Ген PDLIM4/RIL - Институт биоорганической химии
реклама
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА УДК 577.21;579.23''315 УТВЕРЖДАЮ ВГК ОКП № госрегистрации 01201365240 Инв. № Директор академик ______________ В.Т. ИВАНОВ «28» июня 2013 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии по теме: Выбор направления исследований. Теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед НИР задач. (промежуточный) Этап первый № 2013-1.2-14.512.11.0040 Государственный контракт от «03» апреля 2013 г. № 14.512.11.0040 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» Научный руководитель, кандилат биологических наук, Е.И. Фролова подпись, дата Москва 2013 г СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Научный руководитель: ведущий научный сотрудник, к.б.н подпись, дата Фролова Е.И. (раздел(ы) 1-6) подпись, дата Чумаков С.П, (раздел(ы) 3, 4, 5, сп. лит.) подпись, дата Кравченко Ю.Е. (раздел(ы) введ.,1, 2, 6, заключ.) Исполнители темы: Научный сотрудник, к.б.н. Научный сотрудник, к.б.н. Научный сотрудник, к.б.н. Аспирант Аспирант Аспирант Аспирант Старший лаборант Старший лаборант Нормоконтролер подпись, дата Кочетков Д.В. (раздел 1) подпись, дата Лежнин Ю.Н. (раздел 1) подпись, дата Ратникова Н.М. (раздел 1) подпись, дата Далина А.А. (раздел 1) подпись, дата Панасенко Е.Н. (раздел 1) подпись, дата Кузьмина О.Н. (раздел 1, сп. лит ) подпись, дата Алибаева Р.А. (раздел 1, сп. лит) подпись, дата <Фамилия И.О.> Соисполнители: зав. лаб., д.б.н., профессор зав. лаб., д.б.н., профессор 2 подпись, дата Чумаков П.М. (раздел(ы) 1,4,5) ИМБ РАН подпись, дата Прасолов В.С. (раздел(ы) 1) ИМБ РАН) РЕФЕРАТ Отчет с.82, ч.6 , рис.15, табл.3, источников 100, прил 0. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ОПУХОЛЕВЫЕ МАРКЕРЫ, ОПУХОЛЕВЫЙ СУПРЕССОР, ГЕН PDLIM4/RIL, ТРАНСКРИПТОМА, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, ТРАНСФОРМАЦИЯ, ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК, ЦИТОСКЕЛЕТ, ИНВАЗИВНОСТЬ Целью работы является выявление молекулярных и биологических характеристик субтипа рака молочной железы, зависящих от эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL и разработка теста основанного на технологии NGS для выявления нового биомаркера рака молочной железы, связанного с подавлением гена PDLIM4/RIL. В результате проводимого исследования должна быть проведена оценка возможности использования супрессии гена PDLIM4/RIL в качестве нового маркера рака молочной железы, характеризующего субтип опухоли и возможно отличающийся по чувствительности к определенным терапевтическим походам. В процессе выполнения данного этапа работы был разработан общий план исследований, направленных на изучение корреляции супрессии гена PDLIM4/RIL с морфологическим типом рака молочной железы, характером экспрессии генов и вовлеченности активации рецепторных киназ. Обоснованы и выбраны основные направления, методы, способы решения поставленных задач. Проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Теоретически обоснован выбор нового гена супрессора PDLIM4/RIL в качестве предполагаемого маркера субтипа рака молочной железы. Используя панель линий клеток рака молочной железы человека проведено определение эпигенетического состояния гена PDLIM4/RIL путем ПЦР в реальном времени, проведен анализ метилирования ДНК и гистонов. На этой же панели определена активность рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ. Проведено секвенирование ДНК генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL. С помощью технологии NGS получены данные по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы. Проведен патентный поиск с целью определения перспективности и патентоспособности нового маркера рака молочной железы, основанного на эпигенетической супресси гена PDLIM4/RIL. 3 СОДЕРЖАНИЕ Обозначения и сокращения …………………………………………………………………6 Введение………………………………………………………………………………………10 ГЛАВА 1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР………………………………………………………………..17 1.1. Анализ литературных данных и выбор оптимального направления исследований…17 1.1.1 Анализ публикаций………………………………………………………………….…17 1.1.2 Материалы и методы………………………………………………………………....42 ГЛАВА 2. Определение эпигенетического состояния гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, анализ метилирования ДНК и гистонов…………………………………………………………..56 2.1 Анализ экспрессии мРНК RIL в опухолях человека………………………………..….56 2.2. Экспрессия RIL в культурах клеток рака молочной железы человека………………..57 2.3. Определение статуса метилирования гена RIL при раке молочной железы………...58 ГЛАВА 3. Определение активности рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, состояния сигнальных путей на панели линий клеток рака молочной железы…………………………………………………………………………………………60 ГЛАВА 4. Проведение секвенирования генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL………………………………………...63 4 ГЛАВА 5. Получение данных по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы с помощью технологии NGS………………………………………………………………………….…..68 ГЛАВА 6. Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96…………………....68 Заключение ……………………………………………………………………………..……70 Список использованных источников…………………………………………………..…71 5 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ В настоящем отчете о НИР применяют следующие Обозначения и сокращения: LTR- длинные концевые повторы MuLV - вирус лейкоза мышей cPPT - центральный пурин-пиримидиновый тракт WPRE - геном вируса гепатита сурка кДНК - комплементарная ДНК п.н. - пара нуклеотидов ФС - фетальная сыворотка ФС-КРС - фетальная сыворотка крупного рогатого скота а.о. - аминокислотный остаток БСА - бычий сывороточный альбумин ВИЧ - вирус иммудефицита человека ВПЧ-18 - вирус папилломы человека 18 серотипа ДКП - длинный концевой повтор ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ - дитиотрейтол н. – нуклеотид мРНК - матричная РНК Трис - трисгидроксиметиламинометан ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭФ - электрофорез п.н. - пара нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота 6 СЯЭ – сигнал ядерного экспорта ФСБ – фосфатно-солевой буфер ЭГТА – этиленгликольтетрауксусная кислота ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭМТ – эпителиально-мезенхимальная трансформация ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка AF (AlexaFluor) – общее название флюоресцентных красителей, разработанных компанией Molecular Probes ALP (α-actinin associated LIM domain protein) – α-актинин-ассоциированный LIMдоменный белок APC (от adematous poliposis coli) – ген-опухолевый супрессор, мутации которого идентифицированы при семейном аденоматозном полипозе и спорадических опухолях ободочной кишки CEF (от chicken embryonic fibroblasts) – куриные эмбриональные фибробласты CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa) – карбокси-терминальный LIM-доменный белок массой 36 кДа CytB (Cytochalasin B) – цитохалазин Б DMЕМ (Dulbecco's Modified Eagle Medium) – ростовая среда Игла, модифицированная Дульбекко DMSO (dimethyl sulfoxide) – диметил сульфоксид EGFR (от epidermal growth factor receptor) – рецептор эпидермального фактора роста ENH (от Enigma homologue) – белок, гомологичный белку Enigma ERK (от extracellular signal-regulated kinase) – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами, дерегуляция этого сигнального каскада часто встречается в канцерогенезе FACS (fluorescense-activated cell sorting) – метод проточно-цитометрической селекции клеток, основанной на их флуоресценции FITC (fluorescein isothiocyanate) – флуоресцеин изотиоцианат, зеленый флуоресцентный краситель GFP (green fluorescent protein) – зеленый флуоресцентный белок 7 HA (от haemoagglutinin) – гемагглютинин, мотив, часто используемый для мечения экзогенно-экспрессируемых белков HIV-1 (human immunodeficiency virus type1) – вирус иммунодефицита человека, тип 1 HMEC (human mammary epithelial cells) – клетки эпителия молочной железы человека HRP (от horseradish peroxidase) – пероксидаза хрена IκB (от inhibitor of κB) – ингибитор κB JNK (от Jun N-terminal kinase) – киназа N-конца Jun lacZ – ген β-галактозидазы LatA (Latrunculin A) – латрункулин А LB – среда Луриа-Бертани LEF (от lymphoid enhancer factor) – лимфоидный энхансерный фактор, один из компонентов бета-катенин-зависимого сигнального каскада LIM – структурный белковый домен, названный по первым буквам генов lin-11, isl-1 и mec-3, кодирующих белки, у которых он был впервые описан LTR (long terminal repeat) – длинный концевой повтор mCMV (minimal promotor of cytomegalovirus early gene) – минимальный промотор раннего гена цитомегаловируса MEGM (от mammary epithelium growth medium) – специализированная ростовая среда для культуры первичных эпителиоцитов молочной железы MES – 2-(N-Морфолино)этансульфоновая кислота M-MLV (от Moloney murine leukemia virus) – вирус Молони лейкоза мышей NA (от numerical aperture) – числовая апертура объектива, характеристика, определяющая разрешающую способность линзы NFκB – ядерный фактор каппа Б (от nuclear factor κB) ONPG - o-нитрофенил-β-D-галактопиранозид PDLIM (от PDZ and LIM protein) PDZ – структурный белковый домен, названный по первым буквам белков PSD95, DlgA и ZO-1, у которых он был впервые описан PIPES – пиперазин-N,N’-бис(2-этан)сульфоновая кислота 8 PTP (от protein tyrosine phosphatase) – тирозиновая фосфатаза RE (response element) – чувствительный элемент RIL (reversion induced LIM gene/protein) RISC (от RNA-induced silencing complex) – РНК-индуцированный комплекс, осуществляющий сайленсинг SDS – додецилсульфат натрия shРНК – короткая шпилечная РНК, используемая для РНК-интерференции (от англ. short hairpin) SIN (от self-inactivating) – самоинактивирующийся ДКП, необходимый для получения ретровирусов, неспособных к репликации siРНК– короткая интерферирующая РНК (от англ. short interfering) TCF (от T-cell factor) – фактор Т клеток, транскрипционный фактор, компонент бетакатенин-зависимого сигнального каскада, гиперактивация которого часто встречается в канцерогенезе TGFβ – трансформирующий фактор роста β (от англ. transforming growth factor β) THRβ – рецептор тиреоидного гормона бета (от англ. thyroid hormone receptor) TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6) VSV-G (от vescular stomatitit virus G protein) – оболочечный белок G вируса везикулярного стоматита, часто используется для псевдотипирования рекомбинантных вирусных частиц WPRE (от woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) – посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, повышает стабильность вирусных транскриптов X-gal – 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид ZASP (от Z-band alternatively spliced сплайсированный PDZ-белок Z-диска 9 PDZ-motif protein) – альтернативно ВВЕДЕНИЕ Злокачественные заболевания возникают при утрате клеткой контроля за стабильностью генома, в результате чего она вступает на путь эволюции в сторону приобретения автономии делений, и последовательной селекции все более быстро делящихся вариантов, характеризующихся ускоряющейся экспансией. потерей специфических функций и В процессе канцерогенеза клетка последовательно накапливает множество генетических и эпигенетических повреждений, которые обеспечивают ускорение пролиферации и экспансию. Несмотря на существование морфологической классификации различных форм злокачественных заболеваний, набор поврежденных генов и последовательность приобретения мутаций чрезвычайно разнообразны, так как проходят по множеству сценариев. Наряду с индивидуальными генетическими различиями между людьми, вариации в процессе канцерогенеза обуславливают высокую степень разнообразия, как течения заболевания, так и ответ на применяемую терапию. В связи с этим, медицина будущего, безусловно, должна учитывать генетические особенности опухоли конкретного пациента при выборе наиболее эффективного способа лечения. С этой целью в настоящее время ведется поиск молекулярных маркеров, характеризующих отдельные формы рака, и изучение корреляции выявленных маркеров с характером опухоли, течением опухолевого процесса и особенностей реакции на применяемую терапию опухолей, имеющих данный маркер. Планируемая работа предполагает изучение в качестве перспективного маркера опухолей молочной железы гена супрессора PDLIM4/RIL. Целью планируемых работ является разработка подхода к дифференциальной диагностике молекулярных разновидностей рака молочной железы для оптимизации персонифицированной терапии. Помимо морфологических типов рака молочной железы большое значение для прогноза и выбора оптимальной терапевтической стратегии имеют молекулярные маркеры, свидетельствующие о нарушениях в тех или иных молекулярных процессах клетки. Исследования, проведенные в лаборатории, указывают на возможность использования в качестве ценного молекулярного маркера эпигенетический статус гена-супрессора PDLIM4/RIL. Этот ген был впервые картирован в нашей лаборатории на участке длинного плеча хромосомы 5 (5q31), часто делетируемой при ряде злокачественных заболеваний человека. Помимо делеций, ген PDLIM4/RIL часто подвергается эпигенетической супрессии, в результате которой его экспрессия подавляется. Подавление экспрессии RIL происходит только в части случаев рака молочной железы и по имеющимся в лаборатории данным в таких случаях 10 отмечается меньшая степень морфологической трансформации и пониженная частота активации тирозиновых киназ. Конкретной целью данной работы является сравнительная характеристика образцов рака молочной железы в которых отмечается подавление экспрессии гена PDLIM4/RIL с образцами, экспрессирующими нормальные уровни этого гена супрессора. Согласно высказанной нами ранее гипотезе, возникновение эпигенетической супрессии гена RIL направляет клетки по особому типу трансформации, который может не вовлекать изменения активности рецепторных киназ, функция которых тесно связана с активацией Src, поскольку утрата активности гена RIL сама по себе приводит к конститутивной активации Src киназы. Если эта гипотеза будет подтверждена в результате проводимой работы, то эпигенетическую супрессию гена PDLIM4/RIL можно будет рассматривать в качестве маркера, характеризующего определенный субтип рака молочной железы. Будущие исследования прольют свет на возможность использования нового маркера для выбора оптимальных стратегий терапии, а также определения прогноза течения заболевания. Оценка современного состояния решаемой научно-технической проблемы Ген RIL (reversion-induced LIM-domain containing) в последствии получивший современное название PDLIM4, был впервые идентифицирован при изучении трансформации фибробластов под действием онкогена H-Ras. Экспрессия гена RIL супрессируется при трансформации, однако восстанавливается в фенотипических ревертантах, что навело на мысль о функционировании гена RIL в качестве опухолевого супрессора [1]. В нашей лаборатории этот ген был картирован в области 5q31 генома человека, которая часто делетирует при злокачественных заболеваниях [2], что хорошо согласуется с возможной супрессорной ролью этого гена у человека. Ген RIL кодирует адаптерный белок, содержащий два типа доменов, часто встречающихся в белках, принимающих участие в белок-белковых взаимодействиях – Сконцевой LIM-домен и N-концевой PDZ домен. Этот ген относится к семейству генов ALP/Enigma которые обнаруживаются в ассоциации с актиновым цитоскелетом [2, 3]. Это консервативные белки, которые у нематоды C. elegans представлены единичным геном (alp-1/eat-1) [4-7]. Белок RIL, как и другие представители этого семейства, связан с актиновым цитоскелетом через α-актинины [8, 9]. Белки этого семейства важны для поддержания структуры Z-дисков миофибрилл благодаря их роли в стабилизации актиновых филаментов [5, 10, 11]. Нарушения некоторых из этих генов сопровождаются миопатиями у животных и человека [11-18]. В немышечных клетках белки семейства 11 PDLIM играют похожую роль в стабилизации актиновых стресс-фибрилл. В частности, RIL увеличивает сродство α-актинина к филаментозному актину (F-актину), что сопровождается выраженной перестройкой актинового цитоскелета [3]. В нашей лаборатории обнаружено несколько альтернативно сплайсированных изоформ – продуктов гена RIL, одна из которых играет роль доминантно-негативного регулятора полноразмерного белка RIL и участвует в перестройке цитоскелета в ответ на определенные стрессы [19]. Недавно установлена еще одна важная функция гена PDLIM4/RIL, которая непосредственно объясняет его роль в качестве опухолевого супрессора. Было установлено, что RIL участвует в регуляции киназной активности протоонкогена Src. RIL, действуя в качестве адаптера связывается с активированным (фосфорилированным) белком Src и одновременно с протеинфосфатазой PTPL1 (или PTP-BL), в результате чего фосфатаза осуществляет дефосфорилирование активности белка Src [20]. и инактивацию протеинкиназной Таким образом RIL снижает активность Src после его активации, способствуя обратимости пролиферативного сигнала. Поэтому понятно, что утрата активности RIL может сопровождаться конститутивной активацией киназы Src, в то время как увеличение экспрессии белка RIL, напротив, будет способствовать снижению активности Src, характерной для состояния фенотипической реверсии. Работами ряда авторов было установлено, что в ряде злокачественных заболеваний человека определенный процент опухолей демонстрирует эпигенетическую супрессию транскрипции гена PDLIM4/RIL [21-24]. Наиболее часто супрессия RIL наблюдается в опухолях простаты, толстого кишечника, молочной железы и острой миелоидной лейкемии. При этих заболеваниях метилирование и супрессия гена RIL наблюдается приблизительно в половине случаев. Очевидно, подавление экспрессии гена RIL играет важную роль в канцерогенезе, поскольку восстановление экспрессии сопровождается остановкой пролиферации [23]. Основание и исходные данные для разработки темы. В нашей лаборатории при исследовании панели линий клеток рака молочной железы было обнаружено, что приблизительно в половине линий экспрессия гена RIL подавлена на уровне транскрипции. При этом было обнаружено, что в другой половине линий уровень экспрессии RIL соответствует контрольным нормальным клеткам молочной железы. Характерно, что два типа линий клеток также отличались по морфологическим признакам. Линии с нормальным уровнем экспрессии гена RIL 12 обладали выраженными эпителиальной признаками морфологии, морфологической характерной трансформации, утратой эпителиально-мезенхимальной трансформации, выраженной дезогранизацией актинового цитоскелета, увеличением подвижности клеток и снижением адгезии. Характерно, что подавление экспрессии RIL в этих линиях с помощью РНК-интерференции не сопровождалось реверсией трансформированного фенотипа, в то время как восстановление экспрессии RIL в клетках демонстрирующих его супрессию приводило к снижению трансформированного фенотипа. Полученные данные указывают на существование двух типов линий клеток рака молочной железы, коррелирующих с уровнем экспрессии RIL. Согласно рабочей гипотезе, подтверждающейся рядом наших неопубликованных данных, фенотипические различия обусловлены отличиями в механизме активации тирозиновых киназ. Если в линиях, утративших в результате эпигенетическогй супрессии транскрипцию гена RIL активация Src достигается путем отсутствия контроля со стороны фосфатазы PTP-BL, то в линиях, где экспрессия RIL не изменена, трансформация поддерживается за счет иных событий, включающих активацию Src-подобных киназ за счет альтернативных механизмов. Один