Краткий отчёт ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России
advertisement
Краткий отчет ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России за 2013 год Основные достижения Новые лекарственные средства, разрешенные к медицинскому применению Полимурамил – иммуностимулятор для активации мукозального иммунитета верхних дыхательных путей, является эффективным средством для профилактики и лечения острых и хронических инфекционных процессов респираторного тракта. Полимурамил (субстанция) зарегистрирован в Государственном реестре лекарственных средств РФ, № ФС-000557. Полимурамил (лекарственный препарат). Государственный реестр лекарственных средств РФ, № ЛП-002069 (совместно с ООО "Корус Фарм") Экспериментальные образцы субстанций новых лекарственных средств: на основе рекомбинантного белка ИПФIII и полиоксидония для комплексной терапии гепатита С на основе рекомбинантного аналога полноразмерного паратиреоидного гормона для лечения остеопороза пять противовоспалительных антисмысловых олигонуклеотида (АСО) на основе механизма интерференции РНК для терапии бронхиальной астмы молекулы миРНК, обладающие противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С (HCV) Экспериментальные образцы субстанций новых иммуномодуляторов: экспериментальный образец поли-1,4-этиленпиперидина (ПЭП) 12 катионных пептидов: 7 линейных, 4 липопептида комплекс фрагментов пептидогликана (КФПГ) грамотрицательных бактерий. мурамилпептиды грамотрицательных бактерий ГМтри, ГМтетра и диГМтетра Экспериментальные образцы вакцин нового поколения: комплексный лекарственный препарат, состоящий из капсульного полисахарида (КПС) и липоолигосахарида (ЛОС) H.influenzae для профилактики гемофильной инфекции комбинированная профилактическая вакцина против шигеллезной инфекции на основе капсульного полисахарида бактерий Зонне и модифицированного липополисахарида бактерий Флекснера Экспериментальные образцы субстанций компонентов вакцин: рекомбинантные белки gp120 и gp41 - аналоги нативных белков ВИЧ-1 синтетические олигосахариды S1, S2, S3 для гликозилирования рекомбинантных интерферонов 2 типа цвиттерионный О-специфический полисахаридный компонент липополисахарида (ЛПС) Shigella sonnei, фаза 1 олигосахаридные фрагменты опухольассоциированного ганглиозида GM3 и конъюгаты этих фрагментов с белками: гемоцианином, рекомбинантным флагеллином и токсоидом столбняка биополимеры углеводной природы (НЭТ-БУП) S. sonnei и E. coli аллергены из трех видов насекомых: Apis mellifera, Aedes aegypti, Blattella germanica мономерный аллергоид из клещей домашней пыли D1 1 Фундаментальные НИР по Госзаданию тема «Иммуногенетика» Проведен анализ литературы о взаимосвязи аллельных вариантов генов HLA и предрасположенностью к развитию сахарного диабета типа 1 (СД1) и других заболеваний, ассоциированных с иммунной системой. Для проведения последующих работ по HLAгенотипированию на уровне высокого разрешения (аллели) проводился сбор биологических образцов от больных СД1 и контрольных доноров крови. Из собранных образцов крови стандартными методами была выделена ДНК и измерена ее концентрация. Выполнено генотипирование на уровне аллелей гена HLA-DRB1*04 от больных СД1 русских, жителей г.Москвы и жителей Архангельской области и соответствующих контрольных образцов. Проведено сравнение распределения аллелей гена HLA DRB1*04 у больных и здоровых субъектов из контрольной группы. Установлены аллели, ассоциированные с чувствительностью к СД1. Аллелей, ассоциированных с устойчивостью к СД1, среди исследованных групп не выявлено. Продолжена работа по созданию «иммуногенетической карты России». Собран биологический материал от жителей Вологодской области, проживающих в сельских районах, 120 образцов биоматериала в виде периферической крови от лиц, не состоящих друг с другом в близком родстве. Из собранного биоматериала стандартными методами была выделена ДНК и определено ее количество в образцах. Выполнено генотипирование образцов по локусам HLA DRB1, HLA-A и HLA-B на уровне аллелей методом прямого сиквенирования. Отобраны 196 больных с диагнозом «Хроническая идиопатическая крапивница» (ХИК). Все больные были обследованы в период обострения ХИК однократно. При проведении внутрикожной пробы с аутологичной сывороткой положительные результаты получены у 28/50% из 56 обследованных больных ХИК. У этой группы больных часто встречались антитиреоидные антитела и отсутствие эффекта антигистаминной терапии. Положительный тест с аутосывороткой указывает на возможную циркуляцию гистаминвысвобождающих аутоантител и имеет умеренную специфичность как маркер этих аутоантител. Рекомендовано включение теста с аутосывороткой у больных ХИК в перечень обязательных, особенно в случаях тяжелого течения заболевания. Прикладные НИР по Госзаданию тема «Иммунобиотехнологии-13» Осуществлен дизайн антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), направленных на подавление экспрессии про-воспалительного гена il-4 человека. Спроектировано 5 различных молекул АСО к разным участкам гена относительно старт-кодона. Осуществлен химический синтез спроектированных молекул АСО. Кроме того, методами генной инженерии была разработана экзогенная модель экспрессии гена-мишени (il-4 человека) в клетках 293T (эмбриональная почка человека). Начато создание экспериментальной модели экспрессии гена-мишени il-13 человека, принимающего ключевое участие в патогенезе бронхиальной астмы (БА). Ген il-13 человека был амплифицирован, клонирован и точность его клонирования подтверждена методом секвенирования. Проведены работы по созданию генетических конструкций, кодирующих рекомбинантные белки gp120 и gp41 ВИЧ1, которые были оптимизированы для экспрессии в бактериальных клетках E. coli. Получены штаммы-продуценты рекомбинантных