Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова биологический факультет кафедра биофизики

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова
биологический факультет
кафедра биофизики
Отчет по летней практике:
«Изучение инактивации дрожжей при их облучении
неионизирующим излучением разной длины волны»
Выполнила: Никитина В.В.
Проверил: Перов С.Ю.
Москва, 2013г.
Теоретическая часть
Летальное действие коротковолнового УФ на микроорганизмы.
Процесс инактивации, отражающий зависимость выживаемости клеток
от дозы УФ облучения, можно выразить при помощи соотношения,
получаемого из распределения Пуассона 𝑁 = 𝑁0 𝑒 −𝜎𝐷 , где N0 и N отражают
соответственно первоначальное число клеток и число выживших клеток
после облучения дозой D. Константа σ называется поперечным сечением
инактивации, а выражение σD равно среднему числу ударов на мишень. При
σD = 1 на одну мишень приходится один летальный удар. Отсюда σ можно
определить как величину, обратную дозе, при которой выживаемость
составляет 37%. Лишь в очень ограниченном числе случаев зависимость доли
выживших клеток от величины дозы облучения описывается экспонентой,
т.е. простой одноударной кривой. Значительно чаще в эксперименте
получают кривые «доза-эффект», которые имеют плечо.
Согласно общепринятому мнению, основной мишенью при летальном
действии коротковолнового УФ света на микроорганизмы является ДНК.
Подтверждением решающей роли УФ повреждений ДНК в гибели клеток
является совпадение максимума в спектрах действия инактивации различных
микроорганизмов (260-265 нм) с максимумом в спектре поглощения ДНК.
Под действием УФ света изменяются физические и химические свойства
ДНК: снижается температура плавления и уменьшается вязкость растворов
ДНК, появляется гиперхромный эффект и реакция с формальдегидом,
характерная для денатурированных молекул. В результате ингибируется
трансформирующая активность ДНК и ее способность к репликации и
транскрипции.
Внутриклеточные системы темновой репарации ДНК.
Особенностью летального действия коротковолнового УФ излучения
на клеточном уровне является его высокая обратимость. Это означает, что
УФ индуцируемые повреждения не фиксируются немедленно, а являются
потенциальными, и могут быть репарированы клеткой. Установлено, что
фотохимические
основными
повреждения
темновыми
ДНК
могут
репарационными
ликвидироваться
системами:
двумя
эксцизионной
репарации и пострепликативной репарации.
Повреждающее действие длинноволнового УФ света на микроорганизмы.
Эффекты, индуцируемы длинноволновым УФ светом области 300 - 400
нм у микроорганизмов
начали систематически изучаться только в 70-х
годах. В основном работы проводились на различных штаммах E.coli.
Длинноволновый
УФ
свет
вызывает
торможение
роста
и
деления
бактериальных клеток, а в определенных дозах и их гибель.
Под действием длинноволнового УФ света в ДНК клеток индуцируется
образование фотопродуктов, ответственных за мутагенез и гибель клеток.
Основным типом фотопродуктов, как и в случае облучения коротковолновым
УФ, являются пиримидиновые димеры ДНК. Однако отношение количества
димеров, образовавшихся в ДНК E.coli при определенной дозе УФ 254 нм к
количеству димеров, индуцированных той же дозой 365 нм, равно 7*105.
Доказательством димерной природы продуктов ДНК, индуцированных
длинноволновым УФ светом, являются данные о фотореактивируемости
большей части этих продуктов как в клетках, так и в растворах ДНК, а
известно, что единственным субстратом фотореактивирующего фермента
являются димеры пиримидиновых оснований.
Другим
типом
фотопродуктов
ДНК
являются
одноцепочечные
разрывы, индуцируемые светом 365 нм. Отношение числа димеров к числу
одноцепочечных разрывов ДНК уменьшается с увеличением длины волны
УФ облучения. Так при облучении E.coli 254 нм это отношение равно 800,
при 313 нм – 21, а при 405 нм – 0,1.
Образование фотопродуктов в ДНК под действием УФ света 300 – 320
нм можно частично объяснить прямым поглощением света ДНК. Однако
длинноволновая граница поглощения света ДНК находится около 310 нм.