из таких механизмов может осуществляться путем активации EGFR, другой – путем активации HER2. В этом случае, применение терапии, направленной на подавление HER2 (herceptin) оказаться неэффективным в случае опухолей, реализующих сценарий трансформации за счет подавления экспрессии RIL. Планируемая работа предполагает проведение расширенного исследования корреляции супрессии гена RIL с менее выраженной фенотипической трансформацией, а также частоты вовлечения активации EGFR и HER2 в зависимости от эпигенетического статуса гена PDLIM4/RIL. Эта работа будет проведена на большой панели линий клеток рака молочной железы, имеющейся в нашей коллекции, а ее результаты будут верифицированы на клинических образцах рака молочной железы. Эта работа оценит значение гена RIL в качестве дифференциального маркера приблизительно половины случаев рака молочной железы, что будет способствовать осознанному выбору оптимальных схем терапии. Связь данной работы с другими научно-исследовательскими работами. Коллектив лаборатории на протяжении последних многих лет занимался картированием области хромосомы 5, в которой располагается кластер цитокиновых генов (5q31). Эта же область часто повреждается при злокачественных заболеваниях, 13 что указывает на росположение в ней опухолевого супрессора. Коллектив лаборатории вел поиск этого гена и одним из кандидатов на такой ген являлся ген PDLIM4/RIL. В лаборат ории было проведено функциональное изучение этого гена, показано, что он экспрессируется в виде нескольких альтернативных продуктов, изучены свойства различных изоформ. В лаборатории были также обнаружены свойства гена PDLIM4/RIL вляить на состояние актиновго цитоскелета. Данная разработка логически следует из многолетних исследований лаборатории. Цели и задачи первого этапа исследований, их место в выполнении НИР в целом На данном первом этапе исследования основные задачи включали изучение литературных источников по проблеме адапторных белков семейства, содержащих PDZ и LIM домены, роли гена PDLIM4/RIL и злокачественной трансформации клеток. На основании литературных источников предполагалось разработать оптимальный план исследований, направленных на установление корреляции утраты экспрессии гена PDLIM4/RIL и приобретением характерных изменений экспрессии генов, выявляемые путем секвенирования транскриптома по технологии NGS. проведение патентных исследований с целью Предполагалось также установления потенциальной перспективности супрессии гена RIL в качестве молекулярного маркера субтипа рака молочной железы. В плане экспериментальной работы предполагалась отработка подходов с использованием ранее охарактеризованных линий рака молочной железы человека, а именно, определение эпигенетического статуса гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, анализ метилирования ДНК и гистонов, определение активности рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, состояния сигнальных путей, проведение секвенирования генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL, получение данных по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы с помощью технологии NGS. Задачи, намеченные к выполнению на первом этапе работы выполнены в полном объеме. Обоснование необходимости проведения НИР. Необходимость проведения НИР диктуется задачами по переходу медицины на персонифицированный подход к лечению заболеваний. Существование нескольких типов рака молочной железы обуславливает их различную чувствительность к 14 терапевтическим воздействиям. Наблюдения лаборатории указывают на корреляцию супрессии гена PDLIM4/RIL и отсутствия нарушений регуляции рецепторных тирозиновых киназ, что указывает на существование отдельного субтипа рака молочной железы. Этот субтип может обладать особенностями в чувствительности к терапии. Для его быстрой идентификации требуется разработка диагностического теста, позволяющего определять супрессию гена PDLIM4/RIL. Сведения о планируемом научно-техническом уровне разработки. Ген PDLIM4/RIL является объектом исследований лаборатории на протяжении более двадцати лет и мы являемся авторами исходных работ по его изучению. Принадлежность гена к опухолевым супрессорам была также впервые постулирована нами, и недавно это предположение нашло экспериментальное подтверждение. В нашей лабораториивперрвые была замечена корреляция супрессии гена PDLIM4/RIL с морфологией и биохимическими свойствами опухолевых клеток. Поэтому, планируемое исследование будет проведено на самом высоком научном уровне, а получаемые результаты будут носить приоритетный характер. Планируемая разработка базируется на многолетних работах коллектива, которые имели приоритетное значение для установления роли опухолевого супрессора PDLIM4/RIL в злокачественной трансформации. Наблюдения, проведенные в лаборатории свидетельствуют о существенном потенциале гена RIL в качестве биомаркера распространенного (около 50%) подтипа рака молочной железы. Быстрая диагностика этого подтипа путем измерения уровня транскриптов гена RIL будет способствовать адекватному выбору терапии. В связи с значительным разнообразием течения заболевания у пациентов медицина будущего будет ориентироваться на персонифицированные подходы к терапии. В этом смысле планируемая разработка актуальны, поскольку она направлена на выявление распространенного подтипа рака молочной железы, требующего персонифицированного подхода к лечению. Сведения о патентных исследованиях и выводы из них. При выполнении первого этапа НИР были проведены патентные исследования по теме «Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии» по результатам которых был сделан вывод о том, 15 что объект исследования может подлежать охране патентами. 16 ГЛАВА 1 Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР. 1.1. АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ И ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1.1 Анализ публикаций Прежде чем приступить к экспериментальной работе, коллектив исследователей провел анализ публикаций по изучению адапторных белков содержащих PDZ и LIM домены, данные о способности гена PDLIM4/RIL служить опухолевым супрессором, и о возможности использования этого гена в качестве одного из маркеров разновидности рака молочной железы. Адапторные белки содержащие LIM и PDZ домены Основная отличительная черта адапторных белков – наличие нескольких доменов, обеспечивающих белок-белковые взаимодействия. Белки этого класса служат основой для образования крупных сигнальных комплексов, отвечая за правильное проведение сигнала. Они диктуют специфичность межмолекулярных взаимодействий, внутриклеточную локализацию отдельных белков и целых комплексов и могут модулировать активность своих белков-партнеров [1]. Отсутствие у TRIP6 и RIL собственной ферментативной активности, а также наличие PDZ (у RIL) и LIM-доменов (у TRIP6 и RIL) – мотивов, ответственных за белокбелковые взаимодействия, – позволяют отнести их к классу адапторных белков. Рассмотрим структуру и функции этих двух доменов более подробно. Особенности LIM-доменов Белки, содержащие LIM-домены, были обнаружены относительно давно. В начале 90-х годов прошлого века были идентифицированы три структурно похожих гена, которые кодировали транскрипционные факторы, содержащие ДНК-связывающий гомеодомен, а также две тандемные копии некоего цистеин-богатого мотива. Это были ген lin-11, участвующий в контроле пролиферации клеток-предшественников вульвы у Caenorhabditis elegans, Isl-1, кодирующий белок, который связывается с энхансером гена инсулина, а также ген mec-3, кодирующий фактор, необходимый для дифференцировки рецепторных нейронов у нематод [2]. Эти высококонсервативные цистеин-богатые структуры, имеющие два тандемно-расположенных цинковых пальца (консенсусная 17 последовательность – C-X2-C-X16-23-H-X2C-X2-C-X2-C-X16-21C-X2-(C/H/D), где X – любая аминокислота) были названы LIM-доменами [3]. Попытки выявить непосредственное связывание LIM-доменов с ДНК успехом не увенчались [4]. На сегодняшний день утвердилась точка зрения, что LIM-домен – домен белок-белковых взаимодействий. Петли цинковых пальцев могут отличаться по длине и аминокислотной последовательности (Рисунок 1), что обеспечивает специфичность и широкий спектр белков-интеракторов. Рисунок 1. Схематичное изображение аминокислотной структуры LIM-домена. В настоящий момент в геноме человека идентифицировано 58 генов, кодирующих 135 LIM-доменов. Количество LIM-доменов варьирует от одного до пяти, причем эти мотивы могут быть ассоциированы с совершенно разными функциональными доменами, такими как уже упоминавшийся гомеодомен, каталитические домены или другие домены межбелковых взаимодействий. Интересно отметить, что большинство охарактеризованных LIM-белков могут напрямую или опосредованно связываться с актиновым цитоскелетом (см. ниже). LIM-домены не имеют собственной каталитической активности. Тем не менее, LIMбелки участвуют во многих биологических процессах за счет связывания с белкамимишенями. На основании анализа большого числа LIM-белков и их взаимодействий было выделено четыре основных механизма, посредством которых они модулируют функции других белков: LIM-белки могут a) действовать как адапторы, b) конкурировать за связывание с мишенями или «вытитровывать» другие белки из сигнальных комплексов, c) менять конформацию других белков или d) локализовать белкиинтеракторы в соответствующие компартменты клетки (Рисунок 2). 18 Рисунок 2. Четыре механизма, посредством которых LIM-белки модулируют функции своих партнеров. а - Адапторы организуют белковые комплексы таким образом, чтобы обеспечить максимальную активность своих партнеров. б - LIM-домен может иметь различное сродство к своим мишеням, и активность LIM-комплекса будет зависеть от конкурентного связывания. в - Некоторые белки могут иметь «открытую» и «закрытую» конформации, и соответственно, разную активность; связывание с LIM-доменом других белков может снимать такое аутоингибирование и способствовать «переключению» из одного состояния в другое. г - LIM-белки могут локализовать себя и/или своих партнеров по связыванию в определенные компартменты клетки. Недавно в литературе появились сообщения о том, что LIM домен также может обладать Е3-убиквитин-лигазной функцией [5, 6]. Группой ученых под руководством Grusby был идентифицирован LIM-доменный белок SLIM, необходимый для убиквитинирования in vitro и in vivo белка STAT4, который играет ключевую роль в передаче сигнала от цитокинов. Е3-убиквитин-лигазная активность приписывается LIM-домену на основе сходства укладки петель его цинковых пальцев и структуры RING- и PHD-доменов [7] – характерных компонентов убиквитин- и SUMO-лигаз. Тем не менее, прямого доказательства участия именно LIM-домена в переносе активированного убиквитина с Е2-убиквитин-конъюгирующего фермента на белок-мишень представлено не было. Таким образом, домены межбелковых взаимодействий, включая и LIM-домен, признаны ключевыми компонентами регуляторной системы клетки [8]. Характеристика PDZ-доменов PDZ-домены были выделены в результате анализа сходных структурных мотивов трех белков: белка postsynaptic density PSD95/SAP90; опухолевого супрессора дрозофилы discs large DlgA и белка, участвующего в поддержании клеточной полярности zonula occludens ZO-1. Изначально этот мотив называли GLGF-доменом из-за часто встречающегося в нем аминокислотного повтора (Gly-Leu-Gly-Phe) или DHR-доменом 19 (disc large homology region), чтобы подчеркнуть его сходство с DlgA. Однако вскоре утвердился акроним PDZ (от PSD95, DlgA, ZO-1) [9]. PDZ-домен – один из самых распространенных мотивов, найденных в геномах с уже определенной первичной последовательностью. По некоторым оценкам, в геноме человека закодировано 440 PDZ-доменов в составе 259 различных белков. В отличие от LIM-доменов, PDZ-домены обнаружены даже у простейших [10]. Тот факт, что «классические» PDZ-домены отсутствуют у дрожжей, но большое разнообразие этих мотивов идентифицированы у бактерий и растений [11], стал основанием для предположения о горизонтальном генетическом переносе таких последовательностей. Отсутствие PDZ-доменов у архей также хорошо согласуется с этой гипотезой [12]. PDZ-домены встречаются почти исключительно в цитоплазматических белках (единственные известные исключения – ядерный белок SLIM [5] и секретируемый цитокин интерлейкин IL-16, однако в случае последнего PDZ домен имеет модифицированное строение [13]) и могут в их составе присутствовать в нескольких копиях (от одной до 13). В зависимости от доменной структуры PDZ-белки подразделяют на 3 семейства. К первому относятся белки, состоящие исключительно из PDZ-доменов. В отличие от многих других белков, состоящих из доменов межбелкового взаимодействия, таким PDZ-белкам не требуется олигомеризация. Второе семейство составляют белки MAGUK (от membrane-associated guanylate kinases). Они содержат от одного до трех PDZ-доменов, один SH3-домен и гуанилат-киназный домен. Интересной особенностью белков этого семейства является то, что их гуанилат-киназный домен не обладает каталитической активностью, а участвует в белок-белковых взаимодействиях. В третье семейство входят белки, содержащие кроме PDZ-мотивов другие домены. В отличие от SH2- или SH3-содержащих белков, PDZ-домены никогда не встречаются в составе тирозин-киназ, однако могут соседствовать с серин-треонин-киназными или фосфатазными доменам. PDZ-белки, не имеющие собственной каталитической активности, выполняют функции адапторов, чаще всего соединяя мембранные рецепторы и сигнальные молекулы в крупные комплексы [14]. PDZ-домены – высококонсервативные 80-100 аминокислотные мотивы, которые сворачиваются в компактную глобулу, состоящую из шести β-листов и двух α-спиралей. «Углубление», образованное вторым β-листом и α-спиралью αB, узнает свой классический лиганд – карбокситерминальный тетрапептид. В зависимости от аминокислотной PDZ-домены последовательности подразделены на три класса [15]. классификации PDZ-мотивов. пептида узнающие их были Предпринимались также и другие попытки Так, анализируя гидрофобность лиганд-связывающих 20 остатков, Besprozvanny и Maximov [16] предложили подразделить PDZ-домены на 25 классов, представители каждого из которых имеют различную лиганд-специфичность. С течением времени накопились данные о том, что, хотя «каноническим» лигандом для PDZ-домена является карбокситерминальный тетрапептид [17], этот мотив имеет более широкий репертуар возможных взаимодействий. спектрин-подобные мотивы, последовательности. анкириновые Так, PDZ-домены могут связывать повторы, Кристаллографический LIM-домены анализ таких и другие неканонических взаимодействий позволил сформулировать гипотетическое общее правило узнавания PDZ-доменом: лиганд должен иметь экспонированный на поверхности линейный пептидный мотив, заканчивающийся карбоксильной группой или стабилизированный βповоротом [18]. Было показано, что некоторые PDZ-домены сами содержат такие мотивы, что обусловило возможность ди- или олигомеризации PDZ-белков. PDZ-белки часто ассоциированы с плазматической мембраной [19]. Недавно была продемонстрирована возможность прямого взаимодействия некоторых PDZ-доменов с фосфотидилинозитол-4,5-дифосфатом подмембранном синтетина. пространстве (PIP2). нарушает Показано, мембранную что гидролиз локализацию PIP2 в PDZ-белка Эти наблюдения свидетельствуют в пользу того, что такой тип взаимодействия может обеспечивать локализацию некоторых PDZ-белков к плазматической мембране [20]. Рисунок 3 суммирует четыре типа взаимодействий PDZ-доменов. Рисунок 3. Возможные типы взаимодействий PDZ-доменов. PDZ-домены задействованы в узнавании как минимум четырех типов лигандов: они связывают карбокситерминальные пептиды или внутренние пептидные мотивы, могут олигомеризоваться или взаимодействовать с некоторыми липидами [21]. Итак, белки TRIP6 и RIL содержат функциональные мотивы, обеспечивающие межбелковые взаимодействия. Как описано выше, LIM и PDZ-домены участвуют в сборке сигнальных комплексов, локализации и компартментализации белков-партнеров 21 и регуляции их активности. Рассмотрим известные взаимодействия этих белков более подробно. Ген TRIP6 TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6 – белок, взаимодействующий с рецептором тиреоидного гормона) – 476-аминокислотный белок семейства зиксина [22], преимущественно экспрессирующийся в эпителиальных клетках [23]. При анализе последовательности белков этого семейства можно выделить две различные по структуре области: N-концевой пролин-богатый участок и C-концевую часть с тремя LIM-доменами. TRIP6 локализуется преимущественно в цитоплазме в области фокальных контактов, однако при некоторых условиях может транспортироваться в ядро, а затем поступать обратно в цитоплазму за счет сигнала ядерного экспорта (СЯЭ) [24]. К настоящему времени о зиксин-подобных белках сложилось представление как об актин-ассоциированных адапторных белках, осуществляющих функциональную связь между цитоплазмой и ядром, где они могут играть роль транскрипционных регуляторов [2]. На данный момент идентифицировано более десятка белков-партнеров TRIP6. Кроме PTP-BL и RIL, в цитоплазме TRIP6 взаимодействует с p130Cas, необходимым для проведения сигналов с интегринов внутрь клетки [25], с компонентом рецепторного комплекса TGF-β белком endoglin [26], а также фосфорилироваться клеточным протоонкогеном c-src [27]. Список белков, взаимодействующих с TRIP6, указывает на возможное участие TRIP6 в регуляции актинового цитоскелета и клеточной подвижности. С другой стороны, известно, что TRIP6 способен взаимодействовать с некоторыми транскрипционными факторами: рецептором тиреоидного гормона THR-β, ретиноидным X рецептором [28], глюкокортикоидным рецептором, c-Fos, p65 (RelA) субъединицей NFκB [29, 30 ]. При этом TRIP6 может выступать в роли как позитивного, так и негативного регулятора транскрипции. Однако, несмотря на обилие данных, биологическая роль TRIP6 остается неясной. Ген PDLIM4/RIL Первое сообщение о гене PDLIM4/RIL появилось в 1995 г. в статье Kiess с соавт. [ 31]. Целью этой работы был поиск так называемых H-rev генов, т.е. генов, ответственных за поддержание нормального (неопухолевого) роста клеток. Методом вычитающего клонирования были идентифицированы гены, экспрессия которых была подавлена в Hras трансформированных крысиных фибробластах по сравнению с их фенотипическими ревертантрами, а также с исходной клеточной линией. 22 Неизвестный ранее ген, кодирующей LIM-домен содержащий белок, получил название PDLIM4/RIL (от reversion-induced LIM gene). Изначально считалось, что у белкового продукта гена PDLIM4/RIL кроме LIM-домена, ответственного за белок-белковые взаимодействия, никакие другие известные мотивы не выявляются. Однако позднее при тщательном анализе его аминокислотной последовательности на N-конце был обнаружен PDZ-домен [32] – мотив, также ответственный за белок-белковые взаимодействия. Таким образом, наличие нескольких модулей для взаимодействия с другими белками, а также отсутствие собственной ферментативной активности указывают на принадлежность PDLIM4/RIL к адапторным белкам, основная функция которых – участие в сборке макромолекулярных комплексов и регуляция активности белков-партнеров. RIL – представитель семейства белков ALP/Enigma Семейство ALP (от α-actinin associated LIM protein) и Enigma объединяет несколько родственных PDZ-LIM белков, идентифицированных за последнее десятилетие, многие из которых способны взаимодействовать с α-актинином. Белки ALP/Enigma млекопитающих характеризуются присутствием одного амино-концевого PDZ-домена и одного (подсемейство ALP) или трех (подсемейство Enigma) LIM-доменов на карбоксильном конце. К настоящему времени в литературе утвердилось мнение, что белки этого семейства играют роль в заякоривании актина на мембранных структурах и организации актинового цитоскелета в клетках мышечного и немышечного происхождения. На данный момент идентифицировано 4 представителя подсемейства ALP млекопитающих: ALP [33], CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa)/Elfin [34, 35 ], RIL/PDLIM4 (от PDZ and LIM domain protein) [31, Mystique/PDLIM2 [37, 38 ]. 