белков gp120 и gp41. Наработаны рекомбинантные белки gp120 и gp41 в количестве по 150 мг. Разработаны методики рефолдинга рекомбинантных белков gp120 и gp41. Определен дизайн молекул олигосахаридов, которые будут участвовать в конъюгации с молекулами рекомбинантных интерферонов 2-го типа. Разработана 4-хэтапная методика синтеза олигосахаридов с заданной структурой. Наработаны 2 олигосахариды в количестве: S1 - 1012 мг, олигосахарид S2 - 914 мг, олигосахарид S3 - 69 мг. Для получения липополисахаридов выбран производственный штамм S.sonnei, фаза 1 (№ 5063). Подобрана синтетическая питательная среда, использование которой обеспечивало максимальный выход как клеточной массы, так и бактериальных полисахарид-содержащих биополимеров. Выделен полимер, строение которого полностью совпадает со строением цвиттерионного О-специфического полисахаридного компонента липополисахарида (ЛПС) Shigella sonnei, фаза 1. Изучены его физикохимическая и иммунологическая характеристики. Уровень пирогенности цвиттерионного капсульного полисахарида Shigella sonnei, фаза 1 оказался приемлемым для дальнейшего использования его в качестве вакцинного компонента. Разработана методика получения мономерного аллергоида из клещей домашней пыли D1. Отработаны методы контроля специфической активности мономерного аллергоида из аллергенов D1. Получена модель экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у мышей. Изучена аллергенность и иммуногенность полученного мономерного аллергоида. Разработана унифицированная лабораторная технология выделения аллергенов из пыльцы амброзии. Выделенный аллерген был нетоксичен в тесте острой токсичности и обладал иммуногенностью и специфической активностью. Подготовлен лабораторный технологический регламент получения аллергена из пыльцы амброзии. Разработан метод полимеризации гетероциклического амина, 1азабицикло[2.2.2]октана, (хинуклидин). Получен экспериментальный образец поли-1,4этиленпиперидина (ПЭП), определена структура, отработаны условия измельчения и очистки полученного полимера. Разработан метод получения алкилзамещенных производных ПЭП. Проведено тестирование пирогенности образца производного ПЭП. Показано, что в дозах 0,1 и 1 мг/кг он непирогенен. Твердофазным методом синтезированы 12 катионных пептидов: 7 линейных, 4 липопептида (модифицированные пальмитиновой кислотой) и 1 дендримерный (разветвленный) пептид. Разработаны методы синтеза катионных производных фуллерена С60. Полученные производные охарактеризованы элементным анализом, ЯМР-, ИК-, УФВИД- и масс-спектрометрией. Подана заявка на патент "Способ получения водных нанодисперсий фуллерена". Наработан комплекс фрагментов пептидогликана (КФПГ) грамотрицательных бактерий. Показано, что при иммунизации мышей КФПГ в дозе 100 мкг/мышь титры специфических антител начинают увеличиваться с 3-го дня после иммунизации и достигают максимума к 10-му дню, будучи в 100 раз выше исходных. Бустерная иммунизация в той же дозе, проводимая на 10-е сутки после первичной иммунизации, не вызывает дальнейшего прироста титров антител по сравнению с титром, достигнутым на 10-е сутки. Доза 10 мкг/мышь обладает сопоставимым иммунизирующим действием, тогда как низкая доза - 1 мкг/мышь – неэффективна; Синтезированы олигосахаридные фрагменты опухольассоциированного ганглиозида GM3 и получены конъюгаты этих фрагментов с белками: гемоцианином, рекомбинантным флагеллином и токсоидом столбняка. Установлено, что наибольшей иммуногенностью обладал конъюгат на основе рекомбинантного флагеллина. Сапонин значительно увеличивал иммуногенность конъюгатов на основе рекомбинантного флагеллина и гемоцианина. Введение мышам дендритных клеток (ДК), пульсированных конъюгатами на основе гемоцианина и рекомбинатного флагеллина, но не токсоида столбняка, вызывало адъювантный эффект. Разработана лекарственная форма препаратов на основе гемоцианина и рекомбинантного флагеллина. Наработаны серии химически чистых апирогенных низкоэндотоксичных биополимеров углеводной природы (НЭТ-БУП) S. sonnei и E. coli O:55. Получена коррекция развития эндотоксического и септического шока у мышей при предварительном введении НЭТ-БУП. 3 тема «Диагностика-13» Для получения гибридом в качестве антигенного материала выбраны живые клетки Jurkat, на которых опухольассоциированный Tn антиген находится в нативной конформации. 7 мышей линии BALB/c были иммунизированы живыми клетками Jurkat. Три мыши с наивысшим титром антител были отобраны для гибридизации. Выполнено три гибридизации спленоцитов с мышиной миеломой Sp2/0. Получено более 800 гибридных первичных культур, которые тестировали в иммунофлуоресцентном тесте. При дополнительном тестировании выявлены 11 первичных гибридомных культур, которые не давали окрашивания клеток Jurkat. Отобранные первичные гибридомные культуры были клонированы. В результате получено 9 стабильных гибридомных клеточных линий, которые криоконсервированы для дальнейшего изучения специфичности полученных антител. Проведена работа по выбору подходящих эндогенных и экзогенных субстратов основных изоферментов цитохрома Р450. Выбрано 4 основных изофермента, ответственных за метаболизм большого количества известных лекарственных средств. Это CYP 2С9, CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 1A2. Изучена их активность. Разработаны методики определения эндогенного кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в биологических жидкостях. Обе методики были валидированы. и апробированы на биоматериале. Проведено выделение аллергенов из трех видов насекомых: Apis mellifera, Aedes aegypti, Blattella germanica. Показано наличие специфических IgE-связывающих свойств у белковых фракций, полученных из водно-солевого экстракта (ВСЭ) каждого вида указанных насекомых. Определены главные