet, L.N. Zu, D.G. Morris et al. // J. Immunol. – 2001. – V. 166. – P. 6301-6310. 221. Preissler G. Recipient treatment with L-Arginine attenuates donor lung injury associated with hemorrhagic shock/ G. Preissler, F. Löhe, U. Ebersberger et al. // Transplantation. 2009. V. 87(11). P. 1602–1608. 222. Puzserova A., Csizmadiova Z., Bernatova I. Effect of blood pressure on LNAME-sensitive component of vasorelaxation in adult rats // Physiol. Res. 2007. V. 56, Suppl 2. P. 77-84. 132 223. McQuillan L.P. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanisms/ L.P. McQuillan, G.K. Leung, P.A. Marsden et al. // Am J Physiol. 1994. V. 267. H.1921–1927. 224. Rivera -Chavez F.A. Exogenous and endogenous nitric oxide but not iNOS inhibition improves function and survival of ischemically injured livers / F.A. Rivera -Chavez, L.H. Toledo-Pereyra, R.E. Dean et al. // J. Invest.Surg. 2001. V.14, №5. P. 267-273. 225. Rixen D. A pig hemorrhagic shock model: oxygen debt and metabolic acidemia as indicators of severity/ D. Rixen, M. Raum, B. Holzgraefe et al.// Shock. 2001. V. 16(3). P. 239–244. 226. Saad W.A. Nitric oxide and L-type calcium-channel influences the changes in arterial blood pressure and heart rate induced by central angiotesin II / W.A-. Saad, I.F. Guarda, L.A. Camargo et al. // Behav. Brain. Funct. 2008. №4. 22. 227. Salazar-Vazquez B.Y. Microvascular experimental evidence on the relative significance of restoring oxygen carrying capacity vs. blood viscosity in shock resuscitation/ B.Y. Salazar-Vazquez, R. Wettstein, P. Cabrales et al. //Biochim Biophys Acta. 2008. V. 1784(10). P. 1421-1427. 228. Savoye G. Hemorrhagic shock resuscitation affects early and selective mesenteric artery endothelial function through a free radical-dependent mechanism/ G. Savoye, F. Tamion, V. Richard et al. //Shock. 2005. V. 23, №5. P. 411-416. 229. Scatena R. Nitric oxide donor drugs: an update on pathophysiology and therapeutic potential / R. Scatena, P. Bottoni, G.E. Martorana et al. // Expert. Opin. Investig. Drugs. 2005. V. 14, № 7. P. 835-846. 230. Schairer D. The potential of nitric oxide releasing therapies as antimicrobial agents/ D. Schairer, J. Chouake, J. Nosanchuk et al.// Virulence. 2012. V. 3. P. 271–279. 231. Searles CD. Transcriptional and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase expression// Am J Physiol Cell Physiol. 2006. V. 291(5). Р. 803-816. 133 232. Shahar L. The Interaction Between: Coronary Endothelial Dysfunction, Local Oxidative Stress and Endogenous Nitric Oxide: in Humans / S. Lavi, E.H. Yang, A. Prasad et al.// Hypertension. 2008. V. 51, № l. P. 127-133. 233. Singel DJ, Stamler JS. Chemical physiology of blood flow regulation by red blood cells: the role of nitric oxide and S-nitrosohemoglobin//Annu Rev Physiol. 2005. V. 67. P. 99–145. 234. Shirhan M. Influence of selective nitric oxide synthetase inhibitor for treatment of refractory haemorrhagic shock/ M. Shirhan, S.M. Moochhala, S.YL.Kerwin et al. // Resuscit. 2004. V. 61(2). P. 221-29. 235. Sobhian B. Nitric oxide-supplemented resuscitation improves early gastrointestinal blood flow in rats subjected to hemorrhagic shock without late consequences/ B. Sobhian, M. Jafarmadar, H. Redl et al. // Am. J. Surgery. 2011. V. 201(1). P. 100–110. 236. Szabo C. Poly (ADP-ribose) polymerase activation and circulatory shock//Novartis Found Symp. 2007. V. 280. P. 92–103. 237. Szabo C, Ischiropoulos H, Radi R. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics//Nat Rev Drug Discov. 2007. V. 6. P. 662–680. 238. Szabo C, Billiar TR. Novel roles of nitric oxide in hemorrhagic shock// Shock. 1999. V. 12. Р. 1-9. 239. Szabo C. Angiotensin II-mediated endothelial dysfunction: Role of poly(ADPribose) polymerase activation/ C. Szabo, P. Pacher, Z. Zsengeller et al.// Mol Med. 2004a. V. 10. P. 28–35. 240. Tasoulis M.K. High concentrations of reactive oxygen species in the BAL fluid are correlated with lung injury in rabbits after hemorrhagic shock and resuscitation/ M.K. Tasoulis, O. Livaditi, M. Stamatakos et al. // Tohoku J Exp Med. 2009. V. 219. P. 193–199. 