36 ] и В литературе также имеется сообщение о гене PCD1 (от pancreatic cancer derived), кодирующем PDZ-LIM белок [39], однако отсутствие других признаков родства ALP-белкам не позволяет присовокупить его к этому подсемейству. Прототипный белок ALP – на сегодняшний день наиболее охарактеризованный член этой группы. Подсемейство Enigma также объединяет несколько белков: Enigma [40], также описанный как LMP-1 [41], ENH (от Enigma homologue) [42, 43 ]и ZASP (от Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein)/Cypher1 [44, 45], также описанный как Oracle [46]. Итак, белки семейства ALP/Enigma имеют сходные доменную структуру, общую длину и аминокислотную последовательность (Рисунок 4). 23 Гомология между RIL и CLP-36 несколько выше, чем между RIL и ALP, и составляет 43% и 41%, соответственно. Наиболее высоко сходство между CLP-36 и ALP – около 50% гомологии [47]. Рисунок 4. Белки семейства ALP/Enigma позвоночных. PDZ домен обозначен розовым цветом, LIM домен белков подсемейства ALP – зеленым, LIM домены 1, 2 и 3 белков подсемейства Enigma – голубым, синим и лиловым, соответственно; междоменная область закрашена оранжевым. Длины белков (а.о.) указаны справа (использованы последовательности белков мыши). Происхождение и эволюционная консервативность семейства ALP/Enigma Недавно у беспозвоночных был обнаружен предковый ген, соответствующий современному семейству просеквенированного В ALP/Enigma. генома червя результате Caenorhabditis анализа elegans полностью идентифицирован единственный ген T11B7.4, получивший впоследствии название alp-1, с которого считывается 4 альтернативно-сплайсированных мРНК. Наиболее короткий транскрипт кодирует C. elegans ALP-гомолог, другие 3 продукта ответственны за синтез трех Enigma-подобных белков (Рисунок 5). 24 Рисунок 5. Сложная организация alp-1 локуса C. elegans. Ген имеет сложную организацию с двумя сайтами старта и двумя стоп-кодонами и в результате альтернативного сплайсинга кодирует 4 различных транскрипта, обозначенных alp-1a, alp-1b, alp-1c и alp-1d. Цвет экзонов соответствует цвету транслируемых с них доменов. Ген C. elegans alp-1 кодирует одну ALP- и три Enigma-изоформы. Длины белков (а.о.) указаны справа. Интересно, что ALP-1 Enigma-подобные белки имеют 4 LIM-домена, а у ALP-1C отсутствует PDZ-домен. В отличие от Enigma-подобных белков позвоночных, у C.elegans Enigma-изоформы имеют четыре, а не три LIM-домена. При филогенетическом анализе было продемонстрировано, что N-концевой LIM-домен (LIM1) Enigma-белков C.elegans наиболее близок LIM-домену ALP-белков позвоночных, в то время как LIM2, LIM3 и LIM4 червя родственны LIM-доменам Enigma-белков позвоночных. В геноме плодовой мушки Drosophila melanogaster идентифицирован также единственный ген, кодирующий и ALP, и Enigma-изоформы. Структура результирующих белков весьма близка таковой у C.elegans. Таким образом, ген alp/enigma беспозвоночных (D.melanogaster и C.elegans) представляет собой предковую форму, которая в процессе эволюции в результате дупликаций и мобилизации дала начало сложно организованному семейству ALP/Enigma позвоночных. Действительно, в геноме человека обращает на себя внимание попарное распределение генов подсемейств ALP и Enigma на хромосомах. Так, ALP картируется в локусе 4q35 недалеко от ENH (4q22); CLP-36 (10q22-26.3) рядом с Cypher/ZASP (10q22.323.4); RIL (5q31.1) локализован на 5-й хромосоме вместе с Enigma (5q35.3) [48]. Подсемейство Enigma эволюционно возникло несколько раньше и присутствуют уже у хордовых [49, 50 ], в то время как гены подсемейства Alp описаны только у позвоночных [51, 52]. Ген PDLIM4/RIL человека впервые был клонирован в нашей лаборатории Башировой с соавт. в ходе экспериментов по определению физической карты кластера цитокиновых 25 генов, расположенного на 5-й хромосоме человека [36]. Рассмотрим геномную структуру человеческого гена PDLIM4/RIL более подробно. Геномная организация гена PDLIM4/RIL человека Хромосомная локализация гена PDLIM4/RIL была впервые определена в работе Szpirer с соавт. [53], целью которой явилось картирование трех H-rev генов, идентифицированных ранее. У крысы ген PDLIM4/RIL был локализован на 10-й хромосоме, а у человека – на 5-й. Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными в нашей лаборатории в ходе работы по поиску новых генов в районе кластеризации генов цитокинов на 5-й хромосоме человека в области 5q31.1 [36]. В результате проведенной кДНК-селекции на космидных клонах в районе между генами IRF1 и CSF2 картирован человеческий ген PDLIM4/RIL (Рисунок 6). Рисунок 6. Физическая карта геномного участка из хромосомного сегмента 5q31.1 человека. Черными прямоугольниками и стрелками указаны соответственно положения и ориентации генов IL3, IL4, IL5, IL13, IRF1, RAD50 и картированного гена PDLIM4/RIL. Сверху указана локализация космидных клонов, снизу – YAC-клонов. M – MluI, N – NotI. При изучении интрон-экзонной структуры было установлено, что ген PDLIM4/RIL состоит их 7 экзонов и имеет геномную длину около 14.5 т.п.н. (Рисунок 7). При этом PDZ-домен кодируют два 5’-концевых экзона, а LIM-мотив – два экзона на 3’-конце (Рисунок 8, I). 26 Рисунок 7. Рестриктная карта космидного клона 30D8 и экзон-интронная структура гена PDLIM4/RIL человека с указанием размеров экзонов и примерного размера интронов. Экзоны изображены с помощью черных прямоугольников. Стрелками обозначены сайты сплайсигна. R – EcoRI, H – HindIII, B – BssHII, S – SacII, F – SfiI. Альтернативные транскрипты гена PDLIM4/RIL человека По оценкам, сделанным в процессе анализа данных Celera Genomics и проекта «Геном человека», наш геном кодирует всего около 30 тысяч генов, т.е. намного меньше, чем предполагалось ранее [54, 55 56 , ]. Такое относительно небольшое число генов может быть компенсировано за счет альтернативного сплайсинга, дающего возможность получить несколько белковых продуктов для каждого гена. Результаты анализа полной последовательности генома и экспрессионных баз данных методами биоинформатики позволяют утверждать, что до 40-60% генов человека имеют по крайней мере одну альтернативно-сплайсированную изоформу [57]. При изучении экспрессии гена PDLIM4/RIL в образцах РНК фетального мозга человека с помощью ОТ-ПЦР с концевыми праймерами кроме ожидаемого продукта, содержащего все 7 экзонов PDLIM4/RIL , был также получен более короткий продукт, где отсутствовал 6-й экзон (Рисунок 8, II). В результате такого альтернативного сплайсинга происходит сдвиг рамки считывания, и появляется более ранний стоп-кодон. Все это приводит к исчезновению LIM-домена и укорочению белкового продукта на 84 аминокислотных остатка. I II III U IIV 27 Рисунок 8. Схематическое изображение четырех альтернативных транскриптов гена PDLIM4/RIL и соответствующих им белков. Участки, кодирующие PDZ-домен, залиты розовым цветом, область, соответствующая LIM-домену, обозначена темно-зеленым, а междоменный участок - оранжевым. При делеции 6-го экзона происходит сдвиг рамки считывания (обозначено на рисунке голубым цветом), что приводит к появлению нового стоп-кодона и, соответственно, укорочению белкового продукта на 84 аминокислотных остатка. При делеции 2-го и 3-го экзонов сдвига рамки считывания не происходит. ОТ-ПЦР анализ образцов РНК клеток линии Daudi (B-клеточная лимфома) выявил 4 альтернативных варианта гена RIL (Баширова с соавт., неопубликованные данные). Более длинные трансткрипты I и II полностью соответствовали двум транскриптам, идентифицированным ранее. В более коротком транскрипте III делетированы 2-й и 3-й экзоны, кодирующие большую часть PDZ-домена. В этом случае, однако, сдвига рамки считывания не происходит, и предсказанный белковый продукт сохраняет C-концевой Транскрипт IV комбинирует в себе описанные ранее делеции: в нем LIM-домен. отсутствуют как 2-й и 3-й, так и 6-й экзоны. Его предсказанный белковый продукт будет иметь ущербный PDZ-домен на N-конце и альтернативный пептид вместо LIM-домена на C-конце, сохраняя неизменной лишь междоменную область (Рисунок 8, I-IV). Позднее также был идентифицирован пятый альтернативный транскрипт PDLIM4/RIL с длинной 3’-нетранслируемой областью за счет наличия альтернативного неканонического сигнала полиаденилирования (AAGTAAA) в сильно удлиненном 7-и экзоне. Белок-кодирующая область этого альтернативного транскрипта была неизменной. На данный момент утвердилась точка зрения, что генные дупликации и явление альтернативного сплайсинга – два возможных молекулярных эвоционных механизма, ведущих к генетической диверсификации [58]. Нельзя исключить, что мы наблюдаем появление новых функций PDLIM4/RIL , о чем свидетельствует такое обилие альтернативно сплайсированных транскриптов. Альтернативный сплайсинг, приводящий к появлению белков с разными комбинациями PDZ и LIM-доменов, скорее всего, является механизмом регуляции функций этих мотивов и связывающихся с ними белков. Наличие пятого альтернативного транскрипта с длинной нетранслируемой областью может быть частью механизма регуляции трансляции белка. Феномен альтернативного сплайсинга описан и для других генов семейства ALP/Enigma. Так, на данный момент идентифицировано 6 изоформ ZASP/Cypher, две из которых, подобно PDLIM4/RIL, имеют лишь PDZ-домен [59]. Очевидно, что в данном случае за счет альтернативного сплайсинга осуществляется его тонкая функциональная регуляция. Так, половина альтернативных форм Cypher экспрессируется только в скелетных 28 мышцах, в то время как остальные варианты специфичны для сердца [45, 59]. В процессе эмбриогенеза баланс экспрессии разных изоформ также постоянно меняется [59]. Для ENH на данный момент описано по меньшей мере 4 альтернативно- сплайсированные изоформы, у трех из которых отсутствуют все три LIM домена. Предполагается, что функционируют такие укороченные варианты как доминантнонегативные регуляторы полноразмерного белка [60]. Mystique/PDLIM2 кодирует по меньшей мере 3 изоформы, дифференциально экспрессируемые в различных тканях [37]. В литературе имеется упоминание о существовании двух альтернативных форм ALP – гладкомышечной smALP и скелетной skALP [61]. Как уже упоминалось ранее, альтернативный сплайсинг – основной механизм, обеспечивающий разнообразие белков ALP/Enigma у беспозвоночных. У червя С.elegans существует вариант белка с отсутствующим PDZ-доменом [48], подобный RIL-изоформе III. Эволюционная консервативность PDLIM4/RIL Ген PDLIM4/RIL эволюционно консервативен, что было показано при перекрестной гибридизации с геномной ДНК крысиного, мышиного, хомячьего, человеческого, обезьяньего и куриного происхождения [31]. В базе данных GenBank имеются высокогомологичные (более 80%) полные копии кДНК для мыши, крысы и человека. Размер кДНК составляет около 1100 т.п.н., которые соответствуют 328-330 а.о. LIMдомен расположен на C-конце. Анализ экспрессии PDLIM4/RIL и других членов семейства ALP/Enigma в различных тканях К настоящему моменту накоплено достаточно много данных об экспрессии членов этого семейства. Белки подсемейства Enigma были найдены преимущественно в поперечнополосатых мышцах, где они локализуются в области Z-линий [40, 43-46, 48]. Считается, что белки этого подсемейства необходимы для поддержания структуры Z-линий при мышечном сокращении. Так, было показано, что мыши с нокаутированным Cypher умирают вскоре после рождения вследствие тяжелой миопатии [62]. Более того, мутации Cypher ассоциированы с дилатационной кардиомиопатией у людей [63]. Тем не менее появляются данные и о других тканях, где могут экспрессироваться Enigma-подобные белки. При обработке срезов 15.5-дневного эмбриона мыши (Е15.5) поликлональными антителами, специфичными к ENH, наиболее сильно оказались окрашены гладкие и скелетные мышцы, однако экспрессия этого белка также детектировалась в нейронах центральной нервной системы, в дорсальных корешковых ганглиях, а также в 29 хромаффинных клетках медуллы надпочечников [64]. При Нозерн-блот гибридизации с образцами полиаденилированной РНК из разных органов человека наибольший уровень ENH была зафиксирована в сердце и мышечной ткани, хотя экспрессия этого гена детектировалась и в других тканях [65]. Эти и некоторые другие данные указывают на возможное участие этих белков в развитии нервной системы. По сравнению с подсемейством Enigma, ALP-подобные белки экспрессируются не только в поперечно-полосатых мышцах. Так, Alp детектируется исключительно в мышцах, сердце и тканях, обогащенных гладкомышечными клетками (артерии, желудок, кишечник, легкое), взрослой крысы, пятнадцатидневного эмбриона крысы (E15) и человека [33], четырнадцатидневного мышиного девятнадцатидневного куриного эмбриона [61]. эмбриона (E14) [47] и В последней работе также описано весьма интересное наблюдение: уровень белка Alp значительно повышался во время миогенной дифференцировки (в период между 11-м и 18-м днями развития куриного эмбриона), подчеркивая его важность для формирования мышц. Развитие in utero дилатационной кардиомиопатии правого желудочка, наблюдаемой у мышей, нокаутных по гену Alp [66], даже при отсутствии патологии скелетных мышц [67] полностью согласуется с этими результатами. Небезынтересно, что у человека ген ALP картируется в области 4q35 вблизи от гетерохроматинового локуса, ассоциированного с фасциоскапулогумеральной мышечной дистрофией [68] – наиболее распространенной аутосомно-доминантной мышечной дистрофией. В отличие от ALP CLP-36, RIL и Mystique также экспрессируются во многих немышечных клетках. Так, у мыши на разных стадиях эмбрионального развития Clp-36 детектируется в печени, коже и эпителии ротовой полости, пищеварительной системы, матки, мочевого пузыря, легкого и в эндотелии. Весьма высокий уровень экспрессии наблюдался в развивающемся сердце четырнадцатидневного эмбриона (E14). Экспрессия Clp-36 в гладкомышечных клетках и в поперечно-полосатых мышцах не детектировалась [47, экспрессируется. 69 70 , ]. Подобно Clp-36, у мыши Mystique в скелетных мышцах не Методом Нозерн-блот гибридизации наибольший его уровень зарегистрирован в легких, также эта мРНК детектируется в почке, яичке, селезенке и в меньшей степени в сердечной мышце. В мозге и сердечной мышце неожиданно была обнаружена экспрессия наиболее короткой изоформы Mystique с отсутствующим LIMдоменом [37]. Подобно CLP-36 и Mystique RIL детектируется преимущественно в эпителиальных тканях, однако наблюдаются значительные отличия в паттернах экспрессии этих генов. Картина экспрессии Ril, полученная с помощью in situ гибридизации в мышиных тканях, 30 указывает на возможную физиологическую роль продукта этого гена в эпителиальных клетках бронхов и альвеол, фаллопиевых труб и желудка, а также в постмитотических нейронах мозга. Возможна также его роль в дифференцировке сперматогоний в сперматиды [31]. С этими результатами хорошо согласуется факт обнаружения Ril в легком, мозге, яичнике и матке четырнадцатидневного мышиного эмбриона [47]. При анализе экспрессии RIL в тканях 20-недельного эмбриона человека, проведенном в нашей лаборатории методом Нозерн-гибридизации, наиболее высокий уровень мРНК был зафиксирован в головном мозге, продолговатом и спинном мозге; также RIL детектировался в тимусе, почке, тонкой кишке и в меньшей степени в сердце и легком [Баширова с соавт., неопубликованные данные]. Сравнение паттернов экспрессии RIL и CLP-36 наводит на мысль о различной, хотя и частично перекрывающейся физиологической роли продуктов этих генов. Для того, чтобы приблизиться к пониманию возможной функции RIL, обратим более пристальное внимание на доменную структуру этого белка, на его локализацию в клетке и на его партнеров по взаимодействию. Репертуар взаимодействий белка RIL На сегодняшний день устоялось мнение, что PDZ-LIM белки принимают активное участие в поддержании структуры и регуляции динамики актинового цитоскелета в клетках как мышечного, так и немышечного происхождения. актининами или другими структурными белками Взаимодействие с α- цитоскелета как правило осуществляется через PDZ домен белков семейства ALP/Enigma [33, 44, Error! Bookmark not defined., 69, 71 72 , ]. Кроме того, PDZ-LIM белки участвуют в регуляции активности транскрипционных факторов [64, 73 , 74 ], киназ [42, 44, 75 , 76 ], кальциевых каналов [77], рецепторов [40] и рецепторных тирозин-киназ [78] и других сигнальных молекул [79]. В этом отношении RIL – также не исключение: среди его партнеров были идентифицированы протеинтирозинфосфатаза PTP-BL, актин-ассоциированный LIMбелок TRIP6, компонент актиновых стресс-фибрилл α-актинин-1 и глутаматный AMPAрецептор GluR1. 31 RIL взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой PTP -BL Первый белок-партнер RIL описал Cuppen с соавт. [32]. Эта группа исследователей занималась изучением свойств мышиной протеинтирозинфосфатазы PTP-BL. При поиске белков, взаимодействующих с PTP-BL, с помощью дрожжевой двухгибридной системы было обнаружено, что данный белок посредством своих PDZ-доменов связывается с LIM-доменом белка RIL (как мышиного, так и человеческого). Мышиный PTP-BL (или PTP-Bas человека) – крупный цитоплазматический белок массой 270кДа, имеющий модулярную структуру. На его N-конце он содержит киназный некаталитический домен KIND с неясной функцией. За ним следует FERM-домен. Считается, что эти домены обеспечивают связь между мембранными рецепторами и актиновым цитоскелетом. На C-конце PTP-BL расположен тирозинфосфатазный домен, каталитическая активность которого была продемонстрирована in vitro. Между FERM и PTP-доменами расположены пять PDZ-доменов [80], которые и использовались в качестве зонда при скрининге библиотеки кДНК с помощью двухгибридной системы. Было показано, что для связывания PTP-BL с белком RIL необходимо и достаточно наличие второго или четвертого PDZ-домена PTP-BL и LIM-домена RIL. Этот результат был подтвержден in vivo в экспериментах по коиммнопреципитации двух белков с помощью поликлональных антител. Этот результат был опровергнут в более поздней работе авторов [18]. В результате более тщательного исследования было установлено, что с PDZ-доменом PTP-BL взаимодействует C-концевой участок RIL, а LIM-домен играет лишь стабилизирующую роль. Также было установлено, что RIL-LIM фосфорилируется по тирозиновому остатку Y274 как in vitro, так и in vivo и дефосфорилируется фосфатазным доменом PTP-BL in vitro [32]. Все эти данные стали первым прорывом в функциональном изучении гена RIL. 32 Краткая функциональная характеристика PTP-Bas/PTP-BL PTP-Bas была впервые протеинтирозинфосфатаз клонирована с в использованием ходе работы по ПЦР-амплификации поиску новых консервативных каталитических участков из линии клеток базофилов, откуда и получила свое название. Мышиный гомолог был назван соответственно PTP-basophil-like (сокращенно PTP-BL). О сложности и разнообразии функций этой молекулы можно судить по белкам, с которыми она взаимодействует. Пожалуй, наиболее интересным является участие PTP-Bas в Fas-индуцированном апоптозе (другое название PTP-Bas – Fas-associated phosphatase 1, или FAP-1). Своим вторым PDZ-доменом PTP-Bas связывается с Fas и тем самым негативно регулирует активацию сигнального каскада, инициируемого при взаимодействии Fas с Fasлигандом. Считается, что именно гиперэкспрессия PTP-Bas в клетках рака яичника делает их резистентными к Fas-индуцированному апоптозу [81]. PTP-Bas также может участвовать в регуляции активности транскрипционного фактора NFκB. Это происходит за счет взаимодействия первого PDZ-домена PTP-Bas с анкириновыми повторами IκBα. Более того, PTP-Bas способна дефосфорилировать IκBα, тем самым, по-видимому, препятствуя диссоциации комплекса NFκB-IκBα [80]. Наиболее важным для понимания функции PTP-Bas является идентификация субстратов ее форфатазного домена. Было показано, что протоонкогены v-src и β-catenin могут быть дефосфорилированы с участием PTP-Bas in vitro, однако функциональная значимость таких событий остается неизученной. Тем не менее, взаимодействие PTP-Bas с β- катенином, по всей видимости, неслучайно. Об этом может свидетельствовать факт взаимодействия со вторым PDZ-доменом PTP-Bas хорошо изученного опухолевого супрессора APC [82]. Связывая β-катенин цитоплазме, APC препятствует его транслокации в ядро и, следовательно, активации транскрипции в комплексе с транскрипционным фактором TCF/Lef [83]. О вовлеченности PTP-Bas/PTP-BL в регуляцию структуры актинового цитоскелета может свидетельствовать факт ее участия в цитокинезе [84]. Недавно также описан фенотип мышей, нокаутных по PTP-BL: у этих животных нарушена репарация моторных нейронов, однако более серьезных изменений не выявлено. Авторы статьи считают, что такой «мягкий» фенотип – отражение роли PTP-BL как основы для сборки сигнальных комплексов, а не отсутствия фосфатазной активности [85]. 