и минорные аллергены для каждого вида насекомых, установлены их IgE-связывающие свойства и сформированы суммарные аллергенные фракции (САФ). Разработаны технологические схемы выделения специфически активных аллергенов из разных видов насекомых. тема «Радиация-13» Оценивали динамику субпопуляций тимоцитов и уровня Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в тимусе и периферическом отделе иммунной системы в пострадиационном периоде у мышей. На пике экстренной регенерации тимуса (10 сут. после облучения) регистрируется усиление притока клеток-предшественников из костного мозга (повышение численности клеток во фракции CD44+CD25- DN1-тимоцитов) и в то же время практически полное исчезновение клеток во фракциях DN2 и DN3, что, очевидно, служит причиной вторичной атрофии органа. Интенсивность перестройки генов TCR, определяемой по накоплению ТРЭК, снижается сразу после облучения, затем быстро возрастает, существенно превосходя уровень нормы к 10 сут. после облучения. Пострадиационная динамика уровня ТРЭК в лимфатических узлах и селезенке отражает разные этапы восстановительных процессов, происходящих в тимусе, но с небольшой отсрочкой во времени. Таким образом, вклад тимуса в восстановление популяции периферических Т-клеток, поврежденной облучением, особенно велик в интервале 8-12 сут., что выражается в усилении созревания и эмиграции Т-клеток из тимуса во вторичные лимфоидные органы, позволяющем обеспечить равномерное увеличение численности Тклеток в этих органах. На основании литературных данных определен перечень кандидатных SNPмаркеров, перспективных для оценки радиочувствительности человека. Наиболее критическим параметром, влияющим на эффективность и специфичность иммунных реакций в ответ на облучение, является система представления антигенов (в том числе нео-антигенов) эндогенного и экзогенного для клетки происхождения. Таким образом, для установления ассоциации вариантов генов иммунного ответа с восприимчивостью человека к радиационному воздействию, целесообразно исследование генов HLA класса I на уровне аллельных вариантов. Сформированы коллекции образцов от облученных лиц (УНПЦ РМ ФМБА России) и популяционного контроля (коллекция ФГБУ «ГНЦ 4 Институт иммунологии» ФМБА России) для проведения исследования. С помощью программного обеспечения разработаны последовательности синтетических молекул (праймеров, проб) для специфической детекции выбранных кандидатных SNP-маркеров. тема «ВИЧ/СПИД-13» Проведено исследование иммуногенных свойств смеси синтетических пептидов, копирующих эпитопы ВИЧ1 (V1-, V2-, V3 - петлю белка gp120 консенсусной последовательности группы М и V3 - петлю белка gp120 российского изолята), с пептидогликаном клеточной стенки бактерии E. coli. Введение препарата стимулировало выработку специфических антител класса IgG и IgM. Для сравнительного анализа иммунного ответа на синтетические пептиды с иммунным ответом, образующимся в результате естественной инфекции, собраны образцы сывороток людей, содержащих антитела к ВИЧ. Проведено исследование нейтрализующей активности ВИЧ положительных сывороток на модели псевдовирусной инфекции. Исследовано 11 пептидных препаратов, 10 из которых имитируют вариабельность поверхностных эпитопов V3-петли вируса ВИЧ-1, один является нашим оригинальным проектом и представляет собой минимальный мультимер потенциального конформационного эпитопа нейтрализации в линейном синтетическом пептиде. При иммунизации лабораторных животных (инбредных мышей) только пептидами после одноили двукратной иммунизации титры антител в сыворотке не поднимались выше фона неиммунизированных мышей. Добавление к пептидным антигенам в качестве адъювантов препаратов пептидогликанов из клеточной стенки бактерий Salmonella typhi (как рецептор-направленных адъювантов) позволяет получить анти-пептидные антитела в титрах: после однократной иммунизации порядка - 102, после двукратной – (2 – 5) х 102. Проведен анализ данных научной литературы о современных биомедицинских подходах к иммунопрофилактике и иммунотерапии ВИЧ-инфекции/СПИДа. Проанализированы международные нормативные документы по противодействию ВИЧинфекции/СПИДу, в том числе последние рекомендации ВОЗ о раннем начале антиретровирусной терапии. Подготовлен аналитический обзор «Биомедицинские подходы к иммунопрофилактике и иммунотерапии ВИЧ-инфекции/СПИДа». Подготовлен вопросник для анкетирования потенциальных добровольцев с целью оценки информированности о ВИЧ/СПИДе и готовности к участию в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин и вакцинации против ВИЧ/СПИДа. Подготовлен проект «Методики проведения анкетирования для оценки информированности потенциальных добровольцев о ВИЧ/СПИДе и готовности к вакцинации против ВИЧ/СПИДа». Подготовлен проект методических рекомендаций «Принципы обследования и отбора потенциальных добровольцев для участия в клинических испытаниях профилактических кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИДа». тема «Иммунопатология» Выявлено, что среди иммунологических отклонений, зарегистрированных у детей первого года жизни с тимомегалией, наиболее постоянно проявляется Т-лимфопения с преобладающим снижением содержания CD4+-лимфоцитов и уровня Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в лимфоцитах. Выраженность этих изменений увеличивается с нарастанием степени тимомегалии. Менее закономерно выявляется снижение содержания регуляторных CD4+CD25hi-Т-клеток и эндогенно активированных CD4+CD25lo Т-клеток. Снижение содержания ТРЭК при тимомегалии в периферических Т-клетках указывает на ослабление эмиграции зрелых Т-клеток из органа, что может способствовать проявлению несостоятельности иммунной защиты. Поэтому детей с увеличением тимуса можно рассматривать как группу риска, предрасположенную