Более длинноволновый УФ свет, например, 365 нм, молекулой ДНК
непосредственно не поглощается, но индуцирует образование в ней
пиримидиновых димеров и одноцепочечных разрывов. Предполагаемый
фотохимический механизм косвенного воздействия длинноволнового УФ
света на ДНК заключается в фотосенсибилизации, т.е. в поглощении квантов
УФ света этой области спектра некоторыми соединениями с дальнейшей
передачи энергии возбуждения основаниями ДНК.
Длинноволновый УФ свет вызывает повреждения не только в ДНК, но
и в других внутриклеточных системах, таких как система репарации,
транспорта, метаболизма и в мембранах.
Под действием УФ света в
мутантных по фотореактивации клетках уменьшается эффективность работы
эксцизионной и рекомбинационной репарации, причем эти эффекты
кислородзависимые.
При
облучении
клеток
сублетальными
дозами
обнаружены нарушения в работе транспортных систем у бактерий и
дрожжей. Транспорт лейцина, например, подавляется светом 365 нм, а
сукцината – 340 нм. Наблюдается так же нарушения работы метаболических
систем – инактивации светом 334 нм ферментов триптофаназы и
галактозидазы и их индуцированного синтеза. Подобные эффекты могут
приводить к накоплению промежуточных метаболитов в клетках, в свою
очередь являющихся акцепторами длинноволнового УФ света.
В немногочисленных работах по изучению подавления дыхания и
инактивации дрожжевых клеток УФ светом длин волн 313 нм и 365 нм
установлено, что хромофором и мишенью этих процессов является
переносчик электронов в дыхательной цепи митохондрий – убихинон.
Предполагается,
что
митохондриальных
фотодеструкция
при
мембран
молекулы
облучении
и
целых
убихинона,
длинноволновым
клеток
дрожжей
приводящая
к
УФ
светом
происходит
потере
ее
функциональной активности.
При
облучении
некоторых
организмов
сублетальными
дозами
длинноволнового УФ света наблюдается задержка роста и деления клеток. В
отличие от эффекта инактивации эффекты задержки роста и деления клеток
характеризуются обратимостью и не связаны с фотоповреждением ДНК, а
обусловлены
либо
фотоингибированием
энергетических
процессов
–
дыхания и фотосинтеза, либо с фотоинактивацией ключевых биохимических
компонентов
и
синтезов,
например
транспортной
РНК,
синтеза
триптофаназы. Проявление эффекта задержки роста и деления клеток
зависит, вероятно, от положения поврежденного компонента в системе
внутриклеточной регуляции, от наличия в клетках обходных путей УФ
повреждений и от эффективности работ систем репарации.
Цель работы: Изучить влияние различных длин волн УФ спектра на
выживаемость дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Объекты и методы исследования
I.
Объекты исследования.
Объектами
исследования
являлись
следующие
представители
дрожжевых микроорганизмов: S. cerevisiae С-7 – диплоидный дикий
штамм, S. cerevisiae С1-9 – гаплоидный дикий штамм. Культуры
дрожжей выращивали по стандартной схеме. С суточного косяка (суслоагар), выращенного в термостате при 30°С, делали смыв и 4 мл суспензии
клеток вносили в колбу на 500 мл, содержащую 100 мл питательной среды
следующего состава: NH4H2PO4 – 2,0 г; (NH4)2HPO4 – 0,5 г; K2SO4 – 0,2 г;
MgSO4 – 0,2 г; дрожжевой автолизат – 20 мл; вода водопроводная – 1000
мл; сахароза – 1%. Исходное значение рН 5,7. Культуру выращивали на
качалке 230 об/мин при 32°С в течение 6 часов.
II.
Методы исследования.
Монохроматический длинноволновый УФ свет 313 нм получали с
помощью дифракционного спектрографа (линейная дисперсия 1 нм/мм) от
ртутной лампы ДРШ-1000. Кварцевые или стеклянные пробирки с
суспензиями клеток располагали в фокальной плоскости спектрографа.
При
помощи
поддерживалась
системы
термостатирования
постоянная
температура
во
время
25°С.