33 RIL взаимодействует с LIM -доменным белком TRIP6 Работа по поиску партнеров RIL по связыванию была продолжена, и первые результаты были получены уже в 2000 году. На этот раз в качестве «наживки» в дрожжевой двухгибридной системе был использован PDZ-домен RIL. Было установлено, что этот участок RIL связывается со вторым и, в меньшей степени, с третьим LIM-доменом белка TRIP6. Также при этом скрининге был выделен клон, весьма неожиданно кодировавший LIM-домен самого RIL. Таким образом, RIL может димеризоваться за счет взаимодействия RIL-LIM c RIL-PDZ. В том же исследовании было показано, что TRIP6 также связывается с PTP-BL. Релевантность этих взаимодействий была подтверждена с помощью коиммунопреципитации отдельных мотивов этих белков. Наконец, с помощью поликлональных антител, специфичных для PTP-BL, RIL и TRIP6, была определена внутриклеточная локализация этих белков. Оказалось, что в клетках карциномы линии A431 все три белка колокализуются в субмембранной области, богатой фибриллярным актином. Кроме того, значительные количества PTP-BL и TRIP6 находились в ядре [86]. Роль RIL в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл Ранее уже отмечалось, что представители семейства ALP, к которому относится и RIL, белки ALP и CLP-36 посредством своих PDZ-доменов взаимодействуют с спектринподобными повторами α-актининов и колокализуются в клетках с актиновыми стрессфибриллами [33, 61, 69]. Отсюда логично вытекало предположение, что RIL также может ассоциироваться с актиновым цитоскелетом. Эта гипотеза была подтверждена в работе Vallenius с соавт. [47]. Первым шагом в исследовании функции белка RIL было определение его внутриклеточной локализации. По причине отсутствия коммерчески-доступных RILспецифичных антител авторы этого исследования были вынуждены создать конструкцию для экзогенной экспрессии этого белка, слитого с эпитопом Myc. При иммунофлюоресцентной окраске клеток, в которые была введена такая конструкция, RIL действительно фаллоидином. колокализовался с полимеризованным актином, окрашенным Однако в RIL-экспрессирующих клетках наблюдались драматические изменения в морфологии актинового цитоскелета: в них обнаруживались атипично толстые волокна и актиновые кластеры (Рисунок 9). Подобная картина наблюдалась не только в клетках остеосаркомы U2OS, но и эпителиального (А549) происхождения и в фибробластах (COS-7). Дальнейшие эксперименты по частичному разрушению 34 актинового цитоскелета детергентом или цитохалазином B позволили сделать вывод, что RIL является компонентом стресс-фибрилл. Рисунок 9. RIL локализуется на актиновых стресс-волокнах. Конструкция для экспрессии MycRIL была транзиентно введена в клетки остеосаркомы U2OS с помощью трансфекции. Клетки подвергли двойной флюоресцентной окраске Myc-специфичными моноклональными антителами (A) для детекции Myc-RIL и Texas Red-конъюгированным фаллоидином (B) для визуализации актиновых филаментов. (C) – появление желтого цвета говорит о колоколизации RIL с актиновыми волокнами. Нахождение RIL на актиновых волокнах могло говорить о том, что, подобно ALP и CLP36, RIL может взаимодействовать с α-актинином. Это предположение было подтверждено в экспериментах по коиммунопреципитации этих белков, введенных экзогенно. При более детальном исследовании было установлено, что RIL связывается с α-актинином своим PDZ-доменом и за счет этого облегчает взаимодействие α-актинина с актиновыми филаментами. В работе было предложено два возможных механизма формирования нерегулярных актиновых фибрилл. Во-первых, RIL может рекрутировать α-актинин в формирующиеся волокна или стабилизировать взаимодействие α-актинина с актиновыми филаментами. Альтернативный механизм возникновения толстых актиновых фибрилл – дефект при их разборке. Так или иначе, было убедительно показано, что RIL участвует в регуляции структуры и динамики актинового цитоскелета. 35 Краткая характеристика α -актининов α-Актинины – группа из четырех высокородственных генов, продукты которых были изначально описаны как белки, образующие поперечные сшивки между актиновыми филаментами в поперечно-полосатых мышцах. Однако с течением времени экспрессия α-актининов была обнаружена и в гладких мышцах, и в немышечных типах клеток, где они локализуются в области межклеточный контактов, фокальных контактов, в ламеллиподиях и вдоль актиновых стресс-волокон мигрирующих клеток. Функционально α-актинин представляет собой антипараллельный гомодимер, состоящий из полипептидных цепей массой около 100 кДа. На N-конце белка содержится актинсвязывающий домен (ABD – actin-binding domain), состоящий из двух CH-доменов (calponin homology), гомологичных кальпонину. С-конец молекулы образован кальмодулин-подобным (СaM) доменом, связывающим ионы кальция. Описанные структуры соединяются четырьмя спектриновыми повторами, обеспечивающими гомодимеризацию α-актинина, в результате чего образуется жесткий удлиненный «ствол» с актин-связывающими доменами на обоих концах, длина которого определяет расстояние между актиновыми фибриллами. шарнирным участком, позволяющим ABD соединен со «стволом» гибким соединять как параллельные, так и антипараллельные актиновые пучки. Таким образом, геометрия актинового каркаса, повидимому, зависит от присутствия дополнительных структурных белков [87]. α-Актинин имеет три основных функции. 1. Это основной белок, который образует поперечные сшивки актиновых филаментов Z-диска поперечно-полосатых мышц, соединяя соседние саркомеры. 2. α-Актинин локализуется в подмембранном пространстве, где связывает кортикальный актин с интегринами и трансмембранными рецепторами, а также обеспечивает стабильность структуре фокального контакта. 3. В немышечных клетках он является основным компонентом актиновых стресс-волокон. На данный момент идентифицировано 4 изоформы α-актинина: две немышечных (1 и 4) и две мышечных (2 и 3). Несмотря на крайне высокую гомологию (86% идентичности аминокислотной последовательности) α-актинины 1 и 4 имеют дивергентные функции: Подоциты мышей, нокаутных по изоформе 4, имеют аномальную морфологию, хотя и экспрессируют α-актинин-1, и у таких животных развивается гломерулярный склероз, приводящий к тяжелой почечной недостаточности. Кроме того, известно, что экспрессия α-актинина-4 значительно повышается в мигрирующих клетках [88]. α- Актинин-2 человека высоко экспрессируется во всех типах мышечных клеток, а изоформа 3 встречается только в некоторых типах быстрых волокон. Более того, у некоторой части человеческой популяции α-актинин-3 отсутствует, что, однако, не 36 связано с развитием каких-либо патологий. Этот факт говорит о полном перекрывании функций этих изоформ [89]. На данный момент выявлено четыре основных механизма регуляции α-актинина: 1. ограниченный протеолиз (кальпаин расщепляет α-актинин в процессе деадгезии), 2. связывание с фосфоинозитил-интермедиатами (снижает сродсво к β-интегринами и актину), 3. фосфорилирование тирозин-киназами (в частности, фосфорилирование киназой фокальных контактов FAK препятствует взаимодействию α-актинина с актином) и 4. связывание с Ca2+ (снижает аффинность к актину). Мышечные изоформы α- актинина, однако, потеряли способность связывать ионы кальция, что, по-видимому, защищает структуру мышечных волокон от дестабилизирующего эффекта кальция во время Са2+-индуцированных сокращений [90]. Идентифицированы и другие белки- партнеры α-актинина, среди них можно отметить МАР-киназы, LIM-доменные адапторные белки, глутаматные NMDA рецепторы. В последние годы становится очевидно, что α-актинин – не только белок, образующий сшивки актиновых филаментов, но и важный регулятор организации фокальных контактов и цитоскелет-связанный «плацдарм» для сборки сигнальных комплексов [91]. Транспортная функция RIL Итак, белки семейства ALP в своем составе имеют два функциональных модуля: с помощью PDZ-домена они связаны со структурым компонентом актиновых фибрилл αактинином, а при этом LIM-домен остается свободным для взаимодействий с некоторыми киназами и другими сигнальными белками. В этом свете идея о возможной транспортной функции PDZ-LIM белков не выглядит безосновательной. Такая гипотеза была сформулирована в работе Vallenius [75] (см. Рисунок 10). Рисунок 10. Белки семейства ALP могут выполнять транспортную функцию. Согласно этой гипотезе ALP-белки своим PDZ-доменом заякорены на α-актинине, а LIM-домен остается свободным для других взаимодействий. 37 Это предположение вскоре нашло свое подтверждение в работе Shulz с соавт. [92]. Статья посвящена поиску механизмов транспорта в нейронах глутаматных AMPAрецепторов на поверхность синаптической поверхности и их рециклизации. Известно, что цитоскелет нейронов состоит преимущественно из актиновых волокон, разрушение которых влияет катастрофически на концентрацию синаптических AMPA-рецепторов и передачу нервных сигналов. В ходе работы с помощью двухгибридной дрожжевой системы, метода, уже не раз подтвердившего свою эффективность, было установлено, что одна из субъединиц глутаматного рецептора GluR-A связывается с LIM-доменом белка RIL, который в свою очередь через PDZ-домен взаимодействует с α-актинином. В пользу функциональной значимости образования такого комплекса свидетельствует тот факт, что RIL может быть коиммунопреципитирован с GluR-A in vivo. Более того, в экспериментах по субклеточному фракционированию лизатов переднего мозга наиболее обогащена белком RIL оказалась именно постсинаптическая фракция. Следует обратить внимание, что в предшествующих исследованиях наибольшая экспрессия RIL была отмечена именно в тканях мозга (см. стр. 29). Верификация функции RIL в транспорте AMPA-рецепторов была проведена на первичной культуре нейронов гиппокампа. Было установлено, что гиперэкспрессия этого белка в нейронах приводит к 2,5-кратному обогащению глутаматных рецепторов в области синапсов и 25% усилению AMPA-зависимых синаптических токов, для чего было необходимым наличие неповрежденных LIM и PDZ-доменов. Таким образом, полученные данные предполагают непосредственное участие белка RIL в транспорте и правильной локализации AMPA-рецепторов в нейронах мозга. Возможное участие RIL в злокачественной трансформации Структура и динамика актинового цитоскелета сопряжены с рядом сигнальных путей и, в частности, принимают участие в регуляции клеточной адгезии, распластывании и миграции клеток. Состояние цитоскелета влияет также на процессы деления клеток и их злокачественную трансформацию. В этом свете представляет интерес уточнение потенциальной роли RIL в канцерогенезе. Первое упоминание о RIL было сделано в работе, посвященной выявлению различий между HRAS-трансформированными крысиными фибробластами и родственными им фенотипически нормальными клетками [31]. Было показано, что экспрессия RIL значительно подавлена в клетках с введенными онкогенами Ras или Raf, но полностью 38 восстанавливалась в независимых фенотипических ревертантах. Такое «поведение» позволило отнести RIL к потенциальным опухолевым супрессорам. Через несколько лет в свет вышло новое исследование, ставившее своей целью поиск генов, задействованных в образовании злокачественных опухолей. В этой работе сравнивались библиотеки кДНК из нормальных первичных куриных фибробластов CEF и тех же клеток, трансформированных вирусным онкогеном v-Jun. В результате субстракционного клонирования было идентифицировано 6 генов, экспрессия которых значительно повышалась при злокачественной трансформации. Одним из этих генов оказался куриный гомолог RIL. При анализе панели CEF, трансформированных мутантами v-Jun с различной трансформирующей способностью, выяснилось, что экспрессия RIL напрямую коррелировала со степенью злокачественности клеток, т.е. в условиях этой модели RIL проявлял себя как потенциальный онкоген. Тем не менее, гиперэкспрессия RIL в куриных фибробластах к трансформации или детектируемому изменению морфологии или скорости пролиферации не привела [93]. Недавно в литературе появилось сообщение о подавлении уровня мРНК RIL при раке простаты. При углубленном изучении этого феномена выяснилось, что в более чем 90% проанализированных опухолевых образцах наблюдалось аберрантное гиперметилирование промоторной области этого гена по сравнению с окружающей нормальной тканью от того же пациента. Авторы исследования даже предлагают использовать подавление RIL в комбинации с анализом экспрессии нескольких других генов в качестве маркера рака простаты [94]. Эти данные прекрасно согласуются с другими сообщениями о репрессии RIL при злокачественной трансформации [31, 95, 96]. Итак, на сегодняшний день данные об участии RIL в онкогенезе все еще весьма разрозненны и противоречивы. Роль RIL в этом процессе остается неясной, но можно предположить, что она зависит от конкретных механизмов трансформации. Данные о дифференциальной экспрессии RIL, полученные с использованием микропанелей олигонуклеотидов За последние годы благодаря взрывообразному развитию технологии микрочипов был накоплен значительный массив данных об экспрессии генов. Выводы, сделанные при анализе этой информации, могут служить отправными точками в поиске и изучении функций гена RIL. Обратимся к некоторым данным, опубликованным на этот счет к сегодняшнему дню. Авторы одного из первых подобных исследований ставили своей целью поиск отличий париетальных (продуцирующих кислоту) клеток от других типов клеток выстилки 39 желудка. Ген RIL был идентифицирован в составе молекулярной сигнатуры из 92 генов, экспрессия которых достоверно повышена в париетальных клетках. Высокий интерес к изучению клеток выстилки желудка обусловлен необходимостью выявления механизмов развития гастритов и пептических язв желудка, являющихся важной медико-социальной проблемой [97]. Другое исследование было посвящено поиску генов-мишеней гетеродимерного транскрипционного фактора SIM1/ARNT2. В культивируемых нейрональных клетках с тетрациклин-индуцируемой гиперэкспрессией этих белков активация конструкции приводила к повышению уровня RIL почти в два раза. функционирование этого транскрипционного Известно, что корректное фактора необходимо для дифференцировки нейроэндокринных органов в гипоталамусе мыши. Установлено, что мутации SIM1 приводят к раннему развитию ожирения у мышей, а повреждения этого гена у человека ассоциированы с излишним весом [98]. Недавно появилось сообщение, что, параллельно с генами белков острой фазы, экспрессия RIL значительно повышается в Мюллеровых глиальных клетках сетчатки при диабете, что подразумевает участие RIL в воспалительных процессах. Исследование было проведено на крысиной модели диабета, вызванного стрептозотоцином [99]. Приведенные данные ясно показывают, сколь многообразны процессы, в которых задействован RIL. Массив подобной информации неустанно продолжает расти, открывая все новые грани функции этого гена. Из других данных, которые могут помочь понять функцию RIL, обращает на себя внимание сообщение, увидевшее свет в 2003 году. В этой статье обсуждается возможное участие гена RIL в развитии остеопороза, т.е. снижении минеральной плотности и разряжении костной ткани. Авторы исследования проанализировали образцы ДНК, выделенной из крови 370 японских женщин, как здоровых, так и больных остеопорозом. Была установлена корреляция между точечным полиморфизмом –3333T→C от точки начала транскрипции RIL и повышенными риском развития этого заболевания. Эти результаты подразумевают участие RIL в дифференцировке остеобластов и регуляции метаболизма костной ткани [100]. 1.1.2. Выбор оптимального направления исследований При разработке оптимальной стратегии исследования мы исходили из необходимости установления существования корреляции между часто встречаемой эпигенетической 40 супрессией гена PDLIM4/RIL и своеобразным паттерном изменений транскрипции генов, который может обуславливать выявленные нами ранее характерные морфологические признаки клеток рака молочной железы. В результате исследования нам предстоит также разработать диагностический тест, который позволит определять в клинических образцах супрессию гена PDLIM4/RIL. Прежде чем проводить анализ клинических образцов мы считаем необходимым верифицировать данные и методики на панели линий клеток рака молочной железы, которые были ранее нами охарактеризованы в плане экспрессии гена PDLIM4/RIL и состояния сигнальных путей. Эти линии клеток также должны служить источником РНК для секвенирования по технологии NGS. Кроме этого необходимо провести анализ состояния гена PDLIM4/RIL на уровне ДНК чтобы исключить появление точечных мутаций в кодирующей области. Наконец, для верификации эпигенетического характера супрессии гена PDLIM4/RIL необходимо провести анализ метилирования этого гена на уровне ДНК и гистонов. Эти задачи были сформулированы как первоочередные и они стали задачами первого этапа. На втором этапе будет проведено изучение образцов опухолей рака молочной железы, полученных в клинике, с целью разработки теста и подтверждения выводов, полученных на культурах клеток. 41 1.