к возникновению более частых заболеваний. Отработана экспериментальная модель метастазирующего рака 4Т1 на мышах, определена динамика роста опухоли, динамика нарастания супрессорных популяций 5 MDSC и T reg в селезенке и легких, динамика появления метастазов в легких. Показана пригодность данной модели для исследования возможности и эффективности фармакологической коррекции иммунитета у экспериментальных животных как при росте солидной опухоли, так и при метастатической болезни, а также для анализа возможности преодоления иммуносупрессии, связанной с опухолевым процессом. Сформирована группа из 26 пациентов с бронхиальной астмой средней и тяжелой степени тяжести, длительно получающих глюкокортикоиды и произведен забор крови в фазе обострения. Купирование обострения бронхиальной астмы сопровождалось увеличением показателей бронхиальной проходимости, достоверным увеличением объема форсированного выдоха, а также существенным повышением пролиферативного ответа лимфоцитов на митоген. У больных БА, длительно получавших ГКС-терапию, имеется стойкое снижение чувствительности ЛПК к действию глюкокортикостероидов. С помощью разработанной анкеты опрошено 750 респондентов молодого возраста (1990-1995 годов рождения). Респондентам, которые дали положительные ответы было проведено аллергообследование с помощью постановки кожных тестов со стандартным набором диагностических аллергенов и проведена спирометрия для выявления бронхообструкции. Установлено, что за последние 2 десятилетия (по сравнению с данными 1992 г) возросла распространенность аллергического ринита (с 17% до 59%), крапивницы (с 13% до 35%), пищевой аллергии (с 1,8% до 48%) и лекарственной непереносимости (с 5,4% до 29%). Отмечен рост сенсибилизации к эпидермальным аллергенам и аллергенам клещей домашней пыли. Выявлено 16 человек с различными видами врожденных иммунодефицитов. Для подтверждения диагноза проведено молекулярно- генетическое обследование трех больных. В настоящее время под наблюдением состоит 395 пациентов с первичными иммунодефицитами взрослого возраста. Проведено изучение особенностей течения беременности у пациенток с иммунодефицитными состояниями. Разработан алгоритм ведения беременности, родов и послеродового периода у пациенток с иммунодефицитами. Обоснована необходимость включения аллерголога-иммунолога в стандарты ведения пациенток, получающих иммуносупрессивную терапию во время беременности. Проведено комплексное клинико-иммунологическое и аллергологическое обследование больных, перенесших в анамнезе реакции гиперчувствительности после введения рентгеноконтрастных средств (РКС) с различными клиническими проявлениями. У 48 человек из 87 (55,2%) были выявлены различные аллергические заболевания. Определена специфичность и чувствительность кожного тестирования для диагностики лекарственной аллергии РКС. Разработан протокол обследования пациентов с предполагаемой аллергией на РКС. Проведено комплексное клинико-аллергологическое обследование и лечение 35 пациентов с астматической триадой (АсТ). При аллергообследовании установлен высокий процент непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов (100%), природных салицилатов и продуктов, консервированных с помощью ацетилсалициловой кислоты (5,4%), сенсибилизация к неинфекционным и грибковым аллергенам (54,2%). Выявлена дисфункция мукозального иммунитета у больных с АсТ проявляющиеся в виде повышения содержания IgG и лактоферрина, а также снижения активности лизоцима. Комплексную фармакотерапию ПРС проводили с применением препарата Лонгидазы. Показано, что применение препарата способствует снижению и нормализации показателей уровня лактоферрина, что свидетельствует о его противовоспалительном и иммуномодулирующем эффекте. Обследовано 18 пациентов с атопическим дерматитом (АтД) различной степени тяжести (10 женщин и 8 мужчин), в возрасте от 18 до 47 лет. Проведена сравнительная оценка экспрессии генов цитокинов в биоптатах кожи. Выявлено увеличение уровня экспрессии генов IL5, IL10, IL25 и TGFβ в группе больных АтД по сравнению со здоровыми донорами (p <0, 005). Статистически значимых различий по признакам IL4, IL 6 13, IL 17, IL 32, IL33, IL 35, выявлено не было. Показана целесообразность исследования экспрессии генов цитокинов в качестве маркеров иммунного ответа непосредственно в органе мишени аллергического воспаления – коже при АтД. Исследованы in vivo адъювантные эффекты шигеллезной вакцины, представляющей собой низкотоксичный экзополисахарид, содержащий 2 остатка липида, полученный из S.sonnei 5063. В опытах ex vivo у здоровых доноров выявлены индивидуальные различия в активации адаптивного иммунитета, при этом шигеллезная вакцина в подавляющем большинстве случаев активировала «аларминовое» и ТLRзависимое звенья врожденного иммунитета. Исследуемый препарат определял направление дифференцировки предшественников регуляторных T-клеток и активировал преимущественно ТН1/провоспалительный иммунный ответ. Совокупность представленных результатов позволяет рассматривать исследуемый препарат как бифункциональный иммунотропный агент, обладающий иммуностимулирующей активностью. В течение 2013 г. года регистр пополнился 8-ю наблюдениями вновь выявленных пациентов (детей) с первичной иммунной недостаточностью, включая 2-х пациентов СНIgA, 2-х с ХКСК, 1-го с гипер-IgE, 1-го с КИН с атаксией-телеангиэктазией, 1-го с транзиторной гипогамаглобулинемией младенческого возраста и 1-го с агаммаглобулинемией с гипер-IgM. Данные клинико-иммунологического обследования подтвердили диагноз первичных иммунодефицитов. Общее число пациентов, внесенных в регистр достигло 649. Контракты с ФМБА По отраслевому заказу «Объект-13» Обследовано 197 лиц из персонала предприятия и лиц, проживающих в г. Красноармейске. 