241. Tassorelli C. Comparative analysis of the neuronal activation and cardiovascular effect of nitroglycerin, sodium nitroprusside and L-arginine/ C. 134 Tassorelli, R. Greco, D. Cappeletti et al. //Brain Res. 2005. V. 1051(1-2). P. 1724. 242. Taylor B.S., Alarcon L.H., Billiar T.R. Inducible nitric oxide synthase in the liver: regulation and function// Biochemistry (Mosc). 1998. V. 63(7). P. 766– 781. 243. Toda N., Okamura T. The pharmacology of nitric oxide in the peripheral nervous system of blood vessels // Pharmacol Rev. 2003. V. 55. Р. 271-324. 244. Todorović Z. The cardiovascular effects of the administration of L-NAME during the early posthemorrhagic period / Z. Todorović, M.S. Prostran, V. Varagić et al. // Gen. Pharmacol. – 1998. – V. 30, №5. – P. 763-769. 245. Torres L.N., Pittman R.N., Torres F.-I.P. Microvascular blood flow and oxygenation during hemorrhagic hypotension// Microvasc Res. 2008. V. 75. P. 217–226. 246. Tsoukias N.M. Nitric Oxide Bioavailability in the Microcirculation: Insights from Mathematical Models//Microcirculation. 2008. V. 15(8). P. 813-834. 247. Tsoukias N.M., Kavdia M., Popel A.S. A theoretical model of nitric oxide transport in arterioles: frequency- vs. amplitude-dependent control of cGMP formation// Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004. V. 286. H. 1043–1056. 248. Tsukada K. Effect of uric acid on liver injury during hemorrhagic shock / K. Tsukada, T. Hasegawa, S. Tsutsumi et al.//Surgery. 2000. V. 127, №4. P. 439446. 249. Trostchansky A., Rubbo H. Nitrated fatty acids: Mechanisms of formation, chemical characterization, and biological properties // Free Radic. Biol. Med. 2008. V. 44. P. 1887-1896. 250. Ulker P. Mechanical stimulation of nitric oxide synthesizing mechanisms in erythrocytes/ P. Ulker, L. Sati , C. Celik-Ozenci et al.// Biorheology. 2009. V. 46(2). P. 121-32. 251. Vanhoutte P.M. Arginine and arginase: endothelial NO synthase double crossed? //Circ. Res. 2008. V. 102. P. 866–868. 135 252. Wang Y., Lawson J.A., Jaeschke H. Differential effect of 2-aminoethylisothiourea, an inhibitor of the inducible nitric oxide synthase, on microvascular blood flow and organ injury in models of hepatic ischemia-reperfusion and endotoxemia// Shock. 1998. V. 10. P. 20–25. 253. Webb A.J. Mechanisms underlying erythrocyte and endothelial nitrite reduction to nitric oxide in hypoxia: role for xanthine oxidoreductase and endothelial nitric oxide synthase/ A.J. Webb, A.B. Milsom, K.S. Rathod et al. // Circ Res. 2008. V. 103(9). Р. 957–964. 254. Wettstein R, Tsai AG, Erni D. et al. Improving microcirculation is more effective than substitution of red blood cells to correct metabolic disorder in experimental hemorrhagic shock/ R. Wettstein, A.G. Tsai, D. Erni et al. //Shock. 2004. V. 21. P. 235-240. 255. Wray G.M. Selective inhibition of the activity of inducible nitric oxide synthase prevents the circulatory failure, but not the organ injury/ dysfunction, caused by endotoxin/ G.M. Wray, C.G. Millar, C.J. Hinds et al. // Shock. 1998. V. 9. P. 329–335. 256. Yalcin O. Nitric oxide generation by endothelial cells exposed to shear stress in glass tubes perfused with red blood cell suspensions: role of aggregation/ O. Yalcin, P. Ulker, U. Yavuzer et al.// Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008. V. 294. H.2098–2105. 257. Yetik-Anacak G, Catravas JD. Nitric oxide and the endothelium: history and impact on cardiovascular disease// Vascul Pharmacol. 2006. V. 45. P. 268–276. 258. Zavodnik I.B., Lapshina E.A., Rekawieka K. Membrane effects of nitriteinduced oxidation of human red blood cells // Biochem. Biophys. Acta. 1999. V. 1421, №2. P. 306 - 316. 259. Zhao L. Effects of different resuscitation fluids on the rheologic behavior of red blood cells, blood viscosity and plasma viscosity in experimental hemorrhagic shock / L. Zhao, B. Wang, G.X. You et al. //Resuscitation. 2008. V. 80(2). P. 253-258. 136 260. Zingarelli B. Evidence for a Role Nitric Oxide in Hypovolemic Hemorrhagic Shock/ B. Zingarelli, F. Squadrito, D. Altavilla et al. // J.Cardiovasc. Pharmacol. 1992. V. 19, № 6. P. 982986. 261. Zimmermann C., Wimmer M., Haberl R.L. L-arginine –mediater vasoreactivity in patients with a risk of stroke// Cerebrоvasc. Dis. 2004. V. 17(23). P. 128-133.