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Использованные реактивы В работе были использованы следующие материалы и реактивы: трипсин сухой (Invitrogen), версен (Диа-М), глицерин («Sigms-Aldrich», США), набор для определения концентрации белка «Bio-Rad Protein Assay Kit» («Bio-Rad», США), фетальная бычья сыворотка (Invitrogen), пластиковая культуральная посуда («Nunk» Дания), криопробирки («Sigma», США), среды AmnioMAX (Invitrogen), среда DMEM/F12 (1:1) (Applichem), L-глутамин (Sigma-G5763), диметилсульфоксид («Amresco», США), соляная кислота, гидроксид натрия, спирт этиловый, ледяная уксусная кислота; реактивы производства «Sigma» (США): трипановый синий, агароза, Трис-HCl, ацетат натрия, бромистый этидий, трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис), динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2ЭДТА); ферменты и реактивы производства ЗАО «Медиген», Россия: РНК-зависимая ДНК-полимераза вируса мышиного миелобластоза Mo-MuLV, Taq ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты; набор РИБО-сорб, (производства ЗАО «Интерлабсервис», Россия) для выделения ДНК/РНК; набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System производства «Promega» (США) для выделения продуктов амплификации из агарозного геля. Для определения нуклеотидной последовательности ДНК использовали наборы реагентов фирмы ABI. Эритроциты человека для постановки реакции гемагглютинации получали от волантера – сотрудника лаборатории. Промывание эритроцитов и подготовку рабочей 1%-ной суспензии осуществляли с использованием 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологический раствор). Иммунная сыворотка овцы к вирусу Сендай, культивированному в клетках 4647, получена путем трехкратной иммунизации овцы породы Дорпер (Ферма Capri, Россия). Растворы для культур клеток: Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) содержит хлорид натрия (0.14M), фосфатный буфер (0.01M), хлорид калия (0.003M). Мы использовали PBS в таблетках (Invitrogen, USA), одну таблетку растворяли в 100мл дистиллированной воды и автоклавировали для стерилизации. Раствор трипсина для пересева клеток готовится на PBS добавлением ЭДТА до 1мМ и трипсина до 0,05%. Сначала готовится раствор 1мМ ЭДТА в 1ХPBS, этот раствор автоклавирусется для стерилизации при 42 121°С, 45 мин. Затем добавляется соответствующее количество сухого трипсина и полученный раствор фильтруют через шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 нм (стерильная фильтрация). Раствор трипсина для подращивания вируса Сендай готовится на среде ДМЕМ добавлением сухого тирпсина до конечно концентрации 10 мг/мл (1000-кратный раствор штоковый), затем полученный раствор фильтруют через шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 нм для стерилизации, расфасовывают в микропробирки по 100 мкл и хранят при -20°С до использования. Для работы с культурами клеток использовали культуральный пластик фирмы Greiner, Германия. Культивирование клеток и ростовая среда Краткая характеристика культур клеток, использовавшихся в работе, приведена в Таблица 1. Если не указано иначе, клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дюльбекко (DMEM), дополненной 2 мМ L-глутамина, 4.5 г/л глюкозы, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (BioWhitacker). Первичные эпителиоциты молочной железы человека (Cambrex) выращивали в среде MEGM (mammary epithelium growth medium), содержащей все необходимые ростовые факторы (Cascade Biologics). Культивирование проводили при 37ºС во влажной атмосфере с 5% СО2. Таблица 1. Клеточные культуры, использованные в работе, и их происхождение. Происхождение Клеточная линия 293Т человеческие эмбриональные почечные клетки, трансформированные ДНК из ранней области аденовируса 5 типа Н1299 карцинома легкого человека (ATCC номер CRL-5803) А549 карцинома легкого человека (АТСС номер CCL-185) HeLa рак шейки матки человека, клетки трансформированы вирусом папилломы человека 18 типа производная HeLa, содержит стабильно введенный репортер HeLa LC5 транскрипционной активности р53, в качестве репортерного гена была использована β-галактозидаза SW480 аденокарцинома ободочной кишки человека (ATCC номер CCL228) 43 А431 эпидермоидная карцинома человека (ATCC номер CRL-1555) U-2 OS остеосаркома человека (АТСС номер HTB-96) HMEC MCF7 BT-20 Нормальные первичные эпителиоциты молочной железы человека (Cambrex) аденокарцинома молочной железы человека, метастатическая эффузия плевры (АТСС номер HTB-22) карцинома молочной железы человека (АТСС номер НТВ-19) инфильтративная протоковая карцинома молочной железы T-47D человека, метастатическое поражение плевры (АТСС номер НТВ133) MDA-MB-468 MDA-MB-231 MDA-MB-435S MDA-MB-436 BT-474 Культивирование аденокарцинома молочной железы человека, метастатическое поражение плевры (АТСС номер НТВ-132) аденокарцинома молочной железы человека, метастазы плевры (АТСС номер НТВ-26) протоковая карцинома молочной железы человека, метастатическая эффузия плевры (АТСС номер НТВ-129) аденокарцинома молочной железы человека, метастатическое поражение плевры (АТСС номер НТВ-130) инвазивная протоковая карцинома молочной железы человека (АТСС номер НТВ-20) опухолевых клеточных линий проводили с использованием следующих вариантов ростовых сред: - DMEM (Панэко, РФ) c добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, стандартной концентрации антибиотиков (ампициллин -100 мкг/мл, гентамицин -80-160 мкг/мл и амфотерицин В – 25 мкг/мл) и 5% среды AmnioMAX (Invitrogen, Cot. No 11269032); - среда F12/DMEM (1:1) c добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, стандартной концентрации антибиотиков (пенициллин – 100 мкг/мл и стрептомицин – 100 мкг/мл). 44 Протокол пересева культур клеток. 1. Приготовить смесь растворов DMEM и сыворотки в отношении 9:1. Рассчитывать объём смеси исходя из способа пересева. 2. Удалить ростовую культуральную среду. 3. Промыть 2 раза по 10 мл раствором PBS. 4. Удалить PBS, остатки PBS убрать пипеткой. 5. К клеткам добавить 0,5 мл раствора трипсина, покачать для равномерного распределения по всей поверхности монослоя. При необходимости поставить клетки в термостат (37°C). 6. Когда монослой клеток разрыхлится под воздействием трипсина, добавить ростовую среду DMEM c 10% FBS (аккуратно, чтобы не возникла пена). Добавляемый объём можно определить из соображений удобства пересева. Например, если пересев идёт на 5 чашек, то можно добавить 9,5 мл. 7. Часть клеток перенести на новые чашки. 8. Добавить ростовую среду до объёма 10мл. 9. Содержимое каждой чашки дополнительно пипетировать для разрушения агрегатов клеток с целью получения гомогенной суспензии. Не бояться образования пены, которая исчезнет при дальнейшем инкубировании в термостате. Криоконсервация и размораживание клеточных линий. Для замораживания в жидком азоте (-1960С) клетки снимали с поверхности культуральных сосудов раствором трипсина с версеном (1:3), осаждали из суспензии центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и суспендировали в среде для заморозки, состоящей из среды DMEM с добавлением 40-80%- ФС и 10% ДМСО. Концентрацию клеток доводили до 1-2 млн клеток/мл, расфасовывали клеточную суспензию в полиэтиленовые ампулы фирмы «Nunk» по 1 мл. Ампулы помещали в пары жидкого азота (-1200С) или в холодильник (-700С) на 24 часа, после чего переносили непосредственно в жидкий азот. Размораживали клетки, помещая ампулы в теплую воду с температурой 37 - 410C, после чего отмывали клетки в среде DMEM и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в ростовой среде DMEM(M) с 15% ФБС и высевали в культуральные планшеты или стеклянные сосуды. Полимеразная цепная реакция. Реакции проводили со специфическими праймерами в условиях, продиктованных составом праймеров, размером ДНК и в зависимости от типа использованной 45 термостабильной полимеразы. фирмы Bio-Rad (США). ПЦР проводили с использованием амплификатора Для анализа продуктов ПЦР использовали метод гель- электрофореза. Электрофорез проводили в 1,5% горизонтальном агарозном геле в буфере TBE (89 mM Трис-НСl; 2 мМ ЭДТА pH 8.0; 89мМ Н3BО3). Для визуализации ДНК использовали бромистый этидий, который добавляли непосредственно в гель и в буфер в процессе их приготовления до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Оценку длины фрагментов ДНК проводили, сравнивая положения зон проб с зонами маркерной ДНК известной длины. Синтез комплементарных ДНК Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием синтетического «случайного» праймера dN6. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 4 мкл пятикратного буфера для обратной транскриптазы (Promega, США), 10 мМ DTT, по 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2,5 М гексамера dN6, 50 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Промега, США) при 370C в течение 1 часа. Перед добавлением обратной транскриптазы смесь прогревали при 650С в течение 2 минут. Определение нуклеотидных последовательностей кДНК Секвенирование соответствующих фрагментов генома вирусов и клеток проводили на автоматическом анализаторе ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные последовательности редактировали с помощью программы SeqMan II DNASTAR 7.0. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием сервера Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, США) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), включающего базы данных GenBank (NCBI, США), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) и DDBJ (DNA DataBank of Japan) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали приложение ClustalW программы Mega 4.1. Все генно-инженерные манипуляции, микробиологические процедуры (получение и трансформация компетентных клеток E.coli, наработка и анализ рекомбинантных ДНК) проводили в соответствии с инструкциями к используемым наборам ферментов и китов. Для проведения трансфекции плазмидные ДНК были наработаны в препаративных количествах из 1000 мл среды Лурия-Бертани и выделены с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов «EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Cat.12362). 46 Рекомбинантные варианты лентивирусов получали методом трансфекции с использованием Lipofectin Reagent в среде Opti-MEM (Gibco BRL). Для получения вариантов гена с заданными свойствами проводили синтез перекрывающихся фрагментов гена в виде олигонуклеотидов протяженностью 45-55 пар оснований, их отжиг, последующую достройку брешей полимеразой, соединение фрагментов ДНК лигазой, амплификацию с помощью ПЦР с введением сайтов для рестриктаз. Полученные копии синтетического гена далее вводятся в ДНК-плазмиды с помощью генно-инженерных технологий. Биоинформатическая обработка данных секвенирования Филогенетический анализ: Нуклеотидные последовательности для проведения филогенетического анализа были получены из базы данных GenBank. Обработка последовательностей, филогенетический и молекулярно-генетический анализ проводились с использованием программных пакетов MEGA 4 [26] и Vector NTI 9 (InforMax, США). Генетические расстояния между последовательностями рассчитывали при помощи программы Mega v.4.1 с использованием двухпараметрической модели нуклеотидных замещений Кимуры [27]. Вычисление генетической дивергенции (π) между штаммами вариантов вируса Сендай и другими представителями семейства парамиксовирусов проводили, используя программу DNAsp v. 4.10.9 [28] в соответствии с рекомендациями Нея и Миллера [29] в окне длиной 100 нуклеотидов, с шагом 25 нуклеотидов. Анализ рекомбинации проводили, используя малый информационный критерий Akaike [30] в программе GARD (Genetic Algorithms for Recombination Detection) [31]. Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были рассчитаны в программе Oligo 6.0. Вестерн-блот анализ белков. Для детекции белков экстракты клеток фракционировали в полиакриламидном геле, переносили белки на мембраны и инкубировали с специфическими антителами. Проявка белков осуществлялась обработкой вторичными антителами, мечеными ферментами и добавлением их субстратов. Более подробно, методика выглядит следующим образом. 47 1. Электрофоретическое разделение белков проводили в камере “BioRad” в 5% концентрирующем и 14% разделяющем акриламидном геле при V=100 через концентрирующий и разделяющий гель. 2. Перенос белков с геля на мембрану осуществлялся в Mini Trans-Blot cell “BioRad”, на мембрану Immun-BlotTMPVDF Membrane for Protein Blotting, 0,2µm при V = 100 1 час 20 минут. 3. После легкого промывания буфером для переноса мембраны поместили в блокирующий раствор - ТВS рН 7,4 с 5% молоком (Skim Milk Powder, Biochemika, Fluka) на 1 час при RT на качалке. 4. Отмывали мембраны 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 на качалке. 5. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела или поликлональные специфические сыворотки (Abcam. США), в рабочей концентрации 0,2 мкг/мл, в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. Инкубировали мембраны с антителами в течение ночи, ~ 16 часов, при +4ºС. 6. После связывания с первичными антителами отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке. 7. В качестве вторичных антител использовали Anti-rabbit IgG (Whole molecule) alcaline phosphatase conjugate (Sigma) в рабочем разведении 1:5000 в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. Инкубировали 1 час при RT на качалке. 8. После связывания с конъюгатом отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке и 1 раз с буфером для субстрата (АР – буфер: 100 mM Tris, 100mM NaCl, pH 9,5 с добавлением 50 mM MgCl2). 9. В качестве субстрата использовали BCIP (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate) и NBT (Nitro Blue tetrazolium). Останавливали реакцию промыванием в дистиллированной воде. Оценка скорости клеточного деления Клетки высевали на 12-луночные планшеты по 1.5×104 клеток на лунку в двух или трех повторах в полной ростовой среде. Каждые 24 ч. клетки снимали трипсином и их количество дважды считали в камере Горяева. Определение скорости миграции клеток На монослой клеток пластиковыми носиками для микропипетки наносили прямолинейные «раны». Зарастание «раны» за счет миграции в нее клеток фотографировали через определенные промежутки времени. 48 Оценка подвижности клеток с помощью трансмиграционных камер Перед началом эксперимента клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение 4 ч., затем клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина в бессывороточной среде или фосфатно-солевом буфере и считали в камере Горяева. Клетки помещали в бессывороточной среде с добавлением 0.1% БСА в верхнюю камеру трасмиграционных вставок в 24-луночном планшете по 1×105 клеток на лунку. Нижнюю камеру заполняли ростовой средой с добавлением 5% ЭТС для стимуляции хемотактической миграции клеток. Через 1-8 ч оставшиеся клетки из верхней камеры удаляли ватным тампоном, а клетки на нижней поверхности трансмиграционной вставки фиксировали метанолом и окрашивали метиленовым синим. Для количественной оценки миграции проводили обсчет клеток на нижней поверхности мембраны в пяти случайных полях зрения при световой микроскопии. Альтернативно, клетки, окрашенные метиленовым синим, лизировали в 0.1% SDS в фосфатно-солевом буфере и измеряли оптическую плотность полученного раствора при 600 нм (OD600). Использовались трансмиграционные вставки с пористой мембраной (BD Biosciences), размер поры – 8 мкм. Время миграции клеток определяли эмпирически для каждой клеточной линии. Измерение клеточной адгезии Перед началом эксперимента клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение 4 ч., затем клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина в бессывороточной среде или фосфатно-солевом буфере, считали в камере Горяева, а затем при необходимости окрашивали витальным флюоресцентным красителем Calcein AM (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Равные количества клеток высевали в трех повторах в бессывороточной среде с добавлением 0.1% БСА в лунки планшетов, дно которых было заранее покрыто различными лигандами (фибронектином, фибриногеном). Клеткам давали прикрепиться в течение 30-120 мин., процесс адгезии клеток контролировали визуально под микроскопом. Неприкрепившиеся клетки дважды аккуратно отмывали теплым фосфатно-солевым буфером. Качественно адгезию оценивали визуально при световой микроскопии, а количественно – измеряя флюоресценцию кальцеина в зеленом спектре (использовали настройки для FITC). Оптимальное время прикрепления для каждой клеточной линии определяли эмпирически. На лунку 96-луночной плашки высевали по 5×104 клеток. 49 Для адгезионных тестов культуральные сосуды сначала обрабатывали растворами лигандов (фибронектин в концетрации 5мкг/мл, фибриноген в концетрации 2мкг/мл) в течение 1 ч. при 37ºС, аккуратно промывали фосфатно-солевым буфером, а затем для предотвращения неспецифического связывания блокировали 2% БСА на фосфатносолевом буфере в тех же условиях, избыток БСА удаляли двукратной отмывкой фосфатно-солевым буфером. В качестве контроля использовали непокрытый культуральный пластик. Колониеобразование в полужидкой среде Для предотвращения прикрепления клеток к культуральному пластику сначала заливали базальный 0.5% агар на полной среде. Клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина и считали в камере Горяева. перемешивали с 0.7% легкоплавкой агарозой Равные количества клеток или 1.2% метилцеллюлозой, приготовленных на полной ростовой среде, и наслаивали на базальный агар. Клетки культивировали 3-14 дней до образования колоний, которые затем считали. На лунку 6луночного планшета высевали по 5×104-2×105 клеток. Метод проточной цитометрии В данном проекте этим методом определяли токсичность рекомбинантных онколитических белков. Клетки метили введением плазмиды, экспрессирующей флуоресцентный белок (EGFP), что позволило с помощью лазерного флуоресцентного цитофлуориметра отделить флуоресцентную фракцию от добавленных в смесь немеченых клеток. Мечеными являются опухолевые клетки, немечеными – нормальные. После обработки потенциально токсическим препаратом проводили определение изменения соотношения фракций меченых и немеченых клеток. Метод детекции апоптоза с применением Аннексина V. При индукции апоптоза происходит модификация мембран, которую способен детектировать препарат Annexin V. Детекцию проводили с помощью проточного цитофлуориметра Facs-Advantage GE, который является препаративным цитофлуориметром высокого класса. Он оснащен тремя лазерами, что позволяет одновременно отслеживать несколько параметров клеток. Определение токсичности с помощью ХТТ теста 50 Для определения токсичности онколитических препаратов использовали ХТТ тест. Метаболизирующие живые клетки активно превращают бесцветный формазановый предшественник ХТТ в цветное соединение, интенсивность которого можно детектировать с помощью планшетного ридера. При действии цитотоксических препаратов клетки утрачивают способность метаболизировать ХТТ, что приводит к ослаблению окраски. Технология лентивирусного переноса Наиболее удобным методом введения экспрессирующих генетических конструкций является лентивирусный перенос. Лентивирусный вектор создавали на основе вируса иммунодефицита человека, из которого удалены все последовательности, кодирующие белки, но сохранены регуляторные последовательности. В вектор вводили требуемые рекомбинантные гены, после чего с использованием упаковочных линий (НЕК293Т) получали вирусные частицы одноразового действия. Заражая подобными частицами клетки, удается ввести генетический материал, который встраивается строго упорядоченным способом без нарушения структуры генетической конструкции. Ряд лентивирусных векторов содержал вторую кассету, экспрессирующую ген устойчивости к антибиотику, по которому можно было проводить селекцию клеток, получивших эту генетическую конструкцию. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, выделение из геля Для разделения фрагментов ДНК использовали агарозу компании фирмы Хеликон (Россия). Электрофорез проводили в трис-ацетатном буфере (40 мМ трис-ацетат, pH 7.5; 2 мМ ЭДТА) с добавлением в него бромистого этидия до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полосы ДНК на геле визуализировали с помощью трансиллюминатора, соединенного с цифровой фотокамерой Kodak. Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно указаниям производителя. Обработка фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции Обработка целевых фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции проводилась согласно протоколу, рекомендованному производителем (New England Biolabs). По окончании реакции ДНК фракционировали в агарозном геле. В случае рестрикции амплифицированных фрагментов, рестрикционную смесь чистили на колонках набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). 51 Лигирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы Для лигирования фрагментов ДНК, представляющих каждый из генов вируса Сендай в лентивирусный вектор pLCMV-FLAG-puro выдерживали молярные соотношение вектор/вставка 1:6. В качестве контроля проводили лигирование вектора без вставки. Для реакции использовали лигазу New England Biolabs в буфере производителя. Реакция проходила в течение 12 часов при 14оС. Трансформация клеток E. coli JM109 К 100 мкл компетентных клеток JM109, размороженных на льду, добавляли плазмидную ДНК (до 10 нг) и инкубировали во льду в течение 30 мин. Далее делали тепловой шок (30 сек инкубировали при 42оС, затем переносили в лёд на 5-10 мин), добавляли 1 мл среды LB, инкубировали клетки 1 час при 37оС. Селекцию трансформантов проводили на чашках Петри (1.5% LB агар), содержащих 100мг/мл ампициллина Аналитическое выделение плазмидных ДНК из трансформированных компетентных клеток Трансформированные лигазными смесями клетки E.coli выращивали из отдельной колонии в 5 мл среды LB (Sigma-Aldrich) с ампициллином (100мг/мл) в пластиковых пробирках объемом 15 мл в течение 15 часов при 370С и интенсивном встряхивании. Затем бактерии осаждали центрифугированием в течение 15 минут на скорости 3,7 тысячи об/мин при 40С. Осадок клеток ресуспендировали в 250 мкл плазмидного раствора I, содержащего 25 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ ЭДТА, 15% сахарозы, и 2 мг/мл лизоцима, с добавлением 10 мгк/мл РНКазы А, переносили в пробирку на 1,5 мл и инкубировали на льду в течение 5 минут. Затем добавляли 250 мкл лизирующего раствора II (0.2 М NaOH, 1% SDS), аккуратно перемешивали и инкубировали 2-3 минуты при комнатной температуре, после чего вносили 350 мкл нейтрализующего раствора III (3 M ацетат калия, pH 5.2), тщательно перемешивали и инкубировали во льду еще 10 минут. После этого лизаты клеток центрифугировали в течение 15 минут на скорости 14 тысяч об/мин при 40С. Супернатант переносили в новую пробирку на 1,5 мл, добавляли 0,7 объема изопропанола, инкубировали в течение 15 минут и центрифугировали еще 15 минут на той же скорости. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл воды, очищенной в системе MilliQ (Millipore). 52 Получившиеся по данной методике аналитические препараты плазмидных ДНК подвергали рестрикции с целью проверки качества проведенных реакций лигирования и трансформации. С помощью рестриктазного анализа были отобраны нужные клоны. Для дополнительного контроля качества клонирования, полученные конструкты были отданы на сиквенс в компанию Евроген. Анализ результатов секвенирования проводился с помощью программы Vector NTI. ОТ-ПЦР Для получения кДНК обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы SuperScript II RT (Invitrogen) с использованием олиго(дТ)12-18 праймера на 2 мкг тотальной РНК. Обратная транскриптаза SuperScript II RT имеет пониженную активность РНКазы Н, что позволяет получать полноразмерную кДНК в большем количестве, чем при использовании обратной транскриптазы M-MLV RT. Методика обратной транскрипции описана в инструкции к набору реагентов SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Аликвоты по 2 мкл кДНК вносили в стандартную смесь для ПЦР-амплификации (25 мкл). Для выравнивания температуры плавления GC- и АТ-богатых областей, а также повышения стабильности Taqполимеразы, в реакционную смесь добавляли глицерин до 5% или формамид до 1 М. Использовали по 12.5 пмоль каждого из праймеров (Таблица 2). Температуру отжига праймеров вычисляли с помощью программы OligoAnalyser, имеющейся на интернетстраничке компании IDT DNA (www.idtdna.com/scitools). Для контроля эффективности обратной транскрипции и выравнивания амплифицировали участки мРНК генов «домашнего хозяйства». Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных для ОТ-ПЦР. Название Последовательность прямой 5’-GACCTCAAAGCTGTTCCGTCC p53 p53 обратный прямой TRIP6 5'-CGTCTGGGCTTCTTGCATTC (экзон7) 5’-GTGGCCACCCTGGAGAAATGT TRIP6 обратный (экзон 8) RIL 4 экзон 5’-CGATCCAGAGCAACAATTCTCAC прямой 5’-CTCGCTTTCCAGTCCCTCACAAT RIL 5 экзон обратный 5’-TCTAGCATGCCCTGCAAGTAGC 53 1 RIL экзон прямой 5’-GACTTCAGCGCGCCCCTCACCATCTCACG RIL 7 экзон обратный 5’-GAGCTTGTCCCGTGCCTTGACGATGGTGC прямой 5’-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCA EGFP EGFP обратный 5’-TGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCT прямой 5’-CAGCACGTACACAGCCCTAA E-cadherin E-cadherin обратный 5’-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC прямой 5’-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA Snail Snail обратный 5’-TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG прямой 5’-GCCTCCAAAAAGCCAAACTA Slug Slug обратный 5’-CACAGTGATGGGGCTGTATG прямой 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG Twist Twist обратный α-actinin 5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG прямой 5’-CAACTTCAACACGCTGCAGACCAA α-actinin обратный β-actin 5’-CACGTGGTCCCATTTGCCATTGAT прямой 5’-GCTTGCCATCCAACCACTCAGTCTTG β-actin обратный 5’-GCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGCAGAC PPIA (Cyclophilin) прямой 5’-CTTCACACGCCATAATGGC (Cyclophilin) 5’-GTGATCTTCTTGCTGGTCTTG PPIA обратный GAPDH GAPDH обратный прямой 5’-CTCGCTCCTGGAAGATGG 5’-CAATGACCCCTTCATTGAC Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами Для выделения и анализа мРНК, связанной с полисомами, использовали клетки линии HeLa. Прямой трансфекцией в клетки на 10 см. культуральных чашках вводили необходимые конструкции и инкубировали 1-2 дня, пока культура не дорастет до 70-90% монослоя. Клетки трижды промывали холодным ФСБ с 50 мкг/мл циклогексимида, собирали скребком и освобождали от буфера центрифугированием 3 мин. При 5 тыс. об./мин. в настольной центрифуге. Клеточный осадок лизировали в 2.5 объемах лизис54 буфера (10 мМ MgCl2, 80 мМ KCl, 0.2 М Трис-HCl pH 7.4, 5 мМ ЭГTA, 2% Triton X-100 с добавлением ингибиторов РНКаз 1000 ед./мл), лизат наслаивали на подушку из 20% сахарозы, приготовленной на лизис-буфере и центрифугировали в роторе SW50.1 (Beckman) 3 ч. на скорости 43 тыс. об./мин. при 4ºС. РНК из осадка (полирибосомы) и супернатанта (безполисомная фракция) выделяли с помощью реагента TRIzol и анализировали методом ОТ-ПЦР, как описано выше. 55 ГЛАВА 2 Определение эпигенетического состояния гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, анализ метилирования ДНК и гистонов Установлено, что в ряде злокачественных заболеваний человека определенный процент опухолей демонстрирует эпигенетическую супрессию транскрипции гена PDLIM4/RIL. Наиболее часто супрессия RIL наблюдается в опухолях простаты, толстого кишечника, молочной железы и острой миелоидной лейкемии. При этих заболеваниях метилирование и супрессия гена RIL наблюдается приблизительно в половине случаев. Очевидно, подавление экспрессии гена RIL играет важную роль в канцерогенезе, поскольку восстановление экспрессии сопровождается остановкой пролиферации. 2.1 АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ мРНК RIL В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА Рисунок 11. Экспрессия мРНК RIL в человеческих опухолях различного происхождения по сравнению с нормальными тканями. Нозерн-анализ образцов тотальной РНК, представленных на микропанели Cancer Profiling Array I (BD Clontech), с помощью RIL-специфического зонда. Все значения были нормализованы с учетом экспрессии мРНК гена «домашнего хозяйства» GAPDH. а – Вид ауторадиограммы микропанели (О – образец тотальной РНК из опухоли; Н – тотальная РНК из окружающей морфологически нормальной ткани от того же пациента). б – Доля пар «норма:опухоль», в которых экспрессия мРНК RIL в опухоли подавлена в 2 и более раз (Н/О > 2), не изменена (0.5 < Н/О < 2) 56 или повышена в 2 и более раз (Н/О < 0.5). Пунктиром выделена область ауторадиограммы блота (а) и столбчатой диаграммы (б), соответствующие парам «норма:опухоль» из молочной железы. Для определения возможной роли RIL в злокачественной трансформации был проведен анализ уровня экспрессии его мРНК в образцах злокачественных новообразований из разных органов по сравнению с окружающей нормальной тканью методом Нозернгибридизации с Cancer Profiling Array I (BD Clontech). На этой микропанели представлена 241 пара образцов «опухоль/норма» из 8 различных тканей человека. Было обнаружено, что уровень экспрессии RIL был подавлен в 2 и более раз в 43% (23 из 53) образцов злокачественных опухолей молочной железы. Тенденция к снижению экспрессии мРНК RIL была также отмечена для опухолей яичника (38%, 6 из 16 пар образцов), почки (35%, 7 из 20 пар) и легкого (29%, 6 из 21). 2.2 ЭКСПРЕССИЯ RIL В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА Рисунок 12. Экспрессия RIL в линиях клеток карцином молочной железы человека по сравнению с нормальным эпителием молочной железы. а – Экспрессия мРНК RIL по данным ОТ-ПЦР. б – Уровни белка RIL по данным Вестерн-блот анализа с поликлональными козьими RIL-специфичными антителами. в – Морфология клеток использованных культур опухолей молочной железы человека и первичного эпителия. Световая микроскопия. Здесь и далее черной рамкой обозначены культуры клеток с высокой экспрессией RIL, серым пунктиром – линии, где экспрессия RIL недетектируема. 57 Для независимого подтверждения данных, полученных с помощью блота Cancer Profiling Array I, мы проанализировали уровень экспрессии RIL в панели из 8 клеточных линий карцином молочной железы человека как на уровне мРНК с помощью ОТ-ПЦР, а также методом ПЦР в реальном времени и на уровне белка методом иммуноблоттинга. В качестве контроля были использованы клетки HMEC – культуры первичных эпителиоцитов молочной железы человека (Cambrex) (пассаж 9). Действительно, в четырех случаях из 8 экспрессия RIL оказалась ниже уровня детекции, в то время как в остальных 4 клеточных линиях уровень RIL был сравним с контролем или несколько превышал его (Рисунок 12 а,б). Бросается в глаза корреляция статуса RIL в этих культурах с морфологией клеток (Рисунок 12в). Так, высокий уровень экспрессии RIL был выявлен у высоко-агрессивных культур рака молочной железы MDA-MB-231, MDA-MB-435S, MDA-MB-436 и BT-474, клетки которых характеризуются звездчатой или веретенообразной фибробластоидной формой, слабой степенью адгезии и распластанности, высокой скоростью роста и видимым отсутствием межклеточных контактов. Малоагрессивные клеточные линии MCF-7, BT-20, T-47D и MDA-MB-468, наоборот, имеют недетектируемый уровень RIL и сохраняют эпителиальную морфологию и видимые межклеточные контакты. Таким образом, при исследовании панели линий клеток рака молочной железы было обнаружено, что приблизительно в половине линий экспрессия гена RIL подавлена на уровне транскрипции. При этом было обнаружено, что в другой половине линий уровень экспрессии RIL соответствует контрольным нормальным клеткам молочной железы. Характерно, что два типа линий клеток также отличались по морфологическим признакам. Линии с нормальным уровнем экспрессии гена RIL обладали выраженными признаками морфологической трансформации, утратой эпителиальной морфологии, характерной дезогранизацией эпителиально-мезенхимальной актинового снижением адгезии. цитоскелета, трансформации, увеличением выраженной подвижности клеток и Характерно, что подавление экспрессии RIL в этих линиях с помощью РНК-интерференции не сопровождалось реверсией трансформированного фенотипа, в то время как восстановление экспрессии RIL в клетках, демонстрирующих его супрессию приводило к снижению трансформированного фенотипа. 2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНА RIL ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Молекулярные повреждения ряда генов имеют большое значение для опухолеобразования. Изучение механизмов канцерогенеза указывает на важную роль 58 инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, обусловленной как генетическими так и эпигенетическими изменениями. Один из механизмов эпигенетическиой регуляции – метилирование промоторных и регуляторных областей, которое приводит к подавлению экспрессии гена. Такие повреждения приводят к нарушению путей регуляции клеточного цикла, стимулируя неконтролируемый клеточный рост и образование опухолей. Аномальное метилирование промоторных районов, вызывающее инактивацию гена RIL, по нашему мнению, может служить маркером рака молочной железы. Поэтому изучение частоты метилирования гена RIL и включении его в специфический профиль метилирования (метилотип) опухолей различного происхождения важно для понимания его роли в канцерогенезе, в том числе в развитии рака молочной железы, что и является нашей задачей. Для определения частоты метилирования гена RIL в случае рака молочной железы нами были исследованы следующие клеточные линии: - MCF7, BT-20, T47D, MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-435S, BT-474, - образцы тканей, полученных от 50 больных раком молочной железы, - а также образцы неизмененной ткани молочной железы. Сразу после удаления опухоли образцы тканей замораживали и хранили в жидком азоте. Геномную ДНК выделяли с использованием фенол-хлоровормной реакции. Метилирование СрG-островков промоторной области определяли с помощью бисульфитной ПЦР, секвенирования и метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. Бисульфитная ПЦР представляет собой процесс амплификации бисульфитно-модифицированной ДНК. Данный метод основан на способности иона гидросульфита, получающегося при растворении бисульфита натрия в воде, взаимодействовать с цитозином, с превращением последнего в урацил, таким образом, при бисульфитной модификации ДНК, все неметилированные цитозины конвертируются в урацил, в то время как метилированные цитозины в составе СрG-островков остаются неизменными. В дальнейшем при амплификации исследуемого участка ДНК все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин. В результате эпигенетической реактивации было показано увеличение уровня экспрессии RIL/PDLIM4 в клеточных линиях рака молочной железы в среднем в 3,5 раза. Характеристики CpG островка, входящего в состав промотора RIL/PDLIM4: Н/Т = 0,73, состав GC = 73%, длина 801 п.н. В ходе секвенирования промоторного участка 59 метилирование было обнаружено во всех исследуемых клеточных линиях рака молочной железы. Всего было проанализировано 11 СрG-пар, что составило более 20% от числа пар в анализируемом фрагменте. В исследуемых линиях клеток рака молочной железы метилирование промотоной области гена RIL было обнаружено в 79 % случаев, и в 56% случаев в образцах тканей, а метилирование всего CpG островка обнаружено в 18 из 50 образцов РМЖ (36%). Таким образом, ген RIL с полным правом можно отнести к списку генов, демонстрирующих аномальное метилирование при раке молочной железы. Высокий уровень метилирования гена RIL в опухоли, по сравнению с контролем, может быть использован как маркер злокачественной трансформации, а функциональную инактивацию генов-супрессоров можно считать значимым механизмом канцерогенеза. Идентификация генов с высокой частотой метилирования в опухолях – необходимый шаг в характеристике опухоли. Профиль метилирования в сочетании с другими молекулярно-генетическими маркерами может быть использован для ранней диагностики злокачественного процесса и определения прогноза развития и поведения опухоли. Дальнейшая разработка диагностической тест-системы на основе RIL в качестве маркера позволит осуществлять эффективный скрининг и бороться с заболеванием на разных этапах возникновения и определять тактику терапии. ГЛАВА 3 Определение активности рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, состояния сигнальных путей на панели линий клеток рака молочной железы Большинство существующих линий клеток опухолей молочной железы характеризуются отсутствием трех наиболее распространенных маркеров РМЖ – в клетках этих линий не экспрессированы эстрогеновый и прогестероновый рецепторы, и отсутствует амплификация HER2. В ходе работ по данному проекту была проанализирована панель клеточных линий карцином молочной железы с целью определения функционального статуса рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, изменение функциональной активности которых наиболее часто наблюдается в опухолях этого типа. Статус рецептор-ассоциированных тирозиновых киназ был определен в клетках следующих линий: 1. MCF7 2. BT-20 3. T47D 60 4. MDA-MB-468 5. MDA-MB-231 6. MDA-MB-435S 7. BT-474 8. BT-549 9. MDA-MB-157 10. SK-BR-3 Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о том, что только в двух клеточных линиях (BT-474 и SK-BR-3) амплифицирован HER2. В то же время, в трех клеточных линиях (BT-20, MDA-MB-468 и MDA-MB-231) наблюдается значительное повышение уровня экспрессии EGFR. Рис. 13 Статус EGFP/HER2 в панели клеточных линий карцином молочной железы. Результаты эксперимента хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными, согласно которым, некоторые опухолевые линии, характеризующиеся тройным негативным генотипом, гиперэкспрессируют EGFR. В ходе следующего эксперимента, в искомой панели клеточных линий была определена активность двух рецептор-неассоциированных тирозин-киназ, Src и Syk. Для обеих киназ показано активное участие в PI3K-сигнальном пути, а также их частая оверэкспрессия в опухолях с тройным негативным генотипом. Результаты эксперимента 61 показали, что две клеточные линии - BT-474 и SK-BR-3 – характеризуются нормальным уровнем активности Src, в то время, как во всех остальных активность Src аномально высока. Киназа Syk, напротив, характеризуется более равномерным распределением активности среди протестированных клеточных линий. Однако уровни ее активности в клетках MDA-MB-231 и MDA-MB-468 были существенно снижены. В ряде работ указывается, что тирозин-киназа Syk ассоциирована с регуляцией актинового цитоскелета клетки, и оказывает существенное влияние на клеточную подвижность. Клетки линий MDA-MB-231 и MDA-MB-468 характеризуются высокоинвазивным характером роста и обладают повышенной подвижностью, что хорошо кореллирует с данными литературы, согласно которым Syk оказывает суппрессирующее действие на рост высокоинвазивных опухолей молочной железы. Рис. 14 Результаты измерения активности киназ Src и Syk на панели клеточных линий карцином молочной железы Для выявления возможной связи между уровнями активности тирозиновых киназ и статусом гена RIL данные экспериментов были сведены в общую Таблицу 3: 62 Клеточная линия MCF7 BT-20 T47D MDA-MB-468 MDA-MB-231 MDA-MB-435S BT-474 BT-549 MDA-MB-157 SK-BR-3 EGFR + + + - HER2 + + Src + + + + + + + + - Syk + + + + + + + + RIL + + + + Полученные данные указывают на существование двух типов линий клеток рака молочной железы, коррелирующих с уровнем экспрессии RIL. Согласно выдвинутой гипотезе, фенотипические различия обусловлены отличиями в механизме активации тирозиновых киназ. Если в линиях, утративших в результате эпигенетическогй супрессии транскрипцию гена RIL активация Src достигается путем отсутствия контроля со стороны фосфатазы PTP-BL, то в линиях, где экспрессия RIL не изменена, трансформация поддерживается за счет иных событий, включающих активацию Srcподобных киназ за счет альтернативных механизмов. Один из таких механизмов может осуществляться путем активации EGFR, другой – путем активации HER2. В этом случае, применение терапии, направленной на подавление HER2 (herceptin) оказаться неэффективным в случае опухолей, реализующих сценарий трансформации за счет подавления экспрессии RIL. ГЛАВА 4 Проведение секвенирования генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL. При исследовании экспрессии гена PDLIM4/RIL, детектируемой с помощью ОТПЦР было показано её угнетение в половине из исследованных линий клеток рака молочной железы человека. В другой половине уровень транскриптов гена PDLIM4/RIL находился на уровне, характерном для нормального молочного эпителия, использованного в качестве контроля. Супрессия транскриптов гена PDLIM4/RIL наблюдалась в линиях MCF7, BT-20, T47D и MDA-MB468. В этих же линиях отмечалось сохранение и даже некоторое увеличение экспрессии Е-кадхерина и утрата экспрессии виментина. Другая группа клеток (MDA-MB231, MDA-MB435S, MDS-MB436 и BT-474), напротив, содержала 63 нормальные уровни транскриптов гена PDLIM4/RIL, но отсутствие экспрессии Екадхерина и выраженную экспрессию виментина. Интересно, что виментин также хорошо экспрессируется к контрольных клетках нормального молочного эпителия. При анализе морфологических свойств клеток было также установлено, что летки, характеризующиеся супрессией гена PDLIM4/RIL обладают менее выраженными признаками морфологической трансформации. Для того чтобы удостовериться в полноценности экспрессии гена PDLIM4/RIL необходимо убедиться в отсутствии мутаций в кодирующей области гена в исследуемых линиях клеток. Для этого на матрице РНК из восьми линий клеток, а также из клеток нормального молочного эпителия с помощью ОТ-ПЦР получали ДНК копии, которые затем подвергали секвенированию на капиллярном секвенаторе. Структура праймеров для амплификациииы была следующей: RIL-5’-primer^ ctcctcctcagagtccg RIL 3’ rpimer: gtggaactcgtctgagct Среди четырех линий клеток без супрессии гена RIL замен нуклеотидов в кДНК, полученной на матрице мРНК не было обнаружено. На Риснке приведена структура полноразмерной мРНК гена PDLIM4/RIL, полученная для всех четырех линий клеток. 