90 человек обследовано повторно. Наличие аллергопатологии отмечено у 19,19% лиц 1 группы - персонала, имеющего возможный контакт с производственным фактором (ПФ), у 22,73% лиц 2 группы- лиц, не имеющих допуска для работы с ПФ, и у 16,36% лиц 3 группы – группы контроля, которую составили жители г. Красноармейска. В структуре отмечено преобладание аллергического ринита с бытовой сенсибилизацией, а также поллиноза с преимущественной сенсибилизацией к аллергенам злаковых трав. Оказана консультативная и лечебная помощь. Разработаны и применены обучающие программы для пациентов по наиболее распространенным аллергическим заболеваниям и ИДС. Для изучения показателей мукозального иммунитета исследованы образцы слюны. Выявлен повышенный уровень общего IgG в слюне у персонала предприятия с заболеваниями нижних отделов респираторного тракта и заболеваниями ЖКТ и повышенный уровень sIgA у лиц с частыми ОРВИ, заболеваниями верхних отделов респираторного тракта и ротовой полости. «Аллергодиагностика-13» Получены и охарактеризованы пищевые аллергены: куриного яйца (цельного), рыбы (треска), яблока и моркови. Выделены и охарактеризованы аллергены из пыльцы амброзии, полыни, березы и тимофеевки. Показана специфическая активность полученных аллергенных препаратов. Выполнены эксперименты по изучению влияния на иммунную систему мышей комбинаций бактериального липополисахарида (комплексный ЛПС P. аeruginosa) и мурамилпептида из клеточной стенки E. сoli (штамм М-17) с пищевыми аллергенами, при пероральном введении. Разработана лабораторная технологии выделения аллергенов из плодовых тел гриба Шиитаке. Выделенные аллергены охарактеризованы в электрофорезе в ПААГ. Показано увеличение синтеза ИЛ4 лимфоидными клетками здоровых доноров под воздействием белковых фракций из плодовых тел гриба Шиитаке. 7 В рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации 2009-2014 годы» «Стандарт-12» Разработана новая модификация методики оценки дегрануляции NK-клеток с использованием антител к CD107a с меткой PC5 (вместо FITC, использованной ранее), что позволило повысить чувствительность метода. Разработана новая модификация методики оценки экспрессии внутриклеточного перфорина и CD107a в NK-клетках, особенностью которой является введение внутреннего стандарта, представляющего собой мононуклеарные клетки здоровых доноров, меченные флюоресцентным красителем CFSE. Получены нормативные показатели для дегрануляции NK-клеток, экспрессии CD107a и перфорина. «Гепатит-12» Синтезированы молекулы миРНК, обладающие противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С (HCV). Установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладает препарат siUTR280, который наравне с контрольным препаратом siLuc снижает люциферазную активность и содержание РНК HCV в клетках гепатомы человека Huh-7, несущих полноразмерный репликон HCV. Созданы соответствующие вспомогательные вещества для транспорта миРНК в клетку, в том числе: фуллерены, катионные пептиды, липосомы и лентивирусные векторы. На основе полученных веществ и молекул миРНК, разработаны и синтезированы биомолекулярные комплексы с противовирусным эффектом. Проведена оценка эффективности транспорта биомолекулярных комплексов через плазматическую мембрану клетки. Проведена оценка токсичности биомолекулярных комплексов на основе катионных пептидов и липосом. Отработана модель для оценки трансфекционной активности siRNA в комплексе со средствами доставки различной природы и показана принципиальная возможность создания препаратов на основе siRNA для подавления репликации HCV. «Антропоген -13» Монография посвящена комлексной методологии оценки риска развития нарушений иммунной системы при действии антропогенных факторов. Монография состоит из 6 глав. В главе 1 представлен анализ данных об отрицательном действии различных химических, физических, биологических и других факторов окружающей среды, в результате которого выявлены характерные изменения в иммунном статусе под действием каждого из рассмотренных антропогенных факторов. В главе 2 описана методология проведения иммуномониторинга с последующим её применением при массовом обследовании 12000 человек в различных регионах. Глава 3 посвящена анализу полученных результатов с использованием различных математических подходов. В главе 4 представлены материалы по созданию системы прогнозирования развития ИДС. Глава 5 посвящена анализу применения различных подходов к проведению иммуномониторинга. Глава 6 – Заключение. Подготовлен авторский макет монографии. «Иммунитет-13» Монография посвящена анализу функционирования клеток врождённого иммунитета в норме и при воздействии различных антропогенных факторов. Монография включает следующие главы: вводную, в которой изложены основные закономерности функционирования врожденной иммунной системы и принципы ее ответа на неблагоприятные факторы антропогенной природы. Глава 1 посвящена рецепторному аппарату клеток врождённого иммунитета и его изменениям под влиянием антропогенных факторов. В главе 2 рассматривается роль цитокинов врождённого иммунитета и их изменений под влиянием антропогенных факторов. Глава 3 посвящена клеточным факторам врождённого иммунитета и их изменениям под влиянием антропогенных факторов. В главе 4 рассмотрено учение об аларминах. Проведена компоновка 8 материала, редакторская правка, оформление иллюстраций. Подготовлен авторский макет монографии. «Иммуногенетика-13» Монография посвящена проблеме изучения роли иммуногенетики человека в обеспечении биобезопасности государства и включает следующие главы: 1 Введение в иммуногенетику; 2 Геномика и протеомика генов иммунного ответа; 3 Эпидемиологические аспекты противоинфекционной защиты и полиморфизм генов иммунного ответа; 4 Трансплантация органов и тканей