облучения
Интенсивность
монохроматического
света
измеряли
высокочувствительным
термостолбиком Hilger FT 16.1/628. После выравнивания ослабляющими
сетками она составляла 10-3Дж/см2*сек.
Источником коротковолнового УФ 254 нм являлась бактерицидная
лампа БУВ-30. Интенсивность УФ света 254 нм при облучении составляла
10-3Дж/см2*сек. Облучение суспензии дрожжей (концентрации 106
клеток/мл) проводили в чашках Петри в солевой среде следующего
состава (в г/л): NH4H2PO4 – 2; (NH4)2HPO4 – 0,5; K2SO4 – 0,2; MgSO4 – 0,2 с
добавлением 1% сахарозы.
Концентрацию клеток определяли их подсчетом в камере Горяева.
Выживаемость клеток определяли по методу микроколоний. Выжившими
считали клетки, способные к бесконечному размножению и образованию
через 24 ч роста на агаровых пластинках при 30°С колоний правильной
круглой формы.
Экспериментальная часть
Были выбраны две длины волны 254 нм – коротковолновый УФ и 313 нм
– длинноволновый УФ. При облучении дрожжей этими двумя длинами волн
мы наблюдали инактивацию клеток. На рис. 1 и 2 приведены зависимости
выживаемости клеток двух штаммов S.cerevisiae от дозы УФ света 254 нм
или 313 нм.
Рис.1. Кривые выживаемости дрожжей S.cerevisiae, облученных
ультрафиолетом 254нм.
Рис.2. Кривые выживаемости дрожжей S.cerevisiae, облученных
ультрафиолетом 313 нм.
По полученным дозовым зависимостям были определены основные
параметры кривых выживания.
Таблица 1. Значения параметра n при инактивации дрожжей S. сerevisiae
ультрафиолетом длин волн 254 или 313 нм.
С1-9
С-7
отн.ед.
отн.ед.
254 нм
1,15
1,22
313 нм
0,75
0,86
Таблица 2. Значения параметра D37 при инактивации дрожжей S. сerevisiae
ультрафиолетом длин волн 254 или 313 нм (Дж/см2).
С1-9
С-7
Дж/см2
Дж/см2
254 нм
0,06
0,08
313 нм
3,6
4,5
Таблица 3. Значения параметра D0 при инактивации дрожжей S. сerevisiae
ультрафиолетом длин волн 254 или 313 нм.
С1-9
С-7
Дж/см2
Дж/см2
254 нм
0,014
0,039
313 нм
1,8
1,1
Выводы
УФ свет длин волн 254 нм и 313 нм вызывает инактивацию клеток
штаммов С1-9 и С-7. Среднелетальная доза (D37) при облучении УФ длиной
313 нм примерно в 60 раз больше, чем при облучении УФ длиной 254 нм.
Это означает, что коротковолновый УФ намного сильнее инактивирует
клетки, чем длинноволновый. Хотя количество «мишеней» у разных
штаммов при разных длинах волн примерно одинаковые ≈ 1.
Литература
1. Завильгельский Г. Б., Парибок В. П. Молекулярные механизмы
действия УФ-излучения на клетку.— В сб.: Ультрафиолетовое
излучение, вып. 5. М., 1971, с. 5.
2. Корогодин
В.И.
(1966)
Проблемы
пострадиационного
восстановления. М: Атомиздат, 391 с.
3. К. Смит, Ф.Хеноуолт. Молекулярная фотобиология. М., 1972.
4. Ю.Б.
Кудряшов.
Радиационная
биофизика
(ионизирующие
излучения). М., 2004.
5. Фрайкин
Г.Я.
деструктивных
(1988)
и
Механизмы
УФ-индуцированных
фотомодифицирующих
реакций
у
микроорганизмов. В кн.: Молекулярные механизмы биологического
действия оптического излучения (ред. А.Б.Рубин). М: Наука, 154165.
6. Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я. (1987) Первичные молекулярные
механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие
оптического излучения. Успехи совр. биол., 103, 323-339.
7. Webb, R. B. Lethal and mutagenic effects of near-ultraviolet radiations.
Photochem. Photobiol. Rev. 2, 169-271, 1977.