1 GCGGCGGCGG CGGCTGCGGC GGCGGCGGCT CCTCCTCAGA GTCCGGCTCA MetPro HisSerVal ThrLeuArg 51 GGCTCCGGCT GCGGCTCCAG CCCGCGATGC CCCATTCCGT GACCCTGCGC GlyProSerPro TrpGlyPhe ArgLeuVal GlyGlyArgAsp PheSerAla· 101 GGGCCTTCGC CCTGGGGCTT CCGCCTGGTG GGCGGCCGGG ACTTCAGCGC ·ProLeuThr IleSerArgVal HisAlaGly SerLysAla AlaLeuAlaAla· 151 GCCCCTCACC ATCTCACGGG TCCATGCTGG CAGCAAGGCT GCATTGGCTG ·ALeuCysPro GlyAspLeu IleGlnAlaIle AsnGlyGlu SerThrGlu 201 CCCTGTGCCC AGGAGACCTG ATCCAGGCCA TCAATGGTGA GAGCACAGAG LeuMetThrHis LeuGluAla GlnAsnArg IleLysGlyCys HisAspHis· 251 CTCATGACAC ACCTGGAGGC ACAGAACCGC ATCAAGGGCT GCCACGATCA ·LeuThrLeu SerValSerArg ProGluGly ArgSerTrp ProSerAlaPro· 301 CCTCACACTG TCTGTGAGCA GGCCTGAGGG TAGGAGCTGG CCCAGTGCCC ·PAspAspSer LysAlaGln AlaHisArgIle HisIleAsp ProGluIle 351 CTGATGACAG CAAGGCTCAG GCACACAGGA TCCACATCGA TCCTGAGATC GlnAspGlySer ProThrThr SerArgArg ProSerGlyThr GlyThrGly· 64 401 CAGGACGGCA GCCCAACAAC CAGCAGGCGG CCCTCAGGCA CCGGGACTGG ·ProGluAsp GlyArgProSer LeuGlySer ProTyrGly GlnProProArg· 451 GCCAGAAGAT GGCAGACCAA GCCTGGGATC TCCATATGGA CAACCCCCTC ·APheProVal ProHisAsn GlySerSerGlu AlaThrLeu ProAlaGln 501 GCTTTCCAGT CCCTCACAAT GGCAGCAGCG AGGCCACCCT GCCAGCCCAG MetSerThrLeu HisValSer ProProPro SerAlaAspPro AlaArgGly· 551 ATGAGCACCC TGCATGTGTC TCCACCCCCC AGCGCTGACC CAGCCAGAGG ·LeuProArg SerArgAspCys ArgValAsp LeuGlySer GluValTyrArg· 601 CCTCCCGCGG AGCCGGGACT GCAGAGTCGA CCTGGGCTCC GAGGTGTACA ·AMetLeuArg GluProAla GluProValAla AlaGluPro LysGlnSer 651 GGATGCTGCG GGAGCCAGCC GAGCCCGTGG CCGCGGAGCC CAAGCAGTCA GlySerPheArg TyrLeuGln GlyMetLeu GluAlaGlyGlu GlyGlyAsp· 701 GGCTCCTTCC GCTACTTGCA GGGCATGCTA GAGGCCGGCG AGGGCGGGGA ·TrpProGly ProGlyGlyPro ArgAsnLeu LysProThr AlaSerLysLeu· 751 TTGGCCCGGG CCTGGCGGCC CCCGGAACCT CAAGCCCACG GCCAGCAAGC ·LGlyAlaPro LeuSerGly LeuGlnGlyLeu ProGluCys ThrArgCys 801 TGGGCGCTCC GCTGAGCGGC CTGCAGGGGC TGCCCGAGTG CACGCGCTGC GlyHisGlyIle ValGlyThr IleValLys AlaArgAspLys LeuTyrHis· 851 GGCCACGGCA TCGTGGGCAC CATCGTCAAG GCACGGGACA AGCTCTACCA ·ProGluCys PheMetCysSer AspCysGly LeuAsnLeu LysGlnArgGly· 901 TCCCGAGTGC TTCATGTGCA GTGACTGCGG CCTGAACCTC AAGCAGCGTG ·GTyrPhePhe LeuAspGlu ArgLeuTyrCys GluSerHis AlaLysAla 951 GTTACTTCTT TCTGGACGAG CGGCTCTACT GTGAGAGCCA CGCCAAGGCG ArgValLysPro ProGluGly TyrAspVal ValAlaValTyr ProAsnAla· 1001 CGCGTGAAGC CGCCCGAGGG CTACGACGTG GTGGCGGTGT ACCCCAATGC ·LysValGlu LeuVal*** 1051 CAAGGTGGAA CTCGTCTGAG CTGGGACCCT GCTCCCACGC CTGCTTCTTA 1101 AGGTCCCTGC TCGGCCGGTG TAAATATGTT TCACCCTGTC CCTCTAATAA 1151 AGCTCCTCTG CTCCACCTTG AACCTGTCAC CTGGCCTGCC ACCCTCCTGC 1201 GCAGGCCATG CATGGCTCCC GAGTACAGTA GTATCTGCTT AGGTGCCAGG 1251 CATGTCCTAG GCTCTGGGTG CAGTAGTGAG CAGGACGGGT ACCATGCTGC 1301 CCTGAAGGGG GCCACAGCCT GGGTGGAAGG CAGACCTGAA TCACAACGGG 1351 CCAGCTCTAG TAATACGAAG GTGAGGTCTG GGATGCTGCG TGCGGCGCGA 1401 CGACAGGAGG TATGACCTGG GTGGGGTCAG GGAAAGTCTT AGCTGAGAAC 65 1451 TAAGAGATGA GGGAGGCACA AACTCTGCAC GGGGGAACTG TGTGTGCAAA 1501 GGTGAGCTGG GGGCGAGAAA GGCCTCTGTG GCCGTCATCG GCACTAGCGG 1551 GTTGGGGGTG GTGGTGGGGT GCTGGCAGCC TCAGGAGCGA TCGCTCCCCT 1601 GGAGAGGGTG ATTGAGTGTG GAGATCACCG GGGCCGCCGC GGGCCGTCTG 1651 CACTTCTGTT CCAGGTTTTT CTGGCATTTT CTGTTCCAGG TTTCTTCCAC 1701 CCACGAGCAC TTTATTCTCC TCCGAGACCC CCTTTTCTTC CCCTTCCTCT 1751 CTCCCCCACC AGGGGGCGCG CTTAAATTTC CAGACAGAGA CCAGAAGGAA 1801 GGTTTAGAAA GAAAAGAACA CTTGCCCAGG GCAGCTTTGC CCTCCAAGAG 1851 GCTCCCTCCT GTCTCTAAGT CAATTCCACC CCTCCTCGAA GTCCCGGCTT 1901 CCACCCCTCT CCTCAGAGTC CCGGCGTTTA CCTCGTGGTG TGTTTGCCTT 1951 GGGCCTTTCA TGCCCCGGCT GCACACATCG TCTGTGAATT GTGGCTGTTC 2001 ACTCCCGAGG ATGTGTCCTA GACTCCGGGT CGCGTGGATC TACCCTCTAG 2051 TTTACTTGCT CGGGAGAAGA AACTGACTCG TTTTATTTAG TGCCTATTTA 2101 GCGAGCCCAG AGTAACGTAC ATTTGTGCTG TTTTCAATTT TGTGCTATCG 2151 CAAATCACAA AAAAACTGTT ATCAATTCAC ATTCATCATC AGCACGAGAC 2201 CCATTTCCTT GTGCTCCTGC CAGCTCAGGA TATTATGTTT CTTTTTTCAT 2251 TTTTGCCAGT CTGTTAAGTA AAATGTCATA TGCGTTTGTT TTAAAAAAAA 2301 AAAAAA Рисунок 15. Структура кДНК гена PDLIM4/RIL, полученная при секвенировании четырех линий клеток рака молочной железы с сохраненной экспрессией гtна PDLIM4/RIL. В оставшихся линиях клеток экспрессия гена PDLIM4/RIL была подавлена. Для определения полноценности кодирующей области гена с помощью ПЦР были амплифицированы экзоны на матрице геномной ДНК, выделенной из этих линий. Были использованы следующие праймеры: Экзон 1 5’-ctcagagtccggctcag и 5’- ccagactcacccgtgag Экзон 2 5’-tgctcgcaggtccatgc и 5’-cacctgtgcatacctgc Экзон 3 5’-ctgccacaggcctgagg и 5’- ctgtacatacctggatc Экзон 4 5’-cctctctctaataggac и 5’-catctctgtgctacctg Экзон 5 5’-ctccctcccagcgctgac и 5’-gtggcaggcgtcttacc 66 Экзон 6 5’-cgggtttcaggggattg и 5’-gtcccagctcagacgag Секвенирование шести экзонов в четырех линиях не обнаружило замен нуклеотидов. Эти результаты указывают на отсутствие точечных мутаций в кодирующей области гена PDLIM4/RIL в линиях клеток, характеризующихся отсутствием транскриптов. 67 ГЛАВА 5 Получение данных по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы с помощью технологии NGS. Для определения характерных различий спектров транскрибируемых генов был применен метод секвенирования транскриптома с помощью технологии NGS. Для этого из петидесяти линий клеток рака молочной железы выделяли тотальную РНК методом тризольной экстракции и дочищали ее с помощью Agencourt RNA clean реагента (Beckman-Coulter). На матрице РНК с помощью олиго дТ затравки получали кДНК продукты, представляющие библиотеку для секвенирования. С помощью секвенатора Illumina HiSeq 2500 осуществляли прочитывание библиотек, после чего массив данных по секвенированию экспрессирующихся форм мРНК подвергали биоинформатическому анализу. Этот анализ проводится в настоящее время с целью вычисленения характерных наборов генов, преимущественно экспрессирующихся в линиях клеток, различающихся по экспрессии гена PDLIM4/RIL. количество транскриптов, В образцах также подсчитывадлсь относительное соответствующих гену PDLIM4. При сравнении представленности транскриптов PDLIM4/RIL установлено, в частности, что в линии клеток MCF7 число копий таких транскриптов различается в 250 раз (в меньшую сторону) по сравнению с числом копий в линии клеток MDA-MB435S. В таблице (Приложение) представлено сравнение частот экспрессии генов в линиях клеток MCF7 и MDA-MB435S. В списке присутствуют гены, уровень экспрессии которых различается в большую или меньшую сторону в 2 и более раз. Детальная биоинформатическая обработка проводится в настоящее время и будет представлена в заключительном отчете. Однако уже на данном этапе нами установлено, что имеется массивный кластер генов, экспрессия которых закономерно изменяется в зависимости от супрессии гена RIL. Некоторые из выявленных генов, демонстрирующие максимальные изменения в настоящее время верифицируются с помощью ОТ-ПЦР. ГЛАВА 6 Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96. При выполнении первого этапа НИР были проведены патентные исследования по теме «Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии» 68 Задачей патентных исследований был анализ уровня техники объекта хозяйственной деятельности, проверка патентной чистоты объекта, выявление тенденций и возможности патентования в РФ. Согласно заданию на проведение патентных исследований и Регламенту поиска проанализировано около 150 патентных источников информации. Использовались возможности поиска по ключевым терминам: биомаркер, маркер, эпигенетич* супресс*, PDLIM4/RIL, PDLIM, RIL, способ лечения рака молочной железы, опухол*, адапторн* белок(ки), плеч* хромосомы 5 (5q31), reversion-induced LIM-domain, клеточн* линии MCF7, T47D, BT20, BT-483, BT549, MDA-MB231, MDA-MB436, MDA-MB453, MDAMB468, MDA-MB474, 184B5, AU-565, SK-BR3 Также использовалась возможность поиска по рубрикам МПК 4-12 редакции: C12Q 1/68, C12N 15/00, A61K38/00, A61K38/16, C07K14/00, G01N 33/48, G01N 33/53; G01N 33/68, A61P 35/00. В результате проведенного исследования были сформулированы выводы: 1. Объект исследований «новый биомаркер, основанный на эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL для оптимизации способа лечения рака молочной железы» обладает патентной чистотой в отношении Российской Федерации по состоянию: - на 27.06.2013 – Официальный бюллетень РФ «Изобретения, полезные модели» № 18 за 2013г. - на 2013.05.30– Бюллетень Евразийского патентного ведомства, № 5, за 2013г. - на 06.07.2013 – Фонд международных заявок по состоянию на июль 2013г. 2. Результаты исследования объекта НИР на патентную чистоту приведены в таблицах Д.3.1.1, Д.3.1.3 Приложения Д. 3. Данная тема, касающаяся маркера, основанного на эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL для оптимизации способа лечения рака молочной железы является перспективным направлением в области химии медицины. 4. В качестве ближайшего аналога (прототипа) может быть принято техническое решение по заявке RU 2009114745, дата публикации 27.10.2010. Результаты патентного исследования приведены в Приложении. 69 ЗАКЛЮЧЕНИЕ На первом этапе выполнения НИР были получены следующие результаты: 1 Определено эпигенетическое состояние гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, проведен анализ метилирования ДНК и гистонов. 2 Проведено секвенирование генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL. 3 На основании результатов секвенирования определена взаимосвязь генетических и эпигенетических маркеров (метилирование ДНК гена PDLIM4/RIL, уровень транскриптов гена PDLIM4/RIL) позволяющая дальнейшее изучение их прогностической значимости и оптимизацию методов лечения пациентов, страдающих раком молочной железы. 4 На панели клеток рака молочной железы определена активность рецепторных (EGFR, HER2) и нерецепторных (Src) тирозиновых киназ и определена корреляция с морфологическим фенотипом клеток и уровнем экспрессии PDLIM4. 5 Разработана методика регистрации эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL. 6. Проведены патентные исследования по теме НИР В рамках данного этапа были выполнены все поставленные задачи, все выводы соответствуют установленным целям, результаты просуммированы, обобщены и готовятся к публикациям, по завершению работ описаны рекомендации возможного практического применения полученных результатов и их актуальность. Все полученные данные оригинальны и приоритенты и лягут в основу НИР второго этапа. 70 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Kiess M., Scharm B., Aguzzi A., Hajnal A., Klemenz R., Schwarte-Waldhoff I., Schafer R. Expression of ril, a novel LIM domain gene, is down-regulated in Hras-transformed cells and restored in phenotypic revertants.// Oncogene. - 1995. -V. 10. -P. 61-68. 2 Bashirova A.A., Markelov M.L., Shlykova T.V., Levshenkova E.V., Alibaeva R.A., Frolova E.I. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts.// Gene. - 1998. -V. 210. -P. 239-245. 3 Vallenius T., Scharm B., Vesikansa A., Luukko K., Schafer R., Makela T.P. The PDZLIM protein RIL modulates actin stress fiber turnover and enhances the association of alpha-actinin with F-actin.// Exp Cell Res. - 2004. -V. 293. -P. 117-128. 4 Jani K.,Schock F. Zasp is required for the assembly of functional integrin adhesion sites.// J Cell Biol. - 2007. -V. 179. -P. 1583-1597. 5 McKeown C.R., Han H.F., Beckerle M.C. Molecular characterization of the Caenorhabditis elegans ALP/Enigma gene alp-1.// Dev Dyn. - 2006. -V. 235. -P. 530538. 6 Te Velthuis A.J., Isogai T., Gerrits L., Bagowski C.P. Insights into the molecular evolution of the PDZ/LIM family and identification of a novel conserved protein motif.// PLoS One. - 2007. -V. 2. -P. e189. 7 Krcmery J., Camarata T., Kulisz A., Simon H.G. Nucleocytoplasmic functions of the PDZ-LIM protein family: new insights into organ development.// Bioessays. - 2010. -V. 32. -P. 100-108. 8 Schulz T.W., Nakagawa T., Licznerski P., Pawlak V., Kolleker A., Rozov A., Kim J., Dittgen T., Kohr G., Sheng M., Seeburg P.H., Osten P. Actin/alpha-actinin-dependent transport of AMPA receptors in dendritic spines: role of the PDZ-LIM protein RIL.// J Neurosci. - 2004. -V. 24. -P. 8584-8594. 9 Vallenius T., Luukko K., Makela T.P. CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4.// J Biol Chem. - 2000. -V. 275. -P. 11100-11105. 10 Klaavuniemi T., Kelloniemi A., Ylanne J. The ZASP-like motif in actinin-associated LIM protein is required for interaction with the alpha-actinin rod and for targeting to the muscle Z-line.// J Biol Chem. - 2004. -V. 279. -P. 26402-26410. 11 Zheng M., Cheng H., Banerjee I., Chen J. ALP/Enigma PDZ-LIM domain proteins in the heart.// J Mol Cell Biol. - 2010. -V. 2. -P. 96-102. 71 12 Benna C., Peron S., Rizzo G., Faulkner G., Megighian A., Perini G., Tognon G., Valle G., Reggiani C., Costa R., Zordan M.A. Post-transcriptional silencing of the Drosophila homolog of human ZASP: a molecular and functional analysis.// Cell Tissue Res. 2009. -V. 337. -P. 463-476. 13 van der Meer D.L., Marques I.J., Leito J.T., Besser J., Bakkers J., Schoonheere E., Bagowski C.P. Zebrafish cypher is important for somite formation and heart development.// Dev Biol. - 2006. -V. 299. -P. 356-372. 14 Pashmforoush M., Pomies P., Peterson K.L., Kubalak S., Ross J., Jr., Hefti A., Aebi U., Beckerle M.C., Chien K.R. Adult mice deficient in actinin-associated LIM-domain protein reveal a developmental pathway for right ventricular cardiomyopathy.// Nat Med. - 2001. -V. 7. -P. 591-597. 15 Zhou Q., Chu P.H., Huang C., Cheng C.F., Martone M.E., Knoll G., Shelton G.D., Evans S., Chen J. Ablation of Cypher, a PDZ-LIM domain Z-line protein, causes a severe form of congenital myopathy.// J Cell Biol. - 2001. -V. 155. -P. 605-612. 16 Vatta M., Mohapatra B., Jimenez S., Sanchez X., Faulkner G., Perles Z., Sinagra G., Lin J.H., Vu T.M., Zhou Q., Bowles K.R., Di Lenarda A., Schimmenti L., Fox M., Chrisco M.A., Murphy R.T., McKenna W., Elliott P., Bowles N.E., Chen J., Valle G., Towbin J.A. Mutations in Cypher/ZASP in patients with dilated cardiomyopathy and left ventricular non-compaction.// J Am Coll Cardiol. - 2003. -V. 42. -P. 2014-2027. 17 Selcen D.,Engel A.G. Mutations in ZASP define a novel form of muscular dystrophy in humans.// Ann Neurol. - 2005. -V. 57. -P. 269-276. 18 Xing Y., Ichida F., Matsuoka T., Isobe T., Ikemoto Y., Higaki T., Tsuji T., Haneda N., Kuwabara A., Chen R., Futatani T., Tsubata S., Watanabe S., Watanabe K., Hirono K., Uese K., Miyawaki T., Bowles K.R., Bowles N.E., Towbin J.A. Genetic analysis in patients with left ventricular noncompaction and evidence for genetic heterogeneity.// Mol Genet Metab. - 2006. -V. 88. -P. 71-77. 19 Guryanova O.A., Drazba J.A., Frolova E.I., Chumakov P.M. Actin cytoskeleton remodeling by the alternatively spliced isoform of PDLIM4/RIL protein.// J Biol Chem. - 2011. -V. 286. -P. 26849-26859. 20 Zhang Y., Tu Y., Zhao J., Chen K., Wu C. Reversion-induced LIM interaction with Src reveals a novel Src inactivation cycle.// J Cell Biol. - 2009. -V. 184. -P. 785-792. 21 Xu J., Shetty P.B., Feng W., Chenault C., Bast R.C., Jr., Issa J.P., Hilsenbeck S.G., Yu Y. Methylation of HIN-1, RASSF1A, RIL and CDH13 in breast cancer is associated with clinical characteristics, but only RASSF1A methylation is associated with outcome.// BMC Cancer. - 2012. -V. 12. -P. 1471-2407. 72 22 Feng W., Orlandi R., Zhao N., Carcangiu M.L., Tagliabue E., Xu J., Bast R.C., Jr., Yu Y. Tumor suppressor genes are frequently methylated in lymph node metastases of breast cancers.// BMC Cancer. - 2010. -V. 10. -P. 378. 23 Boumber Y.A., Kondo Y., Chen X., Shen L., Gharibyan V., Konishi K., Estey E., Kantarjian H., Garcia-Manero G., Issa J.P. RIL, a LIM gene on 5q31, is silenced by methylation in cancer and sensitizes cancer cells to apoptosis.// Cancer Res. - 2007. -V. 67. -P. 1997-2005. 24 Vanaja D.K., Ballman K.V., Morlan B.W., Cheville J.C., Neumann R.M., Lieber M.M., Tindall D.J., Young C.Y. PDLIM4 repression by hypermethylation as a potential biomarker for prostate cancer.// Clin Cancer Res. - 2006. -V. 12. -P. 1128-1136. 25 Wei D., Sun N., Nan G., Wang Y., Liu H.Q., Peeters B., Chen Z.N., Bian H. Construction of Recombinant Newcastle Disease Virus Italien Strain for Oncolytic Virotherapy of Tumors.// Hum Gene Ther. - 2012. -V. 28. -P. 28. 26 Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.// Molecular biology and evolution. - 2007. -V. 24. -P. 1596-1599. 27 Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.// Journal of molecular evolution. 1980. -V. 16. -P. 111-120. 28 Rozas J., Sanchez-DelBarrio J.C., Messeguer X., Rozas R. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods.// Bioinformatics. - 2003. -V. 19. -P. 2496-2497. 29 Nei M.,Miller J.C. A simple method for estimating average number of nucleotide substitutions within and between populations from restriction data.// Genetics. - 1990. V. 125. -P. 873-879. 30 Sugiura N. Further analysis of the data by Akaike's information criterion and the finite corrections.// Commun. Stat. Theory Meth. - 1978. -V. A7. -P. 13–26. 31 Pond S.L.,Frost S.D. Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments.// Bioinformatics. - 2005. -V. 21. -P. 2531-2533. 1. Flynn D.C. 2001. Adaptor proteins. Oncogene. 20, 6270-6272. 2. Kadrmas J.L., Beckerle M.C. 2004. The LIM domain: from the cytoskeleton to the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 920-931. 