человека, полиморфизм HLA и биологическая безопасность; 5 HLA полиморфизм и репродукция; 6 "Новые" гены иммунного ответа человека и заболевания; 7 Иммуногенетика сахарного диабета 1 типа; 8 Создание отечественной платформы (оборудование, реагенты) для развития фундаментальных и прикладных исследований в области иммуногенетики человека; 9 Иммуногенетика в биомедицине: этапы развития и перспективы. Проведены систематизация и обобщение литературных данных. Проведена компоновка материала, редакторская правка. Подготовлен авторский макет монографии. В рамках ЦПИ «Медико-биологическое и медико-санитарное обеспечение спортсменов сборных команд Российской Федерации на 2011-2013 годы» (заказчик ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России) «Поиск-2-ИИ» Проведены доклинические исследования перспективных иммуномодулирующих средств на основе мурамилпептидов клеточной стенки бактерий кишечной палочки (ПеКСИМ-1) и полисахаридов из гриба Шиитаке (ПГШ-1). Подготовлены материалы для регистрационного досье перспективных иммуномодулирующих средств ПеКСИМ-1 и ПГШ-1, а именно: - описание и схема технологического процесса; - лабораторный регламент; - фармакопейная статья;аналитический паспорт;- аналитические методики контроля качества; - данные по условиям хранения, включая описание первичной упаковки, проект инструкции по применению. Подготовлены акты производства двух опытных партий перспективных иммуномодулирующих средств ПеКСИМ-1 в объеме 2000 доз и ПГШ-1 в объеме 1000 доз. В рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (заказчик Минобрнауки России, Минпромторг России) – 6 тем «Доклинические исследования лекарственного средства – профилактической вакцины против гемофильной инфекции» Сконструирован комплексный лекарственный препарат, состоящий из капсульного полисахарида (КПС) и липоолигосахарида (ЛОС) H.influenzae, который представляет собой мицеллы, в состав которых входят оба антигена, которые в соотношении 1:1 обеспечивают препарату требуемые иммунобиологические свойства. Проведены доклинические исследования вакцины (иммуногенность, иммунобиологическая безопасность, острая и хроническая токсичность). «Доклинические исследования лекарственного средства для комплексной терапии гепатита С на основе естественных и искусственных регуляторов иммунного ответа» Проведены доклинические исследования полученного лекарственного средства на основе рекомбинантного белка ИПФIII и полиоксидония (эмбриотоксическое и тератогенное действие в антенатальном периоде развития потомства, мутагенное действие на клетки костного мозга млекопитающих в тесте Эймса, исследование хронической токсичности, иммунотоксические и аллергизующее действие). Подготовлен комплект документов на получение разрешения на клинические исследования лекарственного средства, включающий проект фармакопейной статьи лекарственного 9 средства, протокол клинических исследований, проект брошюры исследователя. Разработаны рекомендации по использованию лекарственного средства, опытнопромышленный регламент получения и проект инструкции по применению лекарственного средства. «Доклинические исследования лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога полноразмерного паратиреоидного гормона для лечения остеопороза» Проведены доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного аналога полноразмерного паратиреоидного гормона для лечения остеопороза. Показана зависимость периода полувыведения лекарственного средства от способа введения и от вида животных. Установлена низкая острая токсичность и отсутствие хронической токсичности, низкое иммунотоксическое действие, отсутствие аллергизующего действия лекарственного средства. Разработана экспресс-методика и проведено изучение биологической активности лекарственного средства по уровню цАМФ, фосфолипазы С и протеинкиназы С на клеточных линиях. Подана заявка на патент «Способ получения лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога полноразмерного паратиреоидного гормона для лечения остеопороза», рег. № 2013150663 от 14.11.13. «Доклинические исследования лекарственного средства интерференции РНК для терапии бронхиальной астмы» на основе механизма Разработаны методики для опытно-промышленного регламента (ОПР): количественного определения лизин-транспортного пептида (ЛТП) и примесей, подлинности пептида ЛТП как компонента лекарственного средства, подлинности РНКолигонуклеотида как компонента лекарственного средства, подлинности комплекса РНКолигонуклеотида/ЛТП как компонента лекарственного средства. Проведена наработка РНК-олигонуклеотидов, ЛТП и оптимизирован способ получения комплекса РНКолигонуклеотида с ЛТП (миРНК/ЛТП). Разработаны методики анализа комплекса миРНК/ЛТП и лабораторный регламент получения лекарственного средства. «Доклинические исследования лекарственного средства профилактической вакцины против шигеллезной инфекции» - комбинированной Оптимизирована лабораторно-экспериментальная технология получения фармацевтической субстанции (ФС) на основе капсульного полисахарида бактерий Зонне и модифицированного липополисахарида бактерий Флекснера. Разработан лабораторный регламент получения ФС. Наработаны опытные образцы ФС и проведен сравнительный анализ физико-химических свойств и подлинности (3 серии). Произведена закладка опытных образцов ФС на хранение для исследования стабильности и определения условий хранения и срока годности. Начаты доклинические исследования. Осуществлено изучение специфической активности ФС на моделях in vitro и in vivo. Исследован эффект межмолекулярной антигенной конкуренции при иммунизации ФС. Изучена иммуногенность (серологический профиль иммунного ответа) ФС. Проведен сравнительный анализ иммуногенности ФС с моновариантами составляющих компонентов. Показано, что способность ФС индуцировать образование антител не уступает такой способности моновариантов. «Доклиническое исследование лекарственных средств иммунотерапии аллергии» (заказчик Минпромторг России) для специфической Проведены доклинические исследования аллерготропинов «Птерпол» и «Фарпол» для лечения аллергии, вызываемой клещами домашней пыли. Оба аллерготропина являются безопасными препаратами, не вызывающими у животных токсических реакций при длительном введении в эквивалентной максимальной терапевтической дозе. В сравнении с исходным аллергеном, аллерготропины являются препаратами со сниженными аллергенными свойствами по критерию стимуляции синтеза 10 гомоцитотропных антител (специфических IgE) и обладают повышенными иммуногенными свойствами. Проведенные исследования дают основание рекомендовать аллерготропины «Птерпол» и «Фарпол» для проведения первой фазы клинических испытаний. Подготовлены проекты опытно-промышленных регламентов. Разработаны проекты документов для проведения первой фазы клинических испытаний. Подана заявка на патент "Аллерготропины для лечения аллергии, вызываемой клещами домашней пыли" № 2013138134 от 15.08.2013. «Доклинические исследования лекарственного средства на основе комплекса мурамилпептидов пептидогликана клеточной стенки грамм-отрицательных бактерий для профилактики и лечения острых и хронических респираторных инфекций» Подготовлен аналитический обзор информационных источников. Проведены патентные исследования. Разработаны методы анализа образцов субстанции лекарственного средства. Начата разработка лабораторной технологии получения лекарственного средства. Федеральная целевая программа «Научные инновационной России» на 2009– 2013 годы и научно-педагогические кадры – «Разработка экспериментальной модели атопического дерматита у мышей для изучения механизмов развития и эффективности новых подходов к терапии данного заболевания» Разработана экспериментальная модель АД (атопического дерматита). На разработанной модели АД проведена оценка эффективности АСИТ. По совокупности иммунологических, патофизиологических, клинических и гистологических изменений в результате проведения АСИТ модифицированным сОА аллергеном, можно сделать вывод о том, что мономерный аллергоид (сОА) является перспективным препаратом для терапии атопического дерматита. В качестве одного из перспективных терапевтических подходов к АСИТ, предложено применять блокаду экспрессии генов цитокинов, вовлеченных в патогенез заболевания, используя метод РНК-интерференции, где ключевым моментом является доставка молекул РНК в клетки. В качестве альтернативных невирусных векторов показано применять разнообразные поликатионные соединения, способные образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами (НК) и конденсировать их в компактные наноструктуры. Созданы липопептидные и фуллереновые конструкции, способные образовывать комплексы с НК. Кроме того, удалось синтезировать нетоксичное химическое соединение липопептидной природы, способное эффективно осуществлять адресную доставку плазмидной ДНК в различные органы млекопитающих. Разработанная пептидная конструкция способствует проникновению трансгена преимущественно в ткань селезенки. по программе Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) – 5 тем – «Гомеостатические процессы в популяции Т-лимфоцитов, вызванные лимфопенией. Анализ механизмов и предпосылок развития иммунопатологии» Исследование влияния цитостатических препаратов на развитие Т-лимфопении и последующее изучение гомеостатических процессов при восстановлении Т-клеток проводили на периферической крови пациентов с впервые выявленной множественной миеломой до начала лечения и через 4 и 30 дней после окончания курса химиотерапии. При изначальном Т-лимфоцитозе на 4 сутки после окончания курса химиотерапии наблюдается Т-лимфопения, а к 30 суткам - восстановление до уровня здоровых доноров. Динамика изменения более выражена у CD8+ Т-клеток по сравнению с CD4+ Т-клетками. Восстановление регуляторных Т-клеток в два раза превышающих количество у здоровых людей после лимфопении характеризовалось снижением числа CD4+FOXP3+ клеток на 4 сутки после окончания курса химиотерапии и достижением уровня здоровых доноров на 11 30 сутки после лечения. – «Лимфоцитарный фосфатазо-ассоциированный протеин (LPAP) как новая сигнальная молекула» Изучали фосфорилированные изоформы белка LPAP человека. Выявлено несколько сайтов фосфорилирования белка LPAP. Для определения конкретных сайтов фосфорилирования были испытаны мутанты белка LPAP, в которых определенные сериновые, треониновые и тирозиновые остатки были замещены на нейтральную аминокислоту аланин, которая не подвержена фосфорилированию. Полученные мутантные варианты гена LPAP были трансфецированы в клетки 293Т. Окрашивание иммунопреципитатов LPAP показало, что мутации в сайте Thr113/Tyr115, а также Ser153 приводили к падению в два раза интенсивности окрашивания LPAP красителем Pro-Q, и, следовательно, фосфорилирование белка LPAP проходит по этим сайтам. Обе индивидуальные мутации как в положении Thr113, так и Tyr115 приводили к уменьшению фосфорилирования. Сделан вывод о том, что одна из этих мутаций приводит к исчезновению сайта фосфорилирования, а другая к изменению пептидного мотива, который узнает соответствующая киназа. – «Изучение молекулярного состава вирусных биопленок на поверхности Тлимфоцитов человека и их роли в межклеточной передаче вирусов HTLV-1 и ВИЧ-1» Получены два моноклональных антитела, распознающих антиген на поверхности клеток C91/PL и колокализующихся с белком Gag вируса HTLV-1. Дается характеристика полученным антителам и их идентификация с помощью метода иммунопреципитации и последующей масс-спектрометрии. Проведена повторная иммунизация мышей биопленками