73 3. Dawid I.B., Breen J.J., Toyama R. 1998. LIM domains: multiple roles as adapters and functional modifiers in protein interactions. Trends Genet. 14, 156-162. 4. Wang Y., Gilmore T.D. 2001. LIM domain protein Trip6 has a conserved nuclear export signal, nuclear targeting sequences, and multiple transactivation domains. Biochim. Biophys. Acta. 1538, 260-272. 5. Tanaka T., Soriano M.A., Grusby M.J. 2005. SLIM is a nuclear ubiquitin E3 ligase that negatively regulates STAT signaling. Immunity. 22, 729-736. 6. Ungureanu D., Silvennoinen O. 2005. SLIM trims STATs: Ubiquitin E3 ligases provide insights in the regulation of cytokine signaling. Science’s STKE, 304, pe49. 7. Capilli A.D., Schultz D.C., Rauscher III F.J., Borden K.L. 2001. Solution structure of the PHD domain from the KAP-1 corepressor: structural determinants for PHD, RING and LIM zinc-binding domains. EMBO J. 20, 165-177. 8. Pawson T., Nash P. 2003. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452. 9. Fanning A.S., Anderson J.M. 1999. PDZ domains: fundamental building blocks in the organization of protein complexes at the plasma membrane. J. Clin. Invest. 103, 767772. 10. Pallen M.J., Ponting C.P. 1997. PDZ domains in bacterial proteins. Mol. Microbiol. 26, 411-413. 11. Ponting C.P. 1997. Evidence for PDZ domains in bacteria, yeast, and plants. Protein Sci. 6, 464-468. 12. Harris B.Z., Lim W.A. 2001. Mechanism and role of PDZ domains in signaling complex assembly. J. Cell Sci. 114, 3219-3231. 13. Muhlhahn P., Zweckstetter M., Georgescu J., Ciosto C., Renner C., Lanzendorfer M., Lang K., Ambrosius D., Baier M., Kurth R., Holak T.A. 1998. Structure of interleukin 16 resembles a PDZ domain with an occluded peptide binding site. Nat. Struct. Biol. 5, 682-686. 14. Fan J.-S., Zhang M. 2002. Signaling complex organization by PDZ domain proteins. Neurosignals. 11, 315-321. 15. Hung A.Y., Sheng M. 2002. PDZ domains: structural modules for protein complex assembly. J. Biol. Chem. 277, 5699-5702. 16. Besprozvanny I., Maximov A. 2001. Classification of PDZ domains. FEBS Lett. 509, 457-462. 74 17. Songyang Z., Fanning A.S., Fu C., Xu J., Marfatia S.M., Chishti A.H., Crompton A., Chan A.C., Anderson J.M., Cantley L.C. 1997. Recognition of unique carboxylterminal motifs by distinct PDZ domains. Science (Washington D.C.) 275, 73-77. 18. Van den Berk L.C.J., van Ham M.A., te Lindert M.M., Walma T., Aelen J., Vuister G.W., Hendriks W.J.A.J. 2004. The interaction of PTP-BL PDZ domains with RIL: an enigmatic role for the RIL LIM domain. Mol. Biol. Rep. 31, 203-215. 19. Ponting C.P., Phillips C., Davies K.E., Blake D.J. 1997. PDZ domains: targeting signaling molecules to sub-membranous sites. Bioessays. 19, 469-479. 20. Nourry C., Grant S.G.N., Borg J.-P. 2003. PDZ Domain Proteins: Plug and Play! Science’s STKE. re7. 21. Jelen F., Oleksy A., Smietana K., Otlewski J. 2003. PDZ domains – common players in the cell signaling. Acta Biochim. Pol. 50, 985-1017. 22. Yi J., Beckerle M.C. 1998. The human TRIP6 gene encodes a LIM domain protein and maps to chromosome 7q22, a region associated with tumorigenesis. Genomics. 49, 314316. 23. Murthy K.K., Clark K., Fortin Y., Shen S.-H., Banville D. 1999. ZRP-1, a zyxin related protein, interacts with the second PDZ domain of the cytosolic protein tyrosine phosphatase hPTP1E. J. Biol. Chem. 274, 20679-20687. 24. Wang Y., Gilmore T.D. 2001. LIM domain protein Trip6 has a conserved nuclear export signal, nuclear targeting sequences, and multiple transactivation domains. Biochim. Biophys. Acta. 1538, 260-272. 25. Yi J., Kloeker S., Jensen C.C., Bockholt S., Honda H., Hirai H., Beckerle M.C. 2002. Members of the zyxin family of LIM proteins interact with members of the p130Cas family of signal transducers. J. Biol. Chem. 277, 9580-9589. 26. Sanz-Rodriguez F., Guerrero-Esteo M., Botella L.-M., Banville D, Vary C.P.H., Bernabéu C. 2004. Endoglin regulates cytoskeletal organization through binding to ZRP-1, a member of the LIM family of proteins. J. Biol. Chem. 279, 32858-32868. 27. Lai Y.-J., Chen C.-S., Lin W.-C., Lin F.-T. 2005. c-Src-mediated phosphorylation of TRIP6 regulates its function in lysophosphatidic acid-induced cell migration. Mol. Cell. Biol. 25, 5859-5868. 28. Lee J.W., Choi H.-S., Gyuris J.,Brent R., Moore D.D. 1995. Two classes of proteins dependent on either the presence or absence of thyroid hormone for interaction with the thyroid hormone receptor. Endocrinology. 9, 243-254. 75 29. Kassel O., Schneider S., Heilbock C., Litfin M., Göttlicher M., Herrlich P. 2004. A nuclear isoform of the focal adhesion LIM-domain protein Trip6 integrates activating and repressing signals at AP-1- and NF-κB-regulated promoters. Genes Dev. 18, 25182528. 30. Li L., Bin L.H., Liu Y., Chen D., Zhai Z., Shu H.B. 2005. TRIP6 is RIP2-associated common signaling component of multiple NF-κB activation pathways. J. Cell Sci. 118, 555-563. 31. Kiess M., Scharm B., Aguzzi A., Hajnal A., Klemez R., Schwarte-Waldhoff I., Schäfer R. 1995. Expression of ril, a novel LIM domain gene, is down-regulated in HRAStransformed cells and restored in phenotypic revertants. Oncogene. 10, 61-68. 32. Cuppen E., Gerrits H., Pepers B., Wieringa B., Hendriks W. 1998. PDZ motifs in PTPBL and RIL bind to internal protein segments in the LIM domain protein RIL. Mol. Biol. Cell. 9, 671-683. 33. Xia H., Winokur S.T., Kuo W.L., Altherr M.R., Bredt D.S. 1997. Actinin-associated LIM protein: identification of a domain interaction between PDZ and spectrin-like repeat. J. Cell Biol. 139, 507-515. 34. Wang H., Harrison-Shostak D.C., Lemasters J.J., Herman B. 1995. Cloning of a rat cDNA encoding a novel LIM domain protein with high homology to rat RIL. Gene. 165, 267-71. 35. Kotaka M., Ngai S.M., Garcia-Barcelo M., Tsui S.K., Fung K.P., Lee C.Y., Waye M.M. 1999. Characterization of the human 36-kDa carboxyl terminal LIM domain protein (hCLIM1). J. Cell Biochem. 72, 279-285. 36. Bashirova A.A., Markelov M.L., Shlykova T.V., Levshenkova E.V., Alibaeva R.A., Frolova E.I. 1998. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts. Gene. 210, 239-245. 37. Loughran G., Healy N.C., Kiely P.A., Huigsloot M., Kedersha N., O’Connor R. 2005. Mystique is a new insulin-like growth factor-I-regulated PDZ-LIM domain protein that promotes cell attachement and migration and suppresses anchorage-independent growth. Mol. Biol. Cell. 16, 1811-1822. 38. Torrado M., Senatorov V.V., Trivedi R., Fariss R.N., Tomarev S.I. 2004. Pdlim2, a novel PDZ-LIM domain protein, interacts with α-actinins and filamin A. Invest. Ophth. Vis. Sci. 45, 3955-3963. 76 39. Kang S., Xu H., Duan X., Liu J.-J., He Z., Yu F., Zhou S., Meng X.-Q., Cao M., Kennedy G.C. 2000. PCD1, a novel gene containing PDZ and LIM domains, is overexpressed in several human cancers. Cancer Res. 60, 5296-5302. 40. Wu R.Y., Gill G.N. 1994. LIM domain recognition of a tyrosine-containing tight turn. J. Biol. Chem. 269, 25085-25090. 41. Boden S.D., Liu Y., Hair G.A., Helms J.A., Hu D., Racine M., Nanes M.S., Titus L. 1998. LMP-1, a LIM-domain protein, mediates BMP-6 effect on bone formation. Endocrinology. 139, 5125-5134. 42. Kuroda S., Tokunaga C., Kiyohara Y., Higuchi O., Konishi H., Mizuno K., Gill G.N., Kikkawa U. 1996. Protein-protein interaction of zinc finger LIM domains with PKC. J. Biol. Chem. 271, 31029-31032. 43. Nakagawa N., Hoshijima M., Oyasu M., Saito N., Tanizawa K., Kuroda S. 2000. ENH, containing PDZ and LIM domains, heart/skeletal muscle-specific protein, associates with cytoskeletal proteins through the PDZ domain. Biochem. Bioph. Res. Co. 272, 505-512. 44. Zhou Q., Ruiz-Lozano P., Martone M.E., Chen J. 1999. Cypher, a striated musclerestricted PDZ and LIM domain-containing protein, binds to alpha-actinin-2 and protein kinase C. J. Biol. Chem. 274, 19807-19813. 45. Faulkner G., Pallavicini A., Formentin E., Comelli A., Ievolella C., Trevisan S., Bortoletto G., Scannapieco P., Salamon M., Mouly V., Valle G., Lanfranchi G. 1999. ZASP: a new Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein. J. Cell Biol. 146, 465475. 46. Passier R., Richardson J.A., Olson E.N. 2000. Oracle, a novel PDZ-LIM domain protein expressed in heart and skeletal muscle. Mech. Develop. 92, 277-284. 47. Vallenius T., Scharm B., Vesikansa A., Luukko K., Schäfer R., Mäkelä T.P. 2004. The PDZ-LIM protein RIL modulated actin stress fiber turnover and enhances the association of alpha-actinin with F-actin. Exp. Cell Res. 293, 117-128. 48. McKeown C.R., Han H.-F., Beckerle M.C. 2006. Molecular characterization of the Caenorhabditis elegans ALP/Enigma gene alp-1. Developmental Dynamics. 235, 530538. 49. te Velthuis A.J.W., Isogai T., Gerrits L., Bagowski C.P. 2007. Insights into the molecular evolution of the PDZ/LIM family and identification of a novel conserved protein motif. PloS ONE. 2, e189. 77 50. van der Meer D.L.M., Marques I.J., Leito J.T.D., Besser J., Bakkers J., Schoonheere E., Bagowski C.P. 2006. Zebrafish cipher is important for somite formation and heart development. Dev. Biol. 299, 356-372. 51. te Velthuis A.J.W., Ott E.B., Marques I.J., Bagowski C.P. 2007. Gene expression pattern of the ALP family during zebrafish development. Gene Expression Patterns. 7, 297-305. 52. Andersen O., Ostbye T.K., Gabestad I., Nielsen C., Bardal T. 2004. Molecular characterization of a PDZ-LIM protein in Atlantic salmon (Salmo salar): a fish ortholog of the alpha-actinin-associated LIM-protein (ALP). J. Muscle Res. Cell Motil. 25, 61. 53. Szpirer C., Szpirer J., Riviere M., Hagnal A., Kiess M., Scharm B., Schäfer R. 1996. Chromosomal assignment of three rat and human H-rev genes, putative tumor suppressors, down-regulated in malignantly HRAS-transformed cells. Mamm. Genome. 7, 701-703. 54. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., et al. 2001. The sequence of the human genome. Science. 291, 1304-1351. 55. Lander E.S., Linton L.M., Birren B., et al. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921. 56. Subramanian G., Adams M.D., Venter J.C., Broder S. 2001. Implications of the human genome for understanding human biology and medicine. J. Am. Med. Assn. 286, 22962307. 57. Modrek B., Lee C. 2002. A genomic view of alternative splicing. Nat. Genet. 30, 13-19. 58. Kopelman N.M., Lancet D., Yanai I. 2005. Alternative splicing and gene duplication are inversely correlated evolutionary mechanisms. Nat. Genet. 37, 588-589. 59. Huang C., Zhou Q., Liang P., Hollander M.S., Sheikh F., Li X., Greaser M., Shelton G.D., Evans S., Chen J. 2003. Characterization and in vivo analysis of splice variants of Cypher. J. Biol. Chem. 278, 7360-7365. 60. Niederländer N., Fayein N.A., Auffray C., Pomiès P. 2004. Characterization of a new human isoform of the enigma homolog family specifically expressed in skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Co. 325, 1304-1311. 61. Pomiès P., Macalma T., Beckerle M.C. 1999. Purification and characterization of an alpha-actinin-binding PDZ-LIM protein that is up-regulated during muscle differentiation. J. Biol. Chem. 274, 29242-29250. 78 62. Zhou Q., Chu P.-H., Huang C., Cheng C.-F., Martone M.E., Knoll G., Shelton G.D., Evans S., Chen J. 2001. Ablation of Cypher, a PDZ-LIM domain Z-line protein, causes a severe form of congenital myopathy. J. Cell Biol. 155, 605-612. 63. Vatta M., Mohapatra B., Jimenez S., Sanchez X., Faulkner G., Perles Z., Sinagra G., Lin J.H., Vu T.M., Zhou Q., Bowles K.R., DiLenarda A., Schimmenti L., Fox M., Chrisco M.A., Murphy R.T., McKenna W., Elliott P., Bowles N.E., Chen J., Valle G., Towbin J.A. 2003. Mutations in Cypher/ZASP in patients with dilated cardiomyopathy and left ventricular non-compaction. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2014-2027 64. Lasorella A., Iavarone A. 2006. The protein ENH is a cytoplasmic sequestration factor for Id2 in normal and tumor cells from the nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 4976-4981. 65. Ueki N., Seki N., Yano K., Masuho Y., Saito T., Muramatsu M.-a. 1999. Isolation, tissue expression, and chromosomal assignment of a human LIM protein gene, showing homology to rat Enigma homologue (ENH). J. Hum. Genet. 44, 256-260. 66. Pashmforoush M., Pomiès P., Peterson K.L., Kubalak S., Ross J. Jr., Hefti A., Aebi U., Beckerle M.C., Chien K.R. 2001. Adult mice deficient in actinin-associated LIMdomain protein reveal a developmental pathway for right ventricular cardiomyopathy. Nat. Med. 7, 591-597. 67. Jo K., Rutten B., Bunn R.C., Bredt D.S. 2001. Actinin-associated LIM protein-deficient mice maintain normal development and structure of skeletal muscle. Mol. Cell. Biol. 21, 1682-1687. 68. Altherr M.R., Bengtsson U., Markovich R.P., Winokur S.T. 1995. Efforts toward understanding the molecular basis of fascioscapulohumeral muscular dystrophy. Muscle Nerve. 2, S32-S38. 69. Vallenius T., Luukko K., Mäkelä T.P. 2000. CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4. J. Biol. Chem. 275, 11100-11105. 70. Kotaka M., Lau Y.-m., Cheung K.-k., Lee S.M.Y., Li H.-y., Chan W.-y., Fung K.-p., Lee C.-y., Waye M.M.Y., Tsui S.K.W. 2001. Elfin is expressed during early heart development. J. Cell. Biochem. 83, 463-472. 71. Guy P.M., Kenny D.A., Gill G.N. 1999. The PDZ domain of the LIM protein Enigma binds to beta-tropomyosin. Mol. Biol. Cell. 10, 1973-1984. 72. Bauer K., Kratzer M., Otte M., de Quintana K.L., Hagmann J., Arnold G.J., Eckerskom C., Lottspeich F., Siess W. 2000. Human CLP36, a PDZ-domain and LIM-domain 79 protein, binds to alpha-actinin-1 and associates with actin filaments and stress fibers in activated platelets and endothelial cells. Blood. 96, 4236-4245. 73. Krause A., Zacharias W., Camarata T., Linkhart B., Law E., Lischke A., Miljan E., Simon H.-G. 2004. Tbx5 and Tbx4 transcription factors interact with a new chicken PDZ-LIM protein in limb and heart development. Dev. Biol. 273, 106-120. 74. Camarata T., Bimber B., Kulisz A., Chew T.-L., Yeung J., Simon H.-G. 2006. LMP4 regulates Tbx5 protein subcellular localization and activity. J. Cell Biol. 174, 339-348. 75. Vallenius T. 2004. Characterization of actin stress fibers: involvement of PDZ-LIM adapter proteins and the novel Clik1 kinase. Academic dissertation. 76. Arimura T., Hayashi T., Terada H., Lee S.-Y., Zhou Q., Takahashi M., Ueda K., Nouchi T., Honda S., Shibutani M., Hirose M., Chen J., Park J.-E., Yasunami M., Hayashi H., Kimura A. 2004. A Cypher/ZASP mutation associated with dilated cardiomyopathy alters the binding affinity to protein kinase C. J. Biol. Chem. 279, 6746-6752. 77. Maeno-Hikichi Y., Chang S., Matsumura K., Lai M., Lin H., Nakagawa N., Kuroda S., Zhang J.-f. 2003. A PKCε-ENH-channel complex specifically modulates N-type Ca2+ channels. Nat. Neurosci. 6, 468-475. 78. Wu R.-y., Durick K., Songyang Z., Cantley L.C., Taylor S.S., Gill G.N. 1996. Specificity of LIM domain interactions with receptor tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 271, 15934-15941. 79. Frey N., Olson E.N. 2002. Calsarcin-3, a novel skeletal muscle-specific member of the calsarcin family, interacts with multiple Z-disc proteins. J. Biol. Chem. 277, 1399814004. 80. Erdmann K.S. 2003. The protein tyrosine phosphatase PTP-Basophil/Basophil-like: interacting proteins and molecular functions. Eur. J. Biochem. 270, 4789-4798. 81. Meinhold-Heerlein I., Stenner-Liewen F., Liewen H., Kitada S., Krajewska M., Krajewski S., Zapata J.M., Monks A., Scudiero D.A., Bauknecht T., Reed J.C. 2001. Expression and potential role of Fas-associated phosphatase-1 in ovarian cancer. Am. J. Pathol. 158, 1335-1344. 82. Erdmann K.S., Kuhlmann J., Lessmann V., Herrmann L., Eulenburg V., Muller O., Heumann R. 2000. The Adematous Polyposis Coli-protein (APC) interacts with the protein tyrosine phosphatase PTP-BL via an alternatively spliced PDZ domain. Oncogene. 19, 3894-3901. 83. Nelson W.J., Nusse R. 2004. Convergence of Wnt, β-catenin, and cadherin pathways. Science. 303, 1483-1487. 80 84. Hermann L., Dittmar T., Erdmann K.S. 2003. The protein tyrosine phosphatase PTP-BL associates with the midbody and is involved in the regulation of cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 14, 230-240. 85. Wansink D.G., Peters W., Schaafsma I., Sutmuller R.P.M., Oerlemans F., Adena G.J., Wieringa B., van der Zee C.E.E.M., Hendriks W. 2004. Mild inpairment of motor nerve repair in mice lacking PTP-BL tyrosine phosphatase activity. Physiol. Genomics. 19, 50-60. 86. Cuppen E., van Ham M., Wansink D.G., de Leeuw A., Wieringa B., Hendriks W. 2000. The zyxin-related protein TRIP6 interacts with PDZ motifs in the adaptor protein RIL and the protein tyrosine phosphatase PTP-BL. Eur. J. Cell Biol. 79, 283-293. 87. Taylor K.A., Taylor D.W., Schachat F. 2000. Isoforms of α-actinin from cardiac, smooth, and skeletal muscle form polar arrays of actin filaments. J. Cell Biol. 149, 635645. 88. Honda K., Yamada T., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein, associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140, 1383-1393. 89. Mills M.A., Yang N., Weinberg R.P., van der Woude D.L., Beggs A.H., Eastel S., North K.N. 2001. Differential expression of the actin-binding proteins, α-actinin-2 and –3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10, 1335-1346. 90. Broderick M.J.F., Winder S.J. 2005. Spectrin, α-actinin, and dystrophin. Adv. Protein Chem. 70, 203-246. 91. Otey C.A., Carpen O. 2004. α-Actinin revisited: a fresh look at an old player. Cell Motil. Cytoskel. 58, 104-111. 92. Schulz T.W., Nakagawa T., Licznerski P., Pawlak V., Kolleker A., Rozov A., Kim J., Dittgen T., Köhr G., Sheng M., Seeburg P.H., Osten P. 2004. Actin/alpha-actinindependent transport of AMPA receptors in dendritic spines: role of the PDZ-LIM protein RIL. J. Neurosci. 24, 8584-8594. 93. Fu S.-l., Waha A., Vogt P.K. 2000. Identification and characterization of genes upregulated in cells transformed by v-Jun. Oncogene. 19, 3537-3545. 94. Vanaja D.K., Ballman K.V., Morlan B.W., Cheville J.C., Neumann R.M., Lieber M.M., Tindall D.J., Young C.Y.F. 2006. PDLIM4 repression by hypermethylation as a potential biomarker for prostate cancer. Clin. Cancer Res. 12, 1128-1136. 81 95. Welsh J.B., Sapinoso L.M., Su A.I., et al. 2001. Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res. 61, 5974-5978. 96. Yu Y.P., Landsittel D., Jing L., et al. 2004. Gene expression alterations in prostate cancer predicting tumor aggression and preceding development of malignancy. J. Clin. Oncol. 22, 2790-2799. 97. Mills J.C., Syder A.J., Hong C.V., Guruge J.L., Raaii F., Gordon J.I. 2001. A molecular profile of the mouse gastric parietal cell with and without exposure to Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 13687-13692. 98. Liu C., Goshu E., Wells A., Fang C.-M. 2003. Identification of the downstream targets of SIM1 and ARNT2, a pair of transcription factors essential for neuroendocrine cell differentiation. J. Biol. Chem. 278, 44857-44867. 99. Gerhardinger C., Costa M.B., Coulombe M.C., Toth I., Hoehn T., Grosu P. 2005. Expression of acute-phase response proteins in retinal Müller cells in diabetes. Invest. Ophth. Vis. Sci. 46, 349-357. 100. Omasu F., Ezura Y., Kajita M., Ishida R., Kodaira M., Yoshida H., Suzuki T., Hosoi T., Inoue S., Shiraki M., Orimo H., Emi M. 2003. Association of genetic variation of the RIL gene, encoding a PDZ-LIM domain protein and localized in 5q31.1, with low bone mineral density in adult Japanese women. J. Hum. Genet. 48, 342-345. 82