вируса HTLV-1, полученных элюированием с клеток C91/PL. Это позволит расширить панель моноклональных антител к вирусным биопленкам и более полно охарактеризовать компоненты биопленок. Проведена иммунизация мышей Т-клеточной линией человека MT2, также продуцирующей вирус HTLV-1 и образующей вирусные биопленки. Модифицирован метод скрининга моноклональных антител, полученных к биопленкам и клеткам, продуцирующим вирус HTLV-1. Получены 3 гибридомных линии секретирующих моноклональные антитела против клеток MT2, которые дают окраску клеток, колокализующуюся с местоположением вирусного корового белка p19 и не реагирующих с клетками СЕМ. Полученные гибридомные культуры клонированы и подготовлены для скрининга. "Роль вирусологического синапса и транспорта макромолекул в межклеточной трансмиссии и репликации ВИЧ-1" Осуществлен успешный дизайн, сборка и тестирование in vivo генетических конструкций для нок-аута рецепторов и корецепторов ВИЧ-1 (CD4, CXCR4 и CCR5) в Т клетках человека с помощью нуклеаз «цинковые пальцы» и Cas9. Получено большинство из донорских векторов, кодирующих различные части генома ВИЧ-1 и репортер inGFPt и предназначенные для таргетной интеграции их в геном клетки. Полученные первые клоны Т клеток с интегрированной ДНК ВИЧ-1, лишенной гена env, проверены методами генетического анализа и в инфекционном тесте. Путем последовательных трансфекций и клонирований будут получены конечные трансгенные Т клетки – продуценты ВИЧ-1 и Т клетки – мишени. «Изучение иммуностимулирующих свойств и иммуногенности мурамилпептидов грамотрицательных бактерий» Наработаны мурамилпептиды грамотрицательных бактерий ГМтри, ГМтетра и диГМтетра в количестве, необходимом для последующих экспериментов. Получены полноразмерные кДНК рецепторов NOD1, NOD2, TLR2, TLR4, CD14, которые участвуют или могут участвовать в распознавании мурамилпептидов грамотрицательных бактерий. Перечисленные кДНК клонированы в экспрессионный вектор pcDNA3.1, полученные 12 экспрессионные плазмиды наработаны в препаративных количествах. Отработана методика трансфекции клеток репортерной плазмидой, содержащей ген люциферазы под контролем NF-kB-индуцибельного промотера. Получена клеточная линия HEK293-Luc, со стабильно встроенной в геном конструкцией «NF-kB-индуцибельный промотер — люцифераза». Показано, что интерлейкин-1 альфа и бета костимулируют выработку провоспалительных цитокинов ФНО и ИЛ-12 дендритными клетками, а также выработку ФНО макрофагами. В результате выполнения указанных выше работ получена следующая научнотехническая продукция: Акты Аналитические обзоры Доклинические испытания (законченные) Заключения Инструкции (проекты) Лабораторные, опытно-промышленные регламенты (проекты) 16 4 6 5 7 10 Фармстатьи, НТД (проекты), регистрационное досье 10 Методы 8 Методики 35 Методические рекомендации, пособия (проект), рекомендации и предложения Мониторинг Монографии (авторские макеты) Отчеты о доклинических исследованиях/план Препараты (лабораторные или экспериментальные образцы, лекарственные формы) Справки-доклады Инструкции Аналитические обзоры Протоколы/перечень Спецификации/паспорта Экспериментальные лабораторные технологии Экспериментальные модели 3 1 3 7/1 21 3 2 1 13/2 4/11 4 5 Иммуногенетическая карта обследованных этнических групп России Регистр первичных иммунодефицитов дополнена дополнен Банк данных ВИЧ-инфицированных Банк сывороток, неопределенных в отношении ВИЧ Коллекция штаммов и рекомбинантных плазмид Публикации, всего: Монографии (книги): в том числе, руководство для врачей/учебное пособие отечественные, всего cтатьи/тезисы зарубежные, всего cтатьи/тезисы Патенты Заявка на патент дополнен дополнен дополнена 158 3 1/1 127 96/31 28 5/23 2 5 13 Проведение научных мероприятий XII Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, г. Москва. Организаторы Конгресса - ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Российская Ассоциация Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ). Р.М. Хаитов - Президент Конгресса. В работе Конгресса приняли участие 24 сотрудника Института, было сделано более 30 докладов. Р.М. Хаитов выступил с актовой лекцией «Иммуногенетика и биомедицина». VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» и XI Международная специализированная выставка «Мир биотехнологии – 2013», 19-22 марта 2013 года, г. Москва. Р.М. Хаитов, – руководитель секции «Иммунная биотехнология», член Организационного и Программного комитетов Конгресса. А.И. Мартынов - руководитель секции «Иммунная биотехнология», член Организационного комитета. Сотрудники Института сделали 5 пленарных докладов. Участие в подготовке заседания рабочей группы по здравоохранению в рамках Азиатско - Тихоокеанского экономического сотрудничества (АТЭС) в г. Сурабая (Индонезия) 11-13 апреля 2013 года. Научно-практическая конференция «Московская международная неделя вирусологии» 8-12 сентября 2013 г., Москва. В состав Организационного комитета от Института вошли Хаитов Р. М. и Гудима Г.О. Сотрудники Института сделали 7 докладов. 16-20 сентября 2013 в г. Волгограде состоялся XXII съезд с международным участием Физиологического общества имени И.П. Павлова. В состав Программного комитета входил Р.М. Хаитов. 26 – 27 ноября 2013, Москва– II молодежный международный форум медицинских наук “MedWAYS". Смирнов В.В. - член Оргкомитета, выступил с докладом. Сотрудники Института принимали активное участие в работе 76 научных и научнопрактических мероприятий, в том числе 14 международных и 20 российских с международным участием. Сделано 158 докладов, в том числе 69 на международных или с международным участием мероприятиях. Сотрудники Института активно участвовали в работе редакционных советов и редколлегий свыше 30 научных журналов, неоднократно выступали в СМИ. 14